JP3753942B2 - 5-pyrimidine-containing nucleic acid and reversible ligation method using the same - Google Patents

Description

【０００７】
（式中、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す。）
で表される基を有する核酸類、及び当該核酸が固相担体に固定化された核酸類に関する。
また、本発明は、前記した本発明の核酸類と、炭素−炭素二重結合、好ましくは非縮合環系の炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類に光を照射して、核酸類を可逆的に光連結又は開裂させる方法に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明の核酸類と、塩基としてシトシンを有する核酸類に光を照射して塩基同士を連結させ、酸素又は水などの酸素含有物の存在下にシトシンのアミノ基を分解して、次いでより短波長の光を照射して前記塩基同士の連結を開裂させることからなるシトシンを選択的にウラシルに変換する方法に関する。
【０００８】
また、本発明は、ＤＮＡの特定の塩基を対象として、前記した本発明の核酸類の５’末端及び３’末端が、前記ＤＮＡの特定の塩基の周辺の塩基配列と相補的な塩基配列を有する本発明の核酸類を配置して、これに光を照射してなる前記ＤＮＡの不活性化方法に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明の固定化された核酸類を用いた、標的となる特定の核酸類の固定化方法、標的となる特定の核酸類を精製及び／又は回収する方法、並びに同定及び／又は検出及び／又は定量する方法に関する。
即ち、本発明は、本発明の固定化された核酸類と、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類を含有する核酸混合物が存在する系に、光を照射して当該核酸混合物中の標的とする特定の核酸類を共有結合により光連結させてなる核酸類の固定化する方法に関し、また、本発明は、本発明の固定化された核酸類と、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類を含有する核酸混合物が存在する系に、光を照射して当該核酸混合物中の標的とする特定の核酸類を共有結合により光連結させて核酸混合物中の特定の核酸類を固定化し、固定化された核酸類を分離又は回収することからなる核酸混合物中の特定の核酸類を同定、検出又は定量する方法に関し、さらに、本発明は、本発明の固定化された核酸類と、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類を含有する核酸混合物が存在する系に、光を照射して当該核酸混合物中の目的の特定の核酸類を共有結合により光連結させて核酸混合物中の特定の核酸類を固定化し、固定化された核酸類を精製又は回収した後、さらに光を照射して固定化された核酸類を光開裂させることからなる、特定の核酸類を精製、回収する方法に関する。
【０００９】
このように、本発明の核酸類は、光の照射によりＤＮＡやＰＮＡなどの核酸類と可逆的に連結し、開裂することができるものであり、ＤＮＡやＰＮＡなどの核酸類の可逆的光連結剤として有用なものである。また、本発明の核酸類は、２本鎖ＤＮＡをテンプレートとして光反応を行うことが可能であり、このような方法で遺伝子の特定の塩基配列の箇所において本発明の核酸類を連結させることにより、２本鎖ＤＮＡの特定の塩基配列の箇所に本発明の方法により塩基と塩基とが光反応により連結した３本目の核酸類を導入することができる。この結果当該２本鎖ＤＮＡの転写等が抑制され、ＤＮＡを不活性化することから本発明の核酸類はＤＮＡ不活性化剤としても有用である。
【００１０】
ＰＮＡ（ペプチド核酸）は、天然のＤＮＡよりもより強くＤＮＡの相補鎖に結合することができることから、遺伝子治療におけるアンチジーン又はアンチセンスとして使用されている。しかし、ＰＮＡは水への溶解性が低く、細胞内や核内への輸送効率が低いことが課題とされている。これを改善するために、ＤＮＡの親水性と膜親和性を利用したＰＮＡ−ＤＮＡのキメラ複合体が注目されてきているが、ＤＮＡとＰＮＡとでは基本となる鎖が異なるために、その合成法は煩雑なものであった。
本発明者らは、ピリミジンの５位に電子吸引基で置換されたビニル基を有するピリミジン塩基、例えば次式（Ｘ）、
【００１１】
【化３】

【００１２】
で示される５−カルボキシビニルウラシルを塩基とする核酸を末端に有する核酸を用いて、この光反応性を利用することによる可逆的な核酸の連結を行った。
まず、テンプレートとなるＤＮＡ上にその相補鎖となるＰＮＡを配置し、次いでＰＮＡの末端部分に前記した塩基を有する本発明の核酸を配置し、これに３６６ｎｍの光を３時間照射させることにより、塩基部分で連結したＰＮＡ−ＤＮＡキメラ複合体を得た。この反応式を次式で示す。
【００１３】
【化４】

【００１４】
テンプレート（ＯＤＮ Ｃ）にＰＮＡ（ＰＮＡ Ａ）及び本発明の核酸（ＯＤＮ Ｂ）を配置し３６６ｎｍの光を照射して、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体（ＰＮＡ−ＤＮＡ Ｈｙｂｒｉｄ Ｅ）を得る。このスキームではテンプレート（ＯＤＮ Ｃ）は直接反応には関与しないが、便宜的に生成物のほうのテンプレートをテンプレート（ＯＤＮ Ｄ）としている。
【００１５】
この結果を図１に示す。図１は図面に代わる写真である。図１の右側（−）は光を照射する前のスポットであり、これは^３２Ｐで標識化された本発明の核酸である。これに光を照射した後のものが左側（＋）に示されている。光を照射することによりＰＮＡと本発明の核酸が連結されて、より高分子量の位置にスポットが移動していることがわかる。
図２はこの結果を示したＨＰＬＣのチャートである。図２の横軸はリテンション時間（分）であり、図３の上段は光照射前のチャートであり、図３の下段は光照射後のチャートである。
図３の一番左側のピークはテンプレート（ＯＤＮ Ｃ）のピークであり、光照射前と後で変化は無い。（ａ）の左から２番目及び３番目のピークは本発明の核酸（ＯＤＮ Ｂ）と連結されるＰＮＡ（ＰＮＡ Ａ）のピークである。図２の下段では、原料の２種の核酸のピークはほぼ消失して、より高分子量の生成物のピークが出現してきていることがわかる。
このように、本発明の核酸の塩基であるピリミジンの５位の置換ビニル基の二重結合と、隣接する塩基の炭素−炭素二重結合が光により直接結合するものであり、ＰＮＡとＤＮＡのように基本となる鎖が相違していても、塩基同士により連結することが可能となる。さらに、この光による連結は光可逆反応であり、異なる波長の光を照射することにより、可逆的に開裂させることも可能である。
また、この方法を応用することにより、光によって末端をキャップした核酸を簡便に合成することが可能になる。遺伝子治療においては、遺伝子を核に送り込むためには遺伝子に酵素耐性を付与しなければならず、本発明の核酸の光キャップ化によってこのような酵素耐性を付与することができる。
【００１６】
次に、前記式（Ｘ）で示される５−カルボキシビニルウラシルを塩基とする核酸を用いて、シチジン（シトシン塩基）との光反応を行ったところ、３６６ｎｍの紫外線を３０分間照射することにより、９３％の収率で目的の連結ＤＮＡが得られた。比較例として、カルボキシル基が置換していない５−ビニルウラシルを塩基とする核酸を用いた場合には、６時間の照射で８０％の収率であった。
このように、ビニル基の水素原子をカルボキシル基のような電子吸引基で置換することにより、短時間で且つ高収率で反応を行わせることができることがわかった。
【００１７】
本発明の連結反応はＤＮＡやＲＮＡなどをテンプレートとして用いることが好ましい。即ち、前記したＰＮＡとの反応式に示したように、ＤＮＡをテンプレートとして、その上にその相補鎖の連結されるべき核酸を置き、連結部分が隣接するように隣接して本発明の核酸を配置して光を照射するのが好ましい。このようなテンプレートを使用することにより、目的の位置で選択的に連結を行うことができる。
本発明者は、このようなテンプレートとして、２本鎖のＤＮＡを使用することができるかどうかを検討した。２本鎖のＤＮＡにさらに３本目のＤＮＡなどの核酸が塩基対を形成することは、フーゲスティン塩基対（Hoogsteen base pair）として知られているとおりである。
そこで、核酸の一端に前記式（Ｘ）で示される５−カルボキシビニルウラシルを塩基を有し、他端にシトシン塩基（Ｐｙ）を有する核酸を用意し、この核酸の両端が隣接するように両端部分の塩基を２本鎖ＤＮＡの塩基対と対を形成させた。この反応式を次に示す。
【００１８】
【化５】

【００１９】
これに３６６ｎｍの光を照射させることにより、環状のＤＮＡを８９％の収率で得た。
結果を図３に示す。図３は図面に代わる写真である。図３のレーン１はコントロールとして１２ｍｅｒの核酸を示したものであり、レーン２は光照射の無い場合のものであり、環状になっていない核酸のスポットがみられる。レーン３は３６６ｎｍの光を照射したときのものであり、環状の核酸のスポットがみられる。レーン４はこれにさらに３０２ｎｍの光を照射したものであり、環が開環してもとの鎖状のもののスポットが出現していることがわかる。
得られたＤＮＡは、２本鎖ＤＮＡに、塩基部分が光環化反応により環化されたＤＮＡが塩基対を形成しているものであり、この部分にはＲＮＡポリメラーゼなどの酵素や他のタンパク質が結合することができず、その結果この部分の遺伝子の発現が抑制されることになる。したがって、この方法により発現を抑制したい遺伝子の発現を阻害することが可能となり、本発明の核酸を遺伝子治療として使用できる。
また、得られた環状ＤＮＡに、３０２ｎｍの光を照射することにより、可逆的に開環することができ、遺伝子の発現の抑制を解除することも可能である。
【００２０】
次に枝分かれの核酸の製造方法について検討した。
図４にその概要を示す。例えば、ＡＣＡＣＧ及びＡＣＧＣＡＣの塩基配列を有するテンプレート（ＯＤＮ Ｉ）に、末端に前記式（Ｘ）で示される５−カルボキシビニルウラシルを塩基（図４中では^ＶＣＵ）を有するＵＧＣＧＴＧ・・・の塩基配列を有する本発明の核酸（ＯＤＮ Ｈ）を配置し、その隣接する位置に・・・ＴＧＴＧＣ・・・の部分配列を有する核酸（ＯＤＮ Ｇ）を配置する。これらの塩基配列はテンプレートに相補的な配列であり、目的核酸の塩基配列に応じてテンプレートの塩基配列を選択することができる。
これに３６６ｎｍの光を１時間照射すると、５−カルボキシビニルウラシルの塩基部分と、隣接するシトシン（Ｃ）が連結して図４に示される枝分かれ状の核酸を得ることができる。
【００２１】
図５はこの結果を示したＨＰＬＣのチャートである。図５の横軸はリテンション時間（分）であり、図５のａ）（図５の上段）は光照射前のチャートであり、図５のｂ）（図５の下段）は光照射後のチャートである。
図５の一番左側のピークはテンプレートのピークであり、光照射前と後で変化は無い。（ａ）の左から２番目及び３番目のピークは本発明の核酸と連結される核酸のピークである。図５の（ｂ）では、原料の２種の核酸のピークは消失して、より高分子量の生成物の大きなピークが出現してきていることがわかる。このピークの分子量は５２５０．１２で、計算値の５２４９．９０と一致した。
【００２２】
さらに、本発明の方法によれば、対象遺伝子上の任意のシトシンをウラシルへと変異させることが可能になる。
即ち、前記した枝分かれ状の核酸を製造するのと同様にして、対象遺伝子のシトシン（Ｃ）の塩基までをテンプレートに固定化し、当該シトシンに隣接して本発明の核酸を配置して光を照射すると、対象遺伝子と本発明の核酸が連結する。この連結した状態のときに、シトシンの４位のアミノ基を酸素又は水などの酸素含有物の存在下の水酸基に置換することができる。例えば、連結した状態で空気中で穏やかに温度を上げてゆくと空気酸化されて、シトシンのピリミジン環の４位のアミノ基が水酸基に置換される。そして、再度光を照射して、連結を開裂させると、シトシンがウラシルに変換されることになる。
【００２３】
この反応式を図６に示す。枝分かれ構造の核酸を製造するところまでは、前述したのと同様である。即ち、例えば、ＡＣＡＣＧ及びＡＣＧＣＡＣの塩基配列を有するテンプレート（ＯＤＮ Ｉ）に、末端に前記式（Ｘ）で示される５−カルボキシビニルウラシルを塩基（図６中では^ＶＣＵ（以下の説明では^ＣＶＵと標記することもある。））を有するＵＧＣＧＴＧ・・・の塩基配列を有する本発明の核酸（ＯＤＮ Ｈ）を配置し、その隣接する位置に・・・ＴＧＴＧＣ・・・の部分配列を有する核酸（ＯＤＮ Ｇ）を配置する。これらの塩基配列はテンプレートに相補的な配列であり、目的核酸の塩基配列に応じてテンプレートの塩基配列を選択することができる。
これに３６６ｎｍの光を１時間照射すると、５−カルボキシビニルウラシルの塩基部分と、隣接するシトシン（Ｃ）が連結して図４に示される枝分かれ状の核酸を得る。これを加熱処理した後、３０２ｎｍの光を１時間照射して開裂させるとシトシンがウラシルに変換された核酸（ＯＤＮ Ｍ）を得ることができる。
【００２４】
図７はこの結果を示したＨＰＬＣのチャートである。図７の横軸はリテンション時間（分）であり、図７の上段は光照射前のチャートであり、図７の下段は光照射後のチャートである。図７の左から２番目のピークはテンプレートのピークであり、光照射前と後で変化は無い。図７の上段の左から１番目及び３番目のピークは本発明の核酸（ＯＤＮ Ｈ）と連結される核酸（ＯＤＮ Ｇ）のピークである。図７の下段では、原料の２種の核酸のピークに加えて、ウラシルに変換された核酸（ＯＤＮ Ｍ）のピークが出現してきていることがわかる。
【００２５】
シトシンがウラシルに変換されたＤＮＡを、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理すると、このウラシルの位置で特異的に切断することができる。したがって、ＤＮＡの任意のシトシンの位置を本発明の方法によりウラシル化することにより、ＤＮＡを任意の位置での特異的に切断することも可能となる。
図８は、前記に示した方法で得られたウラシルに変換された核酸（ＯＤＮ Ｍ）を酵素処理した結果のＨＰＬＣのチャートを示す。左側にｄＵのピークを確認することができた。
また、同様な方法で、ｍＲＮＡ上のシトシンをウラシルに変換することができる。本発明の方法によりｍＲＮＡ上のシトシンをウラシルに特異的に変換することにより、コードされているアミノ酸を特異的に変更することができる。
このように、本発明の核酸類を利用することにより、ａ）光遺伝子治療をすること、ｂ）ミスマッチ検出等の遺伝子診断、ｃ）核酸をキャップ化することにより酵素耐性を付与することができ、ｄ）光変異誘導等を行うことが可能となる。次に本発明の固定化された核酸類について説明する。本発明の固定化された核酸類の代表的な例を次の化学式で示す。
【００２６】
【化６】

【００２７】
（式中、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す。波線はＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡなどの核酸部分を示し、太線はリンカー部分を示し、球状で示された丸は固相担体を示す。）
本発明の固定化された核酸類は、前述してきた光の照射によりＤＮＡやＰＮＡなどの核酸類と可逆的に共有結合により連結し、開裂することができる本発明の核酸類が、多孔質ガラスビーズやポリスチレンなどの固相担体に結合したものであり、好ましくは核酸やポリエチレングリコール基などのリンカー部分を介して固相担体に結合したものである。
【００２８】
本発明の固定化された核酸類の利用例を模式図により図１０に示す。図１０に示す例は前述してきたテンプレートの役割をする核酸を鋳型用の核酸として使用する例である。図１０中の丸印に点線で結合している核酸が本発明の固定化された核酸類である。この核酸は図１０の右側に示される鋳型ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列を有している。図１０の最上段に枠で囲って示されている容器の中には種々の塩基配列を有する核酸が存在している。そして、その容器の中には、前記した鋳型ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列を有する核酸がある。
この容器の中に本発明の固定化された核酸類と、前記した鋳型ＤＮＡを入れると、図１０の上から２段目に示されるように、本発明の固定化された核酸類と鋳型ＤＮＡの一部がハイブリダイズし、鋳型ＤＮＡの残りの部分に容器中に存在している特定の塩基配列を有する核酸がハイブリダイズする。このときに前記してきたように、本発明の光の照射により核酸類と可逆的に共有結合により連結することができる塩基と、連結される塩基とが隣り合うように鋳型ＤＮＡを設計しておくと、光の照射により、図１０の上から２段目に示されるように両者の核酸が共有結合により連結される。
【００２９】
次いで、鋳型ＤＮＡを解離させて、固相担体を分離、洗浄すると、図１０の上から３段目に示されるように、本発明の固定化された核酸類に共有結合により連結した特定の塩基配列を有する核酸を固相担体に固定化して、他の核酸とを分離することができる。
このようにして得られた固定化された核酸に、再び光を照射すると本発明の固定化された核酸類と、目的の特定の塩基配列を有する核酸とを可逆的に開裂させることができる。
このようにして、種々の塩基配列を有する核酸の混合物中から、目的とする特定の塩基配列を有する核酸を選択的に分離し、精製することができる。また、このときに使用された本発明の固定化された核酸類は、光による可逆反応により連結し、開裂するのであるから、開裂した後は元の状態の戻るので再利用することができる。
本発明のこの方法によれば、種々の塩基配列を有する核酸の混合物中から、標的とする特定の塩基配列を有する核酸を特異的かつ選択的に分離、精製することができるので、この方法により核酸混合物中の特定の塩基配列を有する核酸を同定したり、検出したり、また定量することができることになる。
【００３０】
図１１に本発明のこの方法による実験結果を示す。図１１はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのチャートであり、図１１の最上段は光を照射する前の核酸の混合物のチャートである。左から核酸Ａ１、核酸Ａ２、核酸Ａ３、核酸Ａ４の各ピークが示されている（後述する実施例１２参照）。
図１１の上から２段目は、本発明のこの方法により前記の核酸の混合物中から、核酸Ａ０のみが選別できたことを示すものである。同様に、図１１の上から３段目は、本発明のこの方法により前記の核酸の混合物中から、核酸Ａ１のみが選別できたことを示すものである。さらに、図１１の上から４段目は、本発明のこの方法により前記の核酸の混合物中から、核酸Ａ２のみが選別できたことを示すものである。図１１の一番下の段は、本発明のこの方法により前記の核酸の混合物中から、核酸Ａ３のみが選別できたことを示すものである。
【００３１】
本発明である固相上に固定化された光連結性核酸は、鋳型ＤＮＡによって目的の核酸のみを固相担体上に光連結させることが可能である。即ち、通常のアフィニティークロマトと違い、目的の核酸のみを共有結合により固相上への固定化が可能である。従って目的核酸の効率よい精製・分離が可能になる。また、違う波長の光照射によって目的核酸を回収することも可能である。このように高効率的な遺伝子の選別、回収が光制御可能であるため、ａ）目的ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白の精製、ｂ）遺伝子診断・遺伝子治療等、ｃ）機能性核酸の選別等への利用のみならず、ｄ）ＤＮＡ−コンピューティング、ｅ）核酸の固相担体への共有結合による固定化、ｆ）核酸の固相担体上での化学修飾等への利用も期待される。
【００３２】
【発明の実施の形態】
本発明の核酸類は、塩基部分に次式、
【００３３】
【化７】

【００３４】
（式中、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す。）
で表される基を有することを特徴とするものでる。
置換基Ｘ、Ｙにおける電子吸引基としては、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基、ニトロ基などが挙げられるがこれらの例示したものに限定されるものではなく、細胞系への適合を考慮して適宜電子吸引基を選択することができる。好ましい電子吸引基としては、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、シアノ基などが挙げられる。アルコキシカルボニル基におけるアルキル基としては、炭素数１から１０、好ましくは１から５の低級アルキル基が挙げられる。
置換基Ｘ、Ｙは、両方が同時に同一または異なる電子吸引基であってもよく、また置換基Ｘ、Ｙの一方だけが電子吸引基であり、他方が水素原子であってもよい。
【００３５】
本発明の核酸類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどのいずれであってもよく、天然又は合成のＤＮＡやＲＮＡなどと塩基対を形成し得るものが好ましい。また、本発明の核酸類は、前記した本発明の塩基だけを有するモノヌクレオチドであってもよいが、他の核酸と共にオリゴヌクレオチドになっているものが好ましい。オリゴヌクレオチドにおける塩基数は特に制限はないが、好ましくは１から１５０、より好ましくは１から５０、さらに好ましくは１から２０程度である。
オリゴヌクレオチドの場合には、本発明の前記した塩基を有する核酸を１個、好ましくは片方の末端部分に有していてもよいが、このような塩基を２個以上有していてもよい。
【００３６】
本発明の核酸類は、通常の核酸の製造方法に準じて製造することができる。例えば、５−置換ビニルウリジンのＤＭＴｒ体にアミダイド化剤を作用させてアミダイド化し、次いで保護基を切断して、これを通常のＤＮＡ合成法によりオリゴヌクレオチドとすることができる。
５−置換ビニルシトシン誘導体又は５−置換ビニルウラシル誘導体は、以下に示す具体例の方法によってもよいが、他の通常の有機合成法によっても製造することができる。
【００３７】
本発明の核酸類を可逆的に光連結又は開裂させる方法における、炭素−炭素二重結合を有する塩基としては、縮合環を形成している炭素−炭素二重結合は好ましくなく、単環式の炭素−炭素二重結合又は環に置換している炭素−炭素二重結合が好ましい。好ましい炭素−炭素二重結合を有する塩基としては、天然のものではシトシン、チミン又はウラシルなどが挙げられる。
炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどのいずれのものであってもよい。
【００３８】
炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類は、前記した本発明の核酸類とは異なる核酸であってもよいが、炭素−炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類が本発明の核酸類であってもよい。後者の場合には、ひとつの核酸の中に本発明の塩基部分を有するものと、炭素−炭素二重結合を有する塩基とが存在することになり、これを連結すると環状の核酸を得ることができる。
本発明の方法における光としては、反応に必要なエネルギーを有する波長のものであればよいが、紫外線が好ましい。一般に、連結させるときは、比較的長波長側でよく、開裂させる場合には比較的短波長側の光が好ましい。より具体的には、連結させるときの波長としては、３３０ｎｍ以上、好ましくは３５０ｎｍ以上、より好ましくは３６０ｎｍ以上の波長が好ましい。また、開裂させるときの波長としては、３２０ｎｍ以下、好ましくは３１０ｎｍ以下の波長が好ましい。好ましい波長としては、連結させるときの波長が３６６ｎｍで、開裂させるときの波長が３０２ｎｍである場合が挙げられる。
【００３９】
本発明の方法は、溶液中のように自由に流動できる状態で行うこともできるが、より選択性を挙げるためにはテンプレートに固定して反応させる方法が好ましい。テンプレートとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの塩基対を形成し得るものであればよい。テンプレートの長さは特に制限はないが、３塩基以上、好ましくは５塩基以上がテンプレート上で塩基対を形成できる長さのものが好ましい。
テンプレートは１本鎖のものであってよいが、前述してきたようにテンプレートとして二本鎖ＤＮＡを使用することもできる。
【００４０】
本発明のシトシンを選択的にウラシルに変換する方法における、塩基としてシトシンを有する核酸類としては、前記したテンプレートに固定化できるものであればどのようなものであってもよい。目的のシトシンの位置から上流又は下流側の３〜１０塩基程度の塩基配列を調べて、それの相補的な塩基配列を有するものをテンプレートとして使用することができる。
また、この方法における、酸素又は水などの酸素含有物としては、空気中の酸素や加水分のための水などを使用することができる。
この方法によって得られたウラシル化されたＤＮＡは、常法によるウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理をすることができる。
【００４１】
本発明のＤＮＡの不活性化方法におけるＤＮＡとして、天然のものでも合成のものであってもよいが、遺伝子を対象としてもよい。
この方法により不活性化しようとする塩基の上流及び下流の各３塩基〜３０塩基程度の塩基配列を調べ、５’末端及び３’末端がその塩基配列と同じ又は相補的な塩基配列となる本発明の核酸を調製する。本発明の核酸の片方の末端は前記した本発明の塩基を有するものであり、他端はこれと連結可能な炭素−炭素二重結合を有する塩基となるように調製する。そして、本発明の核酸を不活性化しようとするＤＮＡに配置して光を照射することにより、環化された本発明の核酸がＤＮＡの目的の位置に固定化される（フォトパドロック（photopadlock）法）。そして、これを解除しようとするときは、より短波長の光を照射して、連結を開裂させることにより、不活性化を解除することができる。
不活性化されるＤＮＡの特定の塩基としては、プロモーター領域が好ましいがこれに限定されるものではない。
【００４２】
以上のように、本発明の核酸類はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの核酸類を光照射により、可逆的の連結することができるものであり、この方法により当該核酸類に枝分かれ構造やキャップ構造を導入することができることから、本発明の核酸類を可逆的光連結剤として使用することができる。
また、本発明の核酸類は、２本鎖に反応してこれを不活性化することができることから、本発明の核酸類をＤＮＡの不活性化剤として使用することができる。
【００４３】
本発明の固定化された核酸類における固相担体としては、生化学分野で使用される固相担体を使用することができる。例えば、多孔質ガラスビーズ（ＰＣＧ）などの無機物質類、ポリスチレン（ＰＳ）などの樹脂類、金などの金属類などが挙げられる。好ましい固相担体としては、アデノシン残基を有する固相担体（オリゴアフィニティーサポート（ＯＡＳ）（商品名）など）が挙げられる。より具体的には後述する実施例１１に記載されているようにアデノシン残基の環に結合しているアミノ基を介してポリスチレン（ＰＳ）（ＯＡＳ−ＰＳ）や多孔質ガラスビーズ（ＯＡＳ−ＣＰＧ）に結合している固相担体が好ましく、当該アミノ基からリンカー部分を結合させて本発明の固定化された核酸類を製造することができる。
本発明の核酸類を前記した固相担体に直接結合させてもよいが、両者をリンカー部分を介して結合させるのが好ましい。リンカー部分としては、核酸類の化学反応に不活性で、５個以上、好ましくは１０個以上の原子を有する、好ましくは直鎖状の分子種であればよい。リンカー部分としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの核酸や、次式で示されるようなポリエチレングリコールなどが好ましい。
【００４４】
【化８】

【００４５】
本発明の固定化された核酸類を製造する方法としては、本発明の核酸類の末端のリン酸基をリンカー部分に結合させて製造することができる。リンカー部分と核酸類を結合させて、次いで固相担体に結合してもよいし、逆に先に固相担体とリンカー部分を結合させて、次いでリンカー部分と核酸類とを結合させてもよい。核酸類と結合する位置は、通常は末端のリン酸基を用いるのが好ましいが、これに限定させるものではない。例えば、核酸類の途中の塩基部分の官能基と結合させてもよい。
本発明の固定化された核酸類を使用する方法においては、鋳型となる核酸を併せて使用するのが好ましい。鋳型となる核酸としては一般的にはＤＮＡが好ましいが、ＲＮＡでもＰＮＡでもよい。鋳型となる核酸は、その一部に本発明の固定化された核酸類とハイヅリダイズし得る相補的な塩基配列を含み、かつ標的となる核酸にハイブリダイズし得る相補的な塩基配列を含むものである。そして、本発明の光の照射により可逆的に連結及び開裂し得る塩基と、当該塩基と光反応をし得る塩基とが、隣り合うように鋳型となる核酸を設計する。
本発明のこの方法における鋳型となる核酸としては、前記した実験例におけるテンプレートとなり得る核酸を使用することができる。
【００４６】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
５−シアノビニルデオキシウリジンを含有する核酸の製造例の反応式を次に示す。以下の説明においては、この反応式に示される化合物番号を使用する。
【００４７】
【化９】

【００４８】
実施例１ ５−シアノビニルデオキシウリジン（４）の製造
（１） 化合物（２）の製造
５−ヨード−デオキシウリジン（ＩＤＵ）（１）をピリジン５ｍＬと３回共沸し、ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（１．７１７ｇ，１１．４０ｍｍｏｌ）と共に窒素置換し、ピリジン５ｍＬを加え均一溶液とした。これにイミダゾール（０．７７６ｇ，１１．３９ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（５ｍＬ）を加え、室温で１２時間攪拌した。薄層クロマト（ＴＬＣ）で原料の消失を確認後、ピリジンを減圧で留去し、残留物を酢酸エチル（２０ｍＬｘ３）と水（２０ｍＬ）を用いて抽出した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 ヘキサン/酢酸エチル＝４：１）により目的の化合物（２）を白色固体（１．６６１ｇ，９６．５％）として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：
0.04-0.14 (m,12H,CH3Six4), 0.88 (s,9H,t-BuSi),
0.93(s,9H,t-BuSi), 1.96 (m,1H,H-2β'), 2.28 (m,1H,H-2α'),
3.74 (dd,J=11.2Hz,J=2.4Hz,1H,H-5'),
3.87 (dd,J=11.2Hz,J=2.4Hz,1H,H-5'),
3.97 (m,1H,H-4'), 4.38 (m,1H,H-3'), 6.25 (t,1H,H-1'),
8.07 (s,1H,H-6), 8.09(br,1H,NH)
【００４９】
（２） 化合物（３）の製造
Ｐｄ（ＯＡｃ）_２（０．０１９ｇ，０．０８５ｍｍｏｌ），ＰＰｈ_３（０．０４５ｇ，０．１７０ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で、ＤＭＦ（２．５ｍＬ）中に加えた後、さらにＮＥｔ_３（０．９３ｍＬ，６．６７２ｍｍｏｌ）を加え、６０℃の水浴中で攪拌した。溶液が濃赤色になった後に、前記（１）で得た化合物（２）（０．４９８ｇ，０．８５４ｍｍｏｌ）、アクリルニトリル（０．７ｍＬ，１０．６３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ溶液として加え一晩攪拌した。減圧でＤＭＦを除去した後、酢酸エチル（１５ｍＬｘ３）、水（１５ｍＬ）で抽出し、得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し再び溶媒を除去した。残留物に対してカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 ヘキサン/酢酸エチル＝４：１）により目的の化合物（３）を黄色固体（０．４３４ｇ，５３．７％）として単離した。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：
0.03-0.14 (m,12H,CH3Six4), 0.88 (s,9H,t-BuSi),
0.91 (s,9H,t-BuSi), 2.00 (m,1H,H-2'β), 2.39 (m,1H,H-2'α),
3.76 (dd,1H,H-5'), 3.87 (dd,1H,H-5'), 4.00 (m,1H,H-4'),
4.37 (m,1H,H-3'), 6.23 (t,1H,H-1'),
6.67 (dd,J=16.4Hz,1H,vinylic H-1''),
6.85 (dd,J=16.2Hz,1H,vinylic H-2''), 7.96 (s,1H,H-6),
7.98 (br,1H,NH)
【００５０】
（３） 化合物（４）の製造
前記の（２）で得られた化合物（３）（０．２３３ｇ，０．４５９ｍｍｏｌ）にＴＢＡＦ（in ＴＨＦ，１ｍｍｏｌ／ｌ）２．０ｍＬを加え室温で４５分攪拌した後、溶媒を除去した。残留物に対してカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒 ５％ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ_３）により目的の化合物（４）を淡黄色固体（０．１２８ｇ，７５％）として単離した。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：
2.15 (m,2H,H-2'αβ), 3.57 (m,1H,H-5'), 3.65 (m,1H,H-5'),
3.80 (m,1H,H-4'), 4.23 (m,1H,H-3'), 5.10 (t,1H,OH-5'),
5.26 (d,1H,OH-3'), 6.08 (t,J=6.4Hz,1H,H-1'),
6.50 (dd,J=1.6Hz,J=14Hz,1H,vinylic H-1''),
7.22 (dd,J=1.6Hz,J=14Hz,1H,vinylic H-2''), 8.33 (s,1H,H-6),
11.72 (br,1H,NH)
【００５１】
実施例２ ５−シアノビニルデオキシウリジンを含有する核酸（７）の製造
（１） 化合物（５）の製造
前記した実施例１で得られた化合物（４）（０．０９６ｇ，０．３４４ｍｍｏｌ）をピリジン２ｍＬとの供沸操作を３回行った後、ＤＭＴｒ−Ｃｌ（０．１３３ｇ，０．３９２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０２５ｇ，０．２０３ｍｍｏｌ）と共に窒素雰囲気下とした。ピリジン（１ｍＬ）を加え攪拌し、均一溶液とした。さらにここへＮＥｔ_３（０．０５ｍＬ，０．３５９ｍｍｏｌ）を加え室温で２０時間攪拌した。減圧でピリジンを除去した後、クロロホルム（１０ｍＬｘ３）と水（１０ｍＬ）で抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を除去した。残留物に対しカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出溶媒３％ＭｅＯＨ in ＣＨＣｌ_３）により目的の化合物（５）を黄色固体（０．０９６ｇ，４７．９％）として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：
2.38 (m,1H,H-2'β), 2.49 (m,1H,H-2'α),
3.43 (dd,J=10.4Hz,J=2.4Hz,1H,H-5'),
3.52 (dd,J=2.4Hz,J=10.4Hz,1H,H-5'), 3.80 (s,6H,OCH3x2),
4.11 (m,1H,H-4'), 4.68 (m,1H,H-3'),
6.50 (d,J=14Hz,1H,vinylic H-1''), 6.08 (t,J=6.4Hz,1H,H-1'),
7.22 (d,J=14Hz,1H,vinylic H-2''),
6.84-6.87 (m,4H,H-β to OCH3x4), 7.20-7.33 (m,9H,phenyl),
7.98 (br,1H,NH), 8.00 (s,1H,H-6)
【００５２】
（２） 化合物（７）の製造
前記の（１）で得られた化合物（５）をアセトニトリルを用いてゴムシールドボトルへ移した後、減圧し溶媒を除去し、アルゴン雰囲気下とした。アセトニトリル（１ｍＬ）を加え固体を溶解させた後、アミダイト化剤（５０ｕＬ）、テトラゾール（０．５Ｍ，３６０ｕＬ）を順に加え９０分攪拌した。あらかじめＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄した酢酸エチルと、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を用いて抽出操作を行い、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し溶媒を除去した。得られた固体をアセトニトリルを用いてゴムシールドボトルへ移し、減圧し溶媒を除去した。さらにアセトニトリルとの供沸操作を２回行った。これ以上の精製はせず、このままＤＮＡ合成機へ取り付けオリゴマー合成を行った。
ＤＮＡ合成機を用いてオリゴマー（５’−^ＣＮＵＧＣ ＧＴＧ）を合成し、ＨＰＬＣを用いて精製を行った。

【００５３】
前記した実施例２と同様の方法により、次の反応式に示される化合物（９）〜化合物（１１）を製造した。以下の説明においては、この反応式に示される化合物番号を使用する。
【００５４】
【化１０】

【００５５】
実施例３ 化合物（９）の製造
ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着しフォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相担体よりアンモニア処理を６５℃、４時間の条件で行うことでＤＮＡを切り出しかつ脱保護を行った。アンモニア留去後、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ（５’−^ＶＣＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。

【００５６】
実施例４ 化合物（１０）の製造
ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着し、緩和条件で脱保護可能なアミダイトを用いて、フォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相担体よりアンモニア処理を３７℃、１時間の条件で行うことでＤＮＡを切り出しかつ脱保護を行った。アンモニア留去後、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ（５’−^ＶＭＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。

【００５７】
実施例５ 化合物（１１）の製造
ＤＮＡ自動合成機に市販のアミダイト（７）を装着し、フォスフォロアミダイト法によりＤＮＡを合成した。固相担体より２Ｎのトリメリレンジアミンのメタノール溶液で密封条件下６５℃、４時間加熱することで、ＤＮＡを修飾、切り出しそして脱保護を行った。１Ｎ酢酸で中和後、メタノール及び水を留去し、ＨＰＬＣにより精製を行い、目的のＤＮＡ（５’−^ＶＡＵＧＣＧＴＧ−３’）を得た。

【００５８】
実施例６ ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ複合体の製造
２０μＭのペプチド核酸Ｎ−ＴＧＴＧＣＣ−Ｃ（ＰＮＡ Ａ）及び、２０μＭの５’−^ＣＶＵＧＣＧＴＧ−３’（ＯＤＮ Ｂ）を、２０μＭの鋳型ＤＮＡ ５’−ＣＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡ−３’（ＯＤＮ Ｃ）の存在下、０℃で３６６ｎｍの光照射を６時間行い、目的のＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドを９０％の収率で得た。ＨＰＬＣによって単離したＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドの分子量を測定することで同定を行った。結果を図１及び図２に示す。

【００５９】
実施例７ ＤＮＡカテナンの製造
環状ＤＮＡの環中をくぐる環状ＤＮＡ（ＤＮＡカテナン）を次に示す反応式にしたがって製造した。
【００６０】
【化１１】

【００６１】
９０μＭのプラスミドＭ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡ及び、末端を^３２Ｐでラベルされた３０μＭの５’−^ＶＣＧＴＧＣＡＧＣＴ−Ｔ_４０−ＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴ（ＯＤＮ Ｆ）を、０℃で３６６ｎｍの光照射を３時間行った。光反応後、５％のポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）を用いて電気泳動解析を行い、フォトパドロックされた目的のＤＮＡカテナンを３０％の収率で得ていることを確認した。また、この混合物にさらに３０２ｎｍの光照射を３０分行うことで定量的にＤＮＡカテナンが開裂していることをＰＡＧＥにより確認した。
結果を図９に示す。３６６ｎｍの光照射により、ＤＮＡカテナンのスポットが観察されるが、３０２ｎｍの光を照射することによりこのスポットが消失することが確認された。
【００６２】
実施例８ ２本鎖ＤＮＡをテンプレートとする環化法
次に示す反応式にしたがって２本鎖ＤＮＡをテンプレートとする環化を行った。
【００６３】
【化１２】

【００６４】
なお、反応式中のＳはポリエチレングリコールスペーサーを示している。
２０μＭの５’−^ＣＶＵＴＴＣＣＣＣＴＣＴＴＳＳＳＳＳＳＳＳＣＣＴＣＴＴＣ−３’（ＯＤＮ Ｊ）（Ｓはポリエチレングリコールスペーサー）に対して、２０μＭの ＧＴＡＣＴＧＡＡＴＴＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴＣ−３’（ＯＤＮ Ｋ）及び、２０μＭの５’−ＧＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＣＣＣＣＴＴＴＣＴＴＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＧＴＡＣ−３’（ＯＤＮＬ）の存在下に、３６６ｎｍの光照射を１時間行い、目的の環化したＤＮＡを９７％の収率で得た。ＰＡＧＥ解析によって同定を行った。また３０２ｎｍ光照射を３０分行うことで原料ＯＤＮ Ｊの回復を確認した。
結果を図３に示す。
【００６５】
実施例９ 枝分かれ構造の調製
２０μＭの５’−ＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡ−３’（ＯＤＮ Ｇ）及び、２０μＭの５’−^ＣＶＵＧＣＧＴＧ−３’（ＯＤＮ Ｈ）を、２０μＭの鋳型ＤＮＡ５’−ＣＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡ−３’（ＯＤＮ Ｉ）の存在下に、３６６ｎｍの光照射を０℃で１時間行い、目的の枝分かれ構造を有するＤＮＡを９８％の収率で得た。ＨＰＬＣによって単離した枝分かれＤＮＡを測定することで同定を行った。
ＨＰＬＣの結果を図５に示す。

【００６６】
実施例１０ シトシンのウラシルへの変換
図６に示す反応経路にしたがってシトシンからウラシルへの変換を行った。
２０μＭの５’−ＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡ−３’（ＯＤＮ Ｇ）及び、２０μＭの５’−^ＣＶＵＧＣＧＴＧ−３’（ＯＤＮ Ｈ）を、２０μＭの鋳型ＤＮＡ５’−ＣＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡ−３’（ＯＤＮ Ｉ）の存在下に、３６６ｎｍの光照射を０℃、１時間行い、枝分かれ構造を有するＤＮＡを９８％の収率で得た。収率はＨＰＬＣによって算出した。次に９０℃で加熱を１時間行い、その後３０２ｎｍの光照射を３０分行ったところシトシンからウラシルへ変換されたＤＮＡ（ＯＤＮ Ｍ）を６０％の収率で得ることができた。変換されたＤＮＡの同定は酵素分解によって行った。
結果を図７及び８に示す。
【００６７】
実施例１１ 固相担体に固定化されたＤＮＡの合成
次式で表される固相担体（Oligo Affinity Support）
【００６８】
【化１３】

【００６９】
２５ｍｇを用い、ＤＮＡ自動合成機により１μｍｏｌスケールで固相担体とＤＮＡの間にリンカーとして、ヘキサエチレングリコールを１分子挿入した配列を合成した。得られたＤＮＡはアンモニア水中、６５℃で４時間加熱することによって脱保護を行った。
【００７０】
実施例１２ 光連結・切断を用いたオリゴマーの配列選択的検出
（１） Ｒｕｎ０
１．５ｍｌエッペンドルフチューブにオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ０（５’−^ＣＶＵＣＣＡＡＴＴＣＧ−３’）が固定された固相担体を１ｍｇとり、塩化ナトリウム１ｍＭ、カコジル酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝７．０）５０ｍＭ、鋳型ＤＮＡ Ｃ０（５’−ＣＧＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＴＧＡＡＧＣ−３’）１２０μＭ、天然ＯＤＮ Ａ０〜Ａ３（Ａ０：５’−ＴＴＧＣＴＴＣＡＡＣＴ−３’、Ａ１：５’−ＧＣＴＴＴＣＴＣＴ−３’、Ａ２：５’−ＧＣＴＴＧＡＡＧＴ−３’、Ａ３：５’−ＴＧＣＴＴＡＧＧＡＴ−３’）が各１００μＭの濃度で溶液の全量が５μｌになるよう調整した。チューブを０℃で１５分放置した後、トランスイルミネーターで３６６ｎｍの光を３０分照射し、純水１ｍｌを加え、６５℃で加熱してから攪拌、遠心沈降させ、液のみを除去する操作を５回繰り返し、残った少量の水はスピードバックにより除去した。次に純水５μｌを加えて室温中でトランスイルミネーターにより３０２ｎｍの光を３０分照射し、液を１μｌ取ってＴＨＡＰをマトリックスとしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる測定を行った。結果を図１１に示す。
以上の操作によりＡ０の核酸のみを選択的に検出することができた。
【００７１】
（２） Ｒｕｎ１
前記（１）に記載したＲＵＮ０の場合の、固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ０に代えて固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ１（５’−^ＣＶＵＡＧＡＧＴＴＣＧ−３’）を用い、鋳型ＤＮＡ Ｃ０に代えてＣ１（５’−ＣＧＡＡＣＴＣＴＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣ−３’）を用いたほかは、前記（１）のＲＵＮ０の場合と同様に処理した。結果を図１１に示す。
以上の操作によりＡ１の核酸のみを選択的に検出することができた。
【００７２】
（３） Ｒｕｎ２
前記（１）に記載したＲＵＮ０の場合の、固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ０に代えて固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ２（５’−^ＣＶＵＧＣＡＴＴＴＣＧ−３’）を用い、鋳型ＤＮＡ Ｃ０に代えてＣ２（５’−ＣＧＡＡＴＴＧＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＣ−３’）を用いたほかは、前記（１）のＲＵＮ０の場合と同様に処理した。結果を図１１に示す。
以上の操作によりＡ２の核酸のみを選択的に検出することができた。
【００７３】
（４） Ｒｕｎ３
前記（１）に記載したＲＵＮ０の場合の、固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ０に代えて固定化されたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）Ｂ３（５’−^ＣＶＵＡＴＧＣＴＴＣＧ−３’）を用い、鋳型ＤＮＡ Ｃ０に代えてＣ３（５’−ＣＧＡＡＧＣＡＴＡＡＴＣＣＴＡＡＧＣ−３’）を用いたほかは、前記（１）のＲＵＮ０の場合と同様に処理した。結果を図１１に示す。
以上の操作によりＡ３の核酸のみを選択的に検出することができた。
【００７４】
結果を図１１に示す。図１１の最上段は、光を照射する前のものであり、各ピークは左からＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ０のそれぞれの核酸のものである。図１１の上から２段目はラン０（ＲＵＮ０）のものであり、Ａ０の核酸のみのピークが観察され、Ａ０の核酸のみが選択されたことを確認することができる。図１１の上から３段目はラン１（ＲＵＮ１）のものであり、Ａ１の核酸のみのピークが観察され、Ａ１の核酸のみが選択されたことを確認することができる。図１１の上から４段目はラン２（ＲＵＮ２）のものであり、Ａ２の核酸のみのピークが観察され、Ａ２の核酸のみが選択されたことを確認することができる。図１１の上から５段目（一番下）はラン３（ＲＵＮ３）のものであり、Ａ３の核酸のみのピークが観察され、Ａ３の核酸のみが選択されたことを確認することができる。

【００７５】
【発明の効果】
本発明は、短時間で効率よく核酸類を可逆的に連結できる新規な核酸類を提供する。本発明の核酸類を用いることにより、狙った位置で核酸同士を光連結したり、キャップ構造や枝分かれ構造を光を用いて簡便にしかも効率良く構築することができる。核酸を本発明の方法により光キャップ化することにより、分解酵素への耐性を付与することができる。また、光を用いてユニークな構造を持つ核酸を合成するため、環境にもやさしい方法である。
また、本発明の方法を用いれば対象遺伝子上の任意のシトシンをウラシルへと変異させることができる。これをウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理を行うことで任意の位置で特異的に切断することができる。このような変換はＤＮＡのみならず、ｍＲＮＡ上のシトシンをウラシルへ特異的に変換し、ｍＲＮＡの遺伝情報を特異的に変更することができる。
さらに、本発明の方法により２本鎖ＤＮＡの特定の位置を、可逆的に不活性化することができ、遺伝子治療やミスマッチ検出等の遺伝子診断に応用することができる。
また、本発明の固相上に固定化された光連結性核酸は、鋳型ＤＮＡによって目的の核酸のみを固相担体上に光連結させることが可能である。即ち、通常のアフィニティークロマトと違い、目的の核酸のみを共有結合により固相上への固定化が可能である。従って目的核酸の効率よい精製・分離が可能になる。また、違う波長の光照射によって目的核酸を回収することも可能である。このように高効率的な遺伝子の選別、回収が光制御可能であるため、ａ）目的ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白の精製、ｂ）遺伝子診断・遺伝子治療等、ｃ）機能性核酸の選別等への利用のみならず、ｄ）ＤＮＡ−コンピューティング、ｅ）核酸の固相担体への共有結合による固定化、ｆ）核酸の固相担体上での化学修飾等への利用も期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の方法によりＰＮＡ−ＤＮＡキメラ複合体を製造した結果を示す図面に代わる写真である。
【図２】図２は、本発明の方法により、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体を製造した結果を示すＨＰＬＣのチャートである。
【図３】図３は、本発明の方法により、２本鎖ＤＮＡを不活性化した結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】図４は、本発明の核酸に枝分かれ構造を導入する方法を例示したものである。
【図５】図５は、本発明の方法により、枝分かれ構造を有する核酸を製造した結果を示すＨＰＬＣのチャートである。
【図６】図６は、本発明のシトシンをウラシルに変換する方法を例示したものである。
【図７】図７は、本発明のシトシンをウラシルに変換する方法による結果を示したＨＰＬＣのチャートである。
【図８】図８は、本発明のシトシンをウラシルに変換する方法により製造されたウラシルを含有する核酸を酵素処理した結果を示すＨＰＬＣのチャートである。
【図９】図９は、本発明の方法により製造されたＤＮＡカテナンの製造結果を示した図面に代わる写真である。
【図１０】図１０は、本発明の固定化された核酸類を用いて核酸混合物中から、目的の核酸のみを特異的に選択する方法を模式図として示したものである。
【図１１】図１１は、本発明の固定化された核酸類を用いて核酸混合物中から、目的の核酸のみを特異的に選択する方法の結果を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのチャートである。図１１の最上段は、光を照射する前のものであり、各ピークは左からＳＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ０のそれぞれの核酸のものである。図１１の上から２段目は実施例１２のラン０のものであり、３段目はラン１のものであり、４段目はラン２のものであり、５段目（一番下）はラン３のものである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention provides a method for reversibly and efficiently linking nucleic acids using the photoreactivity of a pyrimidine base having a substituted vinyl group at the 5-position of pyrimidine, a nucleic acid for the method, and DNA immobilization using the method. It relates to the activation method. By the method of the present invention, capped nucleic acids and nucleic acids having a branched structure can be synthesized easily and efficiently.
The present invention also relates to nucleic acids having a pyrimidine base having a substituted vinyl group at the 5-position of pyrimidine immobilized on a solid phase carrier, and a method for immobilizing nucleic acids having a specific base sequence using the nucleic acids. , Purification, recovery methods, and identification, detection, or quantification methods.
[0002]
[Prior art]
As a method for linking nucleic acids such as DNA and PNA (peptide nucleic acid), the base strands of these nucleic acids were linked. According to such a method, it was difficult to synthesize end-capped nucleic acids and nucleic acids having a branched structure. As a method for synthesizing such end-capped nucleic acids and nucleic acids having a branched structure, a method such as introducing a linker and linking them was necessary.
In addition, when the basic strands of nucleic acids are different such as DNA and PNA, they cannot be directly linked. Furthermore, in such a conventional method, there is no specificity after ligation, and ligation and cleavage cannot be performed specifically.
The present inventors have previously applied for a patent on a method for linking and cleaving nucleic acids by light irradiation. However, the conventional method has a drawback in that the yield is low and the treatment requires a long time.
[0003]
The nucleic acid immobilized on the solid phase is used for affinity nucleic acid selection for selection of the target nucleic acid or for nucleic acid evolved in a test tube, and is widely used as a tool for genetic engineering. As a method for immobilizing nucleic acid on a solid phase, a method of immobilizing a nucleic acid having biotin on a solid phase carrier by biotin-avidin interaction, a method of immobilizing using magnetic beads, or a nucleic acid immobilized in advance For example, a method of immobilizing a target nucleic acid by ligating it with an enzyme is known. As a method for purifying nucleic acid, affinity column purification using the above-described nucleic acid having biotin or immobilized nucleic acid using magnetic beads is generally used.
As described above, various methods for immobilizing nucleic acids for purification and identification of nucleic acids are known. In either method, the target nucleic acid is immobilized using affinity by hydrogen bonding with the immobilized nucleic acid. There is no known method for immobilizing target nucleic acids by covalent bonds.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a nucleic acid having a novel base capable of reversibly linking nucleic acids by light irradiation.
The present invention also provides a novel method by which a branched nucleic acid and a cap nucleic acid can be synthesized easily.
Furthermore, the present invention provides a method for immobilizing nucleic acids on a solid support by light without using an enzyme or a chemical reaction reagent, and is based on a covalent bond rather than a hydrogen bond interaction. The present invention provides a method capable of firmly immobilizing on a solid support, a method for purifying and recovering nucleic acids using this method, and a method for identification, detection and quantification.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
By utilizing the photoreactivity of a pyrimidine base having a substituted vinyl group at the 5-position of pyrimidine, the present inventors can reversibly link nucleic acids, which are used to capped nucleic acids and branches. It was found that nucleic acids having a structure can be synthesized easily.
In addition, the present inventors fixed nucleic acids having a substituent having a vinyl group at the 5-position of pyrimidine on a solid phase carrier, and fixed the target nucleic acid by covalent bonding using light as a trigger. I was able to succeed. Moreover, it was found that not only the target nucleic acid can be quantitatively recovered by irradiation with light of a different wavelength, but also the solid phase carrier containing the photoligating nucleic acid can be recovered and reused.
That is, the present invention represents the following formula as the base moiety:
[0006]
[Chemical 2]

[0007]
(In the formula, Z represents O or NH, at least one of X and Y represents an electron-withdrawing group, and the remaining groups of X and Y represent a hydrogen atom.)
And a nucleic acid having the nucleic acid immobilized on a solid phase carrier.
The present invention also provides a nucleic acid by irradiating a nucleic acid having a base having the above-described nucleic acid of the present invention and a base having a carbon-carbon double bond, preferably a carbon-carbon double bond of a non-condensed ring system. The present invention relates to a method for reversibly photoligating or cleaving a class.
Furthermore, the present invention provides the nucleic acid of the present invention described above and a nucleic acid having cytosine as a base by irradiating light to link the bases together, and in the presence of an oxygen-containing substance such as oxygen or water, the amino group of cytosine And then selectively converting cytosine into uracil by cleaving light of a shorter wavelength to cleave the linkage between the bases.
[0008]
Further, the present invention is directed to a specific base of DNA, and the 5 ′ end and 3 ′ end of the nucleic acids of the present invention described above are complementary to the base sequence around the specific base of the DNA. The present invention relates to a method for inactivating DNA, which comprises arranging the nucleic acids of the present invention and irradiating it with light.
Furthermore, the present invention provides a method for immobilizing a target specific nucleic acid using the above-described immobilized nucleic acids of the present invention, a method for purifying and / or recovering a target specific nucleic acid, and It relates to a method for identification and / or detection and / or quantification.
That is, the present invention relates to a system in which a nucleic acid mixture containing the immobilized nucleic acids of the present invention and a nucleic acid having a base having a carbon-carbon double bond is present by irradiating with light. The present invention also relates to a method for immobilizing nucleic acids formed by covalently linking specific nucleic acids to be targeted by the present invention, and the present invention relates to the immobilized nucleic acids of the present invention and a carbon-carbon double bond. Specific nucleic acids in a nucleic acid mixture by irradiating light to a system in which a nucleic acid mixture containing nucleic acids having bases is present and photoligating specific nucleic acids to be targeted in the nucleic acid mixture by covalent bonding A method for identifying, detecting or quantifying specific nucleic acids in a nucleic acid mixture comprising separating or recovering the immobilized nucleic acids, and the present invention further relates to the immobilized nucleic acids of the present invention And having a carbon-carbon double bond Immobilize specific nucleic acids in a nucleic acid mixture by irradiating light to a system in which a nucleic acid mixture containing nucleic acids having bases is present and photoligating specific nucleic acids of interest in the nucleic acid mixture by covalent bonds. The present invention relates to a method for purifying and recovering specific nucleic acids, comprising purifying or recovering immobilized nucleic acids and then further photoirradiating the immobilized nucleic acids by irradiation with light.
[0009]
Thus, the nucleic acids of the present invention can be reversibly linked to and cleaved with nucleic acids such as DNA and PNA by light irradiation, and reversible photoligation of nucleic acids such as DNA and PNA. It is useful as an agent. The nucleic acids of the present invention can be subjected to a photoreaction using a double-stranded DNA as a template, and by linking the nucleic acids of the present invention at a specific base sequence site of the gene by such a method. A third nucleic acid in which a base and a base are linked by a photoreaction can be introduced into a specific base sequence of double-stranded DNA by the method of the present invention. As a result, transcription of the double-stranded DNA is suppressed and the DNA is inactivated, so that the nucleic acids of the present invention are useful as a DNA inactivating agent.
[0010]
PNA (peptide nucleic acid) is used as an antigene or antisense in gene therapy because it can bind to a complementary strand of DNA more strongly than natural DNA. However, PNA has a low solubility in water and has a low transport efficiency into cells and nuclei. In order to improve this, a PNA-DNA chimera complex utilizing the hydrophilicity and membrane affinity of DNA has attracted attention. However, since DNA and PNA have different basic strands, the synthesis method thereof is different. Was cumbersome.
We have pyrimidine bases having a vinyl group substituted with an electron withdrawing group at the 5-position of pyrimidine, such as the following formula (X),
[0011]
[Chemical 3]

[0012]
A nucleic acid having a terminal of 5-carboxyvinyluracil as a base and having a terminal nucleic acid was used for reversible nucleic acid linking by utilizing this photoreactivity.
First, PNA that is the complementary strand is placed on the DNA that is the template, then the nucleic acid of the present invention having the above-mentioned base is placed at the terminal portion of PNA, and this is irradiated with light at 366 nm for 3 hours. A PNA-DNA chimera complex linked at the base moiety was obtained. This reaction formula is shown by the following formula.
[0013]
[Formula 4]

[0014]
PNA (PNA A) and the nucleic acid of the present invention (ODN B) are placed on a template (ODN C) and irradiated with 366 nm light to obtain a PNA-DNA complex (PNA-DNA Hybrid E). In this scheme, the template (ODN C) is not directly involved in the reaction, but for convenience, the product template is used as the template (ODN D).
[0015]
The result is shown in FIG. FIG. 1 is a photograph replacing a drawing. The right side (-) of FIG. 1 is a spot before irradiating light, ³² It is a nucleic acid of the present invention labeled with P. The one after irradiation with light is shown on the left (+). It can be seen that by irradiating light, PNA and the nucleic acid of the present invention are linked and the spot moves to a higher molecular weight position.
FIG. 2 is a HPLC chart showing the results. The horizontal axis of FIG. 2 is the retention time (minutes), the upper part of FIG. 3 is a chart before light irradiation, and the lower part of FIG. 3 is a chart after light irradiation.
The leftmost peak in FIG. 3 is a template (ODN C) peak, and there is no change before and after light irradiation. The second and third peaks from the left in (a) are PNA (PNA A) peaks linked to the nucleic acid (ODN B) of the present invention. In the lower part of FIG. 2, it can be seen that the peaks of the two kinds of nucleic acids of the raw material have almost disappeared, and peaks of higher molecular weight products have appeared.
Thus, the double bond of the 5-position substituted vinyl group of pyrimidine which is the base of the nucleic acid of the present invention and the carbon-carbon double bond of the adjacent base are directly bonded by light. Thus, even if the basic chain is different, the bases can be linked together. Furthermore, this connection by light is a photoreversible reaction, and can be reversibly cleaved by irradiating with light of different wavelengths.
Also, by applying this method, it becomes possible to easily synthesize nucleic acids whose ends are capped with light. In gene therapy, in order to send a gene to the nucleus, it is necessary to impart enzyme resistance to the gene, and such enzyme resistance can be imparted by photocapping the nucleic acid of the present invention.
[0016]
Next, when a photoreaction with cytidine (cytosine base) was performed using a nucleic acid having 5-carboxyvinyluracil represented by the formula (X) as a base, irradiation with 366 nm ultraviolet rays for 30 minutes gave: The desired ligated DNA was obtained with a yield of 93%. As a comparative example, when a nucleic acid based on 5-vinyluracil having no carboxyl group substituted was used, the yield was 80% after 6 hours of irradiation.
Thus, it was found that the reaction can be carried out in a short time and in a high yield by replacing the hydrogen atom of the vinyl group with an electron withdrawing group such as a carboxyl group.
[0017]
The ligation reaction of the present invention preferably uses DNA or RNA as a template. That is, as shown in the above reaction formula with PNA, a DNA is used as a template, and a nucleic acid to be linked with its complementary strand is placed on the template, and the nucleic acid of the present invention is placed adjacent to each other so that the linked portions are adjacent. It is preferable to arrange and irradiate light. By using such a template, it is possible to selectively perform connection at a target position.
The inventor examined whether double-stranded DNA can be used as such a template. The formation of a base pair by a nucleic acid such as a third DNA in addition to a double-stranded DNA is known as a Hougesteen base pair.
Therefore, a nucleic acid having a base of 5-carboxyvinyluracil represented by the formula (X) at one end of the nucleic acid and a cytosine base (Py) at the other end is prepared, and both ends of the nucleic acid are adjacent to each other. A partial base was paired with a base pair of double-stranded DNA. This reaction formula is shown below.
[0018]
[Chemical formula 5]

[0019]
By irradiating this with light of 366 nm, circular DNA was obtained in 89% yield.
The results are shown in FIG. FIG. 3 is a photograph replacing the drawing. Lane 1 in FIG. 3 shows a 12-mer nucleic acid as a control, and Lane 2 is a case without light irradiation, and a non-circular nucleic acid spot is seen. Lane 3 is obtained when 366 nm light is irradiated, and a circular nucleic acid spot is observed. Lane 4 is obtained by further irradiating with light of 302 nm, and it can be seen that even when the ring is opened, a chain-like spot appears.
The resulting DNA is a double-stranded DNA in which a base part is cyclized by a photocyclization reaction to form a base pair. In this part, enzymes such as RNA polymerase and other proteins are present. As a result, the expression of this part of the gene is suppressed. Therefore, this method makes it possible to inhibit the expression of a gene whose expression is to be suppressed, and the nucleic acid of the present invention can be used as gene therapy.
Moreover, by irradiating the obtained circular DNA with light of 302 nm, the ring can be reversibly opened and the suppression of gene expression can be released.
[0020]
Next, a method for producing a branched nucleic acid was examined.
The outline is shown in FIG. For example, a template (ODN I) having a base sequence of AACCG and AGCCAC is terminated with 5-carboxyvinyluracil represented by the above formula (X) at the terminal (in FIG. 4). ^VC The nucleic acid (ODN H) of the present invention having the base sequence of UGCGTG ... having U) is arranged, and the nucleic acid having the partial sequence of ... TGTGC ... (ODN G) is arranged at an adjacent position thereof. . These base sequences are sequences complementary to the template, and the template base sequence can be selected according to the base sequence of the target nucleic acid.
When this is irradiated with light at 366 nm for 1 hour, the base part of 5-carboxyvinyluracil and the adjacent cytosine (C) are linked to obtain the branched nucleic acid shown in FIG.
[0021]
FIG. 5 is a HPLC chart showing the results. The horizontal axis of FIG. 5 is the retention time (minutes), FIG. 5 a) (upper part of FIG. 5) is a chart before light irradiation, and FIG. 5 b) (lower part of FIG. 5) is after light irradiation. It is a chart.
The leftmost peak in FIG. 5 is a template peak, and there is no change before and after light irradiation. The second and third peaks from the left in (a) are nucleic acid peaks that are linked to the nucleic acid of the present invention. In FIG. 5 (b), it can be seen that the peaks of the two types of nucleic acids of the raw material have disappeared, and a large peak of a higher molecular weight product has appeared. The molecular weight of this peak was 5250.12, which was consistent with the calculated value of 5249.90.
[0022]
Furthermore, according to the method of the present invention, any cytosine on the target gene can be mutated to uracil.
That is, in the same manner as in the production of the branched nucleic acid described above, the base of cytosine (C) of the target gene is immobilized on the template, and the nucleic acid of the present invention is placed adjacent to the cytosine and irradiated with light. Then, the target gene and the nucleic acid of the present invention are linked. In this linked state, the amino group at the 4-position of cytosine can be substituted with a hydroxyl group in the presence of an oxygen-containing substance such as oxygen or water. For example, when the temperature is raised gently in the air in a connected state, it is oxidized by air, and the amino group at the 4-position of the pyrimidine ring of cytosine is substituted with a hydroxyl group. Then, when light is irradiated again to cleave the connection, cytosine is converted to uracil.
[0023]
This reaction equation is shown in FIG. The process up to the production of a branched structure nucleic acid is the same as described above. That is, for example, a template (ODN I) having a base sequence of AACCG and ACGCAC is converted to a base (in FIG. 6), 5-carboxyvinyluracil represented by the above formula (X) at the end. ^VC U (in the following description ^CV Sometimes referred to as U. The nucleic acid (ODN H) of the present invention having a base sequence of UGCGTG...)) Is arranged, and the nucleic acid (ODN G) having a partial sequence of ... TGTGC. . These base sequences are sequences complementary to the template, and the template base sequence can be selected according to the base sequence of the target nucleic acid.
When this is irradiated with light at 366 nm for 1 hour, the base portion of 5-carboxyvinyluracil and the adjacent cytosine (C) are linked to obtain the branched nucleic acid shown in FIG. When this is heat-treated and then cleaved by irradiation with 302 nm light for 1 hour, a nucleic acid (ODN M) in which cytosine is converted to uracil can be obtained.
[0024]
FIG. 7 is a HPLC chart showing the results. The horizontal axis of FIG. 7 is the retention time (minutes), the upper part of FIG. 7 is a chart before light irradiation, and the lower part of FIG. 7 is a chart after light irradiation. The second peak from the left in FIG. 7 is a template peak, and there is no change before and after light irradiation. The first and third peaks from the left in the upper part of FIG. 7 are peaks of the nucleic acid (ODN G) linked to the nucleic acid (ODN H) of the present invention. In the lower part of FIG. 7, it can be seen that in addition to the peaks of the two kinds of nucleic acids of the raw material, the peak of the nucleic acid converted to uracil (ODN M) appears.
[0025]
When DNA in which cytosine is converted to uracil is treated with uracil DNA glycosylase, it can be cleaved specifically at the position of this uracil. Therefore, DNA can be cleaved specifically at any position by uracilizing the position of any cytosine in the DNA according to the method of the present invention.
FIG. 8 shows an HPLC chart of the result of enzymatic treatment of nucleic acid (ODM M) converted to uracil obtained by the method described above. A dU peak could be confirmed on the left side.
Moreover, cytosine on mRNA can be converted to uracil by a similar method. By specifically converting cytosine on mRNA to uracil by the method of the present invention, the encoded amino acid can be specifically changed.
Thus, by utilizing the nucleic acids of the present invention, a) photogene therapy, b) genetic diagnosis such as mismatch detection, etc. c) enzyme resistance can be imparted by capping the nucleic acid. D) Photo-mutation induction and the like can be performed. Next, the immobilized nucleic acids of the present invention will be described. A typical example of the immobilized nucleic acid of the present invention is represented by the following chemical formula.
[0026]
[Chemical 6]

[0027]
(Wherein Z represents O or NH, at least one of X and Y represents an electron-withdrawing group, and the remaining group of X and Y represents a hydrogen atom. A wavy line represents a nucleic acid moiety such as DNA, PNA or RNA. (The bold line indicates the linker portion, and the circle indicated by the sphere indicates the solid phase carrier.)
The nucleic acids of the present invention that can be cleaved and covalently linked to nucleic acids such as DNA and PNA by irradiation with light as described above are porous glass. Those bonded to a solid phase carrier such as beads or polystyrene, and preferably bonded to a solid phase carrier via a linker moiety such as a nucleic acid or a polyethylene glycol group.
[0028]
An example of utilization of the immobilized nucleic acids of the present invention is shown in FIG. The example shown in FIG. 10 is an example in which the above-described nucleic acid serving as a template is used as a template nucleic acid. Nucleic acids bound by dotted lines to the circles in FIG. 10 are the immobilized nucleic acids of the present invention. This nucleic acid has a base sequence complementary to a part of the template DNA shown on the right side of FIG. Nucleic acids having various base sequences exist in a container surrounded by a frame at the top of FIG. In the container, there is a nucleic acid having a base sequence complementary to a part of the template DNA.
When the immobilized nucleic acids of the present invention and the above-described template DNA are placed in this container, as shown in the second row from the top of FIG. 10, the immobilized nucleic acids and the template DNA of the present invention. A part of the nucleic acid hybridizes, and the remaining part of the template DNA hybridizes with a nucleic acid having a specific base sequence present in the container. At this time, as described above, the template DNA is designed so that the base that can be reversibly and covalently linked to the nucleic acids by irradiation of light of the present invention is adjacent to the base to be linked. By irradiation with light, both nucleic acids are covalently linked as shown in the second row from the top in FIG.
[0029]
Next, when the template DNA is dissociated and the solid phase carrier is separated and washed, as shown in the third row from the top in FIG. 10, a specific base covalently linked to the immobilized nucleic acids of the present invention. A nucleic acid having a sequence can be immobilized on a solid phase carrier and separated from other nucleic acids.
When the immobilized nucleic acid obtained as described above is irradiated again with light, the immobilized nucleic acid of the present invention and the nucleic acid having the target specific base sequence can be reversibly cleaved.
In this manner, a nucleic acid having a specific target base sequence can be selectively separated and purified from a mixture of nucleic acids having various base sequences. Moreover, since the immobilized nucleic acids of the present invention used at this time are linked and cleaved by a reversible reaction by light, they can be reused because they return to their original states after cleavage.
According to this method of the present invention, a target nucleic acid having a specific base sequence can be specifically and selectively separated and purified from a mixture of nucleic acids having various base sequences. Nucleic acids having a specific base sequence in the nucleic acid mixture can be identified, detected and quantified.
[0030]
FIG. 11 shows the experimental results of this method of the present invention. FIG. 11 is a chart of MALDI-TOF MS, and the uppermost part of FIG. 11 is a chart of a mixture of nucleic acids before irradiation with light. From the left, the peaks of nucleic acid A1, nucleic acid A2, nucleic acid A3, and nucleic acid A4 are shown (see Example 12 described later).
The second row from the top in FIG. 11 shows that only the nucleic acid A0 could be selected from the nucleic acid mixture by this method of the present invention. Similarly, the third row from the top in FIG. 11 shows that only the nucleic acid A1 can be selected from the nucleic acid mixture by this method of the present invention. Furthermore, the fourth row from the top in FIG. 11 shows that only the nucleic acid A2 can be selected from the nucleic acid mixture by this method of the present invention. The bottom row of FIG. 11 shows that only the nucleic acid A3 was selected from the nucleic acid mixture by this method of the present invention.
[0031]
In the photoligating nucleic acid immobilized on the solid phase according to the present invention, only the target nucleic acid can be photoligated on the solid phase carrier using the template DNA. That is, unlike ordinary affinity chromatography, only the target nucleic acid can be immobilized on a solid phase by covalent bonding. Therefore, it becomes possible to efficiently purify and separate the target nucleic acid. It is also possible to recover the target nucleic acid by irradiation with light of a different wavelength. Since the selection and recovery of highly efficient genes can be controlled in this way, a) purification of target DNA, RNA, protein, b) gene diagnosis / gene therapy, etc. c) selection of functional nucleic acids, etc. In addition to its use, it is also expected to be used for d) DNA-computing, e) immobilization of nucleic acid by covalent bond, f) chemical modification of nucleic acid on solid support.
[0032]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The nucleic acids of the present invention have the following formula in the base moiety:
[0033]
[Chemical 7]

[0034]
(In the formula, Z represents O or NH, at least one of X and Y represents an electron-withdrawing group, and the remaining groups of X and Y represent a hydrogen atom.)
It has the group represented by these.
Examples of the electron-withdrawing group in the substituents X and Y include a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, a cyano group, and a nitro group, but are not limited to these examples, and are considered to be suitable for cell systems. Thus, an electron withdrawing group can be selected as appropriate. Preferred examples of the electron withdrawing group include a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, and a cyano group. Examples of the alkyl group in the alkoxycarbonyl group include lower alkyl groups having 1 to 10, preferably 1 to 5 carbon atoms.
The substituents X and Y may be the same or different electron withdrawing groups at the same time, or only one of the substituents X and Y may be an electron withdrawing group and the other may be a hydrogen atom.
[0035]
The nucleic acids of the present invention may be any of DNA, RNA, PNA, etc., and those that can form base pairs with natural or synthetic DNA or RNA are preferred. The nucleic acids of the present invention may be mononucleotides having only the above-described bases of the present invention, but those that are oligonucleotides together with other nucleic acids are preferred. The number of bases in the oligonucleotide is not particularly limited, but is preferably 1 to 150, more preferably 1 to 50, and still more preferably about 1 to 20.
In the case of an oligonucleotide, it may have one nucleic acid having the above-mentioned base of the present invention, preferably at one terminal portion, but may have two or more such bases.
[0036]
The nucleic acids of the present invention can be produced according to a normal method for producing nucleic acids. For example, an amidation agent is allowed to act on the DMTr body of 5-substituted vinyluridine to amidide, then the protecting group is cleaved, and this can be converted into an oligonucleotide by a usual DNA synthesis method.
The 5-substituted vinyl cytosine derivative or the 5-substituted vinyl uracil derivative may be produced by a specific method shown below, but can also be produced by other ordinary organic synthesis methods.
[0037]
In the method of reversibly photoligating or cleaving the nucleic acids of the present invention, the base having a carbon-carbon double bond is not preferably a carbon-carbon double bond forming a condensed ring. A carbon-carbon double bond or a carbon-carbon double bond substituted on a ring is preferred. Preferred bases having a carbon-carbon double bond include cytosine, thymine, uracil and the like in the natural form.
The nucleic acid having a base having a carbon-carbon double bond may be any of DNA, RNA, PNA and the like.
[0038]
The nucleic acids having a base having a carbon-carbon double bond may be different from the nucleic acids of the present invention described above, but the nucleic acids having a base having a carbon-carbon double bond are those of the present invention. Nucleic acids may be used. In the latter case, a nucleic acid having the base moiety of the present invention and a base having a carbon-carbon double bond are present in one nucleic acid, and when this is linked, a circular nucleic acid can be obtained. it can.
The light in the method of the present invention may be light having a wavelength having energy necessary for the reaction, but ultraviolet light is preferable. In general, when they are connected, they may be on the relatively long wavelength side, and when they are cleaved, light on the relatively short wavelength side is preferred. More specifically, the wavelength when connecting is preferably 330 nm or more, preferably 350 nm or more, and more preferably 360 nm or more. The wavelength for cleavage is 320 nm or less, preferably 310 nm or less. Preferred examples of the wavelength include a case where the wavelength when coupled is 366 nm and the wavelength when cleaved is 302 nm.
[0039]
The method of the present invention can also be carried out in a state where it can flow freely as in a solution, but in order to increase the selectivity, a method of fixing to a template and reacting is preferred. Any template that can form a base pair such as DNA, RNA, or PNA may be used. The length of the template is not particularly limited, but a length of 3 bases or more, preferably 5 bases or more that can form a base pair on the template is preferable.
The template may be single-stranded, but double-stranded DNA can also be used as a template as described above.
[0040]
In the method of selectively converting cytosine of the present invention to uracil, any nucleic acid having cytosine as a base may be used as long as it can be immobilized on the template. A base sequence of about 3 to 10 bases upstream or downstream from the position of the target cytosine is examined, and one having a complementary base sequence thereof can be used as a template.
In addition, as oxygen-containing substances such as oxygen or water in this method, oxygen in the air, water for hydration, and the like can be used.
The uracilized DNA obtained by this method can be treated with uracil DNA glycosylase by a conventional method.
[0041]
The DNA in the DNA inactivation method of the present invention may be natural or synthetic, but may be a gene.
The base sequence of about 3 to 30 bases upstream and downstream of the base to be inactivated by this method is examined, and the 5 ′ end and the 3 ′ end have the same or complementary base sequence. The nucleic acid of the invention is prepared. One end of the nucleic acid of the present invention has the above-mentioned base of the present invention, and the other end is prepared so as to have a base having a carbon-carbon double bond connectable thereto. Then, the nucleic acid of the present invention is placed on the DNA to be inactivated and irradiated with light, whereby the circularized nucleic acid of the present invention is immobilized at the target position of the DNA (photopadlock). Law). And when trying to cancel | release this, inactivation can be cancelled | released by irradiating light of shorter wavelength, and cleaving a connection.
The specific base of the DNA to be inactivated is preferably a promoter region, but is not limited thereto.
[0042]
As described above, the nucleic acids of the present invention can reversibly link nucleic acids such as DNA, RNA, and PNA by light irradiation. By this method, a branched structure or a cap structure can be added to the nucleic acids. Since it can be introduced, the nucleic acids of the present invention can be used as a reversible photoligating agent.
In addition, since the nucleic acids of the present invention can react with double strands to inactivate them, the nucleic acids of the present invention can be used as a DNA inactivating agent.
[0043]
As the solid phase carrier in the immobilized nucleic acids of the present invention, a solid phase carrier used in the biochemical field can be used. Examples thereof include inorganic substances such as porous glass beads (PCG), resins such as polystyrene (PS), metals such as gold, and the like. Preferred solid phase carriers include solid phase carriers having adenosine residues (such as oligoaffinity support (OAS) (trade name)). More specifically, polystyrene (PS) (OAS-PS) or porous glass beads (OAS-CPG) are bonded via an amino group bonded to the ring of the adenosine residue as described in Example 11 described later. ) Is preferable, and the immobilized nucleic acid of the present invention can be produced by binding a linker moiety from the amino group.
The nucleic acids of the present invention may be directly bonded to the solid phase carrier described above, but it is preferable that they are bonded via a linker moiety. The linker moiety may be any molecular species that is inert to the chemical reaction of nucleic acids and has 5 or more, preferably 10 or more atoms, and preferably a linear molecular species. The linker moiety is preferably a nucleic acid such as DNA, RNA or PNA, or polyethylene glycol represented by the following formula.
[0044]
[Chemical 8]

[0045]
As a method for producing the immobilized nucleic acid of the present invention, it can be produced by binding the terminal phosphate group of the nucleic acid of the present invention to a linker moiety. The linker part and the nucleic acid may be bound and then bound to the solid phase carrier, or conversely, the solid phase carrier and the linker part may be bound first, and then the linker part and the nucleic acid may be bound. . In general, the terminal phosphate group is preferably used as the position for binding to the nucleic acids, but is not limited thereto. For example, you may couple | bond with the functional group of the base part in the middle of nucleic acids.
In the method using the immobilized nucleic acids of the present invention, it is preferable to use a nucleic acid as a template together. As a template nucleic acid, DNA is generally preferable, but RNA or PNA may be used. The nucleic acid to be a template includes a complementary base sequence that can hybridize with the immobilized nucleic acids of the present invention as a part thereof and a complementary base sequence that can hybridize to the target nucleic acid. Then, a nucleic acid serving as a template is designed so that a base that can be reversibly linked and cleaved by light irradiation of the present invention and a base that can photoreact with the base are adjacent to each other.
As a nucleic acid to be a template in this method of the present invention, a nucleic acid that can be a template in the above-described experimental example can be used.
[0046]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these Examples.
A reaction formula of a production example of a nucleic acid containing 5-cyanovinyldeoxyuridine is shown below. In the following description, the compound number shown in this reaction formula is used.
[0047]
[Chemical 9]

[0048]
Example 1 Production of 5-cyanovinyldeoxyuridine (4)
(1) Production of compound (2)
5-Iodo-deoxyuridine (IDU) (1) was azeotroped three times with 5 mL of pyridine, purged with nitrogen together with TBDMS-Cl (1.717 g, 11.40 mmol), and 5 mL of pyridine was added to obtain a homogeneous solution. A pyridine solution (5 mL) of imidazole (0.776 g, 11.39 mmol) was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 12 hours. After confirming the disappearance of the raw material by thin layer chromatography (TLC), pyridine was distilled off under reduced pressure, and the residue was extracted with ethyl acetate (20 mL × 3) and water (20 mL). The obtained organic layer was dried over magnesium sulfate, the solvent was removed, and the target compound (2) was then purified by column chromatography (silica gel, elution solvent hexane / ethyl acetate = 4: 1) as a white solid (1.661 g, 96.5%).
¹ 1 H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) Δ:
0.04-0.14 (m, 12H, CH3Six4), 0.88 (s, 9H, t-BuSi),
0.93 (s, 9H, t-BuSi), 1.96 (m, 1H, H-2β '), 2.28 (m, 1H, H-2α'),
3.74 (dd, J = 11.2Hz, J = 2.4Hz, 1H, H-5 '),
3.87 (dd, J = 11.2Hz, J = 2.4Hz, 1H, H-5 '),
3.97 (m, 1H, H-4 '), 4.38 (m, 1H, H-3'), 6.25 (t, 1H, H-1 '),
8.07 (s, 1H, H-6), 8.09 (br, 1H, NH)
[0049]
(2) Production of compound (3)
Pd (OAc) ₂ (0.019 g, 0.085 mmol), PPh ₃ (0.045 g, 0.170 mmol) was added into DMF (2.5 mL) under a nitrogen atmosphere, followed by more NEt. ₃ (0.93 mL, 6.672 mmol) was added and stirred in a 60 ° C. water bath. After the solution turned deep red, compound (2) obtained in (1) (0.498 g, 0.854 mmol) and acrylonitrile (0.7 mL, 10.63 mmol) were added as a DMF solution and stirred overnight. . After removing DMF under reduced pressure, extraction was performed with ethyl acetate (15 mL × 3) and water (15 mL), and the resulting organic layer was dried over magnesium sulfate and the solvent was removed again. The target compound (3) was isolated as a yellow solid (0.434 g, 53.7%) by column chromatography (silica gel, elution solvent hexane / ethyl acetate = 4: 1) with respect to the residue.
¹ 1 H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) Δ:
0.03-0.14 (m, 12H, CH3Six4), 0.88 (s, 9H, t-BuSi),
0.91 (s, 9H, t-BuSi), 2.00 (m, 1H, H-2'β), 2.39 (m, 1H, H-2'α),
3.76 (dd, 1H, H-5 '), 3.87 (dd, 1H, H-5'), 4.00 (m, 1H, H-4 '),
4.37 (m, 1H, H-3 '), 6.23 (t, 1H, H-1'),
6.67 (dd, J = 16.4Hz, 1H, vinylic H-1``),
6.85 (dd, J = 16.2Hz, 1H, vinylic H-2``), 7.96 (s, 1H, H-6),
7.98 (br, 1H, NH)
[0050]
(3) Production of compound (4)
To the compound (3) (0.233 g, 0.459 mmol) obtained in (2) above, 2.0 mL of TBAF (in THF, 1 mmol / l) was added and stirred at room temperature for 45 minutes, and then the solvent was removed. Column chromatography on silica gel (silica gel, elution solvent 5% MeOH in CHCl ₃ ) To isolate the desired compound (4) as a pale yellow solid (0.128 g, 75%).
¹ 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) Δ:
2.15 (m, 2H, H-2'αβ), 3.57 (m, 1H, H-5 '), 3.65 (m, 1H, H-5'),
3.80 (m, 1H, H-4 '), 4.23 (m, 1H, H-3'), 5.10 (t, 1H, OH-5 '),
5.26 (d, 1H, OH-3 '), 6.08 (t, J = 6.4Hz, 1H, H-1'),
6.50 (dd, J = 1.6Hz, J = 14Hz, 1H, vinylic H-1``),
7.22 (dd, J = 1.6Hz, J = 14Hz, 1H, vinylic H-2``), 8.33 (s, 1H, H-6),
11.72 (br, 1H, NH)
[0051]
Example 2 Production of nucleic acid (7) containing 5-cyanovinyldeoxyuridine
(1) Production of compound (5)
After boiling the compound (4) obtained in Example 1 (0.096 g, 0.344 mmol) with 2 mL of pyridine three times, DMTr-Cl (0.133 g, 0.392 mmol), Under a nitrogen atmosphere with DMAP (0.025 g, 0.203 mmol). Pyridine (1 mL) was added and stirred to obtain a homogeneous solution. Further NEt here ₃ (0.05 mL, 0.359 mmol) was added and stirred at room temperature for 20 hours. After removing pyridine under reduced pressure, extraction was performed with chloroform (10 mL × 3) and water (10 mL), and the resulting organic layer was dried over sodium sulfate to remove the solvent. Column chromatography on the residue (silica gel, elution solvent 3% MeOH in CHCl ₃ ) Gave the desired compound (5) as a yellow solid (0.096 g, 47.9%).
¹ 1 H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) Δ:
2.38 (m, 1H, H-2'β), 2.49 (m, 1H, H-2'α),
3.43 (dd, J = 10.4Hz, J = 2.4Hz, 1H, H-5 '),
3.52 (dd, J = 2.4Hz, J = 10.4Hz, 1H, H-5 '), 3.80 (s, 6H, OCH3x2),
4.11 (m, 1H, H-4 '), 4.68 (m, 1H, H-3'),
6.50 (d, J = 14Hz, 1H, vinylic H-1``), 6.08 (t, J = 6.4Hz, 1H, H-1 '),
7.22 (d, J = 14Hz, 1H, vinylic H-2``),
6.84-6.87 (m, 4H, H-β to OCH3x4), 7.20-7.33 (m, 9H, phenyl),
7.98 (br, 1H, NH), 8.00 (s, 1H, H-6)
[0052]
(2) Production of compound (7)
The compound (5) obtained in the above (1) was transferred to a rubber shield bottle using acetonitrile, and then the pressure was reduced to remove the solvent, and an argon atmosphere was obtained. Acetonitrile (1 mL) was added to dissolve the solid, then an amidite forming agent (50 uL) and tetrazole (0.5 M, 360 uL) were added in this order, and the mixture was stirred for 90 minutes. NaHCO in advance ₃ Ethyl acetate washed with aqueous solution and saturated NaHCO 3 ₃ Extraction operation was performed using an aqueous solution, and the obtained organic layer was dried over sodium sulfate to remove the solvent. The obtained solid was transferred to a rubber shield bottle using acetonitrile, and the solvent was removed under reduced pressure. Further, the azeotropic operation with acetonitrile was performed twice. Without further purification, it was attached to a DNA synthesizer and oligomer synthesis was carried out.
Using a DNA synthesizer, an oligomer (5'- ^CN UGC GTG) was synthesized and purified using HPLC.

[0053]
By the same method as in Example 2, the compounds (9) to (11) shown in the following reaction formula were produced. In the following description, the compound number shown in this reaction formula is used.
[0054]
[Chemical Formula 10]

[0055]
Example 3 Production of Compound (9)
A commercially available amidite (7) was attached to an automatic DNA synthesizer, and DNA was synthesized by the phosphoramidite method. The DNA was excised and deprotected by performing ammonia treatment from the solid phase carrier at 65 ° C. for 4 hours. After the ammonia is distilled off, purification is performed by HPLC, and the target DNA (5′- ^VC UGCGTG-3 ′) was obtained.

[0056]
Example 4 Production of Compound (10)
A commercially available amidite (7) was attached to an automatic DNA synthesizer, and DNA was synthesized by the phosphoramidite method using an amidite that can be deprotected under mild conditions. The DNA was excised and deprotected by performing ammonia treatment from the solid phase carrier at 37 ° C. for 1 hour. After the ammonia is distilled off, purification is performed by HPLC, and the target DNA (5′- ^VM UGCGTG-3 ′) was obtained.

[0057]
Example 5 Production of Compound (11)
A commercially available amidite (7) was mounted on an automatic DNA synthesizer, and DNA was synthesized by the phosphoramidite method. The DNA was modified, excised and deprotected by heating from a solid phase carrier with a 2N solution of trimellylenediamine in a sealed condition at 65 ° C. for 4 hours. After neutralization with 1N acetic acid, methanol and water were distilled off, purification was performed by HPLC, and the target DNA (5′- ^VA UGCGTG-3 ′) was obtained.

[0058]
Example 6 Production of PNA-DNA chimera complex
20 μM peptide nucleic acid N-TGTGCC-C (PNA A) and 20 μM 5′- ^CV UGCGTG-3 ′ (ODN B) was irradiated with light at 366 nm for 6 hours at 0 ° C. in the presence of 20 μM template DNA 5′-CACGCAGGCACA-3 ′ (ODN C), and 90% of the target DNA-PNA hybrid was obtained. The yield was obtained. Identification was performed by measuring the molecular weight of the DNA-PNA hybrid isolated by HPLC. The results are shown in FIGS.

[0059]
Example 7 Production of DNA catenane
A circular DNA (DNA catenane) passing through the circular DNA circle was prepared according to the following reaction formula.
[0060]
Embedded image

[0061]
90 μM plasmid M13mp18 ssDNA and ends ³² 30 μM 5′− labeled with P ^V CGTGCAGCT-T ₄₀ -GGAAACCGT (ODN F) was irradiated with light at 366 nm for 3 hours at 0 ° C. After the photoreaction, electrophoretic analysis was performed using 5% polyacrylamide gel (PAGE), and it was confirmed that the target DNA catenane that was photopadlocked was obtained in a yield of 30%. Moreover, it was confirmed by PAGE that the DNA catenane was cleaved quantitatively by further irradiating the mixture with light of 302 nm for 30 minutes.
The results are shown in FIG. A spot of DNA catenane was observed by irradiation with light at 366 nm, but it was confirmed that this spot disappeared by irradiation with light at 302 nm.
[0062]
Example 8 Circularization method using double-stranded DNA as template
Cyclization using double-stranded DNA as a template was performed according to the following reaction formula.
[0063]
Embedded image

[0064]
Note that S in the reaction formula represents a polyethylene glycol spacer.
20 μM 5′− ^CV UTTCCCCTCTTSSSSSSSSCCTCTTC-3 ′ (ODN J) (S is a polyethylene glycol spacer), 20 μM GTACTGAATTCGGAGAGAAAAAGGGAGAGAATTCTACTC-3 ′ (ODN K), 20 μM 5′-GATAGATATCTCCCTCTCTCTCTCTC Light irradiation was performed for 1 hour, and the desired circularized DNA was obtained in a yield of 97%. Identification was performed by PAGE analysis. Moreover, the recovery of the raw material ODN J was confirmed by performing light irradiation at 302 nm for 30 minutes.
The results are shown in FIG.
[0065]
Example 9 Preparation of a branched structure
20 μM 5′-TGTGCAAAAA-3 ′ (ODN G) and 20 μM 5′- ^CV UGCGTG-3 ′ (ODN H) was irradiated with light at 366 nm for 1 hour at 0 ° C. in the presence of 20 μM template DNA 5′-CACGCAGGCACA-3 ′ (ODN I). % Yield. Identification was performed by measuring branched DNA isolated by HPLC.
The result of HPLC is shown in FIG.

[0066]
Example 10 Conversion of cytosine to uracil
Conversion from cytosine to uracil was performed according to the reaction pathway shown in FIG.
20 μM 5′-TGTGCAAAAA-3 ′ (ODN G) and 20 μM 5′- ^CV UGCGTG-3 ′ (ODN H) was irradiated with light at 366 nm at 0 ° C. for 1 hour in the presence of 20 μM template DNA 5′-CACGCAGGCACA-3 ′ (ODN I), and 98% of the DNA having a branched structure was obtained. Obtained in yield. Yield was calculated by HPLC. Next, heating was performed at 90 ° C. for 1 hour, followed by irradiation with light of 302 nm for 30 minutes. As a result, DNA converted from cytosine to uracil (ODN M) could be obtained in a yield of 60%. The converted DNA was identified by enzymatic degradation.
The results are shown in FIGS.
[0067]
Example 11 Synthesis of DNA immobilized on a solid support
Solid phase carrier represented by the following formula (Oligo Affinity Support)
[0068]
Embedded image

[0069]
Using 25 mg, a sequence in which one molecule of hexaethylene glycol was inserted as a linker between the solid phase carrier and the DNA was synthesized on a 1 μmol scale by an automatic DNA synthesizer. The obtained DNA was deprotected by heating at 65 ° C. for 4 hours in ammonia water.
[0070]
Example 12 Sequence Selective Detection of Oligomers Using Photoligation / Cleavage
(1) Run0
In a 1.5 ml Eppendorf tube, oligodeoxynucleotide (ODN) B0 (5'- ^CV 1 mg of a solid support on which UCCAATTCG-3 ′) is fixed, 1 mM sodium chloride, 50 mM sodium cacodylate buffer solution (pH = 7.0), template DNA C0 (5′-CGAATTGGAAGTTGAAGC-3 ′) 120 μM, natural ODN A0 to A3 (A0: 5′-TTGCTCCAACT-3 ′, A1: 5′-GCTTTCCT-3 ′, A2: 5′-GCTTGAAGT-3 ′, A3: 5′-TGCTTAGGAT-3 ′) at a concentration of 100 μM each. The total volume of the solution was adjusted to 5 μl. After leaving the tube at 0 ° C for 15 minutes, irradiate it with light of 366 nm for 30 minutes with a transilluminator, add 1 ml of pure water, heat at 65 ° C, stir and centrifuge to remove only the liquid. Repeated 5 times, the remaining small amount of water was removed by speedback. Next, 5 μl of pure water was added and 302 nm light was irradiated for 30 minutes at room temperature with a transilluminator. 1 μl of the solution was taken and measured by MALDI-TOF MS using THAP as a matrix. The results are shown in FIG.
Only the A0 nucleic acid could be selectively detected by the above operation.
[0071]
(2) Run1
In the case of RUN0 described in (1) above, immobilized oligodeoxynucleotide (ODN) B1 (5′-) instead of immobilized oligodeoxynucleotide (ODN) B0 ^CV UAGAGTTCG-3 ′) and C1 (5′-CGAACTCTAAGAGAAAAGC-3 ′) was used instead of template DNA C0, and the same treatment as in RUN0 of (1) above was performed. The results are shown in FIG.
By the above operation, only the A1 nucleic acid could be selectively detected.
[0072]
(3) Run2
In the case of RUN0 described in (1) above, immobilized oligodeoxynucleotide (ODN) B2 (5′-) instead of immobilized oligodeoxynucleotide (ODN) B0 ^CV UGCATTTCG-3 ′) and C2 (5′-CGAATTGCAACTTCAAGC-3 ′) was used instead of template DNA C0, and the same treatment as in RUN0 of (1) above was performed. The results are shown in FIG.
By the above operation, only the A2 nucleic acid could be selectively detected.
[0073]
(4) Run3
In the case of RUN0 described in (1) above, immobilized oligodeoxynucleotide (ODN) B3 (5′-) instead of immobilized oligodeoxynucleotide (ODN) B0 ^CV UATGCTTCG-3 ′) and C3 (5′-CGAAGCATAATCCTAAGC-3 ′) was used instead of template DNA C0, and the same treatment as in RUN0 of (1) above was performed. The results are shown in FIG.
By the above operation, only the A3 nucleic acid could be selectively detected.
[0074]
The results are shown in FIG. The top row in FIG. 11 is before light irradiation, and each peak is from the nucleic acid of A1, A2, A3, A0 from the left. The second row from the top in FIG. 11 is for run 0 (RUN0), and a peak of only the nucleic acid of A0 is observed, and it can be confirmed that only the nucleic acid of A0 has been selected. The third row from the top in FIG. 11 is for run 1 (RUN1), and only the peak of A1 nucleic acid is observed, and it can be confirmed that only the nucleic acid of A1 has been selected. The fourth row from the top in FIG. 11 is for Run 2 (RUN2), and a peak of only the A2 nucleic acid is observed, and it can be confirmed that only the A2 nucleic acid has been selected. The fifth row (bottom) from the top of FIG. 11 is for Run 3 (RUN3), and a peak of only the A3 nucleic acid is observed, confirming that only the A3 nucleic acid has been selected.

[0075]
【The invention's effect】
The present invention provides novel nucleic acids capable of reversibly linking nucleic acids efficiently in a short time. By using the nucleic acids of the present invention, nucleic acids can be optically linked to each other at a target position, and a cap structure or a branched structure can be easily and efficiently constructed using light. Resistance to degrading enzymes can be imparted by photocapping a nucleic acid by the method of the present invention. In addition, it is an environmentally friendly method because it uses light to synthesize nucleic acids with unique structures.
Further, any cytosine on the target gene can be mutated to uracil by using the method of the present invention. This can be specifically cleaved at any position by performing uracil DNA glycosylase treatment. Such conversion can specifically change cytosine on mRNA as well as DNA to uracil and specifically change the genetic information of mRNA.
Furthermore, a specific position of the double-stranded DNA can be reversibly inactivated by the method of the present invention, and can be applied to gene diagnosis such as gene therapy and mismatch detection.
In addition, the photoligating nucleic acid immobilized on the solid phase of the present invention can photocouple only the target nucleic acid on the solid phase carrier using the template DNA. That is, unlike ordinary affinity chromatography, only the target nucleic acid can be immobilized on a solid phase by covalent bonding. Therefore, it becomes possible to efficiently purify and separate the target nucleic acid. It is also possible to recover the target nucleic acid by irradiation with light of a different wavelength. Since the selection and recovery of highly efficient genes can be controlled in this way, a) purification of target DNA, RNA, protein, b) gene diagnosis / gene therapy, etc. c) selection of functional nucleic acids, etc. In addition to its use, it is also expected to be used for d) DNA-computing, e) immobilization of nucleic acid by covalent bond, f) chemical modification of nucleic acid on solid support.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph replacing a drawing, showing the result of producing a PNA-DNA chimeric complex by the method of the present invention.
FIG. 2 is a HPLC chart showing the results of producing a PNA-DNA complex by the method of the present invention.
FIG. 3 is a photograph replacing a drawing, showing the result of inactivation of double-stranded DNA by the method of the present invention.
FIG. 4 illustrates a method for introducing a branched structure into the nucleic acid of the present invention.
FIG. 5 is a HPLC chart showing the results of producing a nucleic acid having a branched structure by the method of the present invention.
FIG. 6 illustrates a method for converting cytosine of the present invention to uracil.
FIG. 7 is a HPLC chart showing the results of the method for converting cytosine of the present invention to uracil.
FIG. 8 is a HPLC chart showing the result of enzymatic treatment of nucleic acid containing uracil produced by the method of converting cytosine of the present invention to uracil.
FIG. 9 is a photograph replacing a drawing showing the production results of DNA catenane produced by the method of the present invention.
FIG. 10 is a schematic diagram showing a method for specifically selecting only a target nucleic acid from a nucleic acid mixture using the immobilized nucleic acids of the present invention.
FIG. 11 is a MALDI-TOF MS chart showing the results of a method for specifically selecting only a target nucleic acid from a nucleic acid mixture using the immobilized nucleic acids of the present invention. The top row in FIG. 11 is the one before irradiation with light, and each peak is from the nucleic acid of SA1, A2, A3, A0 from the left. The second row from the top in FIG. 11 is for run 0 of Example 12, the third row is for run 1, the fourth row is for run 2, and the fifth row (bottom). Is for run 3.

Claims (30)

As a base moiety the following formula I:

(In Formula I, Z represents O or NH, and at least one of X and Y represents an electron-withdrawing group selected from the group consisting of a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a substituted amide group, and a cyano group; And the remaining group of Y represents a hydrogen atom.)
A reversible photoligating agent for nucleic acids, comprising nucleic acids having a group represented by formula (wherein nucleic acids include nucleic acids, mononucleotides, and peptide nucleic acids).   The reversible photolinking agent according to claim 1, wherein Z is O, X is a hydrogen atom, and Y is a carboxyl group, a lower alkoxycarbonyl group, a substituted amide group or a cyano group.   The reversible photoligating agent according to claim 1 or 2, wherein the nucleic acid having a group represented by formula I is a mononucleotide.   The reversible photoligating agent according to any one of claims 1 to 3, wherein the nucleic acid having a group represented by formula I is an oligonucleotide.   The reversible photoligating agent according to claim 4, wherein the nucleic acid having a group represented by formula I is DNA or RNA.   The reversible photoligating agent according to claim 1 or 2, wherein the nucleic acid having a group represented by formula I is PNA.   The reversible optical coupling agent by which the reversible optical coupling agent in any one of Claims 1-6 was fix | immobilized by the solid-phase carrier.   The immobilized reversible photolinking agent according to claim 7, wherein the solid phase carrier is porous glass beads (CPG), polystyrene (PS), or gold.   The immobilized reversible photolinker according to claim 7 or 8, further comprising a linker moiety for maintaining a distance between the solid phase carrier and the reversible photolinker.   The reversible photolinker according to claim 9, wherein the linker moiety is composed of a nucleic acid or a derivative thereof.   The reversible photolinker according to claim 9, wherein the linker moiety is made of polyethylene glycol.   The reversible photolinker according to any one of claims 1 to 11 and a nucleic acid having a base having a carbon-carbon double bond are irradiated with light, whereby the nucleic acid and the reversible photolinker are reversible. Optically ligating or cleaving.   The method according to claim 12, wherein the base having a carbon-carbon double bond is cytosine, thymine, or uracil.   The method according to claim 12 or 13, wherein the nucleic acids having a base having a carbon-carbon double bond are DNA or RNA.   The method according to claim 12 or 13, wherein the nucleic acid having a base having a carbon-carbon double bond is PNA.   The nucleic acid having a base having a carbon-carbon double bond and the nucleic acid of the reversible photolinker according to any one of claims 1 to 11 are the same nucleic acid. The method described.   The method according to any one of claims 12 to 16, wherein the light is ultraviolet light.   The method according to any one of claims 12 to 17, wherein the wavelength when cleaving is light having a shorter wavelength than the wavelength when coupling.   The method according to claim 18, wherein the wavelength when ligating is 366 nm and the wavelength when cleaving is 302 nm.   The method according to any one of claims 12 to 19, wherein the nucleic acids are immobilized on a template.   21. The method of claim 20, wherein the template is double stranded DNA. For specific bases of DNA,
The 5 ′ end and the 3 ′ end have a base sequence complementary to the base sequence around the specific base of the DNA,
Having a group represented by the formula I as a base moiety at either the 5 ′ end or the 3 ′ end,
The reversible photoligating agent according to any one of claims 1 to 11 having cytosine as the base moiety at the other of the 5 'end or the 3' end (except for mononucleotides as nucleic acids),
The nucleic acid or peptide nucleic acid was reversibly photoligated to form a base pair by irradiating light with a base pair formed in a base sequence around a specific base of the previous DNA. A method for producing reversibly inactivated DNA by forming a circular nucleic acid or peptide nucleic acid.   The method according to claim 22, wherein the DNA is a double-stranded DNA. For specific bases of DNA,
The 5 ′ end and the 3 ′ end have a base sequence complementary to the base sequence around the specific base of the DNA,
Having a group represented by the formula I as a base moiety at either the 5 ′ end or the 3 ′ end,
The reversible photoligating agent according to any one of claims 1 to 11, which has cytosine as the base moiety at the other of the 5 'end or the 3' end (however, except for mononucleotides as nucleic acids). Activator.   A wavelength of 330 nm or more in a system in which a nucleic acid mixture containing the immobilized reversible photolinker according to any one of claims 7 to 11 and a nucleic acid having a base having a carbon-carbon double bond is present. A method of immobilizing nucleic acids formed by photoligating specific nucleic acids in the nucleic acid mixture by irradiating with the light.   Light having a wavelength of 330 nm or more is applied to a system in which the nucleic acid mixture containing the immobilized nucleic acid according to any one of claims 7 to 11 and a nucleic acid having a base having a carbon-carbon double bond is present. Specific nucleic acids in a nucleic acid mixture comprising: irradiating and photoligating specific nucleic acids in the nucleic acid mixture to immobilize specific nucleic acids in the nucleic acid mixture, and separating or recovering the immobilized nucleic acids A method for identifying, detecting or quantifying a class.   27. The specific nucleic acid mixture according to claim 26, which comprises separating or recovering the immobilized nucleic acids, and further photo-cleaving the immobilized nucleic acids by irradiation with light having a wavelength of 320 nm or less. A method for identifying, detecting or quantifying nucleic acids.   Light having a wavelength of 330 nm or more is applied to a system in which the nucleic acid mixture containing the immobilized nucleic acid according to any one of claims 7 to 11 and a nucleic acid having a base having a carbon-carbon double bond is present. After irradiating and photoligating specific nucleic acids in the nucleic acid mixture to immobilize the specific nucleic acids in the nucleic acid mixture, and purifying or recovering the immobilized nucleic acids, further light of a wavelength of 320 nm or less A method for purifying or recovering specific nucleic acids, comprising photocleaving nucleic acids immobilized by irradiation.   The method according to any one of claims 25 to 28, wherein the base having a carbon-carbon double bond is cytosine, thymine or uracil.   The method according to any one of claims 25 to 29, wherein the nucleic acids having a base having a carbon-carbon double bond are DNA or RNA.

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