JP4220382B2 - 新しいビスホスホナート誘導体、その製造法及び使用 - Google Patents

Description

本発明は、１−ヒドロキシメチレン−１，１−ビスホスホン酸又はビスホスホナートの新しい誘導体、これらを含む医薬組成物、並びに特に癌性腫瘍及びウイルス性又は炎症性肝疾患の処置のための、治療法におけるこれらの適用に関する。本発明はまた、このような誘導体の製造方法を開示する。

１−ヒドロキシメチレン−１，１−ビスホスホン酸の誘導体は、卓越した抗腫瘍性を示し、よってその医学的応用は、徹底的な研究の対象となっている。Ｐ−Ｃ−Ｐ結合を特徴とする、このような誘導体は、ピロホスホナートの安定な類似体であり、そして酵素的加水分解に対して抵抗性である。ジホスホン酸誘導体の治療応用に関して、種々の誘導体が、炎症、骨粗鬆症又はある種の骨転移の治療に有用な性質を有することは周知である。特に、これらは、骨吸収を阻害するその能力のため、異常カルシウム代謝を特徴とする、多数の疾患を治療するために使用される。乳癌又は前立腺癌のような、ある型の癌の転移において、骨吸収は病的に増大し、そして年齢に関係するものを含む様々な形の骨粗鬆症において亢進する。この型の転移のある患者は、いまやビスホスホナートを含む治療法の恩恵を受けることができる（Dielら, 2000；Lipton, 2000；Minceyら, 2000）。骨は、３番目に多く見られる転移の部位であり、癌で死亡する患者の８０％以上では、剖検で骨腫瘍があることを指摘しなければならない。

幾つかのジホスホン酸誘導体、及びその種々の応用における有用な性質は、文献に報告されてきた。

例えば、ジドロン酸（didronic acid）は、骨粗鬆症のような骨疾患の治療における薬物のために活性であることが久しく知られており、そして更に詳細には、ジドロン酸二ナトリウムがフランス特許8,441Mに記載されている。骨吸収を阻害し、そして骨粗鬆症の治療に使用することができる、アレンドロン酸に関係する誘導体が、例えば、米国特許4,705,561に記載されている。抗炎症性を有するイバンドロン酸に関係する、別の類似の構造は、英国特許2,312,165に記載されている。

アミノ酸を伴い、そして抗腫瘍及び骨吸収活性を有する、アルカン−１，１−ジホスホン酸は、ＰＣＴ特許出願WO 97/49711に記載されている。１位にフェニル置換基を含む、他のジホスホン酸誘導体は、米国特許4,473,560（その抗炎症活性、更に詳細には抗関節炎活性を開示している）に記載されているか、あるいは抗新生物活性を有するフェノール置換ジホスホナートに関するＰＣＴ特許出願WO 97/04785に記載されている。更に、ヨーロッパ特許EP 537,008は、親油性基を有するジホスホナート誘導体を記載しているが、これは、ｒａｓ腫瘍遺伝子に由来する新生物の形質転換をブロックしそうな、タンパク質プレニルトランスフェラーゼを阻害する医薬の調製において有用である。

ビスホスホナートのこの抗破骨作用は、メバロン酸経路及びコレステロール合成の阻害を介する、破骨細胞におけるアポトーシスの誘導により出現すると仮定されている（Luckmanら, 1998）。

ビスホスホナートは、インビトロで乳癌細胞（Fromigueら, 2000；Hiragaら, 2001；Jagdevら, 2001；Senaratneら, 2000；Yonedaら, 2000）及び前立腺癌細胞（Leeら, 2001）の増殖を阻害する。このインビトロ阻害は、腫瘍細胞のアポトーシスに起因し、ｂｃｌ−２遺伝子の発現（Senaratneら, 2000）及びカスパーゼの活性化（Fromigueら, 2000）を伴う。

上述の作用の他にも、ビスホスホナートは、骨マトリックスへの乳癌細胞の付着のインビトロでの阻害（Boissierら, 1997；Van der Pluijmら, 1996）、骨髄腫細胞アポトーシスのインビトロでの誘導（Shipmanら, 1997, 1998, 2000a）又は乳癌若しくは前立腺癌細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼの活性（しかし産生ではない）の阻害（Boissierら, 2000；Ichinoseら, 2000；Teronenら, 1997）のような、幾つかの別の作用を有することもある。

ビスホスホナートはまた、リンパ芽球性白血病の治療においても利用されている（Ogiharaら, 1995；Takagiら, 1998）。白血病細胞は、骨髄において脈管形成を誘導するが、このことは、これらの増殖に必要である。ビスホスホナートによるリンパ芽球性白血病の治療は、脈管形成の顕著な低下を伴う（Perez-Ataydeら, 1997）。

最新のデータは、骨転移の形成において脈管形成因子の関与の可能性が非常に高いことを指し示している。例えば、実験的乳癌細胞転移のインビボのマウスモデルにおける研究（ＭＤＡ ＭＢ２３１）では、Van der Pluijmら（2001）は、腫瘍細胞における脈管形成因子（ＶＥＧＦ）及び骨溶解因子（ＰＴＨ）の発現の増大が、骨転移の骨親和性及び骨減少に関与するという仮説を立てた。

インビトロで腫瘍細胞に及ぼすビスホスホナートの抗増殖活性は、今や充分に確立しているが、ビスホスホナートが、インビボで抗腫瘍作用を発揮できるかどうかの問題は未解決である。幾つかのデータは、骨の転移部位でのインビボのビスホスホナートの抗増殖作用を肯定すると考えられる。例えば、Hiragaら（2001）によると、ビスホスホナートは、骨における転移細胞の腫瘍組織量を縮小させるだろう。しかし、我々の知る限りでは、原発性腫瘍に及ぼすインビボのビスホスホナートの抗腫瘍作用に関するデータは報告されていない。

ビスホスホナートは、ある程度は体内で代謝され、そして活性画分は、吸収用量のわずか３〜７％である。経口投与後のビスホスホナートのこの低い生物学的利用能は、その低い親油性（Lin, 1996）に起因するが、これは、生理的ｐＨでの非常に高いイオン化状態のせいである。これらの吸収は、強い負の電荷及びこれらの分子のかなりな大きさにより更に低下する（RuifrokとMol, 1983；PadeとStavchanvsky, 1997）。更には、ビスホスホナートの吸収は、腸におけるカルシウム及び他の２価イオンとのこれらの高レベルの錯形成により更に低下する（Lin, 1996）。これらの投与は、しばしば胃腸症候及び他の副作用を引き起こす（AdamiとZamberlan, 1996；Mondeloら, 1997）。

更に、薬物耐性獲得が、今や癌治療において主要な関心事であり、そしてヒト癌の多くは、化学療法剤の作用に耐性である。

これらの治療効果を改善するために、種々のアプローチが提案されている。第１案は、ヒドロキシビスホスホン酸の側鎖にグラフトしたペプチドベクターの使用である（Ezraら, 2000）。他の研究は、ミクロスフェア（Patashnikら, 1997）又はリポソーム（Ylitaloら, 1998）への薬物の封入を示唆している。

よって本発明は、生物学的利用能が改善し、かつ充分な治療効果を持つ、新しいビスホスホナート誘導体の提供に関する。

文献に記載されている２つの合成方法により、１−ヒドロキシメチレン−１，１−ビスホスホン酸が得られる。

第１法では、目的生成物は、単一工程で得られる。この方法は、カルボン酸の混合物を亜リン酸及び三塩化リンの存在下で１００℃で数時間加熱することである。

この反応の条件は、極めて詳細に検討されてきた。事実、１９７０年以来、５０報を超える特許及び論文が発表されている。しかしこの方法の欠点は多い。実際、激しい操作条件は、不安定な物質には適していない。更に、反応媒体からのビスホスホナートの抽出は、しばしば厄介である。

第２の手順は、１−ヒドロキシメチレン−１，１−ビスホスホン酸エステルの合成と、これに続く脱アルキル化工程を伴う間接法である。α−ケトホスホナートは、典型的には、構造：Ｐ（ＯＲ）₃のホスファイト及び酸塩化物から出発して、ミハエリス・アルブゾフ（Michaelis Arbuzov）反応を介して調製される。次にビスホスホン酸エステルは通常、α−ケトホスホナートとジアルキルホスファイト：ＨＯＰ（ＯＲ）₂との反応により得られる。

脱アルキル化工程は、塩酸中での加水分解により、又はブロモトリメチルシランでの処理とこれに続くメタノリシスにより行われる。

残念ながら、これら２つの合成法のいずれでも、部分エステル化された１−ヒドロキシメチレン−１，１−ビスホスホン酸は生成しない。

よって本発明は同様に、ホスホン酸残基に１個以上のエステル官能基を位置選択的に付加させる、ビスホスホナートの製造法を提案する。

したがって、本発明の１つの目的は、下記式（Ｉ）又は（Ｉ′）：

［式中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は、同一であるか又は異なっており、それぞれ水素原子、アルキル、アリール、アシルオキシアルキル又は複素環基を表し、そしてＲ′及びＲ″は、同一であるか又は異なっており、それぞれ水素原子、アルカリ金属又はアルカリ土類原子を表し、
Ａは、式：−（ＣＨ₂）_n−Ｒ₄の基を表し、
Ｒ₄は、水素原子、アルキル基、アリール基、複素環又は式：−ＮＲ₅Ｒ₆の基を表し、
Ｒ₅及びＲ₆は、同一であるか又は異なっており、水素原子又はアルキル基を表し、
ｎは、０〜２４の整数である］により表されるビスホスホナート誘導体（ただし、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃が、同時に水素原子を表す、式（Ｉ）により表される化合物、並びにＲ′及びＲ″が、同時に水素原子を表す、式（Ｉ′）により表される化合物を除く）、その光学及び幾何異性体、そのラセミ体、その塩、その水和物並びにその混合物を含むことを特徴とする。

よって本発明は、特に治療剤として既に使用されているか、又は報告されている化合物（例えば、エチドロネート（Etidronate）（プロクター＆ギャンブル（Procter & Gamble））、アレンドロネート（Alendronate）（メルク（Merck））、パミドロネート（Pamidronate）（ノバルティス（Novartis））、オルパドロネート（Olpadronate）（ガドール（Gador））、イバンドロネート（Ibandronate）（ベーリンガー・マンハイム（Bohringer-Mannheim））、化合物ＥＢ１０５３（レオ（Leo））、化合物ＹＨ５２９（アヴェンティス（Aventis））又はレシドロネート（Residronate）（プロクター＆ギャンブル）など）に比較して、有利には良好な生物学的利用能を与える化合物を提供する。

本発明の別の目的は、少なくとも１つの上に記載されたような式（Ｉ）又は（Ｉ′）により表される化合物を、ことによると別の治療活性物質と一緒に、薬学的に許容しうる支持体中に含む、医薬組成物である。

更には、癌又は骨粗鬆症のような、異常カルシウム代謝を特徴とする疾患を処置することを目的とする、医薬組成物の製造のための、少なくとも１つの式（Ｉ）又は（Ｉ′）により表される化合物の使用に関する。

本発明の別の目的は、ウイルス性又は炎症性肝疾患を治療することを目的とする、医薬組成物の製造のための、少なくとも１つの式（Ｉ）又は（Ｉ′）により表される化合物の使用である。

本発明の最後の目的は、式（Ｉ）又は（Ｉ′）により表される化合物の製造方法である。

上述のアルキル、アリール、複素環又はアシルオキシアルキル基は、アリール基、複素環基、ヘテロシクロアルキル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキルチオ基、ハロゲン原子（好ましくはＣｌ、Ｆ、Ｂｒ）、ヒドロキシル基、ＮＯ₂基、アルコキシ基、エステル基（−ＣＯＯＲ）、アミノ基：−ＮＲＲ″′、酸残基、アミド基（−ＣＯＮＨＲ又は−ＮＨＣＯＲ）（ここで、Ｒ及びＲ″′は、相互に独立に、水素原子、アルキル、アリール、ヘテロアリール又はアシルオキシアルキル基を表す）から選択される、少なくとも１個の基により置換されていてもよい。

本発明において、「アルキル」という用語は、更に具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシルのような、１〜２４個、好ましくは１〜１２個の炭素原子を有する、直鎖、分岐又は環状炭化水素基を意味する。Ｃ₁−Ｃ₆基が特に好ましい。メチル及びエチル基は、更に好ましい。このアルキル基は、１個以上のヘテロ原子、好ましくはＮ、Ｓ、Ｏ又はＰにより中断されていてもよい。

「アルケニル」という用語は、少なくとも１個の不飽和エチレン結合を有する炭化水素基を意味し、そして「アルキニル」という用語は、少なくとも１個の不飽和アセチレン結合を有する炭化水素基を意味する。

「アリール」基は、６〜１８個の炭素原子を有する、単環、二環又は三環式の芳香族炭化水素である。例としては特に、フェニル、α−ナフチル、β−ナフチル又はアントラセニル基を含む。

「アルコキシ」基は、−Ｏ−（エーテル）結合により、化合物の残部に結合している、上に定義されたアルキル基に相当する。

「アルキルチオ」基は、−Ｓ−（チオエーテル）結合により、化合物の残部に結合している、上に定義されたアルキル基に相当する。

「アシルオキシアルキル」基は、アルキル鎖（Ｃ_1-24）、好ましくはＣ_1-4により、化合物の残部に結合している、アシルオキシ基である。アシルオキシメチル及びピバロイルオキシメチル基が、具体的な例である。

「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子を意味すると解釈される。

「ヘテロ原子」は、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される原子を意味すると解釈される。

アリールアルキル（又はアラルキル）基は、アルキル鎖によって、化合物の残部に結合している、上記と同義のアリール官能基を含む基である。

「複素環」又は「ヘテロシクロアルキル」基は、１個以上のヘテロ原子（一般にＮ、Ｏ、Ｓ又はＰ）、好ましくは１〜５個の環内ヘテロ原子を含む、５〜１８の環員を含む基である。これらは、単環、二環又は三環式であってよい。これらは、芳香族であっても、そうでなくともよい。好ましくは、そしてＲ₅に関して更に具体的には、これらは芳香族複素環である。芳香族複素環の例は、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、フラン、チオフェン、ピロール、オキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、ピラゾール、オキサジアゾール、トリアゾール、チアジアゾール及びトリアジン基を含む。二環式基の例は、特にキノリン、イソキノリン及びキナゾリン基（２個の６員環に関して）並びにインドール、ベンゾイミダゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール及びインダゾール（６員環及び５員環に関して）を含む。非芳香族複素環は、特にピペラジン、ピペリジンなどを含む。

アルカリ金属原子は、ナトリウム及びカリウムを含む。アルカリ土類原子は、カルシウムを含む。

上記と同義の式（Ｉ′）では、Ｒ′及び／又はＲ″は、好ましくは水素原子又はナトリウム、カルシウム若しくはカリウム原子を表す。

好ましい化合物は、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃が、水素原子又はＣ_1-12、特にＣ_1-6のアルキル基である、式（Ｉ）により表される。

有利には、置換基Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃の少なくとも２個が、水素原子とは異なる。

本発明の特に好ましい変種では、置換基Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は、水素原子とは異なっており、同一である。

好ましい化合物は、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃が、メチル又はエチル基を表す、式（Ｉ）により表される。

好ましい化合物は、Ａが、式：−（ＣＨ₂）_n−Ｒ₄（ここで、ｎは、１〜１２、好ましくは１〜６、有利には１〜３の整数である）の基を表す、式（Ｉ）又は（Ｉ′）により表される。

好ましい化合物は、Ｒ₄が、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基、複素環、フェニル基、又は式：−ＮＲ₅Ｒ₆の基であり、ここでＲ₅及びＲ₆が、同一であるか又は異なっており、水素原子又はＣ₁からＣ₆のアルキル基を表し、ここでｎが、有利には１〜６、好ましくは１〜３の整数である、式（Ｉ）又は（Ｉ′）により表される。

発明の特定の実施態様では、好ましい化合物は、Ａが、下記式：

から選択される基である、式（Ｉ）又は（Ｉ′）を有する。

特定の実施態様において、式（Ｉ′）の化合物は、Ａが、下記式：

を表す化合物である。

別の特定の実施態様では、本発明の化合物は、Ａが、下記式：

を表し、Ｒ₁及びＲ₃が、メチルラジカルを表し、そしてＲ₂が、水素原子を表す化合物を除いて、上記と同義の式（Ｉ）又は（Ｉ′）を与える。

本発明の化合物、そして特に式（Ｉ）の化合物は、生物学的利用能の改善（技術の現状の幾つかの既知化合物に比較して実に改善している）という利点を有する。よって本発明の化合物は、非常に満足すべき治療効果を示す。実際、本発明を任意の特定の理論に帰することはないが、本発明の化合物のエステル結合は、本化合物の親油性を増大させ、そして特にこのようにして、本化合物は、経口投与されると、胃腸障壁を効率的に超え、次にエステル結合が分解されて、対応するビスホスホン酸が放出されると考えられる。

本発明の主題はまた、式（Ｉ）及び（Ｉ′）により表される化合物の製造方法に関する。

このような製造方法は、多くの利点を持つ。これらは、工業的規模で実施すること、及び高収量のビスホスホナートを生成することが容易である。

本発明に開示される式（Ｉ）の化合物の製造方法は、以下の工程：
−式（II）：ＡＣＯＸにより表される、少なくとも１つの酸ハロゲン化物、又は式（III）：

により表される、１つのα−ケトホスホナートと、式（IV）：

［式中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は、同一であるか又は異なっており、アルキル、アリール、アシルオキシアルキル又は複素環基を表し、
Ａは、上に定義されるものであり、
Ｘは、ハロゲン原子、好ましくは塩素を表し、
ａｌｋは、Ｃ_1-6アルキル基であり、
ｘは、２又は３である］により表される、少なくとも１つの亜リン酸シリルとを接触（又は反応）させる工程、
−前工程で得られる化合物を加水分解する工程
を特徴とする。

Ｃ_1-6アルキル基は、上に同義されるようなものである。

ハロゲン原子は、塩素、臭素、ヨウ素又はフッ素原子であってよく、好ましくはＸは、塩素原子である。

Ｒ₁及びＲ₂が、水素原子とは異なるとき、式（Ｉ）により表される化合物の製造方法は、有利には以下の工程：
−式（II）：ＡＣＯＸにより表される、少なくとも１つの酸ハロゲン化物と、式（Ｖ）：Ｐ（ＯＲ₁）（ＯＲ₂）（ＯＲ）［式中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲは、同一であるか又は異なっており、アルキル、アリール、アシルオキシアルキル、又は複素環基を表す］により表される、少なくとも１つのホスファイトとを接触させて、式（III）により表される、α−ケトホスホナートを生成させる工程、
−前工程で得られるα−ケトホスホナートと、前記と同義の式（IV）により表される、少なくとも１つの亜リン酸シリルとを接触させる工程、
−前工程で得られる化合物を加水分解する工程
を特徴とする。

更に具体的には、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃が、水素原子とは異なるとき、好ましく使用される式（IV）により表される亜リン酸シリルは、ｘが、２である、式（IV）により表される化合物に相当する。

更に具体的には、Ｒ₁及びＲ₂が、水素原子とは異なり、そしてＲ₃が、水素原子であるとき、好ましく使用される式（IV）により表される亜リン酸シリルは、ｘが、３である、式（IV）により表される化合物に相当する。

Ｒ₁が、水素原子とは異なり、そしてＲ₂が、水素原子であるとき、式（Ｉ）により表される化合物の製造方法は、有利には以下の工程：
−式（II）：ＡＣＯＸにより表される、少なくとも１つの酸ハロゲン化物と、式（IV）：

［式中、Ｒ₃は、アルキル、アリール、アシルオキシアルキル、又は複素環基であり、
Ａは、上に定義されるものであり、
Ｘは、ハロゲン原子、好ましくは塩素を表し、
ａｌｋは、Ｃ_1-6アルキル基であり、
ｘは、０〜３の整数である］により表される、少なくとも１つの亜リン酸シリルとを接触させる工程、
−前工程で得られる化合物を加水分解する工程
を特徴とする。

一般に、シリル化合物と接触させる工程は、有利には化学量論条件下で行われる。しかし、Ｒ₁及びＲ₃が、水素原子とは異なり、そしてＲ₂が、水素原子である、式（Ｉ）により表される化合物を得たいときには、製造方法は、有利には、少なくとも１モル当量の、式（II）：ＡＣＯＸにより表される、少なくとも１つの酸ハロゲン化物を、少なくとも２モル当量の、式（IV）により表される、少なくとも１つの亜リン酸シリルと反応させることにより行われる。

Ｒ₁が、水素原子とは異なり、そしてＲ₂及びＲ₃が、水素原子を表すとき、式（Ｉ）により表される化合物の製造方法は、有利には、式（II）：ＡＣＯＸにより表される、少なくとも１つの酸ハロゲン化物を、ｘが、２である、式（IV）により表される、少なくとも１つの亜リン酸シリルと接触させ、そしてこうして得られる生成物を、ｘが、３である、式（IV）により表される、少なくとも１つの亜リン酸シリルと接触させることにより行われる。

式（Ｉ）により表される化合物の製造方法において、加水分解は、一般に、特にメタノール又はエタノールのような、プロトンを供与できる溶媒中で行われる。好ましくは、メタノールが利用される溶媒である。

式（Ｉ）の化合物の収量は、実質的には定量的である。更に本方法は、生成物を移し換える必要なく、上述の工程をその場で連続的に実行できる利点を有する。

一般的に言って、本発明の方法の工程は、室温（１８〜３０℃）及び大気圧で行ってよい。当然ながら、当業者ならば、必要に応じてこのような条件を変更することができる。

更に具体的には、亜リン酸シリルとの反応は、副反応の発生はないが、発熱性であることを指摘すべきであろう。この発熱性のため、このような反応は、特に塩化ニトロベンゾイルを使用するときには、室温より低い温度、特定すると−７０℃と２０℃の間の温度で行うことが必要である。

本発明の方法において加水分解工程に先立つ工程は、バルクで、又はＣＨＣｌ₃、ＴＨＦ、ＣＨ₃ＣＮ、ＣＨ₂Ｃｌ₂、若しくはエーテルのような溶媒中で行われる。有利には、これらはバルクで行われる。

加水分解工程は、有利には１〜４時間、更に具体的には約２時間行われる。好ましくは室温、１８〜３０℃の間で行われる。

加水分解工程後、本発明の方法は、好ましくは、式（Ｉ）により表される、生じた化合物の精製を含む。このような精製は、任意の既知の手段により実行される。好ましくは、精製は、適切な溶媒、特にエーテル中での少なくとも２回の連続洗浄により実行される。

本発明の方法の出発生成物は、市販されている生成物であって、そのため入手が容易である。ホスファイトに関しては、トリストリメチルシリルホスファイトが市販されている。他のホスファイトは、以下のとおり調製してもよい。ジアルキルホスファイトは、濃アンモニア溶液で０℃で処理する。水の留去後、生じた塩をヘキサメチルジシラザンで還流下で４時間処理する。この反応は、以下に略述される。

本発明の方法の反応図は、図１に描かれる。

本発明により、フェニル酢酸ビスホスホン酸は、フランス特許FR 2669348及びY. Lerouxら, Phosphorus, Sulfur and Silicon, 63, 181(1991)に記載された、ヒドロキシジホスホン酸誘導体の調製に関する方法と同様に調製することができる。このような方法によると、第１工程において、式（II）：ＡＣＯＸの酸塩化物を、ジメチルホスファイト及びトリメチルホスファイトの混合物と反応させ、次に第２工程において、前工程で得られるエステル官能基を酸加水分解により加水分解し、次いで必要ならば塩形成する。

第１工程において使用される酸塩化物は、塩化フェニルアセチル（Ｃ₆Ｈ₅−ＣＨ₂−ＣＯＣｌ）であり、反応は、好ましくはクロロホルムのような溶媒中で３０℃未満の温度、例えば室温又は０℃近い温度で、中性雰囲気下、例えば窒素雰囲気で行われる。

第２工程におけるエステル官能基の加水分解は、第１工程で得られる生成物を過剰の濃塩酸に溶解し、そして約５〜１５時間還流することにより実施することができる。

上述のように調製されるフェニル酢酸ビスホスホン酸は、９５％を超える非常に高い収率で得られる。

本発明の別の目的は、薬学的に許容しうる支持体中に、上述されるような式（Ｉ）又は（Ｉ′）により表される、少なくとも１つの化合物を含む任意の医薬組成物に関する。

有利には、これは、癌又は骨粗鬆症のような、異常カルシウム代謝を特徴とする疾患の治療又は予防を目的とする、医薬組成物である。癌は、更に具体的には、乳癌及び前立腺癌並びに白血病である。

悪性充実性腫瘍は、癌腫（９５％）及び肉腫（５％）として分類される。癌腫及び肉腫の発生は、脈管形成として知られている腫瘍の脈管化と相関している。腫瘍における脈管形成のどのような阻害によっても、腫瘍増殖を収縮、又は少なくとも停止若しくは遅延させることができる。今や、驚くべきことに本発明の化合物は、腫瘍に有効であるばかりでなく、脈管形成にも有効であることが見い出された。

本発明の医薬組成物は、特に悪性腫瘍の処置に、更に具体的には悪性充実性腫瘍の処置に有用であろう。

これらはまた、腫瘍脈管形成を部分的又は全面的に阻害するために使用されよう。

本発明の医薬組成物はまた、ウイルス性又は炎症性肝疾患の処置にも有用であろう。この特定の側面に関して、本医薬組成物は、有利には式（Ｉ′）の化合物又はフェニル酢酸ビスホスホン酸若しくはその塩を含む。

本発明はまた、予防的又は治療的にヒト又は動物の身体を処置することを目的とした医薬組成物の製造のための、式（Ｉ）又は（Ｉ′）［ここで、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は、同一であるか又は異なっており、それぞれ水素原子、アルキル、アリール、アシルオキシアルキル又は複素環基を表し、そしてＲ′及びＲ″は、同一であるか又は異なっており、それぞれ水素原子、アルカリ金属又はアルカリ土類原子を表し、
Ａは、式：−（ＣＨ₂）_n−Ｒ₄の基を表し、
Ｒ₄は、水素原子、アルキル基、アリール基、複素環又は式：−ＮＲ₅Ｒ₆の基を表し、
Ｒ₅及びＲ₆は、同一であるか又は異なっており、水素原子又はアルキル基を表し、
ｎは、０〜２４の整数である］により表される、少なくとも１つの化合物、その光学及び幾何異性体、そのラセミ体、その塩、その水和物並びにその混合物の使用に関する。

本発明の化合物は、特定の活性を示し、長期処置の場合にさえも、副作用や毒性がない。薬理及び臨床研究によって、本発明の化合物、例えば、フェニル酢酸ビスホスホン酸は、抗腫瘍、抗脈管形成及びアポトーシス促進作用を持ち、そしてこれらは、インビボとインビトロの両方で、多数の腫瘍細胞株の増殖に対して活性であることが証明されている。例えば、インビトロで、フェニル酢酸ビスホスホン酸は、細胞周期を破壊し、そして腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することにより、低用量でさえ２つのタイプの乳癌（非転移性ホルモン感受性腫瘍及び転移性ホルモン非依存性腫瘍）を代表する２つの乳癌細胞株の増殖を阻害する。インビボで、フェニル酢酸ビスホスホン酸は、ＭＣＦ７−ｒａｓ細胞の増殖及び乳腺腫瘍の生長を、処置の最初の５又は６週間以内に不可逆的にブロックするが、この作用は、処置が長期に適用されるときでさえ、何ら毒性作用なしに維持される。このようにインビボ及びインビトロの結果により、本発明の化合物のアポトーシス促進及び抗脈管形成作用が証明された。このような測定法については、以降の実施例に詳述される。

更に、研究により、ウイルスにより誘導された肝臓の炎症性病変部に及ぼすフェニル酢酸ビスホスホン酸の作用が証明されている。

これらの結果は、フェニル酢酸ビスホスホン酸、及びその薬学的に許容しうる塩、部分エステル化物、又は誘導体は、癌、そして特にヒト乳癌又は前立腺癌の処置において、また、急性及び慢性肝炎（例えば、ウイルス性又は中毒性肝炎）のような、炎症性肝疾患の処置において、効果的に使用することができる。

抗脈管形成活性もまた、病的脈管形成、例えば、糖尿病性網膜症、リウマチ性多発関節炎及び老齢による黄斑変性症の処置において重要である。

本発明の特別な側面では、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃が、同時に水素原子を表す、式（Ｉ）の化合物、並びにＲ′及びＲ″が、同時に水素原子を表す、式（Ｉ′）の化合物は、本発明から除外される。

本発明はまた、対象、特に患者に、治療有効量の上記と同義の少なくとも１つの化合物又は医薬組成物を投与することを特徴とする、癌又は骨粗鬆症のような、異常カルシウム代謝を特徴とする疾患を処置する方法に関する。

本発明の医薬組成物は、有利には１つ以上の薬学的に許容しうる賦形剤又はビヒクルを含む。例としては、薬学的使用に適合し、かつ当業者に知られている、食塩水、生理的溶液、等張液、緩衝液などが挙げられる。本組成物は、分散剤、可溶化剤、安定化剤、保存料などから選択される、１つ以上の物質又はビヒクルを含んでもよい。処方（液体及び／又は注射液及び／又は固体）中に使用してもよい物質又はビヒクルは、特にメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリソルベート８０、マンニトール、ゼラチン、乳糖、植物油、アラビアゴムなどを含む。本組成物は、持続及び／又は遅延放出を可能にする剤形又は装置によって、注射用懸濁液、ゲル剤、油剤、錠剤、坐剤、粉剤、カプセル剤などとして処方されよう。この型の処方には、セルロース、カーボネート又はデンプンのような物質が有利には使用される。

本発明の化合物又は組成物は、種々の方法で、そして様々な剤形で投与されよう。例えば、これらは、全身性経路により注射しても、又は経口投与してもよいが、好ましくは、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、動脈内経路などのような、全身性経路により投与される。注射には、本化合物は、一般に、例えば、シリンジ又は点滴により注射してもよい、懸濁液として包装される。当然のことながら、注射速度及び／又は用量は、患者、病態、投与の方法などにより、当業者が適合させてよい。典型的には、本化合物は、０．１μg〜５００mg/kg体重、更に一般的には０．０１〜１０mg/kg、典型的には０．１〜１０mg/kgの間の範囲の用量で投与される。更に、場合に応じて反復注射が行われる。更に、本発明の組成物は、他の活性物質又は剤を追加として含んでもよい。

本発明の他の側面及び利点は、以下の実施例から明らかになろうが、これらの実施例は、説明を目的として与えられるものであり、限定を加えるものではない。

実施例
他に記載がなければ、百分率は重量により表される。Ｙ：収率。

本発明の化合物の調製
１−ヒドロキシ−１−フェニルエチリデン−１，１−ビスホスホン酸の調製
クロロホルム５ml中のトリメチルホスファイト（０．０１モル）とジメチルホスファイト（０．０１モル）の混合物に、乾燥窒素下で反応混合物を撹拌しながら、０℃でクロロホルム５ml中の塩化フェニルアセチルの溶液を滴下により加えた。次にこの混合物を８０℃に約８時間加熱した。

冷却後、混合物を洗浄して、エチルエーテル中で沈殿させた。濾過により回収した白色の固体は、ビスホスホナートエステル（１−ヒドロキシ−１−フェニルエチリデン−１，１−ビスホスホナート・テトラメチルエステル）であった。

上述のように得られたビスホスホナートエステルは、大過剰の濃塩酸に再溶解し、次に１５時間還流した。この水溶液をエーテルで洗浄し、次いでロタヴェイパー（Rotavapor）で真空下、溶媒を留去した。こうして対応する酸を得た。

この酸を精製して、エーテル及びベンゼン／エーテル混合物に再沈殿させた。白色の沈殿物を濾過により回収して、１−ヒドロキシ−１−フェニルエチリデン−１，１−ビスホスホン酸が生成した。

メチル−ジ（トリメチルシリル）ホスファイトの調製
メカニカルスターラー、冷却剤、導入アンプル、温度計及び窒素注入弁を取り付けた、４つ口フラスコに、必要ならば前もって蒸留した、ジメチルホスホナート８３ｇ中の濃アンモニア溶液１００mlを滴下により加えた。得られた溶液から減圧下で溶媒を留去した。ピリジン（１００ml）及びベンゼン（２×１００ml）との反復同時蒸発後、得られた白色の固体をヘキサメチルジシラザン１４０mlで処理した。生じた混合物を６時間還流した。次にこの溶液を蒸留することにより、目的化合物を得た。

１−ヒドロキシメチレン−１，１−ビスホスホン酸の合成方法。
酸塩化物１当量を、磁石を取り付けた３つ口フラスコに不活性雰囲気（Ａｒ）下で入れた。トリス（トリメチルシリル）ホスファイト２当量を室温で撹拌しながら加えた。次にこの溶液を室温で数分間静置した。加水分解は、メタノール中で２５℃で１時間行った。揮発性画分を真空下で蒸発させた。生成物は、エーテル洗浄により精製した。

（１−ヒドロキシ−１−ホスホノ−エチル）−ホスホン酸。

（１−ヒドロキシ−１−フェニル−ホスホノ−エチル）−ホスホン酸。

（ヒドロキシ−フェニル−ホスホノ−メチル）−ホスホン酸。

（ヒドロキシ−ｐ−ニトロフェニル−ホスホノ−メチル）−ホスホン酸。

型：Ａ−Ｃ（ＯＨ）ＰＯ（ＯＨ）₂ＰＯ（ＯＭｅ）₂の生成物に関する一般作業手順
メカニカルスターラー、冷却剤、導入アンプル、温度計及び窒素注入弁を取り付けた、４つ口フラスコに、酸塩化物１当量中のトリメチルホスファイト１当量を０℃で滴下により加えた。室温で２時間の反応時間後、α−ケトホスホン酸ジメチルが完全に生成した（反応は、³¹Ｐ ＮＭＲにより追跡した）。次にトリス（トリメチルシリル）ホスファイト１当量を滴下により加えた。次いでこの溶液を１５分間撹拌した。次にメタノールを加え、この溶液を室温で２時間撹拌した。次いで溶媒及び揮発性画分を蒸発させた。生じた生成物は、白色の粉末であったが、これをエーテルでの連続洗浄により精製した。

［（ジメトキシ−ホスホリル）−ヒドロキシ−フェニル−メチル］−ホスホン酸

［（ジメトキシ−ホスホリル）−ヒドロキシ−エチル］−ホスホン酸

型：Ａ−Ｃ（ＯＨ）ＰＯ（ＯＨ）ＯＭｅＰＯ（ＯＨ）（ＯＭｅ）の生成物に関する一般作業手順
メカニカルスターラー、冷却剤、導入アンプル、温度計及び窒素注入弁を取り付けた、４つ口フラスコに、塩化物１当量中のメチル−ビス（トリメチルシリル）ホスファイト２当量を滴下により加えた。室温で１０分の反応時間後、溶液を２時間メタノール分解した。次に溶媒及び揮発性画分を蒸発させた。生じた生成物は、白色の粉末であったが、次にこれをエーテルでの連続洗浄により精製した。

［ヒドロキシ−（ヒドロキシ−メトキシ−ホスホリル）−フェニル−メチル］ホスホン酸のモノメチルエステル。

［ヒドロキシ−（ヒドロキシ−メトキシ−ホスホリル）−エチル］ホスホン酸のモノメチルエステル

［ヒドロキシ−（ヒドロキシ−メトキシ−ホスホリル）−２−フェニル−エチル］ホスホン酸のモノメチルエステル。

型：Ａ−Ｃ（ＯＨ）ＰＯ（ＯＨ）（ＯＭｅ）ＰＯ（ＯＭｅ）₂の生成物に関する一般作業手順
メカニカルスターラー、冷却剤、導入アンプル、温度計及び窒素注入弁を取り付けた、４つ口フラスコに、０℃で酸塩化物１当量中のトリメチルホスファイト１当量を滴下により加えた。室温で２時間の反応時間後、α−ケトホスホン酸ジメチルが完全に生成した（反応は、³¹Ｐ ＮＭＲにより追跡した）。次にメチル−ビス（トリメチルシリル）ホスファイト１当量を滴下により加えた。次いでこの溶液を１５分間撹拌した。次にメタノールを加え、溶液を室温で２時間撹拌した。次いで溶媒及び揮発性画分を蒸発させた。生じた生成物は、無色の油状物であった。これをエーテルでの連続洗浄により精製した。

［ヒドロキシ−（ヒドロキシ−メトキシ−ホスホリル）−フェニル−メチル］−ホスホン酸のジメチルエステル

［ヒドロキシ−（ヒドロキシ−メトキシ−ホスホリル）−エチル］−ホスホン酸のジメチルエステル

本発明の化合物の抗増殖及び抗侵襲活性
式が以下に示される、ＢＰ１及びＢＰ２と称される２つのビスホスホナートを、細胞及び動物モデルで試験した。ＢＰ１は、部分エステル化されておらず、比較例の役割を担う。

インビトロ試験
材料と方法：
ビスホスホナートＢＰ１及びＢＰ２は、様々な細胞株で試験した：
−ＦＲＣｊｕｎ ＭＲＡ、腫瘍遺伝子ｊｕｎ−４によるＦＲ３Ｔ３細胞のトランスフェクションによって産生された、マウス線維肉腫細胞株、
−Ａ４３１ヒト癌腫細胞。これらの細胞は、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）オートクリンループを収容し、免疫抑制マウスに移植後、脈管形成性の高い腫瘍の急速な発生を誘導する。
−ＭＤＡ ＭＢ４３５ヒト乳癌細胞、
−ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ、形質転換ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、
−ＢＢＣ、ウシ脳毛細血管内皮細胞。

様々な濃度のＢＰ１又はＢＰ２の存在下の細胞増殖は、培養の２４、４８及び７２時間後、ＭＴＴ試験により測定した。

インビトロ試験結果：
ビスホスホナート（０．１〜２mM）は、ＦＲＣｊｕｎＭＲＡ、ＭＤＡ ＭＢ４３５及びＡ４３１細胞の増殖を、時間−及び用量−依存的に阻害した（図２及び３）。例えば、ＢＰ２（２mM）は、培養の４８時間後、３つの細胞株の増殖を、それぞれ４０％、６０％及び３０％阻害した。ＢＰ２（２mM）の存在下で７２時間後、Ａ４３１細胞の増殖は、８０％阻害された（Ｐ＜０．０５）（図３）。

トリパンブルー排除試験は、ＢＰ１及びＢＰ２が、５mMを超える濃度であっても細胞障害性を誘導しないことを示した。

更に、ビスホスホナート（０．１〜２mM）はまた、ＨＵＶ ＥＣ Ｃ及びＢＢＣ内皮細胞の増殖を時間−及び用量−依存的に阻害した。

毒性試験
腫瘍のない免疫抑制マウスを、注射１回当たり及びマウス１匹当たり０．０６〜６mgの範囲の用量でＢＰ１及びＢＰ２で処置した。マウスには、１日に１回の注射を１週間投与した。マウスは、処置の前、間及び後に秤量した。

６mg/注射未満のＢＰ１用量及び試験した全てのＢＰ２用量（０．０６〜６mg/注射）は、処置マウスにおいて、脱毛、下痢、感染症又は貧血のような毒性の徴候を引き起こさなかった。

インビボ試験
材料と方法：
Ａ４３１細胞を、免疫抑制マウスに皮下注射した。マウスには１週間以内に腫瘍が発生した。腫瘍担持マウスは、対照群、又は様々な濃度のＢＰ１及びＢＰ２を投与される処置群にランダムに割り当てた。

マウスに、１週間に２回、腫瘍の近くの皮下注射により、対照（ｎ＝６）としてＰＢＳ ０．１mlを単独で、又はＢＰ１若しくはＢＰ２を以下の用量：０．００６（ｎ＝６）；０．０６（ｎ＝６）若しくは０．６mg/注射（ｎ＝６）で含むＰＢＳを投与した。腫瘍は、週に１回測定して、その容量Ｖを下記式により計算した：
Ｖ＝（４／３）πＲ１²Ｒ２［ここで、Ｒ１は、半径１であり、そしてＲ２は、半径２である（ただし、Ｒ１＜Ｒ２）］。

マウスを屠殺して、腫瘍を摘出し、次に秤量し、固定し、パラフィンに包埋して切片にした。腫瘍脈管形成において築かれた腫瘍血管由来の内皮細胞を、免疫組織化学的方法（ＧＳＬ１）により視覚化した。腫瘍脈管形成は、ＮＩＨ画像ソフトウェアでの画像解析により評価した。

インビボ試験結果
ビスホスホナートでの処置は、Ａ４３１腫瘍の増殖を阻害し、そして最低用量でさえ最大効果があった（図４）。５週間の処置後、ＢＰ１及びＢＰ２（０．６mg/注射/マウス）は、Ａ４３１腫瘍の増殖をそれぞれ４０％及び５６％阻害した（Ｐ＜０．０５）。

インビトロの結果とは対照的に、インビボの結果は、ＢＰ２がＢＰ１よりも大きな効果を持つことを示した。

更に、処置マウスにおけるＡ４３１腫瘍の増殖の阻害は、腫瘍内脈管形成の阻害と相関した（図５）。単位面積当たりの内皮細胞面積の有意な低下により証明される、このような阻害は、ＢＰ１及びＢＰ２の最低用量から始まり観測された。

我々の知るところでは、この合成ビスホスホナートは、原発性腫瘍にインビボで抗腫瘍作用を示し、その効果は、脈管形成の阻害と相関した、最初のものである。

フェニル酢酸ビスホスホン酸ナトリウムのインビトロ試験
細胞増殖及び細胞生存度に及ぼすフェニル酢酸ビスホスホン酸ナトリウムの作用の試験は、後述されるように実施した。

ＭＣＦ７−ｒａｓ細胞を、２４ウェルのシャーレで培養した（２０，０００細胞／ウェル）。２４時間インキュベーション後、培地（１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ）を、種々の濃度のフェニル酢酸ビスホスホナート（２mM、４mM、６mM、８mM及び１０mM）を加えた同じ培地で置換した。細胞は、３７℃で１〜４日間インキュベートした。細胞生存度は、トリパンブルー試験により制御した。

次にフェニル酢酸ビスホスホナートは、濃度が６mM未満である、培養の最初の３日間、細胞増殖抑制性であることが認められた。より高濃度（８及び１０mM）では、わずかな毒性（１０％）が観測され、これは培養の４日目までに更に重大になった（５０〜６０％）。

フェニル酢酸ビスホスホナートの作用の可逆性をチェックするために、ＭＣＦ７−ｒａｓ細胞を上昇濃度のフェニル酢酸ビスホスホナートで１０日間処理した（培地は、２日毎に交換した）。細胞を２群に分割した。１０％ウシ胎仔血清を補足したＤＭＥＭ培地を第１群に加え、１０mMのフェニル酢酸ビスホスホナートを含む同じ培地を第２群に加えた（培地は、２日毎に交換した）。１５日後、トリチウム化チミジンを４時間にわたって加えて、ベータ液体シンチグラフィーカウンター（ベックマン（Beckman））を用いて、懸濁液の放射活性を測定した。

２mMの用量では部分的に可逆的であり、そして４mMを超える用量では不可逆的である、細胞増殖の阻害が観測された。

フェニル酢酸ビスホスホン酸ナトリウムのアポトーシス促進活性
フェニル酢酸ビスホスホン酸ナトリウムの毒性の性質を決定するために、ＭＣＦ７及びＭＣＦ７−ｒａｓ細胞を培養し、次いで２４時間後に洗浄し、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地で３時間培養した。フェニル酢酸ビスホスホナート（１０mM）を一方の群に加えたが、もう一方の群には加えなかった。アポトーシスは、ＦＩＴＣ抗体と結合させたアネキシンＶ（Annexine V）の試験により判断した。初期アポトーシス（アネキシンＶには陽性染色、かつヨウ化プロピジウムには陰性染色）及び後期アポトーシス（アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムに陽性染色）を判断するために、ヨウ化プロピジウムを使用した。

４時間のフェニル酢酸ビスホスホナートでの処理後、初期アポトーシスの細胞の百分率は、２つの細胞型でほぼ同一であったが、後期アポトーシスの細胞の百分率は、ＭＣＦ７−ｒａｓ細胞でより重大であった（それぞれ２２％及び５３％）。

細胞アポトーシスは、ＤＮＡ分解法により確認した。ＭＣＦ７及びＭＣＦ７−ｒａｓ細胞を培養した（Ｔ２５フラスコ中に５×１０⁵細胞）。２４時間後、細胞を洗浄し、次に１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地で培養した；フェニル酢酸ビスホスホナート（１０mM）を一方の群に加え、もう一方の群にはフェニル酢酸ビスホスホナートを加えなかった。

９６時間後、断片化ＤＮＡを含む細胞抽出液を、０．５mg/mlのＲＮａｓｅＡと共に３７℃で１時間、次に０．５mg/mlのプロテイナーゼＫと共に３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、断片化ＤＮＡをイソプロパノールにより沈殿させ、次いで１０mMのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）（１ml ＥＤＴＡ、５％グリセロール及び０．０５％ブロモフェノールブルー）に溶解した。１％のアガロースゲル上で電気泳動により分離された断片化ＤＮＡを、臭化エチジウムでマーキングして、ＵＶで撮影した。

１０mMのフェニル酢酸ビスホスホナートを含む群では、次にＭＣＦ７及びＭＣＦ７−ｒａｓ細胞のＤＮＡの劇的な分解が観測された。

これらの結果は、フェニル酢酸ビスホスホン酸が、ＭＣＦ７及びＭＣＦ７−ｒａｓ細胞の増殖を阻害してアポトーシスを誘導することを証明した。

フェニル酢酸ビスホスホン酸ナトリウムのインビボ試験
フェニル酢酸ビスホスホン酸ナトリウムの抗腫瘍作用をマウスにおいて検証した。

メスの無胸腺ヌードマウスへの４×１０⁶個のＭＣＦ７−ｒａｓ細胞の接種は、ＤＭＥＭの容量０．１mlで皮下に行ったが、これは３週間後７０％の腫瘍を誘導した。

フェニル酢酸ビスホスホナートによる処置は、腫瘍の平均容量が５５０mm³になったときに開始した。マウスを２群に分割し、一方にフェニル酢酸ビスホスホナートを投与し、もう一方は投与しなかった。フェニル酢酸ビスホスホナートは、１週間に２回、皮下及び腫瘍周囲に５週間にわたり注射したが、用量は、８０mg/kg（５ケース）及び１６０mg/kg（６ケース）とした。

処置の最後に、腫瘍の生長の阻害を観測した；これは、不可逆的であり用量依存的であった。処置を停止すると、腫瘍の生長は、１６０mg/kg用量で処置したマウスの場合には少なくとも３週間ブロックされたが、８０mg/kg用量で処置したマウスの場合には腫瘍生長の再発が観測された。

腫瘍の免疫組織化学分析により、腫瘍生長の低下がアポトーシスの誘導、腫瘍の脈管形成の急な低下及び腫瘍における線維形成の誘導に関連していることが判った。

アポトーシス促進作用
更に、フェニル酢酸ビスホスホナートのアポトーシス促進作用は、抗体染色の方法により確認した。アポトーシス細胞の染色は、上皮細胞により産生されるサイトケラチン１８フィラメント上のカスパーゼの特異部位を認識する、Ｍ３０抗体により行った。このようなフィラメントは、サイトケラチンの高リン酸化により、初期アポトーシスの細胞内で急速に凝集する。この細胞質染色により、顆粒状構造が細胞質内部に観測されたが、これは、後期アポトーシスの細胞に相当する。

これらの顆粒状構造は、高用量（１６０mg/kg）のフェニル酢酸ビスホスホナートで処置した腫瘍において観測された。更に、抗サイトケラチン１８抗体での染色の濃度依存的な増大が認められた。このようにして、初期アポトーシスは、細胞質の顆粒状構造の存在により、後期アポトーシスとは明らかに区別される。

これにより、８０mg/kg用量のフェニル酢酸ビスホスホナートによる腫瘍の処置によって、アポトーシスが生じたが、１６０mg/kg用量での処置では、アポトーシスと壊死の間の中間状態である、アポネクローシスが生じたことが確認された。

抗脈管形成作用
抗脈管形成性は、ＧＳＬ１レクチン法により検証した。

ＧＳＬ１レクチンを使用することにより、脈管形成は、抗ＧＳＬ１抗体での内皮細胞の赤着色染色により測定及び同定した。この脈管形成は、フェニル酢酸ビスホスホナートによる腫瘍の処置により阻害されることが認められた。この作用は、８０mg/kg用量では部分的であるが重大であり（８０％）、１６０mg/kgでは全面的である。

このような測定法により、フェニル酢酸ビスホスホン酸が、非常に重大な抗脈管形成作用を示し、また抗腫瘍及びアポトーシス促進作用を示すことが証明された。これらの結果により、フェニル酢酸ビスホスホン酸が、癌、更に詳細には乳癌の処置用に潜在的に活性な医薬であることが確認された。

炎症性肝細胞に及ぼす作用
本試験は、急性肝炎を有するヌードマウスで実施した。マウスを２群に分割し、一方は、フェニル酢酸ビスホスホン酸ナトリウムで処置し、２番目の群は処置しなかった。フェニル酢酸ビスホスホナートは、１週間に２回で５週間、処置マウスに皮下投与（８０mg/kg又は１６０mg/kg）した。マウスを屠殺して、ＨＥＳ（ヘマトキシリン・エオシン染色法）後に肝臓を組織化学的に分析した。

光学顕微鏡での検査により、非処置マウスの肝臓は、処置マウスに比較して重篤な損傷を受けたことが判った。更に詳細には、慢性肝炎に由来する壊死領域が認められ、またリンパ球炎症に伴う肝細胞への液体蓄積（脂肪変性）も認められた。このような肝症状により、肝組織壊死、及び線維状領域の形成が起こる。

対照的に、フェニル酢酸ビスホスホナートで処置したマウスの場合には、５例のうち４例で、肝毒性が認められなかった。

図面への凡例
本発明の化合物の製造方法の反応図。Ａは、上記と同義である。 ２４、４８及び７２時間培養後の、それぞれＢＰ１（図２）及びＢＰ２（図３）によるＡ４３１腫瘍細胞の増殖のインビトロ阻害。結果は、細胞数±ＳＥ（バー）として表される。対照と比較して、^*Ｐ＜０．０５；^**Ｐ＜０．０１。 ２４、４８及び７２時間培養後の、それぞれＢＰ１（図２）及びＢＰ２（図３）によるＡ４３１腫瘍細胞の増殖のインビトロ阻害。結果は、細胞数±ＳＥ（バー）として表される。対照と比較して、^*Ｐ＜０．０５；^**Ｐ＜０．０１。 ＢＰ１及びＢＰ２によるＡ４３１腫瘍の生長のインビボ阻害。ヌードマウスへのＡ４３１細胞の移植は、皮下腫瘍の形成を誘導する。細胞の注射の１週間後、１週間に２回で５週間、０．００６、０．０６及び０．６mg/マウスの用量で、ＢＰ１及びＢＰ２で腫瘍を処置した。結果は、腫瘍容量±ＳＥ（バー）として表される。対照と比較して、^*Ｐ＜０．０５。 Ａ４３１腫瘍の脈管形成の免疫組織化学分析。内皮細胞は、特異マーカー（ＧＳＬ１）で検出した。結果は、画像解析（ＮＩＨ画像）により定量された内皮細胞の面積±ＳＥ（バー）として表される。対照と比較して、^*Ｐ＜０．０１。

Claims (10)

1. 下記式（Ｉ）：
   

   

   ［式中、Ｒ ₁ 、Ｒ ₂ 及びＲ ₃ は、同一であるか又は異なっており、それぞれ水素原子、アルキル、アリール、アシルオキシアルキル又は複素環基を表し、Ａは、式：−（ＣＨ ₂ ） _n −Ｒ ₄ の基を表し、Ｒ ₄ は、水素原子、アルキル基、アリール基、複素環又は式：−ＮＲ ₅ Ｒ ₆ の基を表し、Ｒ ₅ 及びＲ ₆ は、同一であるか又は異なっており、水素原子又はアルキル基を表し、ｎは、０〜２４の整数である］により表されるビスホスホナート誘導体（ただし、Ｒ ₁ 、Ｒ ₂ 及びＲ ₃ が、同時に水素原子を表す、式（Ｉ）により表される化合物を除く）の製造方法であって、以下の工程：
   −式（II）：ＡＣＯＸにより表される、少なくとも１つの酸ハロゲン化物、又は式（III）：
   

   

   により表される、１つのα−ケトホスホナートと、式（IV）：
   

   

   ［式（ II ）、 (III) 及び（ IV ）中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は、同一であるか又は異なっており、アルキル、アリール、アシルオキシアルキル、又は複素環基を表し、
   Ａは、上記に定義されるものであり、
   Ｘは、ハロゲン原子を表し、
   ａｌｋは、Ｃ_1-6アルキル基であり、
   ｘは、２又は３である］により表される、少なくとも１つの亜リン酸シリルとを接触させる工程、
   −前工程で得られる化合物を加水分解する工程
   を含むことを特徴とする方法。
2. Ｘが塩素原子であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. アルキル、アリール、複素環又はアシルオキシアルキル基が、アリール基、複素環基、ヘテロシクロアルキル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキルチオ基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、ＮＯ ₂ 基、アルコキシ基、式：−ＣＯＯＲのエステル基、式：−ＮＲＲ″′のアミノ基、酸残基、及び式：−ＣＯＮＨＲ又は−ＮＨＣＯＲのアミド基（式中、Ｒ及びＲ″′は、相互に独立に、水素原子、アルキル、アリール、ヘテロアリール又はアシルオキシアルキル基を表す）からなる群から選択される、少なくとも１個の基により置換されていることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
4. 以下の工程：
   −式（II）：ＡＣＯＸにより表される、少なくとも１つの酸ハロゲン化物と、式（Ｖ）：Ｐ（ＯＲ₁）（ＯＲ₂）（ＯＲ）［式中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲは、同一であるか又は異なっており、アルキル、アリール、アシルオキシアルキル、又は複素環基を表す］により表される、少なくとも１つのホスファイトとを接触させて、式（III）により表される、α−ケトホスホナートを生成させる工程、
   −前工程で得られるα−ケトホスホナートと、請求項１に定義される式（IV）により表される、少なくとも１つの亜リン酸シリルとを接触させる工程、
   −前工程で得られる化合物を加水分解する工程
   を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 亜リン酸シリルが、式（IV）（ここで、ｘは、２である）により表される化合物である、請求項４記載の方法。
6. 亜リン酸シリルが、式（IV）（ここで、ｘは、３である）により表される化合物である、請求項４記載の方法。
7. 式（ II ）：ＡＣＯＸにより表される、少なくとも１つの酸ハロゲン化物を、式（ IV ）（ここで、ｘは、２である）により表される、少なくとも１つの亜リン酸シリルと接触させる、請求項１記載の方法。
8. 式（II）：ＡＣＯＸにより表される、少なくとも１つの酸ハロゲン化物を、式（IV）（ここで、ｘは、２である）により表される、少なくとも１つの亜リン酸シリルと接触させ、次にこうして得られる生成物を、式（IV）（ここで、ｘは、３である）により表される、少なくとも１つの亜リン酸シリルと接触させる、請求項１又は７記載の方法。
9. Ａが、式：−（ＣＨ₂）_n−Ｒ₄の基を表し、ここでＲ₄が、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基、複素環基、フェニル基、又は式：−ＮＲ₅Ｒ₆の基であり、ここでＲ₅及びＲ₆が、同一であるか又は異なっており、水素原子又はＣ_1-6アルキル基を表し、ここでｎが、１〜６の整数である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. Ａが、下記式：
    

    

    から選択される基である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。

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