JP4168028B2 - Expression vector, host, fusion protein, method for producing fusion protein, and method for producing protein - Google Patents
Expression vector, host, fusion protein, method for producing fusion protein, and method for producing protein Download PDFInfo
- Publication number
- JP4168028B2 JP4168028B2 JP2004515182A JP2004515182A JP4168028B2 JP 4168028 B2 JP4168028 B2 JP 4168028B2 JP 2004515182 A JP2004515182 A JP 2004515182A JP 2004515182 A JP2004515182 A JP 2004515182A JP 4168028 B2 JP4168028 B2 JP 4168028B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- ppiase
- expression vector
- coding region
- fusion protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 177
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 117
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 97
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims description 116
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims description 116
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 claims abstract description 76
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 74
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 claims abstract description 68
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 32
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 102000009658 Peptidylprolyl Isomerase Human genes 0.000 claims description 165
- 108010020062 Peptidylprolyl Isomerase Proteins 0.000 claims description 165
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 55
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 41
- 101710104030 Long-type peptidyl-prolyl cis-trans isomerase Proteins 0.000 claims description 34
- 101710124237 Short-type peptidyl-prolyl cis-trans isomerase Proteins 0.000 claims description 34
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 31
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 26
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 26
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 22
- 101710154918 Trigger factor Proteins 0.000 claims description 17
- 108010067247 tacrolimus binding protein 4 Proteins 0.000 claims description 16
- 102100020739 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP4 Human genes 0.000 claims description 15
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 13
- KQPYUDDGWXQXHS-UHFFFAOYSA-N juglone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C2=C1C=CC=C2O KQPYUDDGWXQXHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 102000001493 Cyclophilins Human genes 0.000 claims description 9
- 108010068682 Cyclophilins Proteins 0.000 claims description 9
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 9
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 claims description 8
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 claims description 8
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 claims description 8
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 claims description 8
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 8
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 6
- VYTBDSUNRJYVHL-UHFFFAOYSA-N beta-Hydrojuglone Natural products O=C1CCC(=O)C2=C1C=CC=C2O VYTBDSUNRJYVHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 4
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 claims description 4
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 2
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 claims 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 67
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 32
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 31
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 18
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 108010027179 Tacrolimus Binding Proteins Proteins 0.000 description 15
- 102000018679 Tacrolimus Binding Proteins Human genes 0.000 description 15
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 11
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108050001186 Chaperonin Cpn60 Proteins 0.000 description 8
- 102000052603 Chaperonins Human genes 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 7
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 7
- 102100023737 GrpE protein homolog 1, mitochondrial Human genes 0.000 description 6
- 108010042283 HSP40 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000004447 HSP40 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 6
- 101000829489 Homo sapiens GrpE protein homolog 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 101150025711 TF gene Proteins 0.000 description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 5
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 5
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 5
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 5
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 5
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 5
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 101710113864 Heat shock protein 90 Proteins 0.000 description 4
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 102000040125 5-hydroxytryptamine receptor family Human genes 0.000 description 3
- 108091032151 5-hydroxytryptamine receptor family Proteins 0.000 description 3
- 108010059013 Chaperonin 10 Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 3
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 241000203407 Methanocaldococcus jannaschii Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 102000008063 Small Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010088928 Small Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241001495444 Thermococcus sp. Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- 102100024341 10 kDa heat shock protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 241000522615 Pyrococcus horikoshii Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000794 anti-serotonin Effects 0.000 description 2
- 239000003420 antiserotonin agent Substances 0.000 description 2
- 241000617156 archaeon Species 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 2
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M potassium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[K+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010036114 prefoldin Proteins 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N (2e)-3-ethyl-2-[(z)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S\1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C/1=N/N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010030844 2-methylcitrate synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 241000567139 Aeropyrum pernix Species 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000205042 Archaeoglobus fulgidus Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 229940122644 Chymotrypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710137926 Chymotrypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102000003813 Cis-trans-isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000175 Cis-trans-isomerases Proteins 0.000 description 1
- 108010071536 Citrate (Si)-synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000006732 Citrate synthase Human genes 0.000 description 1
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 description 1
- -1 DnaK Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101100240657 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) swoF gene Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100446641 Homo sapiens FKBP1A gene Proteins 0.000 description 1
- 101100334857 Homo sapiens FKBP4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100321817 Human parvovirus B19 (strain HV) 7.5K gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 101100536883 Legionella pneumophila subsp. pneumophila (strain Philadelphia 1 / ATCC 33152 / DSM 7513) thi5 gene Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 241000202974 Methanobacterium Species 0.000 description 1
- 241000205275 Methanosarcina barkeri Species 0.000 description 1
- 101001031406 Methanothermobacter thermautotrophicus (strain ATCC 29096 / DSM 1053 / JCM 10044 / NBRC 100330 / Delta H) Long-type peptidyl-prolyl cis-trans isomerase Proteins 0.000 description 1
- 241000203382 Methanothermococcus thermolithotrophicus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 description 1
- 241000204051 Mycoplasma genitalium Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 101100240662 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) gtt-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004230 Neurotrophin 3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 101150043338 Nmt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 101710111747 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP12 Proteins 0.000 description 1
- 102100027913 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1A Human genes 0.000 description 1
- 101710111682 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1A Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 241000205091 Sulfolobus solfataricus Species 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 241000204673 Thermoplasma acidophilum Species 0.000 description 1
- 102000013090 Thioredoxin-Disulfide Reductase Human genes 0.000 description 1
- 108010079911 Thioredoxin-disulfide reductase Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003450 affinity purification method Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150010487 are gene Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000001876 chaperonelike Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229940096384 chicken egg white lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000003541 chymotrypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000007697 cis-trans-isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 235000012489 doughnuts Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000006274 endogenous ligand Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000055209 human FKBP1A Human genes 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 102000027411 intracellular receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008582 intracellular receptors Proteins 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012106 screening analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 1
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明は、組み換えタンパク質が封入体等の異常型として発現することを防ぎ、天然型として可溶画分に生産することができる、発現ベクター、宿主、融合タンパク質、タンパク質、融合タンパク質の製造方法及びタンパク質の製造方法に関する。 The present invention prevents expression of a recombinant protein as an abnormal form such as inclusion bodies, and can be produced as a natural form in a soluble fraction, an expression vector, a host, a fusion protein, a protein, a method for producing a fusion protein, and The present invention relates to a method for producing a protein.
近年、種々の生物のゲノム解析が終了しつつあり、今後は遺伝子の発現産物であるタンパク質の網羅的な機能解析へと進むと考えられている。個々のタンパク質の性質を明らかにするとともに、タンパク質同士の相互作用を網羅的に解析することで、生命現象解明の一助としようとする研究が急速に増えつつある。一方、各種の生理活性物質と特異的に結合し、その作用を伝達する細胞内受容体タンパク質も、その受容体タンパク質と結合する活性物質が、新規医薬品の候補物質となり得ることから、その３次元構造決定に重大な関心が持たれ、新規医薬品のスクリーニングにおいて注目されている。このようなタンパク質の性質を決定しようとする場合、該当する遺伝子をベクター遺伝子上に組み込み、バクテリア、酵母、昆虫細胞等の宿主にトランスフォーメーションし、発現させて得られる組み換えタンパク質の性質を調べる方法が一般的である。
タンパク質の正しい性質を評価する際、そのタンパク質が、正しい立体構造に折り畳まれているか否かが非常に重要となる。しかしながら、異種生物由来のタンパク質を、上述の宿主発現系を用いたタンパク質発現法で作成しようとする場合、しばしばタンパク質のフォールディング異常により、立体構造の異なった異常型タンパク質しか得られないケースに遭遇する。このようなタンパク質は宿主内で封入体と呼ばれる凝集体として発現したり、宿主細胞のプロテアーゼにより、分解されたりすることが知られている。これらを解決するためには、目的タンパク質の宿主細胞内での折り畳み反応が正確に行われるよう制御することが極めて重要であると考えられる。
目的タンパク質が異常型タンパク質である封入体として発現した場合、その正常型を得る手段としては、従来それをインビトロで正常型に変換する方法が一般的であった。即ち、宿主から封入体を回収し、高濃度の塩酸グアニジンや尿素等で可溶化後、適当な緩衝液等で３０〜１００倍程度に希釈することで、可溶化した目的タンパク質をリフォールディングさせる方法である。一例を挙げると、抗体は、医療分野等での利用が期待されているが、その組み換え体を大腸菌を宿主としてその細胞質内に発現しようとすると、ほとんどが不溶性の封入体として発現されることが知られている（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、５４５−、１９９１年）。封入体として得られた抗体を、効率よくインビトロでリフォールディングする方法として、希釈緩衝液中にタンパク質の折り畳みを促進するシャペロニンを含有させることで、その収量を増大させる方法が提案されている（特開平９−２２００９２号）。抗体以外にも、封入体タンパク質として発現するＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリータンパク質のリフォールディング方法（特開平６−３２７４８９号、特開平６−３１９５４９号）や、ニューロトロフィン−３のリフォールディング方法（特開平９−２６２０９３号）等、希釈液中に還元剤、有機酸等を加えることで、目的タンパク質の収量を増大させる、さまざまな工夫が提案されてきた。しかしながら、封入体として得られたタンパク質をインビトロでリフォールディングさせるこれらの方法は、非常に手間がかかる割には、得られる収量は低い。
抗体の場合、そのＮ末端にシグナル配列を付与してペリプラズム領域に発現させれば、大腸菌を宿主として用いても可溶画分に発現できることが報告されている（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１、１２７９−、１９９２年）。しかしながら、ペリプラズム領域は細胞質領域と比較して、非常に狭い領域であるため、タンパク質が発現される量も非常に少なく、たとえ、発現量が増やせたとしても、封入体となってしまう。細胞質内に抗体を可溶体として発現させようとする試みもいくつか報告されている。タンパク質のフォールディングに関与する分子シャペロンと抗体遺伝子を細胞質内で共発現させることで、組み換え抗体の封入体形成を防ぎ、可溶型の収量を増大させる工夫や、宿主大腸菌としてチオレドキシン還元酵素欠損株を用いる方法等が提案されている（特開平９−２２００９２号；Ｐｌｏｂａ、Ｇｅｎｅ １５９、２０３−、１９９５年）。しかしながら、これらの方法は、可溶型の抗体を得ることができるとはいえ、その収量は１ｍｇ／培地１Ｌ程度と低く（Ｌｅｖｙ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２３、３３８−、２００１年）、更に生産効率の良い方法が必要とされている。
一方、膜タンパク質も生体膜の表面上又は内部に埋もれて存在する性質上、疎水性アミノ酸の含有率が高く、膜の非存在化で組み換えタンパク質として発現させた場合にはしばしば封入体として発現することが知られる。細胞に対する毒性を示す場合には発現にすら至らない場合が多い。膜タンパク質の組み換え型を取得する場合、酵母や動物細胞等の真核細胞を用い、その膜画分に発現させることが常套手段であるが、一方で発現量は少なく、また、培養発現する際にはコストと手間がかかるため、より簡便な発現方法が望まれている。
発明の要約
本発明は、上記現状に鑑み、組み換えタンパク質生産時の不活性な異常型タンパク質の形成を防ぎ、目的タンパク質を天然型、即ち、可溶型として大量且つ効率的に生産させることを可能とする、発現ベクター、宿主、融合タンパク質、タンパク質、融合タンパク質の製造方法及びタンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
即ち、本発明は、（ａ）分子シャペロン活性を有するポリペプチドをコードする第１コード領域、及び、（ｂ）タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域を含有する発現ベクターである。
本発明の発現ベクターにおいては、上記第１コード領域は、プロモーターに有効に連結しており、かつ、上記制限酵素サイトは、第１コード領域と同じ解読枠内であって、上記第１コード領域の下流にあるか、又は、上記制限酵素サイトは、挿入された上記第２コード領域がプロモーターに有効に連結するように配置されており、かつ、上記第１コード領域は、上記第２コード領域と同じ解読枠内にあって、上記第２コード領域の下流にある。
本発明の発現ベクターは、第１コード領域と、第２コード領域を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域との間にあり、同じ解読枠内で翻訳されてプロテアーゼ消化サイトとなる領域を有することが好ましい。
本発明の発現ベクターは、タンパク質をコードする第２コード領域が組み込まれていることが好ましい。
本発明の発現ベクターにおいて、分子シャペロン活性を有するポリペプチドは、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅであることが好ましい。
上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとしては、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅ、又は、パーブリン型ＰＰＩａｓｅが挙げられる。
上記ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ、ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ、又は、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅが挙げられる。
上記シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅとしては、ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅが挙げられる。
上記パーブリン型ＰＰＩａｓｅとしては、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅが挙げられる。
上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとしては、また、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのＩＦドメイン、及び／又は、Ｃ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅ、トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメイン、及び／又は、Ｃ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅ、ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅ、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅのＣ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅ、ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅのＣ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅ、又は、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅが挙げられる。
本発明の発現ベクターにおいて、上記第２コード領域は、モノクローナル抗体をコードする塩基配列を有するか、又は、膜タンパク質をコードする塩基配列を有することが好ましい。
本発明の発現ベクターを内包している宿主もまた、本発明の１つである。
本発明の宿主は、大腸菌であることが好ましい。
上記分子シャペロン活性を有するポリペプチド及び第２コード領域がコードするタンパク質を含有する融合タンパク質もまた、本発明の１つである。
本発明の融合タンパク質は、プロテアーゼ消化サイトを含有することが好ましい。
本発明の融合タンパク質を製造する方法もまた、本発明の１つである。
本発明の融合タンパク質の製造方法においては、本発明の発現ベクターを内包する宿主を、当該発現ベクターの発現条件下で培養し、上記融合タンパク質を細胞質に発現させるか、本発明の発現ベクターの第１コード領域の５’末端又は第２コード領域の５’末端に転写及び翻訳されてシグナル配列となる領域を設けて、得られた発現ベクターを内包する宿主を、当該発現ベクターの発現条件下で培養し、上記融合タンパク質をペリプラズム又は培地に発現させるか、又は、本発明の発現ベクターに、無細胞翻訳系において、上記融合タンパク質を発現させることが好ましい。
本発明の融合タンパク質の製造方法においては、ＰＰＩａｓｅ活性を阻害するマクロライド、シクロスポリン、ジュグロン、又は、これらの類縁化合物を担持した担体に、融合タンパク質を吸着させた後、上記担体を回収することが好ましい。
上記第２コード領域がコードするタンパク質を製造する方法であって、本発明の融合タンパク質の製造方法で得られた融合タンパク質をプロテアーゼ消化サイトを消化するプロテアーゼで消化するタンパク質の製造方法もまた、本発明の１つである。
発明の詳細な説明
以下に本発明を詳述する。
なお、本発明において、「プロモーターに有効に連結する」とは、分子シャペロン活性を有するポリペプチドが正常に転写されるように第１コード領域がプロモーターに連結していること、又は、目的タンパク質が正常に転写されるように第２コード領域がプロモーターに連結していることを意味する。
また、本発明において、「分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅ」には、実質的に同等の機能を有しているものも含まれる。即ち、実質的に同等のポリペプチド、少なくともこれらの一部分を含むポリペプチド、及び、一部のアミノ酸を他のアミノ酸に改変したもの等も含まれる。
更に、本発明において、「ドメイン」には、実質的に同等の機能を有するドメインも含まれる。
本発明の発現ベクターは、（ａ）分子シャペロン活性を有するポリペプチドをコードする第１コード領域を含有するものである。
上記分子シャペロン活性とは、変性したタンパク質を元の天然型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性を意味する。例えば、ロダネーゼ、クエン酸合成酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等をモデル酵素とし（河田、バイオサイエンスとインダストリー ５６，５９３−、１９９８年）、これらを６Ｍ塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤で変性処理した後、検定対象物質を含む緩衝液で変性剤を希釈した際に開始する変性タンパク質の再生率や、変性タンパク質の凝集の抑制率でその検定対象物の分子シャペロン活性を評価することができる。なお、変性タンパク質の再生率を評価する方法としては、例えばロダネーゼの場合、ホロビッチらの方法（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０、３６１−、１９９５年）等が挙げられ、変性タンパク質の凝集抑制を評価する方法としては田口らの方法（Ｔａｇｕｃｈｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、８５２９−、１９９４年）等が挙げられる。
上記分子シャペロン活性を有するポリペプチドとしては特に限定されず、例えば、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ等の分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅ；スモールヒートショックプロテイン、シャペロニン、プレフォルディン、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＨＳＰ９０等が挙げられる。
上記スモールヒートショックプロテインは、１５〜３０ｋＤａ程度のサブユニットが、２４〜３２個程度集まって巨大な分子構造をとり、シャペロン活性を有することが報告されている（Ｊａｋｏｂ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８，１５１７−、１９９３年）。これと相同性の高い領域をそのＣ末端領域に有するクリスタリンもまた、スモールヒートショックタンパク質と同様の性質を有しており、いずれも本発明の発現ベクターに適用可能である。
上記シャペロニンは７〜９個のサブユニットが環状に連なったドーナツ型構造が２段に重なった、合計１４〜１８個のサブユニットからなる特徴的な構造を有している。上記シャペロニンは、ドーナツ構造の凹部に変性タンパク質を捕捉し、ＡＴＰ等のヌクレオチドの消費をともなってタンパク質のリフォールディングを促進する。真正細菌由来のグループ１型シャペロニンの場合は、更に補助因子としてＧｒｏＥＳ（ヒートショックプロテイン１０）の結合を伴って、タンパク質の折り畳み反応を促進する。真核生物又は古細菌由来のグループ２型に属するシャペロニンの場合は、ＧｒｏＥＳのような補助因子は必要とせず、効率的に正しい立体構造のタンパク質へと折り畳むことが知られている（Ｇｕｐｔａ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５、１−、１９９５年）。
上記プレフォルディンは真核生物のチューブリンのタンパク質折り畳みに関与する因子として見いだされた分子シャペロンであり（Ｌｏｐｅｚ、Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１３５，２１９−、２００１年）、６量体を形成し、インビトロでは、変性したタンパク質と相互作用するシャペロン活性を有することが知られている（Ｓｉｅｇｅｒｔ，Ｃｅｌｌ １０３，６２１−、２０００年）。
上記ＤｎａＫ、ＤｎａＪ及びＧｒｐＥのホモログは生物種を問わず幅広く存在し、タンパク質のフォールディングに関与していると考えられている分子シャペロンである。これらのうち、特に大腸菌のＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ系のタンパク質フォールディングシステムはよく研究されている。これらの提案されている反応メカニズムとしては、リボゾームで生合成された新生ポリペプチドがＤｎａＫと結合し、ＡＴＰ存在下で更にＤｎａＪが結合することで、不可逆的な凝集形成が抑制される。更にＧｒｐＥに依存したヌクレオチドの解離に伴い、新生ポリペプチドも解離され、シャペロニンのフォールディングシステムに受け渡されるというものである（Ｆｉｎｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｆｅ ｃｙｃｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＭＡＲＣＥＬ ＤＥＫＫＥＲ，ＩＮＣ、１９９８）。本発明の発現ベクターにおいては、これら大腸菌由来のＤｎａＫ、ＤｎａＪ及びＧｒｐＥと同じ働するホモログを用いることができる。
上記ＨＳＰ９０（ヒートショックプロテイン９０）にも、シャペロン様活性を有するものがあり（Ｒａｍｓｅｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１７８５７−、２０００年）、本発明の発現ベクターにおいては、そのホモログ、その一部又はそれらを含むポリペプチドを用いることができる。
上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）は、タンパク質のフォールディングに関与するタンパク質折り畳み因子の１つであり、細胞内でフォールディング途上のターゲットタンパク質中のアミノ酸のうち、プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシストランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）を有するものである。
上記分子シャペロン活性を有するポリペプチドとしては、なかでも、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅが好ましい。
上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅはその阻害剤に対する感受性から、ＦＫ５０６ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ型（ＦＫＢＰ型）、シクロフィリン型及びパーブリン型の３種類に分類される。ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは免疫阻害剤の１つであるＦＫ５０６により活性が阻害されるＰＰＩａｓｅ及びそのホモログである。シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅは、別の免疫阻害剤であるシクロスポリンに対して感受性を持つＰＰＩａｓｅ又はそのホモログである。一方、パーブリン型ＰＰＩａｓｅは、いずれの免疫阻害剤に対しても感受性を示さず、ジュグロン（ｊｕｇｌｏｎｅ）によりその活性が阻害されるＰＰＩａｓｅ又はそのホモログである。この３種類のＰＰＩａｓｅは、アミノ酸一次配列上の相同性はほとんどない。
上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとしては、上記の３種類のＰＰＩａｓｅのうち、いずれのタイプのＰＰＩａｓｅであってもよい。
上記ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては、例えば、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ（Ｈｕａｎｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．９、１２５４−、２０００年）、ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ（Ａｒｉｅ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９、１９９−、２００１年）、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ（Ｂｏｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、１７１５−、１９９６年）等が挙げられる。
上記シクロフィリンタイプＰＰＩａｓｅとしては、例えば、ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅ（Ｐｉｒｋｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８、７９５−、２００１年）等が挙げられる。
上記パーブリンタイプＰＰＩａｓｅとしては、例えば、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ（Ｂｅｈｒｅｎｓ、ＥＭＢＯ Ｊ．２０、２８５−、２００１年）等が挙げられる。
上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの機能については、興味深いことに、ＰＰＩａｓｅ活性だけでなく、タンパク質の不可逆的凝集を抑制すると同時に、変性タンパク質のリフォールディングを促進させる分子シャペロン活性を有することが見出されている（Ｆｕｒｕｔａｎｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９、４５３−、２０００年；Ｉｄｅｎｏ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７、３１３９−、２０００年；Ｉｄｅｎｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５７、４６５−、２００１年；Ｉｄｅｎｏ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８、４６４−、２００２）。分子シャペロン活性は、本来、分子シャペロンの１つとして知られるシャペロニンやＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ系のタンパク質折り畳みシステムに見いだされた活性である。これらは、細胞内で生合成されたポリペプチドが正しい形に折り畳まれるよう、サポートする機能を果たしている。その際、ＡＴＰ等の高エネルギー物質の加水分解を必要とする。上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、その分子シャペロン活性を発揮する際、上記高エネルギー物質の加水分解反応を必要としない点で優れている。
上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、その分子量の違いにより、２種類に大別できる。一方は分子量が１６〜１８ｋＤａ程度のショートタイプであり、他方は２６〜３３ｋＤａ程度のロングタイプである。本発明で用いられる古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては、ショートタイプ、ロングタイプのいずれのＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであってもよい。しかしながら、一般的に、ショートタイプの方がより強い分子シャペロン活性を有する傾向にあること、タンパク質の分子量が大きくなるにつれて、その組み換えタンパク質の発現量が低下する傾向があること、の２点を考慮すると、本発明ではショートタイプの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの方が好ましい。なお、上記した分子量の幅はこれまで見いだされているＰＰＩａｓｅの分子量幅であり、本発明における古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、この分子量幅に限定されず、実質的に同じグループに属するものであればいずれであってもよい。
上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては特に限定されず、いずれの古細菌由来のものであってもよく、例えば、これまで見いだされている古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのうち、ショートタイプとしては、好熱性及び超好熱性菌由来古細菌であるＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ由来、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＳ−１由来、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のもの、常温性古細菌であるＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ由来、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ由来のもの等が挙げられる（Ｍａｒｕｙａｍａ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ ５、８２１−、２０００）。一方、ロングタイプは、ゲノム解析やその他の解析の結果、ほとんどの古細菌のゲノム上で見いだされており、例えば、好熱性及び超好熱性古細菌であるＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ由来、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ由来のもの、常温性好塩菌であるＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｕｔｉｒｕｂｒｕｍ由来のもの等が挙げられる（Ｍａｒｕｙａｍａ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ ５、８２１−、２０００年）。なかでも、常温性の古細菌由来のものが好ましい。上記ロングタイプの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの１例として、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のもののアミノ酸配列を配列番号１に、上記ショートタイプの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの１例として、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のもののアミノ酸配列を配列番号２にそれぞれ示す。
上記古細菌ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、ＰＰＩａｓｅ活性とＦＫ５０６との結合に関与するＦＫＢＰドメイン、及び、ＩＦドメインを有しており、ロングタイプの古細菌ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの場合、更にＣ末端ドメインを有している（Ｍａｒｕｙａｍａ ａｎｄ Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．１、Ｄ８２１−、２０００年）。上記ＩＦドメイン（Ｉｎｓｅｒｔ ｉｎ ｔｈｅ ｆｌａｐ；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２８，１１４９−、２００３年）は、アミノ酸一次配列上、ＦＫＢＰドメインを構成するアミノ酸配列中に挿入された約１００アミノ酸からなり、ドメイン構造を形成する特徴的な高次構造を形成している（Ｍａｒｕｙａｍａ ａｎｄ Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．１、Ｄ８２１−、２０００年；Ｉｎｓｅｒｔ ｉｎ ｔｈｅ ｆｌａｐ；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２８，１１４９−、２００３年）。上記ショートタイプの古細菌ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの分子シャペロン活性には、ＦＫＢＰドメインのＦＫ５０６結合領域とＩＦドメインとが関与することがわかっている（Ｆｕｒｕｔａｎｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９，２８２２−，２０００年； Ｉｄｅｎｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３５７、４６５−、２００１年）。また、上記ロングタイプの古細菌ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅについては上記２つのドメインと共にＣ末端ドメインがその分子シャペロン活性に関与していることがわかっている（ＩＤＥＮＯ、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７、３１３９−、２０００年）。本発明においては、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのＩＦドメイン、及び／又は、Ｃ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅであれば、上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして用いることができる。例えば、本来分子シャペロン活性を持たないＰＰＩａｓｅであるヒトＦＫＢＰ１２にタンパク質工学的にＩＦドメインやＣ末端ドメインを導入したキメラＰＰＩａｓｅ等は上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして用いることができる。上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのＩＦドメインとしては、配列番号１では、７８番プロリンから１４６チロシンまでの領域が、また、配列番号２では、７８番プロリンから１４１番グルタミン酸までの領域がそれぞれＩＦドメインに相当する（ＩＤＥＮＯ、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７、３１３９−、２０００年）。一方、上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのＣ末端ドメインとしては、配列番号１では、１５７番イソロイシンからＣ末端までの領域がＣ末端ドメインに相当する（ＩＤＥＮＯ、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７、３１３９−、２０００年）。各ドメインの相同性はＣｌｕｓｔａｌＷ等の多重整列ソフトを用いることで判断することができる。
上記トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅはほとんどすべてのバクテリアのゲノム上で見つかっているＰＰＩａｓｅである。上記トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅとしては特に限定されず、例えば、大腸菌由来、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ由来、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ由来、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ由来、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｕｍ由来、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来、Ｃａｍｐｙｒｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ由来のもの等が挙げられる。また、本発明で用いられるトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅは、アミノ酸配列においてバクテリア由来トリガーファクターと実質的に同じと認められるグループに属するものであれば、いずれのトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅであってもよい。上記トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅの一例として大腸菌由来のトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅのアミノ酸配列を配列番号３に示し、塩基配列を配列番号４に示す。
上記トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅは、ＰＰＩａｓｅ活性とＦＫ５０６との結合に関与するＦＫＢＰドメインを中間ドメインとし、そのＮ末端側及びＣ末端側にそれぞれ２つのドメインを有している（Ｚａｒｎｔ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７１，８２７−，１９９７年）。上記トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅの分子シャペロン活性は、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと同様にＰＰＩａｓｅ活性とは独立した活性であることが知られ、そのＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインのいずれか一方、又は、両者の作用であることが示唆されている。本発明においては、トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメイン、及び／又は、Ｃ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅであれば、上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして用いることができる。上記トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインとしては、配列番号３では、１番メチオニンから１４５番アルギニン付近の領域がＮ末端ドメインに相当し、２５２番フェニルアラニン付近からＣ末端までの領域がＣ末端ドメインに相当する（Ｚａｒｎｔ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７１，８２７−，１９９７年）。各ドメインの相同性はＣｌｕｓｔａｌＷ等の多重整列ソフトを用いることで判断することができる。
上記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ及びＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅは、いずれも大腸菌をはじめとするグラム陰性バクテリアのペリプラズム領域に発現するＰＰＩａｓｅである。上記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅはＦＫ５０６により活性が阻害されるＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであるのに対し、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅは、ＦＫ５０６及び他の免疫抑制剤であるシクロスポリンのいずれの免疫抑制剤に対して感受性を示さない、パーブリン型ＰＰＩａｓｅホモログの１つである。これら２つのＰＰＩａｓｅもまた、分子シャペロン活性を示すタンパク質として知られている（Ｒａｍｍ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７５、１７１０６−、２０００年；Ｂｅｈｒｅｎｓ、ＥＭＢＯ．Ｊ． ２０、２８５−、２００１年）。
上記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ及びＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅは、グラム陰性バクテリアのゲノムに見られるだけでなく、酵母等の真核生物のゲノムでもそのホモログが見つかってきている。
本発明で用いられるＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ及びＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅとしては特に限定されず、例えば、大腸菌由来、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｉｕｍ由来、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来、Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ由来、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ由来、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ由来のもの等が挙げられる。また、バクテリア由来のものだけでなく、それらと同じグループに属し、実質的に同等の機能を有するものであれば、いずれの生物由来のＰＰＩａｓｅであってもよい。上記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅの一例として、大腸菌由来のもののアミノ酸配列を配列番号５に示し、塩基配列を配列番号６に示す。また、上記ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅの一例とし、大腸菌由来のもののアミノ酸配列を配列番号７に示し、塩基配列を配列番号８に示す。
上記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅは、そのＣ末端側のＦＫＢＰドメインとそれ以外のＮ末端ドメインとを有している（Ａｒｉｅ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９，１９９−，２００１年）。上記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅの分子シャペロン活性もまたＰＰＩａｓｅ活性とは独立した活性であることが知られ、そのＮ末端ドメインの関与が示唆されている。本発明においては、ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅであれば、上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして用いることができる。上記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメインとしては、配列番号５では、Ｎ末端から１２０番アスパラギン酸付近の領域がＮ末端ドメインに相当する（Ａｒｉｅ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９，１９９−，２００１年）。
一方、上記ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅもそのＣ末端側にパーブリン型ＰＰＩａｓｅ間で相同性の高いドメインと、それ以外のＮ末端ドメインとを有している。
上記ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅの分子シャペロン活性にも、パーブリン型ＰＰＩａｓｅ間で相同性の高いドメインとは別にＮ末端ドメインの関与が示唆されている（Ｂｅｈｒｅｎｎｓ、ＥＭＢＯ Ｊ．２０，２８５−、２００１年）。本発明においては、上記ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅであれば、上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして用いることができる。上記ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅのＮ末端ドメインとしては、配列番号７では、Ｎ末端から１７５番アスパラギン付近の領域がＮ末端ドメインに相当する。上記Ｎ末端ドメインの相同性はＣｌｕｓｔａｌＷ等の多重整列ソフトを用いることで判断することができる。
上記ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ及びＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅは、いずれも真核生物中に見いだされるＰＰＩａｓｅである。上記ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅは、約５２ｋＤａ程度のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅで、ｐ５９又はＨＳＰ５６等とも呼ばれる。そのアミノ酸配列は、ヒト由来１２ｋＤａ ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと相同性の高い領域２つがタンデムに連なり、更にそのＣ末端側にカルモジュリン結合部位を含む領域が連なった構成を有する（Ｒａｔａｊｃｚａｔ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８、１３１８７−、１９９３）。上記ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅは４０ｋＤａ程度の分子量を持ち、免疫抑制剤であるシクロスポリン感受性であるシクロフィリン型ＰＰＩａｓｅの１つである。いずれも、そのＮ末端にＰＰＩａｓｅ活性を担うドメインを、そのＣ末端にヒートショックタンパク質の１つであるＨＳＰ９０と結合するテトラトリコペプチドリピート（ＴＰＲ）を含むドメインを有することを特徴とし、真核生物においてステロイドホルモンレセプター形成に関与するＰＰＩａｓｅである（Ｇａｌａｔ、Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−Ｐｒｏｌｙｌ ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９８年）。上記ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ及びＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅとしては特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ウサギ、ラット等の真核生物由来のものが挙げられる。また、本発明で用いられるＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ及びＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅは、真核生物由来のものだけでなく、実質的に同等の機能を有するＰＰＩａｓｅと認められるグループに属するものであれば、いずれの生物由来のＰＰＩａｓｅであってもよい。
上記ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅの一例として、ヒト由来のもののアミノ酸配列を配列番号９に示し、塩基配列を配列番号１０に示す。また、上記ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅの一例として、ヒト由来のもののアミノ酸配列を配列番号１１に示し、塩基配列を配列番号１２に示す。
上記ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ及びＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅの分子シャペロン活性には、ＴＰＲを含むそれぞれのＣ末端ドメインが関与していることが示唆されている。本発明においては、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ及びＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅのＣ末端ドメインを含有しているＰＰＩａｓｅであれば、上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして用いることができる。上記Ｃ末端ドメインは、ヒトＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅでは、配列番号９における２６４番グルタミン酸付近からＣ末端までの領域であるが、このうち２６４番グルタミン酸から４００番イソロイシン付近の領域が特に重要である。また、ヒトＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅでは、１８４番ロイシン付近からＣ末端までの領域がＣ末端ドメインに相当する。
本発明で用いられる分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとしては、上記例示のもの以外であっても、同等の分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅであれば、好適に用いることができ、そのようなものとしては、例えば、最近その分子シャペロン活性が再評価されたブタ由来１８ｋＤａシクロフィリン型ＰＰＩａｓｅ（Ｏｕ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１０、２３４６−、２００１年）等が挙げられる。
本発明の発現ベクターは、（ｂ）タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域を含有するものである。
上記第２コード領域は、本発明の発現ベクターを用いて発現しようとする目的タンパク質をコードする塩基配列を有する領域である。
本発明で用いられる第２コード領域としては特に限定されないが、例えば、モノクローナル抗体等の抗体をコードする塩基配列や、膜タンパク質をコードする塩基配列を有するもの等が挙げられる。
上記抗体は、いずれの動物種由来の抗体であってもよく、抗体全長、その断片、Ｆａｂ、Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ（ｓｃＦｖ）等のその２個以上の断片がリンカーペプチドで連結したポリペプチド等も上記抗体に含まれる。また、上記抗体は、いずれのサブクラスであってもよい。
抗体は分子量が１０万を越える巨大分子であり、特定の抗原物質に特異的に結合する機能を利用して、分析用試薬、生体外診断薬等として幅広く使用されており、産業的な利用価値が高い。抗体分子と抗原物質との結合に寄与している部分はＶ領域（可変領域）と呼ばれ、重鎖のＶ領域と軽鎖のＶ領域とから構成されている。特定抗原に対する抗体を取得する方法としては、ラットやウサギ等の実験動物に抗原物質を免疫感作させ、その血清に含まれる抗体（ポリクローナル抗体）を得る方法と、次に述べるモノクローナル抗体を得る方法とが一般的である。
モノクローナル抗体は、単一クローンの抗体産生細胞が産生する抗体であり、その特徴は一次構造が均一なことである。モノクローナル抗体はケーラーとミルシュタインによるハイブリドーマ技術の確立によって、容易に製造できるようになった。この方法では、まず、所定の抗原物質をマウス等の実験動物に投与し免疫感作を行う。次に、免疫感作された動物の脾臓から、上記抗原物質に対する抗体産生能を獲得した脾臓細胞を取り出し、これをミエローマのような適切な腫瘍細胞と融合させてハイブリドーマを作成する。ついでＥＬＩＳＡの様な適当な免疫分析法を用いたスクリーニングにより、目的の抗体を産生しているハイブリドーマを選択する。その後、限界希釈法等を用いてクローニングすることにより、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株を樹立する。こうして樹立されたハイブリドーマを適当な培地中で培養した後、その代謝産物を含む培地をクロマトグラフ等を用いて分離することにより、目的のモノクローナル抗体が得られる。しかしながら、これらの方法は、動物に対する免疫感作というインビボでの生体反応を利用しているため、必然的に実験動物の介在を必要とする。従って、実験動物を飼育維持しなければならず、煩雑な労力を必要とすると同時に、多大なコストが必要となる。また、この方法では必ずしも全ての抗原物質に対するモノクローナル抗体が製造できるとは限らず、試行錯誤的な要素が含まれる。近年、大腸菌の表層に、抗体の重鎖及び軽鎖のＶ領域のみを適当なリンカーを介して連結させたｓｃＦｖ又は抗体のＦａｂ部分が発現できるようになってきた。これら抗体遺伝子をＰＣＲでランダムに増幅することで抗体遺伝子のライブラリーを作成し、細胞外に提示させ、これらのライブラリーから特定抗原に親和性を有するものをスクリーニングする方法が開発されつつある（熊谷ら，タンパク質・核酸・酵素 ４３、１５９−、１９９８年）。スクリーニングによって得られた抗体遺伝子を大腸菌等を用いて発現すれば、目的の抗原に対する抗体を、実験動物を用いることなく作成することが可能である。しかしながら、例えば抗体遺伝子を大腸菌内で大量発現させる場合、前述の通り、ほとんどが不溶性の封入体として発現され、活性型を得ることはできなかった。
これに対して、本発明の発現ベクターに第２コード領域としてモノクローナル抗体をコードする塩基配列を有するものを組み込めば、スクリーニングで得られた抗体の活性型（可溶型）産物を簡単に取得することが可能となる。
上記膜タンパク質としては特に限定されず、例えば、生理活性物質の受容体等が挙げられる。上記生理活性物質の受容体は、細胞外のさまざまな物質に選択的に応答し、細胞内に多彩なシグナルを伝達することから、その機能を解明することが創薬に直接繋がるとして非常に注目されている。これらの膜受容体タンパク質は構造的によく保存されたファミリーを形成しており、大きく分けて、イオンチャネル内在型、チロシンカイネース型、及び、Ｇタンパク質共役型等の３つに分類される。上記イオンチャネル内在型は、リガンドが受容体に結合すると、受容体そのものに存在するイオンチャネルが開き、Ｎａ＋やＣａ２＋等を細胞内外のイオン勾配を利用して細胞内に移動させるタイプである。上記チロシンカイネース型は、リガンドの結合をリン酸化活性の上昇に転換させ、一連のカスケードを引き起こすことによりシグナルを増幅する。上記Ｇタンパク質共役型は、受容体自身はイオンチャネルや酵素活性をもたず、リガンドの結合による情報をＧタンパク質を介して細胞内に伝達する。膜受容体タンパク質を標的とした医薬品は数多く開発されているが、その多くがＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）をターゲットとしている。したがって、ＧＰＣＲの内因性リガンドを特定し、更にその機能及び構造を明らかにすることによって、迅速な医薬品開発が可能になることが期待できる。これらのリガンドスクリーニングや構造解析のための結晶化や重水素化のためにはＧＰＣＲの大量発現技術の開発が不可欠であるが、これまでＧＰＣＲの発現は大腸菌や酵母では不可能であるとされてきており、主にＣＨＯやＣＯＳ−７、ＨＥＫのような動物培養細胞で発現した微量なサンプルを用いて様々な分析を行っているのが現状であった。
これに対して、本発明の発現ベクターに第２コード領域として膜タンパク質をコードする塩基配列を有するものを組み込めば、組み換え型タンパク質を安価に大量調整することができる。
上記制限酵素サイトはマルチクローニングサイトとも呼ばれる。上記制限酵素サイトを有する領域は、目的とするタンパク質をコードする遺伝子を第２コード領域として挿入する領域である。
本発明の発現ベクターにおいては、（１）上記第１コード領域がプロモーターに有効に連結しており、かつ、上記制限酵素サイトが第１コード領域と同じ解読枠内であって、上記第１コード領域の下流にあるか、又は、（２）上記制限酵素サイトが挿入された上記第２コード領域がプロモーターに有効に連結するように配置されており、かつ、上記第１コード領域が上記第２コード領域と同じ解読枠内にあって、上記第２コード領域の下流にある。
上記プロモーターとしては特に限定されず、例えば、Ｐｌａｃプロモーター、Ｐｔａｃプロモーター、ｘｙｌＡプロモーター、ＡｒａＢプロモーター、ｌａｍｂｄａプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｇａｌ１／ｇａｌ１０プロモーター、ｎｍｔ１プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、マウスメタロチオネインプロモーター等が挙げられる。
本発明の発現ベクターでは、上記制限酵素サイトに目的とするタンパク質をコードする第２コード領域を挿入して、第２コード領域が組み込まれている発現ベクターを得、この発現ベクターを発現させることにより、（１）上記第１コード領域がプロモーターに有効に連結しており、かつ、上記制限酵素サイトが第１コード領域と同じ解読枠内であって、上記第１コード領域の下流にある場合は、第１コード領域とそれに続く第２コード領域が上記プロモーターにより翻訳され、一方、（２）上記制限酵素サイトが挿入された上記第２コード領域がプロモーターに有効に連結するように配置されており、かつ、上記第１コード領域が上記第２コード領域と同じ解読枠内にあって、上記第２コード領域の下流にある場合は、第２コード領域とそれに続く第１コード領域が上記プロモーターにより翻訳され、いずれの場合も、第２コード領域にコードされている目的タンパク質は分子シャペロン活性を有するポリペプチドとの融合タンパク質として発現される。
本発明の発現ベクターは、上記第１コード領域と上記第２コード領域を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域との間にあり、同じ解読枠内で翻訳されてプロテアーゼ消化サイトとなる領域を有してもよい。
上記プロテアーゼ消化サイトは、本発明の発現ベクターに第２コード領域が組み込まれた発現ベクターの発現により得られる、第１コード領域にコードされる分子シャペロン活性を有するポリペプチドと第２コード領域にコードされるタンパク質とが結合した融合タンパク質において、上記ポリペプチドと上記タンパク質とをつなぐペプチドリンカーとなるものである。得られた融合タンパク質がプロテアーゼ消化サイトを有することにより、プロテアーゼを作用させることによって容易に融合タンパク質を消化して、第１コード領域にコードされる分子シャペロン活性を有するポリペプチドと第２コード領域にコードされるタンパク質とを切り離して、目的とする第２コード領域にコードされるタンパク質を得ることができる。
上記プロテアーゼとしては特に限定されず、例えば、トロンビン、ファクターＸａ、プレシジョンプロテアーゼ等が挙げられる。これらのプロテアーゼはファルマシアバイオテク社等から市販されている。また、インテインの自己タンパク質スプライシング機能を利用して目的タンパク質を切り離すことも可能である。
上記プロテアーゼ消化サイトをコードする塩基配列の長さは特に限定されないが、１５〜９０塩基程度であることが好ましく、翻訳されてグリシンやセリン等の中性アミノ酸となる塩基配列を多く含むことが好ましい。
本発明の発現ベクターには他の公知の塩基配列が含まれていてもよい。上記他の公知の塩基配列としては特に限定されず、例えば、発現産物の安定性を付与する安定性リーダー配列、発現産物の分泌を付与するシグナル配列、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の形質転換された宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等が挙げられる。
本発明の発現ベクターは、得られる融合タンパク質が適当なリガンドを介して固定化担体に結合する形態に設計されていてもよい。これにより発現後、その精製を簡略化することができる。例えば、分子シャペロン活性を有するポリペプチドとしてＰＰＩａｓｅを用いる場合、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであればＦＫ５０６やラパマイシン、その類縁化合物を担持させた担体を、シクロフィリンタイプＰＰＩａｓｅであればシクロスポリン又はその類縁化合物を担持させた担体を、パーブリンタイプＰＰＩａｓｅであればＪｕｇｌｏｎｅ又はその類縁化合物を担持させた担体をそれぞれ用いることにより融合タンパク質の精製を簡略化することができる。
また、上記分子シャペロン活性を有するポリペプチドのＮ末端側に、ヒスチジン６残基程度のタグを有するよう本発明の発現ベクターを設計すると、得られた融合タンパク質は、ニッケル等の金属をキレートした担体に、ヒスチジン残基を介して結合するので、当該担体を用いれば、宿主由来のタンパク質と融合タンパク質とを簡単に分離することができる。更に、上記担体に結合した融合タンパク質にプロテアーゼを作用させることにより、上記プロテアーゼ消化サイトが消化され、目的タンパク質のみを簡単に担体から遊離させることができる。
なお、イミダゾールで溶出すれば、プロテアーゼを作用させることなく、融合タンパク質のまま担体から遊離させることもできる。上記のヒスチジンタグ以外にも、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ又はその一部分をタグとし、グルタチオン樹脂によるアフィニティークロマトグラフィーにより精製する方法や、マルトース結合タンパク質又はその一部をタグとし、マルトース樹脂により精製する方法等を用いることもできる。その他、抗体との親和性を用いることもできる。上記の各種タグは、融合タンパク質のＮ端側及びＣ末端側のいずれに設計してもよく、双方に設計してもよい。これらの遺伝子操作方法や、アフィニティー精製方法としては、当業者に公知の方法を用いることができる。
本発明の発現ベクターに目的とするタンパク質をコードする遺伝子を第２コード領域として組み込んで発現させることにより、第１コード領域にコードされる分子シャペロン活性を有するポリペプチドと第２コード領域にコードされるタンパク質との融合タンパク質が得られる。このような上記分子シャペロン活性を有するポリペプチド及び第２コード領域がコードするタンパク質を含有する融合タンパク質もまた、本発明の１つである。更に、両者の間にプロテアーゼ消化サイトを含むリンカーペプチドが組み込まれている場合は、得られた融合タンパク質をプロテアーゼで消化すれば、目的タンパク質を容易に融合タンパク質から切り出すことができる。このため、本発明の融合タンパク質は、プロテアーゼ消化サイトを含有することが好ましい。
本発明の発現ベクターは宿主に導入されて目的タンパク質の発現に供される。このような本発明の発現ベクターを内包している宿主もまた、本発明の１つである。
上記宿主としては特に限定されず、例えば、細菌等の原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫細胞、ほ乳類細胞等が挙げられる。しかしながら、使用される宿主と発現ベクターとの特性は適合しなければならない。例えば、ほ乳類細胞系において融合タンパク質を発現する場合、発現ベクターは、マウスメタロチオネインプロモーター等のほ乳類細胞のゲノムから単離されたプロモーターや、バキュロウイルスプロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター等のほ乳類細胞で成長するウイルスから単離されたプロモーターを用いることが好ましい。
上記宿主としては、なかでも、大腸菌等の原核生物が好ましい。
本発明の発現ベクターを宿主に導入する方法としては特に限定されず、公知の種々の方法を用いることができ、例えば、トランスフェクションとしてリン酸カルシウム沈殿法、電気穿孔、リポソーム融合、核注入、ウイルス又はファージ感染等が挙げられる。
本発明の発現ベクターを適切な宿主に導入し、宿主を適切な条件下で培養し、発現させることにより大量の融合タンパク質を得ることができる。このような、本発明の融合タンパク質を製造する方法もまた、本発明の１つである。
本発明の融合タンパク質の製造方法においては、本発明の発現ベクターを内包する宿主を、当該発現ベクターの発現条件下で培養し、上記融合タンパク質を細胞質に発現させるか、本発明の発現ベクターの第１コード領域の５’末端又は第２コード領域の５’末端に転写及び翻訳されてシグナル配列となる領域を設けて、得られた発現ベクターを内包する宿主を、当該発現ベクターの発現条件下で培養し、上記融合タンパク質をペリプラズム又は培地に発現させるか、又は、本発明の発現ベクターに、無細胞翻訳系において、上記融合タンパク質を発現させることが好ましい。
グラム陰性細菌を宿主として用いる場合、融合タンパク質の発現は、細胞質であっても、ペリプラズム又は培地への発現であっても良い。本発明の発現ベクターの第１コード領域の５’末端又は第２コード領域の５’末端に、転写及び翻訳されてシグナル配列となる領域を設けることにより、上記融合タンパク質をペリプラズム又は培地に分泌発現することができる。上記融合タンパク質をペリプラズムに発現させる場合、第１コード領域にコードされるポリペプチドとしては、本来細胞内では膜に存在するポリペプチドを用いると発現性を向上させることができる。上記本来細胞内では膜に存在するポリペプチドとしては、例えば、ＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅであるＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅや、パーブリンタイプＰＰＩａｓｅであるＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ等が挙げられる。これらのＰＰＩａｓｅは本来グラム陰性菌のペリプラズムに存在し、タンパク質の折り畳みに関与するタンパク質である。
上記第２コード領域にコードされるタンパク質が膜タンパク質や抗体等である場合、本来これらのタンパク質は細胞質外に発現しているタンパク質であるため、上記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅやＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ等と融合して発現させれば発現性が向上する。
本発明の発現ベクターに、無細胞翻訳系において、上記融合タンパク質を発現させる場合は、宿主細胞を用いることなく、バクテリア又は真核生物抽出液等を用いた無細胞翻訳系（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ １１，２６５６−２６６４：Ｆａｌｃｏｎｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，２６５６−２６６４）にて、本発明の融合タンパク質を可溶性タンパク質として発現させる。
本発明の融合タンパク質の製造方法においては、ＰＰＩａｓｅ活性を阻害するマクロライド、シクロスポリン、ジュグロン、又は、これらの類縁化合物を担持した担体に、融合タンパク質を吸着させた後、担体を回収することが好ましい。
上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅと上記の阻害剤との結合性は強く、この親和力を利用して発現した融合タンパク質を精製することができる。例えば、アガロースゲル担体上にＦＫ５０６等のマクロライドを担持させたビーズを用いれば、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質を特異的に結合させることができる。同様に、シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質の場合はシクロスポリンを担持させた担体を、パーブリンタイプＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質の場合はジュグロン（Ｊｕｇｌｏｎｅ）を担持させた担体を用いれば精製を簡略化することができる。
本発明の融合タンパク質の製造方法で得られた融合タンパク質をプロテアーゼ消化サイトを消化するプロテアーゼで消化することにより目的タンパク質を得ることができる。このような、上記第２コード領域がコードするタンパク質を製造する方法もまた、本発明の１つである。
本発明によれば、目的のタンパク質を分子シャペロン活性を有するポリペプチドとともにペプチドリンカーで連結して、融合タンパク質として発現させることで、本来、異常型として発現される難発現性タンパク質を天然型の可溶体として大量に発現でき、その生産性を大幅に飛躍させることができる。また、目的タンパク質が抗体である場合、本発明によれば、実験動物を用いることなく簡便に機能を有した組み換え型抗体を調製することが可能となるので、他のタンパク質やペプチド等と融合させることで、高機能な抗体を大量調製することが可能となる。In recent years, genome analysis of various organisms has been finished, and it is considered that it will proceed to comprehensive functional analysis of proteins that are gene expression products in the future. Researches that are trying to help elucidate life phenomena by clarifying the properties of individual proteins and comprehensively analyzing interactions between proteins are rapidly increasing. On the other hand, the intracellular receptor protein that specifically binds to various physiologically active substances and transmits the action thereof, and the active substance that binds to the receptor protein can be a candidate substance for a new drug. There has been significant interest in structure determination and has attracted attention in the screening of new drugs. When trying to determine the properties of such proteins, there is a method for investigating the properties of recombinant proteins obtained by incorporating the relevant genes into vector genes, transforming them into hosts such as bacteria, yeast, and insect cells and expressing them. It is common.
When evaluating the correct properties of a protein, it is very important whether the protein is folded into the correct conformation. However, when a protein derived from a heterologous organism is to be prepared by the protein expression method using the above-described host expression system, a case where only an abnormal protein having a different three-dimensional structure is often obtained due to abnormal protein folding is encountered. . Such proteins are known to be expressed in the host as aggregates called inclusion bodies, or to be degraded by host cell proteases. In order to solve these problems, it is considered extremely important to control the target protein so that the folding reaction in the host cell is accurately performed.
When the target protein is expressed as an inclusion body, which is an abnormal protein, conventionally, a method for obtaining the normal form has generally been a method of converting it into a normal form in vitro. That is, a method for refolding a solubilized target protein by recovering inclusion bodies from a host, solubilizing with high-concentration guanidine hydrochloride, urea, or the like, and then diluting about 30 to 100 times with an appropriate buffer or the like. It is. For example, antibodies are expected to be used in the medical field, but most of them are expressed as insoluble inclusion bodies when the recombinant is expressed in the cytoplasm using E. coli as a host. (Pluckthun, Biotechnology, 9, 545-1991). As a method for efficiently refolding an antibody obtained as an inclusion body in vitro, a method of increasing the yield by incorporating chaperonin that promotes protein folding in a dilution buffer has been proposed (specialty). Kaihei 9-220092). In addition to antibodies, methods for refolding NGF / BDNF family proteins expressed as inclusion body proteins (Japanese Patent Laid-open Nos. 6-327589 and 6-319549), and methods for refolding neurotrophin-3 (Japanese Patent Laid-Open No. 9-1993). Various devices have been proposed to increase the yield of the target protein by adding a reducing agent, an organic acid, or the like to the diluent, such as No. -2622093). However, these methods of refolding the protein obtained as inclusion bodies in vitro are low in yield, although they are very laborious.
In the case of an antibody, it has been reported that if an E-coli is used as a host, it can be expressed in a soluble fraction if a signal sequence is added to its N-terminus and expressed in the periplasmic region (Glockhuber, Biochemistry 31, 1279-, 1992). However, since the periplasm region is a very narrow region compared to the cytoplasm region, the amount of protein expressed is very small, and even if the expression amount can be increased, it becomes an inclusion body. Several attempts to express antibodies in the cytoplasm as soluble forms have also been reported. The molecular chaperone involved in protein folding and the antibody gene are co-expressed in the cytoplasm to prevent the formation of inclusion bodies of recombinant antibodies and to increase the yield of soluble forms, and the thioredoxin reductase-deficient strain as a host E. coli A method to be used has been proposed (Japanese Patent Laid-Open No. 9-220092; Ploba, Gene 159, 203-, 1995). However, although these methods can obtain a soluble antibody, the yield is as low as 1 mg / liter of medium (Levy, Protein Expression and Purification 23, 338-, 2001), and further production efficiency. A good way is needed.
On the other hand, membrane proteins are also embedded in the surface or the interior of biological membranes, so the content of hydrophobic amino acids is high, and when expressed as recombinant proteins in the absence of membranes, they are often expressed as inclusion bodies It is known. In many cases, even when it shows toxicity to cells, even expression does not occur. When obtaining recombinant forms of membrane proteins, it is common practice to use eukaryotic cells such as yeast and animal cells and to express them in their membrane fractions, but on the other hand, the amount of expression is low, and when they are expressed in culture. Is costly and laborious, and a simpler expression method is desired.
Summary of invention
In view of the above situation, the present invention prevents the formation of an inactive abnormal protein during production of a recombinant protein, and enables the target protein to be produced in a large amount and efficiently as a natural type, that is, a soluble type. An object of the present invention is to provide an expression vector, a host, a fusion protein, a protein, a method for producing the fusion protein, and a method for producing the protein.
That is, the present invention comprises (a) a first coding region encoding a polypeptide having a molecular chaperone activity, and (b) at least one restriction enzyme site into which a second coding region encoding a protein can be inserted. An expression vector containing a region having
In the expression vector of the present invention, the first coding region is effectively linked to a promoter, and the restriction enzyme site is in the same reading frame as the first coding region, and the first coding region is Or the restriction enzyme site is arranged so that the inserted second coding region is effectively linked to a promoter, and the first coding region is the second coding region. And in the downstream of the second code area.
The expression vector of the present invention is between a first coding region and a region having at least one restriction enzyme site into which a second coding region can be inserted, and is translated in the same reading frame to obtain a protease digestion site. It is preferable to have a region.
The expression vector of the present invention preferably incorporates a second coding region encoding a protein.
In the expression vector of the present invention, the polypeptide having molecular chaperone activity is preferably PPIase having molecular chaperone activity.
Examples of the PPIase having molecular chaperone activity include FKBP type PPIase, cyclophilin type PPIase, and perbulin type PPIase.
Examples of the FKBP type PPIase include archaebacterial FKBP type PPIase, trigger factor type PPIase, FkpA type PPIase, and FKBP52 type PPIase.
Examples of the cyclophilin type PPIase include CyP40 type PPIase.
Examples of the perbrin type PPIase include SurA type PPIase.
The PPIase having the molecular chaperone activity also includes an IF domain of archaeal FKBP PPIase and / or a PPIase containing a C-terminal domain, an N-terminal domain of trigger factor type PPIase, and / or C PPIase containing the terminal domain, PPIase containing the N-terminal domain of FkpA type PPIase, PPIase containing the C-terminal domain of FKBP52 type PPIase, PPIase containing the C-terminal domain of CyP40 type PPIase Or PPIase containing the N-terminal domain of SurA type PPIase.
In the expression vector of the present invention, the second coding region preferably has a base sequence encoding a monoclonal antibody or a base sequence encoding a membrane protein.
A host containing the expression vector of the present invention is also one of the present invention.
The host of the present invention is preferably E. coli.
A fusion protein containing the polypeptide having the molecular chaperone activity and the protein encoded by the second coding region is also one aspect of the present invention.
The fusion protein of the present invention preferably contains a protease digestion site.
A method for producing the fusion protein of the present invention is also one aspect of the present invention.
In the method for producing the fusion protein of the present invention, the host encapsulating the expression vector of the present invention is cultured under the expression conditions of the expression vector and the fusion protein is expressed in the cytoplasm, or the expression vector of the present invention A host containing the expression vector obtained by providing a signal sequence by transcription and translation at the 5 ′ end of the 1 coding region or the 5 ′ end of the second coding region is obtained under the expression conditions of the expression vector. It is preferable to culture and express the fusion protein in the periplasm or medium, or to express the fusion protein in the expression vector of the present invention in a cell-free translation system.
In the method for producing a fusion protein of the present invention, the carrier can be recovered after adsorbing the fusion protein to a carrier carrying macrolide, cyclosporine, juglone, or a similar compound that inhibits PPIase activity. preferable.
A method for producing a protein encoded by the second coding region, wherein the fusion protein obtained by the method for producing a fusion protein of the present invention is digested with a protease that digests a protease digestion site, is also provided in this method. It is one of the inventions.
Detailed Description of the Invention
The present invention is described in detail below.
In the present invention, “effectively linked to a promoter” means that the first coding region is linked to a promoter so that a polypeptide having molecular chaperone activity is normally transcribed, or the target protein is It means that the second coding region is linked to a promoter so that it is normally transcribed.
In the present invention, “PPIase having molecular chaperone activity” includes those having substantially the same function. That is, a substantially equivalent polypeptide, a polypeptide containing at least a part thereof, and those obtained by changing some amino acids to other amino acids are also included.
Further, in the present invention, the “domain” includes a domain having substantially the same function.
The expression vector of the present invention contains (a) a first coding region encoding a polypeptide having molecular chaperone activity.
The molecular chaperone activity means an activity of refolding a denatured protein to the original natural form, or an activity of suppressing irreversible aggregation of the denatured protein. For example, rhodanese, citrate synthase, malate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase and the like are model enzymes (Kawada, Bioscience and Industry 56,593-1998), and these are 6M guanidine hydrochloride. After denatured with a protein denaturing agent, etc., the denaturing protein regeneration rate that starts when the denaturing agent is diluted with a buffer solution containing the subject substance to be tested, and the molecular chaperone of the test subject matter with the rate of inhibition of denaturing protein aggregation Activity can be evaluated. As a method for evaluating the regeneration rate of the denatured protein, for example, in the case of Rhodanese, the method of Horowitch et al. (Horowitz, Methods Mol. Biol. 40, 361-, 1995) and the like can be mentioned. Examples of the evaluation method include the method by Taguchi et al. (Taguchi, J. Biol. Chem. 269, 8529-, 1994).
The polypeptide having the molecular chaperone activity is not particularly limited. For example, PPIase having molecular chaperone activity such as archaeal FKBP type PPIase; small heat shock protein, chaperonin, prefoldin, DnaK, DnaJ, GrpE, HSP90 Etc.
The small heat shock protein has been reported to have a huge molecular structure in which about 24 to 32 subunits of about 15 to 30 kDa are assembled and have chaperone activity (Jakob, J. Biol. Chem 268, 1517-, 1993). Crystallin having a region with high homology to this in the C-terminal region also has the same properties as the small heat shock protein, and any of them can be applied to the expression vector of the present invention.
The chaperonin has a characteristic structure consisting of a total of 14 to 18 subunits in which donut-shaped structures in which 7 to 9 subunits are linked in a ring are overlapped in two stages. The chaperonin captures a denatured protein in the recess of the donut structure and promotes protein refolding with consumption of nucleotides such as ATP. In the case of
The prefoldin is a molecular chaperone found as a factor involved in protein folding of eukaryotic tubulin (Lopez, J. Struct. Biol. 135, 219-, 2001) and forms a hexamer. In vitro, it is known to have chaperone activity that interacts with denatured proteins (Siegert, Cell 103, 621-2000).
The homologues of DnaK, DnaJ, and GrpE are molecular chaperones that exist widely in any species and are thought to be involved in protein folding. Of these, the DnaK / DnaJ / GrpE system protein folding system of Escherichia coli has been well studied. As these proposed reaction mechanisms, a nascent polypeptide biosynthesized with ribosome binds to DnaK, and further DnaJ binds in the presence of ATP, thereby suppressing irreversible aggregate formation. Furthermore, with the nucleotide dissociation dependent on GrpE, the nascent polypeptide is also dissociated and delivered to the chaperonin folding system (Fink, Molecular chapters in the life of proteins, MARCEL DEKER, INC, 1998). In the expression vector of the present invention, homologues that function in the same manner as these DnaK, DnaJ and GrpE derived from E. coli can be used.
Some of the above HSP90 (heat shock protein 90) also have chaperone-like activity (Ramsey, J. Biol. Chem. 275, 17857-, 2000). In the expression vector of the present invention, its homologue, one of them Parts or polypeptides comprising them can be used.
PPIase (Peptidyl-poly cis-trans isomerase) having molecular chaperone activity is one of protein folding factors involved in protein folding, and among the amino acids in the target protein in the process of folding, a proline residue It has an activity (PPIase activity) that catalyzes a cis-trans isomerization reaction of the N-terminal peptide bond.
Among them, PPIase having molecular chaperone activity is preferable as the polypeptide having molecular chaperone activity.
PPIases having molecular chaperone activity are classified into three types, FK506 Binding Protein type (FKBP type), cyclophilin type and perbulin type, based on their sensitivity to inhibitors. FKBP type PPIase is a PPIase whose activity is inhibited by FK506, which is one of immunosuppressants, and its homologue. Cyclophilin-type PPIase is PPIase or a homologue thereof that is sensitive to cyclosporine, another immune inhibitor. On the other hand, perbulin-type PPIase is PPIase or a homologue thereof that is not sensitive to any immune inhibitor and whose activity is inhibited by juglone. These three types of PPIases have little homology on the primary amino acid sequence.
The PPIase having molecular chaperone activity may be any type of PPIase among the above three types of PPIases.
Examples of the FKBP type PPIase include archaebacterial FKBP type PPIase, trigger factor type PPIase (Huang, Protein Sci. 9, 1254-, 2000), FkpA type PPIase (Arie, Mol. Microbiol. 39, 199-, 2001), FKBP52 type PPIase (Bose, Science 274, 1715-, 1996) and the like.
Examples of the cyclophilin type PPIase include CyP40 type PPIase (Pirkl, J. Mol. Biol. 308, 795-, 2001).
Examples of the perbrin type PPIase include SurA type PPIase (Behrens, EMBO J. 20, 285, 2001).
Regarding the function of the archaebacteria-derived FKBP PPIase, it has been found that it has not only PPIase activity but also molecular chaperone activity that suppresses irreversible aggregation of proteins and at the same time promotes refolding of denatured proteins. (Furutani,
The archaebacteria-derived FKBP PPIase can be roughly classified into two types depending on the difference in molecular weight. One is a short type having a molecular weight of about 16 to 18 kDa, and the other is a long type having a molecular weight of about 26 to 33 kDa. The archaebacteria-derived FKBP PPIase used in the present invention may be either a short type or a long type FKBP type PPIase. However, in general, the short type tends to have stronger molecular chaperone activity, and the expression level of the recombinant protein tends to decrease as the protein molecular weight increases. In the present invention, the short-type archaebacteria-derived FKBP-type PPIase is preferred. The molecular weight range described above is the molecular weight range of PPIase that has been found so far, and the archaebacteria-derived FKBP PPIase in the present invention is not limited to this molecular weight range, and may belong to substantially the same group. Any may be sufficient.
The archaebacteria-derived FKBP PPIase is not particularly limited, and may be derived from any archaea. For example, among archaea-derived FKBP-type PPIases found so far, the short type is thermophilic. And Thermococcus sp. Derived from Methanococcus thermolithotrophicus, an archaebacteria derived from a hyperthermophilic bacterium. Examples include those derived from KS-1, Methanococcus jannaschii, Methanocarcina mazei, which is a psychrophilic archaeon, Methanarcarcina aceticovarans, and those derived from Methanosarcina barkeri (Maruyamat. On the other hand, the long type has been found on the genomes of most archaea as a result of genome analysis and other analyses, such as those derived from Pyrococcus horikoshii, which are thermophilic and hyperthermophilic archaea, from Aeropyrum pernix, and Sulfolobus solfataricus. Derived from Methanococcus jannaschii, derived from Archaeoglobus fulgidus, derived from Methanobacterium autotrophicum Thermoplasma acidophilum, etc. Of these, those derived from cold archaea are preferred. As an example of the long-type archaebacteria-derived FKBP PPIase, the amino acid sequence derived from Pyrococcus horikoshii is SEQ ID NO: 1, and as an example of the short-type archaebacteria-derived FKBP-type PPIase, the amino acid sequence derived from Methanococcus jannaschii They are shown in SEQ ID NO: 2, respectively.
The archaeal FKBP-type PPIase has an FKBP domain involved in the binding between PPIase activity and FK506, and an IF domain, and in the case of the long-type archaeal FKBP-type PPIase, it further has a C-terminal domain. (Maruyama and Furutani, Front Biosci. 1, D821-, 2000). The IF domain (Insert in the flap; Suzuki, J. Mol. Biol. 328, 1149-, 2003) consists of about 100 amino acids inserted in the amino acid sequence constituting the FKBP domain on the primary amino acid sequence, Forms a characteristic higher order structure that forms a domain structure (Maruyama and Furutani, Front Biosci. 1, D821-, 2000; Insert in the flap; Suzuki, J. Mol. Biol. 328, 1149-, 2003). The molecular chaperone activity of the short-type archaeal FKBP-type PPIase is known to involve the FK506 binding region and the IF domain of the FKBP domain (Furutani,
The trigger factor type PPIase is a PPIase found on almost all bacterial genomes. Is not particularly restricted but includes the trigger factor-type PPIase, for example, from E. coli, from Mycoplasma genitalium, from Bacillus subtilis, Salmonella enterica origin, derived Staphylococcus aureus, from Mycobacterium leprae, Agrobacterium tumefacium derived, Lactococcus lactis origin, derived Campyrobacter jejuni, Streptococcus Pyogenes origin, Corynebacterium diphtheriae origin, etc. are mentioned. In addition, the trigger factor type PPIase used in the present invention may be any trigger factor type PPIase as long as it belongs to a group that is recognized to be substantially the same as the bacterial trigger factor in the amino acid sequence. As an example of the trigger factor type PPIase, the amino acid sequence of the trigger factor type PPIase derived from E. coli is shown in SEQ ID NO: 3, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
The trigger factor type PPIase has an FKBP domain involved in the binding of PPIase activity and FK506 as an intermediate domain, and has two domains on the N-terminal side and C-terminal side thereof (Zart, J. Mol. Biol). 271, 827-, 1997). The molecular chaperone activity of the trigger factor type PPIase is known to be independent of the PPIase activity as in the archaebacterial FKBP type PPIase, and either the N-terminal domain or the C-terminal domain, or both It is suggested that In the present invention, any PPIase containing the N-terminal domain and / or C-terminal domain of the trigger factor type PPIase can be used as the PPIase having the molecular chaperone activity. As the N-terminal domain and C-terminal domain of the trigger factor type PPIase, in SEQ ID NO: 3, the region from the 1st methionine to the 145th arginine corresponds to the N-terminal domain, and the region from the 252nd phenylalanine to the C-terminal Corresponds to the C-terminal domain (Zarnt, J. Mol. Biol. 271, 827-, 1997). The homology of each domain can be determined by using multiple alignment software such as ClustalW.
The FkpA type PPIase and SurA type PPIase are both PPIases expressed in the periplasmic region of gram-negative bacteria such as E. coli. The FkpA type PPIase is an FKBP type PPIase whose activity is inhibited by FK506, whereas the SurA type PPIase does not show sensitivity to any immunosuppressive agent of FK506 and other immunosuppressive agents, cyclosporine, It is one of perbulin type PPIase homologues. These two PPIases are also known as proteins that exhibit molecular chaperone activity (Ramm, J. Biol. Chem. 275, 17106-, 2000; Behrens, EMBO. J. 20, 285-, 2001).
The FkpA type PPIase and SurA type PPIase are not only found in the genome of Gram-negative bacteria, but also homologues have been found in the genome of eukaryotes such as yeast.
The FkpA type PPIase and SurA type PPIase used in the present invention are not particularly limited. The thing of origin, etc. are mentioned. In addition, PPIase derived from any organism may be used as long as it belongs to the same group as that of bacteria and has substantially the same function. As an example of the FkpA type PPIase, an amino acid sequence derived from E. coli is shown in SEQ ID NO: 5, and a base sequence is shown in SEQ ID NO: 6. As an example of the above SurA type PPIase, the amino acid sequence of the Escherichia coli-derived one is shown in SEQ ID NO: 7, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 8.
The FkpA type PPIase has a C-terminal FKBP domain and other N-terminal domains (Arie, Mol. Microbiol. 39, 199-, 2001). The molecular chaperone activity of the FkpA type PPIase is also known to be independent of the PPIase activity, suggesting the involvement of its N-terminal domain. In the present invention, any PPIase containing the N-terminal domain of FkpA type PPIase can be used as the PPIase having the molecular chaperone activity. As the N-terminal domain of the FkpA type PPIase, in SEQ ID NO: 5, the region near aspartic acid 120 from the N-terminal corresponds to the N-terminal domain (Arie, Mol. Microbiol. 39, 199-, 2001).
On the other hand, the SurA type PPIase also has a domain having a high homology among perbulin type PPIases and the other N-terminal domain on the C-terminal side.
The N-terminal domain is suggested to be involved in the molecular chaperone activity of the SurA type PPIase in addition to the domain having high homology among perbrin type PPIases (Behrenns, EMBO J. 20, 285, 2001). In the present invention, any PPIase containing the N-terminal domain of the SurA type PPIase can be used as the PPIase having the molecular chaperone activity. As the N-terminal domain of the SurA type PPIase, in SEQ ID NO: 7, a region near the 175th asparagine from the N-terminal corresponds to the N-terminal domain. The homology of the N-terminal domain can be determined by using multiple alignment software such as ClustalW.
The FKBP52 type PPIase and the CyP40 type PPIase are both PPIases found in eukaryotes. The FKBP52 type PPIase is an FKBP type PPIase of about 52 kDa and is also called p59 or HSP56. The amino acid sequence has a structure in which two regions having high homology with human-derived 12 kDa FKBP type PPIase are connected in tandem, and further, a region containing a calmodulin binding site is connected on the C-terminal side (Ratajczat, J. Biol. Chem. 268, 13187-, 1993). The CyP40 type PPIase is one of cyclophilin type PPIases having a molecular weight of about 40 kDa and being sensitive to cyclosporine as an immunosuppressant. Both have a domain containing a PPIase activity at its N-terminus and a domain containing a tetratricopeptide repeat (TPR) that binds to HSP90, which is one of heat shock proteins, at its C-terminus. Is a PPIase involved in steroid hormone receptor formation (Galat, Peptidyl-Prolyl cis / trans isomerase Oxford University Press 1998). The FKBP52 type PPIase and the CyP40 type PPIase are not particularly limited, and examples thereof include those derived from eukaryotes such as humans, mice, cows, rabbits, and rats. In addition, the FKBP52 type PPIase and CyP40 type PPIase used in the present invention are not only derived from eukaryotes, but also from any organism as long as they belong to a group recognized as PPIases having substantially equivalent functions. PPIase may be used.
As an example of the FKBP52 type PPIase, the amino acid sequence of a human-derived one is shown in SEQ ID NO: 9, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 10. As an example of the CyP40 type PPIase, the amino acid sequence of a human-derived one is shown in SEQ ID NO: 11, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 12.
It is suggested that each C-terminal domain including TPR is involved in the molecular chaperone activity of the FKBP52 type PPIase and the CyP40 type PPIase. In the present invention, any PPIase containing the C-terminal domain of FKBP52 type PPIase and CyP40 type PPIase can be used as the PPIase having the molecular chaperone activity. In the human FKBP52 type PPIase, the C-terminal domain is a region from the vicinity of the 264th glutamic acid to the C-terminal in SEQ ID NO: 9, and among these, the region from the 264th glutamic acid to the 400th isoleucine is particularly important. In human CyP40 type PPIase, the region from around 184 leucine to the C-terminal corresponds to the C-terminal domain.
The PPIase having molecular chaperone activity used in the present invention can be suitably used as long as it is a PPIase having equivalent molecular chaperone activity other than those exemplified above. Examples thereof include porcine-derived 18 kDa cyclophilin type PPIase (Ou, Protein Sci. 10, 2346, 2001) whose molecular chaperone activity has been recently re-evaluated.
The expression vector of the present invention contains (b) a region having at least one restriction enzyme site into which a second coding region encoding a protein can be inserted.
The second coding region is a region having a base sequence encoding a target protein to be expressed using the expression vector of the present invention.
The second coding region used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include those having a base sequence encoding an antibody such as a monoclonal antibody and those having a base sequence encoding a membrane protein.
The above-mentioned antibody may be an antibody derived from any animal species, such as a full-length antibody, a fragment thereof, a polypeptide in which two or more fragments such as Fab and Single chain Fv (scFv) are linked by a linker peptide, etc. Included in antibodies. The antibody may be any subclass.
Antibodies are macromolecules with molecular weights exceeding 100,000, and are widely used as analytical reagents, in vitro diagnostics, etc. by utilizing their ability to specifically bind to specific antigenic substances, and are of industrial utility value. Is expensive. The portion contributing to the binding between the antibody molecule and the antigen substance is called a V region (variable region), and is composed of a heavy chain V region and a light chain V region. As a method for obtaining an antibody against a specific antigen, an experimental animal such as a rat or rabbit is immunized with an antigenic substance to obtain an antibody (polyclonal antibody) contained in the serum, and a method for obtaining a monoclonal antibody described below. And is common.
A monoclonal antibody is an antibody produced by a single clone of antibody-producing cells, and is characterized by a uniform primary structure. Monoclonal antibodies can be easily produced by the establishment of hybridoma technology by Kohler and Milstein. In this method, first, a predetermined antigen substance is administered to an experimental animal such as a mouse to perform immunization. Next, spleen cells that have acquired the ability to produce antibodies to the antigenic substance are removed from the spleen of the immunized animal, and this is fused with an appropriate tumor cell such as myeloma to produce a hybridoma. Subsequently, the hybridoma producing the target antibody is selected by screening using an appropriate immunoassay method such as ELISA. Thereafter, a hybridoma strain producing the target monoclonal antibody is established by cloning using a limiting dilution method or the like. The hybridoma thus established is cultured in an appropriate medium, and then the medium containing the metabolite is separated using a chromatograph or the like to obtain the target monoclonal antibody. However, these methods inevitably require the intervention of experimental animals because they utilize the in vivo biological reaction of immunization against animals. Therefore, laboratory animals must be bred and maintained, which requires complicated labor and at the same time a great cost. In addition, this method does not necessarily produce monoclonal antibodies against all antigenic substances, and includes trial and error factors. In recent years, it has become possible to express scFv or the Fab portion of an antibody in which only the V regions of the antibody heavy chain and light chain are linked to the surface layer of E. coli via an appropriate linker. A library of antibody genes is created by randomly amplifying these antibody genes by PCR, presented extracellularly, and a method for screening those libraries having affinity for a specific antigen is being developed ( Kumagai et al., Protein, Nucleic Acid,
In contrast, when an expression vector of the present invention is incorporated with a second coding region having a base sequence encoding a monoclonal antibody, an active (soluble) antibody product obtained by screening can be easily obtained. It becomes possible.
The membrane protein is not particularly limited, and examples thereof include a physiologically active substance receptor. Receptors for the above-mentioned physiologically active substances selectively respond to various extracellular substances and transmit various signals inside the cells. Therefore, elucidating their functions is of great interest as it directly leads to drug discovery. Has been. These membrane receptor proteins form a structurally well-conserved family, and are roughly classified into three types such as ion channel intrinsic type, tyrosine kinase type, and G protein coupled type. In the ion channel intrinsic type, when a ligand binds to a receptor, an ion channel existing in the receptor itself opens, and Na + And Ca 2+ This is a type in which an ion gradient inside and outside the cell is moved into the cell. The tyrosine kinase form amplifies the signal by converting the binding of the ligand to an increase in phosphorylation activity and causing a series of cascades. In the G protein-coupled type, the receptor itself does not have an ion channel or enzyme activity, and transmits information on binding of the ligand into the cell via the G protein. Many drugs targeting membrane receptor proteins have been developed, many of which target G protein-coupled receptors (GPCRs). Therefore, it is expected that rapid drug development can be realized by identifying the endogenous ligand of GPCR and clarifying its function and structure. For the crystallization and deuteration for ligand screening and structural analysis, the development of GPCR mass expression technology is indispensable. Until now, GPCR expression has been considered impossible in E. coli and yeast. At present, various analyzes are performed using a small amount of sample expressed in cultured animal cells such as CHO, COS-7, and HEK.
On the other hand, if the expression vector of the present invention incorporates a base protein encoding a membrane protein as the second coding region, a large amount of recombinant protein can be prepared at low cost.
The restriction enzyme site is also called a multicloning site. The region having the restriction enzyme site is a region into which a gene encoding a target protein is inserted as a second coding region.
In the expression vector of the present invention, (1) the first coding region is effectively linked to a promoter, the restriction enzyme site is in the same reading frame as the first coding region, and the first coding region is Or (2) the second coding region into which the restriction enzyme site has been inserted is disposed so as to be effectively linked to a promoter, and the first coding region is the second region. It is in the same decoding frame as the code area and is downstream of the second code area.
The promoter is not particularly limited, and examples thereof include Plac promoter, Ptac promoter, xylA promoter, AraB promoter, lambda promoter, T7 promoter, gal1 / gal10 promoter, nmt1 promoter, polyhedrin promoter, mouse metallothionein promoter, and the like.
In the expression vector of the present invention, the second coding region encoding the target protein is inserted into the restriction enzyme site to obtain an expression vector incorporating the second coding region, and this expression vector is expressed. (1) When the first coding region is effectively linked to a promoter and the restriction enzyme site is in the same reading frame as the first coding region and downstream of the first coding region, The first coding region and the subsequent second coding region are translated by the promoter, while (2) the second coding region into which the restriction enzyme site is inserted is arranged so as to be effectively linked to the promoter. And when the first code area is in the same decoding frame as the second code area and is downstream of the second code area, the second code area and the second code area. First coding region following the are translated by the promoter, any case, the target protein encoded by the second coding region is expressed as a fusion protein with a polypeptide having molecular chaperone activity.
The expression vector of the present invention is located between a region having at least one restriction enzyme site into which the first coding region and the second coding region can be inserted, and is translated within the same reading frame to be a protease digestion site. It may have a region.
The protease digestion site is obtained by expressing an expression vector in which the second coding region is incorporated into the expression vector of the present invention, and is encoded by the polypeptide having molecular chaperone activity encoded by the first coding region and the second coding region. In the fusion protein to which the protein is bound, it becomes a peptide linker that connects the polypeptide and the protein. Since the obtained fusion protein has a protease digestion site, the fusion protein can be easily digested by the action of a protease, and a polypeptide having a molecular chaperone activity encoded by the first coding region and a second coding region can be obtained. A protein encoded by the target second coding region can be obtained by separating from the encoded protein.
The protease is not particularly limited, and examples thereof include thrombin, factor Xa, and precision protease. These proteases are commercially available from Pharmacia Biotech. It is also possible to cleave the target protein using the intein's self-protein splicing function.
The length of the base sequence encoding the protease digestion site is not particularly limited, but is preferably about 15 to 90 bases, and preferably contains many base sequences that are translated into neutral amino acids such as glycine and serine. .
The expression vector of the present invention may contain other known base sequences. The other known base sequences are not particularly limited. For example, a stability leader sequence that imparts stability of the expression product, a signal sequence that imparts secretion of the expression product, a neomycin resistance gene, a kanamycin resistance gene, chloramphenic acid. Examples thereof include a marking sequence capable of imparting phenotype selection in a transformed host such as a call resistance gene, an ampicillin resistance gene, and a hygromycin resistance gene.
The expression vector of the present invention may be designed in a form in which the obtained fusion protein binds to an immobilization carrier through an appropriate ligand. This can simplify the purification after expression. For example, when PPIase is used as a polypeptide having molecular chaperone activity, a carrier carrying FK506 or rapamycin or its related compound is supported for FKBP type PPIase, and cyclosporine or its related compound is supported for cyclophilin type PPIase. If the carrier is perbrin type PPIase, the purification of the fusion protein can be simplified by using each carrier carrying Juglone or a related compound thereof.
Further, when the expression vector of the present invention is designed to have a tag of about 6 histidine residues on the N-terminal side of the polypeptide having the molecular chaperone activity, the resulting fusion protein is a carrier chelated with a metal such as nickel. In addition, since it is bonded via a histidine residue, a host-derived protein and a fusion protein can be easily separated by using the carrier. Furthermore, by causing a protease to act on the fusion protein bound to the carrier, the protease digestion site is digested, and only the target protein can be easily released from the carrier.
If eluted with imidazole, the fusion protein can be released from the carrier without the action of protease. In addition to the histidine tag described above, glutathione-s-transferase or a part thereof is used as a tag and purified by affinity chromatography using glutathione resin, maltose-binding protein or a part thereof is used as a tag and purified using maltose resin, etc. Can also be used. In addition, affinity with an antibody can also be used. The various tags described above may be designed on either the N-terminal side or the C-terminal side of the fusion protein, or both. As these gene manipulation methods and affinity purification methods, methods known to those skilled in the art can be used.
By incorporating a gene encoding the target protein into the expression vector of the present invention as the second coding region and expressing it, the polypeptide having the molecular chaperone activity encoded by the first coding region and the second coding region are encoded. A fusion protein with a protein is obtained. Such a fusion protein containing the polypeptide having the molecular chaperone activity and the protein encoded by the second coding region is also one aspect of the present invention. Furthermore, when a linker peptide containing a protease digestion site is incorporated between the two, the target protein can be easily excised from the fusion protein by digesting the obtained fusion protein with a protease. For this reason, the fusion protein of the present invention preferably contains a protease digestion site.
The expression vector of the present invention is introduced into a host and used for expression of the target protein. Such a host containing the expression vector of the present invention is also one of the present invention.
The host is not particularly limited, and examples thereof include prokaryotes such as bacteria, yeasts, fungi, plants, insect cells, mammalian cells and the like. However, the characteristics of the host used and the expression vector must be compatible. For example, when expressing a fusion protein in a mammalian cell line, the expression vector can be grown in a mammalian cell such as a mouse metallothionein promoter or a mammalian cell such as a baculovirus promoter or vaccinia virus 7.5K promoter. It is preferable to use a promoter isolated from the virus.
Among these hosts, prokaryotes such as Escherichia coli are preferable.
The method for introducing the expression vector of the present invention into the host is not particularly limited, and various known methods can be used. For example, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome fusion, nuclear injection, virus or phage as transfection Infection and the like.
A large amount of fusion protein can be obtained by introducing the expression vector of the present invention into an appropriate host, culturing the host under appropriate conditions, and expressing the host. Such a method for producing the fusion protein of the present invention is also one aspect of the present invention.
In the method for producing the fusion protein of the present invention, the host encapsulating the expression vector of the present invention is cultured under the expression conditions of the expression vector and the fusion protein is expressed in the cytoplasm, or the expression vector of the present invention A host containing the expression vector obtained by providing a signal sequence by transcription and translation at the 5 ′ end of the 1 coding region or the 5 ′ end of the second coding region is obtained under the expression conditions of the expression vector. It is preferable to culture and express the fusion protein in the periplasm or medium, or to express the fusion protein in the expression vector of the present invention in a cell-free translation system.
When a gram-negative bacterium is used as a host, the expression of the fusion protein may be cytoplasm, expression in the periplasm or medium. Secretion expression of the fusion protein in the periplasm or medium by providing a region that is transcribed and translated into a signal sequence at the 5 ′ end of the first coding region or the 5 ′ end of the second coding region of the expression vector of the present invention. can do. When the fusion protein is expressed in the periplasm, the expression of the polypeptide encoded by the first coding region can be improved by using a polypeptide originally present in the membrane in the cell. Examples of the polypeptide originally present in the membrane in the cell include FkpA type PPIase, which is FKBP type PPIase, and SurA type PPIase, which is perbulin type PPIase. These PPIases are inherently present in the periplasm of Gram-negative bacteria and are proteins involved in protein folding.
When the protein encoded by the second coding region is a membrane protein, an antibody or the like, since these proteins are originally proteins expressed outside the cytoplasm, they are fused with the FkpA type PPIase or SurA type PPIase. If expressed, the expression is improved.
When the fusion protein is expressed in the cell-free translation system of the expression vector of the present invention, a cell-free translation system (Spirin, AS) using a bacterial or eukaryotic extract or the like without using a host cell. , 1991, Science 11, 2656-2664: Falcon, D. et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11, 2656-2664), the fusion protein of the present invention is expressed as a soluble protein.
In the method for producing a fusion protein of the present invention, it is preferable to recover the carrier after adsorbing the fusion protein to a carrier carrying macrolide, cyclosporine, juglone, or a similar compound that inhibits PPIase activity. .
The binding property between the PPIase having the molecular chaperone activity and the inhibitor is strong, and the expressed fusion protein can be purified using this affinity. For example, if a bead having a macrolide such as FK506 supported on an agarose gel carrier is used, a fusion protein with FKBP-type PPIase can be specifically bound. Similarly, in the case of a fusion protein with cyclophilin-type PPIase, purification can be simplified by using a carrier carrying cyclosporin, and in the case of a fusion protein with perbulin-type PPIase, using a carrier carrying juglone. Can do.
The target protein can be obtained by digesting the fusion protein obtained by the method for producing a fusion protein of the present invention with a protease that digests a protease digestion site. Such a method for producing a protein encoded by the second coding region is also one aspect of the present invention.
According to the present invention, a difficult-to-express protein that is originally expressed as an abnormal type can be converted into a natural type by linking the target protein together with a polypeptide having molecular chaperone activity with a peptide linker and expressing it as a fusion protein. It can be expressed in large quantities as a solution, and its productivity can be greatly improved. In addition, when the target protein is an antibody, according to the present invention, it is possible to easily prepare a recombinant antibody having a function without using an experimental animal, so that it is fused with other proteins or peptides. This makes it possible to prepare a large amount of highly functional antibodies.
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
（実施例１）超好熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＳ−１由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８）と融合するための発現ベクター構築
分子シャペロン活性を有するＴｃＦＫＢＰ１８（Ｉｄｅｎｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５７、４６５−、２００１年）の発現プラスミドｐＥＦＥ１−３（Ｉｉｄａ、Ｇｅｎｅ ２２２、２４９−、１９９８）を鋳型とし、そのＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子断片をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ用のプライマーとして、表１に示したＴｃＦｕ−Ｆ１及びＴｃＦｕ−Ｒ２を用いることにより増幅産物の両端に制限酵素サイトを設けた。一方、ＴｃＦＫＢＰ１８融合タンパク質をプロテアーゼによりＴｃＦＫＢＰ１８と目的タンパク質とに切断するためのリンカーをコードする塩基配列として、Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２及びその相補鎖を設計した。Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２は、その５’側にＳｐｅＩサイトを、３’側にＥｃｏＲＩサイトをそれぞれ有している（図１）。Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２は、トロンビン切断部分のＤＮＡ配列の下流には、ＢａｍＨＩサイト、ＮｄｅＩサイトを有しているため、目的タンパク質の遺伝子断片をこれらの制限酵素サイトを利用して導入することにより、ＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質を得ることができる（図１）。
上記ＴｃＦＫＢＰ１８の遺伝子断片と、トロンビン切断部分をコードするＤＮＡ断片とを、各々の制限酵素で処理し、あらかじめＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩにて処理したｐＥＴ２１ｄプラスミドＤＮＡ（ノバジェン社製）に、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子−Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆ２の順でライゲーションした。得られたＴｃＦＫＢＰ１８融合タンパク質発現用プラスミドをＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２とした。
大腸菌由来トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ（ＴＦ）と融合するための発現ベクターを構築するために、大腸菌Ｋ１２株から、終止コドンを除いたＴＦ遺伝子をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ用のプライマーとして、表１に示したＴＦ−Ｆ１及びＴＦ−Ｒ１を用いることにより増幅産物の両端に制限酵素サイトを設けた。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。一方、実施例１で調製したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を除いたベクターをアガロースゲル電気泳動にて精製した。ＴＦ遺伝子を含むｐＴ７ブルーＴベクターをＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、切り出されたＴＦ遺伝子を回収した。得られたＴＦ遺伝子と上記ベクターとをライゲーションし、ＴＦ遺伝子全長を含むベクターを回収した。これにより、実施例１のＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２におけるＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がＴＦ遺伝子に置き換わった、ＴＦ融合タンパク質発現系が構築できた。得られたＴＦ融合タンパク質発現用プラスミドをＴＦｆ２とした。
（実施例３）ヒト由来ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅと融合するための発現ベクター構築
ヒト由来ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ（ｈＦＫＢＰ５２）と融合するための発現ベクターを構築するために、ヒトｃＤＮＡライブラリーから、終止コドンを除いたＦＫＢＰ５２遺伝子をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ用のプライマーとして、表１に示したＦＫ５２−Ｆ１及びＦＫ５２−Ｒ１を用いることにより増幅産物の両端に制限酵素サイトを設けた。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。一方、実施例１で調製したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を除いたベクターをアガロースゲル電気泳動にて精製した。ｈＦＫＢＰ５２遺伝子を含むｐＴ７ブルーＴベクターをＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、切り出されたｈＦＫＢＰ５２遺伝子の断片を回収した。得られたｈＦＫＢＰ５２遺伝子断片と上記ベクターとをライゲーションし、ｈＦＫＢＰ５２遺伝子全長を含むベクターを回収した。これにより、実施例１のＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２におけるＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がｈＦＫＢＰ５２遺伝子に置き換わったｈＦＫＢＰ５２との融合タンパク質発現系が構築できた。得られたｈＦＫＢＰ５２融合タンパク質発現用プラスミドをＦＫ５２ｆ２とした。
（実施例４）ヒト由来ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅと融合するための発現ベクター構築
ヒト由来ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅ（ＣｙＰ４０）と融合するための発現ベクターを構築するために、ヒトｃＤＮＡライブラリーから、終止コドンを除いたｈＣｙＰ４０遺伝子をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ用のプライマーとして、表１に示したＣＰ４０−Ｆ１及びＣＰ４０−Ｒ１を用いることにより増幅産物の両端に制限酵素サイトを設けた。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。一方、実施例１で調製したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を除いたベクターをアガロースゲル電気泳動にて精製した。ｈＣｙＰ４０遺伝子を含むｐＴ７ブルーＴベクターをＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、切り出されたｈＣｙＰ４０遺伝子を回収した。得られたｈＣｙＰ４０遺伝子と上記ベクターとをライゲーションし、ｈＣｙＰ４０遺伝子全長を含むベクターを回収した。これにより、実施例１のＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２におけるＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がｈＣｙＰ４０遺伝子に置き換わったｈＣｙＰ４０との融合タンパク質発現系が構築できた。得られたｈＣｙＰ４０融合タンパク質発現用プラスミドをＣＰ４０ｆ２とした。
（実施例５）大腸菌由来ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅと融合するための発現ベクター構築
大腸菌由来ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ（ＦｋｐＡ）と融合するための発現ベクターを構築するために、大腸菌ＣＴＦ０７３株から、終止コドンを除いたＦｋｐＡ遺伝子をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ用のプライマーとして、表１に示したＦＫＰＡ−Ｆ１及びＦＫＰＡ−Ｒ１を用いることにより増幅産物の両端に制限酵素サイトを設けた。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。一方、実施例１で調製したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を除いたベクターをアガロースゲル電気泳動にて精製した。ＦｋｐＡ遺伝子を含むｐＴ７ブルーＴベクターをＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、切り出されたＦｋｐＡ遺伝子を回収した。得られたＦｋｐＡ遺伝子と上記ベクターとをライゲーションし、ＦｋｐＡ遺伝子全長を含むベクターを回収した。これにより、実施例１のＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２におけるＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がＦｋｐＡ遺伝子に置き換わったＦｋｐＡとの融合タンパク質発現系が構築できた。得られたＦｋｐＡ融合タンパク質発現用プラスミドをＦｋｐＡｆ２とした。
（実施例６）大腸菌由来ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅと融合するための発現ベクター構築
大腸菌由来ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ（ＳｕｒＡ）と融合するための発現ベクターを構築するために、大腸菌Ｋ１２株から、終止コドンを除いたＳｕｒＡ遺伝子をＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ用のプライマーとして、表１に示したＳＵＲ−Ｆ１及びＳＵＲ−Ｒ１を用いることにより増幅産物の両端に制限酵素サイトを設けた。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。一方、実施例１で調製したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を除いたベクターをアガロースゲル電気泳動にて精製した。ＳｕｒＡ遺伝子を含むｐＴ７ブルーＴベクターをＮｃｏＩ／ＳｐｅＩ処理し、切り出されたＳｕｒＡ遺伝子を回収した。得られたＳｕｒＡ遺伝子と上記ベクターとをライゲーションし、ＳｕｒＡ遺伝子全長を含むベクターを回収した。これにより、実施例１のＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２におけるＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がＳｕｒＡ遺伝子に置き換わったＳｕｒＡとの融合タンパク質発現系が構築できた。得られたＳｕｒＡ融合タンパク質発現用プラスミドをＳｕｒＡｆ２とした。
（実施例７）ＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２を用いたＴｃＦＫＢＰ１８の発現
実施例１で調製したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２によりＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株をトランスフォーメーションした。２Ｌの三角フラスコに２×ＹＴ培地（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒｕｃｔ １６ｇ／Ｌ、ＢＡＣＴＯ ＴＲＹＰＴＯＮ ２０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、アンピシリン １００μｇ／ｍＬ、ｐＨ７．５）７００ｍＬを入れ、組み換え大腸菌２〜３白金耳を接種した。３５℃で２４時間回転培養（１１０ｒｐｍ）した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）にて菌体を回収した。得られた菌体は１ｍＭ ＥＤＴＡを含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＬに懸濁し、−２０℃にて凍結保存した。
得られた菌液を超音波破砕後、遠心分離し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分）に分離した。沈殿画分は、更に封入体画分に精製するため、４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁後、３０分間反応させることで膜成分を可溶化し、遠心分離にて沈殿する封入体成分を回収した。この操作を２回繰り返し、得られた沈殿部を封入体画分とした。可溶性画分１０μｇと、それに相当する封入体画分の容量をそれぞれ１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果、ＴｃＦＫＢＰ１８に相当するバンドは、可溶性画分のみに見られた。本来ＴｃＦＫＢＰ１８が検出させる位置よりも見かけ上高分子量の位置に検出されたが（図２）、これは、ＴｃＦＫＢＰ１８の構造遺伝子の３’末端に終止コドンが存在せず、マルチクローニングサイトが存在するため、その翻訳産物がＴｃＦＫＢＰ１８のＣ末端に連なっているためであると考えられる。
（実施例８）ＴｃＦＫＢＰ１８とマウス由来ａｎｔｉ−ニワトリリゾチーム（ＨＥＬ）Ｆａｂ抗体フラグメント（Ｄ１．３）からなる融合タンパク質の発現
マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ Ｆａｂ抗体フラグメントの発現プラスミド ｐＥＨＥＬＦａｂ−１（Ｉｄｅｎｏ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８、４６４−、２００２）をＮｄｅＩ／Ｂｐｕ１１０２Ｉにより処理し、アガローズゲルを用いた電気泳動法により、ａｎｔｉ−ＨＥＬ Ｆａｂ抗体フラグメント遺伝子断片を精製した。あらかじめＮｄｅＩ／Ｂｐｕ１１０２Ｉ処理しておいたＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２に、このＤＮＡ断片をライゲーションした。この結果得られたプラスミドを発現すると、上記Ｆａｂの重鎖部分はＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質として発現され、軽鎖部分は融合タンパク質になることなく、単独で発現することとなる。得られたプラスミドを、実施例７と同様の方法で大腸菌に組み込み、そのトランスフォーマントを取得した。本菌を実施例７と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。
得られた菌液を超音波破砕後、遠心分離し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分）に分離し、実施例７と同様の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による染色と、ウサギ由来抗Ｄ１．３抗体を１次抗体として用いたウエスタンブロッティング法により、発現したＦａｂを特異的に検出した。
宿主菌である大腸菌の可溶性画分及び沈殿画分には、ＣＢＢ染色、ウエスタンブロッティングによる検出のいずれにおいても、ＦａｂとＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質に相当するバンドは見られなかった（図３）。一方、ＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質として発現させた場合、ＣＢＢ染色において、Ｆａｂの重鎖部分はＴｃＦＫＢＰ１８と融合した形態で可溶画分にメジャーバンドとして発現されることが示され、ウエスタンブロッティングにおいても、確かにＦａｂが大量に発現していることが明らかとなった（図４）。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約１０％であった。それに対し、Ｆａｂの軽鎖部分に相当するバンドは見られなかった。ウエスタンブロッティングの結果より、Ｆａｂの軽鎖は宿主由来のプロテアーゼで分解していると考えられた（図４）。
（比較例１）マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ Ｆａｂ抗体フラグメントの単体での発現
マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ Ｆａｂ抗体フラグメントの発現プラスミド ｐＥＨＥＬＦａｂ−１を実施例７と同様の方法で大腸菌に組み込み、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＣＢＢ染色及びウエスタンブロッティングの結果、Ｆａｂ遺伝子は、単独では可溶画分への発現は見られず、すべて沈殿画分に発現することが確認された（図５）。
（実施例９）マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質の発現
マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖフラグメントの発現プラスミドｐＡＡＬＳＣ（伊庭ら １９９７、Ｇｅｎｅ １９４、３５−）を鋳型とし、表１に示したＳＣＦ−Ｆ３及びＳＣＦ−Ｒ３をプライマーして用いるＰＣＲにより、マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖフラグメントの遺伝子を増幅した。この遺伝子をＴＡクローニングにより、ｐＴ７ブルーベクターにライゲーションし、ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理後、あらかじめ同制限酵素により処理しておいたＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２に再度ライゲーションすることで、ＴｃＦＫＢＰ１８とｓｃＦｖとの融合タンパク質発現系を構築した。得られたプラスミドを、実施例７と同様の方法で大腸菌に組み込み、そのトランスフォーマントを取得した。本菌を実施例７と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。得られた菌液を実施例７と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにて染色した。
宿主菌である大腸菌の可溶性画分及び沈殿画分には、ＣＢＢ染色においてマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質に相当するバンドは見られなかった（図６Ａ）。一方、ＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質として発現させた場合、マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖはＴｃＦＫＢＰ１８と融合した形態で可溶画分にメジャーバンドとして大量に発現されることが示された（図６Ｂ）。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約１４％であった。
（比較例２）マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖの単体での発現
実施例９で得られたマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖ遺伝子を含むｐＴ７ブルーベクターをＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理後、あらかじめ同制限酵素により処理しておいたｐＥＴ２１ａ（ノバジェン社製）に再度ライゲーションすることで、マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖの発現系を構築した。得られた発現プラスミドを実施例９と同様の方法で大腸菌に組み込み、そのトランスフォーマントを取得した。本菌を実施例７と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。得られた菌液を実施例７に示した方法と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにて染色した。その結果、マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖは可溶画分にはほとんど発現せず、ほとんどが不溶性画分に発現することが確認された（図６Ｃ）。
（実施例１０）マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとＴＦとの融合タンパク質の発現
実施例９で調製したマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖフラグメントを含むｐＴ７ブルーベクターのＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理ＤＮＡ断片を、あらかじめ同制限酵素により処理しておいた実施例２のＴＦｆ２にライゲーションすることにより、ＴＦとｓｃＦｖとの融合タンパク質発現系を構築した。得られたプラスミドを、実施例７と同様の方法で大腸菌に組み込み、そのトランスフォーマントを取得した。本菌を実施例７と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。得られた菌液を実施例７と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにて染色した。比較例２で示したように、ｓｃＦｖ単独で発現させた場合にはｓｃＦｖは不溶性画分に発現したのに対し、ＴＦと融合発現させた場合、可溶性画分に大量に発現されることがわかった。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約７％であった。
（実施例１１）マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとｈＦＫＢＰ５２との融合タンパク質の発現
実施例９で調製したＴｃＦＫＢＰ１８とｓｃＦｖとの融合タンパク質発現ベクターをＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ処理し、ｓｃＦｖフラグメントを含むＤＮＡ断片を調製した。あらかじめ同制限酵素により処理しておいた実施例３のＦＫ５２ｆ２に上記ＤＮＡ断片をライゲーションすることにより、ｈＦＫＢＰ５２とｓｃＦｖとの融合タンパク質発現系を構築した。得られたプラスミドを、実施例７と同様の方法で大腸菌に組み込み、そのトランスフォーマントを取得した。本菌を実施例７と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。得られた菌液を実施例７と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにて染色した。ｈＦＫＢＰ５２と融合発現させた場合、可溶性画分に大量に発現されることがわかった。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約９％であった。
（実施例１２）マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとｈＣｙＰ４０との融合タンパク質の発現
実施例１１のＦＫ５２ｆ２の代わりに、実施例４で調製したＣＰ４０ｆ２を用いたこと以外は実施例１１と同様の方法でｈＣｙＰ４０とｓｃＦｖとの融合タンパク質を発現させた。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約１１％であった。
（実施例１３） ヒト由来セロトニンレセプターとＦｋｐＡとの融合タンパク質の発現
７回膜貫通型膜タンパク質の一つであるヒト由来セロトニンレセプター（ＨＴ１ａレセプター）と大腸菌由来ＦｋｐＡとの融合タンパク質発現系を構築するためにヒトｃＤＮＡライブラリーからＨＴ１ａレセプター遺伝子のクローニングを行った。すなわち、ＮＣＢＩコード：ＨＳＳＥＲＲ５１として登録されている塩基配列情報を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型としたＰＣＲにより、ＨＴ１ａレセプター遺伝子を増幅した。
ＨＴ１ａのアミノ酸配列を配列番号１３に示し、塩基配列を配列番号１４に示した。プライマーには５‘側にＮｄｅＩ制限酵素サイトを、３’側にＮｏｔＩ制限酵素サイトをそれぞれ設けた。ＰＣＲ産物をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、シーケンスが登録情報と相違ないことを確認した。ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理により、ＨＴ１ａ遺伝子を含むＤＮＡ断片を切断・精製後、あらかじめＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理しておいた実施例５のＦｋｐＡｆ２にライゲーションし、ＨＴ１ａ遺伝子を含むベクターを回収した。得られたＦｋｐＡとＨＴ１ａとの融合タンパク質発現ベクターを実施例７と同様の方法で大腸菌に組み込み、そのトランスフォーマントを取得した。本菌を実施例７と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。得られた菌液を超音波破砕後、３０００ｒｐｍにて遠心分離し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分）に分画した。実施例７と同様の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による染色と、抗セロトニンレセプター抗体を用いたウエスタンブロッティング法により、発現したＨＴ１ａを特異的に検出した。その結果、ＣＢＢ染色において、ＨＴ１ａはＦｋｐＡと融合した形態で可溶画分に発現されることが示され、ウエスタンブロッティングにおいても、確かに発現していることが確認された。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約２％であった。
（実施例１４） ヒト由来セロトニンレセプターとＳｕｒＡとの融合タンパク質の発現
実施例１３のＦｋｐＡｆ２の代わりに、実施例６で調製したＳｕｒＡｆ２を用いたこと以外は実施例１３と同様の方法でＳｕｒＡとＨＴ１ａとの融合タンパク質を発現させた。
実施例７と同様の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による染色と、抗セロトニンレセプター抗体を用いたウエスタンブロッティング法により発現したＨＴ１ａを特異的に検出したところ、ＣＢＢ染色において、ＨＴ１ａはＳｕｒＡと融合した形態で可溶画分に発現されることが示され、ウエスタンブロッティングにおいても、確かに発現していることが確認された。ＣＢＢ染色において、可溶性画分に発現した融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約２％であった。
（実施例１５）マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質の精製
実施例９で得られた可溶性画分を下記の（ａ）及び（ｂ）の陰イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過の順でカラム精製を繰り返すことにより、マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質をほぼ単一にまで精製した。精製の結果得られた融合タンパク質の量は、培地１Ｌあたり約５０ｍｇであった。
（ａ）ＤＥＡＥ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ｃｏｌｕｍｎ（１６ｍｍ×６０ｃｍ；東ソー社製）
Ａ液：２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ 緩衝液（ｐＨ６．８）
Ｂ液：０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ６．８）
（０−３００分：Ｂ液０−１００％の直線グラジエント、３００−４２０分：Ｂ液１００％）
流速：１ｍＬ／分
（ｂ）ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ ｃｏｌｕｍｎ（２６ｍｍ×６０ｃｍ；アマシャムファルマシア社製）
溶離液：１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０；０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有）
流速：３ｍＬ／分
（実施例１６） 融合タンパク質のトロンビンによる切断
実施例１５で精製した融合タンパク質１ｍｇ当たりに、１０Ｕのトロンビンを加え、２２℃にて１６時間処理することにより、融合タンパク質のトロンビンサイトを切断した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、融合タンパク質は確かにマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとＴｃＦＫＢＰ１８とに切断されたことが確認された（図７）。
（実施例１７）ＥＬＩＳＡによるマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖの機能確認
発現で得られたマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖの機能は、ニワトリリゾチームを抗原とするＥＬＩＳＡ法において、１次抗体として機能するか否かで評価した。即ち、９６穴プレートに５０μｇ／ｍＬニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）溶液１００μＬを添加し、３０℃にて３時間インキュベーションすることにより、ＨＥＬをプレート上に固定化した。ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）にてプレートを洗浄後、ブロックエース（大日本製薬社製）を含むＴＢＳ緩衝液でブロッキングした（４℃、オーバーナイト）。ＴＢＳにて洗浄後、実施例１６で得られたマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖ ２４μｇを含むＴＢＳ（１０％ブロックエース含有）を用い、室温にて３時間インキュベートした。ＴＢＳにて洗浄後、２次抗体としてＡｎｔｉ−マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（フナコシ社製）を含むＴＢＳ緩衝液でインキュベート（２時間、３０℃）した。ＴＢＳにて洗浄後、ＨＲＰの基質としてＡＢＴＳ液（フナコシ社製）１００μＬを加え、３０分間インキュベートし、ＯＤ４０５を測定した。得られた結果を図８に示した。プレートに固定したＨＥＬ濃度に応じて、吸光度が増大することから（▲）、得られたｓｃＦｖが抗原と結合していることが確認された。一方、ＨＥＬの代わりに同濃度のキモトリプシンインヒビター（□）を用いた場合、吸光度の上昇は見られなかった。このことは発現して得られた抗体が特異的に抗原に結合することを示していると思われる。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
Example 1 Hyperthermophilic archaeon Thermococcus sp. Expression vector construction for fusing with KS-1-derived short type FKBP type PPIase (TcFKBP18) Expression plasmid pEFE1-3 (Iida, Gene) of TcFKBP18 (Ideno, Biochem. J.357, 465, 2001) having molecular chaperone activity 222, 249-, 1998) was used as a template, and the TcFKBP18 gene fragment was amplified by PCR. By using TcFu-F1 and TcFu-R2 shown in Table 1 as primers for PCR, restriction enzyme sites were provided at both ends of the amplified product. On the other hand, Throm-F2 and its complementary strand were designed as a base sequence encoding a linker for cleaving the TcFKBP18 fusion protein into TcFKBP18 and the target protein with a protease. Throm-F2 has a SpeI site on its 5 ′ side and an EcoRI site on its 3 ′ side (FIG. 1). Since Throm-F2 has a BamHI site and an NdeI site downstream of the DNA sequence of the thrombin cleavage site, by introducing a gene fragment of the target protein using these restriction enzyme sites, TcFKBP18 and Can be obtained (FIG. 1).
The above TcFKBP18 gene fragment and the DNA fragment encoding the thrombin cleavage site were treated with the respective restriction enzymes and previously treated with NcoI / EcoRI to pET21d plasmid DNA (manufactured by Novagen), TcFKBP18 gene-Thermo-F2 Ligated in this order. The obtained plasmid for expressing TcFKBP18 fusion protein was designated as TcFKfusion2.
Example 3 Construction of Expression Vector for Fusion with Human-derived FKBP52 Type PPIase To construct an expression vector for fusion with human-derived FKBP52 type PPIase (hFKBP52), the stop codon was removed from the human cDNA library. The FKBP52 gene was amplified by PCR. By using FK52-F1 and FK52-R1 shown in Table 1 as PCR primers, restriction enzyme sites were provided at both ends of the amplified product. After inserting the PCR product into the pT7 blue T vector, it was confirmed that the sequence was not different from the registration information. On the other hand, TcFKfusion2 prepared in Example 1 was treated with NcoI / SpeI, and a vector excluding the TcFKBP18 gene was purified by agarose gel electrophoresis. The pT7 blue T vector containing the hFKBP52 gene was treated with NcoI / SpeI, and the excised hFKBP52 gene fragment was recovered. The obtained hFKBP52 gene fragment and the above vector were ligated, and a vector containing the full length of the hFKBP52 gene was recovered. Thereby, a fusion protein expression system with hFKBP52 in which the TcFKBP18 gene in TcFKfusion2 of Example 1 was replaced with the hFKBP52 gene could be constructed. The obtained plasmid for expressing hFKBP52 fusion protein was designated as FK52f2.
(Example 4) Expression vector construction for fusing with human-derived CyP40 type PPIase To construct an expression vector for fusing with human-derived CyP40 type PPIase (CyP40), the stop codon was removed from the human cDNA library. The hCyP40 gene was amplified by PCR. By using CP40-F1 and CP40-R1 shown in Table 1 as primers for PCR, restriction enzyme sites were provided at both ends of the amplified product. After inserting the PCR product into the pT7 blue T vector, it was confirmed that the sequence was not different from the registration information. On the other hand, TcFKfusion2 prepared in Example 1 was treated with NcoI / SpeI, and a vector excluding the TcFKBP18 gene was purified by agarose gel electrophoresis. The pT7 blue T vector containing the hCyP40 gene was treated with NcoI / SpeI, and the excised hCyP40 gene was recovered. The obtained hCyP40 gene and the above vector were ligated, and a vector containing the full length of the hCyP40 gene was recovered. Thus, a fusion protein expression system with hCyP40 in which the TcFKBP18 gene in TcFKfusion 2 of Example 1 was replaced with the hCyP40 gene could be constructed. The obtained plasmid for expressing hCyP40 fusion protein was designated as CP40f2.
(Example 5) Construction of expression vector for fusing with E. coli-derived FkpA type PPIase To construct an expression vector for fusing with E. coli-derived FkpA type PPIase (FkpA), FkpA from which E. coli CTF073 was deleted was used. The gene was amplified by PCR. By using FKPA-F1 and FKPA-R1 shown in Table 1 as PCR primers, restriction enzyme sites were provided at both ends of the amplified product. After inserting the PCR product into the pT7 blue T vector, it was confirmed that the sequence was not different from the registration information. On the other hand, TcFKfusion2 prepared in Example 1 was treated with NcoI / SpeI, and a vector excluding the TcFKBP18 gene was purified by agarose gel electrophoresis. The pT7 blue T vector containing the FkpA gene was treated with NcoI / SpeI, and the excised FkpA gene was recovered. The obtained FkpA gene and the above vector were ligated, and a vector containing the full length FkpA gene was recovered. Thus, a fusion protein expression system with FkpA in which the TcFKBP18 gene in TcFKfusion 2 of Example 1 was replaced with the FkpA gene could be constructed. The obtained FkpA fusion protein expression plasmid was designated as FkpAf2.
(Example 6) Construction of expression vector for fusing with E. coli-derived SurA type PPIase To construct an expression vector for fusing with E. coli-derived SurA type PPIase (SurA), SurA from which the stop codon was removed from E. coli K12 strain The gene was amplified by PCR. By using SUR-F1 and SUR-R1 shown in Table 1 as primers for PCR, restriction enzyme sites were provided at both ends of the amplified product. After inserting the PCR product into the pT7 blue T vector, it was confirmed that the sequence was not different from the registration information. On the other hand, TcFKfusion2 prepared in Example 1 was treated with NcoI / SpeI, and a vector excluding the TcFKBP18 gene was purified by agarose gel electrophoresis. The pT7 blue T vector containing the SurA gene was treated with NcoI / SpeI, and the excised SurA gene was recovered. The obtained SurA gene and the above vector were ligated, and a vector containing the entire SurA gene was recovered. Thereby, a fusion protein expression system with SurA in which the TcFKBP18 gene in TcFKfusion 2 of Example 1 was replaced with the SurA gene could be constructed. The obtained SurA fusion protein expression plasmid was named SurAf2.
(Example 7) Expression of TcFKBP18 using TcFKfusion2 By TcFKfusion2 prepared in Example 1, coli BL21 (DE3) strain was transformed. 700 mL of 2 × YT medium (Yeast Extract 16 g / L, BACTO TRYPTON 20 g / L, NaCl 5 g / L, ampicillin 100 μg / mL, pH 7.5) was placed in a 2 L Erlenmeyer flask and inoculated with 2 to 3 platinum ears of recombinant E. coli. . After rotating culture (110 rpm) at 35 ° C. for 24 hours, the cells were collected by centrifugation (10000 rpm × 10 min). The obtained microbial cells were suspended in 20 mL of 25 mM HEPES buffer (pH 6.8) containing 1 mM EDTA and stored frozen at −20 ° C.
The obtained bacterial solution was subjected to ultrasonic disruption and then centrifuged to separate into a supernatant (soluble fraction) and a precipitate (precipitate fraction). To further purify the precipitate fraction into an inclusion body fraction, the membrane components can be obtained by suspending in 25 mM HEPES / 1 mM EDTA buffer (pH 6.8) containing 4% Triton X-100 and reacting for 30 minutes. Inclusion body components that were solubilized and precipitated by centrifugation were collected. This operation was repeated twice, and the resulting precipitate was used as an inclusion body fraction. A volume of 10 μg of the soluble fraction and the volume of the inclusion body fraction corresponding thereto were each subjected to 16% SDS-PAGE. As a result, a band corresponding to TcFKBP18 was found only in the soluble fraction. Originally, it was detected at a higher molecular weight than the position detected by TcFKBP18 (FIG. 2). This is because there is no stop codon at the 3 ′ end of the structural gene of TcFKBP18 and there is a multiple cloning site. The translation product is considered to be linked to the C-terminus of TcFKBP18.
(Example 8) Expression of fusion protein consisting of TcFKBP18 and mouse-derived anti-chicken lysozyme (HEL) Fab antibody fragment (D1.3) Expression plasmid of mouse-derived anti-HEL Fab antibody fragment pEHELFab-1 (Ideno, Appl. Env) Microbiol.68, 464-, 2002) was treated with NdeI / Bpu1102I, and the anti-HEL Fab antibody fragment gene fragment was purified by electrophoresis using an agarose gel. This DNA fragment was ligated to TcFKfusion2 previously treated with NdeI / Bpu1102I. When the resulting plasmid is expressed, the heavy chain portion of the Fab is expressed as a fusion protein with TcFKBP18, and the light chain portion is expressed alone without becoming a fusion protein. The obtained plasmid was incorporated into Escherichia coli in the same manner as in Example 7 to obtain the transformant. The bacterium was cultured and collected in the same manner as in Example 7, and stored frozen at -20 ° C.
The obtained bacterial solution was sonicated and then centrifuged, separated into its supernatant (soluble fraction) and precipitate (precipitate fraction), and subjected to SDS-PAGE by the same method as in Example 7. The SDS-PAGE gel specifically detected the expressed Fab by staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) and Western blotting using a rabbit-derived anti-D1.3 antibody as a primary antibody.
No band corresponding to the fusion protein of Fab and TcFKBP18 was observed in the soluble fraction and the precipitated fraction of E. coli, which is the host strain, in both CBB staining and detection by Western blotting (FIG. 3). On the other hand, when expressed as a fusion protein with TcFKBP18, the heavy chain portion of Fab was shown to be expressed as a major band in the soluble fraction in a form fused with TcFKBP18 in CBB staining. It was clarified that Fab was certainly expressed in large quantities (FIG. 4). In CBB staining, the band density of the fusion protein expressed in the soluble fraction was measured with a densitometer. As a result, it was about 10% of the total soluble protein derived from Escherichia coli. On the other hand, no band corresponding to the light chain part of Fab was observed. From the results of Western blotting, it was considered that the Fab light chain was degraded by a host-derived protease (FIG. 4).
(Comparative Example 1) Expression of mouse-derived anti-HEL Fab antibody fragment alone Expression plasmid of mouse-derived anti-HEL Fab antibody fragment pEHELFab-1 was incorporated into Escherichia coli in the same manner as in Example 7 and subjected to SDS-PAGE. did. As a result of CBB staining and Western blotting, it was confirmed that the Fab gene alone was not expressed in the soluble fraction and was expressed in the precipitated fraction (FIG. 5).
(Example 9) Expression of fusion protein of mouse-derived anti-HEL scFv and TcFKBP18 Expression plasmid pAALSC (Iba et al. 1997, Gene 194, 35-) of mouse-derived anti-HEL scFv fragment was used as a template and shown in Table 1. The gene of mouse-derived anti-HEL scFv fragment was amplified by PCR using SCF-F3 and SCF-R3 as primers. This gene was ligated to the pT7 blue vector by TA cloning, treated with NdeI / NotI, and then ligated again to TcFKfusion2 that had been treated with the same restriction enzyme, thereby constructing a fusion protein expression system of TcFKBP18 and scFv. . The obtained plasmid was incorporated into Escherichia coli in the same manner as in Example 7 to obtain the transformant. The bacterium was cultured and collected in the same manner as in Example 7, and stored frozen at -20 ° C. The obtained bacterial solution was subjected to SDS-PAGE in the same manner as in Example 7, and stained with CBB.
In the soluble fraction and the precipitated fraction of Escherichia coli, which is the host fungus, no band corresponding to the fusion protein of mouse-derived anti-HEL scFv and TcFKBP18 was observed in CBB staining (FIG. 6A). On the other hand, when expressed as a fusion protein with TcFKBP18, it was shown that mouse-derived anti-HEL scFv was expressed in a large amount as a major band in the soluble fraction in a form fused with TcFKBP18 (FIG. 6B). In CBB staining, the band density of the fusion protein expressed in the soluble fraction was measured with a densitometer. As a result, it was about 14% of the total soluble protein derived from E. coli.
(Comparative Example 2) Expression of mouse-derived anti-HEL scFv alone A pT7 blue vector containing the mouse-derived anti-HEL scFv gene obtained in Example 9 was treated with NdeI / NotI in advance and then treated with the same restriction enzyme. By ligating again to Oita pET21a (manufactured by Novagen), a mouse-derived anti-HEL scFv expression system was constructed. The obtained expression plasmid was incorporated into Escherichia coli in the same manner as in Example 9, and the transformant was obtained. The bacterium was cultured and collected in the same manner as in Example 7, and stored frozen at -20 ° C. The obtained bacterial solution was subjected to SDS-PAGE in the same manner as in Example 7, and stained with CBB. As a result, it was confirmed that the mouse-derived anti-HEL scFv was hardly expressed in the soluble fraction and was mostly expressed in the insoluble fraction (FIG. 6C).
(Example 10) Expression of fusion protein of mouse-derived anti-HEL scFv and TF The NdeI / NotI-treated DNA fragment of the pT7 blue vector containing the mouse-derived anti-HEL scFv fragment prepared in Example 9 was prepared in advance with the same restriction enzyme. The TF and scFv fusion protein expression system was constructed by ligating to TFf2 of Example 2 that had been treated by the above. The obtained plasmid was incorporated into Escherichia coli in the same manner as in Example 7 to obtain the transformant. The bacterium was cultured and collected in the same manner as in Example 7, and stored frozen at -20 ° C. The obtained bacterial solution was subjected to SDS-PAGE in the same manner as in Example 7, and stained with CBB. As shown in Comparative Example 2, it was found that scFv was expressed in the insoluble fraction when expressed with scFv alone, whereas it was expressed in a large amount in the soluble fraction when fused with TF. It was. In CBB staining, the band density of the fusion protein expressed in the soluble fraction was measured with a densitometer. As a result, it was about 7% of the total soluble protein derived from Escherichia coli.
(Example 11) Expression of fusion protein of mouse-derived anti-HEL scFv and hFKBP52 The fusion protein expression vector of TcFKBP18 and scFv prepared in Example 9 was treated with SpeI / NotI to prepare a DNA fragment containing scFv fragment. . A fusion protein expression system of hFKBP52 and scFv was constructed by ligating the DNA fragment to FK52f2 of Example 3 previously treated with the same restriction enzyme. The obtained plasmid was incorporated into Escherichia coli in the same manner as in Example 7 to obtain the transformant. The bacterium was cultured and collected in the same manner as in Example 7, and stored frozen at -20 ° C. The obtained bacterial solution was subjected to SDS-PAGE in the same manner as in Example 7, and stained with CBB. It was found that when fused with hFKBP52, it was expressed in a large amount in the soluble fraction. In CBB staining, the band density of the fusion protein expressed in the soluble fraction was measured with a densitometer. As a result, it was about 9% of the total soluble protein derived from E. coli.
(Example 12) Expression of fusion protein of mouse-derived anti-HEL scFv and hCyP40 hCyP40 was prepared in the same manner as in Example 11 except that CP40f2 prepared in Example 4 was used instead of FK52f2 in Example 11. And a scFv fusion protein were expressed. In CBB staining, the band density of the fusion protein expressed in the soluble fraction was measured with a densitometer. As a result, it was about 11% of the total soluble protein derived from Escherichia coli.
(Example 13) Expression of fusion protein of human-derived serotonin receptor and FkpA A fusion protein expression system of human-derived serotonin receptor (HT1a receptor), one of seven transmembrane membrane proteins, and FkpA derived from E. coli is constructed. Therefore, the HT1a receptor gene was cloned from a human cDNA library. Specifically, primers for PCR were designed based on the nucleotide sequence information registered as NCBI code: HSSERR51, and the HT1a receptor gene was amplified by PCR using a human cDNA library as a template.
The amino acid sequence of HT1a is shown in SEQ ID NO: 13, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 14. The primer was provided with an NdeI restriction enzyme site on the 5 ′ side and a NotI restriction enzyme site on the 3 ′ side. After inserting the PCR product into the pT7 blue T vector, it was confirmed that the sequence was not different from the registration information. The DNA fragment containing the HT1a gene was cleaved and purified by NdeI / NotI treatment, and then ligated to FkpAf2 of Example 5 that had been treated with NdeI / NotI in advance, and the vector containing the HT1a gene was recovered. The obtained fusion protein expression vector of FkpA and HT1a was incorporated into E. coli in the same manner as in Example 7 to obtain a transformant. The bacterium was cultured and collected in the same manner as in Example 7, and stored frozen at -20 ° C. The obtained bacterial solution was sonicated and centrifuged at 3000 rpm, and fractionated into a supernatant (soluble fraction) and a precipitate (precipitate fraction). SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 7, and expressed HT1a was specifically detected by staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) and Western blotting using an anti-serotonin receptor antibody. As a result, it was shown in CBB staining that HT1a is expressed in the soluble fraction in a form fused with FkpA, and it was confirmed that it was expressed in Western blotting. In CBB staining, the band density of the fusion protein expressed in the soluble fraction was measured with a densitometer. As a result, it was about 2% of the total soluble protein derived from Escherichia coli.
(Example 14) Expression of fusion protein of human-derived serotonin receptor and SurA SurA and HT1a were prepared in the same manner as in Example 13 except that SurAf2 prepared in Example 6 was used instead of FkpAf2 in Example 13. And a fusion protein was expressed.
When subjected to SDS-PAGE by the same method as in Example 7, HT1a expressed by Western blotting using anti-serotonin receptor antibody and staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) was specifically detected. HT1a was shown to be expressed in the soluble fraction in a form fused with SurA, and was confirmed to be expressed even in Western blotting. In CBB staining, the band density of the fusion protein expressed in the soluble fraction was measured with a densitometer. As a result, it was about 2% of the total soluble protein derived from Escherichia coli.
(Example 15) Purification of fusion protein of mouse-derived anti-HEL scFv and TcFKBP18 The soluble fraction obtained in Example 9 was subjected to anion exchange chromatography and gel filtration in the following order (a) and (b). By repeating the column purification, the fusion protein of mouse-derived anti-HEL scFv and TcFKBP18 was purified to almost single. The amount of the fusion protein obtained as a result of purification was about 50 mg per liter of medium.
(A) DEAE Toyopearl column (16 mm × 60 cm; manufactured by Tosoh Corporation)
Solution A: 25 mM HEPES-KOH buffer (pH 6.8)
Solution B: 25 mM HEPES-KOH buffer solution (pH 6.8) containing 0.5 M NaCl
(0-300 minutes: linear gradient of solution B 0-100%, 300-420 minutes: solution B 100%)
Flow rate: 1 mL / min (b) HiLoad 26/60 Superdex 200 pg column (26 mm × 60 cm; manufactured by Amersham Pharmacia)
Eluent: 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0; containing 0.15 M NaCl)
Flow rate: 3 mL / min (Example 16) Cleavage of the fusion protein with thrombin By adding 10 U of thrombin per 1 mg of the fusion protein purified in Example 15, and treating at 22 ° C for 16 hours, the thrombin site of the fusion protein Was cut off. As a result of SDS-PAGE, it was confirmed that the fusion protein was indeed cleaved into mouse-derived anti-HEL scFv and TcFKBP18 (FIG. 7).
(Example 17) Confirmation of the function of mouse-derived anti-HEL scFv by ELISA Whether the function of mouse-derived anti-HEL scFv obtained by expression functions as a primary antibody in an ELISA method using chicken lysozyme as an antigen It was evaluated with. That is, 100 μL of a 50 μg / mL chicken egg white lysozyme (HEL) solution was added to a 96-well plate and incubated at 30 ° C. for 3 hours to immobilize HEL on the plate. The plate was washed with TBS buffer (pH 7.0) and then blocked with TBS buffer containing Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) (4 ° C., overnight). After washing with TBS, TBS (containing 10% block ace) containing 24 μg of mouse-derived anti-HEL scFv obtained in Example 16 was used and incubated at room temperature for 3 hours. After washing with TBS, the mixture was incubated with TBS buffer containing Anti-mouse IgG-HRP conjugate (Funakoshi) as a secondary antibody (2 hours, 30 ° C.). After washing with TBS, 100 μL of ABTS solution (manufactured by Funakoshi) was added as a substrate for HRP, incubated for 30 minutes, and OD405 was measured. The obtained results are shown in FIG. Since the absorbance increased according to the concentration of HEL immobilized on the plate (A), it was confirmed that the obtained scFv was bound to the antigen. On the other hand, when the same concentration of chymotrypsin inhibitor (□) was used instead of HEL, no increase in absorbance was observed. This seems to indicate that the antibody obtained by expression specifically binds to the antigen.
本発明は、上述の構成よりなるので、これまでバクテリアや酵母、昆虫細胞等を用いたタンパク質発現系において問題となっていた封入体の形成を防ぎ、正常型タンパク質を可溶性画分に大量に発現させることを可能とする。これにより、従来のようにインビトロで封入体を正常型タンパク質にリフォールディングするといった手間が不要となる。 Since the present invention has the above-described configuration, it prevents the formation of inclusion bodies that have been problematic in protein expression systems using bacteria, yeast, insect cells, etc., and expresses a normal protein in a large amount in a soluble fraction. It is possible to make it. This eliminates the trouble of refolding inclusion bodies into normal proteins in vitro as in the prior art.
図１は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＫＳ−１由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質を作成するためのベクターＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２の遺伝子配置を示す図である。
図２は、ＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２を用いた場合のＴｃＦＫＢＰ１８の発現を示す図である。
図３は、宿主由来のタンパク質の電気泳動パターンを示す図である。
図４は、マウス由来ａｎｔｉ−ニワトリリゾチーム（ＨＥＬ）Ｆａｂ抗体フラグメントとＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質の発現を示す図である。
図５は、マウス由来ａｎｔｉ−ニワトリリゾチーム（ＨＥＬ）Ｆａｂ抗体フラグメントの単体での発現を示す図である。
図６は、マウス由来ａｎｔｉ−ニワトリリゾチーム（ＨＥＬ）ｓｃＦｖフラグメント及びそのＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質の発現を示す図である。
図７は、精製したマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖとＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質と、それをトロンビン処理した結果を示す図である。
図８は、発現の結果得られたマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖの活性をＥＬＩＳＡ法により示した図である。FIG. 1 shows Thermococcus sp. It is a figure which shows the gene arrangement | positioning of vector TcFKfusion2 for creating a fusion protein with KS-1-derived short type FKBP type PPIase.
FIG. 2 is a diagram showing the expression of TcFKBP18 when TcFKfusion2 is used.
FIG. 3 is a diagram showing an electrophoresis pattern of a protein derived from a host.
FIG. 4 is a diagram showing expression of a fusion protein of a mouse-derived anti-chicken lysozyme (HEL) Fab antibody fragment and TcFKBP18.
FIG. 5 is a view showing the expression of a mouse-derived anti-chicken lysozyme (HEL) Fab antibody fragment alone.
FIG. 6 is a view showing expression of a mouse-derived anti-chicken lysozyme (HEL) scFv fragment and its fusion protein with TcFKBP18.
FIG. 7 is a diagram showing a purified mouse-derived anti-HEL scFv and TcFKBP18 fusion protein and the results of thrombin treatment thereof.
FIG. 8 shows the activity of mouse-derived anti-HEL scFv obtained as a result of expression by ELISA.
Claims (29)
（ａ）分子シャペロン活性（変性したタンパク質を元の天然型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性）を有するＰＰＩａｓｅであるポリペプチド（ただしＳＬＹＤタンパク質を除く）をコードする第１コード領域、及び、
（ｂ）タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域を含有し、
前記第１コード領域は、プロモーターに有効に連結しており、
前記制限酵素サイトは、第１コード領域と同じ解読枠内であって、前記第１コード領域の下流にある
ことを特徴とする発現ベクター。An expression vector for preventing the formation of an inactive abnormal protein during production of a recombinant protein and for producing a target protein in a large amount and efficiently as a soluble form,
(A) (but excluding SLYD protein) molecular chaperone activity (activity to refolding denatured protein to the original native or denatured irreversible aggregation inhibiting activity of the protein) polypeptide is a PPIase having A first code region encoding
(B) containing a region having at least one restriction enzyme site into which a second coding region encoding a protein can be inserted;
The first coding region is effectively linked to a promoter;
The expression vector, wherein the restriction enzyme site is in the same reading frame as the first coding region and downstream of the first coding region.
（ａ）分子シャペロン活性（変性したタンパク質を元の天然型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性）を有するＰＰＩａｓｅであるポリペプチド（ただしＳＬＹＤタンパク質を除く）をコードする第１コード領域、及び、
（ｂ）タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域を含有し、
前記制限酵素サイトは、挿入された前記第２コード領域がプロモーターに有効に連結するように配置されており、
前記第１コード領域は、前記第２コード領域と同じ解読枠内にあって、前記第２コード領域の下流にある
ことを特徴とする発現ベクター。An expression vector for preventing the formation of an inactive abnormal protein during production of a recombinant protein and for producing a target protein in a large amount and efficiently as a soluble form,
(A) (but excluding SLYD protein) molecular chaperone activity (activity to refolding denatured protein to the original native or denatured irreversible aggregation inhibiting activity of the protein) polypeptide is a PPIase having A first code region encoding
(B) containing a region having at least one restriction enzyme site into which a second coding region encoding a protein can be inserted;
The restriction enzyme site is arranged so that the inserted second coding region is effectively linked to a promoter,
The expression vector, wherein the first coding region is in the same reading frame as the second coding region and is downstream of the second coding region.
請求の範囲第４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２項記載の発現ベクターを内包する宿主を、前記発現ベクターの発現条件下で培養し、前記融合タンパク質を細胞質に発現させることを特徴とする融合タンパク質の製造方法。A method for producing a fusion protein comprising a polypeptide having molecular chaperone activity and a protein encoded by a second coding region, comprising:
A host containing the expression vector according to claim 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 or 22. Is cultured under the expression conditions of the expression vector, and the fusion protein is expressed in the cytoplasm.
請求の範囲第４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２項記載の発現ベクターの第１コード領域の５’末端又は第２コード領域の５’末端に転写及び翻訳されてシグナル配列となる領域を設けて、前記発現ベクターを内包する宿主を、前記発現ベクターの発現条件下で培養し、前記融合タンパク質をペリプラズム又は培地に発現させることを特徴とする融合タンパク質の製造方法。A method for producing a fusion protein comprising a polypeptide having molecular chaperone activity and a protein encoded by a second coding region, comprising:
The first code of the expression vector according to claim 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21 or 22 A region that is transcribed and translated into a signal sequence by being transcribed and translated at the 5 ′ end of the region or the 5 ′ end of the second coding region, and culturing a host enclosing the expression vector under the expression conditions of the expression vector; A method for producing a fusion protein, comprising expressing the fusion protein in a periplasm or a medium.
請求の範囲第４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２項記載の発現ベクターに、無細胞翻訳系において、前記融合タンパク質を発現させることを特徴とする融合タンパク質の製造方法。A method for producing a fusion protein comprising a polypeptide having molecular chaperone activity and a protein encoded by a second coding region, comprising:
A cell-free expression vector according to claim 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 or 22. A method for producing a fusion protein, characterized in that the fusion protein is expressed in a translation system.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002185020 | 2002-06-25 | ||
| JP2002185020 | 2002-06-25 | ||
| PCT/JP2003/008020 WO2004001041A1 (en) | 2002-06-25 | 2003-06-25 | Expression vector, host, fused protein, process for producing fused protein and process for producing protein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2004001041A1 JPWO2004001041A1 (en) | 2005-10-20 |
| JP4168028B2 true JP4168028B2 (en) | 2008-10-22 |
Family
ID=29996719
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004515182A Expired - Fee Related JP4168028B2 (en) | 2002-06-25 | 2003-06-25 | Expression vector, host, fusion protein, method for producing fusion protein, and method for producing protein |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20050130259A1 (en) |
| EP (1) | EP1516928B1 (en) |
| JP (1) | JP4168028B2 (en) |
| AT (1) | ATE458059T1 (en) |
| AU (1) | AU2003243969B2 (en) |
| CA (1) | CA2490384A1 (en) |
| DE (1) | DE60331311D1 (en) |
| WO (1) | WO2004001041A1 (en) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1748071A4 (en) * | 2004-05-21 | 2009-01-07 | Takara Bio Inc | Process for producing polypeptide |
| JP2006230251A (en) * | 2005-02-23 | 2006-09-07 | Kagoshima Univ | Fused protein expression vector |
| CN101351550B (en) | 2006-01-03 | 2012-10-10 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | Chimaeric fusion protein with superior chaperone and folding activities |
| JP2010235492A (en) * | 2009-03-31 | 2010-10-21 | Sekisui Chem Co Ltd | Chaperonine-target protein complex and method for producing the same |
| AR086250A1 (en) * | 2011-05-05 | 2013-11-27 | Hoffmann La Roche | FUSION POLIPEPTIDE PRESENTING A SEQUENCE OF AMINO ACIDS AND USING THE SAME |
| EP2917388B1 (en) | 2012-11-08 | 2016-10-05 | Roche Diagnostics GmbH | Nucleic acids encoding chimeric polypeptides for library screening |
| EP3049437A1 (en) | 2013-09-27 | 2016-08-03 | F. Hoffmann-La Roche AG | Thermus thermophilus slyd fkbp domain specific antibodies |
| BR112017019776B1 (en) | 2015-03-18 | 2020-07-28 | Omnicyte | fusion proteins comprising modified alphavirus surface glycoproteins and tumor-associated antigen and methods thereof |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2231330A1 (en) * | 1995-09-15 | 1997-03-20 | Alice Marcy | A high throughput assay using fusion proteins |
| US5989868A (en) * | 1997-09-12 | 1999-11-23 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Fusion protein systems designed to increase soluble cytoplasmic expression of heterologous proteins in esherichia coli |
| EP1806142B1 (en) * | 1998-10-02 | 2010-07-14 | Rhein Biotech Gesellschaft für neue biotechnologische Prozesse und Produkte mbH | Method for the production of (poly)peptides by using truncated variants of the SV 40 large T antigen with an intact N terminus |
| GB9913437D0 (en) * | 1999-06-09 | 1999-08-11 | Medical Res Council | Fusion proteins |
| JP2002306182A (en) * | 2000-05-26 | 2002-10-22 | Toyota Central Res & Dev Lab Inc | Method for producing antibacterial protein and fused protein |
| JP2002262883A (en) * | 2001-03-13 | 2002-09-17 | Sekisui Chem Co Ltd | Method for producing monoclonal antibody |
| MXPA03011455A (en) * | 2001-06-22 | 2004-04-05 | Hoffmann La Roche | A soluble complex comprising a retroviral surface glycoprotein. |
-
2003
- 2003-06-25 US US10/511,098 patent/US20050130259A1/en not_active Abandoned
- 2003-06-25 JP JP2004515182A patent/JP4168028B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-06-25 CA CA002490384A patent/CA2490384A1/en not_active Abandoned
- 2003-06-25 EP EP03733573A patent/EP1516928B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-25 DE DE60331311T patent/DE60331311D1/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-06-25 AU AU2003243969A patent/AU2003243969B2/en not_active Ceased
- 2003-06-25 WO PCT/JP2003/008020 patent/WO2004001041A1/en active Application Filing
- 2003-06-25 AT AT03733573T patent/ATE458059T1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1516928B1 (en) | 2010-02-17 |
| CA2490384A1 (en) | 2003-12-31 |
| AU2003243969A1 (en) | 2004-01-06 |
| JPWO2004001041A1 (en) | 2005-10-20 |
| WO2004001041A1 (en) | 2003-12-31 |
| ATE458059T1 (en) | 2010-03-15 |
| EP1516928A4 (en) | 2006-11-08 |
| DE60331311D1 (en) | 2010-04-01 |
| EP1516928A1 (en) | 2005-03-23 |
| US20050130259A1 (en) | 2005-06-16 |
| AU2003243969B2 (en) | 2008-03-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210024614A1 (en) | Aldehyde Tags, Uses Thereof in Site-Specific Protein Modification | |
| Tegel et al. | Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter | |
| US7829684B2 (en) | Methods for producing soluble membrane-spanning proteins | |
| US8729232B2 (en) | Aldehyde tags, uses thereof in site-specific protein modification | |
| JPH06500006A (en) | Ubiquitin-specific protease | |
| JP4168028B2 (en) | Expression vector, host, fusion protein, method for producing fusion protein, and method for producing protein | |
| JP2022504487A (en) | Use of novel triple helix polypeptides and polypeptides that do not have binding affinity for immunoglobulin Fc domains | |
| CN113874518A (en) | Protection of the SpyTag-containing periplasmic fusion protein from degradation by proteases Tsp and OmpT | |
| Stockton et al. | A complex of chaperones and disulfide isomerases occludes the cytosolic face of the translocation protein Sec61p and affects translocation of the prion protein | |
| JP2004024102A (en) | Expression vector, host, fusion protein, protein, method for producing fusion protein and method for producing protein | |
| JPWO2005063964A1 (en) | FKBP type PPIase, expression vector, transformant, fusion protein, method for producing fusion protein, method for producing target protein, method for purifying FKBP type PPIase, and method for purifying fusion protein | |
| Demay et al. | Simple purification and characterization of soluble and homogenous ABC-F translation factors from Enterococcus faecium | |
| Owen | Understanding the Role of C-terminal Lysine in Intracellular Secretory Pathways | |
| JP2006166845A (en) | Fkbp-type ppiase gene, method for producing fkbp-type ppiase gene, separated fkbp-type ppiase, its gene, expression vector, transformant and fused protein, method for producing the same, method for producing object protein, method for regeneration of object protein and method for stabilization of object protein | |
| KR20070035499A (en) | Process for producing polypeptide | |
| JP2005013067A (en) | Fused protein and its use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060307 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070731 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070925 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071023 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20070925 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071218 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20080304 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20080304 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080507 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20080623 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080703 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080729 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080804 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110808 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110808 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120808 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120808 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130808 Year of fee payment: 5 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |