JP4385158B2

JP4385158B2 - Cell preservation solution and cell preservation method using the preservation solution

Info

Publication number: JP4385158B2
Application number: JP2001352570A
Authority: JP
Inventors: 憲三馬場; 保幸黒岩; 暉彬関根
Original assignee: Lymphotec Inc
Current assignee: Lymphotec Inc
Priority date: 2000-12-04
Filing date: 2001-11-19
Publication date: 2009-12-16
Anticipated expiration: 2021-11-19
Also published as: JP2002233356A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、精製アルブミンとジメチルスルフォキシドとを含有する細胞の保存液および該保存液を用いた細胞の保存方法に関し、保存後における復活した有効細胞率の向上をはかることを目的とする。
【０００２】
【従来の技術】
細胞の保存液や保存方法については、その由来する細胞の種類などによって一様ではない。例えば微生物のような細胞の場合には、一般的に１０％程度のグリセロールを含む微生物培養用培地中に微生物を懸濁させるとともに、これを低温下にて保存し、あるいは微生物自体を凍結乾燥状態にて保存することがおこなわれている。また哺乳類細胞の場合においては、一般的には１０％程度のジメチルスルフォキシドを添加したウシ胎児血清を含む培養液中に懸濁し、これを予備冷却した後、液体窒素保管庫内に格納して保存することがおこなわれている。
【０００３】
さらに精子などの生殖細胞の場合にあっては、アルブミン単体を含ませたリン酸緩衝液が保存液として用いられる。また前記した哺乳類細胞保存の場合には保存液中に血清を含むタイプと含まないタイプとがあり、血清を含むタイプのものとしては、例えば培養液に血清およびジメチルスルフォキシドを含有させた細胞保存液が知られる。また血清を含まないタイプでは、細胞保存液中に、血清に代えてカルボキシメチルセルロースを含有させたものが知られる（特開平６−４６８４０号）。
【０００４】
しかし血清を含まないものは、細胞保存性能が低く、また通常の培養液には血清が含まれるところから、多くの場合血清を含ませた細胞保存液が使用される。また、一般的に哺乳類細胞は微生物細胞や生殖細胞よりも保存が困難であることから、哺乳類細胞に比して保存が容易な微生物細胞や生殖細胞の保存に際し、哺乳類細胞の保存液を代用使用することもおこなわれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、血清を含有する保存液にあっては、特に培養する細胞毎に異なった培養液が使用されるのみならず、血清についても細胞毎に異なったロットが使用されることになることから、自家調製した細胞保存液を他の細胞の保存液として使用することは困難である。またそればかりでなく、血清含有の細胞保存液にあっては、血清含有成分として各種サイトカインや増殖因子、ホルモン等も含まれるのみならず、アミノ酸や各種イオン等をはじめとした、本来細胞保存に不必要な多くの成分を含む培養液を用いる結果、保存細胞の性質を変えるおそれがあり、さらに血清に含まれる可能性のある未知のウイルスによる影響の問題をも内在している。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記したように血清含有の細胞保存液にあっては、保存している細胞の性質を変えるおそれがあること、および未知ウイルス混入の危険性、ならびに保存液成分が不明瞭であることから品質安定を期することが難しい、といった種々の課題を有するところから、本発明においてはこれらの問題が全く生じないよう、血清および培養液共に含まず、しかも成分が明瞭かつ優れた細胞保存性能を有する細胞保存液および該保存液を用いた細胞の保存方法を開発し、種々の実験を重ねた。
【０００７】
その結果、意外にもこれまで血清含有保存液への添加剤として用いられてきたジメチルスルフォキシドに対し、これまで生殖細胞の保存に用いられているリン酸緩衝液中に含まれるアルブミンを混合したものを主剤とし、これに必要に応じてリン酸イオンや二価金属イオン、単糖などの助剤を添加したところの、血清および培養液非含有型の細胞保存液が、哺乳類細胞をはじめとし、微生物細胞や生殖細胞などの保存について優れた細胞保存性能を有することを見出した。
【０００８】
具体的には、請求項１の発明は、精製アルブミンとジメチルスルフォキシドとを含有し、さらに助剤として単糖と、０．１〜５％のカルシウムおよびマグネシウム、または０．１〜５％のカルシウム、マグネシウムおよび銅を添加してなる哺乳類細胞の保存液に関する。また請求項２の発明は、精製アルブミンがウシ由来のものである請求項１に記載の哺乳類細胞の保存液に関する。
【０００９】
さらに請求項３の発明は、単糖がグルコースであるところの請求項１又は請求項２に記載の哺乳類細胞の保存液に関する。
【００１０】
さらに請求項４の発明は、精製アルブミンの濃度が０．０１〜２５％(w/w) の範囲内であるところの請求項１〜３のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液に関する。さらに請求項５の発明は、精製アルブミンの濃度が０．１〜５％(w/w) の範囲内であるところの請求項１〜３のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液に関する。さらに請求項６の発明は、ジメチルスルフォキシドの濃度が０．１〜５０％(w/w)の範囲内であるところの請求項１〜５のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液に関する。さらに請求項７の発明は、ジメチルスルフォキシドの濃度が１〜２０％(w/w)の範囲内であるところの請求項１〜５のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液に関する。
【００１１】
さらに請求項８の発明は、単糖の濃度が０．１〜１０％（w/w）の範囲内であるところの請求項１〜７のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液に関する。さらに請求項９の発明は、単糖の濃度が１〜５％（w/w）の範囲内であるところの請求項１〜７のいずれか１に記載の哺乳類細胞の保存液に関する。
【００１２】
また請求項１０の発明は、請求項１〜９に記載の哺乳類細胞の保存液を用い、これに哺乳類細胞を懸濁させるとともに、これを複数の細胞保存用容器に分注し、急速に−８０℃で凍結保存するようにしたことを特徴とした哺乳類細胞の保存方法に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
さらに本発明の具体的な内容について説明すると、本発明は細胞の保存液として精製アルブミンとジメチルスルフォキシド、および単糖と、０．１〜５％のカルシウムおよびマグネシウム、または０．１〜５％のカルシウム、マグネシウムおよび銅を添加して用いるものであるが、ここで使用されるジメチルスルフォキシドは一般的に知られている市販のものを用いることができる。ジメチルスルフォキシドの使用量については、濃度が０．１％(w/w)を下回ると細胞の保存能力が薄れ、また反対に保存液全量に対して５０％(w/w)を超えても効果が変わらないので、効果と経済性の面からみて０．１％(w/w)〜５０％(w/w)の範囲内、さらに好ましくは１〜２０％(w/w)の範囲内であるのが好ましい。
【００１４】
さらにジメチルスルフォキシドに添加して使用されるアルブミンとしては、保存する細胞の種類如何によってアルブミンの種類も選択できるが、一般的にはヒト治療用のヒト細胞の保存にはヒトアルブミンの使用が最良である。しかし必ずしもこれに限られるものではなく、この他にもウシあるいは他の種に由来するものであっても使用できる。またアルブミンはどのような方法で精製されたものであっても使用できる。精製アルブミンとしては、純度がフラクションＶ程度で使用可能である。
【００１５】
アルブミンの使用濃度については、０．００１％(w/w) を下回ると効果がなく、また逆に２５％(w/w) を超えても効果は変わらない。したがって０．００１％〜２５％(w/w) の範囲で使用でき、さらに好ましくは０．１〜５％(w/w) の範囲が経済性や取り扱い性の面で良好である。
【００１６】
また金属イオンは、これを添加することにより細胞を復元した際の生細胞率（有効細胞率）およびその後の培養効率が良好となる。この場合に使用される金属イオンとしては、二価あるいは三価の各種金属イオンであり、とりわけて二価の金属イオンの使用が好ましいが、これ以外にも例えばカルシウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、銅イオン、アルミニウムイオン等の使用が考えられる。またその使用濃度については、微量でよいが、０．００００００１％（w/w）を下回ると効果が無く、また反対に１％（w/w）を超えても効果に変わりがない。したがって０．００００００１〜５％（w/w）の濃度範囲、さらに好ましくは０．１〜５％（w/w）の濃度範囲での使用が経済的である。
【００１７】
さらに糖は、これを添加することにより、やはり細胞を復元した際の生細胞率（有効細胞率）およびその後の培養効率が向上する。ここで使用される糖としてはグルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース、トレハロース、ブドウ糖等をはじめとした各種の単糖類、二糖類、三糖類が考えられ、なかでもグルコースが経済性や扱い易さの点で推奨できる。添加量については、０．１％（w/w）に満たないと効果がなく、また１０％（w/w）を超えても効果が変わらないところから、０．１〜１０％（w/w）の濃度範囲、さらに好ましくは１〜５％（w/w）の濃度範囲がよい。
【００１８】
さらにリン酸イオンは、リン酸緩衝液として用いることができ、ダルベッコリン酸緩衝液、リン酸緩衝液などの使用が可能である。また既述した二価あるいは三価の金属イオンやリン酸緩衝液の代わりに各種の培養液を使用することも可能である。さらに細胞の保存としては、一例を挙げれば低温保存用のチューブ中に細胞を１×１０^３から１×１０^８個／ｍｌとなるように細胞保存液中に懸濁し、これを摂氏ー８０度あるいは液体窒素中に保存する。なおこの場合、保存が短期間であれば−４℃〜−２０℃程度でもよい。また前記した細胞の保存液を用い、これに細胞を懸濁させるとともに、これを複数の細胞保存用容器に分注し、予備凍結無しで凍結保存することができる。
【００１９】
また保存に際し、細胞保存液に懸濁した細胞は、プログラムフリーザーなどにより徐々に温度を下げることもできるが、直接急速に低温化して保管することも可能である。さらに凍結保存された細胞の復元について述べると、低温保存された細胞を室温あるいは３７℃の恒温槽内にて融解させ、さらにこれを遠心分離機を用いた遠心分離などの操作により、細胞と細胞保存液とを分離して復元させることができる。また分離した細胞は適当な培養液などで洗浄後、通常の方法により培養をおこなうことができる。
【００２０】
なお細胞の保存性能について評価する方法について述べれば、細胞保存液中に細胞を懸濁し、これを凍結した後、数時間から数日間、また場合によっては数年にわたって凍結のまま保存するとともに、本凍結保存細胞を室温に戻した後、培養し、この時に生きている細胞数を計測することによりおこなうことができる。
【００２１】
【実施例】
以下において実施例により本発明をさらに詳しく説明する
〔１．細胞保存液の調製〕
電子天秤（東京硝子器機株式会社、416-65-81-01）により、炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業株式会社、191-01305 試薬特級）を１．８ｇ、Ｄ(+) グルコース（和光純薬工業株式会社、041-00595 試薬特級）を３００ｇ、ＨＥＰＥＳ（株式会社同仁化学研究所、324-01375 試薬特級）を３．６ｇ、ＰＢＳ(-) 粉末（日水製薬株式会社、05913 ）を９６ｇそれぞれ秤量し、１０リットルのビーカー（旭テクノグラス株式会社、1000BK10000）に入れた。
【００２２】
さらに１０リットルメスシリンダー（株式会社サンプラテック、1079）で注射用水（光製薬株式会社）８リットルを秤量し、前記した１０リットルのビーカー内に加え、これをマグネティクスターラー（旭テクノグラス株式会社、BS-38）で攪拌、溶解した。さらに２リットルメスシリンダー（旭テクノグラス株式会社、3022CYL2000S）でＤＭＳＯ（ナカライテスク株式会社、134-07）１リットルを秤量し、これを前記した１０リットルのビーカー内に加え、マグネティクスターラーで撹拌した。
【００２３】
溶解後、電子天秤で、塩化カルシウム（和光純薬工業株式会社、039-00475 ）を１g 、塩化マグネシウム六水和物（和光純薬工業株式会社、135-00165 ）を１g それぞれ秤量し、これらを前記１０リットルのビーカー内に加え、マグネティックスターラー（旭テクノグラス株式会社、BS-38 ）で撹拌し、溶解した。ＢＳＡ（シグマアルドリッチジャパン株式会社、A-2934）を１００ｇ秤量し、これを前記１０リットルのビーカー内に入れた。溶解後、注射用水で１０リットルまでメスアップして十分に溶解した後、スパイラルキャップＰＦ（日本ジェネティクス株式会社、12981 ）でろ過し、細胞保存液を調製した。
【００２４】
〔２．P3U1細胞を用いた細胞保存液の細胞保存性能の確認〕
あらかじめ、マウスミエローマ由来の細胞であるP3U1細胞を、培養用炭酸ガスインキュベータ（株式会社ヒラサワ、CPD-300A）内で、RPMI1640＋7S（株式会社日研生物医学研究所、GM1104）４５０mlとウシ胎児血清（ライフテックオリエンタル株式会社、26140-079 ）を５０ml混ぜた培地を培養用培地とし、培養用フラスコ（住友ベークライト株式会社、MS-2080R）で培養しておいた。
【００２５】
そのP3U1細胞浮遊液から１０μｌをピペット（株式会社ニチリョー、NPX-20）で取り出し、あらかじめトリパンブルー溶液（シグマアルドリッチジャパン株式会社、T-8154）20μl を入れておいた５００μｌチューブ（旭テクノグラス株式会社、12301MTB0.5 ）に入れ、軽く撹拌したあと、血球計算版（エルマ販売株式会社、03-202-2）に溶液の一部を乗せ、倒立顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社、CK-2）下で細胞数を数えた。
【００２６】
細胞数は生細胞数が７．０×１０^５個／ml であった。その細胞浮遊液５０mlづつを遠心管（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、2070）２本にそれぞれ移し、１５００ｒｐｍで１０分間、２０℃の条件下で遠心し（株式会社コクサン、H700FR）、P3U1細胞を沈殿させた。上澄みをデカンテーションで捨て、沈殿した細胞を試験管ミキサー（旭テクノグラス株式会社、MS-1）を用いて細胞を均一にほぐし、細胞濃度が４．４×１０^６個／ｍｌになるように〔１．〕で作製した細胞保存液で、細胞が均一になるように懸濁し、セラムチューブ（旭テクノグラス株式会社、2722-002 ）に総細胞数が４．４×１０^６個／チューブとなるように分注した。その後、チューブラック（旭テクノグラス株式会社、9791-081）に入れ、−８０℃フリーザー（三洋電機株式会社、MDF-382 ）に保存した。
【００２７】
〔３．凍結保存したP3U1細胞の取り出しと復活化〕
〔２．〕で保存した P3U1 細胞を保存してから１年後に、−８０℃フリーザーから取り出し、あらかじめ３７℃に温めておいたヒートブロック（タイテック株式会社、TAL-1G）に４分間入れて溶解した。クリーンベンチ内（三洋電機株式会社、MCV-131BNF）で１５ml遠沈管（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、2095）に洗浄用培地（株式会社日研生物医学研究所、CM1101）を無菌的に１０ml入れ、そこにヒートブロックで温めて溶解した P3U1 細胞をスポイト（旭テクノグラス株式会社、SM251-1S）で移し、雰囲気温度２０℃、回転数１２００ｒｐｍの条件下で５分間遠心した。
【００２８】
遠心後、上澄みをデカンテーションで捨て、沈殿した細胞を試験管ミキサーを用いて細胞を均一にほぐし、培養用培地２mlに懸濁後、２４ウエル培養用シャーレ（旭テクノグラス株式会社、1820-024N ）に移した。 P3U1細胞浮遊液から１０ｍｌをピペットで取り出し、あらかじめトリパンブルー溶液２０ｍl を入れておいた５００ｍl チューブに入れ、軽く撹拌したあと、血球計算版に溶液の一部を乗せ、倒立顕微鏡下で細胞数を数えた。
【００２９】
その結果、保存した P3U1 細胞の生細胞数（有効細胞数）は４．２×１０^６個であり、細胞保存直前の細胞数が４．４×１０^６個／チューブであったことから生細胞率は９６％であることが確認された。培養３日後に顕微鏡下で観察したところ、P3U1細胞が増殖している事を確認した。これらの結果から本発明の細胞保存液は優れた細胞保存効果を有することがわかった。
【００３０】
〔４．K562細胞を用いた細胞保存液の細胞保存性能の確認〕
あらかじめ、ヒト白血病由来の細胞であるK562細胞を、〔２．〕と同様の操作により培養し、細胞数を数えたところ、細胞数は生細胞数が７．０×１０^５個／mlであった。その細胞浮遊液、５０mlを遠心管（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、2070）２本に移し、雰囲気温度２０℃、回転数１５００ｒｐｍ、の条件で遠心分離機（株式会社コクサン、H700FR）により１０分間遠心し、K562細胞を沈殿させた。
【００３１】
上澄みをデカンテーションで捨て、沈殿した細胞を試験管ミキサー（旭テクノグラス株式会社、MS-1）を用いて細胞を均一にほぐし、細胞濃度が３．０×１０^６個／mlになるように細胞保存液で、細胞が均一になるように懸濁し、セラムチューブ（旭テクノグラス株式会社、2722-002）に総細胞数が３．０×１０^６コ／チューブとなるようにした。その後、チューブラック（旭テクノグラス株式会社、9791-081）に入れ−８０℃フリーザー（三洋電機株式会社、MDF-382）に保存した。
【００３２】
〔５．凍結保存したK562細胞の取り出しと復活化〕
〔４・〕で保存したK562細胞を、保存してから１年後に、〔３．〕と同様に、取り出しと復活化をおこなった。その結果、K562細胞の生細胞数は２．９×１０^６個であり、細胞保存直前の細胞数が３．０×１０^６個／チューブであったことから生細胞率は９５％であることが確認された。次いで２４ウエル培養用シャーレにK562細胞を移して培養した。培養３日後に顕微鏡下で観察したところ、K562細胞が増殖している事を確認した。これらの研究結果から、本発明の細胞保存液は優れた細胞保存効果を有することがわかった。
【００３３】
【発明の効果】
以上詳述した通り、本発明は細胞保存液として精製アルブミンとジメチルスルフォキシドを含有し、さらに助剤として単糖と、０．１〜５％のカルシウムおよびマグネシウム、または０．１〜５％のカルシウム、マグネシウムおよび銅を添加するものであるために、血清および培養液共に含ませる必要が無く、その結果自家調製した細胞保存液を他の細胞の保存液として使用することも可能になり、また血清含有の細胞保存液のように、血清含有成分として各種サイトカインや増殖因子、ホルモン等のほか、アミノ酸や各種イオン等をはじめとした、本来細胞保存に不必要な多くの成分を含む培養液を用いる必要がないことから、特に培養する細胞毎に異なった培養液を使用して細胞の性質を変え、あるいは未知ウイルスの混入を許容したりする危険がなく、さらには細胞毎に異なったロットの血清を使用する必要がない。
【００３４】
しかも保存液成分が明瞭で品質的にきわめて安定であり、かつ細胞保存性能に優れた保存液および細胞保存方法を提供することができる。また本発明の細胞保存液は、とくに哺乳類細胞の保存に適するが、このほかにもプロトプラストをはじめとする植物細胞や生殖細胞の保存等にも使用することができる。さらに本発明の細胞保存液を使用して各種細胞バンクを効率的に構築することも可能である。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a cell preservation solution containing purified albumin and dimethyl sulfoxide and a cell preservation method using the preservation solution, and an object thereof is to improve the restored effective cell rate after preservation.
[0002]
[Prior art]
Cell storage solutions and storage methods are not uniform depending on the type of cells from which they are derived. For example, in the case of a cell such as a microorganism, the microorganism is suspended in a microorganism culture medium generally containing about 10% glycerol and stored at a low temperature, or the microorganism itself is lyophilized. It is done to save in. In the case of mammalian cells, it is generally suspended in a culture solution containing fetal bovine serum supplemented with about 10% dimethyl sulfoxide, precooled, and then stored in a liquid nitrogen storage. It is done to save.
[0003]
Furthermore, in the case of germ cells such as sperm, a phosphate buffer solution containing albumin alone is used as a preservation solution. In the case of the mammalian cell preservation described above, there are a type containing serum and a type not containing serum in the preservation solution. Examples of the type containing serum include cells containing serum and dimethyl sulfoxide in the culture solution, for example. Stock solutions are known. As a type not containing serum, a cell preservation solution containing carboxymethyl cellulose instead of serum is known (Japanese Patent Laid-Open No. 6-46840).
[0004]
However, those that do not contain serum have low cell preservation performance, and since normal serum contains serum, cell preservation solutions containing serum are often used. In addition, since mammalian cells are generally more difficult to store than microbial cells and germ cells, mammalian cell storage solutions are used instead for storing microbial cells and germ cells that are easier to store than mammalian cells. It is also done.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the case of a preservation solution containing serum, not only a different culture solution is used for each cell to be cultured, but also different lots for each cell are used for serum. It is difficult to use a cell preservation solution prepared in-house as a preservation solution for other cells. In addition, serum-containing cell preservation solutions not only contain various cytokines, growth factors, hormones, etc. as serum-containing components, but are also suitable for cell preservation, including amino acids and various ions. As a result of using a culture solution containing many unnecessary components, there is a possibility that the properties of preserved cells may be changed, and the problem of influence by unknown viruses that may be contained in serum is also inherent.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As described above, in the case of serum-containing cell preservation solutions, the quality of the cells is stable because there is a risk of changing the nature of the preserved cells, the risk of contamination with unknown viruses, and the contents of the preservation solution are unclear. In order to prevent these problems from occurring in the present invention, the serum and the culture solution are not included, and the cells have clear and excellent cell preservation performance. A preservation solution and a cell preservation method using the preservation solution were developed, and various experiments were repeated.
[0007]
As a result, surprisingly, albumin contained in the phosphate buffer used to store germ cells has been mixed with dimethyl sulfoxide, which has been used as an additive to serum-containing storage solutions. Serum and culture medium-free cell preservation solutions, which are supplemented with auxiliary substances such as phosphate ions, divalent metal ions, and monosaccharides as necessary, are used as mammalian bases. And found that it has excellent cell preservation performance for preservation of microbial cells and germ cells.
[0008]
Specifically, the invention of claim 1 contains purified albumin and dimethyl sulfoxide, and further monosaccharides and 0.1 to 5% calcium and magnesium, or 0.1 to 5% as auxiliaries. It is related with the preservation | save liquid of the mammalian cell which adds calcium, magnesium, and copper . The invention according to claim 2 relates to the mammalian cell preservation solution according to claim 1, wherein the purified albumin is derived from bovine.
[0009]
Furthermore, the invention of claim 3 relates to the mammalian cell preservation solution according to claim 1 or claim 2, wherein the monosaccharide is glucose.
[0010]
Furthermore, the invention of claim 4 relates to the mammalian cell preservation solution according to any one of claims 1 to 3, wherein the concentration of purified albumin is in the range of 0.01 to 25% (w / w). Furthermore, the invention of claim 5 relates to the mammalian cell preservation solution according to any one of claims 1 to 3 , wherein the concentration of purified albumin is in the range of 0.1 to 5% (w / w). Furthermore, the invention of claim 6 is the mammalian cell preservation solution according to any one of claims 1 to 5 , wherein the concentration of dimethyl sulfoxide is in the range of 0.1 to 50% (w / w). About. Furthermore, the invention of claim 7 relates to the preservation solution for mammalian cells according to any one of claims 1 to 5 , wherein the concentration of dimethyl sulfoxide is in the range of 1 to 20% (w / w).
[0011]
Furthermore, the invention of claim 8 relates to the mammalian cell preservation solution according to any one of claims 1 to 7 , wherein the monosaccharide concentration is in the range of 0.1 to 10% (w / w). Furthermore, the invention of claim 9 relates to the mammalian cell preservation solution according to any one of claims 1 to 7, wherein the concentration of the monosaccharide is in the range of 1 to 5% (w / w).
[0012]
The invention of claim 10, using a storage solution of a mammalian cell according to claim 1-9, together with suspended mammalian cells to which the dispensed into a plurality of cell storage container, rapidly - The present invention relates to a method for preserving mammalian cells characterized by being cryopreserved at 80 ° C.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Further, the specific contents of the present invention will be described. The present invention provides purified albumin, dimethyl sulfoxide, and monosaccharide , 0.1 to 5% calcium and magnesium, or 0.1 to 5 as a cell preservation solution. % Of calcium, magnesium and copper are used for addition, and dimethyl sulfoxide used here can be a commonly known commercially available one. Regarding the amount of dimethyl sulfoxide used, if the concentration falls below 0.1% (w / w), the storage capacity of the cells decreases, and conversely, it exceeds 50% (w / w) with respect to the total amount of the preservation solution. However, the effect does not change, so in terms of effect and economy, it is in the range of 0.1% (w / w) to 50% (w / w), more preferably in the range of 1 to 20% (w / w) Is preferably within.
[0014]
Furthermore, as the albumin used by adding to dimethyl sulfoxide, the type of albumin can be selected depending on the type of cells to be stored, but generally human albumin is used for storing human cells for human treatment. Is the best. However, the present invention is not necessarily limited to this, and any other thing derived from cattle or other species can also be used. Moreover, albumin can be used even if it refine | purified by what kind of method. Purified albumin can be used with a purity of about fraction V.
[0015]
With regard to the concentration of albumin used, if it is less than 0.001% (w / w), no effect is obtained, and conversely if it exceeds 25% (w / w), the effect is not changed. Therefore, it can be used in the range of 0.001% to 25% (w / w), and more preferably in the range of 0.1 to 5% (w / w) in terms of economy and handleability.
[0016]
In addition, the addition of metal ions improves the viable cell rate (effective cell rate) and subsequent culture efficiency when cells are restored. The metal ions used in this case are various divalent or trivalent metal ions, and in particular, the use of divalent metal ions is preferable. For example, calcium ions, magnesium ions, iron ions, Use of zinc ions, copper ions, aluminum ions, etc. is conceivable. The use concentration may be very small, but if it is less than 0.0000001% (w / w), there is no effect, and conversely if it exceeds 1% (w / w), the effect does not change. Therefore, it is economical to use in the concentration range of 0.0000001 to 5% (w / w), more preferably in the concentration range of 0.1 to 5% (w / w).
[0017]
Furthermore, the addition of sugar improves the viable cell rate (effective cell rate) when cells are restored and the subsequent culture efficiency. The sugars used here include various monosaccharides such as glucose, galactose, fructose, ribose, trehalose, and glucose, disaccharides, and trisaccharides. Among them, glucose is economical and easy to handle. Can be recommended. With respect to the amount added, there is no effect unless it is less than 0.1% (w / w), and the effect does not change even if it exceeds 10% (w / w). A concentration range of w), more preferably 1 to 5% (w / w) is preferable.
[0018]
Further, phosphate ions can be used as a phosphate buffer, and Dulbecco's phosphate buffer, phosphate buffer, and the like can be used. In addition, various culture solutions can be used in place of the divalent or trivalent metal ions or phosphate buffer described above. Further, as an example of cell preservation, cells are suspended in a cell preservation solution at 1 × 10 ³ to 1 × 10 ⁸ cells / ml in a cryopreservation tube, and this is suspended at −80 degrees Celsius. Alternatively, store in liquid nitrogen. In this case, the temperature may be about −4 ° C. to −20 ° C. as long as the storage is short. In addition, the above-described cell preservation solution can be used to suspend cells, dispense them into a plurality of cell storage containers, and store them frozen without pre-freezing.
[0019]
During storage, cells suspended in a cell preservation solution can be gradually lowered in temperature by a program freezer or the like, but can also be stored at a reduced temperature directly and rapidly. Further, the restoration of the cryopreserved cells will be described. The cryopreserved cells are thawed in a constant temperature bath at room temperature or 37 ° C., and further, the cells are separated from each other by an operation such as centrifugation using a centrifuge. The preservation solution can be separated and restored. The separated cells can be cultured by a usual method after washing with an appropriate culture solution or the like.
[0020]
To describe the method for evaluating the preservation performance of cells, suspend cells in a cell preservation solution, freeze them, and store them frozen for several hours to several days, or even several years. The cryopreserved cells can be returned to room temperature, cultured, and the number of living cells can be counted at this time.
[0021]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples [1. Preparation of cell preservation solution
Using an electronic balance (Tokyo Glassware Co., Ltd., 416-65-81-01), 1.8 g of sodium hydrogen carbonate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 191-01305 reagent grade), D (+) glucose (Wako Pure Chemical) Kogyo Co., Ltd., 041-00595 reagent grade) 300g, HEPES (Dojindo Laboratories Ltd., 324-01375 reagent grade) 3.6g, PBS (-) powder (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., 05913) 96g each Weighed and placed in a 10-liter beaker (Asahi Techno Glass Co., Ltd., 1000BK10000).
[0022]
Further, 8 liters of water for injection (Hikari Pharmaceutical Co., Ltd.) was weighed with a 10 liter graduated cylinder (Sampra Tech Co., Ltd., 1079) and added to the 10 liter beaker described above. -38) was stirred and dissolved. Furthermore, 1 liter of DMSO (Nacalai Tesque, Inc., 134-07) was weighed with a 2 liter graduated cylinder (Asahi Techno Glass Co., Ltd., 3022CYL2000S), added to the 10 liter beaker, and stirred with a magnetic stirrer. .
[0023]
After dissolution, weigh 1g of calcium chloride (Wako Pure Chemical Industries, 039-00475) and 1g of magnesium chloride hexahydrate (Wako Pure Chemical Industries, 135-00165) with an electronic balance. In addition to the 10-liter beaker, the mixture was stirred and dissolved with a magnetic stirrer (Asahi Techno Glass Co., Ltd., BS-38). 100 g of BSA (Sigma Aldrich Japan Co., A-2934) was weighed and placed in the 10 liter beaker. After dissolution, the solution was made up to 10 liters with water for injection and sufficiently dissolved, followed by filtration with spiral cap PF (Nippon Genetics, 12981) to prepare a cell preservation solution.
[0024]
[2. Confirmation of cell preservation performance of cell preservation solution using P3U1 cells)
In advance, P3U1 cells derived from mouse myeloma were cultured in a carbon dioxide incubator for culture (Hirasawa Co., Ltd., CPD-300A) with 450 ml RPMI1640 + 7S (Nikken Biomedical Research Institute, Inc., GM1104) and fetal bovine serum (Life A medium in which 50 ml of Tech Oriental Co., Ltd., 26140-079) was mixed was used as a culture medium, and cultured in a culture flask (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., MS-2080R).
[0025]
Remove 10 μl from the P3U1 cell suspension with a pipette (Nichiyo Co., Ltd., NPX-20), and add 500 μl of trypan blue solution (Sigma Aldrich Japan Co., Ltd., T-8154) in advance (Asahi Techno Glass Co., Ltd.) , 12301MTB0.5), lightly agitate, place a portion of the solution on a hemocytometer (Elma Sales Co., Ltd., 03-202-2), and under an inverted microscope (Olympus Optical Co., Ltd., CK-2) To count the number of cells.
[0026]
The number of cells was 7.0 × 10 ⁵ cells / ml. Transfer 50 ml of each cell suspension to two centrifuge tubes (Nippon Becton Dickinson Co., Ltd., 2070), and centrifuge at 1500 rpm for 10 minutes at 20 ° C (Kokusan Co., Ltd., H700FR) to precipitate P3U1 cells. I let you. The supernatant is discarded by decantation, and the precipitated cells are evenly loosened using a test tube mixer (Asahi Techno Glass Co., Ltd., MS-1) so that the cell concentration becomes 4.4 × 10 ⁶ cells / ml. [1. In the cell preservation solution prepared in step 2), the cells are suspended in a uniform manner, and the total number of cells is 4.4 × 10 ⁶ cells / tube in a serum tube (Asahi Techno Glass Co., Ltd., 2722-002). Dispensed. After that, it was put in a tube rack (Asahi Techno Glass Co., Ltd., 9791-081) and stored in a −80 ° C. freezer (Sanyo Electric Co., Ltd., MDF-382).
[0027]
[3. (Removal and restoration of cryopreserved P3U1 cells)
[2. One year after storing the P3U1 cells stored in the above, the cells were removed from the −80 ° C. freezer and placed in a heat block (Taitech Co., Ltd., TAL-1G) previously warmed to 37 ° C. for 4 minutes for lysis. In a clean bench (Sanyo Electric Co., Ltd., MCV-131BNF), aseptically put 10 ml of washing medium (Nikken Biomedical Research Institute, CM1101) into a 15 ml centrifuge tube (Nippon Becton Dickinson Co., Ltd., 2095) P3U1 cells that had been warmed and lysed with a heat block were transferred with a dropper (Asahi Techno Glass Co., Ltd., SM251-1S), and centrifuged for 5 minutes under the conditions of an atmospheric temperature of 20 ° C. and a rotational speed of 1200 rpm.
[0028]
After centrifugation, the supernatant is discarded by decantation, and the precipitated cells are uniformly loosened using a test tube mixer, suspended in 2 ml of culture medium, and then cultured in a 24-well culture dish (Asahi Techno Glass Co., Ltd., 1820-024N). ). Remove 10 ml from the P3U1 cell suspension with a pipette, put it in a 500 ml tube containing 20 ml trypan blue solution in advance, lightly stir, place a portion of the solution on the hemocytometer, and count the number of cells under an inverted microscope. It was.
[0029]
As a result, the number of viable cells (effective cells) of the stored P3U1 cells was 4.2 × 10 ⁶ cells, and the number of cells immediately before cell storage was 4.4 × 10 ⁶ cells / tube. The rate was confirmed to be 96%. When observed under a microscope after 3 days of culture, it was confirmed that P3U1 cells were proliferating. From these results, it was found that the cell preservation solution of the present invention has an excellent cell preservation effect.
[0030]
[4. (Confirmation of cell preservation performance of cell preservation solution using K562 cells)
In advance, K562 cells, which are cells derived from human leukemia, are prepared according to [2. ] And the number of cells was counted. As a result, the number of living cells was 7.0 × 10 ⁵ cells / ml. Transfer 50 ml of the cell suspension to two centrifuge tubes (Nippon Becton Dickinson Co., Ltd., 2070), and centrifuge for 10 minutes using a centrifuge (Kokusan Co., Ltd., H700FR) at an atmospheric temperature of 20 ° C. and a rotation speed of 1500 rpm. And K562 cells were precipitated.
[0031]
The supernatant is discarded by decantation, and the precipitated cells are uniformly loosened using a test tube mixer (Asahi Techno Glass Co., Ltd., MS-1) so that the cell concentration becomes 3.0 × 10 ⁶ cells / ml. The cells were suspended in a cell preservation solution so as to be uniform, and the total number of cells was adjusted to 3.0 × 10 ⁶ cells / tube in a serum tube (Asahi Techno Glass Co., Ltd., 2722-002). After that, it was put in a tube rack (Asahi Techno Glass Co., Ltd., 9791-081) and stored in a -80 ° C freezer (Sanyo Electric Co., Ltd., MDF-382).
[0032]
[5. (Removal and restoration of cryopreserved K562 cells)
One year after the K562 cells stored in [4.] are stored, [3. ] And took out and revived. As a result, the number of living cells of K562 cells was 2.9 × 10 ⁶ cells, and the number of cells immediately before cell storage was 3.0 × 10 ⁶ cells / tube, so the viable cell rate was 95%. Was confirmed. Next, K562 cells were transferred to a 24-well culture dish and cultured. Observation under a microscope after 3 days of culture confirmed that K562 cells had proliferated. From these research results, it was found that the cell preservation solution of the present invention has an excellent cell preservation effect.
[0033]
【The invention's effect】
As described above in detail, the present invention contains purified albumin and dimethyl sulfoxide as a cell preservation solution, and further, a monosaccharide as an auxiliary, 0.1 to 5% calcium and magnesium, or 0.1 to 5%. Because of the addition of calcium, magnesium and copper, it is not necessary to contain both serum and culture solution, and as a result, it becomes possible to use a cell preservation solution prepared in-house as a preservation solution for other cells, In addition to various cytokines, growth factors, hormones, etc. as serum-containing components such as serum-containing cell preservation solutions, the culture solution contains many components that are not essential for cell preservation, including amino acids and various ions. Since it is not necessary to use a different culture solution for each cell to be cultured, the properties of the cells can be changed, or contamination with unknown viruses can be allowed. There is no danger that, further there is no need to use the serum of different lots for each cell.
[0034]
In addition, it is possible to provide a preservation solution and a cell preservation method in which the preservation solution components are clear, the quality is extremely stable, and the cell preservation performance is excellent. The cell preservation solution of the present invention is particularly suitable for preservation of mammalian cells, but can also be used for preservation of plant cells such as protoplasts and germ cells. Further, various cell banks can be efficiently constructed using the cell preservation solution of the present invention.

Claims

Mammals containing purified albumin and dimethyl sulfoxide and further supplemented with monosaccharides and 0.1 to 5% calcium and magnesium, or 0.1 to 5% calcium, magnesium and copper as auxiliaries Cell preservation solution.

The preservation solution for mammalian cells according to claim 1, wherein the purified albumin is derived from bovine.

The preservation solution for mammalian cells according to claim 1 or 2, wherein the monosaccharide is glucose.

The mammalian cell preservation solution according to any one of claims 1 to 3, wherein the concentration of the purified albumin is in the range of 0.01 to 25% (w / w).

The mammalian cell preservation solution according to any one of claims 1 to 3, wherein the concentration of the purified albumin is in the range of 0.1 to 5% (w / w).

The preservation | save liquid of the mammalian cell of any one of Claims 1-5 whose density | concentration of a dimethyl sulfoxide exists in the range of 0.1-50% (w / w).

The preservation | save liquid of the mammalian cell of any one of Claims 1-5 whose density | concentration of a dimethyl sulfoxide exists in the range of 1-20% (w / w).

The preservation | save liquid of the mammalian cell of any one of Claims 1-7 whose density | concentration of a monosaccharide exists in the range of 0.1-10% (w / w).

The preservation | save liquid of the mammalian cell of any one of Claims 1-7 whose density | concentration of a monosaccharide exists in the range of 1-5% (w / w).

A mammalian cell preservation solution according to any one of claims 1 to 9 , wherein the mammalian cells are suspended therein and dispensed into a plurality of cell storage containers, and rapidly frozen and stored at -80 ° C. A method for preserving mammalian cells characterized by the above.