JP4542302B2 - Confocal microscope system - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光電子増倍管を受光素子として使用する共焦点顕微鏡システムにおいて、受光素子の損傷を防止するために、受光素子の光電流が最大定格電流を超えないように受光素子のゲインを制御するゲインリミッタ回路を用いた共焦点顕微鏡システムに関する。
【0002】
【従来の技術】
共焦点顕微鏡では、試料からの光が共焦点光学系を介して受光素子で受光され、その受光量に基づいて、試料の共焦点画像(超焦点深度画像)や高さ分布等の情報が取得される。例えば、ステージに載置された試料と対物レンズとの相対距離を光軸方向に変化させると、共焦点光学系を介して受光素子に入射する光の量、すなわち受光量が変化し、試料の表面にピントが合ったときに受光量が最大となる。したがって、最大受光量が得られるときの試料と対物レンズとの相対距離から試料の表面の高さ情報を算出し、試料の表面を光で走査することによって試料の表面の高さ分布を取得することができる。
【0003】
取得された高さ分布は、例えば三次元表示によって表示装置の画面上に表示される。あるいは、高さ分布を輝度分布や色分布に置き換えたものが画面上に表示される。表示装置としてCRT(陰極線管)やLCD(液晶表示装置)が使用され、共焦点顕微鏡に制御用のコントローラ、表示装置、コンソール等が接続されて共焦点顕微鏡システムが構成される。
【0004】
また、試料表面の各点(画素)でピントが合ったときの受光量の情報(すなわち各画素の最大輝度情報)をつなぎ合わせることにより、焦点深度の非常に深い試料表面の白黒画像を得ることができる。この画像がいわゆる超深度画像である。
【0005】
更に、試料からの光の一部を共焦点光学系から途中で分けてカラー撮像素子で受光することにより、共焦点画像と同じ範囲の試料表面のカラー画像を得ることができる。このカラー画像は共焦点画像と異なり、試料表面の凹凸に応じてピントが合った部分とぼやけた部分とを含む。このカラー画像の輝度信号を共焦点画像の輝度信号で置き換えるような合成処理を行うことにより、各画素で略ピントが合ったカラー画像を得ることも可能である。
【0006】
上記のような共焦点顕微鏡システムにおいて、受光素子として光電子増倍管(フォトマルチプライヤチューブ)を用いることが多い。光電子増倍管は、光電面、二次電子増倍機構、陽極からなる真空管であり、光が光電面に入射したときに放出される光電子が増倍されて陽極に捕集され、出力電流として外部に取り出される。多段の二次電子放出面を用いることにより、大きな増倍度(高い受光感度)が得られる。
【0007】
受光素子として光電子増倍管を用いた共焦点顕微鏡システム等の光量検出回路において、受光感度の高い光電子増倍管に所定レベルを超える光が入射すると、最大定格以上の光電流が出力されて光電子増倍管に損傷(ダメージ)を与えるおそれがある。また、例えば共焦点顕微鏡システムでは、受光素子からの信号により、後段回路である光量検出回路の出力電流が飽和する結果として前述の共焦点画像や超深度画像が白く飛んでしまう現象(いわゆる白飛び)が発生する。
【0008】
そこで、従来の共焦点顕微鏡システムの中には、例えば試料の光反射率が高いような場合に所定レベルを超える光が光電子増倍管に入射して飽和現象が発生すると、一旦測定を中断して出射光量の調整やゲインの調整を自動的に行うものがある。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記のように測定の途中で自動的に出射光量の調整やゲインの調整に入ってしまうと、ユーザは自動調整が完了するまで待たされることになり、そのことがユーザにとってストレスと感じられる場合もある。また、測定本番の前に測定条件を決定するための試し測定を行っているような場合には、そのような自動調整が不要であり、却って煩わしく感じられる場合もある。更に、共焦点顕微鏡で得られた共焦点画像のほとんど全面で飽和による白飛びが生じている場合であっても、画面の一部でユーザが所望する画像情報が得られる場合がある。
【0010】
本発明は、上記のような従来の課題に鑑み、ユーザが測定時に意識することなく受光素子の保護のための出力電流制限が作動し、かつ、ユーザの望む測定条件に対して不用意に出力電流制限が働くことが少ないゲインリミッタ回路とそれを用いた共焦点顕微鏡システムを提供することを目的とする。
【0011】
本発明の請求項1に記載の共焦点顕微鏡システムは、光源と、受光した光量及び所定のゲインに応じた光電流値を出力する受光素子とを有し、前記光源からの光で試料の走査を行い、共焦点光学系を介して前記走査の範囲内の各点における前記試料からの透過光または反射光を前記受光素子で受光し、前記受光素子の受光情報に基づいて前記試料の表面の高さ情報及び光量情報を取得する共焦点顕微鏡システムであって、
前記受光素子からの前記光電流値に応じたディジタル値を出力し、前記光電流値が前記受光素子の最大定格電流値よりも小さい所定の飽和電流値を超えると前記ディジタル値が飽和して一定のディジタル値を出力する光量検出回路と、
前記ディジタル値に基づいて前記走査の範囲内の各点における前記試料の表面の高さ情報及び光量情報を取得する制御部と、
前記光電流値が前記最大定格電流値を超えることに起因する前記受光素子の損傷を防止するために、前記最大定格電流値より小さく、かつ前記飽和電流値より大きい範囲内にあるしきい値と前記受光素子からの前記光電流値を比較し、前記光電流値が前記しきい値より小さいときには前記受光素子のゲインに影響を与えないようにし、前記光電流値が前記しきい値に達したときには前記受光素子のゲインを下げて前記光電流値の更なる増加を制限し、前記受光素子のゲインが下がって前記光電流値が前記しきい値よりも小さくなったときは前記光電流値を前記飽和電流値よりも大きい前記しきい値に維持するように、前記受光素子のゲインを制御するゲインリミッタ回路と、
を有することを特徴とする。
【0012】
また、本発明の請求項2に記載の共焦点システムは、請求項1に記載の共焦点顕微鏡システムであって、前記ゲインリミッタ回路が、前記しきい値に応じた基準電圧値と前記受光素子からの前記光電流値に応じた信号電圧値とを比較した結果に応じてゲインを制御するための制御信号を出力する演算増幅器と、前記演算増幅器の後段に設けられたダイオードとを有し、前記ダイオードは、前記信号電圧値が前記基準電圧値より小さいときには前記演算増幅器と前記受光素子とが電気的に導通しない向きに設置され、前記信号電圧値が前記基準電圧値より小さいときには前記ゲインリミッタ回路が前記受光素子のゲインに影響を与えないことを特徴とする。
【0013】
上記のような構成を有する電子増倍管のゲインリミッタ回路とそれを用いた共焦点顕微鏡システムによれば、ゲインリミッタ回路が作動するしきい値が最大定格電流より小さく、かつ、光量検出回路の飽和電流より大きい範囲内に設定されているので、電子増倍管の損傷を防ぐための電流制限が確実に働く一方で、ユーザが望む測定条件に柔軟に対応し、測定の途中で出力電流制限が不用意に働くことが少なくなる。例えば、共焦点顕微鏡で得られた共焦点画像のほとんど全面で飽和による白飛びが生じている場合であっても、受光素子の出力電流が飽和電流より大きいしきい値を超えない限り出力電流制限が働くことはない。したがって、共焦点画像の略全面で飽和による白飛びが生じているような測定条件においても測定を継続し、その画面の一部で所望の画像情報を得ることが可能になる。
【0014】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
【0015】
図1は、本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡システムの概略構成を示している。共焦点顕微鏡システム1は、共焦点光学系2及び非共焦点光学系3を有する共焦点顕微鏡と、レーザ駆動回路44、共焦点信号処理回路41、制御部46等を含むコントローラと、コントローラに接続された表示装置47及び入力装置48とを備えている。
【0016】
まず、共焦点顕微鏡の共焦点光学系2とその信号処理について説明する。共焦点光学系2は、試料wkに単色光(例えばレーザ光)を照射するための光源10、第1コリメートレンズ11、偏光ビームスプリッタ12、1/4波長板13、水平偏向装置14a、垂直偏向装置14b、第1リレーレンズ15、第2リレーレンズ16、対物レンズ17、結像レンズ18、ピンホール板9、受光素子19等を含んでいる。
【0017】
光源10には、例えば赤色レーザ光を発する半導体レーザが用いられる。レーザ駆動回路44によって駆動される光源10から出たレーザ光は、第1コリメートレンズ11を通り、偏光ビームスプリッタ12で光路を曲げられ、1/4波長板13を通過する。この後、水平偏向装置14a及び垂直偏向装置14bによって水平(横)方向及び垂直(縦)方向に偏向された後、第1リレーレンズ15及び第2リレーレンズ16を通過し、対物レンズ17によって試料ステージ30上に置かれた試料wkの表面に集光される。
【0018】
水平偏向装置14a及び垂直偏向装置14bは、それぞれガルバノミラーで構成され、レーザ光を水平及び垂直方向に偏向させることにより、試料wkの表面をレーザ光で走査する。説明の便宜上、水平方向をX方向、垂直方向をY方向ということにする。対物レンズ17は、対物レンズ移動機構40によりZ方向(光軸方向)に駆動される。これにより、対物レンズ17の焦点と試料wkとの光軸方向での相対位置を変化させることができる。
【0019】
ただし、対物レンズ17の焦点と試料wkとの光軸方向での相対位置は、他の方法で変化させることもできる。例えば、対物レンズ17をZ軸方向に駆動する代わりに試料ステージ30をZ軸方向に駆動してもよい。あるいは、対物レンズ17と試料wkとの間に屈折率が変化するレンズを挿入することにより、対物レンズ17の焦点をZ軸方向に移動させる構成も可能である。なお、試料ステージ30は、手動操作によってX、Y方向及びZ方向に変位可能である。
【0020】
試料wkで反射されたレーザ光は、上記の光路を逆に辿る。すなわち、対物レンズ17、第2リレーレンズ16及び第1リレーレンズ15を通り、水平偏向装置14a及び垂直偏向装置14bを介して1/4波長板13を再び通る。この結果、レーザ光は偏光ビームスプリッタ12を透過し、結像レンズ18によって集光される。集光されたレーザ光は、結像レンズ18の焦点位置に配置されたピンホール板9のピンホールを通過して受光素子19に入射する。
【0021】
受光素子19として、光電子増倍管(フォトマルチプライヤチューブ)が使用される。光電子増倍管は、光電面、二次電子増倍機構、陽極からなる真空管であり、光が光電面に入射したときに放出される光電子が増倍されて陽極に捕集され、出力電流として外部に取り出される。多段の二次電子放出面を用いることにより、大きな増倍度(高い受光感度)が得られる。受光量に相当する電気信号は、出力アンプ、ゲインリミッタ回路、AD変換器等を含む共焦点信号処理回路41を経てディジタル値として制御部46に与えられる。
【0022】
上記のような構成の共焦点光学系2により、試料wkの表面の高さ(深さ)情報を取得することができる。以下に、その原理を簡単に説明する。
【0023】
上述のように、対物レンズ17が対物レンズ移動機構40によってZ方向(光軸方向)に駆動されると、対物レンズ17の焦点と試料wkとの光軸方向での相対距離が変化する。そして、対物レンズ17の焦点が試料wkの表面に結ばれたときに、試料wkの表面で反射されたレーザ光は上記の光路を経て結像レンズ18で集光され、ほとんどすべてのレーザ光がピンホール板9のピンホールを通過する。したがって、このときに、受光素子19の受光量が最大になる。逆に、対物レンズ17の焦点が試料wkの表面からずれている状態では、結像レンズ18によって集光されたレーザ光はピンホール板9からずれた位置に焦点を結ぶので、一部のレーザ光しかピンホールを通過することができない。その結果、受光素子19の受光量は著しく低下する。
【0024】
したがって、試料wkの表面の任意の点について、対物レンズ17をZ方向(光軸方向)に駆動しながら受光素子19の受光量を検出すれば、その受光量が最大になるときの対物レンズ17のZ方向位置(対物レンズ17の焦点と試料wkとの光軸方向での相対位置)を高さ情報として一義的に求めることができる。
【0025】
実際には、対物レンズ17を1ステップ(1ピッチ)移動するたびに水平偏向装置14a及び垂直偏向装置14bによって試料wkの表面を走査して受光素子19の受光量を得る。対物レンズ17を測定範囲の下端から上端までZ方向に移動させたとき、走査範囲内の各点(画素)について、Z方向位置に応じて変化する受光量データが得られる。
【0026】
図2は、対物レンズ17のZ方向位置に応じて変化する受光量データの例を示すグラフである。このような受光量データに基づいて、最大受光量とそのときのZ方向位置が各点(画素)ごとに得られる。したがって、試料wkの表面高さのXY平面での分布が得られる。この処理は、マイクロコンピュータを用いた制御部46によって実行される。
【0027】
得られた表面高さの分布情報は、いくつかの方法で表示装置47のモニタ画面に表示することができる。例えば3次元表示によって試料の高さ分布(表面形状)を立体的に表示することができる。あるいは、高さデータを輝度データに変換することにより、明るさの二次元分布として表示できる。高さデータを色差データに変換することにより、高さの分布を色の分布として表示することもできる。
【0028】
また、XY走査範囲内の各点(画素)について得られた受光量を輝度データとする輝度信号から、試料wkの表面画像(白黒画像)が得られる。各画素における最大受光量を輝度データとして輝度信号を生成すれば、表面高さの異なる各点でピントの合った焦点深度の非常に深い画像、いわゆる超焦点深度画像が得られる。また、任意の注目画素で最大受光量が得られた高さ(Z方向位置)に固定した場合は、注目画素の部分と高低差が大きい部分の画素の受光量は著しく小さくなるので、注目画素と同じ高さの部分のみが明るい画像が得られる。
【0029】
つぎに、共焦点顕微鏡に備えられた非共焦点光学系3とその信号処理について説明する。非共焦点光学系3は、試料wkに白色光(カラー画像撮影用の照明光)を照射するための白色光源20、第2コリメートレンズ21、第1ハーフミラー22、第2ハーフミラー23、カラーCCD(イメージセンサー)24等を含んでいる。また、非共焦点光学系3は共焦点光学系2の対物レンズ17を共用しており、2つの光学系1,2の光軸は部分的に一致している。
【0030】
白色光源20には例えば白色ランプが用いられるが、特に専用の光源を設けず、自然光又は室内光を利用してもよい。白色光源20から出た白色光は、第2コリメートレンズ21を通り、第1ハーフミラー22で光路を曲げられ、対物レンズ17によって試料ステージ30上に置かれた試料wkの表面に集光される。
【0031】
試料wkで反射された白色光は、対物レンズ17、第1ハーフミラー22、第2リレーレンズ16を通過し、第2ハーフミラー23で反射されてカラーCCD24に入射して結像する。カラーCCD24は、共焦点光学系2のピンホール板9のピンホールと共役又は共役に近い位置に設けられている。カラーCCD24で撮像されたカラー画像は、CCD駆動回路43によって読み出され、カラー画像信号処理回路42を経て制御部46に与えられる。このようにして得られたカラー画像は、試料wkの観察用の拡大カラー画像として表示装置47のモニタ画面に表示される。
【0032】
また、共焦点光学系2で得られた焦点深度の深い画像と非共焦点光学系3で得られた通常のカラー画像とを組み合わせて、すべての画素で略ピントの合った焦点深度の深いカラー画像を生成し、表示することもできる。例えば、非共焦点光学系3で得られたカラー画像を構成する輝度信号を共焦点光学系2で得られた共焦点画像の輝度信号で置き換えることにより、簡易的にカラー共焦点画像を生成することができる。
【0033】
上記のようなカラー画像に関する処理についても、制御部46を含むコントローラが司る。コントローラにはコンソール(操作卓)のような入力装置48やCRT(陰極線管)又はLCD(液晶表示装置)のような表示装置47が接続されている。また、マウスのようなポインティングデバイスも入力装置48として接続される。
【0034】
ユーザは、表示装置47の画面上に表示されるガイダンスにしたがって入力装置48を用いて種々の測定用パラメータを設定することができる。例えば、対物レンズ17のZ方向移動範囲(測定範囲)や移動ピッチを設定する。あるいは、試料wkの表面の光反射率等に応じて受光素子19の受光感度(PMTゲイン)やNDフィルタによる減衰量の設定を行うことにより、共焦点画像の明るさが適当になるようにする。また、カラーCCD24によるカラー画像の取得のためのシャッタースピードやゲイン及びホワイトバランスの設定を行う。
【0035】
図3は、受光素子19の出力信号を処理する共焦点信号処理回路41の構成を示すブロック図である。共焦点信号処理回路41は増幅器51、ゲインリミッタ回路52及びAD変換器53を有する。光電子増倍管である受光素子19から出力された信号電圧Vsigは共焦点信号処理回路41の増幅器51で増幅された後にAD変換器53でディジタル信号に変換されて制御部46へ与えられる。受光素子19からの信号電圧Vsigは、ゲインリミッタ回路52にも入力され、ゲインリミッタ回路52の出力信号Vcontが受光素子(PMT)19のゲインを制御するように構成されている。
【0036】
図4は、ゲインリミッタ回路52の回路構成例を示す図である。受光素子19からの信号電圧Vsigは、抵抗R1とコンデンサC1からなるローパスフィルタを介してコンパレータ(演算増幅器)55の反転入力側に入力される。非反転入力側にはしきい値である基準電圧Vrefが入力されている。
【0037】
信号電圧Vsigが基準電圧Vrefより低いときは、演算増幅器55の出力はHレベルであり、ダイオードD1がカットオフ状態になっている。このとき、ゲインリミッタ回路52の出力Vcontはオープン状態(ハイインピーダンス)となっており、受光素子(PMT)19に影響を与えない。
【0038】
基準電圧Vrefより高い信号電圧Vsigが入力されると、演算増幅器55の出力が反転してLレベルとなり、ダイオードD1が導通する。このとき、ゲインリミッタ回路52の出力であるコントロール電圧Vcontが受光素子19のゲイン(PMTゲイン)を下げるように働く。その結果、受光素子(光電子増倍管)19から取り出される光電流に制限がかかることになる。
【0039】
本実施形態の共焦点顕微鏡システム1において、基準電圧(しきい値)Vrefは、受光素子19の最大定格電流より(十分に)小さい光電流で上記の制限がかかるように設定されている。これにより、鏡面のように光反射率の高い試料wkを繰り返し測定しても、受光素子(光電子増倍管)19が劣化したり損傷を受けたりするおそれが無くなる。
【0040】
また、増幅器51以降の後段回路である光量検出回路で、飽和電流となる光電流より(十分)大きい光電流で上記の制限がかかるように基準電圧(しきい値)Vrefが設定されている。これにより、得られた共焦点画像のほとんど全面で飽和による白飛びが生じている場合であっても、受光素子19の出力電流が前述の後段回路である光量検出回路の飽和電流より大きいしきい値を超えない限り出力電流制限が働くことはない。つまり、共焦点画像の略全面で飽和による白飛びが生じているような測定条件においても測定を継続し、その画面の一部で所望の画像情報を得ることが可能になる。
【0041】
図5及び図6は、ユーザが所望する測定条件で測定する場合の例を示す図である。図5は通常のPMTゲインで測定したときの様子を示し、図6は図5の条件からPMTゲインを増加したときの様子を示している。図5(a)に示す共焦点画像60において、白い背景61の中に、黒い島62が表示されている。画面の横方向の直線L1に沿う受光量の変化は図5(b)に示すようになっている。黒い島62の部分で受光量は非常に小さく、白い背景61の部分で受光量は飽和光量に近くなっている。このとき、図2に示した対物レンズ17のZ方向位置に応じて変化する受光量のグラフは、図7に実線で示すようになる。65が白い背景61の受光量を示し、66が黒い島62の受光量を示している。
【0042】
図5(a)では黒い島62が均一に見えるが、PMTゲインを増加すると図6(a)に示すように、黒い島62の中に更に暗いスポット63があることがわかる。ユーザが詳しく観察したい箇所がこの部分にあるとする。PMTゲインを増加した図6(a)において、直線L1に沿う受光量の変化は図6(b)に示すようになり、白い背景61の部分では受光量が飽和光量を超えている。
【0043】
本実施形態の共焦点顕微鏡システム1では、光電子増倍管19の飽和電流より(十分)大きい光電流で制限がかかるように基準電圧(しきい値)Vrefが設定されているので、図6に示すような状態でも試料wkの測定及び観察が可能である。
【0044】
また、図5に示した共焦点画像のPMTゲインでは、図7に示すように白い背景61の受光量の変化65から最大受光量となるZ方向位置(ピントが合った位置)Z1を見つけることが容易であるが、黒い島62の受光量の変化66から最大受光量となるZ方向位置を見つけることは困難である。これに対して、図6に示した共焦点画像のようにPMTゲインを増加した状態では、黒い島62の受光量の変化が図7において実線66から破線66'のように増幅されるので、その最大受光量となるZ方向位置(ピントが合った位置)Z2を容易に見つけられるようになる。
【0045】
このように、本実施形態の共焦点顕微鏡システム1によれば、通常のPMTゲインで受光量が小さいために暗くなってしまう部分を詳細に観察したい場合に、周辺部分が飽和光量を超えるまでPMTゲインを上げることができるので、当該部分の詳細な観察が可能となる。また、その部分に含まれる特定箇所にピントを合わせることも容易になる。
【0046】
以上、本発明の実施形態を図面に沿って説明したが、本発明は上記の実施形態に限らず種々の形態で実施することができる。例えば、共焦点光学系2による試料wkの表面の高さ情報を取得するために、対物レンズ17をZ方向に移動(上下動)させる代わりに、ステージ30を上下動させてもよい。
【0047】
また、光による試料の走査は、水平偏向及び垂直偏向による二次元走査に限らず、種々の走査方法が考えられる。例えば、シリンドリカルレンズを用いてX方向に細長い光(スリット光)を生成し、これをY方向に偏向すれば、二次元走査が可能である。
【0048】
また、上記の実施形態の共焦点顕微鏡は反射型の顕微鏡であるが、透過型の共焦点顕微鏡にも本発明を適用することができる。透過型の顕微鏡の場合は、試料の裏面から共焦点光学系のレーザ光及び非共焦点光学系の白色光が照射される。
共焦点光学系の光源はレーザ光源を含む単色光源はもちろんのこと、複数波長を含むものであってもよい。非共焦点光学系の光源は自然光又は室内光で代用することもできる。
【0049】
【発明の効果】
以上に説明したように、本発明の光電子増倍管のゲインリミッタ回路と共焦点顕微鏡システムによれば、ゲインリミッタ回路が作動するしきい値が最大定格電流より小さく、かつ、光量検出回路の飽和電流より大きい範囲内に設定されているので、電子増倍管の損傷を防ぐための電流制限が確実に働く一方で、ユーザが望む測定条件に柔軟に対応し、測定の途中で出力電流制限が不用意に働くことが少なくなる。例えば、共焦点顕微鏡で得られた共焦点画像のほとんど全面で飽和による白飛びが生じている場合であっても、受光素子の出力電流が光量検出回路の飽和電流より大きいしきい値を超えない限り出力電流制限が働くことはない。
したがって、共焦点画像の略全面で飽和による白飛びが生じているような測定条件においても測定を継続し、その画面の一部で所望の画像情報を得ることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡システムの概略構成を示している。
【図2】対物レンズのZ方向位置に応じて変化する受光量データの例を示すグラフである。
【図3】受光素子の出力信号を処理する共焦点信号処理回路の構成を示すブロック図である。
【図4】ゲインリミッタ回路の回路構成例を示す図である。
【図5】ユーザが所望する測定条件で測定する場合の例を示す図である。
【図6】図5の条件からPMTゲインを増加したときの様子を示す図である。
【図7】図5及び図6の測定例において、対物レンズのZ方向位置に応じて変化する受光量の例を示すグラフである。
【符号の説明】
1 共焦点顕微鏡システム
19 光電子増倍管(受光素子)
52 ゲインリミッタ回路[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention is controlled in a confocal microscope system using a photomultiplier tube as the light receiving element, in order to prevent damage to the light-receiving element, the gain of the light receiving element so that the light current of the light receiving element does not exceed the maximum rated current about a confocal microscope system using the gain limiter circuitry for.
[0002]
[Prior art]
In a confocal microscope, light from a sample is received by a light receiving element via a confocal optical system, and information such as a confocal image (hyperfocal depth image) and height distribution of the sample is acquired based on the amount of light received. Is done. For example, when the relative distance between the sample placed on the stage and the objective lens is changed in the optical axis direction, the amount of light incident on the light receiving element via the confocal optical system, that is, the amount of received light changes, The amount of light received is maximized when the surface is in focus. Therefore, the height information of the surface of the sample is calculated from the relative distance between the sample and the objective lens when the maximum amount of received light is obtained, and the height distribution of the surface of the sample is acquired by scanning the surface of the sample with light. be able to.
[0003]
The acquired height distribution is displayed on the screen of the display device by, for example, three-dimensional display. Alternatively, the height distribution replaced with a luminance distribution or a color distribution is displayed on the screen. A CRT (cathode ray tube) or LCD (liquid crystal display device) is used as a display device, and a confocal microscope is connected to a control controller, a display device, a console, and the like to constitute a confocal microscope system.
[0004]
Also, by combining the information on the amount of light received when each point (pixel) on the sample surface is in focus (that is, the maximum luminance information of each pixel), a black and white image of the sample surface with a very deep focal depth can be obtained. Can do. This image is a so-called ultra-deep image.
[0005]
Furthermore, a color image of the sample surface in the same range as the confocal image can be obtained by separating a part of the light from the sample halfway from the confocal optical system and receiving it with the color imaging device. Unlike a confocal image, this color image includes a focused portion and a blurred portion according to the unevenness of the sample surface. It is also possible to obtain a color image that is substantially in focus at each pixel by performing a synthesis process that replaces the luminance signal of the color image with the luminance signal of the confocal image.
[0006]
In the confocal microscope system as described above, a photomultiplier tube (photomultiplier tube) is often used as a light receiving element. A photomultiplier tube is a vacuum tube composed of a photocathode, a secondary electron multiplier mechanism, and an anode. Photoelectrons emitted when light enters the photocathode are multiplied and collected by the anode, and output current is obtained. Take out to the outside. By using a multistage secondary electron emission surface, a large multiplication factor (high light receiving sensitivity) can be obtained.
[0007]
In a light intensity detection circuit such as a confocal microscope system using a photomultiplier tube as a light receiving element, when light exceeding a predetermined level is incident on a photomultiplier tube with high light receiving sensitivity, a photocurrent exceeding the maximum rating is output and the photoelectron is output. There is a risk of damage (damage) to the multiplier. Further, for example, in a confocal microscope system, the above-described confocal image or ultra-deep image is whitened as a result of saturation of the output current of the light amount detection circuit, which is a subsequent circuit, due to the signal from the light receiving element (so-called whiteout) ) Occurs.
[0008]
Therefore, in a conventional confocal microscope system, for example, when the light reflectance of a sample is high, when a saturation phenomenon occurs when light exceeding a predetermined level enters the photomultiplier tube, the measurement is temporarily stopped. Some of them automatically adjust the amount of emitted light and adjust the gain.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
However, if the output light amount adjustment or gain adjustment is automatically entered during the measurement as described above, the user will have to wait until the automatic adjustment is completed, which is felt stressful to the user. In some cases. In addition, when a test measurement for determining measurement conditions is performed before the actual measurement, such automatic adjustment is unnecessary, and it may be annoying. Further, even if the confocal image obtained by the confocal microscope has a whiteout due to saturation almost on the entire surface, image information desired by the user may be obtained on a part of the screen.
[0010]
In view of the above-described conventional problems, the present invention operates the output current limit for protecting the light receiving element without the user being conscious of the measurement, and outputs carelessly for the measurement conditions desired by the user. An object of the present invention is to provide a gain limiter circuit in which current limiting is less effective and a confocal microscope system using the gain limiter circuit.
[0011]
A confocal microscope system according to a first aspect of the present invention includes a light source and a light receiving element that outputs a photocurrent value corresponding to a received light amount and a predetermined gain, and scans a sample with light from the light source. The light receiving element receives light or reflected light from the sample at each point within the scanning range via a confocal optical system, and the surface of the sample is received based on light reception information of the light receiving element. A confocal microscope system for acquiring height information and light amount information,
A digital value corresponding to the photocurrent value from the light receiving element is output, and when the photocurrent value exceeds a predetermined saturation current value smaller than the maximum rated current value of the light receiving element, the digital value is saturated and constant. A light amount detection circuit that outputs a digital value of
A control unit for acquiring height information and light amount information of the surface of the sample at each point within the scanning range based on the digital value;
In order to prevent damage to the light receiving element due to the photocurrent value exceeding the maximum rated current value, a threshold value that is smaller than the maximum rated current value and within a range greater than the saturation current value; comparing the photocurrent value from the light receiving element, when the photocurrent value is smaller than the threshold value so as not to affect the gain of the previous SL light receiving element, the photocurrent value is the threshold value lower the gain of the light receiving element to limit a further increase of the photocurrent value upon reaching, the when the photocurrent value gain down of the light receiving element becomes rather smaller than the threshold value so as to maintain the photocurrent value to the threshold value greater than the saturation current value, the gain limiter circuit for controlling the gain of the light receiving element,
It is characterized by having.
[0012]
The confocal system according to
[0013]
According to the gain limiter circuit of the electron multiplier having the above-described configuration and the confocal microscope system using the same, the threshold at which the gain limiter circuit operates is smaller than the maximum rated current, and the light amount detection circuit Since it is set within a range larger than the saturation current, the current limit to prevent damage to the electron multiplier works reliably, while flexibly responding to the measurement conditions desired by the user and limiting the output current during the measurement Work less carelessly. For example, even if the confocal image obtained with a confocal microscope has whiteout due to saturation almost entirely, the output current is limited as long as the output current of the light receiving element does not exceed a threshold value greater than the saturation current. Will not work. Therefore, measurement can be continued even under measurement conditions in which whiteout due to saturation occurs on almost the entire confocal image, and desired image information can be obtained on a part of the screen.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
[0015]
FIG. 1 shows a schematic configuration of a confocal microscope system according to an embodiment of the present invention. The confocal microscope system 1 includes a confocal microscope having a confocal
[0016]
First, the confocal
[0017]
As the
[0018]
The
[0019]
However, the relative position in the optical axis direction between the focal point of the
[0020]
The laser beam reflected by the sample wk follows the above optical path in reverse. That is, it passes through the
[0021]
As the
[0022]
With the confocal
[0023]
As described above, when the
[0024]
Therefore, if the received light amount of the
[0025]
Actually, each time the
[0026]
FIG. 2 is a graph showing an example of received light amount data that changes in accordance with the position of the
[0027]
The obtained surface height distribution information can be displayed on the monitor screen of the
[0028]
Further, a surface image (black and white image) of the sample wk is obtained from a luminance signal having the received light amount obtained for each point (pixel) in the XY scanning range as luminance data. If a luminance signal is generated using the maximum amount of light received at each pixel as luminance data, an image having a very deep focal depth in focus at each point having a different surface height, a so-called hyperfocus depth image can be obtained. In addition, when the height (Z-direction position) at which the maximum light reception amount is obtained at any target pixel is fixed, the light reception amount of the pixel of the target pixel portion and the portion having a large difference in height is significantly reduced. A bright image is obtained only at the same height.
[0029]
Next, the non-confocal
[0030]
For example, a white lamp is used as the
[0031]
The white light reflected by the sample wk passes through the
[0032]
In addition, by combining an image with a deep focal depth obtained by the confocal
[0033]
The controller including the
[0034]
The user can set various measurement parameters using the
[0035]
FIG. 3 is a block diagram showing the configuration of the confocal
[0036]
FIG. 4 is a diagram illustrating a circuit configuration example of the
[0037]
When the signal voltage Vsig is lower than the reference voltage Vref, the output of the
[0038]
When a signal voltage Vsig higher than the reference voltage Vref is input, the output of the
[0039]
In the confocal microscope system 1 of the present embodiment, the reference voltage (threshold value) Vref is set so that the above limitation is applied with a photocurrent (sufficiently) smaller than the maximum rated current of the
[0040]
Further, the reference voltage (threshold) Vref is set so that the above-described restriction is applied with a photocurrent that is (sufficiently) larger than the photocurrent that becomes the saturation current in the light amount detection circuit that is a subsequent circuit after the
[0041]
FIG. 5 and FIG. 6 are diagrams illustrating an example in the case where measurement is performed under measurement conditions desired by the user. FIG. 5 shows a state when measured with a normal PMT gain, and FIG. 6 shows a state when the PMT gain is increased from the conditions of FIG. In the
[0042]
In FIG. 5A, the
[0043]
In the confocal microscope system 1 of the present embodiment, since the reference voltage (threshold value) Vref is set so as to be limited by a photocurrent (sufficiently) larger than the saturation current of the
[0044]
Further, in the PMT gain of the confocal image shown in FIG. 5, the Z-direction position (focused position) Z1 that is the maximum light reception amount is found from the
[0045]
As described above, according to the confocal microscope system 1 of the present embodiment, when it is desired to observe in detail a portion that becomes dark due to a small amount of received light with a normal PMT gain, the PMT is increased until the peripheral portion exceeds the saturation light amount. Since the gain can be increased, detailed observation of the part can be performed. Also, it is easy to focus on a specific location included in the portion.
[0046]
As mentioned above, although embodiment of this invention was described along drawing, this invention is not restricted to said embodiment, It can implement with a various form. For example, in order to acquire the height information of the surface of the sample wk by the confocal
[0047]
The scanning of the sample with light is not limited to two-dimensional scanning by horizontal deflection and vertical deflection, and various scanning methods can be considered. For example, if a cylindrical lens is used to generate light that is elongated in the X direction (slit light) and is deflected in the Y direction, two-dimensional scanning is possible.
[0048]
The confocal microscope of the above embodiment is a reflection type microscope, but the present invention can also be applied to a transmission type confocal microscope. In the case of a transmission type microscope, laser light from a confocal optical system and white light from a non-confocal optical system are irradiated from the back surface of the sample.
The light source of the confocal optical system may include not only a monochromatic light source including a laser light source but also a plurality of wavelengths. The light source of the non-confocal optical system can be replaced with natural light or room light.
[0049]
【The invention's effect】
As described above, according to the gain limiter circuit and the confocal microscope system of the photomultiplier tube of the present invention, the threshold at which the gain limiter circuit operates is smaller than the maximum rated current and the light amount detection circuit is saturated. Since it is set within a range larger than the current, the current limit to prevent damage to the electron multiplier works reliably, while flexibly responding to the measurement conditions desired by the user, the output current limit is limited during the measurement. Work less carelessly. For example, even if the confocal image obtained with the confocal microscope has a whiteout due to saturation in almost the entire surface, the output current of the light receiving element does not exceed a threshold value greater than the saturation current of the light amount detection circuit. As long as the output current limit does not work.
Therefore, measurement can be continued even under measurement conditions in which whiteout due to saturation occurs on substantially the entire confocal image, and desired image information can be obtained on a part of the screen.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a schematic configuration of a confocal microscope system according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing an example of received light amount data that changes in accordance with the position of the objective lens in the Z direction.
FIG. 3 is a block diagram illustrating a configuration of a confocal signal processing circuit that processes an output signal of a light receiving element.
FIG. 4 is a diagram illustrating a circuit configuration example of a gain limiter circuit.
FIG. 5 is a diagram illustrating an example in the case where measurement is performed under measurement conditions desired by a user.
6 is a diagram showing a state when a PMT gain is increased from the condition of FIG. 5. FIG.
7 is a graph showing an example of the amount of received light that changes in accordance with the position of the objective lens in the Z direction in the measurement examples of FIGS. 5 and 6. FIG.
[Explanation of symbols]
1
52 Gain limiter circuit
Claims (2)
前記受光素子からの前記光電流値に応じたディジタル値を出力し、前記光電流値が前記受光素子の最大定格電流値よりも小さい所定の飽和電流値を超えると前記ディジタル値が飽和して一定のディジタル値を出力する光量検出回路と、
前記ディジタル値に基づいて前記走査の範囲内の各点における前記試料の表面の高さ情報及び光量情報を取得する制御部と、
前記光電流値が前記最大定格電流値を超えることに起因する前記受光素子の損傷を防止するために、前記最大定格電流値より小さく、かつ前記飽和電流値より大きい範囲内にあるしきい値と前記受光素子からの前記光電流値を比較し、前記光電流値が前記しきい値より小さいときには前記受光素子のゲインに影響を与えないようにし、前記光電流値が前記しきい値に達したときには前記受光素子のゲインを下げて前記光電流値の更なる増加を制限し、前記受光素子のゲインが下がって前記光電流値が前記しきい値よりも小さくなったときは前記光電流値を前記飽和電流値よりも大きい前記しきい値に維持するように、前記受光素子のゲインを制御するゲインリミッタ回路と、
を有することを特徴とする共焦点顕微鏡システム。A light source and a light receiving element that outputs a photocurrent value corresponding to the amount of light received and a predetermined gain, scans the sample with light from the light source, and within the scanning range via a confocal optical system In this confocal microscope system, transmitted light or reflected light from the sample at each point is received by the light receiving element, and height information and light amount information on the surface of the sample are acquired based on light reception information of the light receiving element. And
A digital value corresponding to the photocurrent value from the light receiving element is output, and when the photocurrent value exceeds a predetermined saturation current value smaller than the maximum rated current value of the light receiving element, the digital value is saturated and constant. A light amount detection circuit that outputs a digital value of
A control unit for acquiring height information and light amount information of the surface of the sample at each point within the scanning range based on the digital value;
In order to prevent damage to the light receiving element due to the photocurrent value exceeding the maximum rated current value, a threshold value that is smaller than the maximum rated current value and within a range greater than the saturation current value; comparing the photocurrent value from the light receiving element, when the photocurrent value is smaller than the threshold value so as not to affect the gain of the previous SL light receiving element, the photocurrent value is the threshold value lower the gain of the light receiving element to limit a further increase of the photocurrent value upon reaching, the when the photocurrent value gain down of the light receiving element becomes rather smaller than the threshold value so as to maintain the photocurrent value to the threshold value greater than the saturation current value, the gain limiter circuit for controlling the gain of the light receiving element,
A confocal microscope system characterized by comprising:
前記しきい値に応じた基準電圧値と前記受光素子からの前記光電流値に応じた信号電圧値とを比較した結果に応じてゲインを制御するための制御信号を出力する演算増幅器と、
前記演算増幅器の後段に設けられたダイオードとを有し、
前記ダイオードは、前記信号電圧値が前記基準電圧値より小さいときには前記演算増幅器と前記受光素子とが電気的に導通しない向きに設置され、前記信号電圧値が前記基準電圧値より小さいときには前記ゲインリミッタ回路が前記受光素子のゲインに影響を与えないことを特徴とする請求項1に記載の共焦点顕微鏡システム。The gain limiter circuit is
An operational amplifier that outputs a control signal for controlling a gain according to a result of comparing a reference voltage value corresponding to the threshold value and a signal voltage value corresponding to the photocurrent value from the light receiving element;
A diode provided at a subsequent stage of the operational amplifier,
The diode is installed in a direction in which the operational amplifier and the light receiving element are not electrically connected when the signal voltage value is smaller than the reference voltage value, and the gain limiter when the signal voltage value is smaller than the reference voltage value. The confocal microscope system according to claim 1, wherein the circuit does not affect the gain of the light receiving element.
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