JP3438888B2 - 非分裂促進競合性ｈｇｆ拮抗剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は代替HGF mRNA転写物によりコードされ、HGF
の分裂促進活性と特異的に拮抗する、端部切取り形の肝
細胞増殖因子（HGF）に関する。特に、本発明はその細
胞表面レセプターに結合するHGFのレベルで競合的拮抗
剤として機能する、スモールHGF変種に関する。

本発明は細胞増殖が悪性腫瘍のケースのように過剰で
あるか又は一部は様々な形のHGFの異常発現により害さ
れている症状の診断及び治療方法に更に関する。

背景情報 肝細胞増殖因子はホルモン様活性を有し、部分的肝切
除及び肝損傷に応答して放出され、肝再生の重要な媒介
物質であると考えられる〔Nakamura et al,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA,84:6489−6493（1986）;Gohda et al,J.Cl
in.Invest.,81:414−419（1988）;R.Zarnegar及びG.Mic
halopoulous,Cancer Research.49:3314−3320（198
9）〕。間質繊維芽細胞によるその偏在的発現、並び
に、メラニン細胞、内皮細胞及び上皮細胞においてDNA
合成を促進するとの実証済の能力は、この因子が細胞増
殖のパラ分泌調節でも役割を果たすことを示唆している
〔Rubin et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:415（199
1）〕。限られた領域にわたりHGFと高いアミノ酸配列同
一性を示す散乱因子の精製についての最近のレポート
は、HGFが細胞−細胞相互作用及び移動の調節にも関与
することを示唆している〔E.Gherardi及びM.Stoker,Nat
ure,346:228（1990）;Weidner et al,J.Cell Biology,1
11:2097−2108（1990）〕。

構造的に、HGFはそれが特徴的なクリングルドメイン
〔Patthy et al,FEBS Lett.,171:131−136（1984）〕及
びセリンプロテアーゼ様ドメイン〔Miyazawa et al,Bio
chem.Biophys.Res.Commun.,163:967−973（1989）;Naka
mura et al,Nature,342:440−443（1989）〕を有する点
でプラスミノーゲンに似ている。プラスミノーゲンのよ
うに、HGFはタンパク質分解開裂によりプロセッシング
でき、ジスルフィド結合で共有結合された重鎖及び軽鎖
から構成されるヘテロ二量体分子を生じる〔Nakamura e
t al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:6489−6493（1986）;
Gohda et al,J.Clin.Invest.,81:414−419（1988）;Zar
negar et al,Cancer Research.49:3314−3320（198
9）〕。その作用がレセプターチロシンキナーゼで媒介
される可能性は標的細胞における細胞タンパク質のチロ
シンリン酸化のその速やかな促進により示唆された〔Ru
bin et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:415（199
1）〕。最近の研究ではｃ−mel癌原遺伝子産物としてHG
Fレセプターを直接確認したが〔Bottaro et al,Scienc
e,251:802（1991）〕、その構造は膜スパンニング（spa
nning）チロシンキナーゼの場合と似ている〔Park et a
l,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:6379−6383（1987）;Cha
n et al,Oncogene,2:593−599（1988）〕。

細胞増殖に関する増殖因子の陽性効果は細胞内〔Mose
s et al,Cell,63:245−247（1990）〕及び細胞表面〔Ha
nnum et al,Science,343:336−340（1990）;Eisenberg
et al,Nature,343:341−346（1990）;Carter et al,Nat
ure,344:633−637（1990）〕の双方において様々なレベ
ルで打ち消されるという証拠が蓄積されている。このた
め、増殖因子の増殖効果を負に調節するHGFに対する拮
抗剤を見出せる可能性は存在する。本発明は、スモール
HGF変種及びそれらの対応転写物に関する。これらHGF変
種の一つの特徴はそれがHGF作用の競合的拮抗剤であ
り、このため新規調節メカニズムを確立して、それによ
り同様の遺伝子が増殖因子作用の作動剤及び拮抗剤の双
方をコードできることを明らかにした。

発明の要旨 本発明は、Ｎ末端と最初の２つのクリングルドメイン
を含む配列を特定する代替HGF転写物によりコードされ
る、より小さな形のHGF（HGF/NK2）として確認される肝
細胞増殖因子（HGF）作用の特異的阻害剤を提供するこ
とを目的とする。この端部切取りHGF変種は、HGFに関す
る細胞表面レセプターと競合的に結合することでHGFの
分裂促進活性と特異的に拮抗する。その変種自体は分裂
促進活性を欠く。

一つの態様において、本発明は端部切取りHGF変種のH
GF/NK2に関するが、これは還元条件下でSDS−PAGEによ
ると34kdの見掛け分子量を有し、その変種は通常関連す
るタンパク質を実質上含まない。

もう一つの態様において、本発明は34キロダルトンHG
F変種タンパク質についてコードするDNA断片に関する。

本発明のもう一つの態様は、Ｎ末端と最初のクリング
ルドメインのみを含む配列を特定する代替HGF転写物に
よりコードされる34kd変種以外のもう一つのより小さな
形のHGF（HGF/NK1）に関する。

更にもう一つの態様において、本発明は予想サイズ約
20キロダルトンのHGF/NK1をコードするDNA断片に関す
る。

もう一つの態様において、本発明は前記DANの断片及
びベクターを含む組換えDNA分子に関する。本発明はDNA
断片でコードされるスモールHGF変種タンパク質を発現
させるように、このような組換えDNA分子で安定的又は
一時的に形質転換された宿主細胞にも関する。

もう一つの態様において、本発明はHGF阻害活性を有
する組換えHGF端部切取り変種の産生方法に関し、その
方法はタンパク質を発現させるような方法でHGF変種タ
ンパク質を発現する宿主細胞を培養し、宿主細胞からそ
のタンパク質を単離することからなる。

他の方法において、本発明は培地でHGF変種産生細胞
を培養し、その変種とヘパリンとの複合体が形成される
ような条件下でHGF変種培地をヘパリンアフィニティ樹
脂と接触させ、培地で大部分の他のタンパク質からその
複合体を分離し、ヘパリンアフィニティ樹脂からHGF変
種を解離させ、最後にHGF変種からいかなる残留汚染物
質も分離するためサイジングカラムでその変種を分別す
るステップからなる、他のタンパク質を実質上含まない
培養細胞におけるHGF端部切取り変種タンパク質の産生
方法に関する。

本発明は端部切取りHGF変種、HGF/NK2及びHGF/NK1を
コードするcDNAクローンにも関する。

他の態様において、本発明はHGFが過剰である癌及び
非悪性症状の双方を含めた増殖障害におけるHGF阻害剤
変種の治療的応用に関する。その方法は治療量のHGF阻
害剤を臨床サンプルに投与するか又は阻害剤量を増加さ
せる内生的発現を誘導することにより、HGFの作用を特
異的に遮断することからなる。

本発明は害された細胞再生の場面において高レベルで
不適当に産生される阻害性HGF変種の過剰産生を減少さ
せる治療方法にも関する。その方法は阻害剤HGF転写物
をアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させるか、又
は、阻害剤HGFタンパク質を阻害剤分子に特異的な抗体
と接触させることにより、阻害剤HGF分子の合成又は作
用を特異的に遮断することからなる。

更にもう一つの態様において、本発明は生物学的サン
プルからmRNA転写物を単離し、そのmRNA転写物を阻害性
HGF変種をコードするDNA断片と接触させ、サンプル中に
おける阻害性HGF変種発現のレベルを調べるため特異的R
NA−DNAハイブリッドの存在を検出する工程からなる、
細胞増殖が害されているか又は過剰である病的症状の診
断方法に関する。その方法はハイブリッド形成が実施さ
れる前にサンプルからmRNA転写物を単離するステップが
省略される原位置ハイブリッド形成により行ってもよ
い。

本発明の様々な他の目的及び利点は本発明の図面及び
以下の記載から明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 図１はM426及びSK−LMS−１細胞におけるp34の検出に
ついて示す。M426及びSK−LMS−１細胞からの〔³⁵S〕−
メチオニン及びシステイン標識ならし培地の相当量が非
免疫（Ｎ）及びHGF免疫血清（Ｉ）で免疫沈降された。
タンパク質は還元条件下で10％SDS−PAGEに付された。H
GFp87及びp34は矢印で示され、分子量マーカーはkDで示
されている。

図２はM426及びSK−LMS−１細胞からのRNAのノーザン
分析について示す。SK−LMS−１及びM426細胞からのポ
リ（Ａ）′RNA2μｇが１％アガロースゲルで電気泳動さ
れ、ノーザンブロットがHGFコード領域（H/L）、重
（Ｈ）又は軽（Ｌ）鎖プローブでハイブリッド形成され
た。３つの主要HGF関連転写物のキロ塩基（kb）サイズ
が示されている。

図３は34kdHGF変種、HGF/NK2のcDNAコード配列及び対
応アミノ酸配列について示す。

図４はHGF/NK2 cDNAの特徴について更に示す。

（Ａ）HGF及びHGF/NK2のドメイン構造の概略図（白抜き
枠）。1.2kb cDNAクローンpH45はコード（白抜き棒）及
び非翻訳領域（実線）から構成される。矢印は利用され
るPCRプライマーの位置及び方向を表す。HGFとの分岐箇
所におけるHGF/NK2（エキソン）のcDNA及び予想アミノ
酸配列が表示されたスプライス部位と共に示されてい
る。対応ゲノム領域（イントロン）は下線を引いたエキ
ソン−イントロン境界において共通スプライシングシグ
ナルと共に〜400bpイントロンを含む。略号はS,シグナ
ルペプチド;N,N末端ドメイン;K1−K4,クリングル１〜4;
L,リンカー領域である。プライマーは以下である： （Ｂ）PCR増幅によるHGF/NK2転写物の検出。サンプルは
陽性コントロールプラスミドpH45（列１）、M426（列
２）、SK−LMS−１（列３）及びB5/589（列４）からのR
NAとM426細胞からのゲノムDNA（列５）を含有してい
た。プライマーP1及びP2が増幅反応で用いられ、形成さ
れたPCR断片（220及び620bp）が示されている。列３に
おける微弱な620bpバンドはSK−LMS−1RNA製造における
未プロセッシングHGF RNA又はゲノムDNAを示す。

図５はCOS−１細胞におけるHGF/NK2 cDNAの発現につ
いて示す。プラスミドpC45as（アンチセンス組立体）又
はpC45s（センス組立体）でトランスフェクトされたCOS
−１細胞とM426及びSK−LMS−１細胞からのならし培地
が非免疫（Ｎ）又はHGF抗血清（Ｉ）で免疫沈降され
た。サンプルは還元（Ａ）及び非還元（Ｂ）双方の条件
下で分析された。特異的HGF/NK2免疫反応種は矢印で示
されている。

図６は精製された天然HGF/NK2について示す。HGF/NK2
は例で記載されるようなSK−LMS−１細胞のならし培地
から精製された。TSKサイジングカラムから溶出された
選択分画の一部が還元条件下（Ｒ）で10％SDS−PAGE又
は非還元条件下（NR）で14％SDS−PAGEで分析され、銀
染色技術により検出された。HGF/NK2は34及び28kDで各
々移動する単一バンドとして視覚化された（矢印）。高
分子量側の人工産物バンドが還元条件下で観察された。
同一サンプルは非還元条件下で14％SDS−PAGEに付さ
れ、HGF抗血清で免疫ブロットされた。

図７はHGF/NK2生物活性の分析について示す。（Ａ）H
GF（−○−）及びHGF/NK2（−●−）により促進されたD
NA合成の比較。B5/589細胞は濃度を増加させながらタン
パク質と接触させられ、〔³H〕−チミジン取込み量が実
験操作で記載されたように測定された。（Ｂ）B5/589細
胞によるHGF（−○−）及びEGF（−●−）誘導〔³H〕−
チミジン取込みに関するHGF/NK2の効果。結果はHGF/NK2
の非存在下における促進率として表示されている。HGF
及びEGF処理細胞はそれらの用量−応答曲線の直線範囲
における増殖因子濃度（各々0.2nM及び0.3nM）で試験さ
れた。典型的には、促進は10,000〜20,000cpm、バック
グラウンドは2000cpmであった。（Ａ）及び（Ｂ）の双
方に関して、各データポイントは三重測定の平均標準偏
差である；誤差棒が示されない場合、誤差はシンボルサ
イズ以下であった。

図８はHGFレセプターに対するHGF/NK2の架橋及び競合
分析について示す。〔¹²⁹I〕−HGF/NK2はHGF/NK2、HGF
又はEGFの存在下又は非存在下において表示された濃度
で45分間にわたり22℃でB5/589細胞と共にインキュベー
トされた。次いで培養物はHEPES塩水で洗浄され、架橋
剤スベリン酸ジスクシニミジルと共に15分間インキュベ
ートされた。全細胞溶離物は還元条件下で6.5％SDS−PA
GEにより分離され、乾燥されたゲルは−70℃で32日間に
わたりＸ線フィルムに露出させられた。

図９は1.5及び22kb転写物によりコードされるHGF変
種、HGF/NK1のcDNAコード配列及び対応アミノ酸配列に
ついて示す。

発明の具体的説明 本発明は、Ｎ末端と最初２つのクリングルドメインを
含む配列を特定する代替HGF転写物によりコードされ
る、端部切取り形の肝細胞増殖因子（HGF）に関する。
このタンパク質はHGFの分裂促進活性と特異的に拮抗す
る。本発明は、Ｎ末端と最初のクリングルドメインのみ
を含む配列を特定する代替HGF転写物によりコードされ
る、もう一つの端部切取り形のHGF（HGF/NK1）にも関す
る。本発明はスモールHGF阻害剤の診断及び治療適用に
更に関する。

本発明の主態様は通常HGFも合成する細胞において合
成されるHGFの端部切取り変種に関する。一つのこのよ
うなHGF変種は還元条件下でSDS−PAGEにより調べたとこ
ろ約34kdの分子量で特徴付けられる。その分子は分裂促
進活性を欠くが、但しHGFレセプターと結合する上で増
殖因子と競合することによりHGF誘導性分裂誘発を特異
的に阻害する。

HGF変種とHGFタンパク質の配列は小さな方のHGF変種
分子の全長にわたり＞99％同一である。端部切取りHGF
及びその対立遺伝子バリエーションはHGFをコードする
同遺伝子座又は最近複製された遺伝子コピーのいずれか
に由来する代替転写物の産物を表す。この結論はNK2コ
ード配列だけでなくその上流５′非翻訳領域もHGF cDN
Aの場合と同一であるという発見により支持される。更
に証拠によれば、K2（クリングル２）配列がNK2転写物
に関する終止コドン及びポリアデニル化シグナルを含む
エキソンとヒトゲノムDNAにおいて隣接していることを
示す（図４（Ａ））。

本発明が関係するHGF変種タンパク質は、他のタンパ
ク質を実質上含まないで、ヒト平滑筋肉腫細胞系と他の
細胞系、例えばM426繊維芽細胞系のならし培地から単離
することができる。ここで示された説明に従い、本発明
の阻害性HGF変種の活性形はならし培地を濃縮し、その
濃縮物をヘパリン支持体、例えばヘパリン−セファロー
ス樹脂に適用し、HGF変種を塩増加勾配で溶出させるタ
ンパク質精製ステップの組合せにより得ることができ
る。精製されたHGF変種は、溶出物中におけるいかなる
残留成分からもHGF変種が分離されるように、ヘパリン
結合溶出物がサイジングカラム、例えばTSK−G3000で分
別された後に得られる。一方、その変種は当業界で公知
の方法を用いて化学的に又は組換えにより産生してもよ
い。

本発明は端部切取りHGF変種、HGF/NK2及びHGF/NK1を
コードするcDNAにも関する。HGFの重又は軽鎖いずれか
の領域に特異的なDNAプローブでM426ヒト肺繊維芽細胞c
DNAライブラリーをスクリーニングすることにより、軽
鎖ではなく重鎖のプローブとハイブリッド形成する４つ
のcDNAクローンが確認された。これら４つのクローンの
うち1.2又は1.6kbのインサートを有する２つは阻害性HG
F変種、HGF/NK2に関するコード配列を含む；それらはそ
れらの３′非翻訳配列の長さにおいて互いに異なってい
た。しかしながら、他の２つのクローンは各々1.5及び
2.2kbのインサートを含み、それらは各々Ｎ末端で最初
のクリングルドメインのみをコードしていた；それらは
それらの３′非翻訳領域において互いに異なっていた。
得られた端部切取り形のHGF、HGF/NK1は約20キロダルト
ンの予想分子量を有し、HGF/NK2のような特異的HGF阻害
活性を有すると予想される。M426及びSK−LMS−１ヒト
細胞系におけるHGF発現のノーザンブロット分析では、
弱い2.2kbバンドと1.3〜1.5kbでみられる拡散（図２）
を示したが、これはこれらの少し豊富なcDNAに対応する
転写物をおそらく表す。

本発明はヒト端部切取りHGF変種、HGF/NK1又はHGF/NK
2のいずれかをコードするDNA断片及びベクターを含む組
換えDNA分子に更に関する。可能なベクターとしてはHGF
変種を発現させるように宿主細胞を一時的（pCDV−１）
又は安定的（pZIPneo）にいずれかで形質転換する当業
界で公知のプラスミド、例えばpCDV−１及びpZIPneoの
ような他のベクターがある。適切な真核宿主細胞の例と
しては、例えばマウス繊維芽細胞及びサル上皮細胞があ
る。バキュロウイルスと他の真核又は原核発現系はHGF
変種の産生に適合化できる。

本発明は、HGFの分裂促進活性を阻害することが示さ
れたHGF/NK2のような本発明が関係する端部切取り形のH
GFの治療的応用にも関する。HGF作用の特異的阻害剤の
使用は、HGF促進が過剰である場合に、癌及び良性前立
腺肥大のような非悪性状態の双方を含む増殖障害を治療
する上で有益である。本発明の阻害性HGF変種はこのよ
うな増殖障害のある患者に異なる経路、例えば局所、経
口又は静脈内で投与できる。治療量の阻害性HGF変種を
与えれば細胞増殖を正常レベルに戻せると予想される。
一方、阻害性HGF変種の産生が細胞増殖又は再生にとり
不適切に高くて結果的に害を起こす状況は、これら分子
の合成又は作用を特異的に阻止することにより（即ち、
独特な３′非翻訳配列に対するアンチセンスオリゴヌク
レオチド又は阻害分子に特異的な抗体の使用により）処
理できる。

本発明は、細胞増殖が、少くとも一部はHGF及びその
阻害性変種の発現レベルにより害されているか又は過剰
である病的状態の診断方法にも関する。これらの転写
物、特に分裂促進活性HGFをコードする転写物に関する
1.3kb転写物のレベルの変動は、増殖を調節する上で機
能的役割と相関するように異なる細胞系で観察された。
例えば、1.3kb転写物は活性細胞分裂を支える胎児繊維
芽細胞系で比較的低いレベルで発現されるが、但しその
転写物は細胞再生のより減弱化された刺激を与えるらし
い成人繊維芽細胞株でかなり高いレベルで存在する。当
業者には明らかなように、タンパク質産生増加は対応mR
NA転写物のレベル増加に起因する。HGF変種のcDNAに由
来するDNA断片と当業界で公知の標準方法を用いた場合
には、HGF変種転写物は図２で示されるように検出でき
る。検出は抽出されたRNAで又はそのDNA断片もしくはそ
れに由来するRNA断片を用いた原位置ハイブリッド形成
により行われる。

細胞増殖が害されているか又は過剰である病的状態を
診断するもう一つの検出方法において、患者からの生物
学的サンプルはHGF及び／又は特定のHGF変種に特異的な
抗体と接触させられる。当業界で周知の標準方法を用い
た場合、抗体−タンパク質複合体は、例えば免疫沈降及
びSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図１）、免
疫ブロッティング（図６）、酵素結合免疫吸着剤アッセ
イ（ELISA）又は免疫組織化学により検出できる。

本発明のある面は下記の非制限な例で更に詳細に記載
されている。

例 下記プロトコールは下記例で参照される。

細胞培養 M426ヒト胎児肺繊維芽細胞〔S.A.Aaronson及びG.J.To
daro,Viology,36:254−261（1968）〕、SK−LMS−１ヒ
ト平滑筋肉腫〔J.Fogh及びG.Trempe,In:Human Tumor Ce
lls In Vitro（インビトロヒト腫瘍細胞）,J.Fogh（e
d.）,Plenum Press,New York,115−159〕及びCOS−１サ
ル腎上皮〔Gluzman et al,Cell,23:175−182（1981）〕
細胞系を含めた細胞を10％牛胎児血清（Bethesda Resea
rchLaboratories）で補充されたダルベッコ修正イーグ
ル培地（DMEM）中で維持した。B5/589ヒト乳房上皮細胞
〔M.R.Stampfer及びJ.C.Bartley,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,82:2394−2398（1985）〕を記載されたように増殖さ
せた〔Rubin et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:802（1
989）〕。

分裂促進アッセイ DNA合成は既に記載されたように測定した〔Rubin et
al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:802（1989）〕。96ウェ
ル微量滴定プレートをB5/589細胞で接種する前に１μg/
cm²でヒトフィブロネクチンで前被覆した。〔³H〕−チ
ミジン取込みをサンプル添加の16時間後から始めて６時
間にわたり調べた。トリクロロ酢酸−不溶性DNAを回収
し、カウントした。この研究で用いられたHGFは報告さ
れたようにこの研究所で精製し〔Rubin et al,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,88:415（1991）〕、ヒト組換えEGFはUp
state Biotechnology Inc.から購入した。

免疫沈降 100mm組織培養プレート中において細胞を既に記載さ
れたように４時間にわたりヘパリン50μg/ml中〔³⁵S〕
−メチオニン及びシステイン0.1mCi/ml〔放射能1150Ci/
ml;（Du Pont−New England Nuclear）で標識した〔Rub
in et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:415（1991）〕。
ならし培地をセントリコン（Centricon）−10マイクロ
濃縮器（Amicon）で20倍に濃縮し、非免疫又はHGF中和
抗血清で免疫沈降させた。免疫沈降物をガンマ−結合Ｇ
アガロース（Genex）に吸着させ、150mM NaCl、0.05％T
ween−20、0.1％SDS、１％NP−40、1mM EDTA及び10mM K
Clを含有した10mMトリスHCl緩衝液で３回洗浄した。サ
ンプルを10％又は14％SDS−PAGE上において還元（100mM
β−メルカプトエタノール）及び非還元条件下）で分析
した。ゲルを固定し、エンライトニング（enlightenin
g）溶液（New England Nuclear）で処理し、乾燥し、−
70℃でコダックARフィルムに露出させた。

ノーザン分析 ポリ（Ａ）′RNAを記載されたようにオリゴdTカラム
により単離した〔Maniatis et al,Molecular cloning.A
Laboratory Manual（分子クローニング．実験マニュア
ル）,Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbo
r Laboratory（1982）〕。１％変性ホルムアルデヒドア
ガロースゲルで電気泳動後、サンプルをニトロセルロー
スフィルター上に移した〔Maniatis et al,Molecular c
loning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New
York:Cold Spring Harbor Laboratory（1982）〕。ブロ
ットを40％ホルムアルデヒド、６×SSC、５×デンハー
ト溶液、50mMリン酸ナトリウム（pH6.8）及び250μg/ml
音波処理サケ精子DNA中42℃で12時間にわたり〔³²P〕標
識ランダムプライム化DNAプローブとハイブリッド形成
させた。ハイブリッド形成後、フィルターを１×SSC、
0.1％SDS中室温で２回洗浄した。最終洗浄を0.1×SSC、
0.1％SDS中55℃で実施した。フィルターを乾燥し、−70
℃で５〜８日間にわたりＸ線フィルムに露出させた。ハ
イブリッド形成プローブをPCRにより形成させ、低融点
アガロースゲルで精製した。各プローブのヌクレオチド
配列を下記のようなMiyazawa et al,Biochem.Biophys.R
es.Commun.,163:967−973（1989）のHGF配列に従いナン
バリングした： H/L（重及び軽鎖）：−24 〜＋2187 Ｈ（重鎖） ：＋189 〜＋1143 Ｌ（軽鎖） ：＋1475〜 2122 cDNAクローニング及び配列決定 M426cDNAライブラリーからの約１×10⁶ファージプラ
ーク〔Finch et al,Science,245:752−755（1989）〕を
プレート培養し、二重フィルターをノーザン分析に関し
て記載された場合と同一の条件下で（前記のように）放
射性標識プローブＨ及びＬと別々にハイブリッド形成さ
せた。プラーク精製陽性クローンの制限地図化は標準操
作を用いて実施した〔Maniatis et al,Molecular cloni
ng.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New Yor
k:Cold Spring Harbor Laboratory（1982）〕。cDNAラ
イブラリーを切出し、ジデオキシ鎖終結法により配列決
定分析するためM13mp18ベクターに組込んでサブクロー
ニングした〔Sanger et al,J.Mol.Biol.,143:161−178
（1977）〕。

PCR分析 mRNAのPCR法のために、１μｇのポリ（Ａ）RNA^-を、
プライマーとしてランダムヘキサマー（ファルマシア）
を用い、鳥骨髄芽球症ウイルス（AMV）逆転写酵素（Bet
hesda Research Laboratories）によって、まず逆転写
した（Noonan et al.Nucleic Acids Res.16:10366（198
8））。８％（−80ng）のこの第一鎖cDNA生産物をPCR法
に直接用いた（Saiki et.al.Science 230:1350−1354
（1985））。ルーチンのPCR法のために、80ngのcDNA
と、0.5μｇの細胞DNAと、10ngのプラスミドDNAとをプ
ライマーP1およびP2（図４参照）を用いて30サイクルの
増幅にかけた。一サイクルの条件は、94℃で１分間、60
℃で２分間、72℃で３分間とした。各々の反応混合物の
一部（10％）を３％アガロースゲルで分析した。ゲノム
DNAのPCR法によるクローニングのために、PCR法をBamH
Iリンカー−プライマーP1BおよびP2B（図４）を用いて
行い、増幅されたDNA断片をBamH Iで切断した。得られ
たBamH I断片を低い融解温度のアガロースゲルで精製
し、配列分析のためにM13mp18ベクターにサブクローニ
ングした。

COS−１細胞における過渡的発現 NK2コード配列を、BamH Iリンカー−プライマー、す
なわちP3およびP4（図４）、を用いてPCR法によって生
じさせ、ベクターpCDV−１（Okayama et.al.Mol.Cell.B
iol.3:280−289（1983））のBamH I部位に両方向でサブ
クリーニングした。選択された構築物におけるNK2挿入
の配列決定を行い、PCR法による生産物が正しいもので
あることを確認した。10μｇのそれぞれのプラスミドDN
A10μｇを、リン酸カルシウム沈殿法（Wigler et.al.Ce
ll 11:223−232（1977））によってCOS−１細胞（Y.Glu
zman Cell 23:175−182（1981））にトランスフェクシ
ョンした。48時間後、ならし培地におけるタンパク質
を、標識し、免疫沈降させ、上記のように還元下または
非還元下で10％SDS−PAGEにかけた。

タンパク質の精製 173cm³のＴ型フラスコ中に培養したSK−LMS−１細胞
由来の６リットルのならし培地を0.5μｍのフィルター
（Millipore HAWP 142 50）で前濾過し、10kDの分子量
をカットオフするペリコン（Pellicon）カセットシステ
ムによって300mlに濃縮した。濃縮された培地を、20mM
Tris−HCl、pH7.5/0.3M NaClで平衡化されたヘパリ
ン−セファロース樹脂にのせた。サンプルを、NaClの濃
度を線形勾配で増加させたもので溶出した。それぞれの
フラクションの一部を、HGFに対して生じた抗血清（最
終希釈度1:500）を用いたイムノブロット分析にかけ、H
GF/NK2の存在を確認した。集めたフラクションをさら
に、20mM Tris−HCl、pH6.8/1.0M NaClでTSK3000サイ
ジングカラム（LKB/ファルマシア）に溶かした。HGF/NK
2タンパク質の精製の程度および同一性は、銀染色によ
る分析（Merril et.al.Science 211:1437−1438（198
1））および還元および非還元条件下でのイムノブロッ
トによって決定した。HGF/NK2を95％より多く含むフラ
クションは、生物的分析によって選択した。タンパク濃
度は、Ａ（１％:210）＝140と仮定して吸光度から求め
た。

クロスリンクアフィニティー TSK精製されたHGF/NK2を、クロラミン−Ｔ法（W.M.Hu
nter and F.C.Greenwood Nature 194:495−496（196
2））によってヨウ素化し、SDS−PAGE分析によって決定
されたように調製物中の標識された物質の99％以上がHG
F/NK2であった。クロスリンクアフィニティーの実験
は、B5/589細胞を１穴あたり５×10³個の密度で播いた
６穴プレート上で行った。各々の穴に、HGF/NK2（−200
μCi/μｇの特異的活性で５×10³cpm）を、HEPES結合バ
ッファー（100mM HEPES、150mM NaCl、5mM KCl、1.2m
M MgSO₄、8.8mMデキストロース、２μg/mlヘパリンお
よび0.1％BSA、pH7.4）中コールドの競合物の存在下ま
たは非存在下で加えた。45分間室温でインキュベートし
た後、細胞をコールドのHEPES生理食塩水（pH7.4）で２
回洗浄した。ジメチルスルホキシド中のジスクシニミジ
ルスベリン酸塩（Pierce）を最終濃度250μＭで加え、1
5分間インキュベートした。次いでサンプルを100μｌの
20mM Tris、100mMグリシン、1mM EDTAで１分間クエン
チングし、HEPES食塩水ですすいだ。細胞をラエムリ（L
aemmli）サンプルバッファーで抽出し、還元下で6.5％S
DS−PAGEに溶解させた。

例１ 小さく、自然に生ずるHGF免疫反応種の検出およびその
推定される転写物 従前の研究では、HGFが明らかな87,000（87KD）の分
子量（Mr）をもつ一本鎖のポリペプチドとして合成され
ることを示されている。これは、互いにジスルフィド結
合で結合しているheavy鎖（Mr60KD）およびlight鎖（Mr
−30KD）からなるヘテロダイマー型に解離することがで
きる。精製されたHGFに対する中和血清は、代謝的に標
識されたM426ヒト胎児肺繊維芽細胞由来のならし培地中
におけるタンパク質の免疫沈降に用いられた。ドデシル
硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS
−PAGE）を還元下で行うと、一本鎖型（HGF p87）が優
勢な種であった。プロセッシングを受けたheavy鎖およ
びlight鎖の証拠はなかったが、低濃度のMr〜34KD（p3
4）のHGF免疫反応分子が観察された（図１）。パルス−
チェース実験は、p34がHGFp87の分解産物であるか否か
という議論はあるが、HGFp87およびp34の両方が同様の
合成および分泌の機構を持っている、ということを示し
た。同様の実験をもう一つのHGF生産体、平滑筋肉腫細
胞株（SK−LMS−１）で行ったが、p34が比較的多くなる
ことを除くと類似したパターンが見られた（図１）。

HGFp87およびp34の間の関係をさらに理解するため
に、ポリ（Ａ）⁴RNAをM426およびSK−LMS−１細胞から
調製し、プローブとして完全長のHGFコード配列を用い
てノーザンブロット分析にかけた。図２に示されるよう
に、6.0および3.0kbの２つの主要な転写産物が両方の系
列に検出された。これらの転写産物の各々は、完全長の
成長因子をコードすることが以前に示されていた（Rubi
n et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:415（1991））。
〜1.3kbの第三のHGFハイブリダイズRNAは、M426細胞に
おいて比較的低濃度で存在するが、SK−LMS−ｌ細胞に
おいては高濃度発現された。このパターンは、２つの細
胞系列に観察されるp34の相対的濃度と一致し、p34は新
規な1.3kb転写産物によってコードされているかもしれ
ない、ということが示唆された。完全なHGFコード配列
が〜2.0kbである事実に基づくと、1.3kbの転写産物だけ
がこの領域の一部を表すことなる。このことを確認する
ために、同様のノーザンブロットが、Ｎ末端heavy鎖ま
たはＣ末端light鎖のいずれか由来のプローブを用いて
別々にハイブリダイズされた。両方のプローブは6.0お
よび3.0kbの転写産物を検出できたが、heavy鎖のプロー
ブのみが1.3kbの転写物を認識することができた（図
２）。これらの結果は、このRNA種がＮ末端領域由来の
配列を含むHGF分子の切り取られた部分をコードしてい
ることを示唆した。

他の弱いバンドは、また、HGF由来のプローブを用い
てハイブリダイズしたノーザンブロットで検出され（図
２）、約2.2kbのバンドを含んでいた。この観察の重要
点は、更なる研究で明らかにされた（例２参照）。

例２ Ｎ末端および最初の１または２個のクリングル領域のみ
をコードするHGFcDNAクローンの単離 1.3kb転写産物に相当するcDNAクローンの単離の試み
において、M426cDNAライブラリーを、HGFheavyおよびli
ght鎖プローブの両方を用いて、分別スクリーニングし
た。heavy鎖プローブと特異的にハイブリダイズしたがl
ight鎖とはしないクローンが、プラーク精製された。挿
入物の大きさおよび物理的地図に基づいて、〜1.2kbの
挿入物を持つ１つのcDNAクローン、pH45が配列決定のた
めに選択された。図4Aに図示されるように、1199塩基対
（bp）の転写産物を表すクローンpH45は、75bpの５′非
翻訳領域、870bpの読み取り枠およびポリアデニル化シ
グナルAATAAAを含む254bpの３′非翻訳領域から構成さ
れていた。読み取り枠から、一本のペプチドからなるHG
Fの290個のアミノ酸の切り取られた部分、Ｎ末端領域
（Ｎ）、および一本のペプチドを除いて計算された〜30
KDの分子量を持つ最初の２つのクリングル領域（K1およ
びK2）が予想された。この配列、すなわち、NK2と称さ
れる配列は、それがK2領域の終わりで正確に一致する位
置で分岐するまでHGF cDNAのそれと同一であった。NK2
読み取り枠は、２つの追加アミノ酸とその後の枠内スト
ップコドン（TAA）へと続いた（図３および4A）。

cDNAクローンの忠実性を確認するために、プライマー
p1およびp2（図4A）（後者はNK2転写物に特異的であ
る）とを用いて、PCR法分析を行った。図4Bは、B5/589
細胞ではなく、M426およびSK−LMS−１細胞のRNA中にお
いて、予想された220bpのPCR断片が存在することを示し
ている。この領域の遺伝子構造は、同様のPCRプライマ
ー（図4B）を用いてこれに相当するゲノム配列を増幅す
ることによってさらに分析された。PCRによる生産物の
配列決定は、イントロン−エクソンの境界で、共通のス
プライスドナー／アクセプター配列CG/GTおよびAG/AGを
もつ〜400bpのイントロンを明らかにし、これらはNK2の
cDNAクローンにおいて予想されたスプライシング結合で
正確に整列していた（図4A）。従って、1.3kb NK2転写
産物は、K3エクソンの代わりに終止コドンを含む他のエ
クソンにK2エクソンを結合させることによって、前駆体
RNAのプロセシング中に生じ易い。

上記のような異なるスクリーニング戦略を用いること
で、light鎖プローブに対立するものとしてのHGF heav
yに特異的にハイブリダイズした３つのさらなるcDNAク
ローンは、M426ライブラリーから単離された。これらの
うちの１つは〜1.6kbであり、HGF/NK2のコード配列を含
んでいたが、それは長い３′非翻訳配列のストレッチを
含んでいる限りにおいて、1.3kb転写産物とは異なる。
しかしながら、他の２つの挿入物（一つは1.5kb、他方
は2.2kb）は、Ｎ末端および最初のクリングル領域のみ
をコードしており、それらはその３′非翻訳領域におい
て互いに異なっていた。これらNK1 cDNAのうちの１の
コード配列は図９に示されるとおりである。前記した部
分で示したように、ノーザンブロット分析におけるHGF
ハイブリダイゼーションパターンを精密に調べると、1.
3kb〜1.6kbにおける広がったシグナルだけでなくこれら
の低量のcDNAに相当する転写産物をおそらくは表す弱い
2.2kbバンドが明らかとなった（図２）。

例３ HGF/NK2 cDNAの組み換え発現が、小さいHGFクロス反応
種のようなその生産物を特定する NK2転写産物がM426およびSK−LMS−１細胞で検出され
るp34タンパク質をコードするか否かを試験するため
に、NK2コード領域をアンチセンス方向（pC45as）およ
びセンス方向（pC45s）の両方で発現ベクターpCDV−１
にサブクローニングした。いずれかの構成物でトランス
フェクションされたCOS−１細胞のならし培地を集め、H
GF中和抗体で免疫沈降し、次いでSDS−PAGE分析した。
図5Aに表されるように、pC45sでトランスフェクトされ
たCOS−１細胞は、COS−１細胞がpC45as構成物でトラン
スフェクトされた時には検出されなかった34KDのHGF免
疫反応組み換えタンパク質（rHGF/NK2）を分泌した。こ
のタンパク質の大きさは、M426およびSK−LMS−１細胞
由来のp34のそれにほぼ相当した（図5A）。同様の実験
を非還元下で行ったが、組み換えおよび自然に生じた両
方のp34の移動度が分子量で明らかに〜28KD移動し（図5
B）、p34およびrNK2が構造的に区別できないというさら
なる証拠が提供された。

次の実験では、p34およびrHGF/NK2のヘパリン結合特
性を比較した。SK−LMS−１およびpC45sトランスフェク
トCOS−１細胞から集めたならし培地をヘパリンセファ
ロース樹脂にそれぞれかけ、結合タンパク質をNaCl濃度
を上昇させて溶出した。個々のフラクションを抗HGF血
清でイムノブロットすることによって分析すると、p34
とrHGF/NK2の両方が1.0M NaClで溶出ピークにおいて同
様のクロマトグラフィーの概形を示した。これらの発見
は、M426およびSK−LMS−１細胞によって分泌されたp34
タンパク質がNK2転写産物から発現されたHGFの切り取ら
れた部分を表す、ということを示した。従って、p34タ
ンパク質をHGF/NK2と称することとする。

NK2コード領域は、また、pZ1Pneo発現ベクターにサブ
クローニングされ、次いでNIH/3T3マウス繊維芽細胞に
トランスフェクトされた。代謝的に標識されたタンパク
質をトランスフェクションされた細胞のならし培地にお
いて検出したが、濃度は調整的作業には不十分であっ
た。

例４ 精製されたHGF/NK2は、HGF分裂促進活性の特異的阻害剤
である その生物的活性を調べるために、HGF/NK2を、超濾
過、ヘパリン−セファロースおよびTSK−シービングク
ロマトグラフィーを組み合わせた三段階の工程によっ
て、SK−LMS−１細胞の培養液から精製した。精製タン
パク質は、非還元下および還元下で特有の移動度の変化
を示し、抗HGF血清と免疫反応し、これによってHGF/NK2
としてのその性質が確かめられた（図６）。

HGF/NK2の分裂促進活性を試験するために、ヒト乳上
皮細胞系B5/589を標的細胞として用いた。HGFは〜0.25n
Mで最大効果の半分の［³H］チミジン取り込みを刺激し
たが、同一の条件下で10nMの高い濃度のHGF/NK2はDNA合
成の増強を引き起さなかった（図7A）。それらの構造上
の類似性という観点から、HGF/NK2がHGFの特異的阻害剤
として働く可能性がまた試験された。HGFによって誘導
されるDNA合成を、HGF/NK2濃度を増加させて測定した場
合、［³H］チミジン取り込みの濃度依存的な阻害が観察
された（図7B）。50％阻害を達成するために、HGFより
も10〜20倍モル数の多いHGF/NK2が必要であった。類似
の結果が、ヒトメラニン細胞を標的細胞として用いた場
合に得られた。さらに、HGF/NK2が表皮成長因子（EGF）
の分裂促進活性を減じなかったため、阻害はHGFに対し
特異的であった（図7B）。

例５ HGF/NK2およびHGFのHGF受容体に対する競合的結合 ｃ−metがん原遺伝子産物、すなわち膜貫通チロシン
キナーゼ、がHGFに対する細胞表面受容体である、とい
うことが最近明らかにされている（Bottaro et.al.,Sci
ence 251:802（1991））。HGF/NK2がHGFマイトジェン活
性の拮抗剤として働く機構を明らかにするために、B5/5
89細胞に対する［¹²⁵I］−HGF/NK2のクロスリンク実験
が行われた。図８に示されるように、170KDの一個の主
要なクロスリンクする種が還元下で検出された。このバ
ンドは、HGF/NK2にクロスリンクしたプロセシングをう
けたｃ−met産物の145KDのβサブユニットに相当する
（Bottaro et.al.,Science 251:802（1991））。未標識
HGF/NK2またはHGFのいずれかの濃度の増加は、クロスリ
ンク反応における標識されたリガンドと競合した。モル
数の基準において、HGFは、［¹²⁵I］HGF/NK2クロスリン
クの競合剤として、HGF/NK2それ自身よりも３〜５倍効
果的であると評価された。同様の条件下において、EGF
はHGF/NK2のクロスリンクを阻害しなかった（図８）。
これらの発見のすべては、HGF/NK2およびHGFが同じ細胞
表面の受容体分子に特異的競合的に結合することを示し
ている。

本発明が明示と理解のために詳細に記述されている
が、この開示を読むことにより、本発明の真の範囲を逸
脱することなく形態や些細な点において様々な変形がな
されうることが当業者によって認識されるであろう。上
記で引用した全ての文献の全ての内容を、本明細書の開
示の一部として引用する。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/02 // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｒ 1:91 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｂ (72)発明者 アーロンソン，スチュアート エー. アメリカ合衆国バージニア州、グレー ト、フォールズ、ハリマン、ストリー ト、1006 (72)発明者 ボッタロ，ドナルド ピー. アメリカ合衆国メリーランド州、ケンジ ントン、ブルックフィールド、ドライ ブ、4203 (56)参考文献 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏ ｌ．197，Ｎｏ．１（1991．Ａｐｒ．10) ｐ．15−22 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．88，Ｎｏ．２ （1991．Ｊａｎ．15）ｐ．415−419 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (15)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】還元条件下のSDS−PAGEで約34kdの見掛け
   分子量を有し、かつ天然の肝細胞増殖因子の最初の２つ
   のクリングルドメインに対応する２つのクリングルドメ
   インを有する肝細胞増殖因子変異体タンパク質（HGF/NK
   2）であって、少なくとも下記のアミノ酸配列セグメン
   トを含んでなり、HGFレセプターに結合することでHGF誘
   導性分裂誘発を特異的に阻害し、固有の分裂促進活性を
   欠く、肝細胞増殖因子変異体タンパク質。 【化１】
2. 【請求項２】下記アミノ酸配列を有するHGF変異体をコ
   ードする、DNAセグメント。 【化２】
3. 【請求項３】下記ヌクレオチド配列を有する、DNAセグ
   メント。 【化３】
4. 【請求項４】請求項１に記載のHGF/NK2変異体タンパク
   質をコードするDNAセグメントまたは請求項２に記載のD
   NAセグメントと、ベクターとを含んでなる、組換えDNA
   分子。
5. 【請求項５】下記アミノ酸配列を有する、組換え産生タ
   ンパク質。 【化４】
6. 【請求項６】DNAセグメントでコードされたタンパク質
   を発現可能なように、請求項１に記載のHGF/NK2変異体
   タンパク質をコードするDNAセグメントまたは請求項２
   または３に記載のDNAセグメントで安定的又は一時的に
   トランスフェクトされた宿主細胞。
7. 【請求項７】タンパク質を発現するような方法で請求項
   ６に記載の宿主細胞を培養すること、そしてその宿主細
   胞からそのタンパク質を単離することを含んでなる、組
   換え34kdHGF変異体タンパク質の産生方法。
8. 【請求項８】下記の工程を含んでなる、培養細胞からの
   HGF/NK2の産生方法： （ｉ）HGF/NK2変異体が産生されるような条件下におい
   て請求項６に記載の宿主細胞を培地で培養する； （ii）濃縮物が形成されるように上記培地を濃縮する； （iii）上記濃縮物中におけるHGF変異体がヘパリンに結
   合してそれによりヘパリン−HGF変異体複合体が形成さ
   れるような条件下で上記濃縮物をヘパリンと接触させ
   る； （iv）上記ヘパリン−HGF変異体複合体を上記濃縮物か
   ら分離する； （ｖ）上記HGF変異体がヘパリンから解離して遊離HGF変
   異体の溶液が形成されるような条件下で上記ヘパリン−
   HGF変異体複合体を処理する；そして （vi）HGF変異体が残留成分から分離されるようにサイ
   ジングクロマトグラフィーにより上記溶液を分別する。
9. 【請求項９】宿主細胞がヒト平滑筋肉腫SK−LMS−１細
   胞である、請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】請求項１に記載のHGF変異体タンパク質
    の有効量を含んでなる、細胞増殖阻害剤。
11. 【請求項１１】（ｉ）mRNAを生物学的サンプルから単離
    する； （ii）上記mRNAを、請求項３に記載されたDNAセグメン
    トと接触させる；そして （iii）RNA−DNAハイブリッドの存在を検出する；工程
    を含んでなる、細胞増殖の測定方法。
12. 【請求項１２】（ｉ）生物学的サンプル中に含有される
    mRNAを、請求項３に記載されたDNAセグメント又はそれ
    に由来するRNAセグメントと接触させる；そして （ii）RNA−DNA又はRNA−RNRハイブリッドの存在を検出
    する； 工程を含んでなる、in situハイブリッド形成による細
    胞増殖の測定方法。
13. 【請求項１３】DNAセグメントでコードされたタンパク
    質を発現可能なように、請求項４に記載の組み換えDNA
    分子で安定的又は一時的にトランスフェクトされた宿主
    細胞。
14. 【請求項１４】（ｉ）mRNAを生物学的サンプルから単離
    する； （ii）上記mRNAを、請求項３に記載されたDNAセグメン
    トとベクターとを含んでなる組み換えDNA分子と接触さ
    せる；そして （iii）RNA−DNAハイブリッドの存在を検出する；工程
    を含んでなる、細胞増殖の測定方法。
15. 【請求項１５】（ｉ）生物学的サンプル中に含有される
    mRNAを、請求項３に記載されたDNAセグメントとベクタ
    ーとを含んでなる組み換えDNA分子と接触させる；そし
    て （ii）RNA−DNA又はRNA−RNAハイブリッドの存在を検出
    する； 工程を含んでなる、in situハイブリッド形成による細
    胞増殖の測定方法。