JP4068103B2 - 雲南ｓｌ−００１菌の培養によるビタミンｋの生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、枯草菌の培養によるビタミンＫの生産方法に関するものである。

ビタミンＫは、従来、血液が凝固する際に必要な因子として知られており、このビタミンの欠乏は血液凝固能の低下をもたらすので抗出血性ビタミンとも呼ばれる脂溶性ビタミンの一種である。このビタミンＫの欠乏が血液凝固能の低下をもたらす原因としては、近年、プロトロンビンを含む数種の血液凝固因子の生合成にビタミンＫが不可欠であることが示唆された。しかしながら、血液凝固能の低下を防止するために必要とされるビタミンＫの量はμｇオーダーと極めて微量であり、一般的には、成人では腸内細菌から供給されるので、ビタミンＫ欠乏症になることはまれであり、また、ビタミンＫ欠乏性出血症の治療には合成ビタミンＫ1やＫ2が医薬品として用いられ、これまではこの予防を目的として天然ビタミンＫ1濃縮物が食品として利用されているため、ビタミンＫはこれまであまり注目されることはなかった。

しかしながら、近年、ビタミンＫには骨形成促進作用及び骨吸収抑制作用があり、ビタミンＫの投与で骨密度が増加することが明らかにされた。一方、骨粗鬆症は、老化や疾病などの原因によって起こる、骨がもろくなる病態で、骨折したり、激しい痛みなどを伴い、老人医療の面から大きな社会問題となりつつある病気であり、骨粗鬆症患者におけるビタミンＫの血中濃度を調べてみると健常人に比べて約１／２と少ないことが報告された。このため、合成ビタミンＫが骨粗鬆症用治療薬として臨床試験が行われているが、出血症の治療・予防の場合と異なり、骨粗鬆症の治療・予防では、一日に４５ｍｇ以上という多量のビタミンＫの投与で骨量を増す改善効果があることが臨床試験により証明されている。また、骨粗鬆症は発病してからの治療より予防が重要であり、このためには食品から日常的にビタミンＫを摂取することが望まれるが、健常者の場合、一日にどのくらいのビタミンＫを摂取すれば骨量が増し、骨粗鬆症の予防に役立つかは明らかではない上、既存の食品で上記したような量を摂取することは難しいと思われる。

上述したように、ビタミンＫの摂取は日常の食品を通じて行われるのが望ましく、実際、ビタミンＫ1は緑黄色野菜や海草類などから、ビタミンＫ2は納豆などの発酵食品から摂取することができる。しかしながら、市販の食品から骨粗鬆症の改善に有効な量であるとの報告のある４５ｍｇのビタミンＫを摂取しようとする場合、例えば、ビタミンＫを１ｐｐｍ含有する食品では、一日に４５ｋｇという多量の食品を食する必要があるが、このようなことは実際には非常に困難である。また、食品のうちでビタミンＫの含量が十数ｐｐｍと最も多いのは納豆であるが、たとえ、このような納豆を食しても一日に数百ｇから数ｋｇの量を食さなくてはならず、嗜好上、これだけの量を毎日食することは困難である上、摂取されたビタミンＫの半減期は短く、単発で経口摂取したのでは効果が不十分であったり、また逆に一時に大量摂取すると副作用の問題も残されていた。このため、ビタミンＫが濃縮されたものを摂取することが望ましいが、出血症予防のために調製粉乳に添加している市販の天然ビタミンＫ濃縮物は高価であり、医薬品の合成ビタミンＫは食品に使用できないという問題があった。

ところで、ビタミンＫ類の中で、自然界に存在するのはビタミンＫ1およびビタミンＫ2群のみである。ビタミンＫ1は、食品中では、特に緑色野菜、植物油、海藻等に多く含まれており、例えば、海藻・海苔・茶葉などに数十ｐｐｍ、大豆油、ほうれん草やブロッコリーなどに数ｐｐｍ含まれており、また２−メチル−１，４−ナフトキノンとフィチルアセテートを縮合することよって合成される。また、ビタミンＫ2群は、側鎖長の違いによりメナキノン−１〜１４（ＭＫ−１〜１４）の同族体が知られている。これらのうち、特にメナキノン−７（本明細書では、単に「ＭＫ−７」ともいう）は、ビタミンＫ2の代表的な物質であり、主に納豆菌によって合成されるが、自然界では納豆でも数〜十数ｐｐｍと比較的微量にしか存在しない上半減期が短いため、単離が非常に困難であり、これまで、ＭＫ−７高含量の脂質を調製した例は、特開平８−７３３９６号公報一例くらいしか知られていない。

このため、ビタミンＫ2を納豆菌等の微生物を用いて大量に生産することが試みられ、天然ビタミンＫ2を得る方法としては多くの研究が知られており、例えば、フラボバクテリウム属に属する微生物の培養液からビタミンＫ2を採取する方法（特公平７−２８７４８号及び特公平７−５１０７０号公報）、大豆煮汁や豆腐粕等に納豆菌を接種して発酵させることによりビタミンＫを生産する方法（特開平１０−２９５３９３号、特開平８−１９３７８号、特開平８−９９１６号及び特開平８−１７３０７８号公報）が挙げられる。これらの方法に加えて、納豆菌の発酵物をアルコール、エーテル、エステルやケトン等の有機溶媒による溶媒抽出などを行うことによって天然ビタミンＫ2、特に天然ＭＫ−７を多量に含む濃縮脂質を得る方法（特開平８−７３３９６号公報）が提案されている。しかしながら、フラボバクテリウムなどのビタミンＫ生産菌を使用する方法は、フラボバクテリウムが食品としての安全性が証明されていないので、直ちに食品に供することはできないという問題がある。また、納豆菌を用いてビタミンＫを調製する方法では、確かに最大約４０ｍｇ／リットル培養液という比較的ビタミンＫ含有量の高い培養物が得られたものの、ここで産生するのは水溶性ではなく脂溶性のビタミンＫであるため、その使用できる用途は非常に限定されたものとなる。さらに、納豆菌の発酵物を有機溶媒で抽出することによって調製される天然メナキノン−７高含量脂質は、大豆等の食用に供することができるものを原料として調製されてはいるものの、有機溶媒を使用するため食品に使用する際にはこの有機溶媒を完全に除去しなければならずこのための設備や時間がさらに必要となる上、上記と同様、得られるＭＫ−７高含量脂質はその名称からも明らかなように脂溶性であるためその使用できる用途が限定される。

上述したように、納豆、納豆の製造過程で発生する粕、煮汁等の副産物の発酵物から納豆菌等の微生物を用いてビタミンＫやＭＫ−７を生産する（即ち、菌体外からビタミンＫやＭＫ−７を取り出す）方法は多数報告されてきた。
特公平７−２８７４８号 特公平７−５１０７０号 特開平１０−２９５３９３号 特開平８−１９３７８号 特開平８−９９１６号 特開平８−１７３０７８号 特開平８−７３３９６号

本発明の目的は、ビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−７（ビタミンＫ2）誘導体を最も多量に枯草菌(Bacillus
subtilis)の菌体内に貯蔵するようにこの微生物を培養する方法を提供するものである。

本発明の他の目的は、通常の食品からは充分な量の摂取ができないまたは摂取困難な天然ビタミンＫ、特に天然ＭＫ−７を簡単に日常的摂取することを可能にすることを目的として、ビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−７（ビタミンＫ2）誘導体を最も多量に枯草菌(Bacillus subtilis)の菌体内に貯蔵するようにこの微生物を培養する方法を提供するものである。

本発明者は、上記事情を鑑みて、納豆の成分（Experientia,
43:1110, 1987；Acta Haematol.,
84: 139, 1990；Fibrinolysis,
6: 86, 1992；日本薬剤師会誌、30: 73, 1994；バイオインダストリー、14: 47, 1996）、あるいは納豆菌中及び血中ビタミンＫの分析（日本血栓止血誌、8: 287, 1997；Fibrinolysis & Proteolysis, Vol.12,
Supplement 1, 205, p.75, 1998）について鋭意研究を行ってきた結果、納豆等の納豆菌の発酵物やそれに含まれるビタミンＫの摂取ではなく、生きた枯草菌そのものの摂取によって高い血漿中のビタミンＫ、特にＭＫ−７濃度の亢進効果が認められること、及び特に納豆菌の場合は他に比べて極めて高い血漿中濃度の持続効果を発揮することを見い出した。

また、本発明者は、特定の成長段階まで培養した納豆菌は菌体内に多量のＭＫ−７を蓄積しており、この段階で回収された納豆菌またはその培養物そのものを摂取することによって高い血漿中のビタミンＫ、特にＭＫ−７濃度が認められかつこのようにして摂取された際の血漿中のビタミンＫ濃度は長持間持続することをも発見した。上記知見に加えて、本発明者は、上記段階で回収された納豆菌の菌体内に蓄積されたビタミンＫ、特にＭＫ−７は水溶性であることをも発見し、このような水溶性のビタミンＫ、特にＭＫ−７を用いることにより、その用途は非常に広がるであろうと期待した。

本発明の第１の態様に係るビタミンＫの生産方法は、雲南ＳＬ−００１菌を培養し、培養された菌体及び／又は培養液からビタミンＫ誘導体を得る工程を含む。

雲南ＳＬ−００１菌は納豆菌の一種であり、その安全性は確保されている。上記方法によって培養された培養物またはこのような培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体を含む食品、飲料または飼料は、従来に比べて多量の水溶性ビタミンＫ誘導体、特にメナキノン−７誘導体を含みかつ高い安全性を有するため、このような食品、飲料または飼料を食することによって、ビタミンＫを効率的にかつ簡単に日常的に摂取することができ、これにより骨粗鬆症の改善がより一層期待できる。

また、本発明の培養方法によって培養される培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体は、従来脂溶性であったビタミンＫを水溶性にその性質を変えることが可能であるという画期的な発明を包含するものである。さらに、本発明による水溶性ビタミンＫ誘導体は優れた光安定性を有するものである。この発明により、従来に比べてビタミンＫの用途がかなり拡大できることはいうまでもなく、ゆえに本発明は産業上の観点から非常に高い価値を有することが期待できる。

さらに、本発明による培養物または水溶性ビタミンＫ誘導体を含む食品を摂取することにより、効率よく血中ビタミンＫ濃度を高めることができ、また、従来の薬品や食品で摂取されるビタミンＫそのものに比べて血中濃度の高まりをはるかに長持間持続できることから、骨粗鬆症予防のより高い効果も期待できる。

本発明に使用される雲南SL-001菌は、平成１１年５月７日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６７１３号で国際寄託された。

本発明において、雲南SL-001菌を菌体内で産生されたビタミンＫが菌体外に放出される前に培養を終了して回収することが好ましく、雲南SL-001菌の培養（例えば、培地や培養条件）などについては、枯草菌(Bacillus subtilis)を一般的に培養するのと同様の培地及び培養条件が使用できる。これにより、ビタミンＫは、菌体外にはほとんど放出されずに微生物菌体中に選択的にかつ多量に蓄積されるため、このような特定の状態の菌体を回収するという簡単な操作によって、ビタミンＫを多量に含む菌体が得られ、このようにして回収された菌体は、安全性が確認されている菌であり、菌体からビタミンＫを抽出するという操作を介さずとも、そのまま菌体を食するあるいはこのような菌体の培養物を一般的な食品に含ませることも可能である。

本発明において、雲南SL-001菌の菌体の回収時期は、上述したように、菌体内で産生されたビタミンＫが菌体外に放出される前が好ましく、更に、好ましくは前記微生物の菌体数が対数期から定常期に入る時期である。また、対数期から定常期に入る時期でかつナットウキナーゼが産生される前に菌体を回収することが好ましい。より具体的には、培養時間は培養温度及びｐＨや菌体の初期濃度等の培養条件および培養方法によって異なるものの、例えば、５００ｍｌ容量の三角フラスコを用いて３００ｍｌの培養液（組成：１．５％ポリペプトン−Ｓ、１％グルコース、０．１％酵母エキス、ｐＨ７．２）中に雲南SL-001株を、５×１０6個／ｍｌの初期濃度で接種して３７℃で振盪培養（１００ｒｐｍ）を行った場合、０．５〜４日間、好ましくは６６０ｎｍでの吸光度で最大値を示した直後（１〜２日間）である。

本発明において、雲南SL-001菌の培養では、枯草菌(Bacillus subtilis)を一般的に培養するのと同様の培地及び培養条件が使用され、例えば、本発明による培養に使用される培地は、当業者には公知の成分からなる培地が使用でき特に制限されず、各種培養成分を適宜混合することにより調製してもあるいは市販の培地をそのまま使用してもあるいは市販の培地に上記公知の成分を補助成分として添加した培地を使用してもよい。この際、培地は、固体または液体培地のいずれを使用してもよく使用目的によって適宜選択され、また、使用する微生物が資化しうる炭素源、適量の窒素源、無機塩及びその他の栄養素を含有する培地であれば、合成培地または天然培地のいずれであってもよい。

本発明による雲南SL-001菌の培養において使用できる炭素源は、菌株が良好に生育し、ビタミンＫを効率よく産生できるものであれば特に制限されない。具体的には、デンプンまたはその組成画分、焙焼デキストリン、加工デンプン、デンプン誘導体、物理処理デンプン、α−デンプン、可溶性デンプン、アミロース、アミロペクチン、マルトオリゴ糖、シクロデキストリン、プルラン、トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、甘藷デンプン及びデキストリン、グリセリン、ソルビトール、麦芽汁、グルコース等の炭水化物が挙げられる。これらの炭素源のうち、ビタミンＫの産生の観点から、グルコース及びデンプンが好ましく使用される。これらの炭素源は、単独あるいは２種以上の混合物の形態で使用できる。

本発明による雲南SL-001菌の培養において使用できる窒素源もまた、菌株が良好に生育し、ビタミンＫを効率よく産生できるものであれば特に制限されない。具体的には、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン、大豆由来のポリペプトン（例えば、ポリペプトン−Ｓ）、酵母エキス、味液（大豆タンパク酸加水分解物）、大豆粉末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸及びコーンスティープリカー等の有機窒素化合物、およびアンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素等の無機窒素化合物等が挙げられる。これらの窒素源のうち、ビタミンＫの産生の観点から、大豆由来のポリペプトン（例えば、ポリペプトン−Ｓ）及び大豆粉末が好ましく使用される。これらの窒素源も、単独あるいは２種以上の混合物の形態で使用できる。

本発明による培養に使用できる無機塩もまた、使用する種によって異なり、菌株が良好に生育し、ビタミンＫを良好に産生できうるものであれば特に制限されないが、具体的には、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩及び酢酸塩等から選ばれた１種または２種以上を使用することができる。

また、本発明による培養に市販の培地を使用する場合の市販の培地としては、例えば、栄養ブイヨン(nutrient broth)（乾燥ブイヨン）（日水製薬株式会社または日本製薬株式会社製）、ポリペプトン−Ｓ（和光純薬製）などが挙げられる。

または、本発明において、雲南SL-001菌の培養に使用する培地として、オカラ、大豆、味噌や納豆製造時に副生する大豆煮汁、豆腐や油揚げ製造時に副生する豆腐粕、大豆を原料とした製油時に副生する大豆粕、味噌製造時の副産物である大豆の種皮など、納豆菌によって発酵できる材料を使用してもよい。この際、必要であれば、この材料に上記したような炭素源、窒素源及び無機塩を適宜添加してもよい。

本発明において、雲南SL-001菌の培養は、従来公知の方法と同様にして行われ、その際の培養条件は、培地の組成及び培養法によって適宜選択され、菌株が増殖しビタミンＫを効率よく産生できる条件であれば特に制限されない。培養温度は、通常、２０〜４５℃、好ましくは３７〜４２℃であり、また、培養に適当な培地のｐＨは、通常、６．０〜９．５、好ましくは７．０〜８．５である。

本発明において、「雲南SL-001菌の培養物」ということばは、上記方法によって培養された雲南SL-001菌の菌体および菌体外に産生された産物の双方を含む。後者の場合では、雲南SL-001菌が、他の枯草菌(Bacillus subtilis)に比べてより高い菌体外での収率を示すため、好ましい。

上述したように、本発明の方法によって培養された雲南SL-001菌の培養物は、多量のビタミンＫ、特にビタミンＫ2、さらに特にメナキノン−７（ＭＫ−７）をその菌体内に蓄積している。具体的には、培養物中に蓄積されるビタミンＫ、ビタミンＫ2およびＭＫ−７の量は、培地の種類や培養条件などによって変化するが、通常、１０〜２００ｍｇ／１００ｇ真空熱乾燥菌体である。なお、本明細書において、菌体内に蓄積されるＭＫ−７、ＭＫ−４及びビタミンＫ1の量は、下記実施例の項で記載される方法によって測定された値である。

本発明の方法によって培養された雲南SL-001菌を含む枯草菌(Bacillus subtilis)の培養物を濾過や遠心分離等の既知の方法により集菌した後、これを凍結乾燥、風乾、真空熱乾燥等の公知の方法により乾燥し、この乾燥菌体を水に溶解したところ、ビタミンＫが水に溶け出してくる。即ち、この菌体中には多量のビタミンＫ（特にＭＫ−７）が含まれる点を合わせて考慮すると、菌体内に蓄積されたビタミンＫ（特にＭＫ−７）は菌体内では何らかの変化を受けて水溶性となっていると考えられ、このような水溶性が付与された形態のビタミンＫ、ビタミンＫ2及びメナキノン−７（ＭＫ−７）を、本願明細書において、それぞれ、「水溶性ビタミンＫ誘導体」（または、単に「ビタミンＫ誘導体」と称する）、「水溶性ビタミンＫ2誘導体」（または、単に「ビタミンＫ2誘導体」と称する）及び「水溶性メナキノン−７誘導体（水溶性ＭＫ−７誘導体）」と称する。この際、水溶性メナキノン−７誘導体は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定される際に約１０万の分子量の単一のバンドを示す点、ゲル瀘過で測定される際には１０万以上の分子量を示す点、およびメナキノン−７の分子量が約６４９である点を考慮することにより、ＭＫ−７に何らかの物質（例えば、糖タンパク質）が結合して安定化されて水に可溶性のビタミンＫ誘導体（ビタミンＫ2誘導体及びメナキノン−７誘導体を含む；以下、省略）が菌体内で形成されるのではないかと推定される。しかしながら、上記仮説によって本発明の概念が限定されるものではないことはいうまでもない。

本発明において、水に対するビタミンＫ誘導体、ビタミンＫ2誘導体及びメナキノン−７誘導体の溶解度は、使用する菌体や培地の種類、培養条件及び培養物の処理（抽出）方法などによって変化する。例えば、ビタミンＫ誘導体の溶解度は、培養菌体の水抽出操作による場合、約１０５μｇ／１００ｍｌ水（２０℃）であり、液体培養上清の場合、約３００μｇ／１００ｍｌ水（２０℃）であり、さらに、納豆の水抽出操作による場合、約１，５００μｇ／１００ｍｌ水（２０℃）である。

本発明に係る食品、飲料または飼料は、雲南SL-001菌（納豆菌）という安全性が確認されている菌を使用するため、培養物および／または水溶性ビタミンＫ誘導体のみから構成されてもよい。

あるいは、本発明に係る食品、飲料または飼料は、本発明による培養物および／または本発明による水溶性ビタミンＫ誘導体を通常食することのできる食品、飲料または飼料に含ませたものであってもよい。この際、通常食することのできる食品、飲料または飼料としては、例えば、オカラ、オカラ納豆、納豆、大豆、味噌や納豆製造時に副生する大豆煮汁、豆腐や油揚げ製造時に副生する豆腐粕、大豆を原料とした製油時に副生する大豆粕、味噌製造時の副産物である大豆の種皮、ヨーグルト、チーズ等の乳製品、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、なると、つみれ等の水産練り製品、でんぶ等の魚介類加工品、ソーセージ、フランクフルト、レバーペースト等の食肉加工品、豆腐、焼き豆腐、生揚げ、油揚げ、がんもどき、おから、凍り豆腐、湯葉等の豆製品、ピューレ等の野菜加工品、マッシュポテト、くず、はるさめ、こんにゃく、しらたき等の芋加工品、もち、白玉、白飯、麩、ビーフン、マカロニ、スパゲッティ、そうめん、そば、うどん、中華めん、即席麺、食パン、乾パン、アンパン等の穀物の加工品、冷凍食品、栄養補助食品、ジャム等の甘味類、バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング等の油脂類、あめ、らくがん、せんべい、あられ、カステラ、ようかん、もなか、まんじゅう、大福もち、だんご、ういろう、チョコレート、ビスケット、クッキー、ドーナツ、ケーキ、パイ、アイスクリーム、プリン、ババロア、ガム等の菓子類、豆腐、ゼリー、コンニャク、寒天またはトコロテン等のゲル状食品、コンブ、ワカメ、ノリ、テングサ等の海草類など、すべての食品；各種果汁ジュース（オレンジ、パイナップル、リンゴ、ブドウ、メロン及びイチゴジュース等を含む）、各種炭酸飲料、お茶（煎茶、ウーロン茶等を含む）、飲むヨーグルト、牛乳、豆乳、調製乳、ミネラルウォーター、清涼飲料、コーヒー、紅茶、ココアなど、すべての飲料；ならびにブタ、ウシ、ウマ、ヒツジやヤギ等の家畜、イヌ、ネコ、ウサギやハムスター等のペット、家禽及び魚など、通常、飼育される動物用のエサ（飼料）が挙げられる。

また、本発明において、食品、飲料または飼料が本発明による培養物を含む場合の食品における培養物の添加量は、使用する菌体や培地の種類や培養条件さらには水溶性ビタミンＫ誘導体の含量などによって変化するが、食品では、通常、０．００１〜２０重量％の菌体乾燥物、好ましくは０．１〜５重量％の菌体乾燥物を含む量であり、飲料では、通常、０．０００１〜５（ｗ／ｖ）％の菌体乾燥物、好ましくは０．０１〜５（ｗ／ｖ）％の菌体乾燥物を含む量であり、さらに、飼料では、通常、０．０００１〜５重量％の菌体乾燥物、好ましくは０．００１〜１重量％の菌体乾燥物を含む量である。また、食品、飲料または飼料が本発明による水溶性ビタミンＫ誘導体を含む場合の食品における水溶性ビタミンＫ誘導体の量は、上記と同様使用する菌体や培地の種類や培養条件などによって変化するが、食品では、通常、０．００００１〜１０重量％の水溶性ビタミンＫ誘導体、好ましくは０．０００１〜０．１重量％の水溶性ビタミンＫ誘導体を含む量であり、飲料では、通常、０．００００１〜０．１（ｗ／ｖ）％の水溶性ビタミンＫ誘導体、好ましくは０．０００１〜０．０１（ｗ／ｖ）％の水溶性ビタミンＫ誘導体を含む量であり、さらに、飼料では、通常、０．００００１〜１０重量％の水溶性ビタミンＫ誘導体、好ましくは０．０００１〜１重量％の水溶性ビタミンＫ誘導体を含む量である。

したがって、本発明の水溶性ビタミンＫ（特にＭＫ−７）誘導体を多量に含む菌体培養物および／またはこのような培養物由来の水溶性ビタミンＫ（特にＭＫ−７）誘導体を含む食品を摂取することにより、従来に比べてビタミンＫ、特にＭＫ−７を無理なく（不快感を過度に伴うことなく）、効率よくかつ一回に多量に摂取することができる。

本発明によるビタミンＫの生産において、まず、培養された雲南SL-001菌菌体をソックスレー抽出器を用いてヘキサン、ジエチルエーテル、アセトン、エタノール及びイソプロパノール等の有機溶媒で使用する有機溶媒の沸点でソックスレー抽出し、脂溶性画分を得ることができる。次に、この画分をヘキサン、ジエチルエーテル、アセトン、エタノール及びイソプロパノール等の有機溶媒で３０〜１００℃で０．１〜２０時間、抽出する。得られた抽出物を上記と同様の有機溶媒で所定の総容量にまで希釈する。希釈された抽出物の一部を水及びイソプロパノールと混和し、さらにタッチミキサーを使用するなどにより上記と同様の有機溶媒とさらに混和する。得られた液体混合物を遠心し、上清を乾固した後、残渣をエタノールに溶解することにより、ビタミンＫ2（ＭＫ−７、ＭＫ−４）及びビタミンＫ1等のより純度の高い脂溶性のビタミンＫが調製される。

上記方法によって、脂溶性のビタミンＫが公知の方法に比してより効率的に抽出され、これによりビタミンＫ2（ＭＫ−７、ＭＫ−４）及びビタミンＫ1等の脂溶性のビタミンＫがより高い収率で培養菌体から回収できる。

本発明によるビタミンＫの生産において、雲南SL-001菌を公知の方法または上記方法によって培養し、培養液を得る。次に、この培養液のｐＨを下げる、好ましくはｐＨを１〜３に調整することによって沈殿物が得られ、この沈殿物には菌体内に蓄積された及び菌体外に放出された水溶性ビタミンＫ誘導体が含まれる。したがって、この沈殿物を遠心分離などによって分離することによって、水溶性ビタミンＫ誘導体が分取できる。

または、雲南SL-001菌を公知の方法または上記方法によって培養し、得られた培養液を遠心分離などによって、菌体を除去した培養上清を得る。次に、この培養上清のｐＨを下げる、好ましくはｐＨを１〜３に調整することによって沈殿物が得られ、この沈殿物には菌体外に放出された水溶性ビタミンＫ誘導体が含まれる。したがって、この沈殿物を遠心分離などによって分離することによって、水溶性ビタミンＫ誘導体が分取できる。

［実施例］以下、実施例を参照しながら、本発明をより具体的に説明する。

なお、下記実施例において、ＭＫ−７、ＭＫ−４及びビタミンＫ1の量は、以下の方法に従って測定した。

＜各種ビタミンＫ量の測定方法＞まず、脂溶性のＭＫ−７、ＭＫ−４及びビタミンＫ1の場合の菌体試料の調製方法を以下に説明する：培養された微生物菌体１ｇ（乾燥重量）を試料として、ソックスレー抽出器（SIBATA SPC 34, WATER BATH SIBATA WB-6C, 濾紙：ADVANTEC 84 24×100mm）で脂溶性画分を抽出する。これを１００ｍｌヘキサンで８０℃で６時間抽出した後、全液量をヘキサンにより１００ｍｌに調節する。この抽出物１００μｌを１．０ｍｌの蒸留水及び１．５ｍｌのイソプロパノールと混和し、さらに４．９ｍｌのヘキサンをタッチミキサーで約１０秒間混和する。この混合液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ×１０分、２０℃）する。得られた上清部分（有機層：水層＝５．８：１．７）４．０ｍｌをエバポレーターで濃縮・乾固した後、これを１００μｌのエタノールに溶解する。このようにして、菌体内に蓄積された脂溶性のＭＫ−７、ＭＫ−４及びビタミンＫ1の量を測定するためのＨＰＬＣ試料（以下、「ソックスレー−ＨＰＬＣ試料」と称する）が調製される。なお、このソックスレー−ＨＰＬＣ試料を用いて下記ＨＰＬＣによってＭＫ−７量を測定する方法を「ソックスレー−ＨＰＬＣ法」と称する。

次に、水溶性ビタミンＫ誘導体（ＭＫ−７を含む）の場合の試料の調製方法を以下に説明する：培養物をスパーテルでよく練った後に得られた５ｇ量に対して、蒸留水４５ｍｌを加える。この混合液を、２０℃で、３，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、得られた上清０．５ｍｌを抽出試料とする。この抽出試料に、蒸留水０．５ｍｌ、イソプロパノール１．５ｍｌを混和し、さらにヘキサン５．０ｍｌを加え撹拌した後、２０℃で３，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離する。得られた上清４．０ｍｌをエバポレーターで濃縮・乾固し、１００μｌのエタノールで溶解する。このようにして、水溶性ＭＫ−７誘導体の量を測定するためのＨＰＬＣ試料（以下、「ＨＰＬＣ試料」と称する）が調製される。なお、このＨＰＬＣ試料を用いて下記ＨＰＬＣによってＭＫ−７量を測定する方法を「ＨＰＬＣ法」と称する。

また、培養液中のＭＫ−７、ＭＫ−４及びビタミンＫ1の量を測定するためのＨＰＬＣ試料としては、培養液がそのまま使用される。

さらに、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるＭＫ−７、ＭＫ−４及びビタミンＫ1量の測定は、ビタミンＫが白金−アルミナ触媒でハイドロキノン体に還元され、蛍光物質になることを利用するものである。具体的には、以下の条件で測定する。

装置 ポンプ：ＰＵ−９８０（日本分光製）
インジェクタ ：７１２５（日本分光製）
カラムオーブン：ＣＯ−９６５（日本分光製）
検出器 ：蛍光検出器 ８２１−ＦＰ（日本分光製）
データ処理装置：Ｃ−Ｒ５Ａ（島津製作所製）
条件 カラム ：ＯＤＳ−ＩＩカラム（４．６×２５０ｍｍ）（島津製作所製）
還元カラム：白金−アルミナ触媒カラム（和光純薬製、一級白金 −アルミナ、Ｐｔ＝５％を約０．２ｇ充填する；４．０φ×１０ｍｍ）
移動相 ：９７％エタノール（流速；０．７ｍｌ／分）
分離・還元温度：４０℃
測定波長 ：励起 ３２０ｎｍ
蛍光 ４３０ｎｍ
注入量：１０μｌ

このような測定方法によって、ＭＫ−７、メナキノン−４及びビタミンＫ1について検量線を作成したところ、ＭＫ−７の量は、０．０５〜５０ｎｇの範囲で式［−０．８９６６１＋１．６９９３×１０-6×（ビタミンＫに相当するＨＰＬＣの面積（μＶ，ｓｅｃ））］によって、ならびにメナキノン−４及びビタミンＫ1の量は、０．０１〜１０ｎｇの範囲で、それぞれ、式［−０．５８６５７＋４．８０３０×１０-9×（ビタミンＫに相当するＨＰＬＣの面積（μＶ，ｓｅｃ））］及び式［−０．４４３８１＋４．０６２６×１０-7×（ビタミンＫに相当するＨＰＬＣの面積（μＶ，ｓｅｃ））］によって、測定が可能であった。

また、検量線を作成する際のＭＫ−７の標準品は、以下によって調製した。すなわち、６００ｇの納豆に、７５％イソプロパノール１リットル及びｎ−ヘキサン１リットルを加え、１時間、ゆっくりと撹拌、静置した。分離した２層のうち上層を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥、蒸発乾固することにより、抽出物約２０ｇを得た。これを１０ｍｌのｎ−ヘキサンと混合し、４００ｍｌのクロマトグラフィー用シリカゲルに通して吸着させ、２リットルのｎ−ヘキサン／トルエン（１：１）で溶出・分画した。ＭＫ−７を含む画分を減圧下で蒸発乾固し、得られたシリカゲル濃縮物を５ｍｌのｎ−ヘキサンで溶解し、上記と同様にして、再度シリカゲルカラムで分画し、減圧下で蒸発乾固して約３５０ｍｇを得た。このうち５０ｍｇを少量のアセトンに溶解し、アセトニトリル／メタノール（１：１）で充填した６０ｍｌのクロマトグラフィー用ＯＤＳ−シリカゲルに通液し、アセトニトリル／メタノール（１：１）で展開した。溶出液をＨＰＬＣでモニタリングしながら、ＭＫ−７と考えられる物質が単独で溶出している画分を分取し、減圧乾固した。得られた物質について、赤外吸収スペクトラム及びマススペクトラムを得て、ＭＫ−７であることを確認した。なお、この物質の純度を検定したところ、９９．８％であった。また、フィロキノン（ビタミンＫ1）及びメナキノン−４（ＭＫ−４）の標準品としては、それぞれ、シグマ社(Sigma)製の特級品を用いた。測定は、３回抽出して分析した平均値により求めた。

実施例１
下記６種の納豆菌を、それぞれ、５００ｍｌ容の三角フラスコ内で３００ｍｌの３％栄養ブイヨン(nutrient
broth)（乾燥ブイヨン）（日本製薬株式会社製）培地中で３０℃で振盪培養（１００ｒｐｍ）した。この際の菌の成長を６６０ｎｍでの吸光度として測定し、また、培養液中及び菌体内のＭＫ−７量を経時的に測定した。

培養時間に対する、各種納豆菌の成長、培養液中のＭＫ−７量（μｇ／ｍｌ）および各種納豆菌の菌体１ｇ当たりのＭＫ−７量（μｇ／ｇ）を、それぞれ、図１、図２及び図３に示す。

＜使用した納豆菌＞
雲南SL-001菌（または、「雲南菌」とも称する）
宮城野菌（有限会社宮城野納豆製造所製、仙台）
目黒菌（株式会社目黒研究所製、大阪）
日東菌（株式会社日東薬品工業製、京都）
高橋菌（高橋祐蔵研究所製、山形）
成瀬菌（株式会社成瀬醗酵化学研究所製、東京）
以下、上記納豆菌は菌名のみを記載する。

図１から示されるように、菌の成長は、すべての納豆菌で類似の挙動を示し、６６０ｎｍでの平均吸光度（ｎ＝６）として表すと、０．５日目で０．５８３、１日目で１．０１１、２日目で０．９４８、３日目で０．８５４、５日目で０．５９２、および７日目で０．５５２であり、これから菌の成長は培養開始後１〜２日で定常状態となることが分かった。また、培養液中に放出されるＭＫ−７量は、図２から示されるように、やはりすべての納豆菌で類似の挙動を示し、６種の納豆菌による平均値換算で、０．５日目で０．５６３μｇ／ｍｌ、１日目で１．５９２μｇ／ｍｌ、３日目で３．８６７μｇ／ｍｌ、５日目で４．３１７μｇ／ｍｌ、７日目で４．７８４μｇ／ｍｌであり、これから、培地中に放出されるＭＫ−７量は、菌の成長が定常状態になる１〜２日目よりもむしろそれ以降に急激に増加し、特に４日目以降に多量のＭＫ−７が培地中に放出された。この結果に比例するように、菌体１ｇ当たりのＭＫ−７量に換算した場合のＭＫ−７量（やはりすべての納豆菌で類似の挙動を示した）は、図３から示されるように、２日目で最大（平均で約３００μｇ／ｇ乾燥菌）となり、培地中に多量の放出し始める４日目以降ではむしろ減っていくことが分かった。

実施例２
オカラ（旭松食品株式会社、飯田市）を−２５℃で凍結保存し、必要時に解凍して使用した。解凍したオカラを、１２０℃で３０分間、オートクレーブで滅菌した後、約１２０ｍｌ容のポリスチレンペーパー（ＰＳＰ）容器に入れ、これを納豆菌の培地とした。

別途、市販の納豆に使用されている４種の納豆菌株（高橋菌、成瀬菌、宮城野菌及び朝日菌）、薬剤として使用されている２種の納豆菌株（日東菌及び目黒菌）、ならびに中国雲南の納豆から分離された納豆菌株（雲南菌 SL-001）の合計７種の納豆菌を、それぞれ、５００ｍｌ容の三角フラスコ内で１５０ｍｌの３％栄養ブイヨン(nutrient broth)（乾燥ブイヨン）（日水製薬株式会社製）培地中で３７℃で３日間、振盪培養（１００ｒｐｍ）することによって、上記７種の納豆菌の前培養液を調製した。

上記で調製されたオカラ（湿重量５０ｇ）に、これら計７種の納豆菌の前培養液（生菌数：２×１０8個／ｍｌ）０．５ｍｌを、それぞれ、添加し、３７℃で８日間、静置して発酵し続けた。

発酵し始めてから所定の日数（１、２、４、６、８日目）経過後、納豆菌を水中に懸濁し、これを金属製の茶漉しで濾過した後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ×１０分）することによって、各菌体の培養物を調製し、これをＭＫ−７測定用のソックスレー−ＨＰＬＣ試料とした。このようにして調製されたソックスレー−ＨＰＬＣ試料について、ＭＫ−７量及び線溶（血栓溶解）活性を測定し、その結果を図４に示す。

図４から明らかなように、菌体数１０ ^１０ 個当たりの菌体内のＭＫ−７濃度は１〜２日目で高く、それ以降は減少し、これに比例するようにＭＫ−７が培地中に放出され、培地中に放出されるＭＫ−７の量は、発酵後２日をピークとするナットウキナーゼ（ＮＫ）による血栓溶解活性が高まる時点（標準フィブリン平板法でも、合成基質分解法でも発酵開始後２日以内に最高値に達する）より遅れた４日目をピークとすることが分かった。

また、いずれの納豆菌についても、オカラ湿重量１ｇ当たり１．９μｇ以上という高いＭＫ−７生産性（水に溶け出した量が、平均で、雲南菌
３６．６μｇ／ｇオカラ湿重量；宮城野菌 １．９μｇ／ｇオカラ湿重量；成瀬菌
１４．２μｇ／ｇオカラ湿重量；高橋菌 ６．８μｇ／ｇオカラ湿重量；朝日菌 １１．９μｇ／ｇオカラ湿重量；目黒菌 １．９μｇ／ｇオカラ湿重量；および日東菌５．２μｇ／ｇオカラ湿重量）が確認された。特に、雲南菌(SL-001)は、３６．６μｇ／ｇオカラ湿重量という高いＭＫ−７生産量を示し、この値は、計算上、他の納豆菌の生産量に比べて２〜２０倍という高い値であり、また、従来報告（山口迪夫監修、日本食品成分表、医歯薬出版、東京、１９９７年、pp.52-53；坂野俊行ら、ビタミン、６２、393-398(1988)；H. Ikeda and Y. Doi, Eur. J.Biochem., 192,
219-223 (1990)；および池田ひろ、家政誌、４３、643-648(1992)）されている納豆の分析値（６．２〜８．７μｇ／ｇオカラ湿重量）の４倍以上という高いものであった。

比較例１
菌体を４１℃で２日間、振盪培養し、この培養液を遠心分離し、上清と菌体に分けた。この菌体２ｇを乳鉢にとり、海砂３、水３ｍｌを乳鉢に加えた。次に、この乳鉢に、アセトンで磨砕抽出（２０ｍｌ×４）し、ガラスフィルターで吸引濾過した。濾液全量を分液ロートに移し、ジエチルエーテル１００ｍｌ及び水５０ｍｌを添加して抽出して、エーテル層を分離した。水層にさらにジエチルエーテル１００ｍｌを添加して、エーテル層を分離した。これらのエーテル層を合わせて、溶媒を留去し、さらにこれをシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン１０ｍｌ、シリカゲル５ｇ）にかけて、ヘキサン／ジエチルエーテル（８５／１５（ｖ／ｖ））３０ｍｌで溶出した。さらに、溶出液から溶媒を留去した後、２−プロパノールに溶解し、脂溶性ＭＫ−７を調製した。

このようにして調製された脂溶性ＭＫ−７を乾燥し、ＭＫ−７乾燥物を調製した。このＭＫ−７乾燥物に室温で蛍光灯を５時間照射した後、脂溶性ＭＫ−７を測定し、その結果を図５（黒塗りの四角）に示す。図５に示されるように、ＭＫ−７量は、蛍光灯を約３時間照射すると、測定不可能になることから、このようにして調製されたＭＫ−７は光に対して非常に不安定であることが示される。

実施例３
オカラは、旭松食品株式会社（飯田市）より提供されたものを、−２５℃で凍結保存し、必要時に解凍して使用した。

別途、中国雲南の納豆から分離した納豆菌株（雲南菌 SL-001）を、５００ｍｌ容の三角フラスコ内で１５０ｍｌの３％栄養ブイヨン(nutrient broth)（乾燥ブイヨン）（日水製薬株式会社製）培地中で３７℃で３日間、振盪培養（１００ｒｐｍ）することによって、納豆菌の前培養液を調製した。

解凍したオカラ１ｋｇ（湿重量）を、１２０℃で３０分間、オートクレーブで滅菌した後、約１２０ｍｌ容量のポリスチレンペーパー（ＰＳＰ）容器に入れた。この容器に、上記で調製された納豆菌の前培養液を添加し、３７℃で４日間、発酵させた。このようにして発酵させたオカラ納豆１ｋｇ（湿重量）に対して、５リットルの水を加え、室温で１時間撹拌し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）した。得られた上清に対して、６２０ｇのイオン交換樹脂（DEAE-Sepharose CL-613）を加え、撹拌した後、室温で３０分間、静置した。次に、これをガラスカラム（７．５ｃｍφ×１００ｃｍ）に充填し、蒸留水及び０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、０．１〜０．８Ｍ
ＮａＣｌを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でグラジエント溶出した。各画分について、ＨＰＬＣによってビタミンＫ量を測定し、ビタミンＫを含む画分をメンブランフィルター（Millipore製、分子量１０，０００）で濃縮し、蒸留水で透析した後、凍結乾燥し、薄黄色粉末として水溶性ビタミンＫ誘導体を得た。

このようにして得られた水溶性ビタミンＫ誘導体及び上記と同じオカラをイソプロパノールで抽出したものを、ＨＰＬＣによって分析し、その結果を図６に示す。なお、図６において、ＭＫ−４、ビタミンＫ1及びＭＫ−７の保持時間は、それぞれ、約８．２分、約１１．３分及び約１７．５分であり、矢印はＭＫ−７の保持時間を示す。図６から、オカラのイソプロパノール抽出物の６０％以上が水溶性分画に抽出され、また、ビタミンＫとしては、ビタミンＫ1、ＭＫ−４の量は少なく、常に９５％以上がＭＫ−７で占められることが分かった。

また、この水溶性ビタミンＫ誘導体について、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行ったところ、分子量約１０万の位置に幅広いながら単一のバンドを示した。この結果から、水溶性ビタミンＫ誘導体は他の糖タンパク質と分子量約１０万の複合体を形成しているのではないかと考察される。また、この際の納豆１ｋｇからの水溶性ビタミンＫ誘導体の収率は、３回の操作による平均で、約５．３ｇ（８３０μｇ
水溶性ＭＫ−７誘導体／ｇを含む）であった。

実施例４
５００ｍｌ容の三角フラスコ５本に、それぞれ、３００ｍｌの３％乾燥ブイヨン（日水製薬株式会社製）培地を入れ、１２０℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。これらの培地に、雲南SL-001菌を一白金耳ずつ接種し、３７℃で振盪培養（１００ｒｐｍ）した。４日後、培養液を合わせたものを遠心分離（５，０００ｒｐｍ×１０分）し、得られた上清を４００ｍｌずつ３つに分けて、各上清のｐＨを希塩酸で１．０２、２．０７及び３．０１に調節した。室温で３時間放置した後、上清を遠心分離（５，０００ｒｐｍ×１０分、１０℃）し、白色の沈殿を分離した。この白色沈殿物を少量の蒸留水に溶かして、重炭酸アンモニウム粉末でｐＨを７．０に調節した後、凍結乾燥した。この結果、凍結乾燥物の重量は、１．０２、２．０７及び３．０１のｐＨの場合、それぞれ、０．５２ｇ、０．２８ｇ及び０．３１ｇであった。次に、この凍結乾燥物について、ＭＫ−７含量（μｇ／ｇ乾燥物）をソックスレー−ＨＰＬＣ法で調べたところ、１．０２、２．０７及び３．０１のｐＨの場合、それぞれ、２，８００μｇ／ｇ乾燥物、２，２００μｇ／ｇ乾燥物及び２，０００μｇ／ｇ乾燥物であった。さらに、各凍結乾燥物１５ｍｇを蒸留水５ｍｌに添加した溶液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×１０分）した。得られた上清（水溶性分画）について、同様にしてＭＫ−７含量を調べたところ、１．０２、２．０７及び３．０１のｐＨの場合、それぞれ、１，５００μｇ／ｇ乾燥物、１，８００μｇ／ｇ乾燥物及び１，８００μｇ／ｇ乾燥物であったから、各水溶性分画の可溶化率は、約５４％、約８２％及び約９０％であることが分かった。

これらの結果から、従来の方法では、納豆菌を効率よく抽出することが困難であり、培養物のＭＫ−７量が良好に測定できなかったのに対して、本願発明で使用されるソックスレー−ＨＰＬＣ法は、従来の方法に比べて、ＭＫ−７の抽出効率が向上し、培養物のＭＫ−７量をより良好に測定することができることが示された。

は、実施例１における培養時間に対する各種納豆菌の成長を示すグラフである。 は、実施例１における培養時間に対する各種納豆菌の培養液中のＭＫ−７量を示すグラフである。 は、実施例１における培養時間に対する各種納豆菌の菌体内に蓄積されたＭＫ−７量を示すグラフである。 は、実施例２における菌体内に蓄積されるＭＫ−７量、線溶活性及び菌体外に放出されたＭＫ−７量を示すグラフである。 は、比較例１において、蛍光灯による照射時間に対するＭＫ−７量を示すグラフである。 は、実施例３において、水溶性ビタミンＫ誘導体及びオカラのイソプロパノール抽出物のＨＰＬＣ分析結果示すグラフである。

Claims (5)

1. 雲南ＳＬ−００１菌（通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６７１３号で国際寄託）を固体培養し、培養された菌体及び／又は培養液からビタミンＫ誘導体を得る工程を含むことを特徴とするビタミンＫの生産方法。
2. 前記ビタミンＫ誘導体はビタミンＫ２誘導体である請求項１に記載のビタミンＫの生産方法。
3. 前記ビタミンＫ２誘導体はメナキノン−７誘導体である請求項２に記載のビタミンＫの生産方法。
4. 前記培養された菌体をソックスレー抽出することによってビタミンＫを得ることを特徴とする請求項１，２又は３に記載のビタミンＫの生産方法。
5. 前記培養液を酸性化し、沈殿物を得る工程を更に含むことを特徴とする請求項１，２，３又は４に記載のビタミンＫの生産方法。