JP4294584B2 - 核酸ワクチン接種の免疫応答を高めるための方法 - Google Patents

Description

本発明は、核酸およびタンパク質を同時送達するための組成物に関する。同時送達は同じ小胞からの送達を意味し、これにより、両者が一緒に同じ細胞に送達されることがもたらされると考えられる。本発明の組成物は、免疫応答を生じさせるために有用である。特に、この核酸は、抗原性タンパク質またはその一部を機能的にコードし、前記核酸の配列は、組成物の一部を形成する「アシスタータンパク質」の配列に対して相同的であり、好ましくは同一である。

病原体に由来するタンパク質抗原が、抗原に対して特異的な、被接種者における中和抗体または細胞媒介免疫応答を誘発するために設計されたワクチンにおいて長く使用されている。しかしながら、タンパク質は、一般に、ある種のタイプの細胞媒介免疫応答を誘発させる点、特に、非常に多くのワクチン（特に、細胞内病原体またはガン抗原に向けられたワクチン）に対する応答の望ましい構成成分であるエフェクターＴ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞を含む）の生成を誘発させる点が充分でない。最近、様々なワクチンが、むき出しのＤＮＡ（通常、哺乳動物細胞における発現のための適切なプロモーター配列を含有する、大腸菌から製造されたプラスミドＤＮＡ）に基づいて開発されている。これら後者のワクチンは、細胞媒介免疫性（エフェクターＴ細胞、例えば、インターフェロン−γを分泌する抗原特異的なＴ細胞、および抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞などを伴う）を良好に生じさせることが分っているが、コードされ、発現された抗原に対する抗体を生じさせる点で不十分である。抗体は、非常に多くの病原体（特に、細菌およびある種のウイルス、例えば、インフルエンザウイルスなど）に対する保護免疫応答の重要な構成要素である。様々な治療が、下記に記載されるように、ＤＮＡに基づくワクチンの不完全なところを修正するために提案および検討されている。

リポソーム配合が、何年も前から、タンパク質形態のワクチン抗原の免疫原性を高めるために使用されている。リポソーム配合はまた、近年では、ＤＮＡをワクチン目的のために配合することにも適用されている。リポソームを使用してプラスミドＤＮＡをタンパク質と同時配合することを記載した様々な研究が行われている。しかしながら、タンパク質とＤＮＡとのリポソームによる同時配合のこれらの研究は、通常、抗原そのものではない、免疫刺激性サイトカインまたは他の生物学的に活性なタンパク質をコードするプラスミドを使用している。タンパク質をインビボで発現させるために設計されている核酸を含有するワクチン配合物に抗原自体のタンパク質形態を取り込ませることは必要ないようであった。本発明者らは、タンパク質抗原をＤＮＡと一緒に配合物における添加剤として使用した刊行物をただ１つ知っている（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｌａｊｏｎｃｈｅｒｅ，Ｌ．他、Ｍｅｍ Ｉｎｓｔ Ｏｓｗａｌｄｏ Ｃｒｕｚ、Ｒｉｏ ｄｅ Ｊａｎｉｅｒｏ、９７（１）：９５〜９９、２００２年１月）。本発明とは異なり、抗体応答の増強を、抗原をコードするＤＮＡおよびその同系タンパク質の同時配合物において、タンパク質単独による免疫化と比較した場合、著者は認めなかった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｌａｊｏｎｃｈｅｒｅ他によって使用された配合物は、活性な核酸（Ｃ型肝炎ウイルスのコア抗原をコードするプラスミド）および無関係なキャリアＤＮＡと、ポリエチレングリコールと、タンパク質との混合物を含んでいた。注射後、タンパク質および活性なＤＮＡ（これらは混合物において物理的に会合していなかった）は独立に拡散し、抗原提示細胞に別々に到達すると考えられる。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｌａｊｏｎｃｈｅｒｅのこの否定的な知見は、タンパク質をその同系ＤＮＡと配合することは、改善された免疫応答を達成するための有望な方法ではなかったこと、少なくとも改善された抗体応答を達成するための有望な方法ではなかったことを当業者に示唆していると考えられる。

国際特許出願公開ＷＯ−Ａ−９９３０７３３に、核酸ワクチンに対する免疫応答が、同系タンパク質の同時投与によって増強されることが提案されている。この２つの構成成分は同じ組成物で投与される必要はない。両者は、単に、核酸が免疫系を刺激した後まで、好ましくは遮蔽されているかまたは関与していないタンパク質とともに、免疫応答の誘導期の間に投与されなければならない。いくつかの例では、ワクチンは、物理的な混合状態にあるむき出しのＤＮＡおよびむき出しのタンパク質抗原から構成されていた。他の例では、タンパク質抗原が、むき出しのＤＮＡと混合された生分解性ポリマー−ミョウバン配合物において遅れて放出させるように配合されていた。

国際特許出願公開ＷＯ−Ａ−９７２８８１８では、様々なワクチンが、核酸およびタンパク質抗原を抗原提示細胞内に送達するように意図されている。この核酸は、タンパク質抗原と同じタンパク質を発現させることができる。この核酸およびタンパク質は、例えば、共有結合によるコンジュゲート化によって複合体化されている。この複合体は、合成されたウイルス様粒子として配合され得る。リポソームシステムを使用することができることもまた示唆されているが、このタンパク質および核酸の両方をいかにしてそのようなシステムに取り込ませるべきかに関する実施例はなく、また、明細書には、インビボ試験に関する定量的結果が何ら含まれておらず、実際には生じ得ない結果（特に、クラスＩＩ応答）が予測されている。

非コードのプラスミドＤＮＡが、ペプチドと一緒にリポソーム小胞に同時に捕捉されたとき、免疫アジュバント作用を有すること（Ｇｕｒｓｅｌ、Ｍ．他、Ｖａｃｃｉｎｅ、（１９９９）１７：１３７６〜１３８３）、および、ＣｐＧモチーフを有するＤＮＡが、むき出しのＤＮＡおよびペプチドのワクチンに対する免疫アジュバント効果を有すること（Ｋｌｉｎｍａｎ、Ｄ．Ｍ．他、Ｖａｃｃｉｎｅ、（１９９９）１７：１９〜２５）が知られている。

しかしながら、本発明において、本発明者らは、核酸（例えば、ＤＮＡなど）をその同系タンパク質と一緒に物理的に会合させ、それらを捕捉されるようになされたならば、これらの２つの成分は抗原提示細胞に一緒に到達し、これにより、抗原の獲得されたタンパク質形態のプロセシングおよび提示が、同じ細胞において、抗原性タンパク質のＤＮＡによりコードされた形態の発現と一緒にもたらされると考えた。発現したタンパク質の抗原プロセシングが、異なる経路によって、また、獲得されたタンパク質に対する速度論とは少し異なる速度論で起こるので、本発明者らは、その同系タンパク質と会合させたＤＮＡのそのような同時送達により、これらの２つの抗原提示様式の付加的または相乗的な効果に対する機会、および改善された免疫応答が提供されると考えた。ここに、本発明者らは、ＤＮＡおよびタンパク質の会合を提供する、ＤＮＡおよびその同系タンパク質の小胞配合物に関するこの新しい仮説を試験した。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｌａｊｏｎｃｈｅｒｅ他とは異なり、本発明者らは、「アシスタータンパク質」と呼ばれるその同系タンパク質と（リポソームを介して）会合したＤＮＡの特別なワクチン組成物が可能であることを見出した。ここで、（タンパク質単独またはＤＮＡ単独による免疫化と比較した場合）、増強された抗体応答が免疫化後に観測されている。本発明者らは、ＤＮＡおよびタンパク質が別個の粒子に配合され、粒子が混合された場合、抗体産生の増強が認められないことを見出している。これらの観測結果は、同じ抗原提示細胞へのＤＮＡおよびアシスタータンパク質の同時送達の本発明者らの理論と一致している。しかしながら、本発明者らは、この時点では排除することができない他の理論的説明があり得ることを認める。

本発明は、両親媒性成分から形成された小胞を含む、核酸およびアシスタータンパク質を細胞に同時送達するための組成物であって、前記核酸は、少なくとも１つのエピトープを前記アシスタータンパク質と共有する抗原性タンパク質またはその一部を機能的にコードし、相互に同じ小胞と会合した前記核酸および前記アシスタータンパク質を含む、前記組成物を提供する。

アシスタータンパク質の用語は、完全なタンパク質、タンパク質のフラグメント、単一タイプのタンパク質、または異なるタイプのタンパク質を示す。

核酸によりコードされる抗原性タンパク質は、一般に、目的とするタンパク質（すなわち、有益な免疫応答が対象において所望される標的タンパク質）である。アシスタータンパク質は、一般に、核酸によりコードされる抗原性タンパク質の発現した形態（すなわち、核酸の同系タンパク質）と同一である。抗原性タンパク質および／またはアシスタータンパク質はそれぞれが（別々に）、関連した供給源に由来する天然に存在するタンパク質の全長配列を含む。好ましくは、核酸は、天然に存在する完全なタンパク質抗原をコードする。あるいは、核酸は、アシスタータンパク質のエピトープの少なくとも１つを含む天然タンパク質の一部のみをコードすることができる。本発明の１つの好都合な実施態様において、前記エピトープは、感染性媒介因子の表面にその天然に存在する形態で露出しているＢ細胞エピトープである。核酸は、天然に存在する媒介因子のエピトープの少なくとも１つを含む天然タンパク質の一部のみをコードすることができる。媒介因子は、例えば、微生物（例えば、細菌または酵母）またはウイルスである。同様に、アシスタータンパク質は、供給源がその天然の環境に存在するとき、（１つの実施態様では）表面で利用可能な、それぞれの供給源に由来するエピトープを含有しなければならない。あるいは、そして有用なことには、抗原性タンパク質およびアシスタータンパク質はともに、病原体の分泌された毒性産物（例えば、破傷風毒素など）と、そのような毒素の中和に適するエピトープを共有する。同様に、抗原性タンパク質およびアシスタータンパク質はともに、毒素以外の病原体の分泌された毒性産物（例えば、エプスタイン・バールウイルスによりコードされ、エプスタイン・バールウイルスが感染した細胞により分泌されるインターロイキン−１０アナログなど）とも共有されるエピトープを互いに共有することができる。

本発明者らは、新しい組成物の改善された成果を説明するために、相互に排他的でない２つの関連した理論を組み立てている。本発明者らは、これらの理論を、（下記に記載されるように）一般的理論および特異的理論と呼んでいる。

１．一般的理論
一般的理論では、適切に同時配合された物質の増強された成果（ＤＮＡおよびその同系タンパク質の両方が、集団内の小胞がＤＮＡおよびタンパク質の両方を有するように１つの小胞と会合している）は、（抗原提示細胞が古典的な抗原提示細胞（マクロファージもしくは樹状細胞など）またはＢ細胞であるとしても、抗原提示細胞が抗原特異的または抗原非特異的であるとしても）同じ抗原提示細胞による核酸およびその同系タンパク質（アシスタータンパク質）の両方の獲得によるためであるとするものである。同じ細胞へのＤＮＡおよびその同系タンパク質の同時送達により、ＤＮＡがある１つの抗原提示細胞によって獲得されることになり、タンパク質が別の抗原提示細胞によって獲得されることになった場合には可能でないと考えられる、後に続く免疫応答における相乗的な相互作用が可能になる。（以前に記載された組成物は、同じ抗原提示細胞へのＤＮＡおよびその同系タンパク質の同時送達を提供しないか、またはそのような同時送達の重要性を認識していない）。

２．特異的理論
特異的理論では、適切に同時配合された物質の増強された成果（この場合、ＤＮＡおよびその同系タンパク質の両方が、集団内の小胞がＤＮＡおよびタンパク質の両方を有するように１つの小胞と会合する）には、小胞が、（粒子の表面に露出したタンパク質形態での抗原によって）抗原特異的なＢ細胞に標的化されること、それにより、ＤＮＡおよびその同系タンパク質の両方が、標的化された様式で、同じ抗原特異的なＢ細胞に選択的に送達されることが伴うとしている。抗原特異的なＢ細胞は、通常、免疫応答の途中で増殖するので、これらの増殖中の細胞の方が、増殖中でない細胞よりも、粒子に同様に存在する核酸による形質導入に対する良好な標的を形成すると考えられる。上記の一般的理論の場合のように、同じ細胞へのＤＮＡおよびその同系タンパク質の同時送達により、ＤＮＡがある１つの抗原提示細胞（この場合には、抗原特異的なＢ細胞）によって獲得されることになり、タンパク質が別の抗原提示細胞によって獲得されることになった場合には可能でないと考えられる、後に続く免疫応答における相乗的な相互作用が可能になる。この理論の具体的な形態において、粒子はＢ細胞の抗原特異的な受容体（すなわち、表面抗体）によって捕獲され、核酸およびその同系タンパク質（アシスタータンパク質）がともに、個々の抗原特異的なＢ細胞によって取り込まれる。

核酸に基づく免疫化の効率は、目的とする核酸を取り込んで、発現する細胞がほとんどないように、抗原をコードする核酸のむき出し配合物（例えば、むき出しＤＮＡ）を用いてインビボで達成される低い形質導入効率によって制限されている。本発明の例示において、本発明者らは、ＤＮＡをインビボでヌクレアーゼから保護することを達成するために、また、同じ粒子でのＤＮＡおよびその同系タンパク質（アシスタータンパク質）の同時配合を可能にするために、小胞状の、主としてリポソームの組成物を使用している。しかし、他の小胞状の組成物が、ＤＮＡおよびその同系タンパク質の会合を達成して、本明細書中で規定される同時送達の必要な性質を達成するために使用され得ることが、読者には明らかになるに違いない。

本発明による特定の好ましい組成物において、小胞は、リポソーム形成物質から形成されたリポソーム、すなわち、脂質二重層から形成されたリポソームを含む。あるいは、小胞は単層であり得る。リポソームは、合成された両親媒性成分（例えば、界面活性剤型の分子など）を含むことができる。このタイプの非イオン性の小胞は、多くの場合、ニオソームとして知られている。小胞は、リン脂質を含まないことがあるが、しかし、好ましくは、実質的にリン脂質に基づいている。

リポソーム組成物を使用した本発明者ら自身の研究の途中で、本発明者らは、同じリポソーム粒子におけるタンパク質およびＤＮＡの効率的な同時捕捉および／または会合を得ようと努力した。本発明者らは、ＤＮＡをパッケージングし、ＤＮＡをヌクレアーゼから保護するために、また、ＤＮＡ免疫化のために本発明者らが開発したリポソーム組成物（これは本発明者らの初期の出願（国際特許出願公開ＷＯ−Ａ−９８１０７４８）に記載される）もまた、タンパク質およびＤＮＡを同時に同時パッケージングすることにおいて非常に効率的であることを見出している。驚くべきことに、リポソームを配合するための本明細書中に規定される条件のもとでは、ＤＮＡおよびタンパク質は、リポソーム粒子内での会合または封じ込めに関して互いに競合しない。そのうえ、それらはまた、著しい量のアシスタータンパク質を抗原的に活性な形態でリポソーム粒子の表面に呈示することができる。本発明者らは、本発明者らの新しい組成物の表面局在化タンパク質抗原（アシスタータンパク質）が、リポソーム、または、これらの構造体の分解からインビボで生じたリポソームフラグメントを抗原特異的なＢ細胞に標的化する能力を有し得ると考えている。

リポソームに配合されたＤＮＡは、例えば、抗原提示細胞の細胞受容体に対するリガンド（例えば、マンノシル成分、またはＣ３ｄなどの補体タンパク質）をリポソームの表面に置くことによって、抗原提示細胞表面の受容体に標的され得るが、抗原そのものは、核酸に基づくワクチンにおける標的化デバイスとして以前には使用されていなかった。

本発明の新しい組成物は、抗原の獲得されたタンパク質形態（アシスタータンパク質）と、その同系核酸からのタンパク質の発現した形態との両方の抗原提示細胞による同時提示を可能にする。そのような組成物は新規な抗原刺激−追加抗原刺激の作用を可能にし、それにより、（異なる時間で最大となる）発現した抗原性タンパク質およびアシスタータンパク質の提示の動力学が異なることによって、抗原に対する関連した免疫細胞のより長く持続する「ダブルヒット」暴露がもたらされる。核酸ワクチン分野における他の抗原刺激−追加抗原刺激の現象とは異なり、本発明の新規な組成物は、１回の服薬により、抗原刺激および追加抗原刺激の機能をもたらす。

本発明の新しい組成物の別の好都合な特徴は、２つの形態物（タンパク質の添加された形態およびインビボで発現した形態）の抗原提示様式が異なることに関係する。獲得されたタンパク質および発現したタンパク質は抗原提示細胞において２つの異なる経路によって提示される（前者はクラスＩＩのＭＨＣを介してペプチド提示をもたらし、後者はクラスＩのＭＨＣを介してペプチド提示をもたらす）ので、この新しい発明により、Ｔヘルパー細胞（クラスＩＩ限定型）、クラスＩＩ限定型エフェクターＴ細胞、および細胞傷害性Ｔ細胞（クラスＩ限定型）の刺激を伴う、より広範囲に基づく免疫応答がもたらされる。新しい組成物によって生じる細胞の微小環境（この場合、クラスＩＩ提示およびクラスＩ提示の両方が同じ抗原提示細胞の表面で生じている）により、抗原提示細胞を必要とする種々のＴ細胞タイプの間での相互作用が可能になる。両方のＴ細胞タイプ（クラスＩ限定型およびクラスＩＩ限定型）が、同じ抗原提示細胞との相互作用のときに、また、抗原提示細胞の表面に同時に存在しながら相互の相互作用によって刺激され得るので、本発明の新しい配合物は、核酸免疫化について、以前に記載された方法および組成物を上回る理論的利点をいくつか有する。本発明において、本発明者らは、そのような理論的利点が、抗原に対する抗体応答のレベルで実際に確認されることを記載する。しかしながら、本発明者らは、さらなる利点が、（Ｔヘルパー細胞応答、および細胞傷害性Ｔ細胞を含むエフェクターＴ細胞応答を含む）細胞媒介免疫性を刺激することにおける新規な配合方法について見出されることを予測する。タンパク質抗原に対する抗体応答は非常にＴ細胞依存的であるので、抗体産生に関する本出願で示されたデータは、新しい組成物が、Ｔヘルパー細胞（ＭＨＣクラスＩＩ限定型）応答を（少なくとも）刺激することにおいて効果的であることを強く示唆している。新しい配合方法により、同じ抗原提示細胞の表面でのクラスＩＩ限定のヘルパー細胞およびクラスＩ限定の細胞傷害性細胞の同時刺激がもたらされるという事実はまた、この方法が、細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激することにおいて効果的であることを示唆している。従って、アシスタータンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞応答のためにさらなる助けを提供する。すなわち、アシスタータンパク質は、抗原提示細胞の表面でＴヘルパー細胞によって認識された抗原のＭＨＣクラスＩＩ限定ペプチドエピトープの濃度および／または発現の持続時間を増大させ、これにより、クラスＩのＭＨＣ経路を介して提示されたタンパク質抗原について発現した形態に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答のＴ細胞援助のための機会を増大させる。

免疫応答では、免疫系の異なる細胞の間での協調、すなわち、抗原提示細胞（例えば、マクロファージおよび樹状細胞など、これらは「古典的」な抗原提示細胞として知られている）、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）およびＢ細胞（Ｂリンパ球）の間での協調が要求される。Ｂ細胞は、いくつかの点で従来の抗原提示細胞による提示と類似する様式で、抗原をＴ細胞に提示する能力を有する。Ｂ細胞が、特異的な抗体を産生させるために必要とされる「助け」を獲得するのは、このＢ細胞−Ｔ細胞の相互作用のときである。しかしながら、古典的な抗原提示細胞とは異なり、Ｂ細胞は、粒子状の抗原を獲得することが良好でない。しかしながら、一部のＢ細胞（すなわち、所与の抗原に対して特異的であるＢ細胞）は、その抗原特異的な表面免疫グロブリン受容体を介して（抗原分子を含む）小さい抗原粒子を獲得し、かつ濃縮することができるので、抗原提示において特に良好である。抗原非特異的なＢ細胞と比較して、抗原特異的なＢ細胞は、クラスＩＩ限定のＴ細胞に対する抗原の提示において少なくとも１０００倍大きい効率を有する（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ａ．、Ｔ細胞とＢ細胞との間での抗原特異的な相互作用、Ｎａｔｕｒｅ、１９８５年４月、１１〜１７；３１４（６０１１）：５３７〜９）。従って、抗原特異的なＢ細胞は、抗原性タンパク質およびその会合したＤＮＡの粒子を獲得する能力を有するので、本発明の組成物に対する重要な標的であり得る。

Ｔ細胞およびＢ細胞は抗原を異なる方法で認識する。これらの異なる認識様式は、本発明の実施態様の異なる様式について様々な関わりを有する。本発明の好都合な実施態様を理解するためには、最初に、これらの異なる認識様式の特徴を理解することが必要である。Ｔ細胞は、細胞の表面におけるクラスＩＩまたはクラスＩのＭＨＣ抗原に埋め込まれたタンパク質のペプチドフラグメントを認識し、これに対して、Ｂ細胞（これにより、最終的には抗体が産生される）は、その細胞表面における抗体様抗原受容体を介して、（通常、性質が一致するタンパク質である）フラグメント化されていない抗原の表面特徴を認識する。Ｔ細胞およびＢ細胞のこのような異なる認識における条件は、それらのエピトープの性質が異なることを反映している。このように、Ｂ細胞は、抗原または病原体の表面特徴（Ｂ細胞エピトープ）を認識しなければならないが、Ｔ細胞エピトープ（これは、長さが約８アミノ酸から１２アミノ酸のペプチドを含む）は、抗原の表面に存在することは必須ではなく、抗原の三次元構造に関連して見たとき、「外部」だけでなく、「内部」にも存在し得る。本発明の「特異的理論」（これは上記に規定される）によれば、Ｂ細胞エピトープの最も好都合な存在位置は、適切に配合されたリポソーム［核酸＋タンパク質］による抗原特異的なＢ細胞の取り込みおよび刺激を容易にする、抗原または病原体における「表面」である。しかしながら、本発明の一般的理論（この場合、リポソームが抗原非特異的な様式で抗原提示細胞によって獲得される）によれば、エピトープ（特に、Ｔ細胞エピトープ）は、抗原の構造において内部に位置してもよく、抗原または媒介因子の表面において利用可能であること、またはその表面に露出することは要求されない。

本発明の１つの好都合な実施態様において、抗原性タンパク質およびアシスタータンパク質はともに、ウイルスタンパク質の表面抗原に由来する。これらのタンパク質は、少なくとも１つのエピトープ（Ｂ細胞またはＴ細胞）（好ましくは数個）を共有するならば、相互に同じ配列を有してもよく、または変異していてもよく、または一部が欠失していてもよく、または他のポリペプチドと融合していてもよい。

抗原性タンパク質およびアシスタータンパク質が共通して有するタンパク質の一部を、それらの配列相同性の点で発現させることができる。これらのタンパク質は、アシスタータンパク質が、抗原性タンパク質の同じ長さの連続した配列と少なくとも５０％（好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％）の類似性を有する少なくとも１０残基の少なくとも１つの連続した配列を有するようにしなければならないと考えられる。一般に、それぞれの連続した配列は、長さが少なくとも５０残基であり、少なくとも９０％の配列類似性を有し、好ましくは少なくとも７５％の配列類似性を有する。より好ましくは、前記の連続した配列は、少なくとも５０％（好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を有する。

しかしながら、配列類似性は構造的類似性の１つの指標にすぎず、「特異的理論」（上に規定されている）の場合、アシスタータンパク質、およびコードされ、発現したタンパク質が、配列相同性についての条件を何ら伴うことなく、１つのＢ細胞エピトープ（媒介因子を認識する単一の抗体により認識されるものと規定する）を共有することだけを必要とするだけである。

本発明の組成物は、免疫応答（例えば、感染性因子による感染に抵抗するために十分である免疫応答）を生じさせるために有用である。従って、抗原性タンパク質およびアシスタータンパク質は、好ましくは、感染性因子である供給源に由来し、例えば、細菌などの微生物またはウイルスに由来する。好適には、ウイルスは、それに対する免疫応答によりウイルスを中和または排除できることが知られている（あるいは、ウイルスを中和または排除できると考えられる）ウイルスであり、例えば、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスなど）、またはインフルエンザウイルス（例えば、Ａ型インフルエンザウイルスまたはＢ型インフルエンザウイルスなど）である。好適には、感染性因子は細菌であってもよく、例えば、連鎖球菌（例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、またはＡ群連鎖球菌もしくはＢ群連鎖球菌のメンバー）、あるいは髄膜炎を生じさせ得る媒介因子（例えば、髄膜炎菌群Ａ、Ｂ＆Ｃ、またはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）など）、あるいは子供に耳感染症を生じさせ得る生物（例えば、モラクセラ・カタラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔｔｈａｒａｌｉｓ）など）であり得る。好適には、媒介因子は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）などのマイコバクテリウム属細菌であり得る。好適には、抗原はまた、ガン性の細胞または組織の表面または内部で選択的に発現する宿主タンパク質であってもよく、例えば、ガン胎児性抗原、またはＣＤ５５（補体制御タンパク質）、または腫瘍血管系の各種インテグリンもしくは他のマーカーなどであり得る。本発明の新規なワクチン組成物の標的抗原はまた、中和または排除を必要とする宿主タンパク質または宿主ペプチドであってもよく、例えば、有害な自己抗体、または、アルツハイマー病のその様々な形態でのアミロイドβペプチド（Ａ−β４０およびＡ−β４２）などのペプチドなどであり得る。

ワクチンの標的抗原はまた、細菌多糖などの炭水化物であり得る。この場合、タンパク質および／またはアシスタータンパク質の発現した形態は前記炭水化物抗原の抗原性構造を模倣する。Ｂ群髄膜炎菌多糖の好適なペプチド模倣体（Ｌａｉｎｇ，Ｇｒａｎｏｆｆ、Ｇｒａｎｏｆｆ ＤＭおよびＭｏｅ ＧＲ、Ｂ型髄膜炎菌エピトープの分子的模倣体、米国特許第６，０３０，６１９号）およびＢ群連鎖球菌多糖の好適なペプチド模倣体が記載されている。そのようなペプチドは、炭水化物エピトープのペプチド配列の種々の実施態様の、異なる配列が反復するエピトープを含むポリペプチドまたはタンパク質を形成させるＤＮＡレベルで連結されたコンカテマー化形態として、発現させることができる。

本発明によれば、有益な免疫応答が所望される標的エピトープは、ＤＮＡによってコードされるタンパク質と、アシスタータンパク質との間で共有されるエピトープに対応しなければならない。標的抗原上の元の場所の標的エピトープ（例えば、Ａ型インフルエンザ赤血球凝集素の中和エピトープなど）の位置は、抗体にとって利用可能であるが、一方、媒介因子（例えば、結核菌の熱ショックタンパク質など）中の内部でもまた利用可能であり得る。

アシスタータンパク質は、通常、組成物における核酸によりコードされるタンパク質に対して非常に類似しているか、または同一であるが、一方、核酸によりコードされるタンパク質との共有エピトープを少なくとも１つ（好ましくは数個）有するタンパク質を組成物が含有するならば、ウイルス全体（ビリオン）または「分割」ウイルス調製物（例えば、広く知られている界面活性剤溶解インフルエンザウイルス調製物など）でもあり得る。アシスタータンパク質は、一般に、宿主動物での複製が可能である増殖可能なウイルスからは構成されない。

本発明において、核酸はＲＮＡであり得るが、好ましくはＤＮＡであり、好ましくは二本鎖である。抗原を機能的にコードするＤＮＡは、好ましくは、プロモーターおよび好ましくは制御配列を含まなければならない。好適には、ＤＮＡは、好都合には大腸菌Ｃ１プラスミドに由来するプラスミドＤＮＡであり、しかし、線状ＤＮＡも可能である。

本発明においては、核酸が、一つもしくはそれ以上のタンパク質をコードするか、および／または、１つもしくはそれ以上の異なるアシスタータンパク質を含むことが、望ましかろう。この実施態様の場合、単一の小胞が、この小胞粒子と会合した抗原性タンパク質またはアシスタータンパク質と上記のようなエピトープを共有している抗原性タンパク質をコードする核酸と会合していることが好ましい。例えば、本発明の組成物は、２つ以上の異なるリポソームタイプを混合状態で含むことができ、この場合、例えば、その１つが、第１の抗原性タンパク質をコードする核酸を第１のアシスタータンパク質とともに含み（この場合、抗原性タンパク質およびアシスタータンパク質は上記のように関係づけられる）、別のリポソームタイプが、第２の抗原性タンパク質をコードする核酸を、上記のように第２の抗原性タンパク質に関係づけられる第２のアシスタータンパク質と会合して含む。あるいは、１個のリポソームが２つ以上の異なる核酸を含有することができ、この場合、その１つが第１の抗原性タンパク質をコードし、他のものが第２の抗原性タンパク質（など）ならびに第１および第２（など）のアシスタータンパク質をコードし、第１および第２のアシスタータンパク質は、上記のように、それぞれの第１および第２の抗原性タンパク質に関係づけられる。これらの２つ以上の抗原性タンパク質は、１つの核酸によってコードされる同じ発現したタンパク質分子（すなわち、融合タンパク質）の一部分であってもよい。あるいは、２つ以上の別の核酸成分（それぞれが１つの抗原性タンパク質の異なる部分をコードする）を、１つのリポソームに（タンパク質とともに）含めることができる。好都合な組成物はまた、それぞれのＤＮＡが同じリポソーム内にその同系タンパク質またはアシスタータンパク質と会合しているのであれば、別々に同時配合された複数のＤＮＡおよびそれらの同系タンパク質（アシスタータンパク質）を含むことができる。

核酸およびタンパク質との同じ構成を、非リン脂質成分から形成された本発明の小胞状の組成物において達成することができる。

２つ以上の抗原性タンパク質を伴う実施態様は、前段落で記載されたように、組成物が、いくつかの感染性株に存在し得る感染性媒介因子に対して免疫応答を生じさせるために、通常ワクチン接種するために使用される場合、特に有益であり得る。本発明のこの実施態様は、感染性媒介因子がウイルス（特にインフルエンザウイルス）である場合、特に有益である。従って、核酸によりコードされる抗原性タンパク質およびその対応するアシスタータンパク質は、インフルエンザウイルスのＡ株およびＢ株に由来し得る。１つの好ましい実施態様は、Ａ型インフルエンザの２つの現在流行している（または予期される）株、および、Ｂ型インフルエンザの１つの現在流行中の株（または予期される株）を含む。この組成物は、好都合には、それぞれの粒子が３つすべての核酸および３つすべてのタンパク質と会合するように１つの小胞（例えば、リポソーム粒子）と会合した６つの分子的実体のすべてを含む。インフルエンザウイルスを含む別の好都合な実施態様は、単回用量で混合されるか、または、３回の別個の投薬でヒトもしくは動物の受容者に投与される｛Ａｉタンパク質＋Ａｉ ＤＮＡ｝、｛Ａｉｉタンパク質＋Ａｉｉ ＤＮＡ｝および｛Ｂタンパク質＋Ｂ ＤＮＡ｝（この場合、中括弧は個々の小胞への負荷物を示す）を含む３つの別々に作製された小胞配合物を含む。

本発明の１つの有用な実施態様において、この核酸は、少なくとも一部が、好ましくは実質的には全体が小胞（通常、リポソーム）の小胞内空間に捕捉されている。この核酸が小胞内空間に捕捉されているとき、この核酸はその環境から最適に保護され、しかし、それにもかかわらず、対象に投与されると、適切な細胞に送達され得る。あるいは、しかしあまり好ましくないが、核酸を小胞と複合体化することができる。すなわち、核酸を、主に小胞の外側表面に結合させることができる。そのような配置は、核酸の投与時および送達時における低下した保護をもたらすが、効果的である場合もある。

本発明の１つの実施態様において、アシスタータンパク質は、好ましくは、少なくとも一部が小胞の外側表面において利用可能である。これにより、抗原特異的なＢ細胞による小胞の獲得が可能になり、ワクチン組成物に対する免疫応答の初期段階において抗体が産生された後、小胞表面の表面に結合した抗原特異的なＩｇＧを認識する高親和性のＦｃ−γ受容体を介した抗原提示細胞による、抗体と複合体化した小胞の取り込みが容易になる。同様に、リポソームまたは他の小胞における表面に存在する抗原は補体の固定を可能にし、抗原提示細胞およびＢ細胞における補体受容体による小胞およびそのフラグメントの取り込みをもたらす。これらの結果を達成するために、タンパク質は、（例えば、外因性膜タンパク質の様式で、静電的相互作用または疎水性相互作用によって）小胞の外側表面と単に複合体化させることができ、または、好ましくは、小胞外の環境に一部を露出させたまま、（例えば、ポリペプチド鎖の二重層貫通疎水性配列を介して）小胞の壁に埋め込まれる。いずれの場合においても、本発明によれば、目的とするエピトープは小胞の外側から利用可能でなければならない。そのような利用可能性は、それぞれのエピトープに対する抗体を使用した結合実験を行うことによって決定することができる。表面露出を明らかにするそのような結合データが、Ａ型インフルエンザウイルスについてのＤＮＡおよびタンパク質の同時配合に関する本発明者らの研究に対する本文に関連する図に記載されている。

小胞がリポソームである場合、リポソームを形成させるために使用されるリポソーム形成成分は、中性の脂質成分、両性イオン性の脂質成分、アニオン性の脂質成分および／またはカチオン性の脂質分を含むことができる。これらは、全体的な荷電をリポソームにもたらすような相対的な量で使用され得るか、または、あまり好ましくないが、リポソームが全体的な荷電を有しなくともよい。リポソームが全体的な正荷電を有するように脂質成分を使用することにより、良好な結果がもたらされ得ることが見出されている（本明細書のデータの節を参照のこと）。脂質と厳密に呼ばれる成分（これには、グリセリドおよびコレステロールが含まれる）に加えて、リポソーム形成成分には、非イオン性またはカチオン性の表面活性剤などの非脂質性の成分（すなわち、天然に存在する脂質でない成分）が含まれ得る。

本発明の特に好ましい実施態様によれば、本発明の新しい組成物は、リポソームが全体的に正荷電を有するような量で少なくとも１つのカチオン性荷電成分を含むリポソーム形成成分から形成されるリポソームを含む。

本発明のこの実施態様において、リポソームに取り込まれるカチオン性成分は、ポリヌクレオチドとの複合体化によってトランスフェクション率を改善するためにリポソームの調製において使用されているカチオン性成分のいずれかであり得る。そのような成分は脂質化合物または非脂質化合物であってもよく、合成物または天然物であってもよい。好ましいカチオン性脂質は、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ビス（ヘキサデシルオキシ）−３−トリメチルアミノプロパン（ＢｉｓＨＯＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＭ）、および米国特許第４，８９７，３５５号（これは参照して本明細書中に組み込まれる）において規定される構造Ｉの他の脂質、またはそのエステルアナログである。構造は下記の通りである：

またはその光学異性体
（式中、Ｙ１およびＹ２は同じまたは異なり、それぞれが−Ｏ−またはＯ−Ｃ（Ｏ）−であり、この場合、カルボニル炭素は、場合により、Ｒ１またはＲ２に結合する；Ｒ１およびＲ２は独立して、炭素原子が６個から２４個のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、炭素原子が１個から８個のアルキル、炭素原子が６個から１１個のアリールまたはアラルキルである；あるいは、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の２つまたは３つは、正荷電の窒素原子と一緒になって、５個から８個の原子を有する環状構造を形成し、この場合、正荷電の窒素原子に加えて、構造内の原子は炭素原子であり、１個の酸素原子、窒素原子またはイオウ原子を含むことができる；ｎは１から８である；Ｘはアニオンである）。

好ましい実施態様は、Ｒ１およびＲ２が個々に、０個から６個の不飽和部位を有し、下記の構造を有する組成である。

（式中、ａおよびｃの和は１から２３である；ｂは０から６である）。

最も好ましくは、Ｒ１およびＲ２のそれぞれがオレイルである。特に好ましい実施態様は、長鎖アルキル基が脂肪酸である組成、すなわち、Ｙ１およびＹ２が等しく、

である組成である。

あるいは、米国特許第５，４５９，１２７号（これは参照して本明細書中に組み込まれる）において規定される一般構造Ｉまたは一般構造ＩＩのカチオン性脂質を使用することができる。

他の好適なカチオン性化合物は、非脂質成分ステアリルアミン、および３β［Ｎ−Ｎ’Ｎ’−ジメチルアミノエタン］カルバミル］コレステロール（ＤＣ−ＣＨＯＬ）（脂質成分）またはその類似体である。

リポソームは、カチオン性成分を含むことに加えて、一般に、脂質を含む非イオン性成分および／または両性イオン性成分をも含む。この場合、脂質は、リン脂質、またはホスホリル基を含まない他の脂質であり得る。好ましくは、そのような脂質には、リン脂質、例えば、天然または合成のホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルセリン類などが含まれ、これらのいずれにおいても、長鎖アルキル基（これはエステル結合またはエーテル結合を介して結合し得る）は飽和または不飽和であり得る。好ましくは、グリセリド脂質のアシル基が不飽和である。これらの成分は非脂質成分を含むことができ、例えば、非イオン性界面活性剤、例えば、脂肪酸のソルビタンモノエステル、および／またはエトキシル化脂肪酸、または、エトキシル化ラノリンなどの他の類似体などを含むことができる。

リポソームが融合性の脂質（これは、通常、アシル基が不飽和であるホスファチジルエタノールアミン類である）を含むとき、最も良い結果が達成される。コレステロールを含ませることができる。しかしながら、コレステロールは、リポソームを標的細胞内へのポリヌクレオチドの十分な送達のためには安定にしすぎることがある。

カチオン性成分の量は、好ましくは、リポソーム形成成分の総モル数の５％から５０％の範囲であり、好ましくは１０％モルから２５％モルの範囲である。

小胞組成物は、一般に、例えば、生理学的緩衝液における水性懸濁物の形態である。あるいは、小胞組成物は、再水和される乾燥された組成物であり得る。

組成物は、好ましくは、例えば、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、鼻腔経路、経口経路、他の粘膜経路または肺経路による投与のために適合化されたワクチンである。

小胞は、通常使用されている小胞形成技術のいずれかによって作製することができる。小胞は多層小胞または単層小胞であってもよく、また、比較的大きくてもよく（３００ｎｍから５０００ｎｍの範囲にある小胞直径；好ましくは２０００ｎｍ未満で、好ましくは５００ｎｍから１０００ｎｍの範囲にある平均直径を有する）、または小さくてもよい（１００ｎｍから４００ｎｍの範囲にある小胞直径；好ましくは２００ｎｍから３００ｎｍの範囲にある平均直径を有する）。好ましくは、小胞は平均直径が５００ｎｍを超えず、好ましくは、実質的にすべてが２０００ｎｍ未満の直径を有する。

本発明のリポソーム組成物は、従来のリポソーム形成プロセスによって、例えば、核酸およびタンパク質を含有する懸濁媒体にリポソーム形成物質を薄膜から分散させ、その後、１回または複数回のサイズ調節工程を行うことによって、あるいは、リポソーム形成物質および核酸および／またはアシスタータンパク質を共通溶媒に同時に溶解し、その後、水性液体の添加を伴うリポソーム形成工程を行うことによって、あるいは、濃度勾配エレクトロポレーション技術または電気泳動技術を使用して、予備形成リポソームの壁を介して核酸および／またはアシスタータンパク質を負荷することによって形成され得るが、好ましい方法では、脱水−再水和技術が使用される。

リポソーム配合のいくつかの好適な方法が、［Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｊ．ＫｉｒｂｙおよびＧｒｅｇｏｒｙ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓによる書籍：ＩＳＢＮ ０−４７１−１４８２８−８、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（編者：Ｅｄｉｔｈ Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ、１９９９年７月にＷｉｌｅｙにより発行、リポソームについては「Ｌ」章）］に記載されている。これらには、（網羅的ではないが）、「手振とう」法によって調製される多層リポソーム；脱水／再水和小胞（本発明の実施例で使用される方法、これは非常に効率的である）；および、溶媒に可溶化された脂質の簡単な水和が含まれる。これらの手法におけるＤＮＡおよびタンパク質の同時存在は、両者とリポソームとの様々な程度の同時捕捉および他の形態の会合をもたらす。リン酸カルシウムもまた、ＤＮＡおよびタンパク質を一緒に沈殿させるために使用することができ、国際特許出願公開ＷＯ−Ａ−０１４１７３９に記載される本発明者らの発明の「ＤＮＡを伴うタンパク質同時配合」形式をもたらす。

会合したＤＮＡおよびその同系タンパク質を形成させるための別の好都合な方法は、［Ｊｕｄｉｔｈ ＳｅｎｉｏｒおよびＧｒｅｇｏｒｙ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１９８９、１００３、５８〜６２）］によって発表された方法である。これは脱水―再水和法の変法であり、この変法では、本発明の「アシスタータンパク質」成分が、小さい単層小胞（ＳＵＶ）の表面への共有結合コンジュゲート化によって取り込まれ得る。その後、そのようなＳＵＶは凍結乾燥され、その後、抗原をコードするＤＮＡの溶液において、ＳｅｎｉｏｒおよびＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（上記）に従って再水和される。得られる多層小胞は、タンパク質負荷量の大部分がリポソーム粒子の表面に存在する。これは本発明の好都合な実施態様である。

リポソーム組成物を形成させるための本発明による方法は、
ａ）リポソーム形成物質から形成される小さい単層小胞（ＳＵＶ）の水性懸濁物を提供する工程；
ｂ）ＳＵＶの水性懸濁物を、抗原性タンパク質を機能的にコードする核酸と接触させて、ＳＵＶ−核酸の懸濁物を形成させる工程；
ｃ）ＳＵＶ−核酸の懸濁物を脱水して、脱水された混合物を提供する工程；および
ｄ）脱水された混合物を水性再懸濁媒体で再水和して、核酸含有リポソームの懸濁物を形成させる工程
を含み、アシスタータンパク質を導入する工程を含み、それにより、核酸含有リポソームが前記アシスタータンパク質と会合させられる。

脱水−再水和法により、核酸は生成物リポソームの小胞内空間の内部に捕捉される。さらに、少量がリポソームの外側表面に残され得る。アシスタータンパク質は、このプロセスの様々な異なる段階で加えることができる。アシスタータンパク質は、工程ｂの前に、または工程ｂの途中で、または工程ｂの後、工程ｃの前に、ＳＵＶの水性懸濁物と接触させることができる。アシスタータンパク質は、核酸とともにリポソームの小胞内空間の内部に同時に捕捉される。

代わりの方法において、アシスタータンパク質は、再水和工程のときの再懸濁媒体に存在する。この実施態様では、タンパク質の少なくとも一部がリポソームの外側表面に露出すると考えられる。代わりの方法において、タンパク質は核酸含有リポソームの水性懸濁物と接触させられる。この実施態様により、タンパク質の実質的にすべてがリポソームの外側表面と会合する。

タンパク質の取り込み度を増大させ、その一方で、リポソームの外側表面でのエピトープの露出を可能にするために、アシスタータンパク質を、リポソームの壁の中に埋め込むために好適な親油性成分（例えば、脂肪アシル成分など）にコンジュゲート化することが、いくつかの実施態様では望ましい場合がある。コンジュゲート化は、アシスタータンパク質に対する調製法の一部を構成し得る。あるいは、アシスタータンパク質を、工程ｄの後で、リポソームの成分に化学的にコンジュゲート化することができる。

リポソーム形成物質が、全体的なカチオン性荷電がリポソーム上に存在するように、カチオン性成分を含む場合、疎水性タンパク質が必要とされるように、またタンパク質の複合体化により強い十分な会合がもたらされるように、周囲条件の下でアシスタータンパク質が全体的な負荷電を有するとき、十分な静電的引力が正荷電リポソームとアシスタータンパク質との間に存在し得る。

好ましくは、リポソーム形成物質は、モル比で少なくとも５％のカチオン性化合物を含む。

本発明において、核酸対アシスタータンパク質の重量比は、好ましくは１０００：１から１：１の範囲にあり、最も好ましくは、重量比は５：１から３０：１の範囲にある。

核酸対リポソーム形成物質の重量比は、好ましくは１：１００から１：１０００の範囲にあり、より好ましくは１：１００から１：３００の範囲にある。

本発明の方法において、工程ａ）において使用されるリポソーム粒子は、好ましくは、３０ｎｍから５０００ｎｍの範囲のサイズを有し、最も好ましくは、リポソームの実質的にすべてが１０００ｎｍ未満の直径を有する。本発明の方法は、粒子サイズが２００ｎｍから５０００ｎｍの範囲にある生成物リポソームをもたらし、好ましくは、３００ｎｍから２０００ｎｍの範囲にある生成物リポソームをもたらす。必要な場合には、本発明の方法はサイズ制御特徴を伴う場合がある。これは、成分を、リポソームのサイズを制御する再懸濁媒体（例えば、国際特許出願公開ＷＯ−Ａ―０１５６５４８に記載されるように、糖類など）に取り込むことを伴い得る。あるいは、サイズ制御は、懸濁物が微小流体化またはフィルター通過または均質化に供されるさらなる工程を工程ｄの後に伴い得る。超音波処理は、この目的のためのあまり好ましくないが、実行可能な選択肢である。しかし、超音波処理では、ある程度のＤＮＡフラグメント化が避けられない。

処理後、核酸およびタンパク質の両方を含む生成物リポソームを、捕捉されていない核酸またはアシスタータンパク質または他の成分が生成物の懸濁物から除かれる精製工程に供することが好ましい。そのような精製プロセスは、遠心分離、ろ過、規定された細孔サイズの多孔性膜に通すこと、ゲル排除クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、この場合、小胞はボイド体積に現れる）を伴い得る。

本発明者らは、本発明が、対象に施されたとき、免疫応答（特に、改善された抗体応答）を生じさせるために非常に効果的であることを見出している。本発明者らは、本発明によって示される改善は、基本的には、核酸およびアシスタータンパク質が同じ抗原提示細胞（これには、抗原特異的なＢ細胞がおそらくは含まれる）に同時に標的化され、その結果、好適に配合された小胞と遭遇した後、個々の抗原提示細胞が核酸およびその同系タンパク質の両方を取り込むようになったためであると考えている。インフルエンザの赤血球凝集素の場合、本発明者らは、核酸（赤血球凝集素をコードするＤＮＡ）およびその同系タンパク質（赤血球凝集素タンパク質）を、この場合には、核酸を含まない完全な不活化ウイルスのタンパク質の形態で、別個のリポソーム区画またはリポソーム集団において別々に配合し、その後、混合し、インビボで同時投与したとき、それぞれのリポソームがＤＮＡおよびその同系タンパク質の両方を含有するような小さいリポソーム粒子におけるＤＮＡおよびその同系タンパク質の同時配合の相乗的な効果が達成されないことを観測している。これらのデータは、免疫応答（この場合にはインフルエンザ赤血球凝集素に対する免疫応答）を誘発することにおけるＤＮＡおよびその同系タンパク質の相乗作用には、ＤＮＡおよびその同系タンパク質の両方を同じ抗原提示細胞に同時に標的化することを可能にするための適切な配合が要求されるという本発明者らの仮説を、裏付けている。

本発明は、添付された実施例によって例示される。

カチオン性リポソームにおける赤血球凝集素
材料および方法：
脂質
卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）および１，２−ジオレオイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（英国）から購入した。すべての脂質は、クロロホルムに溶解し、窒素置換して保存した（−２０℃）。

ＤＮＡ
プラスミドｐＣＩ−ＯＶＡ（ＤＮＡ ＯＶＡと称される）（Ｔ．Ｎａｇａｔａ博士（浜松医科大学、日本）からの譲渡）はニワトリの卵アルブミンタンパク質（オバルブミン、ＯＶＡ）のｃＤＮＡを含有する（Ｙｏｓｈｉｄａ Ａ、Ｎａｇａｔａ Ｔ、Ｕｃｈｉｊｉｍａ Ｍ、Ｈｉｇａｓｈｉ Ｔ、Ｋｏｉｄｅ Ｙ、特異的な免疫応答の再現可能な誘導におけるプラスミドＤＮＡワクチンの筋肉内接種を上回る遺伝子銃媒介接種の利点、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０００、１８、１７２５〜１７２９）。ｃＤＮＡは、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター領域の下流側の、ｐＣＩプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＥｃｏＲＩ部位にクローン化されている。プラスミドｐ１．１７／ＳｉｃｈＨＡ（ＤＮＡ ＨＡと称される）はＪ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ博士（ＮＩＢＳＣ、英国）によって提供された（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、２０００、１７３７〜１７４５）。これは、Ａ型インフルエンザ／四川／２／８７に由来する全長のＨＡを含有する。両方の投薬用プラスミドがＡｌｄｅｖｒｏｎ（Ｆａｒｇｏ、米国）によって商業的に製造され、１ｍｇのＤＮＡあたり１００未満のエンドトキシン単位（ＥＵ）を含有し、残留タンパク質は検出できなかった。

タンパク質
Ａ型インフルエンザ／四川／２／８７の不活化ウイルスの完全なタンパク質（スクロース勾配精製物、主要タンパク質ＨＡ、抗原ＨＡと称される）をＮＩＢＳＣ（英国）から得た。オバルブミン（グレードＶＩ、抗原ＯＶＡと称される）をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（英国）から購入した。

リポソーム組成物の調製
簡単に記載すると、卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＥ）および１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）（４：２：１のモル比）から超音波処理によって調製された小さい単層小胞（ＳＵＶ）を、ＤＮＡ単独またはタンパク質単独と混合するか、あるいは、ＤＮＡおよびタンパク質と一緒に混合した（表１）。配合物を三連で調製した：２つのバイアルが投薬（抗原刺激および追加抗原刺激）のためであり、１つのバイアルが、［Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、Ｓａｆｆｉｅ，Ｒ．およびＨａｒｔ，Ｓ．Ｌ．、リポソーム内におけるプラスミドＤＮＡの高収率取り込み：ＤＮＡ一体性およびトランスフェクション効率に対する影響、Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、１９９６、３（６）、４６７〜４７５］に、および、［Ｋｉｒｂｙ，Ｃ．、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、脱水−再水和小胞（ＤＲＶ）：リポソームにおける高収率薬物捕捉のための新しい方法、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９４、２、９７９〜９８４］に記載されたように、捕捉用物質に加えられ、一晩凍結乾燥された放射能標識トレーサー（ＨＡおよびＯＶＡ、ＤＮＡおよびタンパク質）に基づく％捕捉の計算のためであった。制御された条件のもとでの再水和の後、得られた脱水−再水和小胞（ＤＲＶリポソーム）を遠心分離によって洗浄して、取り込まれなかった物質を除いた。洗浄されたペレットを、要求される投薬体積にＰＢＳで再懸濁した。リポソーム内へのＤＮＡおよび／またはタンパク質の取り込みを、懸濁されたペレットに回収された^３５Ｓ（ＤＮＡの場合）および^１２５Ｉ（タンパク質の場合）の放射能に基づいて見積もった。リポソームは、微量電気泳動、およびＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００における２５℃での光子相関分光法（ＰＣＳ）に供され、そのゼータ電位（ＺＰ）およびｚ−平均直径がそれぞれ測定された。

動物の処置
メスＢａｌｂ／ｃマウス（６週齢から１２週齢；Ｈａｒｌａｎ、英国）を、０．２ｍｌの投薬体積で投与された皮下注射によって免疫化した（表２）。最終的な投薬量は、（放射能計数バイアルからの）捕捉された物質％（ＤＮＡ、タンパク質または両者）に基づいて計算された。陰性コントロールのマウスはＰＢＳの投与をそれぞれ受けた。マウスは抗原の２回の投薬を０日目および２８日目に受け、サンプル採血物が、最初の注射に関して１６日目、２８日目および４２日目に尾静脈から集められた。

配合物捕獲ＥＬＩＳＡ
免疫化用配合物（表２）を、ＨＡ（Ａ／四川）の抗原性について捕獲酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってアッセイした。保証された結合化学性の９６ウエルプレートを、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）におけるヒツジ抗Ａ／四川ＨＡの基準血清（ＮＩＢＳＣ）の１：２０００希釈物の５０μｌ／ウエルで、一晩、４℃でコーティングした。ヒツジ抗体溶液を除いた後、ウエルを、ＰＢＳにおける１０％（ｗ／ｖ）ＦＣＳ（ウシ胎児血清）の２００ｕｌでコーティングした。３７℃で２時間後、ブロッキング溶液を除き、連続希釈された（ｘ２系列の）配合物（表２参照）をウエルに加えた（ウエルあたり５０μｌのサンプル）。配合物は、ＰＢＳおよびトリトンＸ１００（Ｔｘ−１００）（これは、リポソーム配合物を溶解して、捕捉物質をあらわにすることができる）で希釈された（５）Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ、Ｂｒｅｎｄａ ＭｃＣｏｒｍａｃｋ、Ｍｉａ Ｏｂｒｅｎｏｖｉｃ、Ｒｏｇｈｉｅｈ Ｓａｆｆｉｅ、Ｂｒａｈｉｍ ＺａｄｉおよびＹｖｏｎｎｅ Ｐｅｒｒｉｅ、リポソームにおけるワクチン捕捉、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９９、１９、１５６〜１６２）。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ／ツイーン２０で４回洗浄し、１／５０００の希釈度でのネズミ特異的（Ａ型インフルエンザ／四川）抗血清の希釈物で重層した（ウエルあたり５０μｌのサンプル）。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ／ツイーン２０で４回洗浄し、５０μｌ／ウエルのウサギ抗マウスＩｇ−ＨＲＰコンジュゲート化血清（Ｄａｋｏ）を重層した。３７℃で１時間後、プレートをＰＢＳ／ツイーン２０で４回洗浄し、５０μｌ／ウエルの基質溶液ｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ、Ｆａｓｔ ＯＰＤ）で重層した。反応を、５０μｌ／ウエルの停止溶液（３Ｍ硫酸）を添加することによって停止させ、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した。

血清のＥＬＩＳＡ
サンプル採血物から得られた血清をＰＢＳで２０倍に希釈して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってアッセイされるまで−２０℃で保存した。保証された結合化学性の９６ウエルプレートを、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）におけるヒツジ抗Ａ／四川ＨＡの基準血清（ＮＩＢＳＣ、英国）の１：１０００希釈物の５０μｌ／ウエルで、一晩、４℃でコーティングした。ヒツジ抗体溶液を除いた後、ウエルを、ＰＢＳにおける２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの２００μｌでコーティングした。３７℃で２時間後、ブロッキング溶液を除き、Ａ型インフルエンザ／四川／２／８７の不活化ウイルスの完全なタンパク質（スクロース勾配精製物、主要タンパク質ＨＡ）（ＰＢＳにおいて２．５μｇ／ｍｌ）をウエルに加えた（ウエルあたり５０μｌのサンプル）。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ／ツイーン２０（商標）で４回洗浄して、１／１００の希釈度から始まる異なる実験血清（個々の動物サンプル採血物または群血清プール物）の希釈物で重層した（ウエルあたり５０μｌのサンプル）。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ／ツイーン２０で４回洗浄し、５０μｌ／ウエルのウサギ抗マウスＩｇ−ＨＲＰコンジュゲート化血清（Ｄａｋｏ）を重層した。３７℃で１時間後、プレートをＰＢＳ／ツイーン２０で４回洗浄し、５０μｌ／ウエルの基質溶液ｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ、Ｆａｓｔ ＯＰＤ）で重層した。反応を、５０μｌ／ウエルの停止溶液（３Ｍ硫酸）を添加することによって停止させ、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した。抗体応答が、ＯＤが０．２００の読み取り値に達するために要求される血清希釈度（終点希釈度）の逆数として表された。セロコンバージョンの基準が陰性コントロール動物から確立された（表３、群１．１２の応答を参照のこと）：ｘ２陰性コントロール（約０．２ユニットのＯＤ）。

結果
これらのデータは、組成物がＤＮＡおよびタンパク質の非常に効率的な同時捕捉を生じさせていること、また、タンパク質の存在はＤＮＡの捕捉効率に対して小さい負の影響を及ぼしているにすぎないこと、および逆の場合逆のことを示している。

ＨＡ（Ａ型インフルエンザ／四川株）の抗原性に対する配合物の評価が図１に示される。ＯＤ（４９０ｎｍ）シグナルはＨＡ抗原に比例している。１２個の群に対する血清抗体の結果（表２）が表３に示される。これらの結果はまた、図２（１６日目）、図３（２８日目）および図４（４２日目、すなわち、２回目の投薬の後の１５日目）に示される。

考察
捕獲ＥＬＩＳＡによるＨＡの抗原性についての配合物（表２）の評価（図１）が、トリトンＸ１００（ＴＸ１００）（リポソーム破壊剤）の非存在下および存在下で配合物に対して行われた（注：−群１．３、群１．４、群１．７、群１．１０および群１．１２は、これらの配合物はＨＡタンパク質を含有しないので、アッセイに対する陰性コントロールとして使用される）。ＴＸ１００の非存在下で試験された配合物は、タンパク質がリポソームと配合されていないＨＡ含有配合物において、ＨＡ抗原が容易に検出可能であり（群１．８、群１．９、群１．１０）、小さいＨＡ抗原陽性シグナルが配合物１．１および配合物１．２において検出可能であること（このことは、このアッセイで用いられた抗体によって結合され得るＨＡ抗原の表面露出により生じたとおそらくは考えられる）を示している。ＴＸ１００の存在下では、実質的により大きい陽性シグナルがリポソーム群１．１およびリポソーム群１．２について得られており、このことは、リポソーム配合物に以前に含有された抗原の検出を示している（ＴＸ１００非存在を参照のこと）。配合物１．５および配合物１．６はともに、配合においてＤＮＡの非存在下でリポソームにより捕捉されたＨＡ抗原を含有するが（１．１および１．２と比較のこと）、ＨＡの抗原性をほとんど明らかにすることができない。

配合物（表２）を用いた免疫化の後に生じた免疫応答が、抗インフルエンザ（主要タンパク質ＨＡ）の抗体応答を測定することによって評価された。結果が表３にまとめられ、図２、図３および図４にも示される。同じリポソーム配合物で同時送達されるＨＡのＤＮＡおよびタンパク質の両方からなった配合物１．１は、試験されたそれぞれの血清サンプル採血物（１６日目、２８日目、および４２日目（２回目の投薬の後の１５日目））において、それ以外の配合物のすべてよりも大きい応答をもたらしている。この同時送達された配合物に対する応答は、大きさ（ＯＤ４９０ｎｍ（１／１００の希釈血清）および力価）に関して、また、それぞれの採血時点で血清陽性と考えられる動物の数に関して最大である。

同じリポソーム配合物に同時送達されたタンパク質およびＤＮＡからやはりなる配合物１．２および配合物１．３は、配合物１．１と同じくらいの実質的な応答を生じさせていない。配合物１．２および配合物１．３は、互いに同系でないタンパク質およびＤＮＡからなる。

配合物１．６は、動物に投与されたタンパク質およびＤＮＡ生成物に関して、配合物１．１が１．６と同等であるという点で、本発明をさらに示している。しかしながら、配合物１．１では、生成物が同じリポソームビヒクルで同時送達され、一方、配合物１．６では、ＤＮＡおよびタンパク質が別個のリポソームビヒクルで送達される。再度ではあるが、以前に述べたように、配合物１．１に対する免疫応答は１．６よりも実質的に大きい。

ＨＡのＤＮＡを含有する配合物に対する応答は、１．１を除き、（配合物１．３、配合物１．４、配合物１．７および配合物１．１０では）、本質的には、免疫応答を生じさせることができない。しかしながら、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｐ他（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、２０００、１７３７〜１７４５）が、（非捕捉での）免疫化の後でのこのプラスミドに対する陽性の応答を報告しているように、この応答は用量に関連づけられ得る。

これ以前に報告されている（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ Ｇ、Ｔａｎ Ｌ、Ｂｅｎ−Ａｈｍｅｉｄａ ＥＴ、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ Ｒ、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９２、１０（１１）：７４７〜５３）、リポソーム配合物で送達されたタンパク質に対するリポソームのアジュバント効果（配合物１．５対配合物１．１１）は、２回の投薬の後の１５日目のサンプル採血において弱く認めることができ、再度ではあるが、投薬および免疫化スケジュールの違いにより、異なる実験結果を説明することができる。リポソームにおけるプラスミドＤＮＡの免疫アジュバント作用が以前に報告されている（Ｇｕｒｓｅｌ Ｍ他、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９９、１７：１３７６〜１３８３）が、これもまた、配合物１．１および配合物１．５に対する応答の違いにおいて明らかにされる。しかしながら、赤血球凝集素タンパク質をその適切な（同系）プラスミドと同時配合することの相乗的な効果は、ＣｐＧモチーフについてＫｌｉｎｍａｎ（Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ他、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９９、１９：２５１９〜２６）によって観測された免疫アジュバント効果などの、ＤＮＡの広く知られている免疫アジュバント効果に起因すると考えられる効果のいずれもはるかに超えている。

示された結果はリポソーム配合物の皮下投与により得られたものであるが、提案された作用機構（一般的および特異的）（＋抗原速度論的性質）は、他の投与経路（例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、鼻／肺を介した経路、および経口経路など）によっても有効であるはずである。実際、リポソームは、タンパク質およびＤＮＡの両方を送達し、かつ、免疫応答を生じさせるために、これらの経路によって成功裏に使用されている。

まとめると、本発明者らは、本発明が、対象に施されたとき、免疫応答を生じさせるために非常に効果的であることを見出している。応答には、抗体応答が伴う。本発明によって示される改善には、リポソーム形成物質の組成物で、抗原性タンパク質を機能的にコードする核酸および同時送達されるタンパク質を、リポソームと会合させて有する組成物を伴い、この場合、同時送達されるタンパク質はエピトープを抗原性タンパク質と共有する。

マンノース標的化Ｂ型肝炎ワクチン
材料および方法
脂質
卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および１，２−ジオレオイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（英国）から購入した。Ｎ−［２−（２−｛２−［２−（２，３−ビス−オクタデカ−９−エニルオキシ−プロポキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エチル］−３−（３，４，５−トリヒドロキシ−６−ヒドロキシメチル−テトラヒドロピラン−２−イルスルファニル）プロピオンアミド（式が下記に示される（ＤＯＧＰ４αＭａｎ、Ｆｒａｎｃｉｓ Ｓｃｈｕｂｅｒ教授（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｌｏｕｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ １、Ｆａｃｕｌｔｅ ｄｅ Ｐｈａｒｍａｃｉｅ ７４、Ｒｏｕｔｅ ｄｕ Ｒｈｉｎ、ＢＰ ２４ ６７４０１、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｇｒａｆｆｅｎｓｔａｄｅｎ）からの譲渡）。すべての脂質は、クロロホルムに溶解し、窒素置換して保存した（−２０℃）。

ＤＮＡ
プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢｓ（Ｓ）（または単にｐＣＭＶ−Ｓ）は、ＣＭＶ最初期プロモーターの制御下でＢ型肝炎表面抗原（小（またはＳ）タンパク質）を発現する（Ｄａｖｉｓ ＨＬ、Ｍｉｃｈｅｌ ＭＬ、Ｗｈａｌｅｎ ＲＧ、ＤＮＡに基づくＢ型肝炎に対する免疫化は抗原の継続した分泌および高レベルの循環抗体を誘導する（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９３、２：１８４７〜１８５１））。投薬用プラスミドがＡｌｄｅｖｒｏｎ（Ｆａｒｇｏ、米国）によって商業的に製造され、１ｍｇのＤＮＡあたり１００未満のエンドトキシン単位（ＥＵ）を含有し、残留タンパク質は検出できなかった。

タンパク質
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）組換えタンパク質、純度：＞９５％（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）、Ａｌｄｅｖｒｏｎ（Ｆａｒｇｏ、米国）から購入された酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）からの精製物（Ｌｏｔ ０５／００ ＨＢｓＡｇ）。

リポソーム組成物の調製
簡単に記載すると、卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）およびＮ−［２−（２−｛２−［２−（２，３−ビス−オクタデカ−９−エニルオキシ−プロポキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エチル］−３−（３，４，５−トリヒドロキシ−６−ヒドロキシメチル−テトラヒドロピラン−２−イルスルファニル）プロピオンアミド（ＤＯＧＰ４αＭａｎ）（４：２：１：１のモル比）から超音波処理によって調製された小さい単層小胞（ＳＵＶ）を、ＤＮＡ単独およびタンパク質単独と混合するか、または、ＤＮＡおよびタンパク質と一緒に混合した（表４）。配合物を投薬（初回抗原刺激および追加抗原刺激）のために２つのバイアル中に調製した。各バイアルは、［Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、Ｓａｆｆｉｅ，Ｒ．およびＨａｒｔ，Ｓ．Ｌ．、リポソーム内におけるプラスミドＤＮＡの高収率取り込み：ＤＮＡ一体性およびトランスフェクション効率に対する影響、Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、１９９６、３（６）、４６７〜４７５］、および［Ｋｉｒｂｙ，Ｃ．、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、脱水−再水和小胞（ＤＲＶ）：リポソームにおける高収率薬物捕捉のための新しい方法、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９４、２、９７９〜９８４］に記載されたように、捕捉される物質に加えられ一晩凍結乾燥された放射能標識トレーサー（ＤＮＡ物質およびタンパク質物質）を含有した（％捕捉の計算のための）。凍結（予備凍結乾燥プロセス）の前に、スクロースを１：３の脂質対スクロース比（ｗ／ｗ）で各バイアルに加え、２０℃で溶解させた（Ｂｒａｈｉｍ、Ｚ．およびＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、溶質を小さいリポソームに高収率で捕捉するための新規な方法、Ｊ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００、１００（１）、７３〜８０）。制御された条件のもとでの再水和の後、得られた脱水−再水和小胞（ＤＲＶリポソーム）を、要求される投薬体積にＰＢＳで希釈した。再水和後の各バイアルの一定体積（約２５％）を遠心分離によって洗浄して、取り込まれなかった物質を除いた。リポソーム配合物へのＤＮＡおよび／またはタンパク質の取り込み割合を、懸濁されたペレットに回収された^３５Ｓ（ＤＮＡの場合）および^１２５Ｉ（タンパク質の場合）の放射能に基づいて見積もった。リポソームは、微量電気泳動、およびＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００における２５℃での光子相関分光法（ＰＣＳ）に供され、そのゼータ電位（ＺＰ）およびｚ−平均直径がそれぞれ測定された。

動物の処置
メスＢａｌｂ／ｃマウス（６週齢から１２週齢；Ｈａｒｌａｎ、英国）を、０．２ｍｌの投薬体積で投与された皮下注射によって免疫化した。最終的な投薬量が表５にまとめられる。マウスは抗原の２回の投薬を０日目および２８日目に受け、サンプル採血物が、最初の注射に関して２８日目（１回の投薬後）および５６日目（２回の投薬後）に尾静脈から集められた。

血清のＥＬＩＳＡ
サンプル採血物から得られた血清をＰＢＳで希釈して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってアッセイされるまで−２０℃で保存した。保証された結合化学性９６ウエルプレートを、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）において２．５μｇ／ｍｌのＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）組換えタンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、Ｆａｒｇｏ、米国、Ｌｏｔ ０５／００ ＨＢｓＡｇ）の５０μｌ／ウエルで、一晩、４℃でコーティングした。一晩インキュベーションした後、ウエルをＰＢＳ／ツイーン２０（商標）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄し、その後、ウエルをＰＢＳにおける２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの２００μｌでコーティングした。３７℃で２時間後、ブロッキング溶液を除き、ウエルをＰＢＳＴで４回洗浄して、１／１００の希釈度から始まる異なる実験血清（個々の動物サンプル採血物）の希釈物で重層した（ウエルあたり５０μｌのサンプル）。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄して、５０μｌ／ウエルのウサギ抗マウスＩｇ−ＨＲＰコンジュゲート化血清（Ｄａｋｏ）を重層した。３７℃で１時間後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄して、５０μｌ／ウエルの基質溶液３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｐｉｅｒｃｅ）で重層した。反応を、５０μｌ／ウエルの停止溶液（２Ｍ硫酸）を添加することによって停止させ、各ウエルの４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した。

結果
物理的特性（％生成物（ＤＮＡおよび／またはタンパク質）捕捉、粒子サイズ、および表面電位（ゼータ））を表６にまとめる。

抗体応答（血清ＥＬＩＳＡ）が、Ｌｏｇ_１０（アッセイされた血清希釈度）における平均（ｎ＝５動物／群）ＯＤシグナル±ＳＥＭとして表される。結果は、ＨｂｓＡｇの１回の投薬の後の２８日目の総Ｉｇ結果を示す図５に、および、２回目の投薬の後の２８日目の総Ｉｇ結果を示す図６に示される。

考察
免疫応答を誘導するためのＤＮＡおよびタンパク質に対する送達ビヒクルとしてのマンノースリガンド標的化リポソームの使用が以前に記載されている（Ｋａｗａｋａｍｉ Ｓ、Ｓａｔｏ Ａ、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｍ、Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｆ、Ｈａｓｈｉｄａ Ｍ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２０００、７（４）：２９２〜９（ＤＮＡ）；および、Ｌａｔｉｆ Ｎ、Ｂａｃｈｈａｗａｔ ＢＫ、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ、１９８４、８（２）：７５〜８（タンパク質）。さらに、抗原提示細胞による抗原（タンパク質）のマンノース受容体媒介取り込みの一般的な有用性が、免疫応答の誘導における強力な構成要素として認識されている（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、８：３４８〜３５４）。ＤＮＡおよびタンパク質の両方を同時送達するためのマンノースリガンド標的化リポソームビヒクルの、同じ送達ビヒクルに含ませての使用は、（そして、おそらくは同じ標的細胞に対しては）、これまで報告されていない。

配合物（表４および表５）を用いた免疫化の後に生じる免疫応答が、抗Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗体応答を測定することによって評価された。結果が図５および図６に例示される。同じリポソーム配合物で同時送達されたＨＡのＤＮＡおよびタンパク質の両方からなった配合物２．１は、試験されたそれぞれの血清サンプル採血物（２８日目および５６日目（２回目の投薬の後の２８日目））において、それ以外の配合物のすべてよりも大きい応答をもたらす。この同時送達された配合物に対する応答は、ＯＤ４５０ｎｍでの血清希釈度および力価（０．３ユニットの終点読み取りＯＤ）の両方の大きさに関して大きくなっている。

ＤＮＡ含有配合物（２．１を除く）、配合物２．３に対する応答は、マンノース脂質（ＤＯＧＰ４αＭａｎ）成分を伴わない同じリポソームビヒクル（ＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＡＰ）において同じＤＮＡ生成物を（１０μｇのＤＮＡ用量で）使用して発表された結果（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ Ｇ、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．、１９９８、１５（５）：６６１〜７０）と一致する免疫応答である。リポソームにおけるプラスミドＤＮＡの免疫アジュバント作用が、本明細書中に記載されるのと同じ、ＤＮＡ（非コード、ＩＳＳ能コントロール）およびタンパク質の生成物を使用して以前に報告されている（Ｇｕｒｓｅｌ Ｍ他、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９９、１７：１３７６〜１３８３）。この論文における抗原−ｐＤＮＡ同時捕捉配合物に対するＤＮＡ成分の報告されたアジュバント作用は、約３倍の力価で、あまり大きくないとして記載されている（２回の投薬の後の結果）。図６に例示される類似する結果は、コードする（ＨＢｓＡｇ）ＤＮＡ成分が使用されたとき（配合物２．１）、応答の３０倍の増大を示している（配合物２．２と比較のこと）。従って、ＨＢｓＡｇタンパク質をその適切な（同系）プラスミドと同時配合することの相乗的な効果は、ＣｐＧモチーフ単独についてＧｕｒｓｅｌまたはＫｌｉｎｍａｎ（Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ他、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９９、１９：２５１９〜２６）によって観測された免疫アジュバント効果などの、ＤＮＡの免疫アジュバント効果（これは約３倍にすぎない）に起因すると考えられる何らかの効果を超えている。

まとめると、本発明者らは、本発明が、対象に施されたとき、免疫応答を生じさせるために非常に効果的であることを見出している。応答には、抗体応答が伴う。本発明によって示される改善には、マンノシル化された脂質成分を含むリポソーム形成物質の組成物で、抗原性タンパク質を機能的にコードする核酸および同時送達されるタンパク質を、リポソームと会合させて有する組成物を伴い、この場合、同時送達されるタンパク質は抗原性タンパク質とエピトープを共有する。

インフルエンザウイルス抗原投与からの保護
材料および方法
脂質
卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および１，２−ジオレオイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（英国）から購入した。すべての脂質は、クロロホルムに溶解し、窒素置換して保存した（−２０℃）。

ＤＮＡ
ｐ１．１８／ＰＲ８−ＨＡ（ＤＮＡ ＨＡと称される）がＪ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ博士（ＮＩＢＳＣ、英国）から提供され、これは、Ａ型インフルエンザ／プエルトリコ／８／３４に由来する全長のＨＡを含有する。投薬用プラスミドがＡｌｄｅｖｒｏｎ（Ｆａｒｇｏ、米国）によって商業的に製造され、１ｍｇのＤＮＡあたり１００未満のエンドトキシン単位（ＥＵ）を含有し、残留タンパク質は検出できなかった。

タンパク質
Ａ型インフルエンザ／プエルトリコ／８／３４の不活性化ウイルスの完全なタンパク質（スクロース勾配精製物、主要タンパク質ＨＡ、抗原ＨＡと称される）をＮＩＢＳＣ（英国）から得た。

リポソーム組成物の調製
簡単に記載すると、卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＥ）および１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）（４：２：１のモル比）から超音波処理によって調製された小さい単層小胞（ＳＵＶ）を、ＤＮＡ（ＤＮＡ ＨＡと称される）およびタンパク質（抗原ＨＡと称される）と混合した（表７を参照のこと）。配合物を四連で調製した。２つのバイアルは投薬（初回抗原刺激および追加抗原刺激）のためであり、２つのバイアルは、［Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、Ｓａｆｆｉｅ，Ｒ．およびＨａｒｔ，Ｓ．Ｌ．、リポソーム内におけるプラスミドＤＮＡの高収率取り込み：ＤＮＡ一体性およびトランスフェクション効率に対する影響、Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、１９９６、３（６）、４６７〜４７５］に、および［Ｋｉｒｂｙ，Ｃ．、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、脱水−再水和小胞（ＤＲＶ）：リポソームにおける高収率薬物捕捉のための新しい方法、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９４、２、９７９〜９８４］に記載されるように、捕捉された物質に加えられ、一晩凍結乾燥された放射能標識トレーサー（ＨＡ；ＤＮＡおよびタンパク質）に基づく％捕捉の計算のためであった。制御された条件のもとでの再水和の後、得られた脱水−再水和小胞（ＤＲＶリポソーム）を遠心分離によって洗浄して、取り込まれなかった物質を除いた。洗浄されたペレットを、要求される投薬体積にＰＢＳで希釈した。ＤＮＡおよび／またはタンパク質の取り込みを、懸濁されたペレットに回収された^３５Ｓ（ＤＮＡの場合）および^１２５Ｉ（タンパク質の場合）の放射能に基づいて見積もった。リポソームは、微量電気泳動、およびＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００における２５℃での光子相関分光法（ＰＣＳ）に供され、そのゼータ電位（ＺＰ）およびｚ−平均直径がそれぞれ測定された。

動物の処置
メスＢａｌｂ／ｃマウス（６週齢から１２週齢；Ｈａｒｌａｎ、英国）を、０．２ｍｌの投薬体積で投与された皮下注射によって免疫化した。最終的な投薬量が表７にまとめられる。マウスは２回の投薬を０日目および２８日目に受け、サンプル採血物が、最初の注射に関して２１日目（１回の投薬の後）および４２日目（２回の投薬の後）に尾静脈から集められた。

生インフルエンザウイルスの抗原投与
マウスに対して、最初の免疫化に関して５７日目に、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ（英国、ＮＩＢＳＣ）において、マウス適合化生インフルエンザウイルス（Ａ／プエルトリコ／８／３４）の、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳにおける約１０倍のＭＩＤ_５０（５０％マウス感染用量）が抗原投与された。ウイルスは、鼻腔内滴下によって左右両方に、非麻酔マウスに５０μｌの体積で投与された。抗原投与後１日間隔で、鼻腔洗浄を、マウスあたり、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む０．５ｍｌのＰＢＳを使用して行った。鼻腔洗浄サンプルにおける流出インフルエンザウイルスの存在をサンプリング後直ちに評価した。鼻腔洗浄サンプルを含む無血清イーグル最少必須培地で、９６ウエル組織培養プレートにおけるＭＤＣＫ細胞のＴＰＣＫ−トリプシン処理されたコンフルエント単層物を覆った。３５℃で３日間インキュベーションした後、各ウエルにおけるウイルスの存在を、５０μｌの上清を等体積の０．７％（ｖ／ｖ）七面鳥赤血球とインキュベーションすることによって測定した。ウイルス陽性サンプルは、目に見える赤血球凝集をもたらした（凝集スポットが明瞭に認められる）。

血清のＥＬＩＳＡ
サンプル採血物から得られた血清をＰＢＳで希釈して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってアッセイされるまで−２０℃で保存した。保証された結合化学性の９６ウエルプレートを、ＰＢＳにおけるインフルエンザＨＡ−ＰＲ８抗原（２０μｇ／ｍｌ）の５０μｌ／ウエルで一晩コーティングした。４℃で一晩インキュベーションする。一晩インキュベーションした後、ウエルをＰＢＳ／ツイーン２０（商標）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄し、その後、ウエルをＰＢＳにおける２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの２００μｌでコーティングした。３７℃で２時間後、ブロッキング溶液を除き、ウエルをＰＢＳＴで４回洗浄して、１／１００の希釈度から始まる異なる実験血清（個々の動物サンプル採血物）の希釈物で重層した（ウエルあたり５０μｌのサンプル）。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄して、５０μｌ／ウエルのウサギ抗マウスＩｇ−ＨＲＰコンジュゲート化血清（Ｄａｋｏ）を重層した。３７℃で１時間後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄して、５０μｌ／ウエルの基質溶液３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｐｉｅｒｃｅ）で重層した。反応を、５０μｌ／ウエルの停止溶液（２Ｍ硫酸）を添加することによって停止させ、各ウエルの４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した。

結果
リポソームの物理的特性（％生成物（ＤＮＡおよび／またはタンパク質）捕捉、粒子サイズ、および表面電位（ゼータ））を表８にまとめる。

抗体応答（血清ＥＬＩＳＡ）は、Ｌｏｇ_１０（アッセイされた血清希釈度）における平均（ｎ＝５動物／群）ＯＤシグナル±ＳＥＭとして表される。結果は、１回の投薬の後の結果を示す図７に、および、２回の投薬の後の結果を示す図８に示される。

生ウイルス抗原投与の結果が、得られた鼻腔洗浄サンプルにおける検出可能なウイルスを示した動物（ｎ＝１５抗原投与）／群の百分率として、表９に示される。

考察
配合物（表７）を用いた免疫化の後に生じた免疫応答が、抗インフルエンザ（Ａ／ＰＲ８株特異的な）応答を測定することによって評価された。結果が図７および図８に示される。同じリポソーム配合物で同時送達されたＨＡのＤＮＡおよびタンパク質の両方からなった群（配合物）３．１は、試験されたそれぞれの血清サンプル採血物（２１日目および４２日目（２回目の投薬の後の１４日目））において、それ以外の群（配合物）のすべてよりも大きい応答をもたらす。この同時送達された配合物群（３．１．１）についての応答は、ＯＤ４９０ｎｍでの血清希釈度および力価（０．３ユニットの終点読み取りＯＤ）の両方の大きさに関して大きくなっている。

負荷成分（混合されたＨＡのＤＮＡおよびタンパク質）（群３．３）に対する応答は、一貫して、同時送達された同じ負荷成分（群３．１）よりも弱い免疫応答を生じさせている。実際、同じリポソームビヒクルにおいて、同じＤＮＡ負荷物（１０μｇのＤＮＡ用量で）を、低下したタンパク質負荷物（０．５μｇのタンパク質用量）とともに使用した場合（群３．２）、３倍より大きいタンパク質成分負荷量と混合されたＨＡのＤＮＡおよびタンパク質（群３．３）に対する同等の血清Ｉｇ免疫応答が生じている。群３．４は何ら特異的な抗Ｉｇインフルエンザ応答を生じさせることができなかった。しかしながら、この群は免疫原成分が全く投与されなかった（ＰＢＳのみ）。従って、この結果は予想通りである。

生ウイルス抗原投与の結果は、配合物を用いた免疫化に応答してマウスで誘導された免疫応答が、動物をウイルス感染から保護するために十分であるかどうかを示すために役立つ。これらは本質的に、抗原投与後、ウイルス感染の通常のプロフィルを反映する「ナイーブ」動物であるので、群３．４は陰性コントロールとして役立つ。この群（３．４）において、すべての動物が４日目までにウイルスに感染し、６８％（ｓｅｍ １８％）の感染動物の平均％（５日超）を有する。負荷成分（混合されたＨＡのＤＮＡおよびタンパク質）からなり、リポソームにより同時送達されず、一方で、抗インフルエンザ応答（図７）を誘導した群３．３は、ウイルスに感染している動物の割合（％）において、（群３．４に対して）著しい低下を明らかにすることができず、３７％（ｓｅｍ １０％）の感染動物の平均％（５日超）を有した。同じリポソーム配合物で同時送達されるＨＡのＤＮＡおよびタンパク質の両方からなった群（配合物）３．１は、それ以外の群（配合物）のすべてよりも大きい応答（抗体応答、図７および図８）をもたらし、また、ウイルスに感染している動物の割合（％）において、（群３．４に対して）著しい低下（ｐ＜０．０５）を明らかにしており、わずかに７％（ｓｅｍ ６％）の感染動物の平均％（５日超）を有しただけであった。

まとめると、本発明者らは、本発明が、対象に施されたときに感染性生物による感染から個体を保護することができる免疫応答を生じさせるために非常に効果的であることを見出している。応答には、抗体応答が伴う。本発明によって示される改善には、抗原性タンパク質を機能的にコードする核酸の負荷物を送達するリポソーム形成物質と、同時送達されるタンパク質との組成物を伴い、この場合、同時送達されるタンパク質は抗原性タンパク質とエピトープを共有する。

多価インフルエンザワクチン
材料および方法
脂質
卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および１，２−ジオレオイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（英国）から購入した。すべての脂質は、クロロホルムに溶解し、窒素置換して保存した（−２０℃）。

ＤＮＡ
プラスミドｐＩ１７／ＨＡ−四川およびプラスミドｐＩ．１８／ＰＲ８−ＨＡがＪ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ博士（ＮＩＢＳＣ、英国）から提供され、これらは、Ａ型インフルエンザ／四川／２／８７およびＡ型インフルエンザ／プエルトリコ／８／３４にそれぞれ由来する全長のＨＡ配列を含有する。投薬用プラスミドがＡｌｄｅｖｒｏｎ（Ｆａｒｇｏ、米国）によって商業的に製造され、１ｍｇのＤＮＡあたり１００未満のエンドトキシン単位（ＥＵ）を含有し、残留タンパク質は検出できなかった。

タンパク質
Ａ型インフルエンザ／四川／２／８７およびＡ型インフルエンザ／プエルトリコ／８／３４の不活性化ウイルスの完全なタンパク質（スクロース勾配精製物、主要タンパク質ＨＡ、抗原ＨＡと称される）をＮＩＢＳＣ（英国）から得た。

リポソーム組成物の調製
簡単に記載すると、卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＥ）および１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）（４：２：１のモル比）から超音波処理によって調製された小さい単層小胞（ＳＵＶ）を、ｐＩ１７／ＨＡ−四川のＤＮＡおよびＡ型インフルエンザ／四川／２／８７のウイルスタンパク質と、または、ｐＩ．１８／ＰＲ８−ＨＡのＤＮＡおよびＡ型インフルエンザ／プエルトリコ／８／３４のウイルスタンパク質とのいずれかと混合した（表１０を参照のこと）。配合物を二連で調製した。１つのバイアルが投薬のためであり、１つのバイアルは、［Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、Ｓａｆｆｉｅ，Ｒ．およびＨａｒｔ，Ｓ．Ｌ．、リポソーム内におけるプラスミドＤＮＡの高収率取り込み：ＤＮＡ一体性およびトランスフェクション効率に対する影響、Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、１９９６、３（６）、４６７〜４７５］および［Ｋｉｒｂｙ，Ｃ．、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、脱水−再水和小胞（ＤＲＶ）：リポソームにおける高収率薬物捕捉のための新しい方法、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９４、２、９７９〜９８４］に記載されたように、捕捉された物質に加えられ、一晩凍結乾燥された放射能標識トレーサー（ＨＡ；ＤＮＡおよびタンパク質）に基づく％捕捉の計算のためであった。制御された条件のもとでの再水和の後、得られた脱水−再水和小胞（ＤＲＶリポソーム）を遠心分離によって洗浄して、取り込まれなかった物質を除いた。洗浄されたペレットを、要求される投薬体積にＰＢＳで希釈した。ＤＮＡおよび／またはタンパク質の取り込みを、懸濁されたペレットに回収された^３５Ｓ（ＤＮＡの場合）および^１２５Ｉ（タンパク質の場合）の放射能に基づいて見積もった。リポソームは、微量電気泳動、およびＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００における２５℃での光子相関分光法（ＰＣＳ）に供され、そのゼータ電位（ＺＰ）およびｚ−平均直径がそれぞれ測定された。

動物の処置
メスＢａｌｂ／ｃマウス（６週齢から１２週齢；Ｈａｒｌａｎ、英国）を、０．２ｍｌの投薬体積で投与された皮下注射によって免疫化した。最終的な投薬量が表１０にまとめられる。マウスは１回の投薬を０日目に受け、サンプル採血物が１４日目および２８日目に尾静脈から集められた。群４．３に対するリポソーム組成物は、投与直前に混合された、群４．１および群４．２に対する組成物の混合物であった。

血清のＥＬＩＳＡ
サンプル採血物から得られた血清をＰＢＳで希釈して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってアッセイされるまで−２０℃で保存した。２つの異なるプロトコルが、検出されるタンパク質基質に依存して使用された。

ＨＡ−ＰＲ８の場合、保証された結合化学性９６ウエルプレートを、ＰＢＳにおけるインフルエンザＨＡ−ＰＲ８抗原（２０μｇ／ｍｌ）の５０μｌ／ウエルでコーティングした。４℃で一晩インキュベーションした後、ウエルをＰＢＳ／ツイーン２０（商標）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄し、その後、ウエルをＰＢＳにおける２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの２００μｌでコーティングした。３７℃で１時間後、ブロッキング溶液を除き、ウエルをＰＢＳＴで４回洗浄して、１／１００の希釈度から始まる異なる実験血清（個々の動物サンプル採血物）の希釈物の５０μｌ／ウエルで重層した。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄して、５０μｌ／ウエルのウサギ抗マウスＩｇ−ＨＲＰコンジュゲート化血清（Ｄａｋｏ）を重層した。３７℃で１時間後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄して、５０μｌ／ウエルの基質溶液３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｐｉｅｒｃｅ）で重層した。反応を、５０μｌ／ウエルの停止溶液（２Ｍ硫酸）を添加することによって停止させ、各ウエルの４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した。

ＨＡ−四川の場合、保証された結合化学性の９６ウエルプレートを、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）における抗ＨＡ四川ヒツジ血清（ＮＩＢＳＣ標準試薬）の１／２０００希釈物の５０μｌ／ウエルでコーティングした。４℃で一晩インキュベーションした後、ウエルをＰＢＳ／ツイーン２０（商標）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄し、その後、ウエルをＰＢＳにおける２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの２００μｌでコーティングした。３７℃で１時間後、ブロッキング溶液を除き、ウエルをＰＢＳＴで４回洗浄して、ＰＢＳにおけるＨＡ−四川抗原（５μｇ／ｍｌ）の５０μｌ／ウエルで重層した。３７℃で１時間後、抗原溶液を除き、ウエルをＰＢＳＴで４回洗浄して、１／１００の希釈度から始まる異なる実験血清（個々の動物サンプル採血物）の希釈物の５０μｌ／ウエルで重層した。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄して、５０μｌ／ウエルのウサギ抗マウスＩｇ−ＨＲＰコンジュゲート化血清（Ｄａｋｏ）を重層した。３７℃で１時間後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄して、５０μｌ／ウエルの基質溶液３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｐｉｅｒｃｅ）で重層した。反応を、５０μｌ／ウエルの停止溶液（２Ｍ硫酸）を添加することによって停止させ、各ウエルの４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した。

結果
リポソームの物理的特性（％生成物（ＤＮＡおよび／またはタンパク質）捕捉、粒子サイズ、および表面電位（ゼータ））を表１１にまとめる。

抗体応答（血清ＥＬＩＳＡ）は、Ｌｏｇ_１０（アッセイされた血清希釈度）における平均（ｎ＝５動物／群）ＯＤシグナル±ＳＥＭとして表される。結果が図９ａからｄに示される。

考察
配合物（表１０）を用いた免疫化の後に生じた免疫応答が、抗インフルエンザのＨＡ−ＰＲ８株特異的な抗体応答およびＨＡ−四川株特異的な抗体応答を測定することによって評価された。結果が図９ａからｄに示される。

１４日目において、これらのインフルエンザ抗原に対する明らかな抗体応答が、配合物４．４（ＰＢＳ）を除くすべての実験群において検出された。配合物４．３（これは、インフルエンザ四川およびインフルエンザ・プエルトリコ８の両方に対するＨＡのＤＮＡおよびタンパク質からなる）を用いた免疫化は、これらの株のそれぞれに対して、配合物４．１（インフルエンザ四川のＤＮＡおよびタンパク質）または配合物４．２（インフルエンザ・プエルトリコ８）を用いた免疫化の後に誘導された抗体力価と同じように、平均（ＳＥＭ）の標準誤差の範囲内で同等の抗体力価を誘導した。

２８日目において、１４日目と比較して、これらのインフルエンザ抗原に対する抗体応答の顕著な増大が認められた。さらに、配合物４．３（これは、インフルエンザ四川およびインフルエンザ・プエルトリコ８の両方に対するＨＡのＤＮＡおよびタンパク質からなる）を用いた免疫化は、再度ではあるが、インフルエンザ四川株に対して、配合物４．１（インフルエンザ四川のＤＮＡおよびタンパク質）を用いた免疫化の後に誘導された抗体力価と、ＳＥＭの範囲内で同等の抗体力価を誘導した。対照的に、配合物４．３（これは、インフルエンザ四川およびインフルエンザ・プエルトリコ８の両方に対するＨＡのＤＮＡおよびタンパク質からなる）を用いた免疫化は、試験された２つの希釈度の値において、配合物４．２（インフルエンザ・プエルトリコ８）を用いた免疫化の後に誘導された抗体力価よりも低いインフルエンザ・プエルトリコ８株に対する抗体力価を誘導した。

まとめると、本発明者らは、本発明が、多価（例えば、多系統）の送達に適用されたとき、配合物に存在する異なる系統に対する抗体応答を誘導することにおいて非常に効果的であることを見出している。この抗体応答は迅速に現れ（抗原特異的な抗体力価は１回の免疫化の後のほんの１４日目で１０００を超える）、１つだけの系統のＤＮＡ成分およびタンパク質成分のみを送達したときの（すなわち、一価配合物を送達したとき）、本発明により誘導されるレベルと同じレベルであり得る。多価配合物を用いた免疫化により、同等な一価配合物によって誘導される抗体応答と比較して、より低い抗体応答が、これらの系統の１つに対して誘導され得る場合でさえ、この応答レベルは、再度ではあるが、大きく（１０００を超える力価）、時間とともに増大する。従って、本発明によってもたらされ、また、この実験において例示される改善は、いくつかの異なる抗原性系統に対する明らかな抗体応答を、これらの系統のすべてに由来するＤＮＡおよびタンパク質を含有する配合物を用いた１回の免疫化の後に誘導することができるということである。

ＤＮＡおよびタンパク質の捕捉レベル、ならびにリポソームサイズ
実施例１に記されたリポソーム配合の一般的な方法が、Ｂ型肝炎表面抗原、およびその抗原をコードするプラスミドＤＮＡを、表１２に示される様々なタンパク質レベルで捕捉するために使用された。％捕捉値が表１２に示され、表１３には、リポソームの平均サイズおよびゼータ電位が示される。

表１２は、ＤＮＡの捕捉が非常に効率的であり、これに対して、ＨｂｓＡｇタンパク質の捕捉がそれほど効率的でなかったことを示している。プラスミドＤＮＡの存在は、タンパク質の捕捉効率に対してあまり大きくない負の影響を有していた。しかしながら、タンパク質およびＤＮＡが一緒に捕捉されたとき、ＤＮＡの捕捉に対する負の影響は全く認められなかった。これらのデータは、これらのリポソーム配合物におけるＤＮＡおよびタンパク質の効率的な同時捕捉が、Ａ型インフルエンザの赤血球凝集素に対して特有でないこと、または、任意のいずれかのプラスミドに対して特有でないことを明らかにしている。ＤＮＡおよびタンパク質の効率的な捕捉がこれらのリポソーム組成物の一般的な性質であるならば、これは、プラスミドＤＮＡおよびタンパク質抗原の事実上すべての組合せに対して適用可能であると考えられる。

リポソーム配合物についてのこれらのデータから、また、実施例２、実施例３および実施例４の結果から、サイズ範囲が、古典的な抗原提示細胞（例えば、マクロファージおよび樹状細胞など）による取り込みに対して適切であることが明らかである。Ｂ細胞によるこれらのリポソームからの物質の取り込みでは、インビボでのある程度のフラグメント化または分解が避けられないか、または、より小さいサイズのリポソームがリポソーム配合物の不均一な集団において生じる可能性がある。

非リン脂質性の配合物
ビヒクル物質
材料：１−モノパルミトイル−ｒａｃ−グリセロール（Ｃ１６：０）（Ｍｏｎｏｐａｌ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）および３−β−［Ｎ（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（英国）から購入した。すべての脂質は、クロロホルムに溶解し、窒素置換して保存した（−２０℃）。

ＤＮＡ
プラスミドｐＣＩ−ＯＶＡ（ＤＮＡ ＯＶＡと称される）（Ｔ．Ｎａｇａｔａ博士（浜松医科大学、日本）からの譲渡）はニワトリの卵アルブミンタンパク質（オバルブミン、ＯＶＡ）のｃＤＮＡを含有する（Ｙｏｓｈｉｄａ Ａ、Ｎａｇａｔａ Ｔ、Ｕｃｈｉｊｉｍａ Ｍ、Ｈｉｇａｓｈｉ Ｔ、Ｋｏｉｄｅ Ｙ、特異的な免疫応答の再現可能な誘導におけるプラスミドＤＮＡワクチンの筋肉内接種を上回る遺伝子銃媒介接種の利点、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０００、１８、１７２５〜１７２９）。ｃＤＮＡは、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター領域の下流側の、ｐＣＩプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＥｃｏＲＩ部位にクローン化されている。プラスミドｐ１．１８／ＰＲ８−ＨＡ（ＤＮＡ ＨＡと称される）がＪ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ博士（ＮＩＢＳＣ、英国）によって提供された。これは、Ａ型インフルエンザ／プエルトリコ／８／３４に由来する全長のＨＡを含有する。投薬用プラスミドがＡｌｄｅｖｒｏｎ（Ｆａｒｇｏ、米国）によって商業的に製造され、１ｍｇのＤＮＡあたり１００未満のエンドトキシン単位（ＥＵ）を含有し、残留タンパク質は検出できなかった。

タンパク質
Ａ型インフルエンザ／プエルトリコ／８／３４の不活性化ウイルスの完全なタンパク質（スクロース勾配精製物、主要タンパク質ＨＡ、抗原ＨＡと称される）をＮＩＢＳＣ（英国）から得た。

組成物の調製
送達システムビヒクルを、真空下での薄膜乾燥によって、ＭｏｎｏｐａｌおよびＣｈｏｌおよびＤＣ−Ｃｈｏｌ（４：２：１のモル比）から調製した。得られた薄膜を、６０℃で１時間振とうすることによって水で水和して、室温に冷却した後、ＤＮＡ（ＤＮＡ ＨＡまたはＤＮＡ ＯＶＡと称される）および／またはタンパク質（抗原ＨＡと称される）と混合した（表１４を参照のこと）。配合物を四連で調製した。２つのバイアルは、投薬（初回抗原刺激および追加抗原刺激）のためであり、２つのバイアルは、［Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、Ｓａｆｆｉｅ，Ｒ．およびＨａｒｔ，Ｓ．Ｌ．、リポソーム内におけるプラスミドＤＮＡの高収率取り込み：ＤＮＡ一体性およびトランスフェクション効率に対する影響、Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、１９９６、３（６）、４６７〜４７５］および［Ｋｉｒｂｙ，Ｃ．、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、脱水−再水和小胞（ＤＲＶ）：リポソームにおける高収率薬物捕捉のための新しい方法、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９４、２、９７９〜９８４］に記載されたように、捕捉された物質に加えられ、一晩凍結乾燥された放射能標識トレーサー（ＤＮＡおよびタンパク質）に基づく％捕捉の計算のためであった。制御された条件のもとでの再水和の後、得られた脱水−再水和小胞（ＤＲＶリポソーム）を遠心分離によって洗浄して、取り込まれなかった物質を除いた。洗浄されたペレットを、要求される投薬体積にＰＢＳで希釈した。ＤＮＡおよび／またはタンパク質の取り込みを、懸濁されたペレットに回収された^３５Ｓ（ＤＮＡの場合）および^１２５Ｉ（タンパク質の場合）の放射能に基づいて見積もった。小胞は微量電気泳動に供され、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ３０００およびＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒにおける２５℃でのレーザー回折を使用して、そのゼータ電位（ＺＰ）およびｚ−平均直径がそれぞれ測定された。

動物の処置
メスＢａｌｂ／ｃマウス（６週齢から１２週齢；Ｈａｒｌａｎ、英国）を、０．２ｍｌの投薬体積で投与された皮下注射によって免疫化した。最終的な投薬量が表１４にまとめられる。マウスは２回の投薬を０日目および２８日目に受け、サンプル採血物が、１回目の注射に関して２１日目（１回の投薬の後）および４２日目（２回の投薬の後）に尾静脈から集められた。

群６．１および群６．２の組成物では、ＤＮＡおよびタンパク質が同時捕捉された。群６．３の組成物では、ＤＮＡおよびタンパク質が別々に捕捉され、混合された。すなわち、これは６．４および６．５の混合物であった。群６．６では、タンパク質が捕捉されなかった。

血清のＥＬＩＳＡ
サンプル採血物から得られた血清をＰＢＳで希釈して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってアッセイされるまで−２０℃で保存した。保証された結合化学性９６ウエルプレートを、ＰＢＳにおけるインフルエンザＨＡ−ＰＲ８抗原（２０μｇ／ｍｌ）の５０μｌ／ウエルで一晩コーティングした。４℃で一晩インキュベーションした後、ウエルをＰＢＳ／ツイーン２０（商標）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄し、その後、ウエルをＰＢＳにおける２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの２００μｌでコーティングした。３７℃で２時間後、ブロッキング溶液を除き、ウエルをＰＢＳＴで４回洗浄して、１／１００の希釈度から始まる異なる実験血清（個々の動物サンプル採血物）の希釈物で重層した（ウエルあたり５０μｌのサンプル）。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄して、５０μｌ／ウエルのウサギ抗マウスＩｇ−ＨＲＰコンジュゲート化血清（Ｄａｋｏ）を重層した。３７℃で１時間後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄して、５０μｌ／ウエルの基質溶液３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｐｉｅｒｃｅ）で重層した。反応を、５０μｌ／ウエルの停止溶液（２Ｍ硫酸）を添加することによって停止させ、各ウエルの４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した。

結果
ビヒクルの物理的特性（％生成物（ＤＮＡおよび／またはタンパク質）捕捉、粒子サイズ、および表面電位（ゼータ））を表１５にまとめる。

個々の動物（ｎ＝５動物／群）の抗体応答（血清ＥＬＩＳＡ）が、ＯＤが０．２７０の読み取り値に達するために要求される血清希釈度の逆数として表される（終点希釈度、アッセイされた１／１００希釈度における約２ｘの正常マウス血清ＯＤ）。結果は図１０に示される。

考察
配合物（表１４）を用いた免疫化の後に生じた免疫応答が、抗インフルエンザ（Ａ／ＰＲ８特異的な）応答を測定することによって評価された。結果は図１０に示される。同じ送達ビヒクルで同時送達されたＨＡのＤＮＡおよびタンパク質の両方からなった群（配合物）６．１は、群６．２を除くそれ以外の群のすべてよりも大きい応答を生じさせている。

これらの結果は下記のことを示している：ＨＡタンパク質の送達は、タンパク質単独を上回る利点をもたらさない（群６．４対群６．６）；ＨＡのＤＮＡ単独の送達は著しい抗体応答を生じさせない（群６．５）、実際、５匹中４匹の動物は、アッセイ（１／１００希釈の血清）の検出限界よりも大きい応答を誘導させていない；別個のビヒクルにおけるＨＡのＤＮＡおよびタンパク質の混合送達（群６．３）は、タンパク質単独またはビヒクル送達タンパク質（それぞれ、群６．６および群６．４）を上回る利点をもたらさない；および、ＨＡタンパク質をＤＮＡ成分（ＨＡまたはＯＶＡ）と同時送達すること（群６．１および群６．２）は、混合で送達された物質、または単独で送達された物質よりも、著しく大きい抗ＨＡ応答を生じさせている（それぞれ、群６．３、群６．４、群６．５および群６．６）。

本発明に関連して、最後の観測結果は、「同系」および「非関連」の両方のＤＮＡ成分に対して適用可能である。アッセイされた免疫系応答は抗体応答に限定されており、細胞媒介免疫応答（Ｔヘルパー、ＣＴＬなど）は調べられていない。従って、「同系」および「非関連」のＤＮＡ群（群６．１および群６．２）に対する免疫応答における等価性を結論することができない。実際、ＨＡのＤＮＡ単独による免疫化（プラスミドＤＮＡがインフルエンザの赤血球凝集素をコードする場合）は、抗体応答を生じさせるその限定された能力にもかかわらず、Ｔｈ１細胞、および、呼吸器感染に対する保護を誘導している。Ｊｏｈｎｓｏｎ ＰＡ、Ｃｏｎｗａｙ ＭＡ、Ｄａｌｙ Ｊ、Ｎｉｃｏｌｓｏｎ Ｃ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｊ、Ｍｉｌｌｓ ＫＨ（Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、２０００、Ｊｕｌ；８１（Ｐｔ７）：１７３７〜４５）は、抗体応答の非存在下で、従って、細胞媒介免疫応答単独に基づくインフルエンザ抗原投与からの保護をもたらすことを見出している。群６．１の「同系」同時送達はＨＡのＤＮＡを配合物の活性な成分として有するが、「非関連」の群６．２はＨＡのＤＮＡを配合物の活性な成分として有しないので、群６．１により、測定されないさらなる細胞媒介免疫応答が誘導され得ると示唆することは妥当でないようである。

まとめると、本発明者らは、本発明が、抗体応答を誘導するために非常に効果的であることを見出している。この応答には、抗体応答が伴う。本発明により示される改善には、抗原性タンパク質を機能的にコードする核酸の負荷物を送達する脂質成分を伴わない送達ビヒクルと、同時送達されるタンパク質との組成物を伴う。

ＨＡ（インフルエンザ）捕獲ＥＬＩＳＡの結果を示す。 １回の投薬の後の１６日目の抗インフルエンザ−総Ｉｇを示す。 １回の投薬の後の２８日目の抗インフルエンザ−総Ｉｇを示す。 ２回の投薬の後の１５日目の抗インフルエンザ−総Ｉｇを示す。 Ｂ型肝炎表面抗原の１回の投薬の後の２８日目の総Ｉｇ結果を示す。 Ｂ型肝炎表面抗原の２回目の投薬の後の２８日目の総Ｉｇ結果を示す。 １回の投薬の後に生じた抗インフルエンザ応答を示す。 ２回の投薬の後に生じた抗インフルエンザ応答を示す。 免疫化の後に生じた特異的な抗体応答およびＨＡ−四川株特異的な抗体応答を示す。 免疫化の後に生じた抗インフルエンザ応答を示す。

Claims (25)

1. 両親媒性成分から形成された小胞を含む、核酸およびアシスタータンパク質を細胞に同時送達するための組成物であって、前記核酸は、少なくとも１つのエピトープを前記アシスタータンパク質と共有する抗原性タンパク質またはその一部を動物被験体内で機能的にコードし、前記組成物は、相互に同じ小胞と会合した前記核酸および前記アシスタータンパク質を含み、前記組成物は、核酸とタンパク質を１０００：１から１：１の範囲の重量比で含有する、前記組成物。
2. 前記小胞が、リポソーム形成物質から形成されるリポソームであり、前記核酸および前記アシスタータンパク質がリポソームと会合している、請求項１に記載の組成物。
3. 前記核酸がリポソームの小胞内空間に捕捉されている、請求項２に記載の組成物。
4. 前記アシスタータンパク質がリポソームの外側表面において利用可能である、請求項２または３に記載の組成物。
5. 前記両親媒性成分が、少なくとも１つのカチオン性荷電成分を、小胞が全体的に正荷電を有するような量で含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記カチオン性成分が、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ビス（ヘキサデシルオキシ）−３−トリメチルアミノプロパン（ＢｉｓＨＯＰ）、β［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＭ）および３β−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエタン）カルバミルコレステロール（ＤＣ−ＣＨＯＬ）から選択される、請求項５に記載の組成物。
7. 前記核酸が、それぞれ異なる抗原性タンパク質をコードする２つ以上の分子を含み、前記アシスタータンパク質が、それぞれのそのような抗原性タンパク質とエピトープを共有する対応するタンパク質を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記核酸分子が同じ小胞と会合している、請求項７に記載の組成物。
9. 前記抗原性タンパク質および前記アシスタータンパク質がウイルスに由来する、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記核酸がＤＮＡである、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
11. ワクチンである請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮内投与、鼻腔投与、経口投与、粘膜投与または肺投与のために適合された、請求項１１に記載の組成物。
13. 動物において免疫応答を生じさせるための医薬組成物であって、核酸およびアシスタータンパク質ならびに両親媒性成分から形成された小胞を含む組成物を含み、前記核酸はアシスタータンパク質と少なくとも１つのエピトープを共有する抗原性タンパク質またはその部分を機能的にコードし、前記組成物は、互いに同じ小胞に会合した前記核酸と前記アシスタータンパク質を１０００：１から１：１の範囲の重量比で含む、前記医薬組成物。
14. 前記組成物が請求項２から１２のいずれか一項に記載された組成物である、請求項１３に記載の医薬組成物。
15. 前記免疫応答が、抗原性タンパク質および／またはアシスタータンパク質に対して特異的な抗体応答を含む、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
16. 前記免疫応答が細胞傷害性Ｔリンパ球の刺激を伴う、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
17. 感染性媒介因子による感染に対する免疫をもたらす、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
18. （ａ）リポソーム形成物質から形成された小さい単層小胞（ＳＵＶ）の水性懸濁物を提供する工程；
    （ｂ）ＳＵＶの水性懸濁物を、抗原性タンパク質を動物被験体内で機能的にコードする核酸と接触させて、ＳＵＶ−核酸の懸濁物を形成させる工程；
    （ｃ）前記ＳＵＶ−核酸の懸濁物を脱水して、脱水された混合物を提供する工程；および
    （ｄ）前記脱水された混合物を水性の再懸濁媒体において再水和して、核酸含有リポソームの懸濁物を形成させる工程
    を含むリポソーム組成物を形成させるための方法であって、
    抗原性タンパク質と少なくとも１つのエピトープを共有するアシスタータンパク質を導入する工程を含み、それにより、前記核酸含有リポソームを前記アシスタータンパク質と会合させ、核酸とアシスタータンパク質が１０００：１から１：１の範囲の重量比である前記方法。
19. 前記アシスタータンパク質を、工程ｂの前に、または工程ｂの途中で、または工程ｂの後工程ｃの前に、ＳＵＶの水性懸濁物と接触させる、請求項１８に記載の方法。
20. 前記アシスタータンパク質が再懸濁媒体に存在する、請求項１８に記載の方法。
21. 前記リポソーム形成物質が、少なくとも１つのリン脂質および少なくとも１つのステロールを含む、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記物質が、少なくとも１つのカチオン性化合物を含み、リポソームが全体的なカチオン性荷電を有する、請求項２１に記載の方法。
23. 核酸対リポソーム形成物質の重量比が、１：１００から１：１０００の範囲にある、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 核酸対アシスタータンパク質の重量比が３０：１から５：１の範囲にある、請求項１８から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 脱水が凍結乾燥によって行われる、請求項１８から２４のいずれか一項に記載の方法。

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