JP6701322B2 - 点像分布関数の測定装置、測定方法、画像取得装置および画像取得方法 - Google Patents

Description

本発明は、点像分布関数の測定装置、測定方法、画像取得装置および画像取得方法に関するものである。

２光子励起顕微鏡のような画像取得装置においては、画像の空間分解能が励起レーザの点像分布関数のみによって決定される。特に試料の深部の観察においては、試料の屈折率や散乱によって点像分布関数の形状が拡がるため、画像の空間分解能が低下する。

点像分布関数の形状を把握して、デコンボリューションにより画像のボケを軽減する手法が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
この手法は、微細な蛍光ビーズを試料内に配置しておき、蛍光ビーズを光トラップによって移動させて任意の位置での点像分布関数を測定している。

Ｊ．Ｗ．Ｓｈａｅｖｉｔｚ ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，"Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｄｅｐｔｈ−ｖａｒｙｉｎｇ ｐｏｉｎｔ−ｓｐｒｅａｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，"Ｊ．Ｏｐｔ，Ｓｏｃ．Ａｍ．Ａ，Ｖｏｌ．２４，２６２２（２００７）．

非特許文献１の手法は、試料に蛍光ビーズを配置するため、試料に手を加える必要があり、試料による制限や試料に対する影響も考えられるため、好ましくない。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、試料に手を加えることなく点像分布関数を取得することができる点像分布関数の測定装置、測定方法、画像取得装置および画像取得方法を提供することを目的としている。

本発明の一態様は、光源から発せられた２つの照明光を走査する走査部と、該走査部により走査される２つの前記照明光を試料に照射する照明光学系と、該照明光学系により照射される２つの前記照明光の前記試料における相対的な照射位置を変更する相対位置調節部と、前記照明光学系により照射された各前記照明光の前記試料における重なり位置において発生した信号光を検出する検出光学系と、該検出光学系により検出された前記信号光と、該信号光の検出時における２つの前記照明光の相対的な照射位置とに基づいて点像分布関数を算出する算出部とを備える点像分布関数の測定装置である。

本態様によれば、光源から発せられた２つの照明光が、走査部によって走査され、照明光学系によって試料に照射されると、照明光の各照射位置において信号光が発生し、検出光学系によって検出される。相対位置調節部の作動により、２つの照明光の相対的な照射位置を異ならせて、２つの照明光の走査および検出を繰り返すことにより、相対的な照射位置と検出された信号光の強度との関係から、算出部によって点像分布関数が算出される。

この場合において、従来のように試料に蛍光ビーズを配置する処理のように、試料に手を加えることなく、試料の任意の位置において照明光の点像分布関数を求めることができる。

上記態様においては、前記算出部が、自己相関波形を求めることにより前記点像分布関数を算出してもよい。
このようにすることで、自己相関波形から点像分布関数を精度よく算出することができる。
すなわち、２つの照明光の相対的な照射位置を変化させることにより、２つの照明光の試料中における重なりが変化し、全く重なっていない状態で、２つの独立した照明光により発生する信号光の和に等しい信号光が発生し、完全に重なった状態で最も大きくなる信号光が発生する。相対的な照射位置に応じた信号光の強度のプロファイルを用いることにより、点像分布関数を精度よく求めることができる。

また、上記態様においては、前記照明光学系が、２つの前記照明光の偏光状態を相互に直交するように設定してもよい。
このようにすることで、２つの照明光が重なる場合の両照明光の電場干渉による余分な信号光成分の発生を抑制し、点像分布関数を精度よく求めることができる。

また、上記態様においては、前記信号光が前記照明光の照射によって非線形光学過程で発生するものであってもよい。
このようにすることで、非線形光学過程を利用した試料観察を行う際にも、点像分布関数による空間分解能の向上を図ることができる。

また、上記態様においては、前記照明光が極短パルスレーザ光であり、前記信号光が多光子吸収効果によって発生する蛍光であってもよい。
このようにすることで、試料に極短パルスレーザ光を照射することにより発生する多光子吸収効果を利用して、蛍光観察を行う場合にも、点像分布関数による空間分解能の向上を図ることができる。

また、上記態様においては、前記検出光学系により検出された前記信号光を用いて少なくとも１次元のサイズを有する１以上の信号光画像を取得し、前記算出部が、前記信号光画像を用いて前記自己相関波形を算出してもよい。
このようにすることで、信号光が検出できれば、どのような試料のどのような位置においても点像分布関数を求めることができる。

また、上記態様においては、前記算出部が、自己相関波形をフーリエ変換することにより前記点像分布関数を算出してもよい。
このようにすることで、自己相関波形から点像分布関数を精度よく求めることができる。

また、上記態様においては、前記照明光がパルス状の光であり、前記照明光学系が、２つの前記照明光の前記試料への照射タイミングを同時または非同時に切り替えるタイミング調整部を備え、前記算出部が、前記タイミング調整部により同時および非同時に切り替えたときにそれぞれ検出された信号光の差分を用いて点像分布関数を算出してもよい。
このようにすることで、タイミング調整部が２つの照明光の試料への照射タイミングを同時に切り替えると、相対的な照射位置に応じて２つの照明光の試料内における重なりが発生し、重なりの度合いに応じて強度が変化する信号光を検出できる。一方、照射タイミングを非同時に切り替えると、２つの照明光の試料内における重なりは発生せず、相対的な照射位置が変化しても変化しない信号光のオフセット成分を検出できる。したがって、差分を算出することにより、オフセット成分を除外した信号光の強度分布を算出することができ、これを用いて点像分布関数を精度よく算出することができる。

また、上記態様においては、前記照明光学系が、前記点像分布関数の空間周波数分布において高周波成分が強調されるように前記照明光の空間分布または偏光状態を変調する光変調部を備えていてもよい。
このようにすることで、試料において信号光が発生するときに光学的に高周波成分を強調することができ、空間分解能を高めることができる。

また、本発明の他の態様は、光源から発せられた２つの照明光を、試料における相対的な照射位置を切り替えて、前記試料において走査させる走査ステップと、該走査ステップにより照射された各前記照明光の前記試料における重なり位置において発生した信号光を検出する検出ステップと、該検出ステップにより検出された前記信号光と、該信号光の検出時における２つの前記照明光の相対的な照射位置とに基づいて点像分布関数を算出する算出ステップとを含む点像分布関数の測定方法である。

上記態様においては、前記算出ステップが、自己相関波形を求めることにより前記点像分布関数を算出してもよい。
また、上記態様においては、前記走査ステップが、２つの前記照明光の偏光状態を相互に直交するように設定して走査させてもよい。

また、上記態様においては、前記信号光が前記照明光の照射によって非線形光学過程で発生するものであってもよい。
また、上記態様においては、前記照明光が極短パルスレーザ光であり、前記信号光が多光子吸収効果により発生する蛍光であってもよい。
また、上記態様においては、前記検出ステップが、検出された前記信号光を用いて少なくとも１次元のサイズを有する１以上の信号光画像を取得し、前記算出ステップが、前記信号光画像を用いて前記自己相関波形を算出してもよい。

また、上記態様においては、前記算出ステップが、自己相関波形をフーリエ変換することにより前記点像分布関数を算出してもよい。
また、上記態様においては、前記照明光がパルス状の光であり、前記走査ステップが、２つの前記照明光の前記試料への照射タイミングを同時または非同時に切り替えて走査させ、前記算出ステップが、前記走査ステップにより同時および非同時に切り替えたときにそれぞれ検出された信号光の差分を用いて点像分布関数を算出してもよい。
また、上記態様においては、前記走査ステップが、前記点像分布関数の空間周波数分布において高周波成分が強調されるように前記照明光の空間分布または偏光状態を変調してもよい。

また、本発明の他の態様は、上記いずれかの点像分布関数の測定装置と、該測定装置により測定された点像分布関数を用いて前記試料の画像を生成する画像処理部とを備える画像取得装置を提供する。
本態様によれば、測定装置によって測定された点像分布関数を用いて、画像処理部によって試料の画像を生成することにより、試料の画像におけるボケを軽減することができる。

上記態様においては、前記画像処理部が、前記走査部により走査された前記光源からの照明光を前記照明光学系によって前記試料に照射し、各照射位置で前記試料において発生した前記信号光を前記検出光学系により検出することにより取得された試料画像を生成し、生成された該試料画像を、前記測定装置により測定された点像分布関数を用いて再構成してもよい。
このようにすることで、点像分布関数を用いた試料画像の再構成により、効果的にボケを軽減することができる。

また、上記態様においては、前記画像処理部が、前記点像分布関数を用いて前記試料画像に対してデコンボリューションを行うことにより前記試料画像を再構成してもよい。
このようにすることで、デコンボリューションによって、試料画像のボケを効果的に軽減することができる。

また、本発明の他の態様は、上記いずれかの測定方法と、該測定方法により測定された点像分布関数を用いて試料画像を生成する画像処理ステップを含む画像取得方法である。
上記態様においては、前記画像処理ステップが、前記光源からの照明光を前記試料において走査させ、各走査位置で前記試料において発生した前記信号光を検出することにより取得された前記試料画像を生成する画像生成ステップと、該画像生成ステップにより生成された前記試料画像を、前記測定方法により測定された点像分布関数を用いて再構成する再構成ステップとを含んでいてもよい。

また、上記態様においては、前記画像処理ステップが、前記点像分布関数を用いて前記試料画像に対してデコンボリューションを行うことにより前記試料画像を再構成してもよい。

本発明によれば、試料に手を加えることなく点像分布関数を取得することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る画像取得装置を示す模式図である。 図１の画像取得装置に備えられる本発明の一実施形態に係る点像分布関数の測定装置による２つのレーザ光の相対位置を示す図である。 図２の測定装置により取得された集光点間距離に対する蛍光強度分布を示す図である。 図３の蛍光強度分布からオフセット成分を除去して回転させることにより取得されたレーザ光の自己相関波形画像を示す図である。 図４の自己相関波形画像を用いて算出された２光子励起蛍光のＰＳＦの空間分布を示す図である。 ＰＳＦ形状の測定位置と画像取得位置とが等しい場合の本発明の一実施形態に係る画像取得方法を説明するフローチャートである。 本発明の一実施形態に係るＰＳＦの測定方法を示すフローチャートである。 ＰＳＦ形状の測定位置と画像取得位置とが異なる場合の画像取得方法を説明するフローチャートである。 試料におけるＰＳＦが非対称の場合のレーザ光のＰＳＦ形状の測定方法の一例を示す図である。 図１の画像取得装置の第１の変形例を示す模式図である。 図１の画像取得装置の第２の変形例を示す模式図である。 図１の画像取得装置の第３の変形例を示す模式図である。 図１の画像取得装置の第４の変形例を示す模式図である。

以下、本発明の一実施形態に係る点像分布関数の測定装置２５、測定方法、画像取得装置１および画像取得方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る画像取得装置１は、多光子励起型（より具体的には２光子励起型）の走査型蛍光顕微鏡であって、図１に示されるように、近赤外の極短パルスレーザ光（以下、レーザ光という。）を射出するチタンサファイアレーザ等の光源（レーザ光源）２と、該光源２からのレーザ光を試料Ｘに照射する照明光学系３と、該照明光学系３の途中位置に配置され、レーザ光を２次元的に走査する走査部４と、レーザ光が試料Ｘに照射されることにより、試料Ｘにおいて発生した蛍光（信号光）を検出する検出光学系５と、該検出光学系５により検出された蛍光の強度に基づいて点像分布関数（以下、ＰＳＦという。）を算出し、算出されたＰＳＦを用いて画像を再構成する処理装置６とを備えている。

照明光学系３は、光源２からのレーザ光のビーム径を調節するビーム径調整光学系７と、レーザ光の偏光方向を４５°方向に設定するλ／２板８と、レーザ光を２つの光路に分岐する第１偏光ビームスプリッタ９と、一方の光路に設けられた光路長調整光学系（タイミング調整部）１０と、２つの光路を通過してきたレーザ光（第１レーザ光と第２レーザ光）を合波する第２偏光ビームスプリッタ１１と、合波されたレーザ光を通過させるλ／４板１２と、２対のリレーレンズ１３ａ，１３ｂと、ビーム整形素子（光変調部）１４と、瞳投影レンズ１５と、結像レンズ１６と、対物レンズ１７とを備えている。図中、符号１８は光路を形成するためのミラーである。

第１偏光ビームスプリッタ９は、λ／２板８により偏光方向が４５°に設定された後のレーザ光が入射することによって、入射したレーザ光を、強度比が１：１の互いに直交する偏光方向の第１レーザ光（照明光）Ｌ１と第２レーザ光（照明光）Ｌ２とに分岐するようになっている。

第２偏光ビームスプリッタ１１は、２軸方向に独立にあおり角度を制御可能な電動ホルダ（相対位置調節部）１９に設置されている。電動ホルダ１９の作動により第２偏光ビームスプリッタ１１のあおり角度が変更されると、第２偏光ビームスプリッタ１１を透過する第１レーザ光Ｌ１は、概ね偏向されることなくほぼ真っ直ぐに透過する一方、第１偏光ビームスプリッタ９において反射される第２レーザ光Ｌ２の偏向角度が変化させられるようになっている。これにより、走査部４に入射する第２レーザ光Ｌ２の角度が変化し、試料Ｘにおける第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２との相対的な照射位置が変化するようになっている。

光路長調整光学系１０は、一対のミラー２０を矢印の方向に移動させることにより、第２偏光ビームスプリッタ１１による合波後の第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とのパルスのタイミングが同時となるように、第２レーザ光Ｌ２の光路長を調整するようになっている。
λ／４板１２は、合波された第１レーザ光Ｌ１および第２レーザ光Ｌ２をそれぞれ円偏光に変換するようになっている。

走査部４は、例えば、２軸のガルバノミラー２１であって、リレーレンズ１３ｂと瞳投影レンズ１５との間に配置されている。走査部４は、２対のリレーレンズ１３ａ，１３ｂ、瞳投影レンズ１５および結像レンズ１６によって、第２偏光ビームスプリッタ１１、ビーム整形素子１４および対物レンズ１７の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている。

検出光学系５は、結像レンズ１６と対物レンズ１７との間に配置され、対物レンズ１７によって集光された蛍光をレーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラー２２と、該ダイクロイックミラー２２によって分岐された蛍光を集光する集光レンズ２３と、集光された蛍光を検出する光電子増倍管のような光検出器２４とを備えている。

処理装置６は、ＰＳＦを算出する算出部（図示略）と、算出されたＰＳＦを用いて蛍光画像を再構成する画像処理部（図示略）とを備えている。光源２から、処理装置６を構成している算出部までの構成によって、本発明の一実施形態に係るＰＳＦの測定装置２５が構成されている。

算出部は、電動ホルダ１９によって設定された第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２との相対距離毎に、走査部４を作動させて取得された各蛍光画像の強度を積分し、相対距離に対して蛍光強度の積分値をプロットすることにより、図３の蛍光強度分布を得るようになっている。
算出部は、さらに図３の蛍光強度分布のオフセット成分を除去するようになっている。

また、算出部は、オフセット成分が除去された蛍光強度分布の波形を、ピークを通過する軸回りに回転させて、図４に示されるような回転対称な画像を作成し、作成された画像に２次元のフーリエ変換を施し、得られた画像を１／２乗した後に、２次元の逆フーリエ変換し、得られた画像を２乗するようになっている。これにより、図５に示されるような２光子励起のＰＳＦの空間分布を取得するようになっている。

算出部における処理を、数式を用いて以下に説明する。
第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２の双方を含めた励起光強度と、それによって発生する蛍光強度を数式で表す。第１レーザ光Ｌ１および第２レーザ光Ｌ２の電場振幅をそれぞれＥ１，Ｅ２とした場合の励起光強度Ｉ_ｅｘは、式（１）で表される。

式（１）において、「＊」は複素共役を示し、Ｉ_１，Ｉ_２はそれぞれ第１レーザ光Ｌ１、第２レーザ光Ｌ２の強度を示している。
本実施形態においては、２光子励起顕微鏡を想定しているので、蛍光強度は励起光強度の２乗に比例する。この比例定数をαとした場合の蛍光強度を式（２）に示す

上述したように、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２は第２偏光ビームスプリッタ１１により相互に直交する直線偏光となった後にλ／４板１２で円偏光に変換されている。この場合、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とは干渉せず、式（２）の第４項および第５項は他の項に比べて無視できるほど小さくなる。すなわち、式（２）は式（３）のように簡略化することができる。

式（３）における第１項および第２項は、第１レーザ光Ｌ１および第２レーザ光Ｌ２の集光点の相対位置がどのような状態にあっても、第１レーザ光Ｌ１および第２レーザ光Ｌ２により各々独立に励起されて発生する蛍光成分を表している。一方、式（３）の第３項は第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２の強度積となっており、これは両集光点の重なりに相当する。すなわち、第１レーザ光Ｌ１の集光点と第２レーザ光Ｌ２の集光点とが全く重なっていない状態において、第３項はゼロになり、第１レーザ光Ｌ１の集光点と第２レーザ光Ｌ２の集光点とが完全に重なっている場合に第３項は最大値となる。

第１レーザ光Ｌ１の集光点と第２レーザ光Ｌ２の集光点の位置の例を図２に示す。符号Ｐ１は第１レーザ光Ｌ１の集光点、符号Ｐ２は第２レーザ光Ｌ２の集光点をそれぞれ示している。図２においては集光点の重なりは生じていない。ここで、集光点Ｐ１，Ｐ２の相対距離を変化させながら試料Ｘの画像を取得することを考える。すなわち、電動ホルダ１９で第２レーザ光Ｌ２の偏向角度を変化させることにより、第２レーザ光Ｌ２の集光点を図２の矢印の方向に移動させながら画像を取得する。

より詳細には、第２レーザ光Ｌ２の集光点Ｐ２が図２の位置にある状態で、走査部４を作動させて試料Ｘの２次元的な蛍光画像を取得する。次いで、集光点Ｐ２を図２の矢印の方向に所定のステップ分だけ移動させて、その状態でさらに試料Ｘの蛍光画像を取得する。これを繰り返して集光点Ｐ１，Ｐ２の各相対距離に対して試料Ｘの蛍光画像を取得する。

このようにして取得された蛍光画像においては、集光点Ｐ１，Ｐ２の重なりの状態が反映された蛍光強度を有している。すなわち、式（３）に従って蛍光強度が変化し、特に、第３項が集光点Ｐ１，Ｐ２の重なりに応じて変化している。

このようにして取得された各蛍光画像の画像内の蛍光強度を積分し、集光点Ｐ１，Ｐ２の相対距離に対してプロットすることにより得られた、図３の積分蛍光強度の分布は、集光点Ｐ１，Ｐ２の相対距離に応じて積分蛍光強度が変化し、特に集光点Ｐ１，Ｐ２の相対距離がゼロとなる位置においてピークとなる形状を有している。

これは、この状態において集光点Ｐ１，Ｐ２の重なり領域が最大となり、式（３）の第３項が最大となっていることを意味している。また、図３の蛍光強度分布のオフセット成分は集光点Ｐ１，Ｐ２の相対距離が変化しても変化しない成分であり、式（３）の第１項と第２項との和に相当している。

次に、オフセット成分を除去する処理について説明する。オフセット成分を除去する方法としては、集光点Ｐ１，Ｐ２が重なりを持たない相対距離にあるときの信号値をオフセット値として検出し、蛍光強度分布全体からオフセット値を減算する方法を挙げることができる。また、式（３）からもわかるように、集光点Ｐ１と集光点Ｐ２の光強度が等しい場合（すなわち、Ｉ_１＝Ｉ_２の場合）、波形のピークの値はオフセットの値の２倍となる。よって、ピーク値の１／２を算出し、波形全体から差分することも可能である。

しかし、画像における集光点Ｐ１，Ｐ２の相対走査を行う方向の周辺部に蛍光分子が存在する場合には、蛍光分子の分布が影響して図３の波形が正しく得られず、集光点Ｐ１，Ｐ２が重なりを持たない相対距離にあるときでも値が一定とならない。このような場合には上記のオフセット成分除去方法は適用できない。

このような場合には、光路長調整光学系１０を利用する方法がある。具体的には、光路長調整光学系１０を調整して、第１レーザ光Ｌ１の光路長と第２レーザ光Ｌ２の光路長とを異ならせて、図３の蛍光強度分布を取得する。第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２の光路長が異なる状態では、第１レーザ光Ｌ１のパルスと第２レーザ光Ｌ２のパルスとが同時に試料Ｘに照射されないため、式（３）の第３項の寄与がなくなる。すなわち、式（３）の第１項と第２項の和からなるオフセット成分のみが得られることになる。

したがって、光路長調整光学系１０を切り替えて、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とが同時に試料Ｘに照射される状態での図３の蛍光強度分布の取得と、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とが同時に試料Ｘに照射されない状態での図３の蛍光強度分布の取得とを行って、その差分を算出することにより、オフセットを除去した蛍光強度分布を取得することができる。

この光路長調整光学系１０を利用したオフセット成分除去方法では、第１レーザ光Ｌ１のパルスと第２レーザ光Ｌ２のパルスが試料Ｘに同時に照射される場合と非同時に照射される場合で励起される蛍光分子は等しいため、その差分時に蛍光分子の分布の影響も除去される。よって、蛍光分子の分布に依らず正しくオフセット成分を除去できるという利点がある。

このようにしてオフセット成分が除去された蛍光強度分布は、式（３）の第３項の第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２の集光点Ｐ１，Ｐ２の相対距離を変化させたものであり、式（４）で示されるように、等しい強度Ｉの２つのレーザ光Ｌ１，Ｌ２のコンボリューションとして表現することができる。

続いて、オフセット成分が除去された蛍光強度分布を、ピークを通過する線回りに回転させて、図４のような回転対称の画像を作成する。この画像ではどの角度においても断面のプロファイルが図３の自己相関波形となっている。そして、この画像は式（４）を２次元的に展開したものとなっており、式（５）のように表現することができる。

実空間におけるコンボリューションはフーリエ空間では積に置き換えられるため、式（５）を２次元でフーリエ変換すると、式（６）のように、励起光強度Ｉをフーリエ変換したものの２乗として表すことができる。このため、式（７）に示されるように、式（６）を１／２乗して２次元で逆フーリエ変換することで、励起光強度Ｉの空間分布、すなわち、集光点におけるレーザ光のＰＳＦの形状を取得することができる。そして、このＩを２乗したものが２光子励起用のＰＳＦの形状となる。

ここで、式（７）のように式（６）１／２乗して逆フーリエ変換することにより励起光強度Ｉ自体を求めるためには、式（４）のように同じ励起光強度Ｉのコンボリューションとなっている必要がある。そのために、図１において、２つの偏光ビームスプリッタ９，１１によって集光点Ｐ１，Ｐ２の偏光が直交するようにし、それによって式（２）の第４項および第５項を除去することができる。

画像処理部は、上記のようにして取得されたＰＳＦを用いて、デコンボリューションを行うことにより、画像の分解能を向上するようになっている。デコンボリューションとしては公知のウィーナーデコンボリューション等を利用すればよい。

試料Ｘの観察を行う場合には、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とが完全に重なった状態で取得された画像、もしくは、第１レーザ光Ｌ１か第２レーザ光Ｌ２のいずれかのレーザ光のみを試料Ｘに照射した状態で取得された画像を取得し、取得された画像を既に求めたＰＳＦを用いてデコンボリューションするようになっている。

第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とが完全に重なった状態での画像としては、集光点Ｐ１，Ｐ２の相対位置を変化させながら取得された画像の中から選んだものを採用してもよい。
第１レーザ光Ｌ１か第２レーザ光Ｌ２のいずれかのレーザ光のみを試料Ｘに照射する場合には、例えば、λ／２板８を回転させて第１偏光ビームスプリッタ９で全成分が反射もしくは透過するように設定すればよい。このようにすることで、レーザ光のパワーを損失することなく、ＰＳＦ形状の測定と試料Ｘの観察のための画像取得とを切り替えることができる。

このように、ＰＳＦの形状測定からデコンボリューションによる高分解能な試料Ｘの画像取得までのフローの一例を図６に示す。
図６によれば、本発明の一実施形態に係る画像取得方法は、まず、試料Ｘ内の画像取得位置を設定し（ステップＳ１）、その位置でＰＳＦの形状を測定する（ステップＳ２）。その後、試料Ｘの画像を取得し（画像生成ステップＳ３、画像処理ステップ）、その画像に対して、測定されたＰＳＦを用いて再構成処理（デコンボリューション）を行う（再構成ステップＳ４、画像処理ステップ）。そして、他にＰＳＦの形状を測定する位置があるか否かを判定し（ステップ５）、全範囲での観察が終了したと判定された場合は測定を完了する。また、試料Ｘ内の別視野での観察が必要であれば、ステップＳ５において、再度、画像取得位置の設定に戻ってステップＳ１からの処理を繰り返す。なお、再構成ステップＳ４は各視野での画像取得毎に行う必要はなく、全視野での測定が終了した後にまとめて行ってもよい。

また、本発明の一実施形態に係るＰＳＦの測定方法は、図７に示されるように、光路長調整光学系１０を作動させて、２つの照明光が同時に試料Ｘに照射されるように設定し（ステップＳ２１）、電動ホルダ１９によって第２レーザ光Ｌ２の偏向角度を設定し（ステップＳ２２）、走査部４の作動によって２つのレーザ光Ｌ１，Ｌ２を試料Ｘにおいて走査し、各走査位置において発生する蛍光の強度を検出する（ステップＳ２３、走査ステップ、検出ステップ）。そして、第１の蛍光強度分布の取得が終了したか否かを判定し（ステップＳ２４）、終了していない場合には、ステップＳ２２に戻って、電動ホルダ１９による第２レーザ光Ｌ２の偏向角度を微小角度だけ変更して処理を繰り返す。これにより、相対的な照射位置に対する第１の蛍光強度分布を取得することができる。

次いで、第１の蛍光強度分布の取得が終了した場合には、光路長調整光学系１０を作動させて、２つの照明光が非同時に試料Ｘに照射されるように設定し（ステップＳ２５）、電動ホルダ１９によって第２レーザ光の偏向角度を設定し（ステップＳ２６）、走査部４の作動によって２つのレーザ光を試料Ｘにおいて走査し、各走査位置において発生する蛍光の強度を検出する（ステップＳ２７、走査ステップ、検出ステップ）。そして、第２の蛍光強度分布の取得が終了したか否かを判定し（ステップＳ２８）、終了していない場合にはステップＳ２６に戻って、電動ホルダ１９による第２レーザ光Ｌ２の偏向角度を微小角度だけ変更して処理を繰り返す、これにより、相対的な照射位置に対する第２の蛍光強度分布を取得することができる。

取得された第１の蛍光強度分布から第２の蛍光強度分布を減算することによりオフセット成分を除去した第３の蛍光強度分布を得る（ステップＳ２９）。得られた第３の蛍光強度分布を、ピークを通過する軸回りに回転させることにより、自己相関波形を示す画像を取得し（算出ステップＳ３０）、取得された画像にフーリエ変換を施し（ステップＳ３１）、１／２乗して（ステップＳ３２）、逆フーリエ変換を施し（ステップＳ３３）、更に２乗する（ステップＳ３４）。これにより、試料Ｘ内の集光点におけるレーザ光の２光子励起用のＰＳＦの形状を求めることができる。

また、上記にように、図３で集光点Ｐ１，Ｐ２が重なりを持たない相対距離にあるときの信号値をオフセット値とする場合や信号ピーク値の１／２をオフセット値とする場合は、ステップＳ２５からステップＳ２８は省略することができ、そのような処理でオフセット値を算出した後、ステップＳ２９でオフセット値を減算すれば良い。

ＰＳＦの形状測定を行う試料Ｘ上の位置と、試料Ｘの画像を取得する位置とは等しいことが望ましいが、ＰＳＦの形状が変化しなければ、異なる位置でもよい。例えば、試料Ｘの同じ深さの別の位置でＰＳＦの形状測定と画像取得とを行うことにしてもよい。

また、連続的に深さを変えながら３次元的に試料Ｘの画像を取得する場合に、例えば、いくつかの断続的な深さ位置においてＰＳＦの形状測定を行い、その間の領域に対しては取得したＰＳＦの形状を補間してＰＳＦの形状を算出してもよい。このようにすることで、ＰＳＦの形状の測定回数を減らしながら効果的にデコンボリューションによって空間分解能の高い画像を取得することができる。

なお、ＰＳＦの測定位置と試料Ｘの画像取得位置とが異なる場合のフローを図８に示す。図８では、まず、ＰＳＦの形状測定位置を設定し（ステップＳ６）、その位置においてＰＳＦの形状を測定する（ステップＳ２）。他にＰＳＦの形状を測定する位置があるか否かを判定し（ステップＳ７）、他に測定位置があれば、ステップＳ６に戻って、再度、ＰＳＦの測定位置を設定し（ステップＳ６）、ＰＳＦの形状を測定する（ステップＳ２）。ＰＳＦの測定が終了した場合には、画像取得位置を設定し（ステップＳ１）、画像取得（ステップＳ３）および画像再構成（ステップＳ４）を行って、全ての視野での画像取得が完了するまで画像取得を繰り返す（ステップＳ５）。

処理の流れは、図８のフローに限定されるものではなく、ＰＳＦを補間して測定位置以外でのＰＳＦを算出するプロセスが加えられていてもよいし、画像再構成を最後にまとめて行ってもよい。

また、対物レンズ１７に入射させるレーザ光を空間変調するなどして、ＰＳＦの空間周波数の高周波成分を光学的に強調することにしてもよい。図１のビーム整形素子１４として、ビームの中心部を遮光するマスクを用いる場合、対物レンズ１７から射出されるレーザ光は輪帯照明となり、高周波成分が強調された形状となる。通常、深部観察の際には散乱や収差によって高周波成分が低減し、分解能が低下する。光学的に高周波成分を強調することにより、分解能の低下を抑制することができる。

輪帯照明のように高周波成分を強調すると、ＰＳＦはサイドローブを有する不自然な形状となるが、ＰＳＦの形状を測定し、得られたＰＳＦを用いてデコンボリューションを行うことにより、サイドローブの影響をなくすとともに、分解能を有する蛍光画像を取得することができる。すなわち、ビーム整形素子１４により光学的に高周波成分を強調し、デコンボリューションによってその成分をさらに画像処理によって強調するとともにサイドローブの影響を取り除いて高分解能な試料Ｘの画像を得ることができる。ＰＳＦの高周波成分を強調するビーム整形素子１４と組み合わせることでさらに蛍光画像の分解能を向上することができる。ビーム整形素子１４としては、マスクの他に、レーザ光の偏光をラジアル偏光に変換する偏光素子等を用いることができ、高周波成分を光学的に強調できるものであればこれに限定されない。

また、本実施形態においては、自己相関波形を取得するために、第１レーザ光Ｌ１の照射位置と第２レーザ光Ｌ２の照射位置とを相対的に変化させながら２軸のガルバノミラー２１で２次元の画像を取得することとしたが、この画像は自己相関波形を取得することを目的としているので、２次元ではなく１次元、すなわちラインであってもよい。

また、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２の照射位置の相対移動については図２に示されるように１次元方向に行うこととしたが、これは１次元の自己相関波形を回転させて２次元の回転対称な自己相関波形を作成するものであり、測定しようとするＰＳＦの形状が回転対称であることを前提としている。したがって、ＰＳＦの形状が回転非対称である場合には適用できない。

ＰＳＦの形状が回転非対象である場合には、図９に示されるように、第１レーザ光Ｌ１の照射位置と第２レーザ光Ｌ２の照射位置とを２次元的に相対走査することが好ましい。このようにして取得した２次元の自己相関波形の画像を用いて、上記と同様の処理を行うことにより、回転非対称なＰＳＦの形状を有する場合にも２光子励起蛍光の自己相関波形画像を取得することができる。

このようにしてＰＳＦ形状が測定されると、それを基にしてデコンボリューションを行い、蛍光画像の分解能を向上することができる。特に、2光子励起顕微鏡による深部観察において、試料Ｘ内での散乱や試料Ｘの屈折率による収差によってＰＳＦ分布が変化している。本実施形態に係る画像取得装置１によれば、試料Ｘの深部においても試料Ｘ内におけるＰＳＦ形状の分布を測定し、デコンボリューションによって分解能の高い蛍光画像を取得することができるという利点がある。

また、デコンボリューションを行うための試料画像として、ＰＳＦ形状を測定する際に取得した画像を流用することにすれば、ＰＳＦ形状測定と試料画像取得とを別々に行う必要がなくなり、全体的な画像取得時間を短縮することができるという利点がある。

また、本実施形態においては、第１偏光ビームスプリッタ９の前段にλ／２板８を配置したが、第１偏光ビームスプリッタ９によって第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とに分岐できればよいので、例えば、λ／４板を利用することもできる。また、第２偏光ビームスプリッタ１１の後段にλ／４板１２を配置したが、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とが試料Ｘに照射される際にその偏光が直交するようになっていればよいので、λ／４板１２はなくてもよい。

但し、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２との偏光が直交した状態で自己相関波形を取得するものであるため、式（７）で得られるＰＳＦの断面形状は縦偏光と横偏光の中間である円偏光のものに等しくなる。したがって、試料Ｘの画像を取得する際には円偏光で取得することが望ましい。このため、第２偏光ビームスプリッタ１１の後段のλ／４板１２がない状態でＰＳＦの形状測定を行い、試料Ｘの画像を取得する際にはλ／４板１２を光路に挿入して円偏光とすることが望ましい。

また、本実施形態においては、第２偏光ビームスプリッタ１１、ビーム整形素子１４および走査部４を２組のリレーレンズ１３ａ，１３ｂ、瞳投影レンズ１５および結像レンズ１６によって対物レンズ１７の瞳位置と光学的に共役な位置関係に配置したが、これに代えて、図１０に示されるように、リレーレンズ１３ａ，１３ｂを１組省略し、ビーム整形素子１４を第２偏光ビームスプリッタ１１の直後に配置することにしてもよい。

ビーム整形素子１４は、第２偏光ビームスプリッタ１１および対物レンズ１７の瞳位置と精度よく光学的に共役な位置に配置されていることが好ましいが、第２偏光ビームスプリッタ１１の直近に配置することで、略共役な位置に配置することができる。また、第２偏光ビームスプリッタ１１から異なる角度で射出される第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２との角度差は極めて微量であるため、ビーム整形素子１４をこのように配置しても、第１レーザ光Ｌ１および第２レーザ光Ｌ２のビーム整形素子１４における通過位置のズレを無視できるほど小さくすることができる。
図１０のように構成することで、図１と同様の効果を奏する画像取得装置１の構成を簡略化することができるという利点がある。

また、本実施形態においては、図１１に示されるように、第１偏光ビームスプリッタ９と第２偏光ビームスプリッタ１１との間の第２レーザ光Ｌ２の光路上にデフォーカス素子２６を配置してもよい。デフォーカス素子２６は第２レーザ光Ｌ２を僅かに発散または収束させ、対物レンズ１７で集光される第２レーザ光Ｌ２の集光点を光軸方向に移動（デフォーカス）させるようになっている。デフォーカス素子２６としてはレンズペアあるいは液体レンズなどのアクティブデバイスを採用すればよい。

図１の画像取得装置１では、光軸に直交する方向に２つの集光点の相対走査を行ってＰＳＦ形状を測定するので、光軸に直交する方向に拡がるＰＳＦ形状のみを測定することができる。しかしながら、実際にはＰＳＦは３次元的に拡がっているため、図１１に示される画像取得装置２７のように、２つの集光点を光軸に沿う方向にも相対走査して、自己相関波形を取得して演算することで、３次元的に拡がるＰＳＦ形状も測定することができる。

このようにすることで、デコンボリューションを３次元的に行うことができ、３次元の蛍光画像を取得した場合に、３次元的に空間分解能を向上することができるようになる。この際に、図１の画像取得装置１と同様に、ビーム整形素子１４によってＰＳＦの空間周波数の高周波成分を強調することでより効果を高めることができる。ＰＳＦの３次元画像を作成するには、光軸に直交する平面内で取得したＰＳＦ断面プロファイルと、光軸に沿う方向で取得したＰＳＦ断面プロファイルから、回転処理や補間処理によって３次元画像を取得すればよい。

また、本実施形態においては、図１２に示されるように、ビーム整形素子１４に代えて、空間光変調器（光変調部）２８を配置してもよい。空間光変調器２８は、対物レンズ１７で集光されるレーザ光の集光点の収差を補正するために使用される。まず、空間光変調器２８でレーザ光を変調しない状態で、ＰＳＦ形状を測定する。これにより、取得されたＰＳＦ形状から収差の状態を把握することができる。収差は光学系および試料Ｘの両方に起因するものを含んでいる。この収差が把握された状態で、単一のレーザ光にした状態で、空間光変調器２８で収差が補正されるようにレーザ光の波面を変調し、試料Ｘの蛍光画像を取得すればよい。

このようにすることで、測定されたＰＳＦ形状を基にしてＰＳＦ自体を収差のない形状に補正し、それによって分解能を高めることができる。これにより画像処理が不要となり、空間分解能の高い蛍光画像を取得することができる。

収差の把握に関しては、得られたＰＳＦ形状と共にシミュレーションを用いてもよいし、異なる深さでのＰＳＦ形状を比較してもよい。例えば、試料Ｘ内で生じる収差に関して、試料Ｘの浅い領域および深い領域でＰＳＦ形状を測定する。それらの比較により試料Ｘ内を深い領域に伝搬することで生じる収差を把握することができ、その収差を補正するように空間光変調器２８によるレーザ光の変調によって、深い領域での分解能を向上することができる。

また、空間光変調器２８で収差を補正した状態でＰＳＦ形状の測定と試料Ｘの画像の取得とを行い、取得された試料Ｘの画像を測定されたＰＳＦ形状を用いてデコンボリューションを行うことにより、さらに空間分解能を高めることができるという利点がある。また、ビーム整形素子１４と併用して光学的に高周波成分を強調して更に分解能を向上することもできる。
さらに、空間光変調器２８で収差を補正した状態で、図１１に示されるように、デフォーカス素子２６を用いて３次元的にＰＳＦ形状を測定し、それによって、３次元的に空間分解能を向上することにしてもよい。

また、図１３に示される構造の画像取得装置３４を採用してもよい。
この画像取得装置３４は、第１偏光ビームスプリッタ９に代えて無偏光の第１偏光ビームスプリッタ２９を採用し、該ビームスプリッタ２９で分岐された２つの光路のそれぞれに音響光学素子３０を配置し、さらに、第２偏光ビームスプリッタ１１に代えて無偏光の第２偏光ビームスプリッタ３１を配置している。

また、第２偏光ビームスプリッタ３１を通過したレーザ光を検出する検出器３２を備え、該検出器３２による検出信号に基づいて、光検出器２４により検出された蛍光信号から所定の周波数の信号を復調するロックインアンプ３３を備えている。

２つの音響光学素子３０は、各光路を通過するレーザ光Ｌ１，Ｌ２の時間周波数を別の周波数に僅かに変化させるようになっている。
一般に、異なる周波数のレーザ光が重なった場合に、その周波数の差分の周波数を有するうなりが発生する。

試料Ｘの位置において周波数の異なる第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とが相対位置を変化させながら走査される際においても、その重なり位置において第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２の差の周波数に相当する周波数成分が発生する。よって、ロックインアンプ３３を用いて、その差の周波数を有する信号を復調することにより、重なり位置からの信号のみを抽出することができるようになる。

すなわち、これにより、図３に示される蛍光強度分布からオフセット成分を除去した波形を一度に取得することができる。したがって、上記と同様に処理することにより、図１３の画像取得装置３４においてもＰＳＦ形状を測定して、空間分解能の高い蛍光画像を取得することができる。

このように、図１３に示される画像取得装置１によれば、オフセットを減算する処理を行わずに、直接的に第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２との重なり部分からの蛍光信号を抽出でき、非線形光学過程ではない１光子励起の顕微鏡にも適用できる。また、本実施形態は第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２との重なり位置からの信号取得に特徴を有しているため、上記空間光変調器２８やデフォーカス素子２６を併用することもできる。なお、１光子励起に適用する場合は、図７のステップＳ３４に該当する２乗の処理は不要である。

また、レーザ光のうなりを発生させるためには、合波される２つの偏光が重なっている必要があるため、他の実施形態とは異なり、無偏光のビームスプリッタ２９，３１を使用している。このため、ビーム整形素子１４に向かう方向以外の方向にも合波されたレーザ光が射出されることになるが、このレーザ光もうなり成分を有しているので、この信号を検出器３２によって検出してロックインアンプ３３のリファレンス信号とすることにより、無駄なく利用することができる。

以上、本発明のいくつかの実施形態について説明したが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。
例えば、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とは同じ光源２からのレーザ光を用いて生成していたが、これに代えて別々の光源から発せられたレーザ光を用いてもよい。その場合、２つのレーザ光Ｌ１，Ｌ２の波長は異なっていてもよく、取得されるＰＳＦ形状は２つのレーザ光Ｌ１，Ｌ２のＰＳＦ形状の平均的な形状となる。また、走査部４として２軸のガルバノミラー２１を用いたものを例示したが、ステージ走査によって画像を取得する方式を採用してもよい。

また、上記実施形態においては、２光子励起顕微鏡について説明したが、非線形光学過程を利用した走査型顕微鏡であれば、例えば、ＳＨＧ顕微鏡のような他の方式の顕微鏡についても本発明を適用することができる。

１，２７，３４ 画像取得装置
２ 光源
３ 照明光学系
４ 走査部
５ 検出光学系
１０ 光路長調整光学系（タイミング調整部）
１４ ビーム整形素子（光変調部）
１９ 電動ホルダ（相対位置調節部）
２５ 測定装置
２８ 空間光変調器（光変調部）
Ｓ３ 画像生成ステップ、画像処理ステップ
Ｓ４ 再構成ステップ、画像処理ステップ
Ｓ２３，Ｓ２７ 走査ステップ、検出ステップ
Ｓ３０ 算出ステップ
Ｌ１，Ｌ２ レーザ光（照明光）
Ｘ 試料

Claims (24)

1. 光源から発せられた２つの照明光を走査する走査部と、
   該走査部により走査される２つの前記照明光を試料に照射する照明光学系と、
   該照明光学系により照射される２つの前記照明光の前記試料における相対的な照射位置を変更する相対位置調節部と、
   前記照明光学系により照射された各前記照明光の前記試料における重なり位置において発生した信号光を検出する検出光学系と、
   該検出光学系により検出された前記信号光と、該信号光の検出時における２つの前記照明光の相対的な照射位置とに基づいて点像分布関数を算出する算出部とを備える点像分布関数の測定装置。
2. 前記算出部が、自己相関波形を求めることにより前記点像分布関数を算出する請求項１に記載の点像分布関数の測定装置。
3. 前記照明光学系が、２つの前記照明光の偏光状態を相互に直交するように設定する請求項１または請求項２に記載の点像分布関数の測定装置。
4. 前記信号光が前記照明光の照射によって非線形光学過程で発生する請求項１から請求３のいずれかに記載の点像分布関数の測定装置。
5. 前記照明光が極短パルスレーザ光であり、
   前記信号光が多光子吸収効果によって発生する蛍光である請求項４のいずれかに記載の点像分布関数の測定装置。
6. 前記検出光学系により検出された前記信号光を用いて少なくとも１次元のサイズを有する１以上の信号光画像を取得し、
   前記算出部が、前記信号光画像を用いて前記自己相関波形を算出する請求項２に記載の点像分布関数の測定装置。
7. 前記算出部が、自己相関波形をフーリエ変換することにより前記点像分布関数を算出する請求項２に記載の点像分布関数の測定装置。
8. 前記照明光がパルス状の光であり、
   前記照明光学系が、２つの前記照明光の前記試料への照射タイミングを同時または非同時に切り替えるタイミング調整部を備え、
   前記算出部が、前記タイミング調整部により同時および非同時に切り替えたときにそれぞれ検出された信号光の差分を用いて点像分布関数を算出する請求項１または請求項２に記載の点像分布関数の測定装置。
9. 前記照明光学系が、前記点像分布関数の空間周波数分布において高周波成分が強調されるように前記照明光の空間分布または偏光状態を変調する光変調部を備える請求項１から請求項８のいずれかに記載の点像分布関数の測定装置。
10. 光源から発せられた２つの照明光を、試料における相対的な照射位置を切り替えて、前記試料において走査させる走査ステップと、
    該走査ステップにより照射された各前記照明光の前記試料における重なり位置において発生した信号光を検出する検出ステップと、
    該検出ステップにより検出された前記信号光と、該信号光の検出時における２つの前記照明光の相対的な照射位置とに基づいて点像分布関数を算出する算出ステップとを含む点像分布関数の測定方法。
11. 前記算出ステップが、自己相関波形を求めることにより前記点像分布関数を算出する請求項１０に記載の点像分布関数の測定方法。
12. 前記走査ステップが、２つの前記照明光の偏光状態を相互に直交するように設定して走査させる請求項１０または請求項１１に記載の点像分布関数の測定方法。
13. 前記信号光が前記照明光の照射によって非線形光学過程で発生する請求項１０から請求１２のいずれかに記載の点像分布関数の測定方法。
14. 前記照明光が極短パルスレーザ光であり、
    前記信号光が多光子吸収効果により発生する蛍光である請求項１３に記載の点像分布関数の測定方法。
15. 前記検出ステップが、検出された前記信号光を用いて少なくとも１次元のサイズを有する１以上の信号光画像を取得し、
    前記算出ステップが、前記信号光画像を用いて前記自己相関波形を算出する請求項１１に記載の点像分布関数の測定方法。
16. 前記算出ステップが、自己相関波形をフーリエ変換することにより前記点像分布関数を算出する請求項１１に記載の点像分布関数の測定方法。
17. 前記照明光がパルス状の光であり、
    前記走査ステップが、２つの前記照明光の前記試料への照射タイミングを同時または非同時に切り替えて走査させ、
    前記算出ステップが、前記走査ステップにより同時および非同時に切り替えたときにそれぞれ検出された信号光の差分を用いて点像分布関数を算出する請求項１０または請求項１１に記載の点像分布関数の測定方法。
18. 前記走査ステップが、前記点像分布関数の空間周波数分布において高周波成分が強調されるように前記照明光の空間分布または偏光状態を変調する請求項１０から請求項１７のいずれかに記載の点像分布関数の測定方法。
19. 請求項１から請求項９のいずれかに記載の点像分布関数の測定装置と、
    該測定装置により測定された点像分布関数を用いて前記試料の画像を生成する画像処理部とを備える画像取得装置。
20. 前記画像処理部が、前記走査部により走査された前記光源からの照明光を前記照明光学系によって前記試料に照射し、各照射位置で前記試料において発生した前記信号光を前記検出光学系により検出することにより取得された試料画像を生成し、生成された該試料画像を、前記測定装置により測定された点像分布関数を用いて再構成する請求項１９に記載の画像取得装置。
21. 前記画像処理部が、前記点像分布関数を用いて前記試料画像に対してデコンボリューションを行うことにより前記試料画像を再構成する請求項２０に記載の画像取得装置。
22. 請求項１０から請求項１８のいずれかに記載の測定方法と、
    該測定方法により測定された点像分布関数を用いて試料画像を生成する画像処理ステップを含む画像取得方法。
23. 前記画像処理ステップが、前記光源からの照明光を前記試料において走査させ、各走査位置で前記試料において発生した前記信号光を検出することにより取得された前記試料画像を生成する画像生成ステップと、該画像生成ステップにより生成された前記試料画像を、前記測定方法により測定された点像分布関数を用いて再構成する再構成ステップとを含む請求項２２に記載の画像取得方法。
24. 前記画像処理ステップが、前記点像分布関数を用いて前記試料画像に対してデコンボリューションを行うことにより前記試料画像を再構成する請求項２３に記載の画像取得方法。

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