JP3409079B2 - 遺伝子の転写を抑制する機能を有するペプチド - Google Patents
遺伝子の転写を抑制する機能を有するペプチドInfo
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の転写を抑
制する機能を有するペプチド、該ペプチドをコードする
遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター及び該組
み換えベクターを含む形質転換体に関する。
制する機能を有するペプチド、該ペプチドをコードする
遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター及び該組
み換えベクターを含む形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】植物ホルモン、エチレンに応答するシス
制御エレメントに結合するタンパク質因子ＥＲＦ（Ethy
lene Responsive Element binding Factor）は、ＥＲＦ
ドメインと名付けたＤＮＡ結合ドメインを有する植物特
有の転写因子である。最近の研究から、ＥＲＦタンパク
質をコードする遺伝子は、マルチジーンファミリーを構
成していることが明らかになっている。これまでに、タ
バコ、シロイヌナズナ植物からＥＲＦドメインを有する
タンパク質因子をコードするｃＤＮＡが明らかにされて
いるが、本発明者らはさらに、タバコ、イネ、シロイヌ
ナズナのｃＤＮＡについて機能解析を行い、植物細胞内
でリプレッサーとして機能するドメインを明らかにし、
本発明を完成した。
制御エレメントに結合するタンパク質因子ＥＲＦ（Ethy
lene Responsive Element binding Factor）は、ＥＲＦ
ドメインと名付けたＤＮＡ結合ドメインを有する植物特
有の転写因子である。最近の研究から、ＥＲＦタンパク
質をコードする遺伝子は、マルチジーンファミリーを構
成していることが明らかになっている。これまでに、タ
バコ、シロイヌナズナ植物からＥＲＦドメインを有する
タンパク質因子をコードするｃＤＮＡが明らかにされて
いるが、本発明者らはさらに、タバコ、イネ、シロイヌ
ナズナのｃＤＮＡについて機能解析を行い、植物細胞内
でリプレッサーとして機能するドメインを明らかにし、
本発明を完成した。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】すなわち、本発明はＤ
ＮＡに結合し遺伝子の転写を抑制する機能を有する高等
植物由来のペプチド、該ペプチドをコードする遺伝子、
該遺伝子を含有する組み換えベクター及び該組み換えベ
クターを含む形質転換体を提供することを目的とする。
ＮＡに結合し遺伝子の転写を抑制する機能を有する高等
植物由来のペプチド、該ペプチドをコードする遺伝子、
該遺伝子を含有する組み換えベクター及び該組み換えベ
クターを含む形質転換体を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、タバコ、
イネ、シロイヌナズナのｃＤＮＡについて機能解析を行
った結果、ＥＲＦ因子のカルボキシ末端領域のアスパラ
ギン酸−ロイシン−アスパラギン（ＤＬＮ）からなるモ
チーフを有する領域が、遺伝子の転写を抑制する機能を
有することを発見し、本発明を完成した。このようなＤ
ＬＮモチーフを有し遺伝子の転写を抑制する機能を有す
るペプチドとしては、例えばタバコ由来のＥＲＦ３に含
まれるペプチド；シロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３、
ＡｔＥＲＦ４、ＡｔＥＲＦ７及びＡｔＥＲＦ８に含まれ
るペプチド；イネ由来のｏｓＥＲＦ３（配列番号１）に
含まれるペプチドが挙げられる。
イネ、シロイヌナズナのｃＤＮＡについて機能解析を行
った結果、ＥＲＦ因子のカルボキシ末端領域のアスパラ
ギン酸−ロイシン−アスパラギン（ＤＬＮ）からなるモ
チーフを有する領域が、遺伝子の転写を抑制する機能を
有することを発見し、本発明を完成した。このようなＤ
ＬＮモチーフを有し遺伝子の転写を抑制する機能を有す
るペプチドとしては、例えばタバコ由来のＥＲＦ３に含
まれるペプチド；シロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３、
ＡｔＥＲＦ４、ＡｔＥＲＦ７及びＡｔＥＲＦ８に含まれ
るペプチド；イネ由来のｏｓＥＲＦ３（配列番号１）に
含まれるペプチドが挙げられる。
【０００５】
【発明の実施の形態】機能解析の方法は、それぞれのＥ
ＲＦ因子をコードしているｃＤＮＡから、タンパク質コ
ード領域を切り出し、これを酵母のＧＡＬ４転写因子の
ＤＮＡ結合ドメインをコードしている領域と結合し、さ
らに植物細胞で機能するカリフラワーモザイクウイルス
３５Ｓプロモーターの下流につないでエフェクタープラ
スミドを構築する。これをＧＡＬ４タンパク質結合部位
をプロモーター領域に結合した、ルシフェラーゼ遺伝子
からなるリポーター遺伝子と同時に、タバコ培養細胞あ
るいはシロイヌナズナ葉にエレクトロポーション法によ
り導入し、リポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝
子の活性を測定することによって調べた。
ＲＦ因子をコードしているｃＤＮＡから、タンパク質コ
ード領域を切り出し、これを酵母のＧＡＬ４転写因子の
ＤＮＡ結合ドメインをコードしている領域と結合し、さ
らに植物細胞で機能するカリフラワーモザイクウイルス
３５Ｓプロモーターの下流につないでエフェクタープラ
スミドを構築する。これをＧＡＬ４タンパク質結合部位
をプロモーター領域に結合した、ルシフェラーゼ遺伝子
からなるリポーター遺伝子と同時に、タバコ培養細胞あ
るいはシロイヌナズナ葉にエレクトロポーション法によ
り導入し、リポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝
子の活性を測定することによって調べた。
【０００６】つぎに、リプレッサー因子に存在するリプ
レッサー機能を有する領域であるリプレッサードメイン
を同定するために、各遺伝子のコード領域を削除する方
法であるディリーション解析法を用いて、ＥＲＦ因子の
どの領域にリプレッサードメインが存在するのかを調べ
た。
レッサー機能を有する領域であるリプレッサードメイン
を同定するために、各遺伝子のコード領域を削除する方
法であるディリーション解析法を用いて、ＥＲＦ因子の
どの領域にリプレッサードメインが存在するのかを調べ
た。
【０００７】
【実施例】イネosERF3遺伝子の単離
塩基配列が決定されているタバコのERF3遺伝子のアミノ
酸配列をもとにBLASTプログラムでデーターベースを探
索し、とERF3と相同性を持つイネのcDNA配列を探索し
た。ERF3と相同性を示しすイネcDNAクローンC1255を農
業生物資源研究所より譲渡を受け、全塩基配列を決定し
た。配列番号１に示すosERF3のcDNAの全長配列を持つプ
ラスミドをposERF3と名付けた。
酸配列をもとにBLASTプログラムでデーターベースを探
索し、とERF3と相同性を持つイネのcDNA配列を探索し
た。ERF3と相同性を示しすイネcDNAクローンC1255を農
業生物資源研究所より譲渡を受け、全塩基配列を決定し
た。配列番号１に示すosERF3のcDNAの全長配列を持つプ
ラスミドをposERF3と名付けた。
【０００８】osERF3リプレッションドメインの同定
エフェクタープラスミドの構築
（osERF3全長を含むエフェクタープラスミドpGAL4DB-os
ERF3の構築：図１）クローンテック社製(Clontech社, U
SA)のプラスミドpBI221を制限酵素XhoIとSacIで切断
し、T4ポリメラーゼで平滑末端処理した後、アガロース
ゲル電気泳動でGUS遺伝子を除き、カリフラワーモザイ
クウイルス35Sプロモーター（以下CaMV35S）とノパリン
合成酵素遺伝子の転写終止領域（Nosターミネーター、
以下Nos-ter)を含む35S-Nosプラスミド断片DNAを得た。
クローンテック社製のpAS2-1ベクターを制限酵素HindII
Iで消化し、酵母 GAL4タンパク質のDNA 結合領域 ( 1-1
47 アミノ酸残基) をコードする 748 bp の DNA 断片
（以下GAL4DBD)をアガロースゲル電気泳動によって単離
した後、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理をした。
このGAL4DBDを含むDNA断片を、先ほどの35S-NosのDNAの
35SプロモーターとNosターミネータ間の平滑末端にした
部位に挿入し、35Sプロモーターに対して酵母 GAL4 タ
ンパク質のDNA 結合領域の ORF が順方向に並んでいる
ものを選抜してp35S-GAL4DBD ベクターを構築した。
ERF3の構築：図１）クローンテック社製(Clontech社, U
SA)のプラスミドpBI221を制限酵素XhoIとSacIで切断
し、T4ポリメラーゼで平滑末端処理した後、アガロース
ゲル電気泳動でGUS遺伝子を除き、カリフラワーモザイ
クウイルス35Sプロモーター（以下CaMV35S）とノパリン
合成酵素遺伝子の転写終止領域（Nosターミネーター、
以下Nos-ter)を含む35S-Nosプラスミド断片DNAを得た。
クローンテック社製のpAS2-1ベクターを制限酵素HindII
Iで消化し、酵母 GAL4タンパク質のDNA 結合領域 ( 1-1
47 アミノ酸残基) をコードする 748 bp の DNA 断片
（以下GAL4DBD)をアガロースゲル電気泳動によって単離
した後、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理をした。
このGAL4DBDを含むDNA断片を、先ほどの35S-NosのDNAの
35SプロモーターとNosターミネータ間の平滑末端にした
部位に挿入し、35Sプロモーターに対して酵母 GAL4 タ
ンパク質のDNA 結合領域の ORF が順方向に並んでいる
ものを選抜してp35S-GAL4DBD ベクターを構築した。
【０００９】osERF3のcDNAプラスミドposERF3と、GAL4D
BDと読み枠（フレーム）が一致するように設計した５末
アッパープライマーprimer1（配列番号３：osERF3塩基
配列1-20に結合）GATGGCGCCCAGAGCAGCTACと制限酵素Sal
I部位を持つ３末ローワープライマーprimer2（配列番号
４：osERF3塩基配列685-708に結合）GTCGACCTAGTTCTCTA
CCGGCGGCGGCCを用いてosERF3全タンパク質コード領域
（配列番号１：osERF3塩基配列1-708; アミノ酸配列1-2
35）をPCR法によって増幅し、DNA断片を得た。PCR反応
の条件は、変性反応94℃１分、アニール反応℃47℃２
分、伸長反応74℃１分を１サイクルとしてで25サイクル
おこなった。以下全てのPCR反応は同じ条件でおこなっ
た。得たDNA断片を制限酵素SalIで消化した後、アガロ
ース電気泳動によって目的とするDNA断片を単離した。
このosERF3をコードするDNA断片を、制限酵素SmaIとSal
Iで予め消化しておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組み込
み、エフェクタープラスミドpGAL-osERF3を構築した。
BDと読み枠（フレーム）が一致するように設計した５末
アッパープライマーprimer1（配列番号３：osERF3塩基
配列1-20に結合）GATGGCGCCCAGAGCAGCTACと制限酵素Sal
I部位を持つ３末ローワープライマーprimer2（配列番号
４：osERF3塩基配列685-708に結合）GTCGACCTAGTTCTCTA
CCGGCGGCGGCCを用いてosERF3全タンパク質コード領域
（配列番号１：osERF3塩基配列1-708; アミノ酸配列1-2
35）をPCR法によって増幅し、DNA断片を得た。PCR反応
の条件は、変性反応94℃１分、アニール反応℃47℃２
分、伸長反応74℃１分を１サイクルとしてで25サイクル
おこなった。以下全てのPCR反応は同じ条件でおこなっ
た。得たDNA断片を制限酵素SalIで消化した後、アガロ
ース電気泳動によって目的とするDNA断片を単離した。
このosERF3をコードするDNA断片を、制限酵素SmaIとSal
Iで予め消化しておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組み込
み、エフェクタープラスミドpGAL-osERF3を構築した。
【００１０】（osERF3アミノ酸193/235を含むエフェク
タープラスミドpGAL-193/235osERF3の構築）posERF3プ
ラスミドとGAL4DBDをコードするフレームと読み枠が一
致するように設計した５末アッパープライマーprimer3
（配列番号５：結合部位osERF3塩基配列575-600）GCGGC
GGTTGCACAAGTGACTCCと制限酵素SalI部位を持つ３末ロー
ワープライマーprimer2（配列番号４：結合部位osERF3
塩基配列685-708）GTCGACCTAGTTCTCTACCGGCGGCGGCCを用
いてosERF3のアミノ酸配列193/235コード領域に該当す
る塩基配列575-708の領域を含むDNA断片をPCR法によっ
て得た。このDNA断片を制限酵素SalIで消化し、アガロ
ース電気泳動によって目的とするDNA断片を単離した。
このosERF3のアミノ酸配列193/235にをコードするDNA断
片(DNA領域575-708)を、制限酵素SmaIとSalIで予め消化
しておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組み込み、エフェ
クタープラスミドpGAL-141/185osERF3を構築した。
タープラスミドpGAL-193/235osERF3の構築）posERF3プ
ラスミドとGAL4DBDをコードするフレームと読み枠が一
致するように設計した５末アッパープライマーprimer3
（配列番号５：結合部位osERF3塩基配列575-600）GCGGC
GGTTGCACAAGTGACTCCと制限酵素SalI部位を持つ３末ロー
ワープライマーprimer2（配列番号４：結合部位osERF3
塩基配列685-708）GTCGACCTAGTTCTCTACCGGCGGCGGCCを用
いてosERF3のアミノ酸配列193/235コード領域に該当す
る塩基配列575-708の領域を含むDNA断片をPCR法によっ
て得た。このDNA断片を制限酵素SalIで消化し、アガロ
ース電気泳動によって目的とするDNA断片を単離した。
このosERF3のアミノ酸配列193/235にをコードするDNA断
片(DNA領域575-708)を、制限酵素SmaIとSalIで予め消化
しておいた35S-GAL4DBDプラスミドに組み込み、エフェ
クタープラスミドpGAL-141/185osERF3を構築した。
【００１１】（レポーター遺伝子の構築：図２及び図
３） プラスミドpUC18 を制限酵素EcoRIとSstI で消化する。
pBI221 （クローンテック社）を 制限酵素EcoRIと Sst
Iで消化し、Nos-ter (nopaline synthase terminator)
を領域含む270bpのDNA断片を挿入するアガロースゲル電
気泳動によって単離する。得られた断片を制限酵素EcoR
IとSstI で消化しておいたプラスミドpUC18 のEcoRI-Ss
tI部位に挿入する。カリフラワーモザイクウイルス35S
プロモーターTATAボックスを含む相補鎖のDNA１（配列
番号６）AGCTTAGATCTGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCA
TTTCATTTGGAGAGGACACGCTG及びDNA２（配列番号７）GATC
CAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTC
TTGCAGATCTAを合成する。合成したDNAを90℃２分加熱し
た後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で
２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させる。
Nos-terを持つpUC18プラスミドを制限酵素 HindIIIと B
amHI で消化する。合成した２本鎖DNAをpUC18のHindIII
-BamHI部位に挿入し、TATA-boxとNos-terを含むプラス
ミドを構築する。上記の手順は、図２に示した。
３） プラスミドpUC18 を制限酵素EcoRIとSstI で消化する。
pBI221 （クローンテック社）を 制限酵素EcoRIと Sst
Iで消化し、Nos-ter (nopaline synthase terminator)
を領域含む270bpのDNA断片を挿入するアガロースゲル電
気泳動によって単離する。得られた断片を制限酵素EcoR
IとSstI で消化しておいたプラスミドpUC18 のEcoRI-Ss
tI部位に挿入する。カリフラワーモザイクウイルス35S
プロモーターTATAボックスを含む相補鎖のDNA１（配列
番号６）AGCTTAGATCTGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCA
TTTCATTTGGAGAGGACACGCTG及びDNA２（配列番号７）GATC
CAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTC
TTGCAGATCTAを合成する。合成したDNAを90℃２分加熱し
た後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で
２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させる。
Nos-terを持つpUC18プラスミドを制限酵素 HindIIIと B
amHI で消化する。合成した２本鎖DNAをpUC18のHindIII
-BamHI部位に挿入し、TATA-boxとNos-terを含むプラス
ミドを構築する。上記の手順は、図２に示した。
【００１２】このプラスミドを制限酵素SstIで消化し、
T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理をおこなう。ホ
タル・ルシフェラーゼ遺伝子(LUC)をもつプラスミドベ
クター PGV-CS2 (東洋インキ社製）を 制限酵素XbaI と
NcoIで消化し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理
をおこなった後、アガロースゲル電気泳動によって、ル
シフェラーゼ遺伝子を含む 1.65 kb の DNA 断片を単離
精製した。このDNA断片を上記のTATAボックスとNosター
ミネーターを含むプラスミドに挿入しTATA-LUC リポー
ター遺伝子を構築した。酵母の GAL4 タンパク質のＤＮ
Ａ結合配列を５コピー持つプラスミド pG5CAT(Clontech
社製) を 制限酵素SmaIと XbaIで消化し、T4 DNA ポリ
メラーゼで平滑末端化処理をおこなった後、５コピーの
GAL4 タンパク質のＤＮＡ結合配列含むDNA 断片をアガ
ロースゲル電気泳動で精製した。TATA-LUC ベクターを
制限酵素BglIIで消化し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末
端化処理をおこう。この部位に平滑末端化した５コピー
の GAL4 タンパク質のＤＮＡ結合配列含む DNA 断片を
挿入し、得られたプラスミドのうち GAL4 タンパク質の
ＤＮＡ結合配列が順方向に向いているものを選抜し、リ
ポーター遺伝子GAL4-LUC を構築した。（図３参照）
T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理をおこなう。ホ
タル・ルシフェラーゼ遺伝子(LUC)をもつプラスミドベ
クター PGV-CS2 (東洋インキ社製）を 制限酵素XbaI と
NcoIで消化し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理
をおこなった後、アガロースゲル電気泳動によって、ル
シフェラーゼ遺伝子を含む 1.65 kb の DNA 断片を単離
精製した。このDNA断片を上記のTATAボックスとNosター
ミネーターを含むプラスミドに挿入しTATA-LUC リポー
ター遺伝子を構築した。酵母の GAL4 タンパク質のＤＮ
Ａ結合配列を５コピー持つプラスミド pG5CAT(Clontech
社製) を 制限酵素SmaIと XbaIで消化し、T4 DNA ポリ
メラーゼで平滑末端化処理をおこなった後、５コピーの
GAL4 タンパク質のＤＮＡ結合配列含むDNA 断片をアガ
ロースゲル電気泳動で精製した。TATA-LUC ベクターを
制限酵素BglIIで消化し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末
端化処理をおこう。この部位に平滑末端化した５コピー
の GAL4 タンパク質のＤＮＡ結合配列含む DNA 断片を
挿入し、得られたプラスミドのうち GAL4 タンパク質の
ＤＮＡ結合配列が順方向に向いているものを選抜し、リ
ポーター遺伝子GAL4-LUC を構築した。（図３参照）
【００１３】（レファレンス遺伝子の構築）ウミシイタ
ケ由来のルシフェラーゼ遺伝子をもつプロメガ社製カセ
ットベクターpRL-null を制限酵素NheIと XbaI 制限酵
素で切断し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理を
行った後、アガロースゲル電気泳動で ウミシイタケ・
ルシフェラーゼ遺伝子を含む 948 bp の DNA 断片を精
製する。この DNA 断片をエフェクタープラスミドの構
築の際に用いたGUS遺伝子を除いたpBI221ベクターのGUS
遺伝子があった領域にに挿入する。得られたプラスミド
のうち、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子がが順方
向に向いているものを選抜する（pPTRL の構築）。
ケ由来のルシフェラーゼ遺伝子をもつプロメガ社製カセ
ットベクターpRL-null を制限酵素NheIと XbaI 制限酵
素で切断し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理を
行った後、アガロースゲル電気泳動で ウミシイタケ・
ルシフェラーゼ遺伝子を含む 948 bp の DNA 断片を精
製する。この DNA 断片をエフェクタープラスミドの構
築の際に用いたGUS遺伝子を除いたpBI221ベクターのGUS
遺伝子があった領域にに挿入する。得られたプラスミド
のうち、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子がが順方
向に向いているものを選抜する（pPTRL の構築）。
【００１４】（レポーター遺伝子の活性測定法）タバコ
培養細胞プロトプラストにリポーター遺伝子とエフェク
タープラスミドをエレクトロポレーション法を用いて導
入し、エフェクターの効果をリポーター遺伝子の活性を
測定することによって調べた。 （プロトプラストの調製法）100 mL の MS 培地 (ムラ
シゲ・スクーグ培地用混合塩類、日本製薬社製 、3%シ
ョ糖、0.2 g/L KH2PO4, 0.2 g/L m-inositol, 2 mg/L g
lycine, 1 mg/L 塩酸チアミン、0.2 mg/L 2, 4-D, pH
を 5.8 に調節する) に７日間培養した タバコ培養細胞
BY-2 の前培養液３ｍｌを加えて 26℃で３日間暗所で
培養した細胞を金属製のメッシュ（目の開きが 125 mm,
東京スクリーン社製）濾過回収し、0.4M マニトールを
含む MS 培地 で細胞を洗浄する。 洗浄した細胞を 25
mL の 0.4 M マニトールを含む MS 培地 に懸濁して１
０分間室温で放置3,000 rpm で１分間遠心して細胞を回
収する。この細胞を 20 mL の１％セルラーゼ（オノヅ
カRS, ）と 0.1％ペクトリアーゼ Y-23（セイシン社
製）を含む MS 培地に細胞を再懸濁して、26℃で 90 分
間暗所で 60 rpm で回転振とうしながら細胞壁を消化す
る。その後、1,000 rpm で５分間遠心してプロトプラス
トを回収する。
培養細胞プロトプラストにリポーター遺伝子とエフェク
タープラスミドをエレクトロポレーション法を用いて導
入し、エフェクターの効果をリポーター遺伝子の活性を
測定することによって調べた。 （プロトプラストの調製法）100 mL の MS 培地 (ムラ
シゲ・スクーグ培地用混合塩類、日本製薬社製 、3%シ
ョ糖、0.2 g/L KH2PO4, 0.2 g/L m-inositol, 2 mg/L g
lycine, 1 mg/L 塩酸チアミン、0.2 mg/L 2, 4-D, pH
を 5.8 に調節する) に７日間培養した タバコ培養細胞
BY-2 の前培養液３ｍｌを加えて 26℃で３日間暗所で
培養した細胞を金属製のメッシュ（目の開きが 125 mm,
東京スクリーン社製）濾過回収し、0.4M マニトールを
含む MS 培地 で細胞を洗浄する。 洗浄した細胞を 25
mL の 0.4 M マニトールを含む MS 培地 に懸濁して１
０分間室温で放置3,000 rpm で１分間遠心して細胞を回
収する。この細胞を 20 mL の１％セルラーゼ（オノヅ
カRS, ）と 0.1％ペクトリアーゼ Y-23（セイシン社
製）を含む MS 培地に細胞を再懸濁して、26℃で 90 分
間暗所で 60 rpm で回転振とうしながら細胞壁を消化す
る。その後、1,000 rpm で５分間遠心してプロトプラス
トを回収する。
【００１５】（エレクトロポレーションによる遺伝子導
入） 上記で得たプロトプラストを濃度が 2.5 X 10 ６ 細胞/
mL になるように エレクトロポレーション緩衝液 （5 m
M MES pH5.8, 70 mM KCl, 0.3 M マニトール）に再懸濁
する。 エレクトロポレーション用キュベット（ジーン
パルサーキュベット 0.4 cm elecrode, バイオラッド社
製）に構築したpGAL4-LUCレポーター遺伝子とエフェク
タープラスミド としてpGALDB-osERF3あるいはそのデレ
ーションシリーズ（pGALDB-1/25osERF3~pGALDB-204-225
osERF3）のDNAを 各10ugと リファレンス遺伝子プラス
ミド1ugを 100 uL の 2X エレクトロポレーション緩衝
液（10 mM MES pH5.8, 140 mM KCl, 0.6 M マニトー
ル）を加えて、滅菌水で全量を 200 uL にする。 キュ
ベットに 600uL のプロトプラスト懸濁液を入れて、エ
レクトロポレーター（Genepulser II Electroporation
Systemバイオラッド社製）を用いて 600 V, 25 mF の条
件で DNA を導入する。導入後、キュベットからプロト
プラストを1,000 rpm で５分間遠心して回収し、 5 mL
の 0.4 M マニトールを含む MS 培地 にプロトプラスト
を再懸濁して、 26℃で６時間暗所で静置した後、レポ
ーター遺伝子の活性を測定した。
入） 上記で得たプロトプラストを濃度が 2.5 X 10 ６ 細胞/
mL になるように エレクトロポレーション緩衝液 （5 m
M MES pH5.8, 70 mM KCl, 0.3 M マニトール）に再懸濁
する。 エレクトロポレーション用キュベット（ジーン
パルサーキュベット 0.4 cm elecrode, バイオラッド社
製）に構築したpGAL4-LUCレポーター遺伝子とエフェク
タープラスミド としてpGALDB-osERF3あるいはそのデレ
ーションシリーズ（pGALDB-1/25osERF3~pGALDB-204-225
osERF3）のDNAを 各10ugと リファレンス遺伝子プラス
ミド1ugを 100 uL の 2X エレクトロポレーション緩衝
液（10 mM MES pH5.8, 140 mM KCl, 0.6 M マニトー
ル）を加えて、滅菌水で全量を 200 uL にする。 キュ
ベットに 600uL のプロトプラスト懸濁液を入れて、エ
レクトロポレーター（Genepulser II Electroporation
Systemバイオラッド社製）を用いて 600 V, 25 mF の条
件で DNA を導入する。導入後、キュベットからプロト
プラストを1,000 rpm で５分間遠心して回収し、 5 mL
の 0.4 M マニトールを含む MS 培地 にプロトプラスト
を再懸濁して、 26℃で６時間暗所で静置した後、レポ
ーター遺伝子の活性を測定した。
【００１６】（ルシフェラーゼ活性測定）６時間静置し
たプロトプラスト懸濁液を 1 mL 採取して、2,000 rpm
で3 分間遠心してプロトプラストを回収した後、 Dual-
LuciferaseTMReporter Assay System (Promega 社製)
に添付されている Passive Lysis Buffer 50 uL に懸
濁する。プロトプラストを破砕した後、遠心して上清を
回収する。この細胞抽出液を5 uL 用いて Dual-Lucifer
aseTMReporter Assay System (Promega 社製)とルミネ
ッセンスリーダー（BLR-201, アロカ社製）を用いてル
シフェラーゼ活性測定を行なった。ホタル・ルシフェラ
ーゼおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性の測定を
測定キットの説明書に従って 10 秒間の発光を積分モー
ドでカウントした。リファレンス遺伝子の活性値ををリ
ポーター遺伝子の活性値で割り、その相対値であるRela
tive luchifarase activityを測定値として求めた。エ
フェクターを入れない場合の相対値を100として、エフ
ェクタープラスミドを同時に細胞に導入したときにリポ
ーター遺伝子の活性値の変動によってエフェクターの効
果を調査した。すなわち、pGAL4-LUCレポーター遺伝子
とpGALDB-osERF3エフェクタープラスミドを導入したと
きのリポーターの活性値が減少することから、pGALDB-o
sERF3は、レポーター遺伝子の活性を抑制する効果（リ
プレッサー機能）があることを示している。以下、リポ
ーターの活性値を測定して、リポーターの相対活性値が
１００以下になる場合に、導入したエフェクターにはリ
プレッサー機能が存在するので、どのエフェクターがリ
プレッサーとして機能するのかをレポーターの活性を測
定することによって調べた。
たプロトプラスト懸濁液を 1 mL 採取して、2,000 rpm
で3 分間遠心してプロトプラストを回収した後、 Dual-
LuciferaseTMReporter Assay System (Promega 社製)
に添付されている Passive Lysis Buffer 50 uL に懸
濁する。プロトプラストを破砕した後、遠心して上清を
回収する。この細胞抽出液を5 uL 用いて Dual-Lucifer
aseTMReporter Assay System (Promega 社製)とルミネ
ッセンスリーダー（BLR-201, アロカ社製）を用いてル
シフェラーゼ活性測定を行なった。ホタル・ルシフェラ
ーゼおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性の測定を
測定キットの説明書に従って 10 秒間の発光を積分モー
ドでカウントした。リファレンス遺伝子の活性値ををリ
ポーター遺伝子の活性値で割り、その相対値であるRela
tive luchifarase activityを測定値として求めた。エ
フェクターを入れない場合の相対値を100として、エフ
ェクタープラスミドを同時に細胞に導入したときにリポ
ーター遺伝子の活性値の変動によってエフェクターの効
果を調査した。すなわち、pGAL4-LUCレポーター遺伝子
とpGALDB-osERF3エフェクタープラスミドを導入したと
きのリポーターの活性値が減少することから、pGALDB-o
sERF3は、レポーター遺伝子の活性を抑制する効果（リ
プレッサー機能）があることを示している。以下、リポ
ーターの活性値を測定して、リポーターの相対活性値が
１００以下になる場合に、導入したエフェクターにはリ
プレッサー機能が存在するので、どのエフェクターがリ
プレッサーとして機能するのかをレポーターの活性を測
定することによって調べた。
【００１７】（リプレッサードメインの同定）アラビド
プシスosERF3の遺伝子の転写制御に関わる機能を解析す
るため、リポーター遺伝子pGAL4-LUCとpGALDB-osERF3を
タバコ培養細胞より調整したプロトプラストにエレクト
ロポレーション法によって導入し、リポーター遺伝子の
活性を調べた。その結果、pGAL-osERF3エフェクター
は、リポーター遺伝子の活性をエフェクターを導入しな
いリポーター遺伝子のみの場合（コントロール）に比べ
５０％減少させた。対照実験としておこなったosERF3の
コード領域を含まないp35S-GALDBDは、リポーター遺伝
子の活性に影響を及ぼさなかった。このことは、osERF3
が転写を抑制するリプレッサーとして機能していること
を示している。
プシスosERF3の遺伝子の転写制御に関わる機能を解析す
るため、リポーター遺伝子pGAL4-LUCとpGALDB-osERF3を
タバコ培養細胞より調整したプロトプラストにエレクト
ロポレーション法によって導入し、リポーター遺伝子の
活性を調べた。その結果、pGAL-osERF3エフェクター
は、リポーター遺伝子の活性をエフェクターを導入しな
いリポーター遺伝子のみの場合（コントロール）に比べ
５０％減少させた。対照実験としておこなったosERF3の
コード領域を含まないp35S-GALDBDは、リポーター遺伝
子の活性に影響を及ぼさなかった。このことは、osERF3
が転写を抑制するリプレッサーとして機能していること
を示している。
【００１８】次に、osERF3遺伝子のタンパク質コード領
域をディリーションしたDAN断片もつエフェクタープラ
スミド、pGAL-193/235osERF3が、リポーター遺伝子の活
性を抑制する機能をもつかを調べた。pGAL-141/185osER
F3エフェクタープラスミドをリポーター遺伝子と共にタ
バコ培養細胞に導入し、リポーター遺伝子の活性を測定
した結果、pGAL-193/235osERF3エフェクターは、pGALDB
-osERF3を導入した場合と同様に、レポーター遺伝子の
活性をコントロールに比べ、約４０％に抑えるリプレッ
サー機能があることが示された。（図４B）。この結果
から、osERF3のリプレッサー機能を持つ領域（リプレッ
ションドメイン）は、osERF3のアミノ酸配列、141/185
に存在することを明らかにした（図４B）。このアミノ
酸配列を配列番号２に示した。
域をディリーションしたDAN断片もつエフェクタープラ
スミド、pGAL-193/235osERF3が、リポーター遺伝子の活
性を抑制する機能をもつかを調べた。pGAL-141/185osER
F3エフェクタープラスミドをリポーター遺伝子と共にタ
バコ培養細胞に導入し、リポーター遺伝子の活性を測定
した結果、pGAL-193/235osERF3エフェクターは、pGALDB
-osERF3を導入した場合と同様に、レポーター遺伝子の
活性をコントロールに比べ、約４０％に抑えるリプレッ
サー機能があることが示された。（図４B）。この結果
から、osERF3のリプレッサー機能を持つ領域（リプレッ
ションドメイン）は、osERF3のアミノ酸配列、141/185
に存在することを明らかにした（図４B）。このアミノ
酸配列を配列番号２に示した。
【００１９】本発明の遺伝子の転写を抑制する機能を有
するペプチドは、例えばガン遺伝子の転写調節領域に特
異的に結合するＤＮＡ結合タンパク質と融合させて、細
胞内で発現させることにより、ガン遺伝子の発現を効率
的に抑制することが可能となる。また、リプレッサー機
能は調べたところ遺伝子に非特異的であるが、ＤＮＡと
の結合が必要であることから、特定のＤＮＡに結合する
ＤＮＡ結合ドメインと融合することにより、遺伝子特異
的あるいは非特異的に転写を抑制することが可能とな
る。このことによって、例えば色素代謝系の酵素をコー
ドする遺伝子の発現を制御することが可能となり、これ
までには得られなかった色違いの花弁を有する花を創作
することができる。また、アレルゲンとなるタンパク質
の発現を抑制することによって、アレルゲンの少ない食
物の生産も可能となる。
するペプチドは、例えばガン遺伝子の転写調節領域に特
異的に結合するＤＮＡ結合タンパク質と融合させて、細
胞内で発現させることにより、ガン遺伝子の発現を効率
的に抑制することが可能となる。また、リプレッサー機
能は調べたところ遺伝子に非特異的であるが、ＤＮＡと
の結合が必要であることから、特定のＤＮＡに結合する
ＤＮＡ結合ドメインと融合することにより、遺伝子特異
的あるいは非特異的に転写を抑制することが可能とな
る。このことによって、例えば色素代謝系の酵素をコー
ドする遺伝子の発現を制御することが可能となり、これ
までには得られなかった色違いの花弁を有する花を創作
することができる。また、アレルゲンとなるタンパク質
の発現を抑制することによって、アレルゲンの少ない食
物の生産も可能となる。
【００２０】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>Secretary of Agency of Industrial Science and Technology
<120>Novel repression domain of plant specific transcription factor
<130>
<160> 7
<210> 1
<211> 741
<212> DNA
<213> oriza stativa
<400>1
atg gcg ccc aga gca gct acg gtg gag aag gtt gct gtg gcg cca ccc 48
Met Ala Pro Arg Ala Ala Thr Val Glu Lys Val Ala Val Ala Pro Pro
5 10 15
acc ggg ctt ggt ctt ggc gtc ggc gga ggt gtc gga gcc ggg ggt cct 96
Thr Gly Leu Gly Leu Gly Val Gly Gly Gly Val Gly Ala Gly Gly Pro
20 25 30
cac tac agg ggc gtc cgc aag cgc ccg tgg ggg cgt tac gca gcg gag 144
His Tyr Arg Gly Val Arg Lys Arg Pro Trp Gly Arg Tyr Ala Ala Glu
35 40 45
atc cgt gac cct gcc aag aag agc cgg gtg tgg ctc ggt acc tac gac 192
Ile Arg Asp Pro Ala Lys Lys Ser Arg Val Trp Leu Gly Thr Tyr Asp
50 55 60
acg gca gag gag gcc gcc cgc gcc tac gac gcc gcc gct cga gag ttc 240
Thr Ala Glu Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Ala Ala Ala Arg Glu Phe
65 70 75 80
cgg ggt gcc aag gca aaa aca aac ttt ccg ttt gca tca cag tcg atg 288
Arg Gly Ala Lys Ala Lys Thr Asn Phe Pro Phe Ala Ser Gln Ser Met
85 90 95
gtc ggc tgt ggc ggc agc ccc agc agc aat agc acg gta gac acc ggt 336
Val Gly Cys Gly Gly Ser Pro Ser Ser Asn Ser Thr Val Asp Thr Gly
100 105 110
ggc ggc ggg gtt cag acg cct atg cgg gcc atg cct ctg ccg ccg act 384
Gly Gly Gly Val Gln Thr Pro Met Arg Ala Met Pro Leu Pro Pro Thr
115 120 125
ctg gac ttg gat ttg ttc cac cgc gcg gct gct gtg act gca gtc gcc 432
Leu Asp Leu Asp Leu Phe His Arg Ala Ala Ala Val Thr Ala Val Ala
130 135 140
ggc acc ggc gtt cgc ttt cct ttc aga gga tat ccc gtt gca cgt cca 480
Gly Thr Gly Val Arg Phe Pro Phe Arg Gly Tyr Pro Val Ala Arg Pro
145 150 155 160
gca acg cat cct tac ttt ttc tat gag cag gct gca gcg gct gcc gca 528
Ala Thr His Pro Tyr Phe Phe Tyr Glu Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala
165 170 175
gct gag gct gga tac cgt atg atg aag ctt gca ccg ccg gtc acc gtg 576
Ala Glu Ala Gly Tyr Arg Met Met Lys Leu Ala Pro Pro Val Thr Val
180 185 190
gcg gcg gtt gca caa agt gac tcc gac tcc tcg tcg gtg gtt gat ctc 624
Ala Ala Val Ala Gln Ser Asp Ser Asp Ser Ser Ser Val Val Asp Leu
195 200 205
gcg ccg tca cct cca gcg gtt acg gcg aac aag gcg gca gct ttc gat 672
Ala Pro Ser Pro Pro Ala Val Thr Ala Asn Lys Ala Ala Ala Phe Asp
210 215 220
ctg gat ctg aac cgg ccg ccg ccg gta gag aac tag ctc agg atg ggt 720
Leu Asp Leu Asn Arg Pro Pro Pro Val Glu Asn *** Leu Arg Met Gly
225 230 235 240
tag ctg acg act ttg tag ttt 741
*** Leu Thr Thr Leu ***
245
<210> 2
<211> 43
<212> RPT
<213> oriza stativa
<400>2
Ala Ala Val Ala Gln Ser Asp Ser Asp Ser Ser Ser Val Val Asp Leu
5 10 15
Ala Pro Ser Pro Pro Ala Val Thr Ala Asn Lys Ala Ala Ala Phe Asp
20 25 30
Leu Asp Leu Asn Arg Pro Pro Pro Val Glu Asn
35 40
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 3
gatggcgccc agagcagcta c
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 4
gtcgacctag ttctctaccg gcggcggcc
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 5
gcggcggttg cacaagtgac tcc
<210> 6
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 6
agcttagatc tgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt ggagaggaca
10 20 30 40 50 60
cgctg
65
<210> 7
<211>
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer DNA
<400> 7
gatccagcgt gtcctctcca aatgaaatga acttccttat atagaggaag ggtcttgcag
10 20 30 40 50 60
atcta
65
【図１】プラスミドpBI221からpGALDB-osERF3を構築す
る手順を示す図である。
る手順を示す図である。
【図２】レポーター遺伝子GAL4-LUC を構築する手順の
前半部を示す図である。
前半部を示す図である。
【図３】図２に引き続きレポーター遺伝子GAL4-LUC を
構築する手順の後半部を示す図である。
構築する手順の後半部を示す図である。
【図４】Aはリポーター遺伝子とエフェクタープラスミ
ドを示す図である。図において、5XGAL4: GAL4転写因子
DNA結合配列、TATA: CaMV35SプロモーターTATAボックス
を含む領域、LUC: ルシフェラーゼ遺伝子、CaMV 35S:
カリフラワーモザイクウイルス35Sタンパク質遺伝子プ
ロモーター、GAL4 DB:酵母GAL4転写因子DAN結合ドメイ
ンコード領域、Nos:ノパリン合成酵素遺伝子転写終止領
域を表す。ＢはosERF3およびosERF3のディリーションが
リポーター遺伝子の活性(Relative Activity)に及ぼす
影響 を示す図である。図において、左の数字（193/23
5）は、osERF3のアミノ酸領域を示す。真ん中のボック
スは左の数字に該当するアミノ酸配列領域を示す。右の
グラフは、左の領域をもつエフェクタープラスミドを導
入したときのリポーター遺伝子の活性を示す。エフェク
ターを入れないときのリポーター遺伝子の活性を100と
した。osERF3およびosERF3ディリーションのエフェクタ
ーでアミノ酸配列193/235を持つエフェクターがリポー
ター遺伝子の活性を４０％に減少させ、転写を抑制する
効果を持つことが示されている。
ドを示す図である。図において、5XGAL4: GAL4転写因子
DNA結合配列、TATA: CaMV35SプロモーターTATAボックス
を含む領域、LUC: ルシフェラーゼ遺伝子、CaMV 35S:
カリフラワーモザイクウイルス35Sタンパク質遺伝子プ
ロモーター、GAL4 DB:酵母GAL4転写因子DAN結合ドメイ
ンコード領域、Nos:ノパリン合成酵素遺伝子転写終止領
域を表す。ＢはosERF3およびosERF3のディリーションが
リポーター遺伝子の活性(Relative Activity)に及ぼす
影響 を示す図である。図において、左の数字（193/23
5）は、osERF3のアミノ酸領域を示す。真ん中のボック
スは左の数字に該当するアミノ酸配列領域を示す。右の
グラフは、左の領域をもつエフェクタープラスミドを導
入したときのリポーター遺伝子の活性を示す。エフェク
ターを入れないときのリポーター遺伝子の活性を100と
した。osERF3およびosERF3ディリーションのエフェクタ
ーでアミノ酸配列193/235を持つエフェクターがリポー
ター遺伝子の活性を４０％に減少させ、転写を抑制する
効果を持つことが示されている。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ
(56)参考文献 Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ,
1995，Ｖｏｌ．７，ｐ．173−182
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，1999，Ｖｏ
ｌ．339，ｐ．111−117
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，1999，Ｖｏｌ．274，Ｎｏ．41，ｐ.
29500−29504
Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，1997,
Ｖｏｌ．253，Ｎｏ．５，ｐ．553−561
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/09
C12N 15/29
C07K 14/415
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (5)
- 【請求項１】 （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配
列からなるペプチド、又は（ｂ）アミノ酸配列（ａ）に
おいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは
付加されたアミノ酸配列からなる遺伝子の転写を抑制す
る機能を有するペプチド。 - 【請求項２】 （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配
列からなるペプチド、又は（ｂ）アミノ酸配列（ａ）に
おいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは
付加されたアミノ酸配列からなる遺伝子の転写を抑制す
る機能を有するペプチド。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載のペプチドをコー
ドする遺伝子。 - 【請求項４】 請求項３に記載の遺伝子を含有する組み
換えベクター。 - 【請求項５】 請求項４に記載の組み換えベクターを含
む形質転換体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000087560A JP3409079B2 (ja) | 2000-03-27 | 2000-03-27 | 遺伝子の転写を抑制する機能を有するペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000087560A JP3409079B2 (ja) | 2000-03-27 | 2000-03-27 | 遺伝子の転写を抑制する機能を有するペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001269179A JP2001269179A (ja) | 2001-10-02 |
| JP3409079B2 true JP3409079B2 (ja) | 2003-05-19 |
Family
ID=18603554
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000087560A Expired - Lifetime JP3409079B2 (ja) | 2000-03-27 | 2000-03-27 | 遺伝子の転写を抑制する機能を有するペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3409079B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8847012B2 (en) | 2007-12-05 | 2014-09-30 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Genes that increase plant oil and method for using the same |
| US8847011B2 (en) | 2007-12-05 | 2014-09-30 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Genes that increase plant oil and method for using the same |
| US9045786B2 (en) | 2008-03-04 | 2015-06-02 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Gene that increases production of plant fat-and-oil and method for using the same |
| US9169488B2 (en) | 2009-06-04 | 2015-10-27 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Gene capable of improving material productivity in seed and method for use thereof |
| US9303265B2 (en) | 2009-06-04 | 2016-04-05 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Gene for increasing plant weight and method for using the same |
| US9309531B2 (en) | 2009-06-04 | 2016-04-12 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Plant with reduced protein productivity in seeds, and method for producing same |
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|---|---|---|---|---|
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| WO2007102346A1 (ja) | 2006-02-28 | 2007-09-13 | Japan Science And Technology Agency | グルカン量を低減させることなくリグニン量およびセルロース量を低減させた植物体およびその生産方法、並びにこれらの利用 |
| EP2183963B1 (en) | 2007-08-06 | 2013-09-18 | University of Tsukuba | Method for producing plant with modified flower morphology |
| JP5207354B2 (ja) | 2008-03-12 | 2013-06-12 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 転写抑制ペプチド及びその遺伝子 |
| US20110209244A1 (en) | 2008-09-29 | 2011-08-25 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Method for production of plant imparted with stress tolerance and use thereof |
| WO2011074646A1 (ja) | 2009-12-17 | 2011-06-23 | 北興化学工業株式会社 | 多弁咲きシクラメンの生産方法 |
| CN114989275B (zh) * | 2021-02-03 | 2024-01-02 | 中国农业科学院生物技术研究所 | OsERF940蛋白在提高水稻稻瘟病抗性中的应用 |
-
2000
- 2000-03-27 JP JP2000087560A patent/JP3409079B2/ja not_active Expired - Lifetime
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|---|
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| Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．４１，ｐ．２９５００−２９５０４ |
| Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１９９５，Ｖｏｌ．７，ｐ．１７３−１８２ |
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