JP4589106B2 - 母体血由来の胎児細胞を同定し濃化するための胎児細胞マーカーとしての母体抗体 - Google Patents
母体血由来の胎児細胞を同定し濃化するための胎児細胞マーカーとしての母体抗体 Download PDFInfo
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Description
Douglasら、Am.J.Obstet.Gynec.78、960-973、1959 Schroder、J.Med Genet.12、230-242、1975 J.Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning、John Wiley and Sons(1984) J.Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989) T.A.Brown(編集者)、Essential Molecular Biology:A Practical Approach、1および2巻、IRL Press(1991) D.M.GloverおよびB.D.Hames(編集者)、DNA Cloning:A Practical Approach、1-4巻、IRL Press(1995および1996) F.M.Ausubelら(編集者)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub.AssociatesおよびWiley-Interscience(1988、現在までのすべての最新内容を含む) Ed HarlowおよびDavid Lane(編集者)Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory、(1988) J.E.Coliganら(編集者)、Current Protocols in Immunology、John Wiley & Sons(現在までのすべての最新内容を含む) Hoffmanら、(Proteomics 1、807-818、2001) Tsangら、J.Immunol.Methods 138、291-299、1991
本明細書に包含されている文書、法令、物質、装置、品物などについてのいかなる議論も、本発明の状況を提供することを単に目的とする。これらの事柄のなにものもまたはすべてが従来技術基盤の一部を形成するかまたは、本出願の各請求項の優先日以前に存在していた本発明関連分野に共通する一般知識であったとは認められない。
本発明の1つの実施形態では、母体血に存在する胎児細胞を同定かつ/また濃化するための方法を提供するものであって、この母体血に存在する胎児細胞-母体抗体複合体を同定または回収するものである。
母体末梢血由来の胎児細胞の同定および/または回収および/または単離もまた、母体血由来の細胞を、母体血漿の抗体含有分画と、暫時母体抗体が結合した胎児細胞複合体が十分形成できる条件下で接触させることを含むプロセスにより実施される。たとえば、胎児細胞に結合した抗-(HLA抗原)-Igを含む複合体が形成される。
i)末梢血単核細胞をサンプルから単離し、
ii)i)からの細胞を、父由来胎児抗原に特異的な母体産生抗体が胎児細胞と十分に結合できる条件下で、母体血漿サンプルからの抗体と接触させ、
iii)ii)からの複合細胞を、母体抗体と複合体を形成できる物質と接触させ、
iv)物質-母体抗体複合体に結合した細胞を回収する。
本明細書で使用されるように、用語「母体血サンプル」は、母体抗体および胎児細胞を含む任意の血液サンプルを意味すると解釈される。
1.汎用技法
母体抗体を、当技術分野に公知の任意の技法を使用して、母体血から単離するかまたは部分精製するか、あるいは精製して他のタンパクを除くこととする。この手法は、本発明の方法のどの段階でも行われる。好ましくは、有核細胞および母体抗体を、母体血漿とは別個に調製し、再び混合して胎児細胞を単離するための免疫複合体を作る。
プロテインAおよび/またはプロテインG親和性クロマトグラフィーはIgGを単離するのに好ましく使用される。親和性リガンドを付着させるマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースまたはセファロース(ファーマシア、スウェーデン)であるが、他のマトリックスも利用可能である。たとえば、被制御細孔ガラスまたはポリ(スチレンジビニル)ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成できるよりも早い流速およびより短い処理時間を可能にする。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース(商標)でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラムなど)、クロマトフォーカシング、SDS-PAGEおよび硫酸アンモニウム沈殿などの抗体精製のための他の技法もまたこの状況に有用である。
抗原反応性抗体(すなわち、胎児細胞表面に存在する父方抗原に対する母体抗体に結合する抗体)を、好ましくは可溶性HLA抗原および/または抗イディオタイプ抗体との複合体から解離させて調製する。
好ましくは、父由来胎児抗原に特異的な、母体産生抗体を本発明の方法に適用する前に濃化する。1つの実施形態では、単離された母体抗体を、たとえば、固体支持体に結合したHLA抗原の大パネルにさらす。既知のHLA抗原を結合する抗体を、HLA抗原を結合しない抗体から分離する。母方HLA抗原を結合する母体抗体は、もし存在するとしても、それは極わずかで、これが起こりうる可能性はかなり低いので、その結果、結合するHLA 抗体の大半は、父由来のHLA抗原に特異的である。
母体抗体が結合した胎児細胞複合体は、容易に検出可能なおよび/または容易に単離可能な物質、たとえば、二次抗体、抗体断片、またはヒト抗体に結合する他の分子などの物質(たとえば、ヤギの抗ヒトIgまたはIgMまたはIgGに結合するポリペプチド、たとえば、プロテインA、プロテインGおよびプロテインLからなる群から選択されるポリペプチドなど)を使用して同定される。
母体抗体と結合する物質は、検出可能な信号(たとえば、蛍光標識、色素札、放射性標識、常磁性粒子、化学発光標識、ビオチン、ストレプトアビジンまたは二次的、酵素的または結合工程によって検出される標識)を提供することができる単離可能または検出可能な標識と結合または接合する。
母体抗体に結合した胎児細胞は、母体血サンプルから直接回収するかまたは母体抗体の調製物と母体血または母体血の細胞分画(たとえば、PBMC分画)とをex vivoで結合させた後に回収する。母体抗体および標識された物質が結合した胎児細胞を、標識で選別する方法で区分され単離される。
胎児細胞の回収または検出は、母体血サンプル中にある母体細胞または母体細胞型が減少することで増進または助長されてもよい。この減少は、母体抗体が結合した胎児細胞と物質とが接触する工程とこの物質-抗体-胎児細胞の複合体を回収する工程の前、中、または後で行う。当業者なら、母体血中の母体細胞型には、赤血球、B細胞、T細胞、単核細胞、マクロファージ、および樹状細胞が含まれることを知っている。この点で、母体抗体もまた、循環中に母体細胞の亜細胞集団と複合または結合し得るので、これによって、ex vivoで母体血中の胎児細胞との複合に使用される母体抗体の利用可能性が減少する。本発明は明らかに、母体血漿または母体血漿の抗体あるいは抗体含有分画の単離の前、中、または後に行われる補助的工程を包含し、ここでは、このような工程により、母体細胞と胎児細胞集団が物理的に分離され、母体細胞集団が減少し、少なくとも1種の母体細胞型の母体細胞が減少し、または分析中に胎児細胞から母体細胞が識別される。
場合によっては、胎児細胞をin vivoで母体血漿にさらしている間に胎児細胞に付着する母体抗体は、マスキングされるかまたは別の方法で、物質との結合および、物質に結合する標識を使用するその後の単離または検出に利用できないこともある。このマスキングは、たとえば、母方の免疫攻撃から胎児細胞を防御するというまだ解明されていないメカニズムにより生じる。たとえば、血漿抗体は、二次、抗イディオタイプ抗体または可溶性HLA抗原と複合することによりマスキングされるかまたは失活され得る。
好ましくは、本明細書に記載の任意の実施形態、具体的には、前記記載の任意の実施形態による本発明の方法は、胎児細胞を分泌させるために、母体抗体の結合した胎児細胞複合体を、好ましくは破壊することにより、胎児細胞を母体抗体から単離することをさらに包含する。好ましくは、この分泌された胎児細胞は、生存可能な胎児細胞である。特に好ましい実施形態では、胎児細胞をin vitroで暫時、遺伝疾患または遺伝疾患にかかりやすい体質の診断または胎児細胞の核型診断に使用されるに十分な条件下で培養する。
本明細書に記載したように調製した単離された胎児細胞は、たとえば羊水穿刺かまたは絨毛膜絨毛サンプリングなどの公知の侵襲手法によって取得した胎児細胞を使用して行うことができる任意および全出生前診断テストに適切に使用される。本発明は明らかに、本明細書に記載された任意の実施形態に従って産生された単離または培養された胎児細胞の、たとえば胎児における遺伝的疾患または遺伝的疾患にかかりやすい体質を決定するための薬剤への使用を提供する。当業者に公知の診断手法は、慣用的にスクリーニングされる多くの遺伝的疾患、たとえば、ダウン症、トリソミー18、トリソミー13、鎌状赤血球貧血、21-ヒドロキシラーゼ欠損症、嚢腫性線維化症などの内の1つまたは複数の疾患を決定するために本発明の方法で単離した胎児細胞で行うことができる。
5人の妊婦から血液サンプル(10ml)を取得した。在胎齢は10〜14週にわたり、胎児の性別および状態は未確認であった。血液サンプルを下記のように処理した。
IgGおよびIgMの親和性捕捉
母体血から単離した血漿をまず清澄させ(10,000gで遠心分離して、0.45μmのろ紙によってろ過する)、プロテインAまたはプロテインGカラム(Amersham Biosciences)を通過させて、全ヒトIgGを結合する。同時に、清澄させた母体血をKaptiv-M(商標)セファロースカラム(Interchim)またはマニン(mannin)結合タンパク(MBP)セファロースカラム(Nevensら、J.Chromatogr.597、247-256、1992;Pierce)を通過させて、全IgM(Sisson and Castor、J.Immunol.Methods 127、215-220、1990)を結合させる。すべての工程を約4℃で行う。
母体血から単離した血漿を、まず清澄させ(10,000gで遠心分離して、0.45μmのろ紙によってろ過する)、次にカプリル酸で処理して、Igおよび数種のα2マクログロブリンに悪影響を与えずに大量の血漿タンパクを沈殿させる。
母体血から単離した血漿をまず清澄させ(10,000gで遠心分離して、0.45μmのろ紙によってろ過する)、カプリル酸で処理してIgおよび数種のα2マクログロブリンに悪影響を与えずに大量の血漿タンパクを沈殿させる。次に、Ig分画を硫酸アンモニウムで沈殿させる(TsangおよびWilkins、J.Immunol.Meth.138、291-299、1991)。
1.凍結乾燥粉末(1gの凍結乾燥粉末は約3.5ml最終容量を与える)の必要量を計量し、1mMのHCl中に懸濁させる。この培地はすぐに膨張するので、焼結グラスフィルター(空隙率1が推奨される)上で1mMのHClにより15分間洗浄すべきである。凍結乾燥粉末グラム当たり1mMのHClを約200ml使用し、数アリコットで添加する。
2.3M塩化マグネシウム/25%エチレングリコール中の抗体調製物をpH8.0で約5mg/mlまで、100K MWCO膜(ウルトラフリー15、ミリポア)付き遠心分離濃化装置を使用して濃化する。凍結乾燥粉末グラム当たり約5mlの抗体溶液を使用する。
3.抗体調製物をファルコンチューブで混合する。混合物を1時間室温でまたは一晩4℃で逆さまに回転させる。他の穏やかな回転方法の使用は可。磁気スターラーは使用しない。
4.過剰のリガンドを、結合緩衝液の少なくとも5倍の培地(ゲル)体積用量で洗浄除去する。
5.残りの任意の活性基をアミン緩衝液でブロックする。培地を0.1 MのTris-HCl緩衝液、pH8.0または1Mエタノールアミン、pH8.0に移し、2時間静置する。
6.培地をpHが交互に変わるサイクルで少なくとも3回洗浄する。少なくとも5倍の培地体積量の各緩衝液で洗浄する。各サイクルは0.5MのNaClを含む0.1Mの酢酸緩衝液pH4.0による洗浄、その後の0.5MのNaClを含む0.1MのTris-HCl、pH8の洗浄から構成すべきである。
7.非使用時には、ビーズを4℃で保存する。
臭化シアンで活性化したセファロースを使用して固体マトリックス上に抗体を固定する従来法は、抗体活性の低い親和性カラムを生じる。なぜなら、免疫グロブリン分子がランダムな方向で、セファロースの多部位に付着していて、それが、抗体/抗原相互作用の効果を減少させているからである。本プロトコールには、Fcドメインを介してプロテインGアガロースと抗体との有向結合、続いてこの複合体をジメチルピメリミデート(DMP)を使用して共有架橋させることが記載される。プロテインGは、免疫グロブリン分子のFc部分と結合し、これによって抗体の最適な空間配向および最大の抗原結合有効性がもたらされる。本プロトコールは、1mlカラムを対象にして記載されているが、バッチモード/溶液結合用に容易に調整できる。
1.架橋緩衝液:架橋緩衝液は0.1M トリエタノールアミン(pH8.5)または別の非アミン配合緩衝液、pH7〜9。
2.ジメチルピメリミデート(DMP)溶液:0.1Mトリエタノールアミン(pH9.5;DMPの酸性度により、溶液のpHは約8.0に減少することになる)中、20mMのDMP(Pierce)を10ml調製する。この試薬は使用直前に調製される。
3.リン酸緩衝食塩水(PBS):20mMリン酸緩衝液、150mMのNaCl、pH7.4。
4.停止溶液:停止溶液は0.1Mのエタノールアミンまたは、トリスまたはグリシンのようなアミン含有溶液。反応を停止するためにサンプルに対して1:4の比率で添加する。
5.フィルターシリンジ(0.2μm低タンパク結合のDurapore(ミリポア)または同等物)。
6.オンラインUV検出器(たとえばPharmacia Monitor UV-1 or UV-MII)。
7.プロテインGカラム(6%の高度に架橋された球状アガロース(Amersham Biosciences)に固定されたプロテインGを含む1-ml HiTrap プロテインGカラムまたはバッチモード用のフリービーズ。膨張したゲルのプロテインGの含有量は2mg/mlで、ヒトIgGに対する結合能力は> 20mg/ml(排出ゲル当たり)。ゲルは予め1mlまたは5mlの床容量を有し、保存液として25%エタノール中に平衡化されたカラム中に事前に充填されて供給される(カラムは4〜30℃に貯蔵すべきである)。
8.100K限界ろ過装置(ミリポア)
1.非リガンド抗体の緩衝液をPBSまたは結合緩衝液に交換し、その濃度を約1mg/mLに調整する。
2.プロテインGカラムを、ぜん動性のポンプを0.5ml/分の流速で使用して20倍のカラム容量のPBSで平衡化する。
3.抗体溶液をカラム上に約0.5ml/分の流速でポンプ供給する。
4.PBSでカラムを広範に洗浄し、収集分画を254nmまたは280nmの吸光度について、オンラインUV検出器を使用してモニターする。もし>75%の抗体がプロテインGセファロースに結合していないならば、残りのプロトコールに進む。もし抗体がプロテインGカラムに弱くしか結合せず、プロテインGカラムから「滴り落ちる」ならば、このプロトコールを中止する。分画を収集し、臭化シアンで活性化したセファロースまたはNヒドロキシスクシンイミドで活性化したセファロースのどちらかを使用して、抗体を無方向型でマトリックスに結合させる。
5.ぜん動性のポンプを0.5ml/分の流速で使用して、抗体結合カラムを約10mlの架橋緩衝液(10倍のカラム容量)で平衡化する。
6.約5mlの新たに調製したDMP溶液をカラムを通して0.5ml/分の流速でポンプ供給し10分間静置する。
7.さらに2.5mlのDMP溶液をカラムにポンプ供給し、さらに10分間静置する。
8.残りのDMP溶液をカラムにポンプ供給し、最後の10分間静置する。
9.カラムを5倍のカラム容量の架橋緩衝液で洗浄する。
10.5倍のカラム容量の停止溶液(たとえば0.1Mエタノールアミン)で反応を停止する。
11.0.02%のアジ化ナトリウムを補給した約20倍のカラム容量のPBSでカラムを平衡化する。このカラムはこの時点で免疫親和性捕捉研究のための準備が整った。
12.非使用時にはカラムを4℃で保存する。
母体血から単離された血漿はまずカプリル酸で処理して、大量の血漿タンパクを、Igおよび数種のα2マクログロブリンに悪影響を与えずに沈殿させる。この初期沈殿の後、上澄み液を取り除き、Ig分画を硫酸アンモニウムで沈殿させる(TsangおよびWilkins、J.Immunol.Meth.138、291-299、1991)。
非共有結合タンパクが、下記方法を使用して単離された胎児細胞から急速に脱離されて、生存可能な胎児細胞を生じる。
母体血調製物から得られた細胞を、PBS中0.1%(w/v)トリプシン/0.02%(v/v)ベルセン溶液でインキュベーションし、37℃で、細胞の生存能力を失うことなく結合した抗体を脱落させるために必要とされる切断の程度に依存して、約1〜5分またはそれ以上インキュベーションする。
母体血調製物から得られた細胞を、PBS中0.1%(w/v)タンパク分解酵素の混合物(たとえば、トリプシン、プロナーゼ、エラスターゼ、コラゲナーゼおよびキモトリプシン)でインキュベーションし、37℃で、細胞の生存能力を失なうことなく結合した抗体を脱落させるために必要な切断の適度に依存して、1〜5分またはそれ以上インキュベーションする。
ジチオスレイトール(DTT)またはトリス(2-カルボキシエチル)ホスファイン(TCEP)の還元を行うために、母体血から単離した細胞を確立した条件下で培養し、1×PBSで洗浄する。洗浄後、1mM〜50mM DTTまたは0.1mM〜50mM TCEPを含むPBSを細胞に加え、これを1〜30分間インキュベーションする。細胞を3回PBSで洗浄して培養培地に置いて細胞の生存能力を維持する。
Claims (23)
- 母体血サンプルで胎児細胞を同定する方法であって、胎児細胞に結合した母体抗体を検出することを含む方法。
- 胎児細胞に結合した母体抗体を、前記母体抗体と複合体を形成することができる物質にさらすことをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- サンプル中で胎児細胞を同定する方法であって、サンプル中の細胞を母体抗体にさらし、胎児細胞に結合した母体抗体を検出することを含み、前記母体抗体が、父由来胎児抗原に特異的な母体産生抗体を含む方法。
- 前記母体抗体が、可溶性HLA抗原および/または抗イディオタイプ抗体との複合体から、抗体を解離させることを含むプロセスにより調製される、請求項3に記載の方法。
- 胎児細胞に結合した母体抗体を、前記母体抗体と複合体を形成することができる物質にさらすことをさらに含む、請求項3または4に記載の方法。
- 前記物質が抗体、抗体断片または免疫グロブリンに結合するポリペプチドである、請求項2または5に記載の方法。
- 前記物質が検出可能に標識される、請求項2、5または6に記載の方法。
- 胎児細胞を母体血サンプルから濃化する方法であって、
i)末梢血単核細胞を含む分画を前記サンプルから単離し、
ii)i)における分画を、父由来胎児抗原に特異的な母体産生抗体が前記分画中の胎児細胞と十分に結合できる条件下で、母体血サンプルからの抗体と接触させ、
iii)ii)からの複合細胞を、母体抗体と複合体を形成できる物質と接触させ、
iv)物質-母体抗体複合体に結合した細胞を回収する、工程を含む方法。 - i)が、前記細胞から、前記細胞由来の細胞表面抗原と結合した抗体を除去するかまたは抗原-抗体複合体を除去することをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記母体血サンプルから得られた抗原反応性抗体が、可溶性HLA抗原および/または抗イディオタイプ抗体との複合体からの解離によって調製されている、請求項8または9に記載の方法。
- 請求項8のii)およびiii)が、補体溶解経路が機能しないかまたは機能できない条件下で行われる、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記物質が、検出可能な標識かまたは単離可能な標識に結合する、請求項8から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記物質が抗体、抗体断片または免疫グロブリンに結合するポリペプチドである、請求項8から12のいずれか一項に記載の方法。
- 母体血サンプルから胎児細胞を濃化する方法であって、前記サンプルから胎児細胞-母体抗体複合体を回収することを含む方法。
- 母体血から得られる細胞のサンプルから胎児細胞を濃化する方法であって、サンプル中の細胞を母体抗体にさらし、胎児細胞-母体抗体複合体を回収することを含み、前記母体抗体が、父由来胎児抗原に特異的な母体産生抗体を含む方法。
- 前記母体抗体が、可溶性HLA抗原および/または抗イディオタイプ抗体との複合体から、抗体を解離させることを含むプロセスにより調製される、請求項15に記載の方法。
- 前記サンプルから胎児細胞-母体抗体複合体を回収する工程が、前記複合体を前記複合体中の母体抗体に結合できる物質と接触させて、物質-母体抗体複合体が結合した細胞を回収することによって行われる、請求項14から16のいずれか一項に記載の方法。
- 母体血サンプルから胎児細胞を濃化する方法であって、胎児細胞を含む母体血またはその有核細胞分画を、暫時、胎児細胞-母体抗体複合体が十分形成できる条件下で、母体血漿の抗体含有分画と接触させ、前記複合体を前記複合体中で母体抗体と結合することができる物質と接触させ、物質-母体抗体複合体が結合した細胞を回収することを含む方法。
- 母体血漿の前記抗体含有分画が、可溶性HLA抗原および/または抗イディオタイプ抗体との複合体から、母体血漿中の抗体を解離させることを含むプロセスにより調製される、請求項18に記載の方法。
- 前記物質が、検出可能な標識かまたは単離可能な標識に結合する、請求項17から19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記物質が抗体、抗体断片または免疫グロブリンに結合するポリペプチドである、請求項17から20のいずれか一項に記載の方法。
- 父由来胎児抗原に特異的に結合する母体産生抗体の、母体血またはその有核細胞分画から胎児細胞を濃化するための使用。
- 父由来胎児抗原に特異的に結合する母体産生抗体の、母体血またはその有核細胞分画中の胎児細胞を同定するための使用。
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