JP5639029B2

JP5639029B2 - 癌及び乾癬等の血管依存性疾患を処置するための医薬の製造における２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の使用

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Publication number: JP5639029B2
Application number: JP2011219725A
Authority: JP
Inventors: サンチェス、ペドロクエバス; ガリド、アントニオロメロ; プエルト、ローサマリアロサノ; ガリェゴ、ギリェルモヒメネス; ロペス、セラフィンバルベルデ
Original assignee: アムデルマファーマシューティカルズ、エルエルシー
Priority date: 2004-02-17
Filing date: 2011-10-04
Publication date: 2014-12-10
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Description

本発明は、２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸を含有する医薬組成物、並びに強力な細胞増殖、脈管形成（血管依存性疾患）を特徴とする疾患、及び特に癌又は乾癬の場合のように、アポトーシスの減少をさらに有する血管依存性疾患を処置するための医薬の製造におけるその使用に関する。

悪性腫瘍は、制御不能な細胞増殖に加え、それらの正常な腫瘍周辺組織に侵入する能力を特徴とする。腫瘍の侵入は以下の連続的な段階：ａ）腫瘍細胞が細胞外マトリックスのタンパク質に接着する段階、ｂ）細胞外マトリックスのタンパク質が、腫瘍細胞が利用する細胞外の空隙を形成するタンパク分解酵素により分解する段階、ｃ）細胞質膜の新たな部分の合成及び細胞骨格の再組織（ＧｉｅｓｅＡ，ＷｅｓｔｐｈａｌＭ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ１９９６；３９；２３５〜２５２）を必要とする動的且つ複雑な機構により移動（ｍｉｇｒａｔｅ）する段階、により進展した複雑な過程である。正常な腫瘍周辺組織に侵入する腫瘍塊からの細胞は、それらの障害された細胞死の遺伝的プログラムを有し、したがって、移動し腫瘍周辺の無傷の組織に侵入する腫瘍細胞はアポトーシスを免れる（ＭａｒｉａｎｉＩらＣｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ７：２４８０〜２４８９，２００１）。一団となった腫瘍細胞が２から３ｍｍ^３の体積に達すると、腫瘍細胞はこの初期腫瘍の低酸素状態に対抗する大量の血管新生因子を合成し、（ＦｏｌｋｍａｎＪ．Ｎ．ＥｎｇｌＪＭｅｄ２８５：１１８２〜１１８６，１９７１；ＣａｒｍｅｌｉｅｔＰ，ＪａｉｎＲＫ．Ｎａｔｕｒｅ４０７：２４９〜２５７，２０００；ＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓＧＤらＮａｔｕｒｅ４０７：２４２〜２４８，２０００）、腫瘍周辺血管を活性化することにより新たな血管（血管新生）を形成し、腫瘍に侵入して酸素及び栄養を供給し、腫瘍からの代謝産物を除去する。腫瘍が侵入する間に起こる同じ細胞過程（運動性及びアポトーシスの欠如）が腫瘍の血管新生の間に求心的に起こる。したがって、腫瘍細胞及び内皮細胞の侵入能力を抑制することは、腫瘍の拡大の抑制、血管新生の減少及びアポトーシスの促進により腫瘍の増殖を遅らせるはずである。したがって、癌に対する効果的な処置は、移動、血管新生を抑制し、及び正常な細胞中にこれらの作用を生成することなくアポトーシスを増大させることである。

腫瘍学では、臨床進展の様々な段階において、多くの抗腫瘍剤及び抗血管新生剤が存在し（ＢｒｅｍＳ．ＣａｎｃｅｒＣｏｎｔｒｏｌ６：４３６〜４５８，１９９９）、その多くは体が血管新生の正の調節剤の作用に対抗するために用いるペプチドである（ＨａｇｅｒｄｏｒｎＭ，ＢｉｋｆａｌｖｉＡ．ＣｒｉｔＲｅｖＯｎｃＨｅｍａｔ３４：８９〜１１０，２０００）。しかし、これらのペプチドは著しく分子量の低い化合物と比較すると、それらの薬理学上の不便さが明らかである。他方、それらの分子構造に芳香環を含有し、成長因子により誘導される細胞分裂促進作用の抑制剤として作用する種々の合成化合物は、静止細胞又は非腫瘍細胞に対し細胞毒性を有する（ＬｏｚａｎｏＲＭＪＭｏｌＢｉｏｌ２８１：８９９〜９１１５，１９９８）。したがって、無傷な細胞、静止細胞、非腫瘍細胞に対し低毒性の抗腫瘍性、抗血管新生及びアポトーシス促進活性（ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ）を有する化合物を見出すことが依然として求められている。現在、古い医薬について新しい治療上の適用を探索することに非常に大きな関心がある。これとの関連で種々の抗生物質が、ラパマイシン（ＭｏｒｉｃｅＭＣらＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３４６：１７７３〜１７８０，２００２）若しくはネオマイシン（ＣｕｅｖａｓＰ．らＮｅｕｒｏｌＲｅｓ２２４：３８９〜３９１，２００２）の場合のようにそれらの抗菌活性に加え、抗増殖活性を有するか、又はノルフロキサシン（フルオロキノロン）のように抗不安薬として有用である（ＪｏｈｎｓｔｏｎｅＴＢらＮａｔＭｅｄ１０；３１〜３２，２００４）ことが最近証明されている。

乾癬は世界の人口の２〜３％が罹患している血管依存性の慢性疾患であり、アポトーシスによる細胞死の減少を伴う、表皮過形成（ｅｐｉｄｅｒｍｉｃｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、炎症細胞及びＴリンパ球の真皮−表皮浸潤（ｄｅｒｍｏ−ｅｐｉｄｅｒｍｉｃｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）及び非常に明白な脈管形成の進展を特徴とする（ＫｏｃａｋＭらＩｎｔＪＤｅｒｍａｔｏｌ４２：７８９〜７９３，２００３）。現在、乾癬に対する治癒的な処置は存在しない。抗乾癬処置は疾患の広がり及び重度に応じ、局所性又は全身性である。主に用いられる抗乾癬局所療法は種々のタイプのコルチコイドからなるが、これらの化合物の拡張使用は、皮膚萎縮、皮膚線条及び毛細血管拡張症を伴う（ＢａｋｅｒＢＳ，ＦｒｙＬ．Ｃｕｔｉｓ１９９９；６４：３１５〜３１８）。免疫抑制剤による全身性の治療は、非常に重い副作用を伴う（ＷｏｌｉｎａＶ．らＣｌｉｎＲｈｅｕｍａｔｏｌ２００１：２０：４０６〜４１０）。例えば、乾癬の処置に対するシクロスポリンの使用は腎臓毒性（間質性線維症及び尿細管萎縮）、高血圧、低マグネシウム血症、高カルシウム血症及び肝機能障害を生じさせる場合がある（ＴｒａｖｉｓＬ，ＷｅｉｎｂｅｒｇＪＭ．ＤｒｕｇｓｏｆＴｏｄａｙ２００２；３８：８４７〜８６５）。乾癬の処置に対して他の免疫抑制剤、タクロリムス、を常用することは、高血圧、腎臓毒性及び免疫抑制を生じさせる場合がある（ＪｅｇａｓｏｔｈｙＢＶらＡｒｃｈＤｅｒｍａｔｏｌ１９９２；１２８：７８１〜７８５）。最近、タクロリムス免疫抑制剤の局所的適用がマウスの皮膚の発癌を促進することが記載されている（ＮｉｗａＹ，ＴｅｒａｓｈｉｍａＴ，ＳｕｍｉＨ，ＢＪＤｅｒｍａｔｏｌ２００３；１４９；９６０〜９６７）。したがって、最も一般的な抗乾癬化合物に伴うこのような副作用を生成しない新規な効果的な抗乾癬化合物が求められている。

２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸は、２，５−ジヒドロキシ安息香酸の誘導体であり、種々の塩（主にカルシウム、カリウム、及びマグネシウム）の形態に薬理学的に処方されており、安定性を付与する。２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸は７０年代から経口血管刺激薬（ｏｒａｌｖａｓｃｕｌｏｔｒｏｐｉｃｍｅｄｉｃｉｎｅ）として使用されてきた。

２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸は血小板凝集を抑制し、糖尿病性網膜症の患者の毛細血管浸透性及び血液粘性を増大させる（ＢａｙｅｒＪ．らＤｔｓｃｈ．ＭｏｄＷｓｃｈｒ１９８０；４６；１６０〜１６０８；ＢａｎａｒｒｏｃｈＩ．Ｓ．らＯｐｈｔｈａｌｍｉｃＲｅｓ１９８５；１７；１３１〜１３８；ＭｉｃｈａｌＭ，ＧｉｅｓｓｉｎｇｅｒＮ．ＴｈｒｏｍｂＲｅｓ１９８８；５１：５９３〜６０５）。この化合物のヒトにおける代謝及び薬物動態は１９７４年から知られている（ＢｅｎａｋｉｓＡ．らＴｈｅｒａｐｉｅ１９７４；２９；２１１〜２１９）。最近の実験は２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸が、細胞毒性作用を発現することなく、ラット内皮細胞中の酸化窒素シンターゼ［内皮酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）］の内皮のアイソフォームの活性を増大させることを証明した（ＳｕｓｃｈｅｃｋＣ．らＢｔＪＰｈａｒｍａｃｏｌ１９９７；１２２；１５０２〜１５０８）。さらに、２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸は、ヒトのペニス動脈の生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）弛緩を可能にする（ＡｎｇｕｌｏＪらＢｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ２００３；１３９：８５４〜８６２）。２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸（カルシウム又はマグネシウム塩として処方されている）が生体外抗酸化活性を有することの実験的証拠が存在する（ＢｒｕｎｅｔＪらＦｕｎｄａｍＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌ１２；２０５〜２１２，１９９８）。

本発明は２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸及び／又はその塩の新規な活性の発見に基づき、それらの抗増殖、抗移動、抗血管新生及び非静止細胞におけるアポトーシス促進能に関係し、組み合わせた活性は、非腫瘍の無傷な細胞又は静止細胞に対する毒性の原因となることなく、アポトーシスによる細胞死の欠損を伴う高増殖性、細胞侵入及び過度の血管新生により特徴的な癌等の血管依存性疾患を処置するための有用な化合物としてそれらを使用することが正当であることを示す。グリオーマ（ｇｌｉｏｍａｓ）は顕著な血管新生能を有し、及び顕著にアポトーシスが欠損した非常に侵入性の腫瘍であるため、グリオミック（Ｇｌｉｏｍｉｃ）腫瘍細胞が実験に用いられてきた（ＭｅｒｚａｋＡ，ＰｉｋｉｎｇｔｏｎＧＪ．ＣａｎｃｅｒＭｅｔａｓｔａｓｉｓＲｅｖ１６：１５５〜１７７，１９９７）。

本発明はまた、２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸及び／又はその塩が、組み合わされた形態において、抗増殖、抗血管新生及びアポトーシス促進作用を有し、したがって、その治療上の有効性が高増殖、急性真皮血管新生及びアポトーシス欠損により特徴的な慢性の乾癬性斑において評価されたという証明された事実に基づいている（ＫａｒａｓｅｋＭＡ，Ｃｕｔｉｓ６４：３１９〜３２２，１９９９）。

本発明は、癌及び他の血管依存性疾患に対する新規な処置の探索に関し、２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸及び／又はその塩が成長及び移動を抑制し、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）により誘導される生体内（ｉｎｖｉｖｏ）血管新生を抑制する能力と同様に、生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するそれらの能力を証明したという事実に基づいている。したがって、これらの能力の組合せにより、上述の化合物が他の重い脈管形成関連疾患（血管依存性疾患）の処置に対するのと同様に、悪性腫瘍及び血液学的新生疾患の処置に対して有用となる。

塩の形態で製剤化された２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸は下記の分子式：

式中、Ｍｅｔ＝金属であり、ｎは塩において用いられる金属原子価の関数である。一般にｎは先の塩の金属カチオン、一価（Ｋ）又は二価（Ｃａ又はＭｇ）に対応する０、１又は２である、による市販品（例えば、カリウム塩はＭｅｒｃｋＦａｒｍａｙＱｕｉｍｉｃａＳＡ，Ｍｏｌｌｅｔｄｅｌｖａｌｌｅｓ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａで入手可能である）である。

４８時間処理後のＣ６細胞培養物における２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカルシウム塩（Ａ）及びカリウム塩（Ｂ）の種々の濃度による処理の抗増殖作用を示すヒストグラムである。縦軸：５９５ｎｍにおける吸光度；横軸：μＭ。パネルＡは４８時間後のＣ６細胞の対照培養物の外観を示す。パネルＢは５０μＭの２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸（カルシウム塩）により４８時間処理したＣ６細胞の培養物の画像を示す。パネルＣは１００μＭの２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカリウム塩により４８時間処理したＣ６の培養物を示す。２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の抗増殖作用が壊死（白いヒストグラム）によるものでなくアポトーシス（線の入ったヒストグラム）によることが観測される代表的なヒストグラムである。Ａ：２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカルシウム塩による処理。Ｂ：２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカリウム塩による処理。縦軸：４０５ｎｍにおける吸光度；横軸：時間（単位：時間）。アポトーシス細胞のｉｎｓｉｔｕ検出のためのＴＵＮＥＬ法により処理したグリオミックＣ６細胞の画像である。アポトーシス核を暗色で示し、非アポトーシス細胞の細胞の核及び細胞質を明色で示す。矢印はアポトーシス核を示す。Ａ及びＢは対照細胞、Ｃ及びＤは２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸で処理した細胞である。Ｂ及びＤの写真はそれぞれＡ及びＣの写真の枠部分を拡大した写真に相当する。種々の細胞増殖抑制化合物、Ａ）シスプラチン（５μｇ／ｍｌ）；Ｂ）ビンクリスチン（０．１μｇ／ｍｌ）；Ｃ）パクリタキセル（５μｇ／ｍｌ）及びＤ）５−フルオロウラシル（１００μｇ／ｍｌ）を用いた２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の化学療法の増強作用（抗増殖作用として評価する）を示すヒストグラムである。縦軸：５９５ｎｍにおける吸光度；横軸：白いヒストグラム（対照）、ドットが付されたヒストグラム（細胞増殖抑制薬；第１日）、線の入ったヒストグラム（２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸＋細胞増殖抑制薬；第１日）、方形ヒストグラム（２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸（０日）＋細胞増殖抑制薬；第１日）。対照実験及び細胞を２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸により処理した他の実験（Ｂ）における細胞移動の写真画像である。対照細胞は培養中に傷害された細胞を完全に再生し、一方、２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸により処理された細胞の細胞移動は培養物の傷害された領域を完全に被覆することができない。水平線は培養中になされた初期の長手方向の傷害を画定する。対照培養物（白いヒストグラム）におけるＣ６細胞の移動能力及び２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸により処理した培養物（黒いヒストグラム）におけるＣ６細胞の移動能力を示すヒストグラムである。移動能力は再生のパーセント（培養物中になされた長手方向の傷害の被覆された領域のパーセント）として（縦軸）に示されている。１７日間のインキュベーションによる２羽のニワトリの胚の画像である。パネルＡは３μｇのｂＦＧＦ＋０．１％のヘパリンにより処理された胚に相当する。パネルＢは３μｇのｂＦＧＦ＋０．１％のヘパリン＋１００μＭの２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカリウム塩により処理された胚の外観を示す。パネルＡは、該物質の放出媒体として使用されたニトロセルロースディスクはほとんど血管がないように見えることから２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の抗血管新生作用を示す。左肘の後部領域に位置する過角化症の乾癬性斑の画像である。画像Ａは処置を始める前の乾癬性斑の外観である。画像Ｂは、活性成分として２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカリウム塩を５％含有するクリームによる６日間の処置後の同じ斑の外観である。画像Ｃは、５％の２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカリウム塩により２週間処置した後の乾癬性斑の外観を示す。画像に示した数字は、写真を撮った日に対応する。

２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の新規な生物活性は、どの塩により処方された２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸も細胞増殖、移動及び血管新生の抑制において同様の作用を有するため、ベンゼン環に結合するカチオンには依存しない。本発明はカリウム及びカルシウム塩として処方された２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の活性のみを記載するが、該化合物のいかなる薬学上許容される塩も本発明の範囲内である。用語「薬学上許容される塩」は、製剤形態として用いることのできる金属塩又は付加塩を含む。２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の薬学上許容される塩は有機又は無機の酸又は塩基から、適当な酸又は塩基と該化合物とを反応させることによる従来の方法により得ることができる。

２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸を含有する医薬組成物は、例えば全身性、経口、非経口、尿道、直腸又は局所性投与の、適当などの投与形態において存在していてもよく、それに対し必要な薬学上許容される賦形剤は所望の投与形態の製剤に含まれる。

以下の実施例は本発明を説明し支持するが、本発明の範囲を限定するものと理解すべきではない。

（例１）
２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の抗増殖能を示す試験
この生体外の検討はラットのグリオミック細胞（Ｃ６系）を用いた、異なる３つの３重の実験において行った。該細胞は、ＤＭＥＭＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＰａｉｓｌｅｙＵＫ）、７．５％の胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）１０単位／ｍｌのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）及び１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）よりなる培地中で培養した。培養は湿潤雰囲気中で３７℃に維持した。細胞増殖に対する２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の作用を評価するために、ウェル当たり２×１０^４個のＣ６細胞を２４ウェル（直径１５ｍｍ）プレートに播種した。実験培養物は該化合物（２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカルシウム又はカリウム塩）の種々のマイクロモル濃度（μＭ）により４８時間処理した。対照の培養物は、該化合物を添加することなしに４８時間存続した。培養物の写真は倒立顕微鏡を用い４８時間後に撮影し、次に培養物をクリスタルバイオレット（ＭｅｒｋＦａｒｍａｙＱｕｉｍｉｃａＳＡ．ＭｏｌｌｅｔｄｅｌＶａｌｌｅｓ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ）により着色し、及びスペクトル測光法を用い、ウェル当たりの細胞数を測定した。図１に示すように、種々の濃度の該化合物による処理は細胞増殖の用量依存的抑制を示し、濃度１００μＭの２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカルシウム塩により８８％抑制される（Ａ）。同濃度の２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカリウム塩により７４％抑制された（Ｂ）。ＩＣ_５０はカルシウム塩について２５μＭ付近及びカリウム塩について４０から５０μＭの間である。図１Ａと図１Ｂを比較すると、該化合物のカルシウム塩による処理後と同じパーセントの細胞増殖を抑制することが観察され、同じ効果を得るためには２倍濃度のカリウム塩が必要である。このことは該化合物のカルシウム塩が水溶液中で塩から分離する２個の活性原理分子（２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸）を含有するという事実による。図２は、処理を行わない４８時間後のＣ６細胞の培養物の画像（Ａ）、濃度５０μＭの２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカルシウム塩により４８時間処理したＣ６細胞の培養物に相当する別の画像（Ｂ）、及び３番目は濃度１００μＭの該酸のカリウム塩により４８時間処理したＣ６細胞の培養物に相当する画像（Ｃ）を示す。この検討は該化合物による処理が新生物細胞における増殖を抑制することを示し、マイトジェン因子により生体外で刺激された正常な血管平滑筋細胞において観察される該化合物の抗増殖作用を裏付ける（Ｐａｒｅｓ−ＨｅｒｂｕｔｅＮらＩｎｔＪＡｎｇｉｏｌ８：Ｓ５〜Ｓ１０，１９９９）。２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の抗増殖活性が細胞毒性又はアポトーシス促進作用のいずれにより媒介されるかを識別するために、本発明者等は以下の例において詳述する、種々の実験を行った。

（例２）
２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のアポトーシス促進能を示す試験
この分析は例１に記載された操作に従いＣ６細胞を用いて行った。分析した化合物のアポトーシス促進作用を示すために、本発明者等はＤＮＡの細胞内分解及びｉｎｓｉｔｕのアポトーシス核を検出する２つの異なる方法を用いた。

ＤＮＡの細胞内分解の検出
ヒストンに関連するＤＮＡ断片を定量する酵素免疫測定法は、アポトーシスの発現を測定するのに適していると考えることができる（ＡｒａｇａｎｅＹらＪＣｅｌｌＢｉｏｌ１９９８；１４０：１７１〜１８２）。この方法は、壊死においては細胞質膜が分解し、培養媒体中にＤＮＡが出現するのに対し、アポトーシスでは細胞膜が無傷で残るため分解されたＤＮＡが細胞内に残ることから、壊死による死とアポトーシスによる死を区別することができる（ＡｒａｇａｎｅＹらＪＣｅｌｌＢｉｏｌ１４０：１７１〜１８２，１９９８）。

細胞死検出ＥＬＩＳＡ^ｐｌｕｓキット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造元の指示に従って使用し、本発明者等は４、１６、２４及び４８時間におけるＣ６（２×１０^３）細胞培養物中のＤＮＡの分解を測定した。対照の培養物は処理を施さなかったが、５０から２００μＭ（図３Ａ）の２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカリウム塩を実験培養物に添加した。また、２５から１００μＭの２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカルシウム塩を添加する実験を行った（図３Ｂ）。すべての実験は異なる３つの実験において３重測定により行った。

図３Ａ及び図３Ｂは以下の事項を示す：ａ）２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の抗増殖作用は主にアポトーシス促進活性により媒介される、ｂ）該化合物のカルシウム又はカリウム塩を用いるアポトーシス促進作用が同様であることから、分子に結合したカチオンは該化合物の活性を決定しない、ｃ）最大のアポトーシス促進作用は該化合物により４８時間処理した細胞において得られる、ｄ）最大の効果はカルシウム塩に対して２５μＭ及びカリウム塩に対して５０μＭの濃度により得られ、細胞増殖の検討におけるＩＣ_５０に一致する。細胞死に関与する２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の抗増殖機構がアポトーシスによることが証明され、本発明者等は以下の方法を用い、かかる作用をグリオミック細胞の顕微鏡による検討により定量的に評価した。

アポトーシス核のｉｎｓｉｔｕ検出（ＴＵＮＥＬ法）
３つの独立した実験を３回繰り返した。対照の培養物からのＣ６細胞及び（それぞれ５０μＭ及び１００μＭのカルシウム及びカリウム塩）により２４時間処理した培養物からのＣ６細胞をガラススライドに付着させ、４％のパラホルムアルデヒドの緩衝溶液（ｐＨ７．４）により実験室の温度で１時間固定し、その後細胞を洗浄し、０．１％のトリトンＸ−１００溶液により透過性とした。次にＴＵＮＥＬ法［（末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）−媒介ｄＵＴＰニック及びラベリング（ＧａｖｒｉｅｌｉＹ，ＳｈｅｒｍａｎＹ，ＢｅｎｓａｓｓｏｎＳＡ．ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ１１９：４９３〜５０１，１９９２））を適用する前に細胞を洗浄した。アポトーシス核のｉｎｓｉｔｕ検出のためのキット（ＩｎｓｉｔｕＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。該方法の種々の段階はキットの製造元の指示に従った。最終的に細胞を緑色光（ｇｒｅｅｎｌｉｇｈｔ）により染色した（Ｆｌｕｋａ，ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。ＴＵＮＥＬ反応はアポトーシス核においてのみ起こる。

非常に類似した結果が該化合物のカルシウム及びカリウム塩により得られるが、本発明の対象である該化合物のカリウム塩により得られた結果のみを示す。細胞は、６個の対照培養物及び２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸（１００μＭ）により処理した６個の培養物からの細胞を付着させた１２個のスライドにおける異なる６領域において計測した。非アポトーシス及びアポトーシス細胞の総数を以下に示す：

処理細胞の総数は該化合物の抗増殖作用により対照細胞の総数より少ない。

図４の画像はＴＵＮＥＬ法を用いた、対照培養物の実験領域（Ａ及びＢ）と該化合物により処理した別の培養物の実験領域（Ｃ及びＤ）を示す。画像に示すように、対照細胞において２個のみのアポトーシス核が観察されるのに対し、本発明の対象である該化合物により処理した細胞においては、１０７個のアポトーシス核と８個のみの正常核（非アポトーシス）が存在する。

これらのデータは、２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸が腫瘍のアポトーシスの誘導に有用な重要なアポトーシス促進活性を有する化合物であることを示す。２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸が正常なヒト細胞におけるアポトーシスを抑制することが証明されている（ＢｒａｂｅｒＲ，ＦａｒｉｎｅＪＣ，ＬｏｒａＧＡ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ４：４１１１〜４９，１９９８）ので、この化合物は癌の処置に対する有力な分子候補である。

化学療法及び放射線療法の治療不成功に関与するメカニズムの１つは、アポトーシスにより細胞死を誘導するこれらの処置が、主に腫瘍細胞中に抗アポトーシスタンパク質を高発現することにより効果を奏さないことである（ＳｅｌｌｅｒｓＷＲ，ＦｉｓｈｅｒＤＥ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ１０４：１６５５〜１６６１，１９９９；ＢｒａｎｃｈＰ．らＯｎｃｏｇｅｎｅ１９：３１３８〜３１４５，２０００）。したがって、アポトーシス促進化合物は化学療法及び放射線療法の処置における補助薬として臨床的に大いに使用することができる。

２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のアポトーシス促進作用が示されると、本発明者等は種々の細胞増殖抑制薬の抗増殖作用を増大させるためにこの化合物の性能を評価した。以下の例は２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸が、シスプラチン、ビンクリスチン、パクリタキセル、５−フルオロウラシル等の腫瘍学において用いられる種々の細胞増殖抑制化合物の治療効果をいかに増大させ得るかを示す。

（例３）
化学療法の増強作用における２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の能力を示す試験
本発明者等はこの検討のために、例１に記載の条件と同じ条件で生体外で培養したＣ６細胞を用いた。ウェル当たり１×１０^３個のＣ６細胞を２４ウェルプレートで培養した。３タイプの処理を行った：ａ）播種後２４時間、細胞を以下の医薬；シスプラチン（５μｇ／ｍｌ）、ビンクリスチン（０．１μｇ／ｍｌ）、パクリタキセル（５μｇ／ｍｌ）及び５−フルオロウラシル（１００μｇ／ｍｌ）の１つでそれぞれ処理する；ｂ）播種後２４時間、２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸（カリウム塩、１００μＭ）及び以下の医薬；シスプラチン（５μｇ／ｍｌ）、ビンクリスチン（０．１μｇ／ｍｌ）、パクリタキセル（５μｇ／ｍｌ）及び５−フルオロウラシル（１００μｇ／ｍｌ）の１つで一緒に処理する；ｃ）播種時（０日）に、細胞を２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸（カリウム塩、１００μＭ）により前処理した。翌日、培養物を以下の医薬；シスプラチン（５μｇ／ｍｌ）、ビンクリスチン（０．１μｇ／ｍｌ）、パクリタキセル（５μｇ／ｍｌ）及び５−フルオロウラシル（１００μｇ／ｍｌ）の１つによってさらに処理した。対照の培養物は２日間の処理を施さなかった。４８時間（２日）後、例１に使用された細胞と同一の形態の細胞をすべての培養物において評価した。この検討は３重の独立した実験において３回繰り返した。

図５（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）は種々の細胞増殖抑制薬の増強作用における２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の効果を評価するために行った実験のヒストグラムを示す。シスプラチン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシルによる処理はＣ６細胞の増殖を５０％抑制し、一方、パクリタキセルによる処理は細胞増殖を６７％抑制する。２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸＋細胞増殖抑制薬（シスプラチン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル）の併用処理は細胞増殖を８４％抑制する。２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸＋パクリタキセルによる併用処理は細胞増殖を８６％抑制する。細胞培養物を２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸で前処理し、その後以下の細胞増殖抑制薬：シスプラチン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシルにより前処理する場合、細胞増殖を９０％抑制する。パクリタキセルを用いると、細胞増殖の抑制は９２％に達する。

上記の結果は、２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸と化学療法剤を同時に処理することにより、その治療効果が増大し、その上この化学的増強効果は細胞を２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸により前処理したときにより高い。これらのデータは化学療法及び放射線療法に関連する処置における補助薬としての２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の使用を支持する。

（例４）
２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の抗移動能を示す試験
分析は３つの異なる３重の実験において行った。細胞移動の抑制についての２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の能力を評価するために、２０ｍｍのプレートにおいて生体外で培養した２×１０^５個のＣ６細胞を用いた。対照の培養物に対し及び１００μＭの２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカリウム塩を用いて処理した培養物において無菌マイクロピペットを用い、長手方向に傷害した（０日）。蛍光顕微鏡（ｌｕｍｉｎａｏｕｓｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）に接続した写真システムを用いてデジタル写真を撮影し、傷害領域をコンピュータ形態プログラム（Ｍｏｔｉｃａｍ．Ｍｏｔｉｃ．Ｂａｒｃｅｌｏｎａ）を用いて画定した。２４時間後再度写真を撮影し、傷害の境界を最初の２枚の写真（０日）とそれらの２４時間後に得られた写真とを重ねて記録し、細胞の移動により被覆された傷害領域のパーセントを計算した。これらの値を処理により得られた再生のパーセントとして表した。図６は対照実験（Ａ）及び細胞を本発明の対象である化合物により２４時間処理した他の実験（Ｂ）の代表例を示す。この図において観察されるように、非処理細胞は傷害を完全に再生する（図６Ａ）が、該化合物により処理した細胞は移動して傷害のすべての領域を被覆することができない（図６Ｂ）。すべての実験のパーセントデータを示す図７は、２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸が腫瘍細胞の移動を６４％まで抑制することを示す。

（例５）
２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の抗血管再生能を示す試験
この分析のために、本発明者等は生体内の抗血管再生物質の活性試験用に胎児の絨毛尿膜を用いた（ＺｉｌｂｅｒｂｅｒｇＬ．らＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２００３；２７８：３５５６４〜３５５７３）。本発明者等は線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の基本的形態である、血管再生促進化合物を用いた（ＭｅｇｈｎａＵらＢｌｏｏｄ２００３；１０２：２１０８〜２１１４）。

受精卵をインキュベーター中に３７℃、湿度８０％で保管する。４日後、卵殻の最も狭い端部に孔を開け、１ｍｌのアルブミンを採取する。次いで、孔をパラフィンフィルム（ＰａｒａｆｉｌｍＭＬａｂｏｒａｔｏｒｙＦｉｌｍＣｈｉｃａｇｏＩＬ．ＵＳＡ）で覆う。この操作は、胚が殻の上部に付着するのを妨げる空気室を形成する。インキュベーションの１３日目に、空気室における殻を割り、処理を行う。２０の胚を、ニトロセルロースペーパーディスクに染み込ませた、３μｇのｂＦＧＦ＋０．１％のヘパリンの溶液５μｌにより処理する。その後、殻をパラフィンフィルムで密封する。翌日、半数の胚（ｎ＝１０）において、殻の覆いを除き、生理的食塩水（５μｌ）に溶解した１００μＭの２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカリウム塩を有するニトロセルロースペーパーディスクを再度浸漬する。次に殻の孔を再度パラフィンフィルムで覆う。実験を終了する１７日目に、比較検討のためニトロセルロース片を写真撮影する。

図８は３μｇのｂＦＧＦ＋０．１％のヘパリンにより処理した胚（Ａ）及び翌日に１００μＭの２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカリウム塩溶液を添加した別の胚（Ｂ）に相当する２つの画像を示し、画像Ａはニトロセルロースディスクが血管によりどの程度侵入されるかを示し、一方、画像Ｂはディスク内の非常に少ない血管侵入を示す。コンピュータシステム（ＭｏｔｉｃａｍＭｏｔｉｃ．Ｂａｒｅｌｏｎａ）を用いたニトロセルロースディスクの画像の形態定量は、該化合物の抗血管新生作用（ｂＦＧＦ＋ヘパリンにより処理した胚中の血管により被覆されたディスクの領域＝３５±８．６％対ｂＦＧＦ＋ヘパリン＋２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカリウム塩により処理した胚中の血管により被覆されたディスクの領域＝２±１．５％；ｐ＜０．０００１；ｕｎｐａｉｒｅｄｓｔｕｄｅｎｔｔ検定）を示す。５０μＭの該化合物のカルシウム塩を用いて同様の結果を得た。この実験は、本発明の対象である該化合物がｂＦＧＦにより誘導された血管新生作用を中和し得る抗血管新生活性を有することを示す。

（例６）
乾癬性傷害における試験
本発明者等はこの検討のために、皮膚疾患の局所的処置として通常の手段であるこの型の製剤用のクリーム中に２．５及び５％で処方した２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカリウム塩を用いた。２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸の塩の選択された濃度は、糖尿病性網膜症の処置に用いる濃度範囲内：１日当たり６錠の５００ｍｇの２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸カルシウム塩である（ＢｅｎａｋｉｓＡらＴｈｅｒａｐｉｅ１９７４；２９：２１１〜２１９）。本発明者等はクリームの水相として蒸留水を用いた。脂肪相はセチルアルコール、ステアリックアルコール又はワセリンにより構成することができる。スパンはクリームの調製において効果的な乳化剤である。製品の両方の製剤（２．５及び５％）は臨床的に効果的であることを示すが、最も大きい治療上の利点は５％の濃度により得られる。したがって、本発明者等はクリーム中に５％で処方された該酸により得られた結果を示す。以下の例は乾癬の局所的処置のための効果的なクリームを示すが、この例によって本発明の範囲を限定するものではない。
Ｉ．活性部分（５．６％の２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカリウム塩）、
ＩＩ．不活性部分（賦形剤としてセチルアルコール（２．５％）、ステアリルアルコール（２．５％）、液体ワセリン（３０％）、白色ソフトパラフィン（２０％）、ソルビタンオレアート（５％）及び蒸留水（ｃ．ｓ．ｐ．１００ｇ））。

該処置の臨床的有効性は、以下の評価：（０）なし；（１）軽度；（２）中等度及び（３）重度を割り振る、落屑兆候（Ｄ）、紅斑（Ｅ）及び浸入（Ｉ）を定量する指標により評価した（ＦｒｅｅｍａｎＡＫらＪＡｍ．ＡｃａｄＤｅｒｍａｔ２００３；４８：５６４〜５６８）。図９は３つの画像：処置前、５％の２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカリウム塩により処置した左肘の伸展領域に位置する同じ慢性の乾癬斑の処置後６日及び１３日を示す。観察できるように、２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカリウム塩を含有するクリームによる１日２回の局所的な処置が、過角化症（ｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｓｉｓ）のほとんど全面的な消失による斑の早期（６日）の非常に顕著な「除去」をもたらす。処置の第２週の終わりにクリームの治療効果がより明らかとなる。かかる処置はＤＥＩ指標（ＤＥＩ全体の前処置＝６±１．５７対ＤＥＩ全体の後処置＝１±０．５８；ｐ＜０．０００１；ｕｎｐａｉｒｅｄｓｔｕｄｅｎｔｔ検定）の全体の値の顕著な減少をもたらす。

Claims

２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸又はその薬学上許容されるいずれかの塩を含有する、血管新生の局所的抑制のための局所的医薬組成物。
薬学上許容される塩が、２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカリウム塩であることを特徴とする、請求項１に記載の局所的医薬組成物。
薬学上許容される塩が、２，５−ジヒドロキシベンゼンスルホン酸のカルシウム塩であることを特徴とする、請求項１に記載の局所的医薬組成物。
適切な量の少なくとも１種の薬学上許容される賦形剤をさらに含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の局所的医薬組成物。