JP3364972B2

JP3364972B2 - 魚由来トランスグルタミナーゼ遺伝子

Info

Publication number: JP3364972B2
Application number: JP00523993A
Authority: JP
Inventors: 寿安枝; 一夫中西; 正雄本木; 和男長瀬; 裕松井
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1992-01-14
Filing date: 1993-01-14
Publication date: 2003-01-08
Anticipated expiration: 2018-01-08
Also published as: JPH06225775A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、魚由来のトランスグル
タミナーゼ活性を保持するポリペプチドをコードする遺
伝子を有するＤＮＡ断片、該ＤＮＡを組み込んだ組換え
プラスミド、該プラスミドが導入された形質転換体、及
び該形質転換体を培養することを特徴とする、魚由来の
トランスグルタミナーゼ活性を有するポリペプチドの製
造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】トランスグルタミナーゼは、ペプチド鎖
内にあるグルタミン残基のγ−カルボキシアミド基のア
シル転移反応を触媒する酵素である。このトランスグル
タミナーゼはアシル受容体としてタンパク質中リジン残
基のε−アミノ基が作用すると、分子内及び分子間にε
−（γ−Gln）−Lys架橋結合が形成され、また、アシル
受容体としてアミノ酸、アミノ酸誘導体などの一級アミ
ンが存在した時は、それがタンパク質に導入される。そ
して水がアシル受容体として機能するときは、グルタミ
ン残基が脱アミド化されグルタミン酸残基になる反応を
進行させる酵素である。

【０００３】トランスグルタミナーゼはゲル状食品、ゲ
ル状化粧料をはじめとしてヨーグルト、ゼリー及びチー
ズ等を製造する際に用いられている（特公平1ー5038
2）。更に、熱に安定なマイクロカプセルの素材、固定
化酵素等の担体等を製造する際にも利用されている。

【０００４】トランスグルタミナーゼは微生物由来のも
のとして、ストレプトベルチシリウム属の菌からカルシ
ウム（Ｃａ2+）非依存性のトランスグルタミナーゼが発
見されている。同属菌の具体例としては、ストレプトベ
ルチシリウム・グリセオカルネウム（Streptoverticill
ium griseocarneum）IFO 12776, ストレプトベルチシ
リウム・シナモネウム・サブ・エスピー・シナモネウ
ム（Streptoverticillium cinnamoneum sub sp. cinnam
oneum）IFO 12852, ストレプトベルチシリウム・モバ
ラエンス（Streptoverticillium mobaraense） IFO1381
9 等があげられる（特開昭64ー27471号参照）。

【０００５】更にトランスグルタミナーゼは、ほ乳類動
物由来のものも知られている。例えば、モルモットの肝
臓由来のもの［Connellan, et al., Journal of Biolog
icalChemistry 246巻４号, 1093〜1098頁(1971)］、ヒ
ト及び牛の血管内皮細胞由来のもの［Gentile, et al.,
Journal of Biological Chemistry 266巻、478〜483頁
(1991)、及び Nakanishi, et al., European Journal
of Biochemistry 202巻、15〜21頁(1991)］、ヒトの血液
凝固因子ＸＩＩＩ［Takahashi, et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 83巻、8019〜8023頁(1986)］等である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来のトランスグルタ
ミナーゼの工業的利用のための酵素供給源は、ほ乳類動
物や細菌類であった。しかしながら、日常、我々が馴れ
親しんでいるトランスグルタミナーゼの作用産物は、蒲
鉾を代表とする水産加工品であり［関ら、NipponSuisan
Gakkaishi 56巻、125〜132頁(1990)］、当然ながら、
そこに作用しているトランスグルタミナーゼは、魚由来
の酵素である。

【０００７】食品タンパク質の改質用の遺伝子組換え型
トランスグルタミナーゼとしてはモルモット由来のもの
があげられる。現在入手可能で比較検討できるものとし
て、これをとりあげ、魚由来のトランスグルタミナーゼ
がこれに対して、産業利用上優位である点として、以下
の項目が考えられる。

【０００８】Ａ）魚は、特に、生であっても人類が永年
食してきた生物であり、従って、本生物中に存在するト
ランスグルタミナーゼも永年食しているという事にな
り、他の生物起源のトランスグルタミナーゼに比べ、そ
の安全上の心配は、全くないといえよう。

【０００９】Ｂ）魚と、他のほ乳類由来のトランスグル
タミナーゼにおける酵素特性の違いとして、特に水産練
り製品への応用を考えた場合、まず、酵素の反応性のよ
さ、作用させる酵素の失活条件の違いによる生産コスト
（これについては、以下の実施例に記す）への影響や、
反応産物の自然な食感、歯ごたえ（弾力性発現）等の質
的効果の違いがあることが充分に考えられる。実際に、
魚トランスグルタミナーゼは、魚のアクトミオシンへの
反応性が高いことが判明した（実施例参照）。

【００１０】Ｃ）遺伝子組み換え型トランスグルタミナ
ーゼの微生物を用いた時の生産性の違いも、トランスグ
ルタミナーゼの実用化を考えた場合、重要な問題とな
る。モルモット由来トランスグルタミナーゼの大腸菌を
用いた生産について既にIkuraらは報告している（文
献、Eur. J. Biochem., vol.187, 705-711, 1990 ）
が、その生産量はきわめて低いものであり、つまりはト
ランスグルタミナーゼの生産菌の抽出液中のトランスグ
ルタミナーゼは、それに対する抗体を用いて、検出でき
る程度であった（培地１リットルあたり約２．６ｍｇ相
当のトランスグルタミナーゼ生産量）。これに対して、
本魚由来トランスグルタミナーゼは、例えば、大腸菌を
宿主として生産させた場合、本酵素は宿主大腸菌由来SD
S可溶性タンパク質の１０％〜１５％相当の生産性を示
し、モルモットトランスグルタミナーゼの約１００倍以
上の発現量を達成するに至り、本魚由来トランスグルタ
ミナーゼは遺伝子組換え型の生産に適した遺伝子構造を
有している可能性も高い。（以下の実施例にて説明）

【００１１】以上の魚由来トランスグルタミナーゼのも
つ諸特性は、トランスグルタミナーゼの産業への応用、
特に食品タンパク質の改質を考えた場合、大きなメリッ
トとなるであろう。また、近年の漁獲海域の２００海里
規制や総漁獲高制限による、水産資源の品不足は水産加
工製品の原材料コスト高となり大きな問題となっている
が、例えば、本酵素の使用により、他の食品タンパク質
との併用により加工品中のすり身原材料の濃度を低減さ
せる事、および低利用魚資源の有効利用を増大させる事
なども可能となる。

【００１２】一方、微生物由来のトランスグルタミナー
ゼ（以下、ＢＴＧと略す）との比較においては、全く構
造的にも、反応機構的にも魚由来トランスグルタミナー
ゼは異なったものである。例えば、その酵素機能発現に
対して、ＢＴＧがカルシウムイオンを必要としない事な
どは、本発明で得られた魚由来トランスグルタミナーゼ
とは、その利用したい目的タンパク質により、それらの
使い分けが必要となろう。

【００１３】ＢＴＧとの差別化では次の事が言えよう。
魚由来トランスグルタミナーゼは、例えば、酵素を基質
に反応させたい時、反応停止させたい時の切り替え時
に、このカルシウムイオン依存性を利用することで、反
応時間や反応性を制御できる可能性がある。また、ＢＴ
Ｇに比べ、魚由来トランスグルタミナーゼは熱安定性が
低いので、比較的低温で、加熱失活させることができ、
このことは高温加熱を好まない食品加工に有利であると
いえる。

【００１４】魚類のトランスグルタミナーゼ遺伝子に関
しては、従来、全く知られていない。また、魚トランス
グルタミナーゼを安価に製造することが可能となれば、
トランスグルタミナーゼの工業的利用範囲が増すばかり
ではなく、より天然に近い酵素利用水産加工製品の提供
が可能となり、また、それら商品の製造コストを、使用
原材料すり身濃度の低減化などにより下げることができ
る。この様に、魚類由来トランスグルタミナーゼの安価
な供給体制の確立のためには、魚トランスグルタミナー
ゼの遺伝子取得、解析、発現等の課題があった。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究した結果、魚類のトランスグルタ
ミナーゼをコードする遺伝子を有するＤＮＡ断片を取得
し、その塩基配列を決定することに成功した。この成果
に基づいて、遺伝子工学的手法により大腸菌、枯草菌、
酵母、カビ等の微生物を用いて該遺伝子を発現させるこ
とが可能となり、魚類由来トランスグルタミナーゼの効
率的大量生産への途を開くことができた。

【００１６】すなわち本願発明は魚類由来のトランスグ
ルタミナーゼ活性を保持するポリペプチドをコードする
ＤＮＡ断片、該ＤＮＡを組み込んだ組換えプラスミド、
該プラスミドが導入された形質転換体、該形質転換体を
培養することを特徴とする当該ポリペプチドの製造法、
及び該製造法により得られる当該ポリペプチドである。

【００１７】本願発明である魚由来のトランスグルタミ
ナーゼ活性を保持するポリペプチドをコードする遺伝子
を有するＤＮＡ断片の取得方法として、本願発明者らは
モルモットのトランスグルタミナーゼの活性中心付近の
合成ＤＮＡ断片（配列表配列番号１０）をプローブとし
てｃＤＮＡより目的ＤＮＡ断片をハイブリダイゼーショ
ンにより単離する方法を採用した。これまでモルモット
のトランスグルタミナーゼ自身あるいはその遺伝子と、
魚のトランスグルタミナーゼ自身あるいはその遺伝子と
が高い相同性を有するとの知見は全くなく、この手法に
より目的ＤＮＡ断片が取得できたことは意外である。

【００１８】上記の他に、本願発明である魚由来のトラ
ンスグルタミナーゼ活性を保持するポリペプチドをコー
ドする遺伝子を有するＤＮＡ断片の取得方法としては以
下のものが掲げられる。Ａ）魚由来のトランスグルタミ
ナーゼ活性を保持するポリペプチドを単離精製し決定さ
れるアミノ酸配列を基に全塩基配列を化学合成する。
Ｂ）決定されたアミノ酸配列を基に塩基配列の一部を合
成してこれをプローブにしてｃＤＮＡバンクあるいはゲ
ノミックバンクよりクローニングを行う。クローニング
方法は、ハイブリダイゼーション法でも良いが、ＰＣＲ
法を用いても良い。Ｃ）あるいはｍＲＮＡをホウィート
ジャームあるいはウサギ網状赤血球のイン・ビトロ翻訳
系に供し、トランスグルタミナーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードするｍＲＮＡが存在する画分を決定し、
そこより目的のｃＤＮＡ断片を作製、取得することもで
きる。

【００１９】本願発明である魚由来のトランスグルタミ
ナーゼ活性を保持するポリペプチドをコードする遺伝子
を有するＤＮＡ断片としては、配列表の配列番号２、
３、６、７、４３、４４記載のポリペプチドをコードす
るものがあげられる。

【００２０】かかるＤＮＡ断片は、遺伝子コドンの縮重
を考慮すると、種々の塩基配列を包含し得るものであ
る。これらの塩基配列は、遺伝子発現系の諸要素、例え
ば宿主細胞の種類等に応じた優先コドンの使用、転写さ
れたＲＮＡに形成される高次構造の回避等によって、当
業者が容易に選択し得るものである。具体例として、天
然塩基配列の一例を配列表中の配列番号４、８、４５に
示し、また、天然塩基配列の一部を人為的に変換した例
を配列表中の配列番号１２、１３、１４、１５、１６、
１７、１８、１９に示す。さらに、かかるＤＮＡ塩基配
列は自然界からクローニングしたものであっても、人為
的に化学合成したＤＮＡであってもよい。

【００２１】更に、かかるＤＮＡ断片は、魚の個体差や
遺伝子の多コピー化に基づく変異や各器官、組織の違い
に基づく塩基配列の置換、欠失、挿入等に由来する変異
を有するが、しかしながら、依然としてトランスグルタ
ミナーゼ活性を発現しうる、本質的に同等なＤＮＡ断片
を包含しえるものである。これらの存在は下記の実施例
中に記載した。

【００２２】本発明はまた、魚由来のトランスグルタミ
ナーゼを遺伝子組換え技術で改変した微生物により発現
させ、本酵素の供給を可能にする。この時に用いる組換
えプラスミドは、所望の発現系に応じた公知の発現ベク
ターに、魚由来のトランスグルタミナーゼをコードする
遺伝子を有するＤＮＡ断片を従来公知の方法によって、
挿入することにより調製することが可能である。大腸菌
用の発現ベクターとしては、T7gene10とリンカーペプチ
ドとの融合タンパク質を高発現する発現ベクタープラス
ミド（インビトロジェン社製：商品名Xpress SystemT
M）や、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融
合タンパク質を高発現する発現ベクタープラスミド（フ
ァルマシアＬＫＢ社製：商品名pGEK系プラスミド）など
がある。より好ましい発現ベクターはｐＢＳＦ２−ＳＤ
７、ｐＴ１３ｓＮｃｏである。一方、パン酵母での発現
ベクターとしては、ガラクトカイネースをコードする遺
伝子であるＧＡＬ１のプロモーターを外来遺伝子の発現
に利用できるｐＹＥＳ２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）な
どがある。

【００２３】また、本発明は、トランスグルタミナーゼ
遺伝子を搭載する発現ベクターを導入することにより得
られた形質転換された種々の形質転換体に関する。形質
転換体となりうる生物には、大腸菌、枯草菌等の原核細
胞並びに酵母、カビ等の真核細胞が考えられるが、より
好ましい生物は大腸菌および酵母であり、更に好ましく
はE.coliＨＢ１０１株およびSaccharomyces cerevisiae
ＩＮＶＳＣ２株である。これら形質転換体は、導入さ
れたトランスグルタミナーゼ遺伝子から該酵素を細胞内
または培地中へ産生、蓄積させることを可能にする。

【００２４】最後に、本発明は、上記の形質転換体を培
養することにより、トランスグルタミナーゼ活性を有す
るポリペプチドを製造する方法に関する。培養条件は、
形質転換体の種類に応じて当業者が適宜決定し得るもの
である。また、発現され細胞内に蓄積または培地中へ分
泌された該酵素は、従来公知の種々の方法で単離、精製
することが可能であるが、天然型の魚由来トランスグル
タミナーゼの精製方法と同様の手法により、遺伝子組換
え型トランスグルタミナーゼの精製もできる。また、天
然型の魚由来トランスグルタミナーゼには糖鎖が付加さ
れているという報告はないが、大腸菌を宿主として製造
した遺伝子組換え型トランスグルタミナーゼには糖鎖は
付加されず、一方、酵母を宿主とした場合には、酵母細
胞内のグリコシレーション機能に応じて、糖鎖の付与も
考えられる。

【００２５】以下、実施例を参照しつつ、本発明を更に
詳しく説明する。

【００２６】

【実施例】

〔１．マダイのトランスグルタミナーゼをコードする遺
伝子を有するＤＮＡ断片〕マダイの肝臓１．３ｇを４Ｍ
グアニジンチオシアネート、１％β−メルカプトエタノ
ールの溶液（２０ｍｌ）中で、ポリトロン、そしてテフ
ロンホモジナイザーを用いて破砕した。この細胞懸濁液
に０．５％ソディウムラウリルザルコシネートを加え溶
解させた後、この溶液を２３ゲージの注射針に１０回通
すことで、染色体ＤＮＡを細断化した。次に、この溶液
を４℃下、５０００ｒｐｍ、２０分間遠心処理し、上清
を採取した。更に常法に従い、上清よりＣｓＣｌの密度
勾配遠心操作を経て、全ＲＮＡを精製した（Sambrook e
t al., Molecular Cloning:a laboratory manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Pres
s (1989) 参照）。得られた全ＲＮＡ量は３．８ｍｇで
あった。この内の１．３ｍｇをオリゴ（ｄＴ）ーセルロ
ースカラムを用いたｍＲＮＡ精製キット（Clontech）に
かけ、ｍＲＮＡ分子を精製し、約２０μｇを得た。

【００２７】得られたｍＲＮＡの内、８μｇをｃＤＮＡ
作製のための鋳型として用いた。ｃＤＮＡ合成には、ラ
ンダムプライマーを用い、２本鎖ｃＤＮＡを合成するＹ
ｏｕ−ｐｒｉｍｅｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）を用いた。得られたｃＤＮＡはλファージベク
ターλＺａｐII（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の制限酵素切
断部位ＥｃｏＲＩに組み込んだ後、ＧＩＧＡＰＡＣＫII
ＧＯＬＤ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のパッケージングキ
ットを用いて、ファージタンパク質中に取り込まれた形
で、マダイのｃＤＮＡライブラリーとして作製し、取得
した。なお、本ライブラリーのタイターは１．２Ｘ１０
6ｐｆｕ／μｇベクターであった。

【００２８】上記のマダイｃＤＮＡライブラリーから
６．０Ｘ１０4ｐｆｕに相当するファージを宿主細胞Ｘ
Ｌ１-Ｂｌｕｅに感染させた後、直径１５０ｍｍの寒天
プレート４枚に、プレート当り１．５Ｘ１０4ｐｆｕと
なるようにまいた。これを３７℃で約９．５時間培養し
た後、プレート上に形成されたファージプラークをナイ
ロンメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ製Ｈｉｂｏｎｄ−
Ｎ）に転写した。次に、転写されたナイロンメンブラン
をアルカリで処理し、ＤＮＡを変性させ、中和、洗浄し
た。その後、メンブランを８０℃で３時間処理すること
でＤＮＡをメンブラン上に固定した。

【００２９】得られたナイロンメンブランに対して４２
℃で２時間、プレハイブリダイゼーションを行い、つい
で、４２℃で１６時間のハイブリダイゼーションを行っ
た。なお、プレハイブリダイゼーションの溶液の組成
は、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成は、0.15M NaCl, 0.
015M クエン酸ナトリウム，pH7.0）、５ＸDenhardt's溶液（１Ｘ
Denhardt's溶液の組成は、0.02％ BSA, 0.02％ Ficoll,
0.02％ポリビニルピロリドン）、２０％フォルムアミ
ド、１００μg/ｍｌのニシン精巣ＤＮＡ、０．１％ＳＤ
Ｓからなる。また、ハイブリダイゼーションの際、ＤＮ
Ａプローブとして、モルモットのトランスグルタミナー
ゼの活性中心付近の合成ＤＮＡ断片（５’ーＧＴＣＡＡ
ＧＴＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＣＧＣ−
３’；Ikura et al., Biochemistry 27, 2898-2905 (1
988)：配列番号１０）を［γ-32Ｐ］ＡＴＰで末端ラベ
ルしたものを用いた。このスクリーニングにより得られ
た陽性クローンの候補株に対して、更に二次、三次スク
リーニングを行うことにより、最終的に４個の陽性クロ
ーンを取得した。

【００３０】上記の４個の陽性クローンを保持する感染
細胞に、ヘルパーファージ（Ｒ４０８）を感染させるこ
とで、各陽性クローンに由来するｃＤＮＡをファージミ
ドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−に組み込まれ
た形態へと変換した。各４クローンの挿入ｃＤＮＡの
長さは、約０．５ｋｂｐ（キロ塩基対）、１．５ｋｂ
ｐ、２．５ｋｂｐ、１．０ｋｂｐであった。そして、そ
れぞれｐＳＬＴＧ２，ｐＳＬＴＧ４，ｐＳＬＴＧ５，及
びｐＳＬＴＧ６と命名した。

【００３１】次に、各ｃＤＮＡクローンの制限酵素地図
の作成及び、ｐＳＬＴＧ５の挿入ｃＤＮＡをプローブと
したサザンブロッティング解析を行った結果、ｐＳＬＴ
Ｇ５（挿入ｃＤＮＡ長２．５ｋｂｐのもの）が、他の３
個のｃＤＮＡクローンを含んでいることが明らかになっ
たので、ｐＳＬＴＧ５の挿入ｃＤＮＡについてそのＤＮ
Ａ塩基配列を決定した。塩基配列の解析には、シーケネ
ースバージョン２．０（Ｕ．Ｓ．Ｂ．社）キットを用い
る従来公知の方法で行った。

【００３２】その結果、配列表中の配列番号５に示す２
５２０塩基対の配列を含むＤＮＡ配列が明らかになっ
た。また、ｐＳＬＴＧ５の制限酵素地図は図１に示し
た。この配列中には、本発明者らが用いたＤＮＡプロー
ブと極めて高い相同性を示す部分が存在した。また、こ
の塩基配列から翻訳されるアミノ酸配列を配列表中の配
列番号２に示す。このアミノ酸配列中には、モルモット
肝臓由来のトランスグルタミナーゼやヒトの血液凝固因
子XIII中に共通して存在する８アミノ酸残基の活性中心
配列、Tyr-Gly-Gln-CysーTrp-Val-Phe-Ala（配列番号１
１）[ Nakanishi etal., Eur. J. Biochem. 202, 15-21
(1991)] が存在した。なお、以上の様にして取得した
マダイのトランスグルタミナーゼｃＤＮＡを含むＤＮＡ
プラスミドｐＳＬＴＧ５を保持する大腸菌株(AJ1267
3)、Escherichia coli XL1-Blue / pSLTG5 は微工研菌
寄第4114号(FERM BP-4114) として寄託されている。

【００３３】〔２．スケソウダラのトランスグルタミナ
ーゼをコードする遺伝子を有するＤＮＡ断片〕スケソウ
ダラの肝臓２．３ｇを４Ｍグアニジンチオシアネート、
１％β−メルカプトエタノールの溶液（２０ｍｌ）中
で、ポリトロン、そしてテフロンホモジナイザーを用い
て破砕した。この細胞懸濁液に０．５％ソディウムラウ
リルザルコシネートを加え溶解させた後、この溶液を２
３ゲージの注射針に１０回通すことで、染色体ＤＮＡを
細断化した。次に、この溶液を４℃下、１００００ｒｐ
ｍ、２０分間遠心処理し、上清を採取した。更に常法に
従い、上清よりＣｓＣｌの密度勾配遠心操作を経て、全
ＲＮＡを精製した（Sambrook et al., Molecular Cloni
ng: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Labora
tory, Cold SpringHarbor Press (1989) 参照）。得ら
れた全ＲＮＡ量は７．２ｍｇであった。この内の２．３
ｍｇをオリゴ（ｄＴ）ーセルロースカラムを用いたｍＲ
ＮＡ精製キット（Clontech）にかけ、ｍＲＮＡ分子を精
製し、約２３μｇを得た。

【００３４】得られたｍＲＮＡの内、４μｇをｃＤＮＡ
作製のための鋳型として用いた。ｃＤＮＡ合成には、ラ
ンダムプライマーを用い、２本鎖ｃＤＮＡを合成するＹ
ｏｕ−ｐｒｉｍｅｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）を用いた。得られたｃＤＮＡはλファージベク
ターλＺａｐII（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の制限酵素切
断部位ＥｃｏＲＩに組み込んだ後、ＧＩＧＡＰＡＣＫII
ＧＯＬＤ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のパッケージングキ
ットを用いて、ファージタンパク質中に取り込まれた形
で、スケソウダラのｃＤＮＡライブラリーとして作製
し、取得した。なお、本ライブラリーのタイターは４．
１Ｘ１０5ｐｆｕ／μｇベクターであった。

【００３５】上記のスケソウダラｃＤＮＡライブラリー
から５．８Ｘ１０4ｐｆｕに相当するファージを宿主細
胞ＸＬ１-Ｂｌｕｅに感染させた後、直径１５０ｍｍの
寒天プレート４枚に、プレート当り１．５Ｘ１０4ｐｆ
ｕとなるようにまいた。これを３７℃で約９．５時間培
養した後、プレート上に形成されたファージプラークを
ナイロンメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ製Ｈｉｂｏｎｄ
−Ｎ）に転写した。次に、転写されたナイロンメンブラ
ンをアルカリで処理し、ＤＮＡを変性させ、中和、洗浄
した。その後、メンブランを８０℃で３時間処理するこ
とでＤＮＡをメンブラン上に固定した。

【００３６】得られたナイロンメンブランに対して４２
℃で２時間、プレハイブリダイゼーションを行い、つい
で、４２℃で１６時間のハイブリダイゼーションを行っ
た。なお、プレハイブリダイゼーションの溶液の組成
は、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成は、0.15M NaCl, 0.
015M クエン酸ナトリウム，pH7.0）、５ＸDenhardt's溶液（１Ｘ
Denhardt's溶液の組成は、0.02％ BSA, 0.02％ Ficoll,
0.02％ポリビニルピロリドン）、２０％フォルムアミ
ド、１００μg/ｍｌのニシン精巣ＤＮＡ、０．１％ＳＤ
Ｓからなる。また、ハイブリダイゼーションの際、ＤＮ
Ａプローブとして、配列表配列番号４記載のマダイ肝臓
トランスグルタミナーゼのｃＤＮＡのうち、制限酵素Ｃ
ｌａＩとＢａｍＨＩとで切り出せる約３００塩基対のＤ
ＮＡ断片（活性中心付近のアミノ酸配列を含む領域をコ
ードしうるＤＮＡ）を［α-32Ｐ］ｄＣＴＰでランダム
ラベルしたものを用いた。このスクリーニングにより得
られた陽性クローンの候補株に対して、更に二次、三次
スクリーニングを行うことにより、最終的に８個の陽性
クローンを取得した。

【００３７】上記の８個の陽性クローンを保持する感染
細胞に、ヘルパーファージ（Ｒ４０８）を感染させるこ
とで、各陽性クローンに由来するｃＤＮＡをファージミ
ドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−に組み込まれ
た形態へと変換した。各８クローンの名称を、各々、ｐ
ＡＬＴＧ１，ｐＡＬＴＧ２、ｐＡＬＴＧ３，ｐＡＬＴＧ
６、ｐＡＬＴＧ７，ｐＡＬＴＧ８、ｐＡＬＴＧ９，ｐＡ
ＬＴＧ１０とした。このうち、ｐＡＬＴＧ１、３、６、
８、について、挿入ｃＤＮＡの長さを検定し、制限酵素
地図を作成、並びに５’端及び３’端のｃＤＮＡ塩基配
列の解析をすることにより、図２に示した各クローンの
相関を得た。この際、塩基配列の解析には、蛍光プライ
マー・サイクル・シーケンシング・キット（Ａ．Ｂ．Ｉ
社製）を用いた。

【００３８】次に得られたｃＤＮＡの一部塩基配列を基
に合成プライマー（２０塩基）を作製し、ｐＡＬＴＧ８
の挿入ｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。塩基配列の解
析には、シーケネースバージョン２．０（Ｕ．Ｓ．Ｂ．
社）キットを用いる従来公知の方法で行った。その結
果、配列表中の配列番号９に示す２９２１塩基対のＤＮ
Ａ配列が明らかになった。また、このｃＤＮＡ塩基配列
から翻訳されるアミノ酸配列を配列表中の配列番号６に
示す。このアミノ酸配列中にはモルモット肝臓由来のト
ランスグルタミナーゼやヒトの血液凝固第ＸＩＩＩ因子
に共通して存在する８アミノ酸残基の活性中心配列、Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｐｈ
ｅ−Ａｌａ（配列番号１１）が存在した。なお、以上の
ようにして取得したスケソウダラのトランスグルタミナ
ーゼｃＤＮＡを含むプラスミドｐＡＬＴＧ８を保持する
大腸菌株（AJ 12709）、Escherichia coli XLI-Blue/pA
LTG8は微工研菌寄第4115号（FERM BP-4115）として寄託
されている。

【００３９】一方、スケソウダラの肝臓以外の組織中で
発現しているトランスグルタミナーゼについても検討し
た。そこで、筋肉組織からのトランスグルタミナーゼｃ
ＤＮＡのクローニングを行うことを試みた。

【００４０】スケソウダラの筋肉１１．５ｇを４Ｍグア
ニジンチオシアネート、１％β−メルカプトエタノール
の溶液（８０ｍｌ）中で、ポリトロン、そしてテフロン
ホモジナイザーを用いて破砕した。この細胞懸濁液に
０．５％ソディウムラウリルザルコシネートを加え溶解
させた後、この溶液を２３ゲージの注射針に７回、続い
て２５ゲージの注射針に７回通すことで、染色体ＤＮＡ
を細断化した。次に、この溶液を４℃下、１００００ｒ
ｐｍ、２０分間遠心処理し、上清を採取した。更に常法
に従い、上清よりＣｓＣｌの密度勾配遠心操作を経て、
全ＲＮＡを精製した（Sambrook et al., Molecular Clo
ning: a laboratory manual, Cold SpringHarbor Labor
atory, Cold Spring Harbor Press (1989) 参照）。得
られた全ＲＮＡ量は２．１ｍｇであった。この内の１．
７ｍｇをオリゴ（ｄＴ）ーセルロースカラムを用いたｍ
ＲＮＡ精製キット（Clontech）にかけ、ｍＲＮＡ分子を
精製し、約２１μｇを得た。

【００４１】得られたｍＲＮＡの内、３．２μｇをｃＤ
ＮＡ作製のための鋳型として用いた。ｃＤＮＡ合成に
は、ランダムプライマーを用い、２本鎖ｃＤＮＡを合成
するＴｉｍｅＳａｖｅｒｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）を用いた。

【００４２】本ｃＤＮＡライブラリーを用いて、上記の
実施例の様な実験手法で、プラークハイブリダイゼーシ
ョンを行ったが、陽性ｃＤＮＡクローンを取得出来なか
った。そこで、以下に記述する手法により、ｃＤＮＡ断
片の取得を行った。

【００４３】作製したスケソウダラ筋肉ｃＤＮＡ群を鋳
型に、スケソウダラ肝臓由来トランスグルタミナーゼの
遺伝子塩基配列を基に合成したオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして、ＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡＰｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いたＰＣＲ法（ポリメラー
ゼチェインリアクション法）にて、スケソウダラ筋肉ト
ランスグルタミナーゼのｃＤＮＡ断片を特異的に遺伝子
増幅させた。

【００４４】図１０に示したが、予想されるスケソウダ
ラの筋肉由来トランスグルタミナーゼｃＤＮＡ構造の
内、５’端領域（Ｎ末側コード領域）は、ｃＤＮＡ断片
の合成用プライマーとして、Pr.10 （配列番号65 5'-TT
GGAAGCTTGTAAGAGCAACTCTTGGAAA-3'）及び Pr.970 （配
列番号66 5'-TTGTACACTCGATCGATGGAGAGGT-3'）を使用し
た。ＰＣＲの後、約980bpのＤＮＡ断片が増幅できた。
次に、この断片の末端をＤＮＡＢｌｕｎｔｉｎｇＫ
ｉｔ（宝酒造）にて平滑化した後、ｐＵＣ１８ベクター
の制限酵素ＨｉｎｃＩＩ切断部位に組み込んだ。

【００４５】中央領域の遺伝子増幅には、合成オリゴヌ
クレオチドプライマーとして、Pr.620 （配列番号67 5'
-TCTGCTTTGGGATCCTTGACCGCT-3'）及び Pr.2000 （配列
番号68 5'-TGAAGGAGAGCTCCACAGACACA-3'）を用いた。こ
れらのプライマー中には制限酵素ＢａｍＨＩ、そしてＳ
ａｃＩの切断認識部位を人為的に組み入れた。そこで、
ＰＣＲの後、増幅された約1.4KbpのＤＮＡ断片を調製
し、これを上記制限酵素にて切断したＤＮＡ断片をｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ−の同制限酵素部位へ組み
込み、ｃＤＮＡクローンを得た。

【００４６】更に、３’端領域（Ｃ末側コード領域）の
ｃＤＮＡ断片増幅には、まずＰＣＲ用プライマー Pr.10
-1F （配列番号69 5'-ATGATGTCAAAGGCTGTCAC-3'）並び
に Pr.8-1R （配列番号70 5'-TCTTACCATATAAGTTGTAA-
3'）で目的領域を増幅させた。しかし、これらのプライ
マーでは、目的ＤＮＡ断片以外の小断片の増幅もみられ
たため、この増幅したＤＮＡ群を鋳型として同プライマ
ー Pr.10-1F と新たなプライマーである Pr.3-2F2R
（配列番号71 5'-ATTGATTAACAACAAAATGG-3'）を用いて
再度遺伝子増幅を行った。その結果、約800bpのＤＮＡ
断片が増幅できた。本ｃＤＮＡ断片も上記のごとく両末
端を平滑化した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ−
の制限酵素ＥｃｏＲＶ部位に組み込んだ。

【００４７】上記の３種類の領域を有するｃＤＮＡ断片
を保持するプラスミドを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅにそれ
ぞれ形質転換することにより、Ｎ末端側クローンとし
て、Ｎｏ．Ｎ−３、Ｎ−４、Ｎ−５を、中央領域を含む
ものとして、クローンＮｏ．ＳＢ−４、ＳＢ−５、ＳＢ
−２１、ＳＢ−２２、ＳＢ−３０を、また、Ｃ末端側を
もつクローンとして、クローンＮｏ．Ｃ−６、Ｃ−９、
Ｃ−１３を得た。次に以上１１個のＤＮＡクローンの塩
基配列を、アプライドバイオシステムス社のＴａｑＤ
ｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ
ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔを用いた公知の方法にて
解析を行い、その結果、配列表中の配列番号５１に示す
ＤＮＡ配列と、配列番号８に示されているスケソウダラ
肝臓に由来するトランスグルタミナーゼｃＤＮＡと同一
の構造をもつＤＮＡ配列との２種類が明らかになった。

【００４８】以上のことから、配列番号６に示すトラン
スグルタミナーゼは、臓器の種類を越えて発現している
スケソウダラのトランスグルタミナーゼであり、また、
配列番号４９に示すトランスグルタミナーゼについて
は、完全長のｃＤＮＡということでは取得できなかった
が、肝臓由来トランスグルタミナーゼと比べて、その構
造遺伝子内にわずかな塩基置換と１２ｂｐの塩基欠失、
および３ｂｐの塩基挿入がみられるのみであり、両遺伝
子および両遺伝子産物は極めて相同性の高いものである
ことが判明した。

【００４９】なお、以上のようにして取得したスケソウ
ダラの筋肉由来トランスグルタミナーゼｃＤＮＡ断片
（配列番号５１）の一部を含むプラスミドN3 を保持す
る大腸菌株（ＡＪ１２７９０）、Escherichia coli XLI
-Blue/N3 は微工研菌寄第４１４７号（ＦＥＲＭＢＰ
−４１４７）、そしてプラスミドN5 を保持する大腸菌
株（ＡＪ１２７９１）、Escherichia coli XLI-Blue/N5
は微工研菌寄第４１４８号（ＦＥＲＭＢＰ−４１４
８）、プラスミドSB4 を保持する大腸菌株（ＡＪ１２７
９２）、Escherichia coli XLI-Blue/SB4 は微工研菌寄
第４１４９号（ＦＥＲＭＢＰ−４１４９）、プラスミ
ドSB5 を保持する大腸菌株（ＡＪ１２７９３）、Escher
ichia coli XLI-Blue/SB5 は微工研菌寄第４１５０号
（ＦＥＲＭＢＰ−４１５０）、プラスミドSB21 を保持
する大腸菌株（ＡＪ１２７９４）、Escherichia coli X
LI-Blue/SB21 は微工研菌寄第４１５１号（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４１５１）、プラスミドSB22 を保持する大腸菌
株（ＡＪ１２７９５）、Escherichia coli XLI-Blue/SB
22 は微工研菌寄第４１５２号（ＦＥＲＭＢＰ−４１
５２）として寄託されている。

【００５０】〔３．マダイのトランスグルタミナーゼ遺
伝子を発現するプラスミドｐＩＬ６ＴＧ１の構築、大腸
菌への導入と生理活性発現の検定〕上記の実施例により
作製したマダイトランスグルタミナーゼ遺伝子（ｃＤＮ
Ａ）を含むプラスミドｐＳＬＴＧ５を、図３に示すよう
に、制限酵素ＸｂａＩとＥｃｏＲＶで消化し、トランス
グルタミナーゼｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を得た。一
方、トリプトファンプロモーター及びｔｒｐＡターミネ
ーターを有する発現ベクターｐＢＳＦ２−ＳＤ７はＢａ
ｍＨＩで消化し、次にクレノウ酵素でＤＮＡ切断端を平
滑化した後に、ＸｂａＩで処理を行い、トリプトファン
プロモーターを有する大きいＤＮＡ断片を得た。なお、
発現プラスミドｐＢＳＦ２−ＳＤ７はBio/Technology 8
p1036-p1040 (1990) に記載のプラスミドである。

【００５１】上記のごとく処理し、得られた２つのＤＮ
Ａ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、マダイトラ
ンスグルタミナーゼｃＤＮＡ発現プラスミドｐＩＬ６Ｔ
Ｇ１を得た。本ｐＩＬ６ＴＧ１のＤＮＡ塩基配列を検定
したところ、ＢａｍＨＩ切断部位の一塩基Ｇが欠失して
おり、従って本プラスミド中のｔｒｐＡターミネーター
上流にはＥｃｏＲＩ部位が存在することがわかった。ｐ
ＩＬ６ＴＧ１は公知の方法により大腸菌ＨＢ１０１に導
入し、形質転換体、Escherichia coli HB101 /pIL6TG1,
(AJ12730) を作製した。なお、AJ12730は微工研菌寄第
4116号（FERMBP-4116）として寄託されている。

【００５２】取得した形質転換体のコロニーを、アンピ
シリン２００μg/ｍｌを含む寒天プレート上に塗布し、
３０℃で一晩培養した後、このプレート上の菌体約２ｃ
ｍ2をアンピシリン２００μg/ｍｌを含むＭ９カザミノ
酸培地（Na2HPO4・12H2O 6g/l,KH2PO4 3g/l, NaCl 0.5g
/l, NH4Cl 1g/l, カサ゛ミノ酸 2g/l, L-Leu 0.2g/l, L-Pro
0.2g/l, Thiamin・HCl 2mg/l, MgSO4・7H2O 0.5g/l, Ca
Cl2・2H2O 0.015g/l,Glucose 2g/l）１００ｍｌを含む
坂口フラスコへ接種した。これを、３０℃で約１６時間
培養、菌体を集菌した。

【００５３】集菌した菌体に、0.5M EDTA 溶液を0.3ｍ
ｌ、20mM Tris-HCl,30mM NaCl 混液を 30ｍｌ添加し、
懸濁した。さらに、4mg/ｍｌリゾチーム溶液を1ｍｌ添
加し、撹拌後、０℃にて１時間放置した。その後、菌体
懸濁液を超音波破砕し、これを遠心（8000rpmで10分
間）し、菌体破砕上清を調製した。また、同様に、トラ
ンスグルタミナーゼｃＤＮＡを有しないプラスミドを保
持する大腸菌(菌株名 E.coli HB101/pBSF2-SD7)から
も、菌体破砕物の遠心上清液を調製した。

【００５４】各々の上清液のトランスグルタミナーゼ活
性を、モノダンシルカダベリンのメチル化カゼインへの
結合による蛍光強度（３５０ｎｍの励起波長光による４
８０ｎｍの蛍光強度）の変化を指標とした活性検出法に
て検定した。本活性検出法はNippon Suisan Gakkaishi
(1991年)の第57巻、ページ1203から1210に記載されてい
る方法を基に、若干の修正を加えたものである。即ち、
メチル化カゼイン1mg/ｍｌ、モノダンシルカダベリン15
μM、CaCl2 5mM, Tris-HCl(pH7.5) 50mM, DTT 3mM の組
成よりなる溶液（サンプル添加後、2.5ｍｌになるよう
調製）に各検定サンプルを150μl添加し、撹拌後、３７
℃で３０分間保温した。反応後、EDTA溶液を終濃度10mM
となるように添加し、各反応溶液の蛍光強度を蛍光強度
計（島津ＲＦ−５２０）により測定した。

【００５５】

【表１】

【００５６】その結果、表１に見られるように上記実施
例で得られたトランスグルタミナーゼｃＤＮＡを含む発
現プラスミドを保持する大腸菌の菌体抽出液には、明ら
かにトランスグルタミナーゼ活性が存在することが判明
した。このことより、我々の取得したｃＤＮＡがトラン
スグルタミナーゼをコードしうるものであることが明ら
かになった。

【００５７】〔４．マダイのトランスグルタミナーゼ遺
伝子を発現するプラスミドｐＴＴＧ２−２２の構築、大
腸菌への導入と生理活性発現の検定〕次に、更に多くの
トランスグルタミナーゼを得るために、トランスグルタ
ミナーゼ発現プラスミドの改良を行うことにした。それ
について、以下説明する。

【００５８】実施例３で得られたトランスグルタミナー
ゼ発現プラスミドｐＩＬ６ＴＧ１によるトランスグルタ
ミナーゼの発現量は少なかったため、更にｐＩＬ６ＴＧ
１よりも多くのトランスグルタミナーゼを発現しうるプ
ラスミドを構築するために、鋭意研究を行い、本トラン
スグルタミナーゼ遺伝子の翻訳効率を上げるための工夫
を施すこととした。

【００５９】その工夫は、天然のトランスグルタミナー
ゼ遺伝子の一部のＤＮＡ塩基配列を化学合成ＤＮＡによ
り置換し、コードするアミノ酸配列は変えずに、塩基配
列を改変し、大腸菌で本トランスグルタミナーゼ遺伝子
が効率よく発現できるようデザインすることであった。
つまり、図４に示したように、本トランスグルタミナー
ゼのアミノ末端メチオニンから３２番目のロイシンまで
をコードする領域（大腸菌で好まれるコドン等を選択し
ている）およびその上流にコンセンサスＳＤ（シャイン
-ダルガルノ）配列（５’−ＴＡＡＧＧＡＧＧＴ−
３’）が存在するようにデザインした化学合成ＤＮＡ
断片を作製し（配列表配列番号１２〜１９）、これを、
天然のトランスグルタミナーゼ遺伝子へ組み込むことを
計画して、以下の手順でこれを行った。

【００６０】図４に示した化学合成ＤＮＡ−１を構成す
るＤＮＡオリゴマー８本（配列表配列番号１２〜１９）
を、合成ＤＮＡ装置（Ａ．Ｂ．Ｉ社製）で作製した。こ
れらのオリゴマーは通常の公知の方法、つまり、アニー
リング及びＴ４ＤＮＡリガーゼにより合体、連結し、化
学合成ＤＮＡ−１を作製した。次に、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１９へ、本ＤＮ
Ａ断片をクローニングし、ｐＦＴＧＮ６を構築した（図
５）。また、本プラスミドを用い、ＤＮＡ塩基配列検定
を行い、作製したＤＮＡが意図した配列であることを確
認した。

【００６１】プラスミドｐＦＴＧＮ６を制限酵素Ｃｌａ
Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、更に、これを制限酵素Ｈ
ａｅＩＩで処理し、ＣｌａＩ切断端とＨａｅＩＩ切断端
を有するＤＮＡ断片Ｃ（約１１０塩基対）を得た（図
６）。

【００６２】一方、マダイトランスグルタミナーゼをコ
ードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＳＬＴＧ５をＥｃ
ｏＲＩ、ＨａｅＩＩ及びＮｃｏＩで処理し、トランスグ
ルタミナーゼのｃＤＮＡの一部を有する約１．４４ｋｂ
ｐ（キロ塩基対）のＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ）を得た
（図６）。

【００６３】トリプトファンプロモーター及びｔｒｐＡ
ターミネーターを有する発現ベクターｐＴ１３ｓＮｃｏ
（本プラスミドは, J. Biochem. 104, 30-34 に記載さ
れている）を、ＮｃｏＩ、及びＢａｍＨＩで消化し、ク
レノウ酵素により各々の切断端を平滑化した後、大きい
ＤＮＡ断片取得した。これを更に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
により自己連結することによりｐＴＴＮｃｏを得た。次
に、本ｐＴＴＮｃｏをＣｌａＩ，ＮｃｏＩで消化後、切
断端をアルカリ性フォスファターゼにより脱燐酸化処理
し、トリプトファンプロモーター及びターミネーターを
有する大きいＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ａ）を調製した
（図６）。

【００６４】各々のＤＮＡ断片Ａ，Ｂ，ＣをＴ４ＤＮＡ
リガーゼにより連結することで、プラスミドｐＴＴＧ１
を構築した（図７）。図７、８では以降の理解を容易に
するため、図６で「白ぬきバー」で表示されていたＤＮ
Ａ断片Ｂを「黒ぬきバー」で表示している。

【００６５】次に、構築したプラスミドｐＴＴＧ１をＢ
ａｍＨＩで処理し、クレノウ酵素により切断端を平滑化
した後、ＳａｃＩで消化し、図８に示す大きいＤＮＡ断
片を得た。また、ｐＳＬＴＧ５を制限酵素ＳａｃＩ及び
ＥｃｏＲＶで処理し、小さいＤＮＡ断片を調製した。こ
れらのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結する
ことで、発現プラスミドｐＴＴＧ２−２２を構築した
（図８）。ｐＴＴＧ２−２２は公知の方法により大腸菌
ＨＢ１０１に導入し、形質転換体、Escherichiacoli HB
101 / pTTG2-22, (AJ12742) を作製した。なお、AJ1274
2は微工研菌寄第4117号（FERM BP-4117）として寄託さ
れている。

【００６６】取得した形質転換体のコロニーを、アンピ
シリン２００μg/ｍｌを含む寒天プレート上に塗布し、
３０℃で一晩培養した後、このプレート上の菌体約２cm
2を上記３のＭ９カザミノ酸培地（アンピシリン２００
μg/ｍｌを含む）１００ｍｌを含む坂口フラスコへ接種
した。これを、３０℃で約１６時間培養、菌体を集菌し
た。

【００６７】集菌した菌体から、上記３と同様にして菌
体破砕上清を調製した。また、同様に、トランスグルタ
ミナーゼｃＤＮＡを有しないプラスミドを保持する大腸
菌(E.coli HB101/pTTNco)からも、菌体破砕物の遠心上
清液を調製した。

【００６８】各々の上清液(50μl)のトランスグルタミ
ナーゼ活性を上記３と同様にして、モノダンシルカダベ
リンのメチル化カゼインへの結合による蛍光強度（３５
０ｎｍの励起波長光による４８０ｎｍの蛍光強度）の変
化を指標とした活性検出法にて検定した（表２）。その
結果、上記実施例で得られたトランスグルタミナーゼｃ
ＤＮＡを含む発現プラスミド(pTTG2-22)を保持する大腸
菌の菌体抽出液には、明らかにトランスグルタミナーゼ
活性が存在することが判明した。このことは、更に、我
々の取得したｃＤＮＡがトランスグルタミナーゼをコー
ドしうるものであることが明らかになった。

【００６９】

【表２】

【００７０】次に、上記菌体抽出液がスケソウダラ由来
ミオシンＢ溶液をゲル化しえるかどうかを検定した。基
質としてのスケソウダラ由来ミオシンＢ（約6mg/ｍｌ）
溶液1.0ｍｌに対して、50mM CaCl2 を471μl添加、ある
いは無添加条件で、上記のトランスグルタミナーゼ活性
を検出した大腸菌粗抽出液を100μl添加したもの、ある
いは無添加の標品を作製し、撹拌後、室温にて約１６時
間放置した。

【００７１】ミオシンＢのゲル化は、反応させた容器で
ある試験管を倒置し、反応内容物が落下するか、あるい
は、固まっているかで判定した。その結果、表３に示し
たように、塩化カルシウム存在下で、トランスグルタミ
ナーゼ活性を示した大腸菌抽出液を加えた標品のみゲル
化が認められ、本発明により取得したｃＤＮＡはまさ
に、トランスグルタミナーゼをコードする遺伝子である
ことが判明した。

【００７２】

【表３】

【００７３】〔５．マダイのトランスグルタミナーゼ遺
伝子を発現するプラスミドｐＹＳＴＧ１の構築、パン
酵母 Saccharomyces cerevisiae への導入と生理活性発
現の検定〕マダイトランスグルタミナーゼをコードする
ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＳＬＴＧ５を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ、ＸｂａＩで処理し、トランスグルタミナーゼの
ｃＤＮＡを有する約２．５ｋｂｐ（キロ塩基対）のＤＮ
Ａ断片を得た。

【００７４】一方、パン酵母での発現ベクターとして
は、ガラクトカイネースをコードする遺伝子であるＧＡ
Ｌ１のプロモーターを外来遺伝子の発現に利用できるｐ
ＹＥＳ２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）を用いた。これを
同制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩで処理し、約５．８ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。

【００７５】上記の２つのＤＮＡ断片を常法に従い、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼにて連結反応を行い、これを、大腸菌
ＨＢ１０１のコンピテントセル（宝酒造製）へ常法に従
い、形質転換した。形質転換体の選別には、抗生物質ア
ンピシリンを１００μg／ｍｌの濃度で含むＬ−寒天プ
レートを用いた。続いて、そこに生育してきた大腸菌の
コロニーの内から６株を滅菌したつまようじにて拾い、
アンピシリン１００μg／ｍｌを含む３ｍｌのＬ−培地
へそれぞれ植菌し、３０℃にて１６時間振盪培養した。

【００７６】各培養菌体２ｍｌから、アルカリＳＤＳ法
に従いプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素による切断
パターンをアガロースゲル電気泳動により解析したとこ
ろ、４株より得られたプラスミドが目的どおりのプラス
ミドであることが判明し、これをｐＹＳＴＧ１と名付け
た。さらに、本プラスミド構築の際の連結部分につい
て、ＤＮＡ塩基配列の解析を行い、それらの塩基配列が
正しいことを確認した。

【００７７】上記のごとく構築したｐＹＳＴＧ１を、ア
ルカリカチオン法（Bio101社製フナコシ(株)より購入）
による酵母形質転換方法に従って、酵母Saccharomyces
cerevisiae INVSC2 株（MATα, his3-Δ200, ura3-16
7）に導入した。なお、選択プレートにはヒスチジン20
mg/lを含むＹＮＢ培地（組成は 0.67％Yeast Nitrogen
Base w/o Amino acids (Difco製), 2％ク゛ルコース, 2％寒
天）を用いた。こうして形質転換体、Saccharomyces ce
revisiae INVSC2 / pYSTG1, (AJ14679) を取得した。な
お、AJ14679は微工研菌寄第 BP-4085 号（FERM BP-408
5）として寄託されている。

【００７８】上記のヒスチジン20mg/lを含むＹＮＢ培地
プレート上に生育させた形質転換体酵母をＹＰＤ培地
（組成は１％酵母エキス、２％バクトペプトン、２％グ
ルコース）１００ｍｌに接種し、３０℃にて一昼夜振盪
培養した。その後、これを遠心集菌し、菌体を１％酵母
エキスで洗浄した後、同溶液１０ｍｌに懸濁した。続い
て、本懸濁液の半分である５ｍｌを１％酵母エキス、２
％バクトペプトン、２％ガラクトースの組成からなる培
地９５ｍｌへ添加し、３０℃にて１８時間振盪培養し
た。ガラクトース含有培地で組換え体酵母を培養するこ
とで、ＧＡＬ１プロモーターからの転写を誘導した。そ
して、残りの懸濁液５ｍｌは、液体ＹＰＤ培地９５ｍｌ
へ同様に接種し、ＧＡＬ１プロモーターからの転写を誘
導しない条件にて培養した。

【００７９】一方、プラスミドを有しない宿主酵母INVS
C2株も、ＹＰＤ培地プレート上に生育させ、同様に液体
ＹＰＤ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にて培養した。
続いて上記のごとく操作し、得られた懸濁液５ｍｌ分を
液体ＹＰＤ培地９５ｍｌへ接種し、培養した。

【００８０】トランスグルタミナーゼ活性測定に供した
サンプル調製は次のように行った。培地１００ｍｌで培
養してきた酵母を遠心集菌した後、そこへ３０ｍＭ塩化
ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）を１５ｍｌ加え、菌体を懸濁した。ここに、０．５
ＭのＥＤＴＡを０．２５ｍｌ添加し撹拌後、本懸濁液に
ほぼ等容量のガラスビーズ（直径０．７５ｍｍ）を加
え、４分間強く撹拌処理をした。その後、６０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心し、不溶物を除去し、その上清をトラ
ンスグルタミナーゼ活性測定用サンプルとした。

【００８１】各々の菌体破砕の上清液（５０μlあるい
は１５０μl）のトランスグルタミナーゼ活性を上記実
施例３と同様にして、モノダンシルカダベリンのジメチ
ル化カゼインへの結合による蛍光強度（３５０ｎｍの励
起波長光による４８０ｎｍ波長光の蛍光強度）の変化を
指標とした活性検定法にて検定した（表４）。なお、プ
ラスミドを保持しない酵母INVSC2株の菌体破砕液を本活
性測定溶液に添加した時の蛍光強度値を０とした。その
結果、本発明により得られたトランスグルタミナーゼｃ
ＤＮＡを含む発現プラスミド（ｐＹＳＴＧ１）を保持
し、ＧＡＬ１プロモーターの転写誘導を行った酵母の菌
体破砕抽出液には、明らかにトランスグルタミナーゼ活
性が存在することが判明した。また、予め酵素反応液へ
ＥＤＴＡの添加を行い、カルシウムイオンを除去した場
合には、当然ながらトランスグルタミナーゼ活性を検出
しなかった。このことより、更に我々の取得したｃＤＮ
Ａがトランスグルタミナーゼをコードするものであるこ
とが明かとなった。

【００８２】

【表４】

【００８３】〔６．ヒラメのトランスグルタミナーゼを
コードする遺伝子を有するＤＮＡ断片〕ヒラメの肝臓
１．５ｇを４Ｍグアニジンチオシアネート、１％β−メ
ルカプトエタノールの溶液（２０ｍｌ）中で、ポリトロ
ン、そしてテフロンホモジナイザーを用いて破砕した。
この細胞懸濁液に０．５％ソディウムラウリルザルコシ
ネートを加え溶解させた後、この溶液を２５ゲージの注
射針に８回通すことで、染色体ＤＮＡを細断化した。次
に、この溶液を４℃下、１００００ｒｐｍ、２０分間遠
心処理し、上清を採取した。更に常法に従い、上清より
ＣｓＣｌの密度勾配遠心操作を経て、全ＲＮＡを精製し
た（Sambrook et al., Molecular Cloning:a laborator
y manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spri
ng Harbor Press (1989) 参照）。得られた全ＲＮＡ量
は４．７ｍｇであった。この内の１．６ｍｇをオリゴ
（ｄＴ）ーセルロースカラムを用いたｍＲＮＡ精製キッ
ト（Clontech）にかけ、ｍＲＮＡ分子を精製し、約２３
μｇを得た。

【００８４】得られたｍＲＮＡの内、４．４μｇをｃＤ
ＮＡ作製のための鋳型として用いた。ｃＤＮＡ合成に
は、ランダムプライマーを用い、２本鎖ｃＤＮＡを合成
するＴｉｍｅＳａｖｅｒｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）を用いた。得られたｃＤＮＡはλファー
ジベクターλＺａｐII（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の制限
酵素切断部位ＥｃｏＲＩに組み込んだ後、ＧＩＧＡＰＡ
ＣＫIIＧＯＬＤ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のパッケージ
ングキットを用いて、ファージタンパク質中に取り込ま
れた形で、ヒラメのｃＤＮＡライブラリーとして作製
し、取得した。なお、本ライブラリーのタイターは２．
０Ｘ１０5ｐｆｕ／μｇベクターであった。

【００８５】上記のヒラメｃＤＮＡライブラリーから
２．２Ｘ１０5ｐｆｕに相当するファージを宿主細胞Ｘ
Ｌ１-Ｂｌｕｅに感染させた後、直径１５０ｍｍの寒天
プレート１１枚に、プレート当り２Ｘ１０4ｐｆｕとな
るようにまいた。これを３７℃で約６時間培養した
後、プレート上に形成されたファージプラークをナイロ
ンメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ製Ｈｉｂｏｎｄ−Ｎ）
に転写した。次に、転写されたナイロンメンブランをア
ルカリで処理し、ＤＮＡを変性させ、中和、洗浄した。
その後、メンブランを８０℃で２．５時間処理すること
でＤＮＡをメンブラン上に固定した。

【００８６】得られたナイロンメンブランに対して４２
℃で２時間、プレハイブリダイゼーションを行い、つい
で、４２℃で１６時間のハイブリダイゼーションを行っ
た。なお、プレハイブリダイゼーションの溶液の組成
は、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成は、0.15M NaCl, 0.
015M クエン酸ナトリウム，pH7.0）、５ＸDenhardt's溶液（１Ｘ
Denhardt's溶液の組成は、0.02％ BSA, 0.02％ Ficoll,
0.02％ポリビニルピロリドン）、２０％フォルムアミ
ド、１００μg/ｍｌのニシン精巣ＤＮＡ、０．１％ＳＤ
Ｓからなる。また、ハイブリダイゼーションの際、ＤＮ
Ａプローブとして、配列表配列番号４記載のマダイ肝臓
トランスグルタミナーゼのｃＤＮＡのうち、制限酵素Ｃ
ｌａＩとＢａｍＨＩとで切り出せる約３００塩基対のＤ
ＮＡ断片（活性中心付近のアミノ酸配列を含む領域をコ
ードしうるＤＮＡ）を［α-32Ｐ］ｄＣＴＰでランダム
ラベルしたものを用いた。このスクリーニングにより得
られた陽性クローンの候補株に対して、更に二次、三次
スクリーニングを行うことにより、最終的に１０個の陽
性クローンを取得した。

【００８７】上記の１０個の陽性クローンを保持する感
染細胞に、ヘルパーファージ（Ｒ４０８）を感染させる
ことで、各陽性クローンに由来するｃＤＮＡをファージ
ミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−に組み込ま
れた形態へと変換した。次に、これらのクローンの内、
５クローン（ｐＦＬＴＧ１０、１２、１６、１７、２１
とそれぞれ命名）について、挿入ｃＤＮＡの長さを検定
し、制限酵素地図を作成、並びに５’端及び３’端のｃ
ＤＮＡ塩基配列の解析をした。この際、塩基配列の解析
には、蛍光プライマー・サイクル・シーケンシング・キ
ット（Ａ．Ｂ．Ｉ社製）を用いた。その結果、上記の各
クローンは、トランスグルタミナーゼ遺伝子の中央部を
コードしているｃＤＮＡ断片であることが判明した。

【００８８】そこで、上記５クローンによっては得られ
なかったトランスグルタミナーゼのＣ末端側をコードし
うるクローンを得るために、上記のヒラメｃＤＮＡライ
ブラリーをもう一度、下記の様にスクリーニングした。

【００８９】スクリーニングのＤＮＡプローブとして、
今回はクローンｐＦＬＴＧ２１より制限酵素ＥｃｏＲＩ
で切り出せる約３００塩基対のＤＮＡ断片、及びｐＦＬ
ＴＧ１７より制限酵素ＳａｌＩ、ＰｓｔＩで処理して切
り出せる約５００塩基対のＤＮＡ断片を［α-32Ｐ］ｄ
ＣＴＰでランダムラベルしたものを用いた。その他の条
件は上記に記載の方法で行った。その結果、本スクリー
ニングにより陽性クローンが得られ、最終的に、２次、
３次スクリーニングにより１０個の陽性クローンを得
た。

【００９０】上記の１０個の陽性クローンの内、４個の
ｃＤＮＡクローンについて、それらのベクターをｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−に変換し、挿入ｃＤＮＡの各相
関を解析した。なお、本４クローンは、ｐＦＬＴＧ４
４、５１、５５、６３とした。

【００９１】更に、トランスグルタミナーゼのＮ末端側
をコードしうるクローンを得るため、ｐＦＬＴＧ１２の
挿入ｃＤＮＡ５’端の塩基配列を基に作製した合成ＤＮ
Ａプライマー（１９塩基より構成され、配列は５’−Ａ
ＣＡＣＴＧＣＣＧＧＴＣＣＡＴＣＧＡＡ−３’）を用い
て、新たにヒラメのｃＤＮＡライブラリーを作製した。
ｃＤＮＡ合成の鋳型には上記記載のｍＲＮＡサンプルを
２μｇ使用した。なお、ここで得られたライブラリーの
タイターは１．５Ｘ１０4ｐｆｕ／μｇベクターであっ
た。

【００９２】次に、上記ｃＤＮＡライブラリーから６Ｘ
１０3ｐｆｕに相当するファージを宿主大腸菌ＸＬ１−
Ｂｌｕｅに感染させ、上記に記載した方法で、スクリー
ニングを行った。但し、ハイブリダイゼーションの際の
プローブとしては上記のクローンｐＦＬＴＧ２１より制
限酵素ＥｃｏＲＩで切り出せる約３００塩基対のＤＮＡ
断片、及びｐＦＬＴＧ１７より制限酵素ＳａｌＩ、Ｐｓ
ｔＩで処理して切り出せる約５００塩基対のＤＮＡ断片
を［α-32Ｐ］ｄＣＴＰでランダムラベルしたものを用
いた。このスクリーニングにより得られた陽性クローン
の候補株に対して、更に２次、３次スクリーニングを行
うことにより、最終的に１個の陽性ｃＤＮＡクローンを
得た。

【００９３】本クローンのベクターを上記の記載した方
法により、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−に変換し、本
クローンをｐＦＬＴＧ６０と命名した。次に、本クロー
ンの挿入ｃＤＮＡの長さを検定し、制限酵素地図を作
成、並びに５’端及び３’端のｃＤＮＡ塩基配列の解析
を行った。

【００９４】上記のごとく取得し、解析した１０個のｃ
ＤＮＡクローンの内、ｐＦＬＴＧ２１、５５、６０、６
３、及びｐＦＬＴＧ１７の挿入ｃＤＮＡの内、制限酵素
ＳａｌＩ切断部位から３’端までの塩基配列解析を行っ
た。その結果、配列表中の配列番号４５、および４７に
示したＤＮＡ配列が明らかになった。この両塩基配列の
違いは、１８５４番目の塩基の違いである。但し、この
変異により、コードされるアミノ酸の変化はない。これ
らの塩基配列から翻訳されるアミノ酸配列を配列表中の
配列番号４３、４４に示す。更にそれらの各クローン間
の相互関係は図１１に示した。

【００９５】なお、以上のようにして取得したヒラメ由
来トランスグルタミナーゼｃＤＮＡ断片（配列番号４
５）の一部を含むプラスミドpFLTG21 を保持する大腸菌
株（ＡＪ１２７９８）、Escherichia coli XLI-Blue/pF
LTG21 は微工研菌寄第４１５４号（ＦＥＲＭＢＰ−４
１５４）、そしてプラスミドpFLTG55 を保持する大腸菌
株（ＡＪ１２７９９）、Escherichia coli XLI-Blue/pF
LTG55 は微工研菌寄第４１５５号（ＦＥＲＭＢＰ−４
１５５）、プラスミドpFLTG60 を保持する大腸菌株（Ａ
Ｊ１２８００）、Escherichia coli XLI-Blue/pFLTG60
は微工研菌寄第４１５６号（ＦＥＲＭＢＰ−４１５
６）、プラスミドpFLTG63 を保持する大腸菌株（ＡＪ１
２８０１）、Escherichia coli XLI-Blue/pFLTG63 は微
工研菌寄第４１５７号（ＦＥＲＭＢＰ−４１５７）、
プラスミドpFLTG17 中ｃＤＮＡ断片の制限酵素SalIから
下流域のｃＤＮＡクローン断片を有するプラスミド pFL
TG17Sを保持する大腸菌株（ＡＪ１２７９７）、Escheri
chia coli XLI-Blue/pFLTG17SalI は微工研菌寄第４１
５３号（ＦＥＲＭＢＰ−４１５３）として寄託されて
いる。また、各ヒラメ由来トランスグルタミナーゼｃＤ
ＮＡ断片を有するプラスミドは図１２に示した。

【００９６】上記のごとく得られた各ｃＤＮＡ断片は、
公知の方法により容易に、トランスグルタミナーゼのコ
ード領域を完全に含む一つのＤＮＡ断片に変換できる。
それには、例えば、pFLTG17Sを制限酵素 PstI で切断
し、得られる大きいＤＮＡ断片と、pFLTG63を同様に Ps
tI にて消化し、得られるトランスグルタミナーゼのＣ
末端側をコードするＤＮＡ断片とを、T4DNAリガーゼに
て連結し、トランスグルタミナーゼのコード領域がつな
がったプラスミド（pFLTG1-Cと命名）を構築する。

【００９７】一方、pFLTG21を制限酵素 BglII、PstI に
て切断し、得られる大きいＤＮＡ断片と、pFLTG60 を同
様に制限酵素 BglII、PstI にて消化し、得られるトラ
ンスグルタミナーゼのＮ末端側をコードするＤＮＡ断片
とを、T4DNAリカ゛ーセ゛にて連結し、トランスグルタミナー
ゼのコード領域がつながったプラスミド（pFLTG1-Nと命
名）を構築する。次に、これをEcoRIにて消化後、ベク
ターＤＮＡ断片の両端を脱リン酸化酵素により脱リン酸
し、そこにもう一度、pFLTG1-Nのトランスグルタミナー
ゼｃＤＮＡ断片を加え、ライゲーションすることで、pF
LTG1-N上でのｃＤＮＡ断片の向きとは反対の向きにｃＤ
ＮＡ断片が挿入されたプラスミド pFLTG2-N を構築す
る。

【００９８】次に、プラスミドpFLTG2-N を制限酵素 Sa
lI で消化することで、トランスグルタミナーゼのＮ末
端側をコードするｃＤＮＡ断片を取得することができ
る。この断片を、制限酵素 SalI で処理した pFLTG1-C
へライゲーションすることで、トランスグルタミナーゼ
の全コード領域が連結したｃＤＮＡ断片が構築できる。

【００９９】また、一方、大腸菌株 recBC, sbcA に対
して、重複するｃＤＮＡ領域を有するふたつのｃＤＮＡ
断片（例えば、pFLTG60 とpFLTG21、pFLTG21 とpFLTG1
7、 pFLTG17 とpFLTG63の各プラスミド上のｃＤＮＡ断
片）を両端とする一本鎖化されたプラスミドＤＮＡを形
質転換することで、宿主大腸菌内の組み替え機構により
極めて容易に、それらｃＤＮＡ断片内の重複部位で組み
替えが起こり、順次連続したｃＤＮＡ断片が構築される
に至り、これを繰り返せば、目的の完全長ｃＤＮＡが得
られる。このような、組み替え機能を利用し、数々のキ
メラ遺伝子も構築されている(Ogawa ら、Journal of Mo
lecular Biology, Vol.226, 651-660, 1992)。

【０１００】また、本発明者らは上記のマダイ、スケソ
ウダラ、ヒラメに由来するトランスグルタミナーゼｃＤ
ＮＡを取得し、翻訳されるアミノ酸配列を解析したとこ
ろ、魚類のトランスグルタミナーゼを構成するアミノ酸
配列間に共通したアミノ酸配列の存在を見いだした。こ
れらを配列表中の配列番号５３、５４、５５、５６、５
７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４に示し
た。但し、特定なアミノ酸残基でないアミノ酸はXaaで
示した。

【０１０１】〔７．取得したマダイトランスグルタミナ
ーゼｃＤＮＡと相同な遺伝子が多くの他の魚種に存在し
ているかどうかの検討〕本発明者らが、上記の実施例の
如く取得したマダイに由来するトランスグルタミナーゼ
遺伝子と非常に相同性の高い遺伝子が、他の魚種にも存
在するのかどうかについて、検討した。

【０１０２】検討対象のサンプルには、アジ、ハマチ、
イワシ、カツオ、サンマ、サバ、サケの肝臓、フグの卵
巣を、また、対照サンプルとして、枯草菌の染色体を使
用した。各魚の組織約３ｇを細かく切断した後、氷冷し
たＴＮ緩衝液（組成は0.1M塩化ナトリウムを含む20mMト
リス塩酸緩衝液(pH7.5)）を30ｍｌ加え、テフロンホモ
ジナイザーにてすりつぶした。

【０１０３】懸濁した試料を遠心チューブにいれ、冷却
遠心機にて５℃、1500rpmで５分間遠心し、沈澱画分を
得た。ここに、氷冷ＴＮＥ緩衝液（組成は1mM EDTA を
含むＴＮ緩衝液）を5ｍｌ添加し、よく懸濁した後、更
に氷冷ＴＮＥ緩衝液を15ｍｌ加え、混和した。その後、
10％ SDS を1ｍｌ加え室温にて３０分間振とうし、次に
20mg/ｍｌのプロテアーゼＫ溶液を100μl添加し、５０
℃にて一晩反応させた。

【０１０４】反応後、各サンプルの水溶液に対して、フ
ェノール処理、フェノールクロロフォルム処理、そして
クロロフォルム処理を行い、除タンパク質操作をした。
その後、各サンプルにその1/50容量の5M塩化ナトリウム
と2.5倍容量のエタノールを加え、核酸を析出させ、回
収し、最終的に1ｍｌのＴＥ緩衝液（組成は１ｍＭＥ
ＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.6)）に溶
解させた。

【０１０５】次に、各サンプルのＤＮＡ約10μｇを200
ユニットの制限酵素HindIIIまたはHincII と EcoRIで消
化し、これを１％アガロースゲルを用いて、電気泳動し
た。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、各サンプル
の泳動ＤＮＡ量がほぼ一定であることを確認した後、ゲ
ルを、0.25Ｎ塩酸に浸し、続いて0.6M塩化ナトリウム
を含む0.4Ｎ水酸化ナトリウム溶液にて処理を行った。
その後、ゲルを1.5M 塩化ナトリウムを含む0.5Mトリス
塩酸緩衝液(pH7.5)にて中和し、１０ＸＳＳＣ（組成は
1.5M塩化ナトリウム、0.15M クエン酸三ナトリウム）
で、ゲル中の核酸をナイロンメンブラン(GeneScreen Pl
us) に写し取った。

【０１０６】核酸を吸着させたメンブランを、0.6M 塩
化ナトリウムを含む 0.4N 水酸化ナトリウム、続いて1.
5M 塩化ナトリウムを含む0.5M トリス塩酸緩衝液(pH7.
5)にて処理後、２ＸＳＳＣ溶液に浸した。その後、メン
ブランを室温にて３０分間放置後８０℃で２時間乾燥さ
せた。

【０１０７】得られたナイロンメンブランに対して６５
℃で３時間、プレハイブリダイゼーションを行い、つい
で、６０℃で１６時間のハイブリダイゼーションを行っ
た。なお、プレハイブリダイゼーションの溶液の組成
は、５ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成は、0.15M NaCl, 0.
015M クエン酸ナトリウム，pH7.0）、１ＸDenhardt's溶液（１Ｘ
Denhardt's溶液の組成は、0.02％ BSA, 0.02％ Ficoll,
0.02％ポリビニルピロリドン）、１％ＳＤＳからな
る。また、ハイブリダイゼーションの際の溶液組成は0.
75M塩化ナトリウム、20mMトリス塩酸(pH8.0)、0.25mM E
DTA、1％ SDS、１ＸDenhardt's溶液、50μg/ｍｌの大腸
菌ゲノム溶液であった。そして、下記の如く作製したＤ
ＮＡプローブを、２Ｘ１０5 cpm/ｍｌの濃度で用い
た。

【０１０８】ＤＮＡプローブとしては、モルモットのト
ランスグルタミナーゼｃＤＮＡ断片と、本発明者らが取
得したマダイのトランスグルタミナーゼｃＤＮＡ断片を
それぞれ鋳型にして、ランダムプライマーにて放射能標
識したＤＮＡ断片を用いた。なお、モルモットのトラン
スグルタミナーゼｃＤＮＡ断片は、それを有するプラス
ミドpKTG1（Ikuraら、Eur. J. Biochem、187巻、705-71
1、1990年に記載されている）を制限酵素StuIで処理し
て得られるトランスグルタミナーゼｃＤＮＡ断片であ
る。また、マダイの場合は、取得したｃＤＮＡクローン
pSLTG5を制限酵素ApaI, SacI で切断し、得られるトラ
ンスグルタミナーゼｃＤＮＡ断片を鋳型とした。

【０１０９】上記の如く、ハイブリダイゼージョンを行
ったメンブランを６０℃で、0.1XＳＳＣ、0.1％ SDS溶
液にて洗浄し、乾燥後、オートラジオグラフィーを取っ
た。その結果、本実験条件において、モルモット由来の
ＤＮＡプローブは、全ての実験サンプルの核酸とは対合
しなかったが、マダイに由来するＤＮＡプローブは、枯
草菌の染色体ＤＮＡとは全く対合しなかったが、アジ、
ハマチ、サバ、カツオ、フグ由来の核酸とは強く、そし
て、イワシ、サンマ、サケ由来の核酸とは弱くではある
が、対合することが判明した。

【０１１０】以上の事実により、本発明者らが取得した
トランスグルタミナーゼ遺伝子と相同性の高い遺伝子
が、他の魚種においても存在していることが示されたと
同時に、本取得トランスグルタミナーゼをＤＮＡプロー
ブとすることで、極めて容易に、マダイ、スケソウダ
ラ、ヒラメ以外の魚種においても、トランスグルタミナ
ーゼ遺伝子の取得ができることを初めて示すことができ
た。

【０１１１】〔８．スケソウダラ肝臓のトランスグルタ
ミナーゼの部分アミノ酸配列解析〕上記の如く取得でき
たスケソウダラ由来トランスグルタミナーゼ遺伝子が、
実際に発現しているトランスグルタミナーゼ酵素を発現
しうるものであることを示す為に、本酵素を精製、純化
し、その構造を明らかにすることを行った。なお、トラ
ンスグルタミナーゼ活性は、モノダンシルカダベリンの
ジメチル化カゼインへの結合による蛍光強度変化を指標
とした、上記に記載の活性検出法を基に検定した。

【０１１２】スケソウダラ肝臓15gに10mM NaCl, 5mM ED
TA, 2mM ジチオスレイトールを含む20mM トリス塩酸緩
衝液（pH8.3）30ｍｌを加え、ホモジナイザーにより破
砕した。この破砕液を4℃において3,000rpm、10分の遠
心分離（日立製 Himac CR 20B2、ローター RPR20-2）を行っ
た。次いで上清をさらに4℃において37,000rpm、1時間
遠心分離（日立製 70P-72、ローター RP-70T）を行い、上清
を0.45μmのフィルター（GL サイエンス製 GLクロマトテ゛ィスク）に
かけ粗抽出液24ｍｌを得た。

【０１１３】本溶液のタンパク質濃度を、BioRad社製の
プロテインアッセイキットにて測定したところ、約8.6m
g/ｍｌであった。また、本粗抽出液の5μlを用いてトラ
ンスグルタミナーゼ活性を調べたところ、全活性849ユ
ニットであり、従って、比活性は4.10ユニト/mgタンパ
ク質であった。

【０１１４】次に粗抽出液を同緩衝液で平衡化したQ-セ
ファロース充填カラム（ファルマシア製 φ1.6cm x 10c
m）に通液したところ、トランスグルタミナーゼは吸着
された。NaCl濃度勾配によりトランスグルタミナーゼの
溶出を試みたところ、NaCl濃度約100mMで溶出された。
得られたトランスグルタミナーゼ活性画分（10ｍｌ）を
同緩衝液に一晩透析し、再度Q-セファロース充填カラム
に通液し、同一条件で溶出させトランスグルタミナーゼ
活性画分（9.5ｍｌ）を得た。

【０１１５】本活性画分のタンパク質濃度は約0.73mg/
ｍｌであった。またトランスグルタミナーゼの全活性は
249ユニットであり、比活性は36.1ユニット/mgタンパク
質であった。

【０１１６】次に得られた活性画分を50mM NaCl, 2mM E
DTA, 0.5mM ジチオスレイトールを含む酢酸ナトリウム
（pH6.45）に一晩透析し、同緩衝液で平衡化したS-セフ
ァロース充填カラム（ファルマシア製 φ1.6cm x 10c
m）に通液したところ、トランスグルタミナーゼは吸着
された。NaCl濃度勾配によりトランスグルタミナーゼ
は、NaCl濃度約200mMで溶出（6.0ｍｌ）した。

【０１１７】本活性画分のタンパク質濃度は約56μg/ｍ
ｌであった。また、トランスグルタミナーゼ全活性は20
1ユニットであり、比活性は591.2ユニット/mgタンパク
質であった。

【０１１８】この画分中には、下に記したように電気泳
動上に分子量約77,000の単一バンドを示すタンパク質の
みが存在し、ここにスケソウダラ肝臓由来のトランスグ
ルタミナーゼを精製し、取得した。得られた精製溶液の
比活性は、粗抽出液の143倍であり、回収率は23.7％で
あった。

【０１１９】a）電気泳動分析精製トランスグルタミナーゼを30μlとり、同量の10％
メルカプトエタノール,4％SDS,20％グリセリン,0.002％
ブロムフェノールブルーを含む0.125Mトリス塩酸緩衝液
（pH6.8）を加え、沸騰浴中で1分加熱し、泳動試料とし
た。泳動試料40μlをアトー（株）製5-20％ポリアクリ
ルアミド既成ゲルに供し、0.1％SDSを含む0.025Mトリス
グリシン緩衝液で40mA、約2時間泳動を行った。泳動終
了後50％メタノール,7％酢酸を含む0.12％クマシーブリ
リアントブルー溶液で一晩染色し、50％メタノールを含
む7％酢酸溶液にて脱色を行った。その結果、分子量約7
7,000の位置に単一バンドを得た。

【０１２０】b）スケソウダラ肝臓由来トランスグルタ
ミナーゼの部分アミノ酸配列精製したトランスグルタミナーゼ約80μgを含むS-セフ
ァロース画分約4ｍｌを透析チューブに入れ、0.001mM E
DTAを含む5mM トリス塩酸緩衝液（pH8.3）に対して、6
時間透析をした後、再度同溶液に12時間透析し、トラン
スグルタミナーゼ酵素標品中のアルカリ金属イオンを除
去した。これを遠心濃縮により乾固させ、蒸留水0.8ｍ
ｌを加え、37℃、30分攪拌し、再溶解させた。これにト
リプシン（シグマ製 11,700ユニット/mg）を16μg添加
し、37℃で12時間反応させ、ペプチド断片へと分解し
た。反応はギ酸を1滴滴下し終了した。

【０１２１】次に、本反応液を逆相HPLC（Inertsil Pre
p-ODS φ6.0mm x 250mm GLサイエンス製）に供し、溶媒
は0.05％ TFA（トリフルオロ酢酸）として、アセトニト
リルの濃度勾配による溶出条件下にて、各ペプチド断片
を分離し、取得した。

【０１２２】取得したペプチド断片をプロテインシーク
エンサー（MilliGen Biosearch製 6400/6600）に供し、
それらのアミノ酸配列を分析したところ、次の6つの配
列が得られた。すなわち、Xaa-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-As
p（配列番号２０）、 Trp-Trp-Leu-His-Gln-Gln-Ser
（配列番号２１）、Met-Tyr-Leu-Leu-Phe-Asn-Pro（配
列番号２２）、Trp-Gln-Glu-Pro-Tyr-Thr-Gly-Gly（配
列番号２３）、 Phe-Asp-Val-Pro-Phe-Val-Phe-Ala-Glu
-Val-Asn-Ala-Asp（配列番号２４）、Ser-Xaa-Tyr-Ser-
Asn-Gluであった（配列番号２５）。但し、Xaaは未同定
アミノ酸残基を表す。

【０１２３】以上の６つのアミノ酸配列は、既に本発明
者らが取得したｃＤＮＡの塩基配列から予測されるアミ
ノ酸配列（配列番号６、７）の一部と完全に一致してお
り、このことは、取得したｃＤＮＡは、まさに実際にス
ケソウダラの生体内で発現し、活性の有しているトラン
スグルタミナーゼをコードしているものであることを示
した。

【０１２４】〔９．マダイ肝臓のトランスグルタミナー
ゼの部分アミノ酸配列解析〕一方、上記の如く取得でき
たマダイ由来トランスグルタミナーゼ遺伝子が、実際に
マダイ中で発現しているトランスグルタミナーゼ酵素を
発現しうるものであることを示す為に、本酵素を精製、
純化し、その構造を明らかにすることを行った。なお、
トランスグルタミナーゼ活性は、スケソウダラの場合と
同様に、モノダンシルカダベリンのジメチル化カゼイン
への結合による蛍光強度変化を指標とした、上記に記載
の活性検出法を基に検定した。

【０１２５】マダイ肝臓20g に 10mM NaCl, 5mM EDTA,
2mM ジチオスレイトールを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．３）４６ｍｌを加え、ホモジナイザー
により破砕した。この破砕液を遠心チューブに入れ、４
℃にて50,000rpm、４５分の遠心分離（日立製 70P-72
ローター RP-65T）を行い、この上清液部分を0.45μmの
フィルター（アドバンテック DISMIC-25 ディスポーザ
ブルシリンジフィルターユニット）に通し、不溶性高分
子を除去した。その結果、赤く着色した抽出液30ｍｌを
得た。次に、本抽出液に氷冷した5mMトリス塩酸緩衝液
(pH8.3)をほぼ等量(30ｍｌ)加え、溶液のイオン強度を
下げ、これをマダイ肝臓の粗抽出液（60ｍｌ）とした。

【０１２６】本溶液のタンパク質濃度を、BioRad社製の
プロテインアッセイキットにて測定したところ、約8.4m
g/ｍｌであった。また、本粗抽出液の5μlを用いてトラ
ンスグルタミナーゼ活性を調べたところ、総活性2088ユ
ニットであり、従って、比活性は4.14ユニット／mgタン
パク質であった。

【０１２７】続いて、本粗抽出液を 5mM NaCl, 2.5mM E
DTA 0.5mM ジチオスレイトールを含む10mMトリス塩酸緩
衝液(pH8.3)で平衡化したDEAE-セファセル充填カラム
(ファルマシア製 φ2.6cm X 11cm)に通液したところ、
トランスグルタミナーゼは本イオン交換体に吸着される
ことがわかった。そこで、NaClの塩濃度勾配による本カ
ラムからの溶出を試みたところ、NaCl濃度約100mMで、
トランスグルタミナーゼ活性を有する画分が溶出でき、
これをDEAE画分とした（約59ｍｌ）。

【０１２８】本活性画分のタンパク質濃度は約145μg/
ｍｌであった。またトランスグルタミナーゼの全活性は
1045ユニットであり、比活性は122ユニット／mgであっ
た。

【０１２９】DEAE-セファセル樹脂により分画されたト
ランスグルタミナーゼ活性画分を、次に透析チューブに
入れ、2mM EDTA, 0.5mM ジチオスレイトールを含む20mM
酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.25)に一晩透析した。その
後、本標品を、同緩衝液にて平衡化したCM-セファロー
ス充填カラム（ファルマシア製 φ1.6cm X 10cm）に通
液したところ、トランスグルタミナーゼは本カラムに吸
着した。そこで、NaClの塩濃度勾配により本カラムから
酵素の溶出を試みたところ、NaCl濃度約200mMで、トラ
ンスグルタミナーゼ活性画分が溶出され、それを取得し
（約35ｍｌ）、これをCM画分とした。

【０１３０】本活性画分のタンパク質濃度は約20μg/ｍ
ｌであった。また、トランスグルタミナーゼ全活性は約
530.6ユニットであり、比活性は758ユニット／mgタンパ
ク質であった。

【０１３１】CMーセファロース樹脂により分画されたト
ランスグルタミナーゼ活性画分を、再び、透析チューブ
に入れ、50mM NaCl, 2mM EDTA, 0.5mM ジチオスレイト
ールを含む20mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.45)に対し
て、一晩透析し、トランスグルタミナーゼ溶液の塩濃度
を下げた。これを同緩衝液にて平衡化したヘパリンーセ
ファロース充填カラム（ファルマシア製 Hi-Trapアフィ
ニティーカラム容量1ｍｌ）に通液したところ、トラン
スグルタミナーゼは同樹脂に吸着された。NaClの塩濃度
勾配をかけることにより、トランスグルタミナーゼはヘ
パリンカラムより、NaCl濃度約200mMで溶出し、これを
取得した（約12.5ｍｌ）。これをヘパリン画分とした。

【０１３２】本活性画分のタンパク質濃度は約32μg/ｍ
ｌであった。また、トランスグルタミナーゼ全活性は約
290.5ユニットであり、比活性は807ユニット／mgタンパ
ク質であった。

【０１３３】本ヘパリン画分を、SDS-ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけ、電気泳動後、ゲルをクマシーブ
リリアントブルーにて染色を行ったところ、分子量約7
7,000の位置にのみ染色される単一バンドを確認でき
た。ここに、マダイ肝臓由来のトランスグルタミナーゼ
を精製し、取得することができた。得られたマダイトラ
ンスグルタミナーゼの精製溶液の比活性は、粗抽出液の
約195倍であり、回収率は約14％であった。

【０１３４】そこで、マダイ肝臓由来トランスグルタミ
ナーゼの部分アミノ酸配列を解析した。精製したトラン
スグルタミナーゼ約100μgを含むヘパリン画分約4ｍｌ
を透析チューブに入れ、0.1mM EDTA, 0.01mM ジチオス
レイトールを含む20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.3)に対し
て、13時間透析をした後、続いて、0.001mM EDTA を含
む20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.3)に再度、透析し、トラ
ンスグルタミナーゼ酵素標品中のアルカリ金属イオンを
除去した。これに尿素480mgを添加し37℃で30分間処理
した後、リシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業）7.
5μg（0.02ユニット（アミダーゼ活性））を添加し、更
に37℃で12時間酵素処理を施して、トランスグルタミナ
ーゼをペプチド断片化した。処理後、反応溶液に10％濃
度のTFA（トリフルオロ酢酸）溶液を40μl添加し（終濃
度0.1％）、撹拌した。

【０１３５】次に、本反応液を、逆相HPLC（Vydac製C4
カラム、φ4.6mm X 250mm）に供し、溶媒は0.1％TFAと
して、アセトニトリルの濃度勾配による溶出条件下に
て、各ペプチド断片を分離し、取得した。

【０１３６】取得したペプチド断片を、プロテインシー
ケンサー（アプライドバイオシステムズ製 470A）に供
し、それらのアミノ酸配列をシークエンス分析機（アプ
ライドバイオシステム製 120A）にて分析したところ、
次の配列が得られた。即ち、His-His-Leu-Glu-Leu-Val-
Leu-Xaa-Leu-Gly（配列番号２６）、Xaa-Xaa-Phe-Asn-G
ln-Gln-Gly-Ala-Gln-Asp-Glu-Ile-Leu-Leu-Thr-Leu-His
（配列番号２７）、 Ile-Ser-Phe-His-Met-Leu-Phe-Asn
-Pro（配列番号２８）、Leu-Gln-Glu-Tyr-Val-Met-Asn-
Glu-Asp-Gly-Val-Ile-Tyr-Met-Gly-Thr（配列番号２
９）、 Asn-Ser-Glu-Met-Asp-Ile-Glu-His-Arg-Ser-As
p-Pro-Val-Tyr-Val-Gly-Arg-Thr（配列番号３０）、 Ty
r-Asp-Ala-Pro-Phe-Val-Phe-Ala-Glu-Val-Asn-Ala-Asp-
Thr-Ile-Tyr（配列番号３１）、Ser-Val-Tyr-Gly-Asn-H
is-Arg-Glu-Asp-Val-Thr-Leu-His-Tyr（配列番号３
２）、Ala-Gly-Arg-Arg-Val-Thr-Glu-Pro-Ser-Asn-Glu-
Ile-Ala-Glu-Gln-Gly-Arg-Leu（配列番号３３）、Xaa-A
la-Gln-Pro-Val-Phe-Gly-Thr-Asp-Phe-Asp-Val-Ile-Val
-Glu（配列番号３４）、 Asn-Glu-Gly-Gly-Arg-Asp-Al
a-His-Ala-Gln-Leu-Thr-Xaa-Leu-Ala-Xaa-Ala（配列番
号３５）、Thr-Ile-Ser-Val-Thr-Val-Pro-Ala-His（配
列番号３６）、 Ala-Val-Val-Xaa-Glu-Pro-Leu-Thr-Ala
（配列番号３７）、 Gly-Gly-Val-Phe-Thr-Leu-Glu-gly
-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Ala-Thr-Gln-Ile-His（配列番号
３８）、 Leu-Ser-Phe-Ser-Pro-Met-Arg-Thr-Gly-Val-
Arg（配列番号３９）、 Leu-Leu-Val-Asp-Phe-Asp-Ser
-Asp-Arg-Leu（配列番号４０）、Gly-Val-Thr-Thr-Val-
Val-Val-His（配列番号４１）、Tyr-Arg-Ser-Leu-Ile-T
hr-Gly-Leu-His-Thr-Asp （配列番号４２）であった。
但し、Xaaは未同定アミノ酸残基を表す。

【０１３７】これらのアミノ酸配列は、上記の実施例で
得たｃＤＮＡ配列から考えられるアミノ酸配列（配列番
号２、３）中に存在するものであり、このことはまさ
に、実際にマダイの生体中で機能しているトランスグル
タミナーゼの活性を示す酵素を、本取得ｃＤＮＡはコー
ドするものであることを示している。

【０１３８】〔１０．モルモット由来トランスグルタミ
ナーゼと魚由来トランスグルタミナーゼの酵素特性比
較〕魚由来トランスグルタミナーゼ（以後、ＦＴＧと略
す）の酵素的特性を、モルモット由来トランスグルタミ
ナーゼ（以後ＭＴＧと略す）との比較で、検定し、ＦＴ
Ｇの産業利用上での優位性について検討した。

【０１３９】a)比活性上記の実施例にて、精製、純化したスケソウダラのトラ
ンスグルタミナーゼと市販されているＭＴＧの、蛍光法
を用いた時の酵素比活性について比較検討した。ＭＴＧ
は、宝酒造（株）製のものと、シグマ社製のものを使用
した。なお、宝酒造製のＭＴＧは純度９５％であり、ま
た、シグマ社製ＭＴＧも同等な純度であった。

【０１４０】上記３つのトランスグルタミナーゼ標品を
同等の酵素濃度（BioRad社製プロテインアッセイキット
でのタンパク質濃度測定による）となるように調製し、
それぞれに至適pH近傍のpH8.5にて、トランスグルタミ
ナーゼ活性を測定したところ、ＦＴＧはＭＴＧ（宝酒造
製）の１０倍、シグマ社製ＭＴＧの２０倍の比活性を示
す事が判明した。

【０１４１】また、上記３つの濃度調製したトランスグ
ルタミナーゼ標品を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開し、ク
マシーブリリアントブルー染色し、デンシトメーター
（ＬＫＢ社製、ＵｌｔｒｏｓｃａｎＸＬＬａｓｅ
ｒＤｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）にて、各トランスグル
タミナーゼ量を検定したところ、ＦＴＧは、ＭＴＧの約
４倍の濃度あることが示された。この事実を考慮して
も、ＦＴＧの蛍光法によるトランスグルタミナーゼ比活
性はＭＴＧの2.5〜5倍であることが判明した。

【０１４２】上記の如く、ＭＴＧの比活性に比べて、Ｆ
ＴＧの高比活性特性は、その産業への利用において、同
一効果の発現量に対する使用トランスグルタミナーゼ量
の低減化となるため、製品製造のコストダウンに、より
寄与できると思われる。

【０１４３】b)熱安定性次に、熱失活のしやすさをＦＴＧとＭＴＧとで比較検討
した。使用酵素量は、共に、同程度の活性を示しうる量
を用いた。各トランスグルタミナーゼ標品を、まず、ト
リス塩酸緩衝液（pH8.5）（組成は、0.5Mトリス塩酸緩
衝液(pH8.5)250μl、100mM DTT 80μl、1mM モノダンシ
ルカダベリン 37μl、水 1300からなる溶液）中に入
れ、０℃、または２０℃、２５℃、３０℃、３７℃、４
０℃、４２℃、５０℃、６０℃で１０分間処理し、その
後、３分間氷冷し、各温度処理を停止した。次に、そこ
へ10mg/ｍｌのジメチル化カゼイン溶液250μl、および5
0mMの塩化カルシウム溶液500μl を添加し、３７℃にて
６０分間反応させた。その後、各反応液に0.5M EDTA を
100μl添加し、酵素反応を停止させた。

【０１４４】上記の如く、調製した反応液の蛍光強度測
定をし、各酵素の熱安定性について調べた。その結果、
図１３に示したように、残存活性５０％を与える処理温
度は、ＦＴＧのほうがＭＴＧよりも、約９℃低いことが
明らかになった。このことはＦＴＧはＭＴＧよりも、失
活させ易いことを示しており、上記a)の結果と合わせる
と、ＦＴＧは酵素反応しやすく、また、反応産物へのわ
ずかな加熱処理によって失活させることができると言え
る。

【０１４５】c)アクトミオシンに対する反応性アクトミオシン（ＡＭ）の調製は、以下のように行っ
た。まず、スケソウダラの冷凍すり身（大洋漁業（株）
製ＳＡ級）約３０ｇに対して０．５Ｍ塩化ナトリウムを
含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を約６０
ｍｌ加え、エクセルオートホモジナイザー（日製産業
（株）製）にてホモジナイズした。これを次に１０００
０ｒｐｍで３０秒間、３回遠心し（日立製ＨｉｍａｃＣ
Ｒ２０Ｂ２型遠心機及びローターＲＰＲ２０−２を用い
て）、不溶物を除去した。上清溶液を透析チューブ（Ｓ
ｅａｍｌｅｓｓｃｅｌｌｕｌｏｓｅｔｕｂｉｎｇ、
輸入元は三光純薬（株））に入れ、これを０．５Ｍ塩化
ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）に対して、３時間、そして１６時間透析した。

【０１４６】その後、透析した溶液を１４０００ｒｐｍ
で６０分間遠心し、その上清を取得した後、ガーゼにて
濾過することで、アクトミオシン溶液（約２７ｍｌ）を
調製した。なお、本溶液のタンパク質濃度はBioRad製の
プロテインアッセイキットにて測定したところ、２６．
１ｍｇ／ｍｌであった。

【０１４７】上記のごとく調製したアクトミオシンを用
いて、ミオシンタンパク質の重合化に及ぼすＭＴＧとＦ
ＴＧの作用効果を比較した。なお、ミオシンの重合化、
多量化は蒲鉾の弾力性発揮機能など、水産練り製品の”
おいしさ”と密接な関連をもつ指標となっている（沼倉
ら、日本水産学会誌第51巻第9号、1559-1565、(198
5)、関ら、日本水産学会誌第56巻第1号、125-132、
(1990)）。

【０１４８】０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて、上記のごとく調製
したアクトミオシンを濃度１０ｍｇ／ｍｌになるよう調
整し、これを試験管（テルモ製、洗浄試験管ラルボ、１
５．５Ｘ１００ｍｍ）に１ｍｌづつ用意した。これに５
０ｍＭ塩化カルシウムを２００μｌ添加、撹拌した後、
別途調製したＦＴＧ、あるいはＭＴＧ（蛍光活性測定で
同活性分）を２００μｌづつ添加し、充分に撹拌した。
なお、ＭＴＧはシグマ社製のものを用いた。

【０１４９】各トランスグルタミナーゼを添加後、３７
℃にて１５分、３０分、４５分そして６０分反応させ
た。それぞれの反応後、反応液１００μｌを試験管から
抜取り、そこへ８Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、２％β−メルカ
プトエタノールを含む２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．
５）を１００μｌずつ添加し、反応を停止させた。次
に、４％ＳＤＳ、１０％β−メルカプトエタノール、２
０％グリセリン、０．００２％ブロモフェノールブルー
を含む１２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）を更
にそこへ３００μｌずつ添加した後、これらのサンプル
を１００℃にて１分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサ
ンプルとした。

【０１５０】以上の各サンプル５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅに供し、電気泳動後、クマシーブリリアントブルー染
色し、ミオシンＨ鎖の単量体量をデンシトメーター（Ｌ
ＫＢ社製、ＵｌｔｒｏｓｃａｎＸＬＬａｓｅｒ
Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）にて測定し、各トランスグ
ルタミナーゼのミオシンタンパク質の重合化、多量化に
及ぼす効果を解析した。その結果を図１４に示すがＦＴ
Ｇのほうが、ＭＴＧよりも速やかに、ミオシンタンパク
質を重合化することが判明した。このことは、更に、水
産練り製品へのトランスグルタミナーゼの応用におい
も、ＭＴＧよりもＦＴＧの方が、製造コストダウンに寄
与しやすいことを示唆するものである。

【０１５１】

【発明の効果】従来、使用できるトランスグルタミナー
ゼの供給由来源としては、放線菌やモルモットのもので
あったが、本発明により、伝統的に蒲鉾等の水産食品加
工時にテクスチャーの保持、補強などの機能を発現し、
天然物中での作用が知られている魚由来のトランスグル
タミナーゼの遺伝子を有するＤＮＡ断片の提供を可能に
した。本発明により得られた魚トランスグルタミナーゼ
の遺伝子に遺伝子組換え技術を応用することでトランス
グルタミナーゼの大量生産が可能であり、該産生酵素を
応用することで、食品タンパク質の物性改変や栄養価の
改善が可能となる。さらに、本酵素は食品以外にも、医
薬品や化成品への応用も期待できるものである。

【０１５２】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：25 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：真鯛肝臓配列 Val Lys Tyr Gly Gln Cys Trp Val Phe Ala Ala Val Ala Cys Thr 1 5 10 15 Val Leu Arg Cys Leu Gly Ile Pro Thr Arg 16 20 25 配列番号：2 配列の長さ：694 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：真鯛肝臓配列 Ala Ser Tyr Lys Gly Leu Ile Val Asp Val Asn Gly Arg Ser His 1 5 10 15 Glu Asn Asn Leu Ala His Arg Thr Arg Glu Ile Asp Arg Glu Arg 20 25 30 Leu Ile Val Arg Arg Gly Gln Pro Phe Ser Ile Thr Leu Gln Cys 35 40 45 Ser Asp Ser Leu Pro Pro Lys His His Leu Glu Leu Val Leu His 50 55 60 Leu Gly Lys Arg Asp Glu Val Val Ile Lys Val Gln Lys Glu His 65 70 75 Gly Ala Arg Asp Lys Trp Trp Phe Asn Gln Gln Gly Ala Gln Asp 80 85 90 Glu Ile Leu Leu Thr Leu His Ser Pro Ala Asn Ala Val Ile Gly 95 100 105 His Tyr Arg Leu Ala Val Leu Val Met Ser Pro Asp Gly His Ile 110 115 120 Val Glu Arg Ala Asp Lys Ile Ser Phe His Met Leu Phe Asn Pro 125 130 135 Trp Cys Arg Asp Asp Met Val Tyr Leu Pro Asp Glu Ser Lys Leu 140 145 150 Gln Glu Tyr Val Met Asn Glu Asp Gly Val Ile Tyr Met Gly Thr 155 160 165 Trp Asp Tyr Ile Arg Ser Ile Pro Trp Asn Tyr Gly Gln Phe Glu 170 175 180 Asp Tyr Val Met Asp Ile Cys Phe Glu Val Leu Asp Asn Ser Pro 185 190 195 Ala Ala Leu Lys Asn Ser Glu Met Asp Ile Glu His Arg Ser Asp 200 205 210 Pro Val Tyr Val Gly Arg Thr Ile Thr Ala Met Val Asn Ser Asn 215 220 225 Gly Asp Arg Gly Val Leu Thr Gly Arg Trp Glu Glu Pro Tyr Thr 230 235 240 Asp Gly Val Ala Pro Tyr Arg Trp Thr Gly Ser Val Pro Ile Leu 245 250 255 Gln Gln Trp Ser Lys Ala Gly Val Arg Pro Val Lys Tyr Gly Gln 260 265 270 Cys Trp Val Phe Ala Ala Val Ala Cys Thr Val Leu Arg Cys Leu 275 280 285 Gly Ile Pro Thr Arg Pro Ile Thr Asn Phe Ala Ser Ala His Asp 290 295 300 Val Asp Gly Asn Leu Ser Val Asp Phe Leu Leu Asn Glu Arg Leu 305 310 315 Glu Ser Leu Asp Ser Arg Gln Arg Ser Asp Ser Ser Trp Asn Phe 320 325 330 His Cys Trp Val Glu Ser Trp Met Ser Arg Glu Asp Leu Pro Glu 335 340 345 Gly Asn Asp Gly Trp Gln Val Leu Asp Pro Thr Pro Gln Glu Leu 350 355 360 Ser Asp Gly Glu Phe Cys Cys Gly Pro Cys Pro Val Ala Ala Ile 365 370 375 Lys Glu Gly Asn Leu Gly Val Lys Tyr Asp Ala Pro Phe Val Phe 380 385 390 Ala Glu Val Asn Ala Asp Thr Ile Tyr Trp Ile Val Gln Lys Asp 395 400 405 Gly Gln Arg Arg Lys Ile Thr Glu Asp His Ala Ser Val Gly Lys 410 415 420 Asn Ile Ser Thr Lys Ser Val Tyr Gly Asn His Arg Glu Asp Val 425 430 435 Thr Leu His Tyr Lys Tyr Pro Glu Gly Ser Gln Lys Glu Arg Glu 440 445 450 Val Tyr Lys Lys Ala Gly Arg Arg Val Thr Glu Pro Ser Asn Glu 455 460 465 Ile Ala Glu Gln Gly Arg Leu Gln Leu Ser Ile Lys His Ala Gln 470 475 480 Pro Val Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Ile Val Glu Val Lys Asn 485 490 495 Glu Gly Gly Arg Asp Ala His Ala Gln Leu Thr Met Leu Ala Met 500 505 510 Ala Val Thr Tyr Asn Ser Leu Arg Arg Gly Glu Cys Gln Arg Lys 515 520 525 Thr Ile Ser Val Thr Val Pro Ala His Lys Ala His Lys Glu Val 530 535 540 Met Arg Leu His Tyr Asp Asp Tyr Val Arg Cys Val Ser Glu His 545 550 555 His Leu Ile Arg Val Lys Ala Leu Leu Asp Ala Pro Gly Glu Asn 560 565 570 Gly Pro Ile Met Thr Val Ala Asn Ile Pro Leu Ser Thr Pro Glu 575 580 585 Leu Leu Val Gln Val Pro Gly Lys Ala Val Val Trp Glu Pro Leu 590 595 600 Thr Ala Tyr Val Ser Phe Thr Asn Pro Leu Pro Val Pro Leu Lys 605 610 615 Gly Gly Val Phe Thr Leu Glu Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ala Thr 620 625 630 Gln Ile His Val Asn Gly Ala Val Ala Pro Ser Gly Lys Val Ser 635 640 645 Val Lys Leu Ser Phe Ser Pro Met Arg Thr Gly Val Arg Lys Leu 650 655 660 Leu Val Asp Phe Asp Ser Asp Arg Leu Lys Asp Val Lys Gly Val 665 670 675 Thr Thr Val Val Val His Lys Lys Tyr Arg Ser Leu Ile Thr Gly 680 685 690 Leu His Thr Asp 配列番号：3 配列の長さ：695 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：真鯛肝臓配列 Met Ala Ser Tyr Lys Gly Leu Ile Val Asp Val Asn Gly Arg Ser 1 5 10 15 His Glu Asn Asn Leu Ala His Arg Thr Arg Glu Ile Asp Arg Glu 20 25 30 Arg Leu Ile Val Arg Arg Gly Gln Pro Phe Ser Ile Thr Leu Gln 35 40 45 Cys Ser Asp Ser Leu Pro Pro Lys His His Leu Glu Leu Val Leu 50 55 60 His Leu Gly Lys Arg Asp Glu Val Val Ile Lys Val Gln Lys Glu 65 70 75 His Gly Ala Arg Asp Lys Trp Trp Phe Asn Gln Gln Gly Ala Gln 80 85 90 Asp Glu Ile Leu Leu Thr Leu His Ser Pro Ala Asn Ala Val Ile 95 100 105 Gly His Tyr Arg Leu Ala Val Leu Val Met Ser Pro Asp Gly His 110 115 120 Ile Val Glu Arg Ala Asp Lys Ile Ser Phe His Met Leu Phe Asn 125 130 135 Pro Trp Cys Arg Asp Asp Met Val Tyr Leu Pro Asp Glu Ser Lys 140 145 150 Leu Gln Glu Tyr Val Met Asn Glu Asp Gly Val Ile Tyr Met Gly 155 160 165 Thr Trp Asp Tyr Ile Arg Ser Ile Pro Trp Asn Tyr Gly Gln Phe 170 175 180 Glu Asp Tyr Val Met Asp Ile Cys Phe Glu Val Leu Asp Asn Ser 185 190 195 Pro Ala Ala Leu Lys Asn Ser Glu Met Asp Ile Glu His Arg Ser 200 205 210 Asp Pro Val Tyr Val Gly Arg Thr Ile Thr Ala Met Val Asn Ser 215 220 225 Asn Gly Asp Arg Gly Val Leu Thr Gly Arg Trp Glu Glu Pro Tyr 230 235 240 Thr Asp Gly Val Ala Pro Tyr Arg Trp Thr Gly Ser Val Pro Ile 245 250 255 Leu Gln Gln Trp Ser Lys Ala Gly Val Arg Pro Val Lys Tyr Gly 260 265 270 Gln Cys Trp Val Phe Ala Ala Val Ala Cys Thr Val Leu Arg Cys 275 280 285 Leu Gly Ile Pro Thr Arg Pro Ile Thr Asn Phe Ala Ser Ala His 290 295 300 Asp Val Asp Gly Asn Leu Ser Val Asp Phe Leu Leu Asn Glu Arg 305 310 315 Leu Glu Ser Leu Asp Ser Arg Gln Arg Ser Asp Ser Ser Trp Asn 320 325 330 Phe His Cys Trp Val Glu Ser Trp Met Ser Arg Glu Asp Leu Pro 335 340 345 Glu Gly Asn Asp Gly Trp Gln Val Leu Asp Pro Thr Pro Gln Glu 350 355 360 Leu Ser Asp Gly Glu Phe Cys Cys Gly Pro Cys Pro Val Ala Ala 365 370 375 Ile Lys Glu Gly Asn Leu Gly Val Lys Tyr Asp Ala Pro Phe Val 380 385 390 Phe Ala Glu Val Asn Ala Asp Thr Ile Tyr Trp Ile Val Gln Lys 395 400 405 Asp Gly Gln Arg Arg Lys Ile Thr Glu Asp His Ala Ser Val Gly 410 415 420 Lys Asn Ile Ser Thr Lys Ser Val Tyr Gly Asn His Arg Glu Asp 425 430 435 Val Thr Leu His Tyr Lys Tyr Pro Glu Gly Ser Gln Lys Glu Arg 440 445 450 Glu Val Tyr Lys Lys Ala Gly Arg Arg Val Thr Glu Pro Ser Asn 455 460 465 Glu Ile Ala Glu Gln Gly Arg Leu Gln Leu Ser Ile Lys His Ala 470 475 480 Gln Pro Val Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Ile Val Glu Val Lys 485 490 495 Asn Glu Gly Gly Arg Asp Ala His Ala Gln Leu Thr Met Leu Ala 500 505 510 Met Ala Val Thr Tyr Asn Ser Leu Arg Arg Gly Glu Cys Gln Arg 515 520 525 Lys Thr Ile Ser Val Thr Val Pro Ala His Lys Ala His Lys Glu 530 535 540 Val Met Arg Leu His Tyr Asp Asp Tyr Val Arg Cys Val Ser Glu 545 550 555 His His Leu Ile Arg Val Lys Ala Leu Leu Asp Ala Pro Gly Glu 560 565 570 Asn Gly Pro Ile Met Thr Val Ala Asn Ile Pro Leu Ser Thr Pro 575 580 585 Glu Leu Leu Val Gln Val Pro Gly Lys Ala Val Val Trp Glu Pro 590 595 600 Leu Thr Ala Tyr Val Ser Phe Thr Asn Pro Leu Pro Val Pro Leu 605 610 615 Lys Gly Gly Val Phe Thr Leu Glu Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ala 620 625 630 Thr Gln Ile His Val Asn Gly Ala Val Ala Pro Ser Gly Lys Val 635 640 645 Ser Val Lys Leu Ser Phe Ser Pro Met Arg Thr Gly Val Arg Lys 650 655 660 Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Asp Arg Leu Lys Asp Val Lys Gly 665 670 675 Val Thr Thr Val Val Val His Lys Lys Tyr Arg Ser Leu Ile Thr 680 685 690 Gly Leu His Thr Asp 695 配列番号：4 配列の長さ：2085 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 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Glu Leu Ser Phe Thr Pro Met Arg Ala Gly Val Arg 650 655 660 Glu Phe Leu Val Asp Phe Asp Ser Asp Arg Leu Gln Asp Val Lys 665 670 675 Gly Val Ala Thr Leu Val Val Arg Lys Thr Ser Pro Ser Tyr Phe 680 685 690 Pro Met Pro Tyr Thr Leu 695 配列番号：8 配列の長さ：2088 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：スケソウタラ肝臓配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：1..2088 特徴を決定した方法：Ｐ配列 GCCCACACAA ACCGTTTAAT TGCTGGTGTT GATCTGAGAA GCCAGGAAAA CAACCGGGAA 60 CACCGAACTG AGGAGATTGA TAGGAAGCGT TTGATTGTTC GGCGGGGACA AGCCTTCTCC 120 CTGACGGTGC ACCTCTCCGA CCCGCTGCAG TCCGGCCATG AGCTGGCCCT GGTCTTAAAG 180 CAGGATAAGA ACAACGATGA TATTGTGATC AGACAGCGAA CGGCTGGAGG GTCTGGTGAC 240 AAGTGGTGGT TACACCAGCA GAGCGCGAGG AACGAATTAC TGCTGACTGT GTACAGTCCT 300 GCCCGTGCTG CCGTTGGCGA GTACCGCTTG GCTGTTGAAC TGATGTCAGG GAATAAACTT 360 CTGGAGAGGA CGGACTTTAC CAAAATGTAC TTGCTGTTTA ATCCCTGGTG CAAAGATGAT 420 GCTGTGTACC TCCCTGATGA AAGTCTGCTC AAGGAATACA TTATGAACGA GAATGGTCGC 480 ATTTTCACTG GGAGTGCGGA TTGGATGAGT GGGTTGCCAT GGAATTTCGG ACAGTTTGAA 540 GACAATGTGA TGGACATCTG CTTTGAGATC CTTGACCGCT TTAAGCCAGC AAGGTCAGAC 600 CCCCCAAACG ACATGCGTCA GCGATGGGAC CCTGTCTACA TCAGCAGGGC AGTCGTTGCC 660 ATGGTGAATG CCAACGATGA CGGTGGAGTC TTGGTGGGGA AATGGCAGGA ACCTTACACA 720 GGTGGAGTAC AGCCAACCAA ATGGATGAGC AGTGTGCCCA TCCTGGAGAA GTGGAGCAAA 780 TCAAAGTCTG GAGTGAAGTA TGGCCAATGC TGGGTGTTTG CAGCCGTGGC CTGCACAGTG 840 CTGCGATGCC TGGGCATCCC CACACGCTGC ATCACCAACT TTGAGTCAGC CCATGACACA 900 GACGGAAACC TCTCCATCGA CCGAGTGTAC AACACACATA GGCAGAGTGT TAACCATGCT 960 GACAGCATCT GGAACTTTCA TTGTTGGATC GAGTCTTACA TGCAGAGAGA AGATCTACCT 1020 GAAGGATATG GTGGCTGGCA AGTCTTGGAC CCCACACCTC AGGAGAGGAG TAGTGGTATG 1080 TTTCGCTGTG GCCCATGTCC ATTGAAGGCC ATTAAAGAAG GGGACCTCAA TGTGAAGTTT 1140 GATGTTCCAT TTGTCTTTGC TGAGGTGAAT GCAGACATCA TCAATTGGGA AATCAGACCA 1200 GACGGTCAGC GAATGCGGCT TTCATCCAAC TCCGCAAAAG TGGGGAGGAA CATTAGCACC 1260 AAAAGTCCTT ACAGTAACGA GAGGGAAGAT ATAACCCTTC AGTACAAGTA CCAAGAAGGT 1320 TCAGCCAAGG AGCGGGAGGT GTACAACAAG GCAGGGCGGC GCATCTCCGG GCCGGATAGA 1380 GAAGAGGAAT CAAAACCAGC CAATGAACCA GGAAACGTGC AGCTGGAGAT CAGATACGCC 1440 AAGCCTGTGT TCGGGACCGA CTTTGACGTC ATCTTTGAGT TGGAGAACAT GGGAGACGAA 1500 GAAGTCAGCT GCAAATTGAA CATGATGTCA AAGGCTGTCA CGTATAACTC GGTCCACCTG 1560 GGAGAGTGCC AGAATAGCAC AGTCAATGTT GTCATTCCTG CTCACAAAGT CCACAGGGAG 1620 ACGGTGCGTC TACTCTACAC TAAGTATGCA TCGTGCGTCA GCGAACACAA CATCATCCGG 1680 GTGGTAGGGG TGGCAAGAGT GTCCGGCCAG GAAAAATCCA TCCTGGAGAT GGTCAACATC 1740 CCACTGAGCA AGCCCAAACT CAGTATTAAG GTTCCTGGCT GGGTGATTTT AAATAGGAAA 1800 ATCACCACCG TCATCACCTT CACCAATCCA TTGCCAGTGC CACTGAACCG AGGAGTGTTC 1860 ACTGTTGAAG GGGCTGGCCT ACTTTCAACC AAAGAGATCC GCATTTCTGG TAGCATCGCT 1920 CCAGGCCAGC GTGTGTCTGT GGAGCTGTCC TTCACACCCA TGAGGGCGGG GGTCAGGGAG 1980 TTCCTGGTGG ACTTTGACTC CGACAGGCTC CAGGACGTGA AGGGAGTCGC CACACTGGTG 2040 GTCCGCAAGA CTTCACCCTC CTATTTTCCC ATGCCCTACA CGTTGTGA 2088 配列番号：9 配列の長さ：2921 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：スケソウタラ肝臓配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：32..2122 特徴を決定した方法：Ｐ配列 AGCAACTCTT GGAAAGAATT TAGCAAAGAT A ATG GCC CAC ACA AAC 46 Met Ala His Thr Asn 1 5 CGT TTA ATT GCT GGT GTT GAT CTG AGA AGC CAG GAA AAC AAC CGG 91 Arg Leu Ile Ala Gly Val Asp Leu Arg Ser Gln Glu Asn Asn Arg 10 15 20 GAA CAC CGA ACT GAG GAG ATT GAT AGG AAG CGT TTG ATT GTT CGG 136 Glu His Arg Thr Glu Glu Ile Asp Arg Lys Arg Leu Ile Val Arg 25 30 35 CGG GGA CAA GCC TTC TCC CTG ACG GTG CAC CTC TCC GAC CCG CTG 181 Arg Gly Gln Ala Phe Ser Leu Thr Val His Leu Ser Asp Pro Leu 40 45 50 CAG TCC GGC CAT GAG CTG GCC CTG GTC TTA AAG CAG GAT AAG AAC 226 Gln Ser Gly His Glu Leu Ala Leu Val Leu Lys Gln Asp Lys Asn 55 60 65 AAC GAT GAT ATT GTG ATC AGA CAG CGA ACG GCT GGA GGG TCT GGT 271 Asn Asp Asp Ile Val Ile Arg Gln Arg Thr Ala Gly Gly Ser Gly 70 75 80 GAC AAG TGG TGG TTA CAC CAG CAG AGC GCG AGG AAC GAA TTA CTG 316 Asp Lys Trp Trp Leu His Gln Gln Ser Ala Arg Asn Glu Leu Leu 85 90 95 CTG ACT GTG TAC AGT CCT GCC CGT GCT GCC GTT GGC GAG TAC CGC 361 Leu Thr Val Tyr Ser Pro Ala Arg Ala Ala Val Gly Glu Tyr Arg 100 105 110 TTG GCT GTT GAA CTG ATG TCA GGG AAT AAA CTT CTG GAG AGG ACG 406 Leu Ala Val Glu Leu Met Ser Gly Asn Lys Leu Leu Glu Arg Thr 115 120 125 GAC TTT ACC AAA ATG TAC TTG CTG TTT AAT CCC TGG TGC AAA GAT 451 Asp Phe Thr Lys Met Tyr Leu Leu Phe Asn Pro Trp Cys Lys Asp 130 135 140 GAT GCT GTG TAC CTC CCT GAT GAA AGT CTG CTC AAG GAA TAC ATT 496 Asp Ala Val Tyr Leu Pro Asp Glu Ser Leu Leu Lys Glu Tyr Ile 145 150 155 ATG AAC GAG AAT GGT CGC ATT TTC ACT GGG AGT GCG GAT TGG ATG 541 Met Asn Glu Asn Gly Arg Ile Phe Thr Gly Ser Ala Asp Trp Met 160 165 170 AGT GGG TTG CCA TGG AAT TTC GGA CAG TTT GAA GAC AAT GTG ATG 586 Ser Gly Leu Pro Trp Asn Phe Gly Gln Phe Glu Asp Asn Val Met 175 180 185 GAC ATC TGC TTT GAG ATC CTT GAC CGC TTT AAG CCA GCA AGG TCA 631 Asp Ile Cys Phe Glu Ile Leu Asp Arg Phe Lys Pro Ala Arg Ser 190 195 200 GAC CCC CCA AAC GAC ATG CGT CAG CGA TGG GAC CCT GTC TAC ATC 676 Asp Pro Pro Asn Asp Met Arg Gln Arg Trp Asp Pro Val Tyr Ile 205 210 215 AGC AGG GCA GTC GTT GCC ATG GTG AAT GCC AAC GAT GAC GGT GGA 721 Ser Arg Ala Val Val Ala Met Val Asn Ala Asn Asp Asp Gly Gly 220 225 230 GTC TTG GTG GGG AAA TGG CAG GAA CCT TAC ACA GGT GGA GTA CAG 766 Val Leu Val Gly Lys Trp Gln Glu Pro Tyr Thr Gly Gly Val Gln 235 240 245 CCA ACC AAA TGG ATG AGC AGT GTG CCC ATC CTG GAG AAG TGG AGC 811 Pro Thr Lys Trp Met Ser Ser Val Pro Ile Leu Glu Lys Trp Ser 250 255 260 AAA TCA AAG TCT GGA GTG AAG TAT GGC CAA TGC TGG GTG TTT GCA 856 Lys Ser Lys Ser Gly Val Lys Tyr Gly Gln Cys Trp Val Phe Ala 265 270 275 GCC GTG GCC TGC ACA GTG CTG CGA TGC CTG GGC ATC CCC ACA CGC 901 Ala Val Ala Cys Thr Val Leu Arg Cys Leu Gly Ile Pro Thr Arg 280 285 290 TGC ATC ACC AAC TTT GAG TCA GCC CAT GAC ACA GAC GGA AAC CTC 946 Cys Ile Thr Asn Phe Glu Ser Ala His Asp Thr Asp Gly Asn Leu 295 300 305 TCC ATC GAC CGA GTG TAC AAC ACA CAT AGG CAG AGT GTT AAC CAT 991 Ser Ile Asp Arg Val Tyr Asn Thr His Arg Gln Ser Val Asn His 310 315 320 GCT GAC AGC ATC TGG AAC TTT CAT TGT TGG ATC GAG TCT TAC ATG 1036 Ala Asp Ser Ile Trp Asn Phe His Cys Trp Ile Glu Ser Tyr Met 325 330 335 CAG AGA GAA GAT CTA CCT GAA GGA TAT GGT GGC TGG CAA GTC TTG 1081 Gln Arg Glu Asp Leu Pro Glu Gly Tyr Gly Gly Trp Gln Val Leu 340 345 350 GAC CCC ACA CCT CAG GAG AGG AGT AGT GGT ATG TTT CGC TGT GGC 1126 Asp Pro Thr Pro Gln Glu Arg Ser Ser Gly Met Phe Arg Cys Gly 355 360 365 CCA TGT CCA TTG AAG GCC ATT AAA GAA GGG GAC CTC AAT GTG AAG 1171 Pro Cys Pro Leu Lys Ala Ile Lys Glu Gly Asp Leu Asn Val Lys 370 375 380 TTT GAT GTT CCA TTT GTC TTT GCT GAG GTG AAT GCA GAC ATC ATC 1216 Phe Asp Val Pro Phe Val Phe Ala Glu Val Asn Ala Asp Ile Ile 385 390 395 AAT TGG GAA ATC AGA CCA GAC GGT CAG CGA ATG CGG CTT TCA TCC 1261 Asn Trp Glu Ile Arg Pro Asp Gly Gln Arg Met Arg Leu Ser Ser 400 405 410 AAC TCC GCA AAA GTG GGG AGG AAC ATT AGC ACC AAA AGT CCT TAC 1306 Asn Ser Ala Lys Val Gly Arg Asn Ile Ser Thr Lys Ser Pro Tyr 415 420 425 AGT AAC GAG AGG GAA GAT ATA ACC CTT CAG TAC AAG TAC CAA GAA 1351 Ser Asn Glu Arg Glu Asp Ile Thr Leu Gln Tyr Lys Tyr Gln Glu 430 435 440 GGT TCA GCC AAG GAG CGG GAG GTG TAC AAC AAG GCA GGG CGG CGC 1396 Gly Ser Ala Lys Glu Arg Glu Val Tyr Asn Lys Ala Gly Arg Arg 445 450 455 ATC TCC GGG CCG GAT AGA GAA GAG GAA TCA AAA CCA GCC AAT GAA 1441 Ile Ser Gly Pro Asp Arg Glu Glu Glu Ser Lys Pro Ala Asn Glu 460 465 470 CCA GGA AAC GTG CAG CTG GAG ATC AGA TAC GCC AAG CCT GTG TTC 1486 Pro Gly Asn Val Gln Leu Glu Ile Arg Tyr Ala Lys Pro Val Phe 475 480 485 GGG ACC GAC TTT GAC GTC ATC TTT GAG TTG GAG AAC ATG GGA GAC 1531 Gly Thr Asp Phe Asp Val Ile Phe Glu Leu Glu Asn Met Gly Asp 490 495 500 GAA GAA GTC AGC TGC AAA TTG AAC ATG ATG TCA AAG GCT GTC ACG 1576 Glu Glu Val Ser Cys Lys Leu Asn Met Met Ser Lys Ala Val Thr 505 510 515 TAT AAC TCG GTC CAC CTG GGA GAG TGC CAG AAT AGC ACA GTC AAT 1621 Tyr Asn Ser Val His Leu Gly Glu Cys Gln Asn Ser Thr Val Asn 520 525 530 GTT GTC ATT CCT GCT CAC AAA GTC CAC AGG GAG ACG GTG CGT CTA 1666 Val Val Ile Pro Ala His Lys Val His Arg Glu Thr Val Arg Leu 535 540 545 CTC TAC ACT AAG TAT GCA TCG TGC GTC AGC GAA CAC AAC ATC ATC 1711 Leu Tyr Thr Lys Tyr Ala Ser Cys Val Ser Glu His Asn Ile Ile 550 555 560 CGG GTG GTA GGG GTG GCA AGA GTG TCC GGC CAG GAA AAA TCC ATC 1756 Arg Val Val Gly Val Ala Arg Val Ser Gly Gln Glu Lys Ser Ile 565 570 575 CTG GAG ATG GTC AAC ATC CCA CTG AGC AAG CCC AAA CTC AGT ATT 1801 Leu Glu Met Val Asn Ile Pro Leu Ser Lys Pro Lys Leu Ser Ile 580 585 590 AAG GTT CCT GGC TGG GTG ATT TTA AAT AGG AAA ATC ACC ACC GTC 1846 Lys Val Pro Gly Trp Val Ile Leu Asn Arg Lys Ile Thr Thr Val 595 600 605 ATC ACC TTC ACC AAT CCA TTG CCA GTG CCA CTG AAC CGA GGA GTG 1891 Ile Thr Phe Thr Asn Pro Leu Pro Val Pro Leu Asn Arg Gly Val 610 615 620 TTC ACT GTT GAA GGG GCT GGC CTA CTT TCA ACC AAA GAG ATC CGC 1936 Phe Thr Val Glu Gly Ala Gly Leu Leu Ser Thr Lys Glu Ile Arg 625 630 635 ATT TCT GGT AGC ATC GCT CCA GGC CAG CGT GTG TCT GTG GAG CTG 1981 Ile Ser Gly Ser Ile Ala Pro Gly Gln Arg Val Ser Val Glu Leu 640 645 650 TCC TTC ACA CCC ATG AGG GCG GGG GTC AGG GAG TTC CTG GTG GAC 2026 Ser Phe Thr Pro Met Arg Ala Gly Val Arg Glu Phe Leu Val Asp 655 660 665 TTT GAC TCC GAC AGG CTC CAG GAC GTG AAG GGA GTC GCC ACA CTG 2071 Phe Asp Ser Asp Arg Leu Gln Asp Val Lys Gly Val Ala Thr Leu 670 675 680 GTG GTC CGC AAG ACT TCA CCC TCC TAT TTT CCC ATG CCC TAC ACG 2116 Val Val Arg Lys Thr Ser Pro Ser Tyr Phe Pro Met Pro Tyr Thr 685 690 695 TTG TGATCAAACC TATAGCTGTC AACAGGGCTC TGGCACTCAT TCTTATACTA 2169 Leu 696 ACAAATATAT TTAGCAAAGT CAAGCAAGGG TTTCACTTTT CTTAATATAC 2219 CATGATGTGT AGCGCTGATT CAATTAATGA ATAAATTAAT TTCAATTAAT 2269 GTGAAGAAAA TGCAAACATT GCCTTAATTC TTTGCAATGT CACAGGAATA 2319 GCGTAAATCA TGGCTCATTG ATATTAAATG TAGTATTGAC ATATATCCAT 2369 GCATTTTGCA CTTCTGCAAA TCACCATTTT GTTGTTAATC AATGTTTTAC 2419 CACGATTTTT GCATCTATTC TTGTTTAATT GTAATCAAGA CATTTACATG 2469 ATTGTGGGGG CCAAAGTATA TAGATGTTGT GGTTGGGAAA TGGGGCAATA 2519 ATAGGGGAAG GGTTAATTAT AGGGTCAGTG TTAGTAATTG GTTAAGGTTA 2569 CTAATAGGGT AAGTGTTACA GTGTAAAGAT AAGCCTTTGA TTTTGTTAAA 2619 TTTATTATGC CTTTCATCAA CAGTGGTTTG GGGTTTTATA ACAACAATTA 2669 AAGTGCTTAA CTACTGGTGA ACGACGTTGC AGAACGTATA TGGTACAAGT 2719 TTGTGTTGAT CGCATGGAAA AGGGAATAAC CAGTTACAAC TTATATGGTA 2769 AGAGCCTGGT AATACCATGG AAACAAACGA GGCTTCCTTT TACAGTACAG 2819 TTTCAGCGTC ATGAATATTT GGCCTGTTAA GCCCTTTGAG ACTGTAATGG 2869 TGATTAAGGG CTATACAAAT AAAATTGAAT TGAATTGAAT TAAAAAAAAA 2919 AA 2921 配列番号：10 配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTCAAGTACG GCCAGTGCTG GGTCTTCGC
29 配列番号：11 配列の長さ：8 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Tyr Gly Gln Cys Trp Val Phe Ala 8 配列番号：12 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＲＢＳ存在位置：15..23 特徴を決定した方法：Ｓ意図した機能：明細書内、図４中の化学合成DNA-1を構
成理想的ＲＢＳの導入配列 AATTCATCGA TTAGTAAGGA GGTTTAAAAT 30 配列番号：13 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：1..30 特徴を決定した方法：Ｐ意図した機能：明細書内、図４中の化学合成DNA-1を構
成真鯛トランスグルタミナーゼのＮ末端領域をコード配列番号12の下流塩基配列を構成配列 GGCTTCTTAT AAAGGTCTGA TTGTTGATGT 30 配列番号：14 配列の長さ：32 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：1..32 特徴を決定した方法：Ｐ意図した機能：明細書内、図４中の化学合成DNA-1を構
成真鯛トランスグルタミナーゼのＮ末端領域をコード配列番号13の下流塩基配列を構成配列 TAATGGTCGT TCTCATGAAA ACAACCTGGC AC 32 配列番号：15 配列の長さ：33 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：1..33 特徴を決定した方法：Ｐ意図した機能：明細書内、図４中の化学合成DNA-1を構
成真鯛トランスグルタミナーゼのＮ末端領域をコード配列番号14の下流塩基配列を構成配列 ATCGTACGCG TGAAATCGAC CGTGAGCGCC TGA 33 配列番号：16 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ意図した機能：明細書内、図４中の化学合成DNA-1を構
成配列番号12の相補鎖的役割配列 AGCCATTTTA AACCTCCTTA CTAATCGATG 30 配列番号：17 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ意図した機能：明細書内、図４中の化学合成DNA-1を構
成配列番号13の相補鎖的役割配列 ATTAACATCA ACAATCAGAC CTTTATAAGA 30 配列番号：18 配列の長さ：32 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ意図した機能：明細書内、図４中の化学合成DNA-1を構
成配列番号14の相補鎖的役割配列 CGATGTGCCA GGTTGTTTTC ATGAGAACGA CC 32 配列番号：19 配列の長さ：33 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ意図した機能：明細書内、図４中の化学合成DNA-1を構
成配列番号15の相補鎖的役割配列 AGCTTCAGGC GCTCACGGTC GATTTCACGC GTA 33

【０１５３】配列番号：20 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：Teragra chalcogramma 組織の種類：肝臓配列番号：21 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：Teragra chalcogramma 組織の種類：肝臓配列番号：22 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：Teragra chalcogramma 組織の種類：肝臓配列番号：23 配列の長さ：8 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：Teragra chalcogramma 組織の種類：肝臓配列番号：24 配列の長さ：13 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：Teragra chalcogramma 組織の種類：肝臓配列 Phe Asp Val Pro Phe Val Phe Ala Glu Val Asn Ala Asp 1 5 10 配列番号：25 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：Teragra chalcogramma 組織の種類：肝臓配列番号：26 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：中間型フラグメント起源生物名：Pagrus major 組織の種類：肝臓配列番号：27 配列の長さ：配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：中間型フラグメント起源生物名：Pagrus major 組織の種類：肝臓配列 Xaa Xaa Phe Asn Gln Gln Gly Ala Gln Asp Glu Ile Leu Leu Thr 1 5 10 15 Leu His 配列番号：28 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：中間型フラグメント起源生物名：Pagrus major 組織の種類：肝臓配列番号：29 配列の長さ：16 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：中間型フラグメント起源生物名：Pagrus major 組織の種類：肝臓配列 Leu Gln Glu Tyr Val Met Asn Glu Asp Gly Val Ile Tyr Met Gly 1 5 10 15 Thr 配列番号：30 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：中間型フラグメント起源生物名：Pagrus major 組織の種類：肝臓配列 Asn Ser Glu Met Asp Ile Glu His Arg Ser Asp Pro Val Tyr Val 1 5 10 15 Gly Arg Thr 配列番号：31 配列の長さ：16 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：中間型フラグメント起源生物名：Pagrus major 組織の種類：肝臓配列 Tyr Asp Ala Pro Phe Val Phe Ala Glu Val Asn Ala Asp Thr Ile 1 5 10 15 Tyr 配列番号：32 配列の長さ：14 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：中間型フラグメント起源生物名：Pagrus major 組織の種類：肝臓配列 Ser Val Tyr Gly Asn His Arg Glu Asp Val Thr Leu His Tyr 1 5 10 配列番号：33 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：中間型フラグメント起源生物名：Pagrus major 組織の種類：肝臓配列 Ala Gly Arg Arg Val Thr Glu Pro Ser Asn Glu Ile Ala Glu Gln 1 5 10 15 Gly Arg Leu 配列番号：34 配列の長さ：15 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：中間型フラグメント起源生物名：Pagrus major 組織の種類：肝臓配列 Xaa Ala Gln Pro Val Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Ile Val Glu 1 5 10 15 配列番号：35 配列の長さ：17 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：中間型フラグメント起源生物名：Pagrus major 組織の種類：肝臓配列 Asn Glu Gly Gly Arg Asp Ala His Ala Gln Leu Thr Xaa Leu Ala 1 5 10 15 Xaa Ala 配列番号：36 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：中間型フラグメント起源生物名：Pagrus major 組織の種類：肝臓配列番号：37 配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：中間型フラグメント起源生物名：Pagrus major 組織の種類：肝臓配列番号：38 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：中間型フラグメント起源生物名：Pagrus major 組織の種類：肝臓配列 Gly Gly Val Phe Thr Leu Glu Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ala Thr 1 5 10 15 Gln Ile His 配列番号：39 配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：中間型フラグメント起源生物名：Pagrus major 組織の種類：肝臓配列番号：40 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：中間型フラグメント起源生物名：Pagrus major 組織の種類：肝臓配列番号：41 配列の長さ：8 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：中間型フラグメント起源生物名：Ｐａｇｒｕｓｍａｊｏｒ組織の種類：肝臓配列番号：42 配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの型：中間型フラグメント起源生物名：Pagrus major 組織の種類：肝臓配列番号：43 配列の長さ：687 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：ヒラメ肝臓配列 Asp Asn Gln Asn Ile Pro Ile Thr Asp Val Asp Val Arg Ser His 1 5 10 15 Glu Asn Asn Leu Ala His Arg Thr Arg Glu Ile Asp Arg Glu Arg 20 25 30 Leu Ile Val Arg Arg Gly Gln Pro Phe Ser Ile Ser Leu Gln Cys 35 40 45 Cys Asp Ser Leu Thr Arg Asn His His Leu Glu Leu Ser Leu His 50 55 60 Leu Gly Lys Lys Asp Glu Val Val Ile Lys Val His Asn Glu Pro 65 70 75 Glu Ala Gly Gly Lys Trp Trp Phe Asn His Gln Lys Val Gln Asp 80 85 90 Glu Ile Leu Leu Thr Leu His Ser Pro Ala Asp Ala Ile Ile Gly 95 100 105 Glu Tyr His Leu Thr Val Leu Ile Lys Ser Pro Asp Gly His Phe 110 115 120 Val Lys Lys Thr Lys Asn Ile Gly Phe His Leu Leu Phe Asn Pro 125 130 135 Trp Cys Lys Asp Asp Ala Val Tyr Leu Pro Asp Glu Arg Met Leu 140 145 150 Asp Glu Tyr Val Met Asn Glu Glu Gly Ile Ile Tyr Arg Gly Thr 155 160 165 Ser Asn His Ile Ser Ser Ile Pro Trp Asn Tyr Gly Gln Phe Glu 170 175 180 Asp Tyr Val Met Asp Ile Cys Phe Gln Val Leu Asp Asn Ser Lys 185 190 195 Glu Ala Leu Lys Asn Ser Lys Met Asp Ile Glu Lys Arg Ser Asp 200 205 210 Pro Val Tyr Val Ser Arg Met Ile Thr Ala Met Val Asn Ser Asn 215 220 225 Gly Asp Arg Gly Val Leu Thr Gly Gln Trp His Glu Pro Tyr Thr 230 235 240 Gly Gly Phe Ser Pro Leu Arg Trp Thr Gly Ser Val Pro Ile Leu 245 250 255 Arg Lys Trp Ser Lys Ala Glu Val Arg Ala Val Lys Tyr Gly Gln 260 265 270 Cys Trp Val Phe Ala Ala Val Ala Cys Thr Val Leu Arg Cys Leu 275 280 285 Gly Ile Pro Thr Arg Asn Ile Thr Asn Phe Asn Ser Ala His Asp 290 295 300 Val Asp Gly Asn Leu Ser Val Asp Ile Val Leu Asn Lys Glu Met 305 310 315 Glu Ser Val Gly Lys Lys Asp Ser Ser Trp Asn Phe His Cys Trp 320 325 330 Ile Glu Ser Trp Met Arg Arg Asp Asp Leu Ser Lys Gly Asn Asp 335 340 345 Gly Trp Gln Val Leu Asp Pro Thr Pro Gln Glu Leu Ser Asp Gly 350 355 360 Glu Tyr Cys Cys Gly Pro Cys Pro Val Thr Ala Ile Lys Glu Gly 365 370 375 Asn Leu Ser Val Lys Tyr Asp Ala Pro Phe Ile Phe Ala Glu Val 380 385 390 Asn Ala Asp Ile Ile Tyr Trp Met Ala Gly Pro Gly Gly Glu Arg 395 400 405 Lys Lys Ile Asp Val Asp Gln Ser Gly Val Gly Lys Asn Ile Ser 410 415 420 Thr Lys Ser Leu Tyr Gly Asp Tyr Arg Glu Asp Val Thr Leu His 425 430 435 Tyr Lys Tyr Pro Glu Gly Ser Lys Lys Glu Arg Glu Val Tyr Gln 440 445 450 Lys Ala Gly His Arg Ile Lys Glu Gln Ile Cys Glu Asn Lys Gly 455 460 465 Pro Gln Gln Leu Gln Leu Ser Val Lys His Gly Lys Pro Val Phe 470 475 480 Gly Thr Asp Phe Asp Val Ile Val Glu Val Lys Asn Glu Gly Gln 485 490 495 Lys Asp Thr Ser Pro Gln Leu Leu Ile Val Val Met Ala Val Thr 500 505 510 Tyr Asn Ser Ile Asn Gln Gly Glu Cys Gln Arg Lys Ala Thr Ile 515 520 525 Val Thr Val Pro Ala Arg Lys Thr His Lys Glu Val Leu Arg Leu 530 535 540 Arg Tyr Asp Asp Tyr Val Lys Cys Val Ser Glu His His Leu Ile 545 550 555 Arg Val Lys Ala Leu Met Glu Val Pro Gly Asp Asn Lys Pro Val 560 565 570 Met Ser Val Ala Asn Ile Pro Leu Ser Met Pro Glu Leu Leu Val 575 580 585 Glu Val Pro Gly Ser Ile Ile Val Gln Glu Lys Val Thr Ala Phe 590 595 600 Ile Ser Phe Thr Asn Pro Leu Thr Val Pro Leu Lys Arg Gly Met 605 610 615 Phe Thr Val Glu Gly Ser Gly Leu Leu Ser Ala Ser Glu Ile Tyr 620 625 630 Val Lys Gly Asp Ile Ala Pro Gly Gln Lys Val Ser Val 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CTC TCC GTC GAC 952 Asn Phe Asn Ser Ala His Asp Val Asp Gly Asn Leu Ser Val Asp 295 300 305 ATC GTG TTG AAC AAA GAA ATG GAG AGC GTT GGC AAG AAG GAC AGT 997 Ile Val Leu Asn Lys Glu Met Glu Ser Val Gly Lys Lys Asp Ser 310 315 320 AGC TGG AAC TTC CAC TGT TGG ATC GAG TCC TGG ATG AGG AGA GAC 1042 Ser Trp Asn Phe His Cys Trp Ile Glu Ser Trp Met Arg Arg Asp 325 330 335 GAC CTC TCT AAA GGA AAT GAC GGC TGG CAG GTT TTG GAC CCC ACC 1087 Asp Leu Ser Lys Gly Asn Asp Gly Trp Gln Val Leu Asp Pro Thr 340 345 350 CCT CAA GAA CTG AGT GAT GGT GAG TAT TGC TGC GGC CCG TGT CCA 1132 Pro Gln Glu Leu Ser Asp Gly Glu Tyr Cys Cys Gly Pro Cys Pro 355 360 365 GTC ACC GCC ATC AAG GAG GGA AAT CTG AGT GTG AAG TAC GAC GCT 1177 Val Thr Ala Ile Lys Glu Gly Asn Leu Ser Val Lys Tyr Asp Ala 370 375 380 CCG TTT ATC TTC GCT GAG GTG AAC GCT GAC ATC ATC TAC TGG ATG 1222 Pro Phe Ile Phe Ala Glu Val Asn Ala Asp Ile Ile Tyr Trp Met 385 390 395 GCT GGA CCA GGA GGC GAA CGG AAG AAG ATC GAT GTG GAC CAG AGT 1267 Ala Gly Pro Gly Gly Glu Arg Lys Lys Ile Asp Val Asp Gln Ser 400 405 410 GGT GTG GGG AAG AAC ATC AGC ACC AAA AGT CTT TAT GGC GAC TAC 1312 Gly Val Gly Lys Asn Ile Ser Thr Lys Ser Leu Tyr Gly Asp Tyr 415 420 425 AGG GAG GAT GTC ACT CTG CAC TAC AAA TAC CCC GAA GGC TCC AAG 1357 Arg Glu Asp Val Thr Leu His Tyr Lys Tyr Pro Glu Gly Ser Lys 430 435 440 AAG GAG AGA GAG GTG TAC CAG AAG GCC GGA CAC CGA ATC AAA GAG 1402 Lys Glu Arg Glu Val Tyr Gln Lys Ala Gly His Arg Ile Lys Glu 445 450 455 CAG ATC TGT GAA AAC AAA GGT CCA CAA CAA CTG CAG CTG TCA GTC 1447 Gln Ile Cys Glu Asn Lys Gly Pro Gln Gln Leu Gln Leu Ser Val 460 465 470 AAG CAC GGG AAA CCT GTA TTT GGC ACT GAC TTC GAT GTG ATA GTT 1492 Lys His Gly Lys Pro Val Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Ile Val 475 480 485 GAG GTG AAG AAT GAA GGA CAG AAA GAC ACC AGT CCA CAG CTG CTG 1537 Glu Val Lys Asn Glu Gly Gln Lys Asp Thr Ser Pro Gln Leu Leu 490 495 500 ATT GTG GTC ATG GCC GTG ACC TAC AAT TCC ATC AAT CAA GGG GAG 1582 Ile Val Val Met Ala Val Thr Tyr Asn Ser Ile Asn Gln Gly Glu 505 510 515 TGT CAG AGG AAG GCG ACC ATA GTG ACC GTG CCG GCT CGC AAA ACC 1627 Cys Gln Arg Lys Ala Thr Ile Val Thr Val Pro Ala Arg Lys Thr 520 525 530 CAC AAG GAA GTG CTG CGT CTG CGC TAC GAC GAC TAT GTC AAA TGT 1672 His Lys Glu Val Leu Arg Leu Arg Tyr Asp Asp Tyr Val Lys Cys 535 540 545 GTC TCT GAG CAC CAT CTG ATC AGG GTG AAA GCG CTC ATG GAG GTT 1717 Val Ser Glu His His Leu Ile Arg Val Lys Ala Leu Met Glu Val 550 555 560 CCA GGG GAC AAC AAA CCC GTC ATG AGT GTG GCC AAC ATT CCA CTG 1762 Pro Gly Asp Asn Lys Pro Val Met Ser Val Ala Asn Ile Pro Leu 565 570 575 AGC ATG CCT GAG CTC CTG GTA GAG GTA CCT GGG AGC ATC ATT GTT 1807 Ser Met Pro Glu Leu Leu Val Glu Val Pro Gly Ser Ile Ile Val 580 585 590 CAG GAG AAG GTG ACA GCC TTC ATC TCC TTC ACA AAT CCT CTA ACT 1852 Gln Glu Lys Val Thr Ala Phe Ile Ser Phe Thr Asn Pro Leu Thr 595 600 605 GTC CCA CTG AAG CGT GGC ATG TTC ACC GTG GAG GGG TCC GGA CTA 1897 Val Pro Leu Lys Arg Gly Met Phe Thr Val Glu Gly Ser Gly Leu 610 615 620 CTG TCT GCC TCT GAG ATC TAT GTG AAA GGG GAC ATT GCT CCA GGC 1942 Leu Ser Ala Ser Glu Ile Tyr Val Lys Gly Asp Ile Ala Pro Gly 625 630 635 CAG AAG GTT TCT GTC AAG ATC ACC TTC ACG CCC ATG AGG GTC GGG 1987 Gln Lys Val Ser Val Lys Ile Thr Phe Thr Pro Met Arg Val Gly 640 645 650 GTG AGG AAG CTC CTG GTG GAC TTT GAC TCT GAC AGG CTG AAG GAT 2032 Val Arg Lys Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Asp Arg Leu Lys Asp 655 660 665 GTG AAA GGA GTC ACG ACA GTG GTC GTC CGC AAG AAA TCC TGT TTT 2077 Val Lys Gly Val Thr Thr Val Val Val Arg Lys Lys Ser Cys Phe 670 675 680 ATT AGG TGT CCT TAAAAACAGA CGGACACGTA TTAAAGTGTG AGATAACCTG 2129 Ile Arg Cys Pro 685 AGAGGTGTAA CTCCCCTGT 2148

【０１５４】配列番号：49 配列の長さ：640 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：スケソウタラ筋肉配列 Ala His Thr Asn Arg Leu Ile Ala Gly Val Asp Leu Arg Ser Gln 1 5 10 15 Glu Asn Asn Arg Glu His Arg Thr Glu Glu Ile Asp Arg Lys Arg 20 25 30 Leu Ile Val Arg Arg Gly Gln Ala Phe Ser Leu Thr Val His Leu 35 40 45 Ser Asp Pro Leu Gln Ser Gly His Glu Leu Ala Leu Val Leu Lys 50 55 60 Gln Asp Lys Ile Asn Asp Asp Ile Val Ile Arg Gln Arg Thr Thr 65 70 75 Gly Gly Ser Gly Asp Lys Trp Trp Leu His Gln Gln Ser Ala Asn 80 85 90 Asn Glu Leu Leu Leu Thr Val Tyr Ser Pro Ala Arg Ala Ala Val 95 100 105 Gly Glu Tyr Arg Leu Ala Val Glu Leu Met Ser Gly Asn Lys Leu 110 115 120 Leu Glu Arg Thr Asp Phe Thr Lys Met Tyr Leu Leu Phe Asn Pro 125 130 135 Trp Cys Lys Glu Asp Ala Val Tyr Leu Pro Asp Glu Cys Leu Leu 140 145 150 Lys Glu Tyr Ile Met Asn Glu Asn Gly Arg Ile Phe Thr Gly Ser 155 160 165 Ala Asp Trp Met Ser Gly Leu Pro Trp Asn Phe Gly Gln Phe Glu 170 175 180 Asp Asn Val Met Asp Ile Cys Phe Glu Ile Leu Asp Arg Phe Asn 185 190 195 Pro Ala Arg Ser Asp Pro Pro Ser Asp Met Leu Gln Arg Trp Asp 200 205 210 Pro Val Tyr Ile Ser Arg Ala Val Val Ala Met Val Asn Ala Asn 215 220 225 Asp Asp Asp Gly Gly Val Val Val Gly Arg Trp Gln Glu Pro Tyr 230 235 240 Thr Gly Gly Val Gln Pro Thr Lys Trp Met Ser Ser Val Pro Ile 245 250 255 Leu Glu Glu Trp Ser Lys Ser Lys Ser Gly Val Lys Tyr Gly Gln 260 265 270 Cys Trp Val Phe Ala Ala Val Ala Cys Thr Val Met Arg Cys Leu 275 280 285 Gly Ile Pro Thr Arg Cys Ile Thr Asn Phe Gln Ser Ala His Asp 290 295 300 Thr Asp Gly Asn Leu Ser Ile Asp Arg Val Tyr Asn Ile His Arg 305 310 315 Gln Leu Val Asp Gly Asp Asp Ser Ile Trp Asn Phe His Cys Trp 320 325 330 Ile Glu Ser Tyr Met Gln Arg Glu Asp Leu Pro Glu Gly Tyr Gly 335 340 345 Gly Trp Gln Val Leu Asp Pro Thr Pro Gln Glu Arg Ser Ser Gly 350 355 360 Met Phe Arg Cys Gly Pro Cys Pro Leu Lys Ala Ile Lys Glu Gly 365 370 375 Asp Leu Asn Val Lys Phe Asp Val Pro Phe Val Phe Ala Glu Val 380 385 390 Asn Ala Asp Ile Ile Asn Trp Glu Ile Arg Pro Asp Gly Gln Arg 395 400 405 Lys Arg Leu Ser Ser Asn Ser Ala Asn Val Gly Arg Asn Ile Ser 410 415 420 Thr Lys Ser Pro Tyr Gly Asn Glu Arg Glu Asp Ile Thr His Gln 425 430 435 Tyr Lys Tyr Gln Glu Gly Ser Ala Lys Glu Arg Glu Val Tyr Asn 440 445 450 Lys Ala Gly Arg Arg Ile Ser Gly Pro Asp Gly Glu Glu Glu Ser 455 460 465 Lys Pro Gly Asn Val Gln Leu Glu Ile Lys His Ala Lys Pro Val 470 475 480 Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Ile Phe Glu Leu Glu Asn Met Gly 485 490 495 Asp Lys Glu Val Ser Cys Lys Leu Asn Met Met Ser Glu Ala Val 500 505 510 Thr Tyr Asn Ser Val His Leu Gly Arg Phe Gln Asn Ser Thr Val 515 520 525 Asn Val Val Ile Pro Ala His Lys Val His Ser Glu Thr Val Arg 530 535 540 Leu Leu Tyr Thr Lys Tyr Ala Ser Val Val Ser Glu His Asn Ile 545 550 555 Ile Arg Val Thr Gly Val Ala Glu Val Ser Gly Gln Glu Lys Ser 560 565 570 Ile Leu Glu Met Val Asn Ile Pro Leu Ser Lys Pro Lys Leu Ser 575 580 585 Ile Lys Val Pro Gly Trp Val Ile Leu Asn Arg Lys Ile Thr Thr 590 595 600 Phe Ile Ser Phe Thr Asn Pro Leu Pro Val Pro Leu Asn Arg Gly 605 610 615 Val Phe Thr Val Glu Gly Ala Gly Leu Leu Pro Thr Lys Glu Ile 620 625 630 Arg Ile Ser Gly Ser Ile Ala Pro Gly Gln 635 640 配列番号：50 配列の長さ：641 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：スケソウタラ筋肉配列 Met Ala His Thr Asn Arg Leu Ile Ala Gly Val Asp Leu Arg Ser 1 5 10 15 Gln Glu Asn Asn Arg Glu His Arg Thr Glu Glu Ile Asp Arg Lys 20 25 30 Arg Leu Ile Val Arg Arg Gly Gln Ala Phe Ser Leu Thr Val His 35 40 45 Leu Ser Asp Pro Leu Gln Ser Gly His Glu Leu Ala Leu Val Leu 50 55 60 Lys Gln Asp Lys Ile Asn Asp Asp Ile Val Ile Arg Gln Arg Thr 65 70 75 Thr Gly Gly Ser Gly Asp Lys Trp Trp Leu His Gln Gln Ser Ala 80 85 90 Asn Asn Glu Leu Leu Leu Thr Val Tyr Ser Pro Ala Arg Ala Ala 95 100 105 Val Gly Glu Tyr Arg Leu Ala Val Glu Leu Met Ser Gly Asn Lys 110 115 120 Leu Leu Glu Arg Thr Asp Phe Thr Lys Met Tyr Leu Leu Phe Asn 125 130 135 Pro Trp Cys Lys Glu Asp Ala Val Tyr Leu Pro Asp Glu Cys Leu 140 145 150 Leu Lys Glu Tyr Ile Met Asn Glu Asn Gly Arg Ile Phe Thr Gly 155 160 165 Ser Ala Asp Trp Met Ser Gly Leu Pro Trp Asn Phe Gly Gln Phe 170 175 180 Glu Asp Asn Val Met Asp Ile Cys Phe Glu Ile Leu Asp Arg Phe 185 190 195 Asn Pro Ala Arg Ser Asp Pro Pro Ser Asp Met Leu Gln Arg Trp 200 205 210 Asp Pro Val Tyr Ile Ser Arg Ala Val Val Ala Met Val Asn Ala 215 220 225 Asn Asp Asp Asp Gly Gly Val Val Val Gly Arg Trp Gln Glu Pro 230 235 240 Tyr Thr Gly Gly Val Gln Pro Thr Lys Trp Met Ser Ser Val Pro 245 250 255 Ile Leu Glu Glu Trp Ser Lys Ser Lys Ser Gly Val Lys Tyr Gly 260 265 270 Gln Cys Trp Val Phe Ala Ala Val Ala Cys Thr Val Met Arg Cys 275 280 285 Leu Gly Ile Pro Thr Arg Cys Ile Thr Asn Phe Gln Ser Ala His 290 295 300 Asp Thr Asp Gly Asn Leu Ser Ile Asp Arg Val Tyr Asn Ile His 305 310 315 Arg Gln Leu Val Asp Gly Asp Asp Ser Ile Trp Asn Phe His Cys 320 325 330 Trp Ile Glu Ser Tyr Met Gln Arg Glu Asp Leu Pro Glu Gly Tyr 335 340 345 Gly Gly Trp Gln Val Leu Asp Pro Thr Pro Gln Glu Arg Ser Ser 350 355 360 Gly Met Phe Arg Cys Gly Pro Cys Pro Leu Lys Ala Ile Lys Glu 365 370 375 Gly Asp Leu Asn Val Lys Phe Asp Val Pro Phe Val Phe Ala Glu 380 385 390 Val Asn Ala Asp Ile Ile Asn Trp Glu Ile Arg Pro Asp Gly Gln 395 400 405 Arg Lys Arg Leu Ser Ser Asn Ser Ala Asn Val Gly Arg Asn Ile 410 415 420 Ser Thr Lys Ser Pro Tyr Gly Asn Glu Arg Glu Asp Ile Thr His 425 430 435 Gln Tyr Lys Tyr Gln Glu Gly Ser Ala Lys Glu Arg Glu Val Tyr 440 445 450 Asn Lys Ala Gly Arg Arg Ile Ser Gly Pro Asp Gly Glu Glu Glu 455 460 465 Ser Lys Pro Gly Asn Val Gln Leu Glu Ile Lys His Ala Lys Pro 470 475 480 Val Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Ile Phe Glu Leu Glu Asn Met 485 490 495 Gly Asp Lys Glu Val Ser Cys Lys Leu Asn Met Met Ser Glu Ala 500 505 510 Val Thr Tyr Asn Ser Val His Leu Gly Arg Phe Gln Asn Ser Thr 515 520 525 Val Asn Val Val Ile Pro Ala His Lys Val His Ser Glu Thr Val 530 535 540 Arg Leu Leu Tyr Thr Lys Tyr Ala Ser Val Val Ser Glu His Asn 545 550 555 Ile Ile Arg Val Thr Gly Val Ala Glu Val Ser Gly Gln Glu Lys 560 565 570 Ser Ile Leu Glu Met Val Asn Ile Pro Leu Ser Lys Pro Lys Leu 575 580 585 Ser Ile Lys Val Pro Gly Trp Val Ile Leu Asn Arg Lys Ile Thr 590 595 600 Thr Phe Ile Ser Phe Thr Asn Pro Leu Pro Val Pro Leu Asn Arg 605 610 615 Gly Val Phe Thr Val Glu Gly Ala Gly Leu Leu Pro Thr Lys Glu 620 625 630 Ile Arg Ile Ser Gly Ser Ile Ala Pro Gly Gln 635 640 配列番号：51 配列の長さ：1921 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：スケソウタラ筋肉配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1.. 特徴を決定した方法：P 配列 GCCCACACAA ACCGTTTAAT TGCTGGTGTT GATCTGAGAA GCCAGGAAAA CAACCGGGAA 60 CACCGAACTG AGGAGATTGA TAGGAAGCGT TTGATTGTTC GGCGGGGACA AGCCTTCTCC 120 CTGACGGTGC ACCTCTCCGA CCCGCTGCAG TCCGGCCATG AGCTGGCCCT GGTCTTAAAG 180 CAGGATAAAA TCAACGATGA TATTGTGATC AGACAGCGAA CGACTGGAGG GTCCGGTGAC 240 AAGTGGTGGT TACACCAGCA GAGCGCGAAC AACGAATTAC TGCTGACTGT GTACAGTCCC 300 GCCCGTGCTG CCGTTGGCGA GTACCGCTTG GCTGTTGAAC TGATGTCAGG GAATAAACTT 360 CTGGAGAGGA CGGACTTTAC CAAAATGTAC TTGCTGTTTA ATCCCTGGTG CAAAGAAGAT 420 GCCGTGTACC TCCCTGATGA GTGTCTGCTC AAGGAATACA TTATGAACGA GAATGGTCGC 480 ATTTTCACTG GGAGTGCGGA TTGGATGAGT GGGTTGCCAT GGAATTTCGG ACAGTTTGAA 540 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Asn Pro Trp Cys Lys 125 130 135 GAA GAT GCC GTG TAC CTC CCT GAT GAG TGT CTG CTC AAG GAA TAC 500 Glu Asp Ala Val Tyr Leu Pro Asp Glu Cys Leu Leu Lys Glu Tyr 140 145 150 ATT ATG AAC GAG AAT GGT CGC ATT TTC ACT GGG AGT GCG GAT TGG 545 Ile Met Asn Glu Asn Gly Arg Ile Phe Thr Gly Ser Ala Asp Trp 155 160 165 ATG AGT GGG TTG CCA TGG AAT TTC GGA CAG TTT GAA GAT AAT GTG 590 Met Ser Gly Leu Pro Trp Asn Phe Gly Gln Phe Glu Asp Asn Val 170 175 180 ATG GAC ATC TGC TTT GAG ATC CTT GAC CGC TTT AAC CCA GCG AGG 635 Met Asp Ile Cys Phe Glu Ile Leu Asp Arg Phe Asn Pro Ala Arg 185 190 195 TCA GAC CCC CCA AGC GAC ATG CTT CAG CGA TGG GAC CCT GTC TAC 680 Ser Asp Pro Pro Ser Asp Met Leu Gln Arg Trp Asp Pro Val Tyr 200 205 210 ATC AGC AGG GCA GTC GTT GCC ATG GTG AAT GCC AAC GAT GAT GAC 725 Ile Ser Arg Ala Val Val Ala Met Val Asn Ala Asn Asp Asp Asp 215 220 225 GGT GGA GTC GTG GTG GGT CGA TGG CAG GAA CCT TAC ACA GGT GGA 770 Gly Gly Val Val Val Gly Arg Trp Gln Glu Pro Tyr Thr Gly Gly 230 235 240 GTA CAG CCA ACC 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1130 Val Leu Asp Pro Thr Pro Gln Glu Arg Ser Ser Gly Met Phe Arg 350 355 360 TGT GGC CCA TGT CCT TTG AAG GCC ATT AAA GAA GGG GAC CTC AAT 1175 Cys Gly Pro Cys Pro Leu Lys Ala Ile Lys Glu Gly Asp Leu Asn 365 370 375 GTG AAG TTT GAT GTT CCA TTT GTC TTT GCT GAG GTG AAT GCA GAC 1220 Val Lys Phe Asp Val Pro Phe Val Phe Ala Glu Val Asn Ala Asp 380 385 390 ATC ATC AAT TGG GAA ATC AGA CCA GAC GGT CAG CGA AAG CGG CTT 1265 Ile Ile Asn Trp Glu Ile Arg Pro Asp Gly Gln Arg Lys Arg Leu 395 400 405 TCA TCC AAC TCT GCA AAT GTG GGG AGG AAC ATT AGC ACC AAA AGT 1310 Ser Ser Asn Ser Ala Asn Val Gly Arg Asn Ile Ser Thr Lys Ser 410 415 420 CCT TAT GGT AAC GAG AGG GAA GAT ATA ACC CAT CAG TAC AAG TAC 1355 Pro Tyr Gly Asn Glu Arg Glu Asp Ile Thr His Gln Tyr Lys Tyr 425 430 435 CAA GAA GGT TCA GCC AAG GAG CGG GAG GTG TAC AAC AAG GCA GGG 1400 Gln Glu Gly Ser Ala Lys Glu Arg Glu Val Tyr Asn Lys Ala Gly 440 445 450 CGG CGC ATC TCC GGG CCG GAT GGA GAA GAG GAA TCA AAA CCA GGA 1445 Arg Arg Ile Ser Gly Pro Asp Gly Glu Glu Glu Ser Lys Pro Gly 455 460 465 AAC GTG CAG CTG GAG ATC AAG CAC GCC AAA CCT GTG TTC GGG ACC 1490 Asn Val Gln Leu Glu Ile Lys His Ala Lys Pro Val Phe Gly Thr 470 475 480 GAC TTT GAC GTC ATC TTT GAG TTG GAG AAC ATG GGA GAC AAA GAA 1535 Asp Phe Asp Val Ile Phe Glu Leu Glu Asn Met Gly Asp Lys Glu 485 490 495 GTC AGC TGC AAA TTA AAC ATG ATG TCA GAG GCT GTC ACC TAT AAC 1580 Val Ser Cys Lys Leu Asn Met Met Ser Glu Ala Val Thr Tyr Asn 500 505 510 TCA GTT CAC CTT GGA CGG TTC CAG AAC AGC ACG GTC AAT GTT GTC 1625 Ser Val His Leu Gly Arg Phe Gln Asn Ser Thr Val Asn Val Val 515 520 525 ATT CCT GCT CAC AAA GTC CAC AGT GAG ACG GTG CGT CTA CTC TAC 1670 Ile Pro Ala His Lys Val His Ser Glu Thr Val Arg Leu Leu Tyr 530 535 540 ACT AAG TAT GCC TCA GTT GTC AGC GAG CAC AAC ATC ATC CGG GTG 1715 Thr Lys Tyr Ala Ser Val Val Ser Glu His Asn Ile Ile Arg Val 545 550 555 ACA GGG GTG GCG GAA GTG TCC GGC CAG GAA AAA TCC ATC CTG GAG 1760 Thr Gly Val Ala Glu Val Ser Gly Gln Glu Lys Ser Ile Leu Glu 560 565 570 ATG GTC AAC ATC CCA CTG AGC AAG CCC AAA CTC AGT ATT AAG GTT 1805 Met Val Asn Ile Pro Leu Ser Lys Pro Lys Leu Ser Ile Lys Val 575 580 585 CCT GGC TGG GTG ATT TTA AAT AGG AAA ATC ACC ACC TTC ATC TCC 1850 Pro Gly Trp Val Ile Leu Asn Arg Lys Ile Thr Thr Phe Ile Ser 590 595 600 TTC ACC AAT CCA TTG CCA GTG CCA CTG AAC CGA GGA GTG TTC ACT 1895 Phe Thr Asn Pro Leu Pro Val Pro Leu Asn Arg Gly Val Phe Thr 605 610 615 GTT GAA GGG GCT GGC CTA CTT CCC ACC AAA GAG ATC CGC ATT TCT 1940 Val Glu Gly Ala Gly Leu Leu Pro Thr Lys Glu Ile Arg Ile Ser 620 625 630 GGT AGC ATC GCT CCA GGC CAG C 1962 Gly Ser Ile Ala Pro Gly Gln 635 640 配列番号：53 配列の長さ：4 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：魚類配列番号：54 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：魚類配列番号：55 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：魚類配列番号：56 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：魚類配列番号：57 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：魚類配列番号：58 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：魚類配列番号：59 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：魚類配列番号：60 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：魚類配列番号：61 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：魚類配列番号：62 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：魚類配列番号：63 配列の長さ：4 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：魚類配列番号：64 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間型フラグメント起源生物名：魚類配列番号：65 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TTGGAAGCTT GTAAGAGCAA CTCTTGGAAA 30 配列番号：66 配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TTGTACACTC GATCGATGGA GAGGT 25 配列番号：67 配列の長さ：24 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TCTGCTTTGG GATCCTTGAC CGCT 24 配列番号：68 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TGAAGGAGAG CTCCACAGAC ACA 23 配列番号：69 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATGATGTCAA AGGCTGTCAC 20 配列番号：70 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TCTTACCATA TAAGTTGTAA 20 配列番号：71 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATTGATTAAC AACAAAATGG 20

【図面の簡単な説明】

【図１】取得したマダイのトランスグルタミナーゼを
コードする遺伝子を有するｃＤＮＡを保持するプラスミ
ドｐＳＬＴＧ５の制限酵素地図

【図２】スケソウダラのトランスグルタミナーゼをコ
ードする遺伝子を有するｃＤＮＡクローン間の相関関係
及びｃＤＮＡの制限酵素地図

【図３】マダイトランスグルタミナーゼｃＤＮＡの発
現プラスミドｐＩＬ６ＴＧ１の構築工程図及び制限酵素
図

【図４】化学合成ＤＮＡ−１の塩基配列表示図大腸菌
のコンセンサスＳＤ（シャイン-ダルガルノ）配列及
び、マダイトランスグルタミナーゼのアミノ末端であ
るメチオニンから３２番目のロイシンまでをコードする
ＤＮＡ塩基配列を示す。

【図５】マダイトランスグルタミナーゼｃＤＮＡの発
現プラスミドｐＴＴＧ２ー２２の構築のためのプラスミ
ドｐＦＴＧＮ６の構築工程図

【図６】マダイトランスグルタミナーゼｃＤＮＡの発
現プラスミドｐＴＴＧ２ー２２の構築のためのＤＮＡ断
片Ａ、Ｂ，Ｃの取得工程図

【図７】プラスミドｐＴＴＧ１の構築工程図

【図８】マダイトランスグルタミナーゼｃＤＮＡの発
現プラスミドｐＴＴＧ２ー２２の構築工程図

【図９】マダイトランスグルタミナーゼｃＤＮＡの酵
母での発現プラスミドｐＹＳＴＧ１の構築工程図

【図１０】スケソウダラ筋肉由来トランスグルタミナー
ゼｃＤＮＡクローンの制限酵素地図

【図１１】ヒラメトランスグルタミナーゼをコードする
ｃＤＮＡの制限酵素地図

【図１２】ヒラメトランスグルタミナーゼをコードする
ｃＤＮＡ断片を有するプラスミド

【図１３】スケソウダラ由来トランスグルタミナーゼ
（ＦＴＧ）とモルモット由来トランスグルタミナーゼ
（ＭＴＧ）の温度安定性比較 ○−○、ＦＴＧの相対残存活性 ●−●、ＭＴＧの相
対残存活性

【図１４】スケソウダラ由来トランスグルタミナーゼ
（ＦＴＧ）とモルモット由来トランスグルタミナーゼ
（ＭＴＧ）のミオシンＨ鎖重合化反応における反応性比
較 △−△、ＦＴＧ ○−○、ＭＴＧ ●−●、無添加
対照

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/10 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:19） (72)発明者松井裕神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社中央研究所内 (56)参考文献ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ，Ｖｏｌ．113，Ｎｏ．21（1990）, ａｂｓｔｒａｃｔｎｏ．189898ｑ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/54 C12N 9/10 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表配列番号２に示す６９４残基のア
ミノ酸配列を含む、魚由来のトランスグルタミナーゼ活
性を保持するポリペプチドをコードする遺伝子を有する
ＤＮＡ断片。
【請求項２】配列表配列番号４に示す塩基配列を有す
る請求項１記載のＤＮＡ断片。
【請求項３】配列表配列番号６に示す６９５残基のア
ミノ酸配列を含む、魚由来のトランスグルタミナーゼ活
性を保持するポリペプチドをコードする遺伝子を有する
ＤＮＡ断片。
【請求項４】配列表配列番号８に示す塩基配列を有す
る請求項３記載のＤＮＡ断片。
【請求項５】配列表配列番号４３に示す６８７残基の
アミノ酸配列を含む、魚由来のトランスグルタミナーゼ
活性を保持するポリペプチドをコードする遺伝子を有す
るＤＮＡ断片。
【請求項６】配列表配列番号４５に示す塩基配列を有
する請求項５記載のＤＮＡ断片。
【請求項７】請求項１ないし６のいずれか一項記載の
ＤＮＡ断片を組み込んだ組換えプラスミド。
【請求項８】プラスミドが発現ベクターである請求項
７記載の組換えプラスミド。
【請求項９】請求項７又は８記載の組換えプラスミド
により形質転換された形質転換体。
【請求項１０】請求項９記載の形質転換体を培養する
ことを特徴とする、魚由来のトランスグルタミナーゼ活
性を保有するポリペプチドの製造法。