JP3428012B2 - Ｈｉｖ―１、ｈｉｖ―２及びｓｉｖタイプのレトロウイルスのゲノムからのヌクレオチド配列、並びに、特に、これらのレトロウイルスのゲノムの増幅のため及びこれらのウイルスによる感染の「生体外」診断のためのこれらの配列の応用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、HIVタイプのヒト免疫不全レトロウイルス
又はSIVタイプのサル免疫不全レトロウイルスに特異な
核酸配列の増幅技術の使用のために用いることができる
オリゴヌクレオチド配列に関する。

本発明は特に、HIV（現在HIV−１及び／又はHIV−
２）タイプのレトロウイルスによるヒトの感染について
の人間の生体外（in vitro）診断方法としてこれらの配
列を応用することに関する。

HIV−１及びHIV−２という呼称でまとめられるレトロ
ウイルスの分離及び特徴づけは、それぞれ欧州特許出願
明細書第85/905.513.9号及び第87/400.151.4号の中で記
述されている。これらのレトロウイルスは、リンパ節疾
患又は後天性免疫不全症候群（エイズ）の症状を示す複
数の患者において分離された。

HIV−２タイプのレトロウイルスは、HIV−１タイプの
レトロウイルスと同様、ヒトT4リンパ球に対する向性及
び増殖した場合のこれらのリンパ球に対する細胞変性効
果ひいては中でも全身性で持続性の多発腺症すなわちエ
イズをひき起こす効果によって特徴づけされる。

それまでのSTLT−IIIという名称に代わってSIV−１と
いう名称で呼ばれているもう１つのレトロウイルスはア
カゲザルにおいて分離された（M.D.DANIEL他、Scienc
e、228、1201（1985年）;N.L.LETWIN他、Science、23
0、71（1985年）、「STLV−III_mac」の呼称で）。

「STLV−III_AGM」（又はSIV_AGM）と呼ばれるもう１つの
レトロウイルスは、野生のサバンサモンキーにおいて分
離された。しかし、アカゲザルに存在するウイルスとは
異なり、STLV−III_AGMの存在は、アフリカのサバンサモ
ンキーにおいてエイズタイプの疾病を誘発しないように
思われる。

言葉の便宜上、以下においては、これらのウイルス
は、SIVという表現（SIVという表現は「Simian Immunod
ificiency Virus」（サルの免疫不全症ウイルス）とい
う英語の略語である）と場合によってそれに続くこれら
ウイルスが出てきたサルの種を表わす略語すなわちアカ
ゲザル（macaque）に対する「MAC」又はアフリカサバン
サモンキーに対する「AGM」（「African Green Monke
y」の略）でのみ呼ばれる。

レトロウイルスSIV−1Macの菌株は1986年２月７日に
Ｉ−521という番号でC.N.C.M.に寄託された。

レトロウイルスHIV−１及びHIV−２の研究を続行する
につれて、そのゲノムのRNAの相補的DNA（cDNA）の配列
を得ることもできた。HIV−２クラスを代表するレトロ
ウイルスのcDNAの完全なヌクレオチド配列（HIV−２、R
OD）は、1986年２月21日、照会名LAV−2RODでＩ−522と
してC.N.C.M.に寄託された。

同様にして、クラスHIV−１を代表するレトロウイル
スのcDNAの完全なヌクレオチド配列は、WAIN HOBSON,SO
NIGO,COLE,DANOS及びALIZONによりCELL（1985年１月）
の中に記述されている。

同様に言葉の便宜上、HIV−１及びHIV−２タイプのウ
イルスは以下時としてHIVという表現で呼ばれる。

現在存在するHIV−１又はHIV−２タイプのウイルスに
よる感染の「生体外」診断方法は、例えば抗体と抽出物
又は抗原の場合によって発生する免疫反応の生成を可能
にする条件の下でHIV−１又はHIV−２の抗原又は抽出物
と生物学的流体を接触させることによる、研究対象の患
者から得られた血清中などの生物学的流体中又は生物学
的採取物中に場合によって存在する抗体ANTI−HIV−１
又はanti−HIV−２の検出（生検）を利用する。

このような診断方法は、特にHIVタイプのウイルスに
ヒトが最近感染した場合には、誤って陰性となる危険性
をはらんでいる。

遺伝子増幅技術は、特にウイルス性疾患に敏感な生体
外診断方法の完成にとって著しく助けとなるものであ
る。これらの遺伝子増幅技術としては、欧州特許出願明
細書1986年３月27日付の第86/302,298.4号及び1987年１
月９日付の第87/300,203.4号の中に記述されているよう
なPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）技術、或いはまたBiote
chnology第６巻p1197（1988年10月）に記述されている
いわゆる「Ｑβレプリカーゼ」技術、及び国際特許出願
明細書WO89/01050号に記述されているRNAポリメラーゼ
（T7RNAポリメラーゼ）を用いて行なう技術、を挙げる
ことができる。これらの技術は、ウイルスの核酸の検出
感度を改善できるようにし、特異的合成リーダの使用を
必要とする。

HIVタイプのウイルスの研究に関しては、リーダ（先
導配列）の選択に問題が多い。実際、ウイルス性ゲノム
のヌクレオチド配列はきわめて可変的であることから、
HIVタイプのウイルスの一定の与えられた隔離集団の既
知の配列に適合するリーダは、HIVタイプのいくつかの
変型ウイルスの増幅を起こしそうになる可能性がある。
一方、１つのHIVウイルスからもう１つのHIVウイルスへ
と保存されたゲノム領域の中でリーダが選択された場
合、その「良好な機能」はそれだからといって保証され
ているわけではなく、増幅収量不良をひき起こす可能性
がある。

本発明はまさに、なかでも、現在の技術状態では最大
と考えられる収量で特に数多くの、非特異性帯域の存在
を避けるような、HIV及びSIVタイプの全てのウイルスの
ゲノムの特に診断を目的とした増幅を可能とするオリゴ
ヌクレオチドリーダを提供する。

本発明のリーダは、HIV−１群のウイルス及び／又はH
IV−２及びSIV群のウイルスに同時に特異的であり、こ
れらのウイルスのゲノムの変異に対する感受性をもたな
い。

本発明の目的は、HIV−１タイプ及び／又はHIV−２及
びSIVタイプのウイルスのゲノム増幅のために使用する
ことができる約15個乃至30個のヌクレオチドのオリゴヌ
クレオチドリーダにある。

本発明は、 −HIV−１ Bru、HIV−１ Mal、HIV−１ Eli、HIV−２ ROD及びSIV MACウイルスのgag、vpr
及びpol遺伝子内又はHIV−２ ROD及びSIV MACウイル
スのnef2、vif2及びvpx遺伝子又はHIV−１ Bru、HIV−
１ Mal及びHIV−１ Eliウイルスのenv、nef1、vif1及
びvpr遺伝子内に含まれているヌクレオチド配列のうち
の１つの中に含まれている配列の中から、より限定的に
は以下に規定するヌクレオチド鎖の中に含まれている配
列の中から選ばれていること、 −又は、（特に最も長い配列について）、HIV−１ Br
u、又はHIV−１ Mal又はHIV−１ Eli又はHIV−２ RO
D又はSIV MACからの前記ヌクレオチド配列のうちの１
つを含むか、又はこれらの配列の相補的ヌクレオチド配
列を含み、末端３′又は５′の側で当該種類のヌクレオ
チド配列から「はみ出す」相補的ヌクレオチドがある場
合それらは好ましくは上記HIV−１、HIV−２又はSIV M
ACタイプのウイルスの完全配列自体の中に相応する末端
５′又は３′の手前に置かれているものと一致するこ
と、 −又はこのヌクレオチド配列が上述のヌクレオチド配列
の１つと同一でない場合又はこれらの配列の１つと相補
的でない場合、それでもHIV−１ Bru、HIV−１ Mal、
HIV−１ Eliウイルスからのヌクレオチド配列と及び／
又は上述のHIV−２ ROD又はSIV MACウイルスからのヌ
クレオチド配列とハイブリダイズする可能性があること を特徴とするあらゆるヌクレオチド配列に関する。ハイ
ブリダイゼーションは、最適な収量を得るのに推奨され
る60℃±１℃（好ましくは60℃±0.5℃）の温度で行な
うことができる。

上述のヌクレオチドの番号づけは、「Los Alamos国立
研究所−米国ニューメキシコ州」により編集された「ヒ
トレトロウイルスとエイズ−1989年」という参照マニュ
アルの中で用いられているものと一致する。（HIV−１
Mal、HIV−１ Eliウイルスの配列については、1986
年６月23日付の欧州特許出願明細書第86.401380号の中
でMONTAGNIER,SONIGO,WAIN−HOBSON及びALIZONにより記
述された）。

本発明の配列は、Applied Biosystemsにより市販され
ている合成装置（リン酸−亜アミノ酸塩法）又はその他
の類似の方法を用いるあらゆる装置で合成される。

本発明はさらに限定的に言うと、以下のヌクレオチド
鎖を特徴とするオリゴヌクレオチド配列に関する（なお
これらの鎖は５′→３′の方向に示され、頭文字「Ｓ」
及び「AS」はオリゴヌクレオチドがセンスか又はアンチ
センスかすなわちそのオリゴヌクレオチドがそれぞれ
５′ｏ→３′の方向又は３′ｏ→５′の方向に向けられ
ているかを示している）： １）HIV−１、HIV−２及びSIVウイルスのゲノムに共通
の配列（１本の線で間隔どりされた一連の数字は、それ
ぞれHIV−１ Bru、HIV−１ Mal、HIV−１ Eli、HIV
−２ ROD及びSIVに相応するゲノム上のヌクレオチドの
位置を示す）： ・上述のウイルスのゲノムのgag遺伝子の特異的配列
（これらのウイルスの核様体の特異的抗原群をコードす
る遺伝子）。

HIV及び／又はSIVタイプのウイルスの遺伝子とこれら
のヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション特性に影
響を及ぼすことなく、下記ヌクレオチド配列のいくつか
の位置に対しいくつかの変異型を加えることも可能であ
る。これらの変異型を含むヌクレオチド配列は、塩基の
置換によってそれが誘導された元のヌクレオチド配列の
下に表示されている。元のヌクレオチド配列の塩基との
関係において変更された塩基は、これらの元の配列内の
置換された塩基に相応する位置に垂直に略さずに示され
ている；一方これらの変異型を有する配列内の置換され
なかった元の配列の塩基は点線を用いて示されている。

リーダの合成は、すべての変異型を同時に用いること
により行なわれる。テストにおいて用いられるのは、１
つの与えられた配列に対する全ての変異型の混合であ
る。

・vpr遺伝子に特異的な配列 ・pol遺伝子に特異的な配列 ２）HIV−２及びSIVウイルスのゲノムに共通の配列（一
本の線で間隔どりされた一連の数字は、それぞれHIV−
２ ROD及びSIV−MACに相応するゲノム上のヌクレオチ
ドの位置を示している）。

・nef2遺伝子の特異的配列（27kDの陰性因子をコードす
る） ・vif2遺伝子の特異的配列（23kDの感染力因子をコード
する） ・vpx遺伝子の特異的配列（12kDのタンパク質をコード
する） ３）HIV−１ Bru、HIV−１ Mal及びHIV−１ Eliウイ
ルスのゲノムに共通の配列（１本の線により間隔どりさ
れた一連の数字は、それぞれHIV−１ Bru、HIV−１ M
A1及びHIV−１ Eliウイルスに相応するゲノム上のヌク
レオチドの位置を示している） ・env遺伝子の特異的配列（外被タンパク質をコードす
る） ・nef1遺伝子の特異的配列 ・vpu遺伝子の特異的配列 本発明は同様に、上述のリーダの配列に相補的なヌク
レオチド構造を有する配列（リーダ）をもその目的とし
ている。

本発明は同様に、配列の上述のようなハイブリダイゼ
ーション特性が変更されることなく、上述のものとの関
係においていくつかの突然変異を示すヌクレオチド配列
にも関する。そのために本発明の配列のハイブリダイゼ
ーション特性に影響を与えることなく、上述の配列を構
成するヌクレオチドと異なるヌクレオチドの百分率は40
％に達しうる。

一般的に言って、センス（Ｓ）リーダ（プライマ）の
場合において、リーダの３′側に比べ５′側でより多く
の突然変異が耐容され、３′側は、配列増幅を可能にす
るため１つの核酸配列の一定のストランド（鎖）と完全
にハイブリダイズしなくてはならない。アンチセンス
（AS）リーダの場合、３′側で耐容が可能である。

本発明の目的は同様に、上述のハイブリダイゼーショ
ン特性が変更されることなく、一時的変異が中央部分に
含まれ、各々の側に５つ以上の塩基の保持を伴う上述の
ようなリーダにもある。

本発明のオリゴヌクレオチドリーダの特徴の１つは、
本発明の中に記されている技術的な使用上の指示が実施
された場合、一般に非特異性帯域の無い明確な増幅帯域
を与えるという点にある。これは、ハイブリダイゼーシ
ョンの特異性を高める27個の塩基に達しうるリーダの長
さ、ならびに外乱性会合を除去することのできる徹底的
な使用条件によるものである。各タイプのウイルスに対
する特異性は、基準マトリクスとの相似性百分率の関数
であると同時に、受諾できる収量について40個の塩基に
達しうるリーダの長さの関数でもある。

本発明は同様に、1988年８月１日付の欧州特許出願明
細書第88/307.102.9号内に記述されているようなDNA又
はRNAの多数のコピーの合成によるゲノム増幅方法の利
用のためにその末端５′のレベルで１つのプロモータに
結びつけられている上述のようなリーダにも拡大され
る。

本発明は特に、HIV−１及び／又はHIV−２タイプのウ
イルスによるヒトの潜在的感染又は３つのウイルス（HI
V−１、HIV−２、SIV）のうちの少なくとも１つによる
動物の潜在的感染の生体外診断に対し応用することので
きる、HIV−１及び／又はHIV−２タイプ又はSIVタイプ
のウイルスの核酸配列の遺伝子増幅を実施するための上
述のリーダの利用をその目的としている。

本発明のこの生体外診断方法は、研究対象の患者から
得られた生物学的試料（例えば循環血液の血清、リンパ
球といった生物学的流体）を用いて実現され、主として
次のような段階を含む： −上述の生物学的試料の中に場合によって存在するHIV
−１及び／又はHIV−２及び／又はSIVタイプのウイルス
のゲノムに属する検出すべき核酸の抽出段階、及び場合
によっては、２本鎖核酸を得るための、この核酸がRNA
の形をしている場合の核酸の逆トランスクリプターゼ
（逆転写酵素）を用いた処理段階（なおこの後者の段階
は以下でウイルスRNAのレトロトランスクリプション
（逆転写）段階とも呼ばれている） −・１本鎖核酸の形成に導く、検出すべき２本鎖核酸の
変性の段階、 ・以下に定めるハイブリダイゼーション条件の下で本発
明による少なくとも１つのリーダ対と上記鎖を接触させ
ることによる、本発明に基づく少なくとも１つのリーダ
と、上記変性段階の際に得られた核酸鎖の各々とのハイ
ブリダイゼーションの段階 ・１つの重合化作用物質（DNAポリメラーゼ）と異なる
４つのヌクレオシド三リン酸（dNTP）が存在する中でリ
ーダが上でハイブリダイズするような鎖と相補性をもつ
DNAを、これらのリーダから形成し、かくして先行する
変性段階に比べさらに多くの２本鎖核酸の形成がもたら
される段階 を含み、かつ場合によって生物学的試料の中にその検出
を可能にするだけ充分な割合で存在する検出すべき前記
核配列を得るため規定の回数だけくり返されるようなサ
イクル。

−生物学的試料内にHIV−１及び又はHIV−２及び／又は
SIVタイプのウイルスのゲノムに属する核酸が場合によ
って存在することを検出する段階。

上述のハイブリダイゼーション段階は、以下に組成
（最終使用濃度単位）が示されている緩衝液「10×バッ
ファ」内で１分30秒間60℃にて有利に実現される。

本発明の生体外診断方法は、ウイルス性RNAを用い
て、或いはまたエピゾーム又は組込み型の相補的DNAを
用いて実現できる。

実際、HIV及びSIVウイルスのゲノムは、生物内のウイ
ルスの局在化に応じてRNA又はDNAの形で現われる。

ウイルスが生体の細胞内部特に血液細胞内にある場
合、そのRNAは、逆トランスクリプターゼによりDNAに再
複写される。反対に、特に血液中の細胞外環境内のHIV
タイプのウイルスのゲノムは、RNAの形にとどまる。

（クロロホルムフェノールでの従来の方法以外に）当該
発明人により推奨されている生物学的試料の細胞内に含
まれているウイルス性DNAの本発明に従った抽出段階
は、以下の段階を含む： ・ポッタ大ピストン内で熱分解された0.5mの水の中で
の細胞沈渣の懸濁段階、 ・いわゆる「往復運動による」細胞の粉砕段階、 ・最終濃度が0.1％になるような、１対「×100トリト
ン」の付加段階、 ・100℃で15分乃至25分間の熱による変性段階、 ・細胞残滓のみを除去するための短い遠心分離段階、 ・無水エタノール2.5体積と最終体積の10％の３モルの
酢酸ナトリウムの付加による−20℃で一晩中のDNAの沈
殿段階。DNAは次に回収されて、70゜でエタノールによ
り２回洗浄された後熱分解水の中に再懸濁させられる。
ここでこの方法はDNAとRNAの同時沈殿を可能にし、従っ
て、「DNA直接PCR」と呼ばれる方法又は「PCR−RNA」と
呼ばれる方法の使用によるHIV又はSIVタイプのウイルス
のゲノムメッセージの検出が可能となる、ということに
留意されたい。

ウイルス性RNAの抽出段階は一般に、当業者にとって
従来通りの方法で行われる。

RNAの抽出後、そのゲノムがRNAの形をしているHIV−
１及び／又はHIV−２及び／又はSIVタイプのウイルスを
含む生物学的試料を用いて本発明の生体外診断が行なわ
れる場合、１本鎖のRNAから２本鎖のDNAへの形質転換と
いう補足的段階を実施する必要がある。

RNAからDNAへのこの形質転換は、逆トランスクリプタ
ーゼを用いた適当な媒質内での生物学的試料特に血清の
抽出後得られたRNAの処理によって実現される。

本発明はさらに限定にいうと、なかでも以下に規定す
るようなウイルス性RNAの逆転写（レトロトランスクリ
プション）段階が以下の要領で実施されるような生体外
診断方法をその目的としている： −水中に再懸濁された抽出RNA10μｇを最終体積40μ
内で各々40μＭの濃度でリーダ対の存在する中に置く。
この全体を10分間100℃で変性し次に氷水の中に沈め
る。

−上述の「10×バッファ」緩衝液５μ＋１単位の逆ト
ランスクリプターゼ［AMV（鳥類の骨髄芽球（細胞）症
ウイルス）又はMuMLV（モロニー白血病ウイルス）の］
＋１単位のTaq−ポリメラーゼ＋各25mMの４つのdNTPの
混合物１μ＋Q.S.P.水10μの混合物10μを加え
る。従って最終体積は50μとなる。

この反応は次の２段階で行なわれる： −ａ）第１段階:13分間42℃での逆トランスクリプター
ゼの作用によるcDNAの製造、 −ｂ）第２段階：従来の遺伝子増幅；逆トランスクリプ
ターゼを破壊しハイブリダイゼーション解除／ハイブリ
ダイゼーション段階を可能にするため３分間95℃に加熱
し、次に遺伝子増幅のため前述のサイクルを開始する。

本発明はさらに限定に言って、本発明のリーダ（又は
プライマ）対の存在する中で変性段階が行なわれる、前
述のような生体外診断方法をその目的としている。実
際、上に明記したように、本発明のオリゴヌクレオチド
（又はプライマ）の特徴の１つは、以下の条件の下で用
いられた場合に、一般に非特異性帯域の無い明確な増幅
帯域を与えるという点にある： −ハイブリダイゼーション：変性−再会合の第１段階の
ためプライマ（各プライマ40μモル（40μＭ）の溶液１
μ）をDNA−マトリクス（100〜300ng）が存在する中
に置く;10分間100℃で加熱しこのDNA−マトリクスとプ
ライマの混合物を含む試験管を氷を含む水の中に沈めて
DNA−マトリクス／プライマの再会合率を増大させる。
これらのプライマは、0.8μＭという次に続く増幅段階
における最終濃度で使用されなくてはならない。

−増幅：前記媒質内に、各々最終溶液（50μ）内で0.
5μモルで使用される４つのdNTPと、50μの反応媒質
に対し１単位のTaq−ポリメラーゼを付加する：この段
階は、1/10゜に希釈した場合、トリスーHCl,pH8.9:50m
M;（NH₄）₂SO₄:15mM;MgCl₂:5mM;βーメルカプト−エタ
ノール:10mM;ゼラチン:0.25mg/mといった組成をもつ
「10×バッファ」という名で一般に呼ばれている本発明
の増幅緩衝液の中で実施される。この緩衝液５μとq.
s.p.水50μを前述の媒質に付加する。

増幅サイクルは次の要領で行なわれる：すなわち、次
のもので成る30回〜40回のサイクル： ・10秒間94℃（変性） ・１分30秒間60℃（ハイブリダイゼーション） ・１分30秒間78℃（伸長）。

この全体の後には、15分間78℃で唯一回のサイクルが
続くことになる。

±0.3℃の誤差で示されている温度の精確さならびに
異なるサイクル中のその安定性は、最大収量を得、非特
異性帯域が無いようにするための不可欠な条件である。

DNAの最適濃度は、（患者の又は培養でホ乳動物その
他の）細胞から抽出されたゲノムDNAについて100乃至30
0ngである。

当然のことながら、前述の条件は、50μの最終反応
媒質に対する最適な条件であり、これらの条件は反応媒
質の最終体積に応じて修正されうるものである。

本発明の異なるリーダ対（又はリーダ対の組合せ）を
複数用いることにより、HIV及び／又はSIVタイプのウイ
ルスの複数タイプの交差検出又は、HIV及び／又はSIVタ
イプの同一ウイルスの複数の遺伝子の同時検出が可能と
なる。

例えば、本発明の枠内で使用可能な好ましいリーダ対
としては、以下のようなリーダ対を挙げることができ
る： ・特にHIV−１及び／又はHIV/2によるヒトの感染の生体
外診断のための、MMy1−MMy4、MMy2−MMy4、MMy1−MMy
3、MMy18−MMy19、MMy4bis−MMy28bis、MMy28−MMy29bi
s、MMy29−MMy30bis、MMy31−MMy32bis、 −特にHIV−１によるヒトの感染の生体外診断のため
の、MMy5−MMy8、MMy6−MMy8、MMy7−MMy8、MMy5−MMy7
bis、MMy6−MMy7bis、MMy9−MMy11、MMy10−MMy11、MMy
9−MMy10bis、MMy26−MMy5bis、MMy8bis−MMy9bis、MMy
8bis−MMy89、MMy89bis−MMy9bis、MMy15−MMy17、MMy1
5−MMy16bis、MMy16−MMy17、MMy25−MMy27、MMy26−MM
y27、 −HIV−２によるヒトの感染の生体外診断のための、MMy
20−MMy22、MMy20−MMy21bis、MMy21−MMy22、MMy23−M
My24、MMy12−MMy14、MMy12−MMy13bis。

このサイクルの伸長段階で用いられる重合化作用物質
は、熱安定性のあるDNAポリメラーゼ特にTaqポリメラー
ゼ、Appligene社のアンプリフィオーゼ又は市販されう
る熱安定性あるあらゆるDNAポリメラーゼである。

一般的に言って、本発明の生体外診断方法は30回から
40回反復される。

本発明の生体外診断方法は同様に、使用されるヌクレ
オチドリーダ対に応じて、生物学的試料の中に存在する
HIV及び／又はSIVタイプのウイルスの遺伝子を選択的に
検出することをも可能にする。

本発明の上述の遺伝子毎の診断方法のために一例とし
て用いることのできるリーダ対は以下のようなものであ
る： −gag遺伝子のためのMMy1−MMy4、MMy2−MMy4、MMy1−M
My3、MMy4bis−MMy28bis、 −vpr遺伝子のためのMMy18−MMy19、 −env遺伝子のためのMMy5−MMy8、MMy6−MMy8、MMy7−M
My8、MMy5−MMy7bis、MMy6−MMy7bis、MMy26−MMy5bi
s、MMy8bis−MMy9bis、MMy8bis−MMy89、MMy89bis−MMy
9bis、 −nef1遺伝子のためのMMy9−MMy11、MMy9−MMy10bis、M
My10−MMy11、 −vif1遺伝子のためのMMy15−MMy17、MMy15−MMy16bi
s、MMy16−MMy17、 −vif2のためのMMy20−MMy22、MMy20−MMy21bis、MMy21
−MMy22、 −vpxのためのMMy23−MMy24、 −nef2のためのMMy12−MMy14、MMy12−MMy13bis、MMy13
−MMy14、 −vpu遺伝子のためのMMy25−MMy27、MMy26−MMy27、 −pol遺伝子のためのMMy28−MMy29bis、MMy29−MMy30bi
s、MMy30−MMy31bis、MMy31−MMy32bis。

ただし、プライマ「Ｓ」及び「AS」の間の組み合わせ
は制限的なものではなく、ユーザの望みに応じて変える
ことができる。

一例として上で記述されたリーダ対を用いて合成され
たヌクレオチドフラグメントのサイズは、以下の表Ｉか
らXIまでに示されている： （以下の表に示されている数字は、合成されたフラグメ
ントのヌクレオチド数を表わし、「ハイフン」は、テス
トされたリーダ対では相応するウイルス菌株を特徴づけ
ることができないことを示している）。

ゲノム上でのその配置により、増幅に役立つプライマ
は、「サザントランスファ」による分析の際に観察され
た増幅帯域の特異性を確認するため低温プローブ技術に
おいて使用するため、又はキネーションによる³²Pでの
標識づけの後に、プローブとして用いることができるよ
うに、組合わせ可能であるということに留意されたい。
第３のオリゴヌクレオチドが特異的内部プローブとして
役立ちうるようにするための従来のリーダー組合せに加
えて、交差検出を可能にするこれらの遺伝子の重複によ
る遺伝子vif1/vpr及びvif2/vpxの特殊なケースにも留意
されたい。さらに、増幅されたDNAの配列決定による分
析の際に、これらのオリゴヌクレオチドは、各方向にお
ける２重配列づけ従って配列の２重読みとりを可能にし
かくして場合によって起こる解釈のあいまいさを無くす
るようなDNA−ポリメラーゼに対し特異的なリーダとし
て用いることができる。

本発明の目的は同様に、特に放射線又は酵素によって
標識づけされた上述のもののようなリーダ、ならびに特
に上述のような生体外診断方法の枠内でのヌクレオチド
ゾンデとしてのその利用にもある。

本発明はまた、α立体配座の糖を含む上述のようなオ
リゴヌクレオチドをもその目的としている。このような
オリグヌクレオチドは、マトリクスと共に形成された２
重らせんの方向を逆転させる特徴をもち（ウイルスのゲ
ノムのストランド）、この２重らせんはかくして「Ｓ」
状態から「AS」状態に移行する。

本発明は同様に、メチル化され及び／又は特にアデニ
ン上に硫黄原子を有するいくつかのヌクレオチドを含む
上述のオリグヌクレオチドにも関する。このようなオリ
ゴヌクレオチドは２重らせんの安定性を増大させ、ひい
ては増幅すべきDNA鎖とより良くハイブリダイズすると
いう特徴を呈する。

本発明は同じく、特に「La Vie des Sciences（科学
ライフ）」報告書、一般シリーズ、第４巻、No.1、p17
−37の中に掲載されたC.Heleneの論文中に記されている
方法に従って、発光剤（オレンジアクリジンといった平
坦な芳香族分子）が上で共有結合的に移植されているヌ
クレオチドを含むいわゆる「改変塩基」の形を呈する上
述のようなオリグヌクレオチドにも関する。このような
オリゴヌクレオチドは、特に蛍光により容易に検出可能
であるという特徴をもつ。

本発明のオリゴヌクレオチドは同様に、SIVタイプの
ウイルスによるサル（アカゲザル、マンガベイザル又は
サバンサモンキー）の感染の生体外診断方法の実施のた
めにも使用できる。なおこの方法は上述のものの主要な
特徴を受け継いでいる。

本発明のもう１つの目的は、上述の生体外診断方法の
実施のための診断用キットにある。一例を挙げると、本
発明の診断用キットには以下のものが含まれる： −検出すべき核酸配列の鎖の１つとハイブリダイズする
リーダ及び上述の条件下で上述の鎖の相補鎖とハイブリ
ダイズするリーダを各々含む少なくとも１つの本発明に
基づくオリゴヌクレオチドリーダ対、 −特にDNAポリメラーゼと４つの異なる三リン酸ヌクレ
オチドの増幅作業サイクルの実施に適した試薬、及び上
述の「10×バッファ」と呼ばれる反応媒質、 −検出すべき増幅された核酸配列と特異的にハイブリダ
イズすることができる、低温プローブ技術又は放射能に
よって特に標識づけされうるゾンデ。

本発明はまた、これらのリーダを用いて増幅されたヌ
クレオチド配列によってコードされたタンパク質の合成
方法の実施のための、前述の本発明に基づくリーダの利
用にも関する。

一例を挙げると、このタンパク質合成方法は、上述の
条件下で本発明に基づく少なくとも１つのリーダ対と配
列を接触させることにより（一定のタンパク質をコード
し場合によってはそのヌクレオチドの或る種の変更を受
けた）HIV又はSIVタイプのウイルスのゲノムのヌクレオ
チド配列を増幅させる段階と、それに続いてこうして増
幅されたこれらの配列をタンパク質に翻訳する段階を含
んでいる。なおこの後者の段階は、特に、増幅された前
記配列を含むベクタを用いて適切な宿主細胞を形質転換
し、これらの宿主細胞内で生成されたタンパク質を回収
することによって実施される。

本発明は同じく、本発明のヌクレオチド配列（又はリ
ーダー）の翻訳から得られたポリペプチドにも関する。

本発明の目的は、特にエイズ予防活動における抗ウイ
ルス剤全般としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドリ
ーダの利用、ならびに薬学的に受容できる賦形剤と結び
つけた形でのこれらのアンチセンスリーダを含む薬剤化
合物にもある。

本発明は同様に、本発明に基づくヌクレオチド配列の
翻訳生成物及び／又は本発明に従って構成されたリーダ
から上述の方法に従って増幅されたヌクレオチド配列の
翻訳生成物を含む免疫化合物にも関する。なおこれらの
翻訳生成物は、薬学的に受容できる賦形剤に結びつけら
れている。

本発明は、上述の翻訳生成物に対して向けられた（換
言すると、本発明に従ったヌクレオチド配列の翻訳生成
物又は本発明に従って構成されたリーダを用いて増幅さ
れたヌクレオチド配列の翻訳生成物と免疫反応を形成す
ることのできる）抗体、ならびに当業者にとって既知の
方法に従いHIV−１及び／又はHIV−２タイプのウイルス
によるヒトの感染又は３つのウイルス（HIV−１、HIV−
２、SIV）のうちの少なくとも１つによる動物の感染の
生体外診断方法の実施のためのその利用、に関する。

一例を挙げると、本発明によるこのような生体外診断
方法は、研究対象の患者から採取した生物学的試料（特
に血清）を本発明に基づく抗体と接触させる作業、及び
場合によって生物学的試料の中に存在するHIV又はSIVタ
イプのウイルスの抗原と前記抗体の間に形成された免疫
学的複合体を（特に標識づけされた抗免疫グロブリンを
用いて）適切なあらゆる方法で検出する作業を含んでい
る。

本発明は同様に、本発明による抗体及び、場合によっ
ては、HIV又はSIVウイルスの抗原とこれらの抗体の間で
形成された免疫反応を立証する適切な試薬を含む、生体
外診断用キットをもその目的としている。

本発明は又、上述のポリペプチド特に国際遺伝コード
に従い上述のヌクレオチド配列（又はリーダ）に相応す
るポリペプチドの調製方法において、好ましくはＣ末端
アミノ酸から出発して、必要とされる順の連続するアミ
ノアシル又は適切な順序で複数のアミノアシル残基をす
でに含む予め形成されたフラグメントとアミノアシル、
或いは又こうして予め調製された複数のフラグメントを
２つずつ連続的に縮合すること、なお、これは順次段階
的に接近するようにＮ末端アミノ酸に至るまで、ペプチ
ド合成において既知の方法に従って行なわれ、特にカル
ボキシル基の活性化の後ペプチド結合の形成に通常介入
しなくてはならないような一方のアミン基及び他方のカ
ルボキシル基又はその逆を除くこれらのアミノアシル又
はフラグメントが支持する全ての反応基は予め保護して
おくことを特徴とする方法にも関する。

例えば、1974年E.Wunschにより編集された「Meuthode
der Organischen Chemie」（有機化学の方法）第15−
Ｉ及びII巻、THIEME,STUTTGARTの中でHoubenweylが記し
た均質溶液ペプチド合成技法又は、R.D.Merrifieldが
「固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesi
s）」（J.AM.CHEM.SOC.,45,2149−2154）に記した固相
ペプチド合成法を利用することができる。

本発明は同様に、上述のヌクレオチド配列（又はリー
ダ）の調製方法において、 −DNA_ase（デオキシリボヌクレアーゼ）Ｉを用いて上述
のHIV又はSIVタイプのウイルスから分離したゲノミック
DNAを保温し、その後EDTAを付加し、フェノール／クロ
ロホルム／イソアミルアルコール（25/24/1）の混合物
次にエーテルでの抽出により精製を行なう段階、 −DTTの存在する中でEcoR1メチラーゼによりこうして抽
出されたDNAを処理し、上述のような抽出により精製を
行なう段階、 −E.coli（大腸菌）のDNAリガーゼとT₄DNAポリメラーゼ
の存在する中で４つのデオキシヌクレオチド三リン酸dA
TP、dCTP、dGTP及びdTTPを用いてこうして精製されたDN
Aを保温しその後上述の方法に従って精製する段階、 −こうして得られた核酸を適切なベクターの中でクロー
ニングし適切なプローブを用いて求める核酸を回収する
段階、 を含むような方法にも関する。

本発明のヌクレオチド配列の特に有利な調製方法に
は、以下の段階が含まれる： −「Bioorganic Chemistry（生物有機化学）」4;274−3
25（1986年）内に記されたリン酸亜アミノ酸β−シアン
エチルの自動化された方法を用いてDNAを合成する段
階、 −こうして得られた核酸を適切なベクター内でクローニ
ングし、適切なプローブでのハイブリダイゼーションに
より核酸を回収する段階。

本発明のヌクレオチド配列のもう１つの調製方法は、
以下の段階を含んでいる： −Proc,Natl.Acad,Sci USA（米国国立科学アカデミ会
報）180;7461−7465（1983年）に記されている原理に従
った天然ポリペプチドのアミノ酸鎖と適合性のある配列
をもつ、異なる制限部位を端部に備えた化学的に合成し
たオリゴヌクレオチドの組立て段階、 −こうして得られた核酸を適切なベクタ内でクローニン
グし、適切なプローブとのハイブリダイゼーションによ
り求める核酸を回収する段階。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ // Ｃ０７Ｋ 14/155 Ｃ０７Ｋ 14/16 14/16 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 モンカニ，モーリス フランス国、エフ―75019 パリ、ア レ・デ・オルゲ―ドゥ―フランドル、18 (72)発明者 モンタニエール，リュク フランス国、エフ―92350 ル・プレシ ―ロバンソン、リュ・ドゥ・マラブリ、 21 (56)参考文献 特開 昭63−102677（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−217161（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−294800（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，1987年，Ｖｏｌ．326, Ｎｏ．16，ｐ．662−669 Ｎａｔｕｒｅ，1987年，Ｖｏｌ．328, Ｎｏ．６，ｐ．543−547 Ｎａｔｕｒｅ，1985年，Ｖｏｌ．313, Ｎｏ．24，ｐ．277−284 Ｓｃｉｅｎｃｅ，1988年，Ｖｏｌ. 239，Ｎｏ．15，ｐ．295−297 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) (54)【発明の名称】 ＨＩＶ―１、ＨＩＶ―２及びＳＩＶタイプのレトロウイルスのゲノムからのヌクレオチド配列、 並びに、特に、これらのレトロウイルスのゲノムの増幅のため及びこれらのウイルスによる感染 の「生体外」診断のためのこれらの配列の応用

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記： MMy2−MMy4、 MMy7−MMy8、 MMy9−MMy10bis、 MMy12−MMy13bis、 MMy15−MMy17、 MMy18−MMy19、 MMy20−MMy21bis、 MMy23−MMy24、 MMy25−MMy27、 MMy28−MMy29bis、 又は上記プライマー対のいずれかの相補的配列からなる
   プライマー対からなる群より選択されるAIDS関連ウイル
   スの検出のためのプライマー対であって、該プライマー
   は、下記： の配列を有する。
2. 【請求項２】生物学的試料で始めるHIV−１及び又はHIV
   −２及び又はSIVタイプのウイルスの核酸配列の調製方
   法であって、該方法が、主として、下記工程： −上述の生物学的試料の中に存在することができるHIV
   −１、HIV−２又はSIVタイプのウイルスのゲノムに属す
   る検出すべき核酸の抽出工程、及び、場合により核酸が
   RNAの形であるならば、逆トランスクリプターゼを用い
   て処理する工程、 −下記工程： ・一本鎖核酸の形成を導く、検出すべき２本鎖核酸の変
   性工程、 ・上記鎖を請求項１に記載の少なくとも１対のプライマ
   ーと接触させることによって、上記変性工程の間に得ら
   れた各々の核酸鎖のハイブリダイゼーション工程 ・DNAポリメラーゼと４つの異なるヌクレオシド三リン
   酸（dNTP）の存在下でハイブリダイゼーションされた鎖
   に相補的なDNAを、プライマーから始めて形成し、先行
   する変性工程に比べてより多くの２本鎖核酸の形成がも
   たらされる工程 を含むサイクル、 を含む方法。
3. 【請求項３】該サイクルを所定回数反復し、その検出を
   可能にするに十分な割合で存在する該検出すべき核酸配
   列を得、さらに生物学的試料中のHIV−１及び／又はHIV
   −２及び／又はSIVタイプウイルスのゲノムに属する核
   酸の場合による存在を検出する工程を含む、請求項２に
   記載の方法。
4. 【請求項４】下記工程： ・ポッタ大ピストン内で熱分解された0.5mlの水の中で
   の細胞沈渣の懸濁段階、 ・いわゆる「往復運動による」細胞の破砕段階、 ・最終濃度が0.1％になるような、１対100×トリトンの
   付加段階、 ・100℃で15分〜25分間の熱による変性段階、 ・細胞残渣のみを除去するための短い遠心分離段階、 ・無水エタノール2.5体積と最終体積の10％の３モルの
   酢酸ナトリウムの付加による−20℃での一晩中のDNAの
   沈殿段階、 が含まれることを特徴とする、請求項２又は３記載の方
   法。
5. 【請求項５】ウイルスのRNAの逆転写段階には、 −水中に再懸濁された抽出RNA10μｇを最終体積40μｌ
   内で各々 0.8μＭの濃度でリーダ対の存在する中に置き、この全
   体を10分間100℃ で変性し次に氷水の中に沈める段階、 −５μｌの「10×バッファ」の緩衝液（1/10゜に希釈さ
   れたときトリス −HCl、pH＝8.9:50mM;（NH₄）₂SO₄;15mM;MgCl₂:5mM; β−メルカプト−エタノール:10mM;ゼラチン:0.25mg/ml
   を含む）＋１単位の逆トランスクリプターゼ＋１単位の
   Taq−ポリメラーゼ＋各25mMの４つのdNTPの混合物１μ
   ｌ＋Q.S.P.水10μｌの混合物10μｌを再び加え（なおcD
   NAの製造は13分間42℃で逆トランスクリプターゼの作用
   により行なわれる）、次に３分間95℃に加熱して逆トラ
   ンスクリプターゼを破壊する段階、 が含まれることを特徴とする、請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】変性段階が、請求項１記載のプライマー対
   の存在する中で行われることを特徴とする、請求項２〜
   ５のいずれか１項記載の方法。
7. 【請求項７】−ハイブリダイゼーション：変性−再会合
   の第１段階のためプライマー（各プライマー40μモルの
   溶液１μｌ）をDNAマトリクス（100〜300ng）が存在す
   る中に置く:10分間100℃で加熱しこのDNA−マトリクス
   とプライマーの混合物を含む試験管を氷を含んだ水の中
   に沈める。これらのプライマーは、0.8μＭという次に
   続く増幅段階における最終濃度で使用されなくてはなら
   ない、 −増幅：前記媒質内に、各々最終容器（50μｌ）中で0.
   5μモルで使用される４つのdNTPと、50μｌの反応媒質
   に対し１単位のTap−ポリメラーゼを付加する；この段
   階は、「10×バッファ」の名で呼ばれる請求項14に組成
   が示されている増幅緩衝液の中で行われる、 という条件の下で実施されることを特徴とする、請求項
   ６記載の方法。
8. 【請求項８】HIV−１及び／又はHIV−２タイプのウイル
   スによるヒトの感染又は３つのウイルス（HIV−１、HIV
   −２、SIV）の１つ以上による動物の感染の生体外検出
   用である、請求項２〜７のいずれか１項記載の方法。
9. 【請求項９】HIV又はSIVタイプのウイルスのゲノムのヌ
   クレオチド配列の増幅とそれに続く、請求項１に記載の
   プライマー対からこれらの増幅された配列をタンパク質
   に翻訳する作業用の、請求項２〜７のいずれか１項記載
   の方法。
10. 【請求項１０】−請求項１に記載の、少なくとも１対の
    オリゴヌクレオチドプライマー、 −特にDNAポリメラーゼと４つの異なる三リン酸ヌクレ
    オチドの増幅作業サイクルの実施に適した試薬、 −請求項５に記されているような「10×バッファ」緩衝
    液、 −検出すべき増幅された核酸配列とハイブリダイズする
    ことのできる、標識づけ可能なプローブ、 を含む、請求項２〜７のいずれか１項記載の方法の使用
    のためのキット。
11. 【請求項１１】請求項２〜７のいずれか１項記載の方法
    により増幅されたヌクレオチド配列の翻訳生成物の１個
    又は数個と免疫反応を起こし得る抗体。
12. 【請求項１２】請求項11記載の抗体と研究対象の患者か
    ら採取した生物学的試料との接触、及び場合によってこ
    の生物学的試料の中に存在するHIV又はSIVタイプのウイ
    ルスの抗原と前記抗体の間で形成された免疫学的複合体
    の検出を含む、３つのウイルス（HIV−１、HIV−２、SI
    V）のうちの少なくとも１つによる動物の感染又はHIV−
    １及び／又はHIV−２タイプのウイルスによるヒトの感
    染を「生体外」で検出する方法。
13. 【請求項１３】生物学的試料が血清である、請求項12記
    載の方法。
14. 【請求項１４】請求項11記載の抗体及び場合によっては
    これらの抗体とHIV及び／又はSIVウイルスの抗原の間で
    起こった免疫学的反応を実証するのに適した試薬を含
    む、請求項12又は13記載の方法の使用のためのキット。