JP3048340B2

JP3048340B2 - Ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｋａｎｓａｓｉｉ核酸の種特異的検出に関する材料および方法

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Publication number: JP3048340B2
Application number: JP9192449A
Authority: JP
Inventors: キミン・ユー
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1996-07-17
Filing date: 1997-07-17
Publication date: 2000-06-05
Anticipated expiration: 2017-07-17
Also published as: JPH1057097A; EP0823484A1; US5747259A; CA2205547A1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸増幅および核
酸ハイブリダイゼーションを用いて微生物を検出および
／または同定するためのオリゴヌクレオチド配列ならび
に方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ミコバクテリアは、抗酸性、非運動性、
グラム陽性、桿菌である、細菌の属である。属は、これ
らに限定されるわけではないが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｂｏ
ｖｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａ
ｅ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、
Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓ
ｉｉ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅ
ｕｍ、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよび
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む、いくつかの種を
含む。これらの生物体のあるものは、疾病の原因作因で
ある。１９５３年に初めてミコバクテリア感染が発見さ
れてから、感染患者が米国で増加している。特に心配な
のは結核であり、その原因作因は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓである。これらの新たな患者の多くは、ＡＩ
ＤＳ伝染病と関係があり、ミコバクテリアに特に感染し
やすい免疫障害性集団になる。その他のミコバクテリア
感染症もまた、多数の免疫障害患者が増加した結果、増
加しつつある。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕ
ｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｋａｎｓａｓｉｉお
よびその他の非結核性ミコバクテリアは、ＨＩＶ感染患
者および他の免疫障害患者に日和見的病原体として見い
だされる。

【０００３】ミコバクテリア感染症の慣用的診断は、生
物体を抗酸性染色し、培養し、さらに生化学的アッセイ
を行うことによって行われる。これらの方法は、時間が
かかり、慣用培養法を用いた典型的診断法では、６週間
ほどの時間を要する。ＢＡＣＴＥＣ（登録商標）システ
ム（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｓｏｎＭｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙＳｙｓｔｅｍｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）の
ような自動培養システムでは、診断に要する時間を１か
ら２週間に短縮することができる。しかしながら、ミコ
バクテリア感染の診断に要する時間を１週間より短く、
望ましくは約１日に短縮する必要がある。サザンハイブ
リダイゼーションまたはドットブロットのようなオリゴ
ヌクレオチドプローブを基にしたアッセイは、迅速に、
（即ち、１日あるいはそれより短い時間で、）結果を導
くことができる。核酸増幅に基づくアッセイは、通常、
より感度が高く、より迅速に、時として１時間以内に、
結果を提供することができる。ミコバクテリア感染の診
断に関するそのような方法では、特定の生物体の同定を
所望する場合、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に特異的
またはミコバクテリアの特定の種に特異的であるオリゴ
ヌクレオチドプローブまたはプライマーを開発する必要
がある。

【０００４】Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｋａｎｓａ
ｓｉｉの同定は、研究室では慣用的に、生化学的試験お
よび増殖特性の測定に基づいて行われている。これらに
は、カタラーゼ生成、ウレアーゼ活性、ＴＷＥＥＮ加水
分解、硝酸還元および光に晒されたときピグメントを生
成する生物体の能力（光発色性）が含まれる。他のミコ
バクテリアの種のいくつかが同様の生化学的プロフィー
ルを示すので、一般的には、光発色性によってＭｉｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｋａｎｓａｓｉｉの確実な同定が
可能になる。しかしながら、光発色性の決定は、生物体
の純粋培養を必要とし、また、この表現型は、可変であ
り、主観的であり、且つ確実性の決定が困難であろう。
これらの理由により、オリゴヌクレオチドプローブを用
いた種特異的ハイブリダイゼーションまたは核酸増幅に
よって、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｋａｎｓａｓｉ
ｉを同定する試みがなされてきた。Ｚ．Ｈ．Ｈｕａｎｇ
ら（１９９１、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，
２９，２１２５−２１２９）は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｋａｎｓａｓｉｉにある程度の種特異性を持つ
ゲノムライブラリーから得られたＤＮＡプローブについ
て報告している。このクローン（ｐＭＫ１−９）は、
Ｍ．ｇａｓｔｒｉを含む他の種とある程度のクロスハイ
ブリダイゼーションを示すが、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの
遺伝的に異なる亜群を検出しなかった。ｐＭＫ１−９の
ヌクレオチド配列は、報告されておらず、それから誘導
されるであろう遺伝子も同定されていない。Ｂ．Ｃ．Ｒ
ｏｓｓら（１９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，３０，２９３０−２９３３）は、ｐＭＫ１−９プ
ローブ、６５ｋＤａ抗原遺伝子プローブ、およびｒＲＮ
Ａに特異的にハイブリダイズするプローブ（ＡＣＣＵ−
ＰＲＯＢＥ、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ，ＳａｎＤｉｅｇ
ｏ，ＣＡ）を用いたＤＮＡプローブ試験商品を用いて、
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの遺伝的に異なる亜群の同定につ
いても報告している。ＡＣＣＵ−ＰＲＯＢＥは、Ｅ．Ｔ
ｏｒｔｏｌｉら（１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１３，２
６４−２６７）によっても評価されており、Ｍ．Ｋａｎ
ｓａｓｉｉの遺伝子不均一性の結果として、一見したと
ころでは１００％の特異性を示すが、感受性は７２．８
％のみであることが見いだされた。Ｔ．Ｒｏｇａｌｌら
（１９９０、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３
６，１９１５−１９２０）は、ミコバクテリアの種を同
定するため、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に基づいた
配列決定戦略に、１６ＳｒＲＮＡを用いた。しかしなが
ら、これらのプライマーは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉから
Ｍ．ｇａｓｔｒｉを識別するために用いることはできな
かった。なぜならば、これらの２つの種は表現型特性が
異なるにもかかわらず、これらからの１６ＳｒＲＮＡ
配列は同一であるからである。同様の研究が、Ｂ．Ｂｏ
ｄｄｉｎｇｈａｕｓら（１９９０、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．，２８，１７５１−１７５９）によっ
て、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ群、即ち、Ｍ．ａｖ
ｉｕｍ−Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよび
Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、に特異的な１６Ｓ
ｒＲＮＡから誘導したオリゴヌクレオチドについて報
告されている。Ｍ．Ｙａｎｇら（１９９３、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１，２７６９−２７７
２）は、ハイブリダイゼーションプローブとして用いた
場合にＭ．ｋａｎｓａｓｉｉに種特異性を示す、臨床単
離物からの配列の単離について報告している。このプロ
ーブ（ｐ６１２３）は、ｐＭＫ１−９とハイブリダイズ
しない亜群を含む、試験したすべてのＭ．ｋａｎｓａｓ
ｉｉ株とハイブリダイズした。米国特許第５，５００，
３４１号は、ｐ６１２３から誘導されたＭ．ｋａｎｎｓ
ａｓｉｉに特異的な増幅プライマーについて記載してい
る。

【０００５】本明細書中では、以下の言葉を次のように
定義する。

【０００６】増幅プライマーは、標的配列へハイブリダ
イゼーションさせた後、オリゴヌクレオチドを伸長させ
ることによって、または標的配列にハイブリダイズした
場合に近接する複数のオリゴヌクレオチドを連結させる
ことによって、標的配列を増幅させるオリゴヌクレオチ
ドである。増幅プライマーは、典型的には、約１０−７
５の長さのヌクレオチド、望ましくは約１５−５０の長
さのヌクレオチドである。ＳＤＡのための増幅プライマ
ーの全長は、典型的には約２５−５０ヌクレオチドであ
る。ＳＤＡ増幅プライマーの３’末端（標的結合配列）
は、標的配列の３’末端にハイブリダイズする。標的結
合配列は、約１０−２５の長さのヌクレオチドであり、
増幅プライマーにハイブリダイゼーション特異性を授け
る。ＳＤＡ増幅プライマーは、さらに、５’から標的結
合配列までに制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。
認識部位は、Ｇ．Ｗａｌｋｅｒら（１９９２、ＰＮＡ
Ｓ，８９：３９２−３９６および１９９２、Ｎｕｃｌ．
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０：１６９１−１６９６）に
よって記載されているように、認識部位が半修飾されて
いる場合にＤＮＡ二重らせんの一本鎖にニックを入れる
であろう制限エンドヌクレオアーゼのためのものであ
る。５’から制限エンドヌクレアーゼ認識部位までのヌ
クレオチド（”尾”）は、ＳＤＡ中に増幅プライマーの
残りの部分がニックを入れられ置換される場合のポリメ
ラーゼ再開始部位として機能する。尾ヌクレオチドの再
開始機能は、ＳＤＡ反応を保持しており、単一の標的分
子から複数のアンプリコンの合成を可能にする。尾は、
典型的には長さ約１０−２５のヌクレオチドである。そ
の長さおよび配列は、一般的に重要ではなく、ハイブリ
ダイゼーションの望みのＴｍを得るために、日常的仕事
で選択し修飾することができる。標的結合配列はその標
的特異性を決定付けるプライマーの部分であるので、標
的の末端に特定の配列を必要としない増幅法では、増幅
プライマーは一般的に、例えばＰＣＲまたはリガーゼ鎖
反応（ＬｉｇａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）
（ＬＣＲ）におけるように、実質上、標的結合配列のみ
からなる。標的（例えば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡまたは転
写に基づく増幅のためのＲＮＡポリメラーゼプロモータ
ー）に加えて特定の配列を必要とするＳＤＡ以外の増幅
法では、プライマーのハイブリダイゼーション特異性を
変えることなくオリゴヌクレオチドを調製する日常的方
法を用いて、必要とされる特定の配列を標的結合配列に
連結させることができる。

【０００７】バンパープライマーまたは外部プライマー
は、等温増幅反応でプライマー伸長生成物を置換するた
めに用いられるプライマーである。バンパープライマー
は、バンパープライマーの伸長物が下流の増幅プライマ
ーおよびその伸長生成物を置換するように、増幅プライ
マーの上流の標的配列にアニールする。

【０００８】プローブと言う言葉は、標的配列とハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドをさし、典型的にはそ
の検出を容易にする。プローブは、ポリメラーゼによっ
て伸長されることはない。プローブは、所望のハイブリ
ダイゼーション特異性を確保するために、典型的には少
なくとも約１０の長さのヌクレオチドであるが、所望の
特異性を保持する任意の長さであって良い。しかしなが
ら、便宜上、プローブは、通常約１０から約７５の長さ
のヌクレオチド、望ましくは約１５から約５０の長さの
ヌクレオチドである。プローブは、場合によっては、標
的配列とハイブリダイズした時にその検出および捕獲を
容易にする検出可能標識に連結され、そうすることによ
って標的配列の検出が容易になる。しかしながら、プラ
イマーおよびプローブは、多くの場合、構造的に類似し
ているかまたは同一である場合もあって良いことを、念
頭に置いておくべきである。プライマーおよびプローブ
と言う言葉は、オリゴヌクレオチドの機能をさす。即
ち、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、それが
標的配列を捕獲または検出するために用いられるなら
ば、プローブとしての機能を持ち、また、同一のオリゴ
ヌクレオチドが、（例えば、標的上にハイブリダイズし
たオリゴヌクレオチドを伸長させることによって、また
は標的にハイブリダイズした複数の近接オリゴヌクレオ
チドを連結することによって）標的配列を増幅するため
に用いられるならば、それはプライマーとしての機能を
持つことができるであろう。検出法が標的にハイブリダ
イズした後のオリゴヌクレオチドの伸長を利用するなら
ば、プライマーを標的配列を検出するために用いること
もできる。

【０００９】標的または標的配列と言う言葉は、増幅さ
れる核酸配列をさす。これらには、増幅される元来の核
酸配列およびその相補的な第二鎖ならびに増幅反応中に
生成した元来の標的配列のコピーのいずれかの鎖が含ま
れる。

【００１０】増幅反応中に生成した標的配列のコピー
は、増幅生成物、アンプリマーまたはアンプリコンと呼
ばれる。

【００１１】伸長生成物と言う言葉は、プライマーをハ
イブリダイゼーションし、さらに、標的配列を鋳型とし
て用いてポリメラーゼによってプライマーを伸長させる
ことによって生成した標的配列のコピーをさす。

【００１２】種特異的と言う言葉は、同じ属の他の種ま
たは異なる属の種を実質的に検出、増幅またはオリゴヌ
クレオチドハイブリダイゼーションすることなく、生物
体の種または関連する種の群を検出、増幅またはオリゴ
ヌクレオチドハイブリダイゼーションすることをさす。

【００１３】同一配列は、同一の相補的ヌクレオチド配
列にハイブリダイズするであろう。実質的に同一の配列
は、同じヌクレオチド配列ともハイブリダイズするそれ
らのヌクレオチド配列と非常に類似している。

【００１４】アッセイプローブと言う言葉は、核酸の検
出または同定を容易にするために用いられる任意のオリ
ゴヌクレオチドをさす。例えば、本発明では、アッセイ
プローブは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｋａｎｓａ
ｓｉｉ核酸の検出または同定に用いられる。検出プロー
ブ、検出プライマー、捕獲プローブおよびシグナルプラ
イマーは、以下に記載したように、アッセイプローブの
例である。

【００１５】Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ株の名称の内、略
語”ＬＣＤＣ”は、ｔｈｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏ
ｆＣａｎａｄｉａｎＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏ
ｌをさし、略語”ＴＭＣ”は、ｔｈｅＴｒｕｄｅａｕ
ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎをさ
す。ＴＭＣから得られた多くの株は、今ではｔｈｅＡｍ
ｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎからも入手することができる。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、核酸ハイブ
リダイゼーションアッセイでＭ．ｋａｎｎｓａｓｉｉ特
異的（即ち種特異的）であり、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉゲ
ノムで新たに同定されたフラグメントを提供する。フラ
グメントの配列決定および既知配列との相同性の検索か
ら、全長のフラグメント（ここに”ＫＡＴＳ１”と命名
する）も、またＫＡＴＳ１の１０の連続するヌクレオチ
ドを有する任意のサブ配列のいずれも、以前に同定され
ていなかったことが明らかになった。ＫＡＴＳ１ヌクレ
オチド配列から誘導されたプライマーおよびプローブ
は、それ故、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉに種特異性が高く、
最も良く保持されている領域から誘導されたそれらは、
典型的な株と典型的でない株の両方を検出する。ＫＡＴ
Ｓ１から誘導されたオリゴヌクレオチドは、従来技術の
プローブおよびプライマーよりも、偽りの陰性を示す可
能性が少なく、典型的なＭ．ｋａｎｓａｓｉｉおよびそ
うではないＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの両方に感受性を持
ち、かつ特異的である。

【００１７】

【課題を解決するための手段】ＫＡＴＳ１ＤＮＡフラ
グメントは、任意開始ＰＣＲ法（Ａｒｂｉｔｒａｒｉｌ
ｙＰｒｉｍｅｄＰＣＲ）（ＡＰ−ＰＣＲ、Ｊ．Ｗｅ
ｌｓｈら、１９９０、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．，１８，７２１３−７２１８）を用い、Ｍ．ｋａｎ
ｓａｓｉｉ株ＴＭＣ１２０１およびＬＣＤＣ７２４（そ
れぞれ、典型的な株およびそうではない株）、Ｍ．ｔｕ
ｂｅｒｕｌｏｓｉｓ（Ｈ３７Ｒｖ）、Ｍ．ａｖｉｕｍ
（ＣＤＣ３３）ならびにＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａ
ｒｅ（ＡＴＣＣ１３９５０）からの増幅生成物が異なる
表示を示すフラグメントとして同定された。ＡＰ−ＰＣ
Ｒプライマーは、ＣＧＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＣ
Ｔ（配列番号１）およびＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＡ
ＣＴＣＴ（配列番号２）：であった。１０ｍＭのＴＲＩ
Ｓ−ＨＣｌｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍ
ＭのＭｇＣｌ₂ 、０．００１％（ｗ／ｖ）のゼラチン、
０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、３．５μＭの³²Ｐで標識した
配列番号１、３．５μＭの³²Ｐで標識した配列番号２、
１ｎｇのゲノムＤＮＡ鋳型、および２．５ＵのＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼを含む５０μｌの反応物を調製し、
標的をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓｔｈｅ
ｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｍｏｄｅｌ４８０）内で増幅し
た。９５℃で３分間変性させた後、増幅反応を次のよう
なプロフィールで４０回繰り返した：９４℃で１分間；
３７℃で２分間；７２℃で２分間。熱循環の後、サンプ
ルを７２℃で７分間加熱し、４℃に一晩保存した。それ
ぞれの種および株の増幅生成物は、８％変性アクリルア
ミドゲル電気泳動（１００Ｗ）の後にオートラジオグラ
フィーによって可視化した。

【００１８】両方のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ株に存在する
が、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉでない種には存在しない唯一
のバンドを同定し、ＫＡＴＳ１と命名した。ＫＡＴＳ１
バンドをゲルから切り出し、１００μｌの蒸留無菌水中
で１５分間煮沸しエタノール沈殿することによって、Ｄ
ＮＡを抽出した。次のような熱循環プロフィール：９４
℃で１分間；６０℃で２分間；７２℃で２分間を３５
回：を用いて、５μｌの抽出ＤＮＡを、前記のようなＰ
ＣＲ法で再増幅させた。

【００１９】ＫＡＴＳ１フラグメントの種特異性は、
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの様々な株のゲノムＤＮＡおよび
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉでない様々なミコバクテリアのゲ
ノムＤＮＡとハイブリダイゼーションさせることによっ
て試験した。それぞれの生物体（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ
ＴＭＣ１２０１、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉＬＣＤＣ７
１１、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉＬＣＤＣ７１５、Ｍ．ｋ
ａｎｓａｓｉｉＬＣＤＣ７２４、Ｍ．ａｖｉｕｍＡ
ＴＣＣ２５２９１、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ
ＴＭＣ１４０６、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ
３７Ｒｖ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍＡＴＣＣ６８４
１、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍＡＴＣＣ１９９８
１、およびＭ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍＡＴＣＣ２７
５４８）のゲノムＤＮＡ１μｇを変性させ、ＺＥＴＡ
−ＰＲＯＢＥＧＴメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に
ブロットした。ＫＡＴＳ１フラグメントをランダム開始
標識（ｒａｍｄｏｍｐｒｉｍｅｄｌａｂｅｌｉｎ
ｇ）（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍからキ
ットの形で商品として入手可能）で標識し、ハイブリダ
イゼーションプローブとして用いる。ハイブリダイゼー
ション条件は、メンブレンの製造者の推薦の通りとし
た。試験したＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ株はすべて、ＫＡＴ
Ｓ１プローブとのハイブリダイゼーションで明らかに陽
性であったが、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉで以外の種は、す
べて明らかに陰性であった。

【００２０】次いで、製造者の指示に従って、ＫＡＴＳ
１フラグメントをＰＣＲＴＡ IIベクター（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。ＫＡＴＳ１挿入物の
存在は、ＥｃｏＲＩで制限消化し、それによるおおよそ
６５０塩基対の長さのＤＮＡフラグメントの遊離によっ
て確認した。次に、クローン化されたＫＡＴＳ１フラグ
メントの種特異性は、上記の方法に従って、ドットブロ
ットハイブリダイゼーションによって再度試験した。試
験した６種類のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ株（上記で試験し
た株に加えてＬＣＤＣ７１４およびＬＣＤＣ７２５を含
む）は、すべて明らかに陽性であり、典型的な株および
そうではない株の両方を検出するプローブとしてのＫＡ
ＴＳ１の用途が確認された。試験した１５種類のＭ．ｋ
ａｎｓａｓｉｉでない種（上記で試験した内、Ｍ．ｈａ
ｅｍｏｐｈｉｌｕｍを除くすべての種を含み、さらに次
の種：Ｍ．ａｖｉｕｍＣＤＣ３３、Ｍ．ａｖｉｕｍ
ＣＤＣ１６、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅＴＭＣ１５４３、
Ｍ．ｇａｓｔｒｉＬＣＤＣ１３０１、Ｍ．ｉｎｔｒａ
ｃｅｌｌｕｌａｒｅＡＴＣＣ１３９５０、Ｍ．ｉｎｔ
ｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅＬＣＤＣ１７０５、Ｍ．ｍａ
ｒｉｎｕｍＬＣＤＣ８０１、Ｍ．ｓｉｍｉａｅＣＤ
Ｃ２、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓＴＭＣ１５３３および
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＶＡ４４を加えた）
は、すべて明らかに陰性であった。試験されたミコバク
テリアでない種（Ａ．ｉｓｒａｅｌｉｉＡＴＣＣ１００
４９、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅＡＴＣＣ１１９３
１、Ｎ．ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓＡＴＣＣ３３０８、
Ｐ．ａｃｎｅｓＡＴＣＣ６９１９、Ｒ．ｒｈｏｄｏｃ
ｈｒｏｕｓＡＴＣＣ１３８０８およびＳ．ｓｏｍａｌ
ｉｅｎｓｉｓＡＴＣＣ１３２０１）もまたすべて、Ｋ
ＡＴＳ１とのハイブリダイゼーションで明らかに陰性で
あった。

【００２１】Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの典型的な株（ＴＭ
Ｃ１２０１）およびそうではない株（ＬＣＤＣ７２４）
の両方からのＫＡＴＳ１ＤＮＡフラグメントを含むプラ
スミドで形質転換された大腸菌は、ｔｈｅＡｍｅｒｉ
ｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）に、１
９９６年６月２７日、受託番号９８０９２（プラスミド
ＫＡＴＳ１−１２０１を含む）および受託番号９８０９
１（プラスミドＫＴＳ１−７２４を含む）で、寄託し
た。クローニングの後、ＰＣＲＴＡ IIベクター内に
位置するＴ７およびＳＰ６プロモーター用に設計したプ
ライマーを用いて、これらのＫＡＴＳ１ＤＮＡフラグメ
ントを配列決定した。配列決定は、ＡＢＩＰＲＩＳＭ
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｃｙｃｌｅｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、Ｐｅｒｋ
ｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌ
ｅｒＭｏｄｅｌ４８０およびＭｏｄｅｌ３７３
ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造者によって推薦された
プロトコールに従って、行われた。２種類の株から得ら
れたＫＡＴＳ１配列を、配列番号３（ＬＣＤＣ７２４）
および配列番号４（ＴＭＣ１２０１）に示す。これらの
２種類の株の配列を並べて比較し、相同性領域を同定
し、ＫＡＴＳ１の共通配列（配列番号５）を決定した。
ＫＡＴＳ１は、おおよそ５８％のＧＣを含む塩基組成を
持つ。典型的な株とそうではない株は、おおよそ９０％
の相同性を持ち、フラグメントの５’部分は、３’部分
より、より相同である。ＧＥＮＢＡＮＫに記載されてい
るミコバクテリアの５５５配列の内には、ＫＡＴＳ１と
相同の配列は見いだされなかった。同様に、ミコバクテ
リア以外の配列との相同性について、ＧＥＮＢＡＮＫ、
ＧＥＮＥＳＥＱおよびＥＭＢＬのデータベースを検索し
たところ、マッチするものは見いだされなかった。ま
た、１０の連続したヌクレオチドのＴＭＣ１２０１
ＫＡＴＳ１サブ配列を用いてＧＥＮＢＡＮＫ検索も行っ
た（１０ヌクレオチドを”ウインドウ”としてそれぞれ
の配列を検索するために一つずつシフトさせた）が、マ
ッチするものは見い出されなかった。それ故、ＫＡＴＳ
１配列内の約１０またはそれより多くの連続したヌクレ
オチドまたはその相補体からなるいかなるオリゴヌクレ
オチドも、アッセイプローブとしてまたは増幅プライマ
ーの標的結合配列として用いた場合、Ｍ．ｋａｎｓａｓ
ｉｉに特異的であろうと期待される。ＫＡＴＳ１の読み
枠の検索から、このＤＮＡフラグメントはタンパク質を
コードしていないことが示唆された。

【００２２】ＫＡＴＳ１特異的ＰＣＲプライマーは、Ｔ
ＭＣ１２０１およびＬＣＤＣ７２４の配列分析に基づい
て設計した。３’プライマーは、ＣＧＡＡＧＣＣＧＡＡ
ＣＣＴＣＡＴＴＧ（配列番号６）であり、２種類の可変
の５’プライマーは、ＣＴＣＧＧＴＧＣＣＧＡＴＧＡＧ
ＧＴ（配列番号７）およびＣＣＧＡＴＧＡＧＧＴＴＧＣ
ＣＧＴＡＴＴＣＧ（配列番号８）である。配列番号６お
よび配列番号７は、環境より単離した株、Ｔ９２９４お
よびＴ８５９４を除くすべての株を増幅するために用い
られた。これらの２種類の株は、配列番号７の結合部位
は典型的でない株にあまり高く保持されていない領域に
あるので、配列番号６および配列番号８を用いて増幅さ
せた。ＰＣＲは、ゲノムＤＮＡの起源として次のＭ．ｋ
ａｎｓａｓｉｉ株：ＴＭＣ１２０１、ＬＣＤＣ７１１、
ＬＣＤＣ７１４、ＬＣＤＣ７１５、ＬＣＤＣ７２４、Ｌ
ＣＤＣ７２５、Ｔ１４９２、Ｔ１６８９、Ｔ１０８９
２、Ｔ１８４９２、Ｔ１１７９２、５Ｃ８２４６、Ｔ８
５９４およびＴ９２９４：を用いて、上にＫＡＴＳ１再
増幅法として記載した方法に従って、実質上成し遂げら
れた。ＫＡＴＳ１は、典型的な株とそうでない株の両方
を含む１４株のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのすべてで、増幅
に成功した。

【００２３】ＫＡＴＳ１増幅生成物（ＬＣＤＣ７１５お
よびＬＣＤＣ７２５のそれらを除く）は、上記の方法に
従って、配列決定した。配列は、内部および外部配列決
定プライマーを用いる複数の配列決定反応によって、決
定された。

【００２４】

【表１】

【００２５】さらに、１０のＫＡＴＳ１配列が、このよ
うにして得られた（配列番号１１−２０）。７配列（Ｌ
ＣＤＣ７１１、ＬＣＤＣ７１４、Ｔ１６８９、Ｔ１０８
９２、Ｔ１８４９２、Ｔ１１７９２および５Ｃ８２４
６）を、ＴＭＣ１２０１およびＬＣＤＣ７２４とアライ
ンすると、約８０％の相同性を示した。これらの株の共
通配列を決定した（配列番号２１）。

【００２６】ＫＡＴＳ１およびその少なくとも約１０の
連続するヌクレオチドのサブ配列の種特異性は、Ｍ．ｋ
ａｎｓａｓｉｉの典型的な株およびそうでない株のより
広い範囲で、ＰＣＲ法によって確認された。５０μｌの
反応混合物およびＰＣＲ法のプロフィールは、２．０μ
Ｍのそれぞれのプライマーおよび１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ
が存在することを除いて、ＫＡＴＳ１の再増幅に用いた
ものと同じである。４７株のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉは、
それぞれ２種類のＰＣＲ法で、それぞれ増幅させた。そ
れぞれのＰＣＲ反応には、以下に示すように、配列番号
６／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、および配
列番号６／配列番号２２（ＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＴＣＧ
ＡＧＧＣ）から選択された異なるプライマー対、二対の
内の一対を用いた。

【００２７】

【表２】

【００２８】Ｔ９０９４およびＴ９９４を除く典型的な
株およびそうでない株は、すべて、両方のプライマー対
で明らかに増幅され、ＫＡＴＳ１およびＫＡＴＳ１から
誘導されたプライマー／プローブの種特異性の程度の高
さが確認された。Ｔ９０９４およびＴ９９４は、一つの
プライマー対（配列番号９／配列番号１０）では陰性で
あったが、他の対（配列番号６／配列番号２２）では陽
性であった。これら２株のＫＡＴＳ１フラグメントは、
配列決定されていないが、配列番号９は、他の典型的で
ない株の内のわずかな可変領域内にある。より保存され
た領域の別のプライマーで置換することによって、時と
して起こるそのような増幅の不成功は、解決されるはず
である。

【００２９】同様の増幅反応を用いて、以下のミコバク
テリアの内のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ種以外の２２株およ
びミコバクテリア以外の近い関係にある６株の交差反応
性について評価した：Ｍ．ａｖｉｕｍＡＴＣＣ２５２
９１、Ｍ．ａｖｉｕｍＣＤＣ３３、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎ
ａｅＴＭＣ１５４３、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍＡＴ
ＣＣ６８４１、Ｍ．ｇａｓｔｒｉＬＣＤＣ１３０１、
Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅＴＭＣ１３１８、Ｍ．ｇｏｒｄｏ
ｎａｅＡＴＣＣ１４４７０、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌ
ｕｌａｒｅＡＴＣＣ１３９５０、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅ
ｌｌｕｌａｒｅＬＣＤＣ１７０５、Ｍ．ｍａｒｉｎｕ
ｍＬＣＤＣ８０１、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉＬＣＤＣ２
０３、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍＢＤＤＩＳ２４
０４、Ｍ．ｓｉｍｉａｅＣＤＣ２、Ｍ．ｓｍｅｇｍａ
ｔｉｓＴＭＣ１５３３、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓＨ３７Ｒｖ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＶＡ
４４、Ａ．ｉｓｒａｅｌｉｉＡＴＣＣ１００４９、
Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅＡＴＣＣ１１９３１、
Ｎ．ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓＡＴＣＣ３３０８、Ｐ．ａ
ｃｎｅｓＡＴＣＣ６９１９、Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏ
ｕｓＡＴＣＣ１３８０８およびＳ．ｓｏｍａｌｉｅｎ
ｓｉｓＡＴＣＣ１３２０１。ゲノム標的は、配列番号
６／配列番号８および配列番号９／配列番号１０プライ
マー対の両方を用い、上に記載したＰＣＲ反応で増幅さ
せた。増幅生成物は、いかなるサンプルでも検出され
ず、ＫＡＴＳ１およびＫＡＴＳ１より誘導されたプライ
マー／プローブの種特異性が確認された。

【００３０】ＳＤＡに用いられるプライマーおよびプロ
ーブもまた、ＫＡＴＳ１配列に基づいて設計され、種特
異性、交差反応性および感受性について増幅反応で試験
した。プライマーおよびプローブを以下の表に示す。制
限エンドヌクレアーゼ認識部位（この例ではＢｓｏＢ
Ｉ）を太字で示し、増幅プライマーの標的結合配列をイ
タリック体で示している。

【００３１】

【表３】

【００３２】上流および下流の増幅プライマー対の組み
合わせのすべてをバンパープライマー対の組み合わせの
すべてと共に、４種類のＳＤＡ反応条件で試験し、最良
のプライマー組み合わせを同定し、増幅反応を最適化し
た。

【００３３】

【表４】

【００３４】株ＬＣＤＣ７２４、ＴＭＣ１２０１、Ｔ８
５９４およびＴ１０８９２を、増幅用に選択した。ｔＳ
ＤＡプロトコールは、実質上、ＥＰ０６８４３１
５に記載されている方法に従った。すべての増幅プライ
マー対は、試験したほとんどの反応条件下、典型的な株
およびそうでない株の両方で検出可能な増幅生成物を生
成した。最も有効な増幅は、配列番号２３および配列番
号２８、反応条件Ｄで得られた。次いで、これらの増幅
プライマーおよび反応条件をさらなる研究のために選択
し、左および右のバンパープライマーの対の組み合わせ
のすべてについて評価した。この実験では、配列番号２
９および配列番号３０が、典型的な株およびそうではな
い株の両方の株で最も効率良く増幅されたが、バンパー
組み合わせはすべて、この反応において効率よく機能し
た。同様の試験では、すべてのディテクタープローブか
ら満足できる結果が得られたが、配列番号３７が最も有
効なディテクターオリゴヌクレオチドであることが分か
った。

【００３５】増幅プライマー配列番号２３および配列番
号２８を用いてｔＳＤＡアッセイのの感受性を測定する
ために、ゲノムの滴定実験を行った。Ｍ．ｋａｎｓａｓ
ｉｉの典型的な株、１種類（ＴＭＣ１２０１）、および
典型的でない株、２種類（Ｔ８５９４およびＴ１０８９
２）から単離したゲノムをヒト胎盤ＤＮＡで希釈し、１
０⁴、１０³、１０²、１０および１ゲノムの初発標的レ
ベルを得た。ｔＳＤＡ反応は、反応Ｄの条件、最も効率
の高いバンパーおよびディテクターを用い、上記の方法
に従って行った。典型的でない株Ｔ１０８９２のオート
ラジオグラフィーでは、最少１０ゲノムコピーが検出可
能であり、ＴＭＣ１２０１およびＴ８５９４では、最少
１００ゲノムコピーが検出可能であった。それ故、アッ
セイの感受性は、Ｔ１０８９２では１から１０の間のゲ
ノムコピー、ＴＭＣ１２０１およびＴ８５９４では１０
から１００の間のゲノムコピーである。

【００３６】同じプライマーおよびプローブの最適セッ
トをｔＳＤＡに用い、さらに種特異性および交差反応性
について評価した。交差反応性分析用にプールされた鋳
型を用い、上記の方法に従って、様々な典型的なＭ．ｋ
ａｎｓａｓｉｉ株およびそうではない株を試験した。プ
ールした交差反応性反応では、５種類のＭ．ｋａｎｓａ
ｓｉｉ以外の株のそれぞれ１０⁷ゲノムを、増幅させる
ために一つのサンプル中に混合した。プールしたサンプ
ル中で増幅が阻害されることによる誤った陰性を同定す
るために、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ以外のプールを含む対
照サンプルおよび２ｘ１０⁴ ゲノムコピーのＭ．ｋａｎ
ｓａｓｉｉＴＭＣ１２０１を増幅させた。４種類のそ
のようなプール（２０種類のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ以外
の種）およびそれらと関連する対照を、Ｄ反応条件下、
上記の方法に従って、増幅させた。試験したＭ．ｋａｎ
ｓａｓｉｉ株は、ＴＭＣ１２０１、ＬＣＤＣ７１１、Ｌ
ＣＤＣ７１４、Ｔ１６８９、Ｔ１０８９２、ＬＣＤＣ７
２５、Ｔ８４９４、ＬＣＤＣ７２４、Ｔ１１７９２、５
Ｃ８２４６、４６９９、５２９２、Ｔ５９９３、Ｔ６８
６、Ｔ７１９３、Ｔ７８５、Ｔ８３９４、Ｔ８７９４、
Ｔ８８９４、Ｔ９６９４、Ｔ９１９４およびＴ９４９４
である。試験したＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ以外の種は、
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒｖ、Ｍ．ｇｏ
ｒｄｏｎａｅＡＴＣＣ１４４７０、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ
ＬＣＤＣ１３０１、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍＬＣＤＣ８０
１、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓＴＭＣ１５３３（プール
１）；Ｍ．ａｖｉｕｍＣＤＣ３３、Ｍ．ｉｎｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒｅ１１３５０、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ
ＴＭＣ１５４３、Ｍ．ｓｉｍｉａｅＣＤＣ２、Ｍ．
ｘｅｎｏｐｉ１４８２（プール２）；Ｍ．ｆｏｒｔｕ
ｉｔｕｍ２８０８、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉＬＣＤＣ２
０３、Ｍ．ｃｅｌａｔｕｍ５１１３１、Ｍ．ｓｃｒｏ
ｆｕｌａｃｅｕｍ１９９８１およびＰ．ａｃｎｅｓ
ＡＴＣＣ６９１９（プール３）；Ａ．ｉｓｒａｅｌｉｉ
ＡＴＣＣ１００４９、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ
ＡＴＣＣ１１９１３、Ｎ．ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓＡＴ
ＣＣ３３０８、Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓＡＴＣＣ
１３８０８およびＳ．ｓｏｍａｌｉｅｎｓｉｓ３３２
１０（プール４）である。増幅生成物は、２２種類の
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ株のすべてで、容易に検出でき、
それぞれの株で等しい強度の信号が認められた。Ｍ．ｋ
ａｎｓａｓｉｉ以外の標的のプールされたサンプルで
は、それぞれ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ標的をも含む陽性
の対照を除いて、増幅は陰性であった。

【００３７】ＫＡＴＳ１またはその相補体から誘導され
たプライマーおよびプローブを用いたＭ．ｋａｎｓａｓ
ｉｉ増幅特異性についての前述の試験は、ＰＣＲおよび
ｔＳＤＡの両方で１００％陽性であった。Ｍ．ｋａｎｓ
ａｓｉｉ以外の種に関して、増幅は１００％陰性である
ことが分かった。

【００３８】ハイブリダイズするために核酸が完全に相
補性である必要はないので、本明細書中に開示されたプ
ローブおよびプライマーの配列は、種特異性を失うこと
なく、また、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ特異的プローブおよ
びプライマーとしての用途を失うことなく、本明細書中
に開示されたＫＡＴＳ１配列と実質的に同一であるよう
に、修飾することができることを理解すべきである。こ
の技術分野で知られているように、相補的なおよび部分
的に相補的な核酸配列のハイブリダイゼーションは、厳
密性を増加または減少させるハイブリダイゼーション条
件を調節する（即ち、ハイブリダイゼーションの温度ま
たはバッファーの塩含有量を調節する）ことによって、
行うことができる。開示した配列のちょっとしたそのよ
うな修飾も同じであり、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ特異性を
維持するためのハイブリダイゼーション条件の任意の必
要な調節は、日常実験のみを必要とし、当業者の技術範
囲内にある。

【００３９】本発明のプライマーを用いて生成させた
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ特異的増幅生成物は、特徴ある大
きさによって、例えば、ポリアクリルアミドまたはアガ
ロースゲルを臭化エチジウムで染色することによって、
検出することができる。また、アッセイプローブを用い
ることによって、サンプル中のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ核
酸または特異的に増幅されたＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ標的
配列を検出することもできる。本発明のアッセイプロー
ブは、ＫＡＴＳ１配列またはその相補体の少なくとも約
１０の連続したヌクレオチドからなる。プローブの長さ
は、最大で、具体的なＫＡＴＳ１配列または選択された
ＫＡＴＳ１共通配列の長さである。即ち、ＴＭＣ１２０
１ＫＡＴＳ１配列から誘導されたプローブ（配列番号
４）は、約１０−６５５の長さのヌクレオチドであり、
ＬＣＤＣ７２４ＫＡＴＳ１配列から誘導されたプロー
ブ（配列番号３）では、約１０−６５６の長さのヌクレ
オチドであり、ＬＣＤＣ７２４／ＴＭＣ１２０１共通配
列から誘導されたプローブ（配列番号５）では、約１０
−６５８の長さのヌクレオチドである。本明細書に記載
しさらにＳＥＱＵＥＮＣＥＬＩＳＴＩＮＧに示した上
記以外の株のＫＡＴＳ１配列から誘導されたアッセイプ
ローブは、長さ約１０−６０５のヌクレオチド（配列番
号１１、１２、１４、１７および１８）、長さ約１０−
６０４のヌクレオチド（配列番号１５）、長さ約１０−
６０２のヌクレオチド（配列番号１６）、長さ約１０−
６０６のヌクレオチド（配列番号１３）、長さ約１０−
５４０のヌクレオチド（配列番号１９）、長さ約１０−
５５８のヌクレオチド（配列番号２０）である。共通配
列（配列番号２１）から誘導されたアッセイプローブ
は、長さ約１０−６６１のヌクレオチドである。配列相
同性の検索をＫＡＴＳ１配列の１０の連続したヌクレオ
チドからなるすべてのサブ配列について行い、相同性は
見いだされなかったので、そのようなプローブのすべて
が、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ特異性を保持していると予想
される。任意のこれらの配列から誘導されたアッセイプ
ローブは、典型的には、約１０−７５の長さの連続した
ヌクレオチドであり、望ましくは約１５−５０の連続ヌ
クレオチドである。

【００４０】増幅生成物を検出した場合、アッセイプロ
ーブは、典型的には、増幅プライマーの間にある配列と
ハイブリダイズするように選択される、即ち、それは、
一般的には、内部プローブである。また、標識された増
幅プライマーを、アッセイプローブとして用いることも
できる。一つの実施態様では、標的配列を検出するため
に、標識した増幅プライマーまたは標識した内部アッセ
イプローブを、Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，上記の方法に従って、標的配列（ディテクタ
ープライマー）に沿って伸長させる。

【００４１】アッセイプローブの検出可能標識とは、直
接または間接のいずれかで、標的核酸の存在の指示薬と
して検出することのできる部分である。標識を直接検出
するために、アッセイプローブをラジオアイソトープで
標識してオートラジオグラフィーによって検出するか、
または、蛍光部分で標識してこの技術分野で既知の方法
に従って蛍光によって検出することができる。また、ア
ッセイプローブは、それを検出可能にするさらなる試薬
を必要とする標識で標識することによって、間接的に検
出することもできる。間接的な検出可能標識には、例え
ば、化学発光剤、可視反応生成物を生成する酵素、およ
び標識された特異的結合パートナー（例えば、抗体また
は抗原／ハプテン）と結合することによって検出するこ
とのできるリガンド（例えば、ハプテン、抗体または抗
原）が含まれる。リガンド標識もまた、オリゴヌクレオ
チドの固相捕獲（捕獲プローブ）に有用である。特に有
用な標識には、ビオチン（標識されたアビジンまたはス
トレプトアビジンと結合することによって検出できる）
および西洋わさびのペルオキシダーゼまたはアルカリホ
スファターゼのような酵素（酵素基質を加えて有色の反
応生成物を生成させることによって検出できる）が含ま
れる。オリゴヌクレオチドにそのような標識を加える、
またはそのような標識を含ませる方法は、この技術分野
で熟知されており、いかなるこれらの方法も、本発明に
おいて、用いるに適当である。

【００４２】用いることのできる具体的な検出法の例と
しては、米国特許第５，４７０，７２３号に記載のよう
に、ビオチニル化捕獲プローブおよび酵素結合ディテク
タープローブを用いて増幅された生成物を検出する化学
発光法が含まれる。標的配列（２つの増幅プライマーの
結合部位の間にある）のアッセイ領域内の異なる部位に
これらの２つのアッセイプローブをハイブリダイゼーシ
ョンさせた後、複合体をストレプトアビジンでコートし
たミクロタイタープレートで捕獲し、さらに化学発光信
号を発生させ、蛍光測定器で測定した。増幅生成物を検
出するためのもう一つの代替法として、ＥＰ０６７８
５８２に記載のシグナルプライマーを、増幅反応に加
えることもできる。この実施態様では、標識された二次
増幅生成物は、標的増幅依存方式で増幅中に生成され、
関連標識による標的増幅表示として検出することができ
る。

【００４３】商業的に便利なものにするために、Ｍ．ｋ
ａｎｓａｓｉｉ核酸を種特異的に検出し同定するための
本発明のＫＡＴＳ１プライマーまたはプローブは、一つ
のキットの形にパッケージしても良い。典型的には、そ
のようなキットは、本発明の少なくとも一対の増幅プラ
イマーまたは少なくとも一つのアッセイプローブを含
む。核酸増幅またはハイブリダイゼーション反応を行う
ための試薬、例えば、バッファー、付加プライマーまた
はプローブ、ヌクレオチド、酵素等、もまたキットに含
ませることができる。キット構成成分は、一つの共通の
容器内に一緒にパッケージされ、所望であれば本発明の
方法の選択された実施態様を成し遂げるための指示をも
含む。所望であれば、検出用構成成分、即ち、第二アッ
セイプローブおよび／または標識検出を行うための試薬
あるいは手段、もまた、キットの中に含ませることがで
きる。

【００４４】増幅プライマーの標的結合配列は、オリゴ
ヌクレオチドにハイブリダイゼーション特異性を与え、
それ故、本発明の方法に種特異性を提供する。所望であ
れば、増幅反応の遂行に必要な他の配列を選択して、増
幅反応の種特異性を変化させることなく、ここに開示さ
れる標的結合配列に付加することができる。例として、
本発明のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ−特異的増幅プライマー
は、ＳＤＡ反応中にニックを入れる制限エンドヌクレア
ーゼＢｓｏＢ１の認識部位を含むことができる。他のニ
ックを入れることのできる制限エンドヌクレアーゼ認識
部位をＢｓｏＢ１認識部位に置換できることは、当業者
に明らかであり、それらの認識部位は、これらに限定さ
れるわけではないが、ＥＰ０６８４３１５および
米国特許第５，４５５，１６６号に開示されているそれ
らを含む。増幅反応を好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）条件下
で行うことができるように、認識部位は、好熱性制限エ
ンドヌクレアーゼに関するものであることが望ましい。
ＳＤＡ増幅プライマーの尾もまた、増幅に必要である
が、その配列は一般的に重要ではない。しかしながら、
ＳＤＡに用いられる制限部位を含むことをさけること、
および、それら自身の標的結合配列またはその他のプラ
イマーのいずれかにハイブリダイズするであろう配列を
さけることが、重要である。それ故、本発明のＳＤＡ増
幅プライマーは、ここに開示したＫＡＴＳ１配列の約１
０−２５の連続するヌクレオチドまたはその相補体
（３’標的結合配列）、ニックを入れることのできる制
限エンドヌクレオチド認識部位（５’から標的結合配
列）、および約１０−２５の長さのヌクレオチドの尾配
列（５’から制限エンドヌクレアーゼ認識部位）を有す
る。ニックを入れることのできる制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位および尾配列は、ＳＤＡ反応に必要な配列で
ある。他の増幅反応のためには、本発明の増幅プライマ
ーは、ＫＡＴＳ１配列の約１０−７５の連続ヌクレオチ
ドまたはその相補体、望ましくは約１５−５０の連続ヌ
クレオチド（例えば、ＰＣＲまたはＬＣＲ用）のみから
なっていても良い。また、本発明の増幅プライマーは、
ＫＡＴＳ１の約１０−７５の連続するヌクレオチドまた
はその相補体、および選択された増幅反応に必要とされ
るこの技術分野で既知のさらなる配列（例えば、３ＳＲ
のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモータ
ー）を有することができる。ＬＣＲでは、ＫＡＴＳ１ま
たはその相補体に近接する２つまたはそれより多く標的
結合配列、それぞれ長さ約１０−７５のヌクレオチド
が、ＫＡＴＳ１標的配列にハイブリダイズした場合に共
に結合することのできる複数の増幅プライマーを調製す
るために、必要である。

【００４５】大多数の種特異的ＳＤＡ反応では、バンパ
ープライマーが種特異的であることは必要条件ではな
い、なぜなら、バンパプライマーの機能は下流の種特異
的増幅プライマーを置き換えることにあるからである。
バンパプライマーは、それらが伸長される場合に増幅プ
ライマーおよびその伸長生成物を置換するであろうため
に、増幅プライマーより上流で標的にハイブリダイズす
ることが要求されるのみである。それ故、バンパープラ
イマーの特定の配列は、一般的に重要ではなく、バンパ
プライマー伸長時に増幅プライマー伸長生成物の置換を
可能にするように、増幅プライマーの結合部位に充分近
い位置にある上流の標的配列から任意に誘導することが
できる。時折起こるであろうバンパープライマー配列の
標的とのミスマッチまたは標的でない配列とのあるクロ
スハイブリダイゼーションは、バンパープライマーが特
異的標的配列とハイブリダイズする能力を保持している
限り、一般的には、増幅効率に負の影響を与えない。し
かしながら、本発明では、バンパーはまた、ＫＡＴＳ１
配列の少なくとも約１０の連続するヌクレオチドまたは
その相補体からなり、それ故、すべてのＫＡＴＳ１バン
パープライマーもまた、種特異的であろう。それ故、Ｋ
ＡＴＳ１から誘導されたバンパープライマーはすべて、
増幅プライマーの標的結合配列として、またはアッセイ
プローブとしてもまた、有用であり、逆もまた真であ
る。

【００４６】本発明のプライマーを用いる増幅反応は、
Ｗａｌｋｅｒら、上記に記載の通り、チミンを取り込む
ことができる、かまたは、例えば、ＥＰ０６２４
６４３に記載の通り、反応中に２’−デオキシウリジン
５’−トリホスフェートの全体または一部をＴＴＰで置
換して、続いて起こる増幅反応の交差汚染を減少させる
ことができる。ｄＵ（ウリジン）は、増幅生成物内に取
り込まれが、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）
で処理することによって除去することができる。これら
の非塩基性部位は、次に起こる増幅反応で、増幅生成物
を増幅不可能にする。ＵＤＧは、次の増幅を行う前に、
ウラシルＤＮＡグルコシラーゼインヒビター（Ｕｇｉ）
によって不活性化し、新たに形成された増幅生成物内で
のｄＵの摘出を防ぐ。

【００４７】ＫＡＴＳ１の１０の連続するヌクレオチド
サブ配列はすべてユニークであると考えられるので、本
明細書中に開示された任意のＫＡＴＳ１配列の少なくと
も約１０の連続するヌクレオチドおよびその相補体をも
とにしたいかなるプローブもまた、ユニークで、かつ
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ−特異的であるはずである。同様
に、ＫＡＴＳ１の１０ヌクレオチドサブ配列のすべてが
ユニークであるらしいと言う事実から、本明細書に開示
した任意のＫＡＴＳ１配列の約１０−７５の連続するヌ
クレオチドおよびその相補体、望ましくは約１５−５０
の連続するヌクレオチドの配列は、そのいかなる配列も
Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ特異的増幅プライマー用の標的結
合配列として用いることができる。さらに、本発明に開
示した任意のＫＡＴＳ１配列およびその相補体の任意の
近接するセグメントは、それぞれ約１０−７５の長さの
連続したヌクレオチドであり、連結可能なＭ．ｋａｎｓ
ａｓｉｉ特異的ＬＣＲ増幅プライマーの標的結合配列と
して用いることができる。

【００４８】

【配列表】

【００４９】(2) 配列情報 SEQ ID NO:1: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 18 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:1: CGTCATGCTG AAGTCCCT 18

【００５０】(2) 配列情報 SEQ ID NO:2: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 18 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:2: TCTGTCTCCT GGCACTCT 18

【００５１】(2) 配列情報 SEQ ID NO:3: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 656 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (B) 株名: LCDC724 (xi) 配列: SEQ ID NO:3: GGTCGCGTAA CTCGGTGCCG ATGAGGTCGC CGTATTCGTA GGCGATTTCG GGATCCCAGC 60 TCGAGGCCTC GGCCACACCG GAAGGCAGCG CCGTGGAATA GCGGCTACGC GGTGCTCCAC 120 GGGCAACACC AACGGCGGCA TCGGACATCT GCAGGTCGGG AATCCCCAAG CGTTCAATAC 180 CGGGAATAAA ACCCGCGCCC CCAAGAGAAC GCACGCCAGG CACTGACGTG GCTCCCTCAA 240 GGAGAGTCCG CCATCCCAAG CCGTGAAGCA ATTGCACTTT TTCGTCGAGC GTCATCTGCT 300 GGATGACCAG ATCGGCCCGC TCATCAGGAG AGAGGTATTT GTTTTCCCAT GGGCGTTCGG 360 GTGCGGCATT TACCGGTTGT CTGAATTGCG TGTACATTGG GGCCGAGGCG ACAAGAAAGA 420 AGAATGCCAG TATTAAATTA GCTGCTTTCA GCAGGGACCT GCGCAGAATC ATCGATTGCG 480 CTCCAGAAAT CTCGTCAGAT CGATCAGCTC CTCCGTTTCG GTTTTGACTT CCTGGGAAAT 540 CATCGACCAT CGCGGCCGGC CGAACCAGAT CACGTGCTCC GAGCTTGCGC TCGTAGGCAA 600 TGAGGTTCGG CTTCGCCCGG TCTCCAGTAA AGAGCCTTTG ACCCTGATGC GTTTCC 656

【００５２】(2) 配列情報 SEQ ID NO:4: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 655 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (B) 株名: TMC1201 (xi) 配列: SEQ ID NO:4: GGTCGCGAAG CTCGGTGCCG ATGAGGTTGC CGTATTCGTA TGCGATTTCT GGATCCCAGC 60 TCGAGGCTTC AGCCACGCCG GAAGGCAGCG CCGTGGAATA GCGGCTACGC GGGGCTCCAC 120 GCGCAACACC AACGGCGGCA TCGGACATCT GCAGGTCTGG AATCCCCAAG CGCTCGATAC 180 CGGGGATGAA ACCCGCGCCC CCAAGAGGGC GCACACCAGG CACTGACGTG GTTCCCTCAA 240 GAAGGATCCG CCATCCCAAG CCGTGAAGCA ACTGCACTTT TTCGTCGAGC GTCATCTGCT 300 GGATGACCAG ATCAGCCCGC TCATCCGGAG AGAGATATTT GTTTTCCCAT GGGCGTATGG 360 GCCCGGTATT TATGGGCTGT CCGAATTGCG TGTAGATTGG AGCCGAGGCG GCAAGAAAGA 420 GGAACGCCAG TAGGAGATTC GCTGCTTTCA GCAAAGACCT GCGCATAATC ATCTATCGTG 480 CTCCATAAAC CTCGTCAGAC CGATCAGCTC CTATCGTTTC GGTTTTGCTT CCTTGTGCAC 540 CATCGACCAT CGCAACCAGG CCACCAGATC ACCCGCTGCG CGCCTGCGCT TGTAGGCAAT 600 GAGGTTCGGC TTCGCCCGTT CTCCAGTAAA GGGCCTTTGG CCCTGATGCG TTTCC 655

【００５３】(2) 配列情報 SEQ ID NO:5: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 658 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:5: GGTCGCGWAR CTCGGTGCCG ATGAGGTYGC CGTATTCGTA KGCGATTTCK GGATCCCAGC 60 TCGAGGCYTC RGCCACRCCG GAAGGCAGCG CCGTGGAATA GCGGCTACGC GGKGCTCCAC 120 GSGCAACACC AACGGCGGCA TCGGACATCT GCAGGTCKGG AATCCCCAAG CGYTCRATAC 180 CGGGRATRAA ACCCGCGCCC CCAAGAGRRC GCACRCCAGG CACTGACGTG GYTCCCTCAA 240 GRAGRRTCCG CCATCCCAAG CCGTGAAGCA AYTGCACTTT TTCGTCGAGC GTCATCTGCT 300 GGATGACCAG ATCRGCCCGC TCATCMGGAG AGAGRTATTT GTTTTCCCAT GGGCGTWYGG 360 GYSCGGYATT TAYSGGYTGT CYGAATTGCG TGTASATTGG RGCCGAGGCG RCAAGAAAGA 420 RGAAYGCCAG TAKKARATTM GCTGCTTTCA GCARRGACCT GCGCAKAATC ATCKATYGYG 480 CTCCAKAAAY CTCGTCAGAY CGATCAGCTC CTAYCGTTTC GGTTTTGACT TCCTKGKRMA 540 YCATCGACCA TCGCRRCCAG GCCGAACCAG ATCACSYGCT SCGMGCYTGC GCTYGTAGGC 600 AATGAGGTTC GGCTTCGCCC GKTCTCCAGT AAAGRGCCTT TGRCCCTGAT GCGTTTCC 658

【００５４】(2) 配列情報 SEQ ID NO:6: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 18 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:6: CGAAGCCGAA CCTCATTG 18

【００５５】(2) 配列情報 SEQ ID NO:7: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 17 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:7: CTCGGTGCCG ATGAGGT 17

【００５６】(2) 配列情報 SEQ ID NO:8: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:8: CCGATGAGGT TGCCGTATTC G 21

【００５７】(2) 配列情報 SEQ ID NO:9: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 20 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:9: CAAGAAGGAT CCGCCATCCC 20

【００５８】(2) 配列情報 SEQ ID NO:10: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 19 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:10: ACGCCCATGG GAAAACAAA 19

【００５９】(2) 配列情報 SEQ ID NO:11: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 605 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (B) 株名: LCDC711 (xi) 配列: SEQ ID NO:11: CTCGGTGCCG ATGAGGTTGC CGTATTCGTA TGCGATTTCT GGATCCCAGC TCGAGGCTTC 60 AGCCACGCCG GAAGGCAGCG CCGTGGAATA GCGGCTACGC GGGGCTCCAC GCGCAACACC 120 AACGGCGGCA TCGGACATCT GCAGGTCTGG AATCCCCAAG CGCTCGATAC CGGGGATGAA 180 ACCCGCGCCC CCAAGAGAGC GCACACCAGG CACTGACGTG GTTCCCTCAA GAAGGATCCG 240 CCATCCCAAG CCGTGAAGCA ACTGCACTTT TTCGTCGAGC GTCATCTGCT GGATGACCAG 300 ATCAGCCCGC TCATCCGGAG AGAGATATTT GTTTTCCCAT GGGCGTATGG GCCCGGTATT 360 TATGGGCTGT CCGAATTGCG TGTAGATTGG AGCCGAGGCG GCAAGAAAGA GGAACGCCAG 420 TAGGAGATTC GCTGCTTTCA GCAAAGACCT GCGCATAATC ATCTATCGTG CTCCATAAAC 480 CTCGTCAGAC CGATCAGCTC CTATCGTTTC GGTTTTGGCT TCCTTGTGCA CCATCGACCA 540 TCGCAACCAG GCCACCAGAT CACCCGCTGC GCGCCTGCGC TTGTAGGCAA TGAGGTTCGG 600 CTTCG 605

【００６０】(2) 配列情報 SEQ ID NO:12: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 605 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (B) 株名: LCDC714 (xi) 配列: SEQ ID NO:12: CTCGGTGCCG ATGTGGTTGC CGTATTCGTA TGCGATTTCT GGATCCCAGC TCGAGGCTTC 60 AGCCCACGCC GGAAGGCAGC GCCGTGGAAT AGCGGCTACG CGGGGCTCCA CGCGCAACAC 120 CAACGGCGGC ATCGGACATC TGCAGGTCTG GAATCCCCAA GCGCTCGATA CCGGGGATGA 180 AACCCGCGCC CCCAAGAGAG CGCACACCAG GCACTGACGT GGTTCCCTCA AGAAGGATCC 240 GCCATCCCAA GCCGTGAAGC AACTGCACTT TTTCGTCGAG CGTCATCTGC TGGATGACCA 300 GATCAGCCCG CTCATCCGGA GAGAGATATT TGTTTTCCCA TGGGCGTATG GGCCCGGTAT 360 TTATGGGCTG TCCGAATTGC GTGTAGATTG GAGCCGAGGC GGCAAGAAAG AGGAACGCCA 420 GTAGGAGATT CGCTGCTTTC AGCAAAGACC TGCGCATAAT CATCTATCGT GCTCCATAAA 480 CCTCGTCAGA CCGATCAGCT CCTATCGTTT CGGTTTTGCT TCCTTGTGCA CCATCGACCA 540 TCGCAACCAG GCCACCAGAT CACCCGCTGC GCGCCTGCGC TTGTAGGCAA TGAGGTTCGG 600 CTTCG 605

【００６１】(2) 配列情報 SEQ ID NO:13: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 606 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (B) 株名: T1492 (xi) 配列: SEQ ID NO:13: CTCGGTGCCG ATGTGGTTGC CGTATTCGTA TGCGATTTCT GGATCCCAGC TCGAGGCTTC 60 AGCCACGCCG GAAGGCAGCC CCCGTGGAAT AGCGGCTACG CGGGGCTCCA CGCGCAACAC 120 CAACGGCGGC ATCGGACATC TGCAGGTCTG GAATCCCCAA GCGCTCGATA CCGGGGATGA 180 AACCCGCGCC CCCAAGAGAG CGCACACCAG GCACTGACGT GGTTCCCTCA AGAAGGATCC 240 GCCATCCCAA GCCGTGAAGC AACTGCACTT TTTCGTCGAG CGTCATCTGC TGGATGACCA 300 GATCAGCCCG CTCATCCGGA GAGAGATATT TGTTTTCCCA TGGGCGTATG GGCCCGGTAT 360 TTATGGGCTG TCCGAATTGC GTGTAGATTG GAGCCGAGGC GGCAAGAAAG AGGAACGCCA 420 GTAGGAGATT CGCTGCTTTC AGCAAAGACC TGCGCATAAT CATCTATCGT GCTCCATAAA 480 CCTCGTCAGA CCGATCAGCT CCTATCGTTT CGGTTTTGGT TCCTTGTGCA CCATCGCAAC 540 CATCGCAACA GGCCACCAGA TCACCCGCTG CGCGCCTGCG CTTGTAGGCA ATGAGGTTCG 600 GCTTCG 606

【００６２】(2) 配列情報 SEQ ID NO:14: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 605 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (B) 株名: T1689 (xi) 配列: SEQ ID NO:14: CTCGGTGCCG ATGAGGTCGC CGTATTCGTA GGCGATTTCG GGATCCCAGC TCGAGGCCTC 60 GGCCACACCG GAAGGCAGCG CCGTGGAATA GCGGCTACGC GGTGCTCCAC GGGCAACACC 120 AACGGCGGCA TCGGACATCT GCAGGTCAGG AATCCCCAAG CGTTCAATAC CGGGAATAAA 180 ACCCGCGCCC CCAAGAGAAC GCACGCCAGG CACTGACGTG GTTCCCTCAA GGAGAGTCCG 240 CCATCCCAAG CCGTGAAGCA ATTGCACTTT TTCGTCGAGC GTCATCTGCT GGATGACCAG 300 ATCGGCCCGC TCATCAGGAG AGAGGTATTT GTTTTCCCAT GGGCGTTCGG GTGCGGCATT 360 TACTGGTTGT CTGAATTGCG TGTACATTGG GGCCGAGGCG ACAAGAAAGA AGAATGCCAG 420 TATTAAATTA GCTGCTTTCA GCAGGGACCT GCGCAGAATC ATCGATTGCG CTCCAGAAAT 480 CTCGTCAGAT CGATCAGCTC CTCCGTTTCG GTTTTGGCTT CCTGGGAAAT CATCGACCAT 540 CGCGGCCGGC CGAACCAGAT CACGTGCTCC GAGCTTGCGC TCGTAGGCAA TGAGGTTCGG 600 CTTCG 605

【００６３】(2) 配列情報 SEQ ID NO:15: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 604 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (B) 株名: T10892 (xi) 配列: SEQ ID NO:15: CTCGGTGCCG ATGTGGTCGC CGTATTCGTA GGCGATTTCG GGATCCCAGC TCGAGGCCTC 60 GGCCACACCG GAAGGCAGCG CCGTGGAATA GCGGCTACGC GGTGCTCCAC GGGCAACACC 120 AACGGCGGCA TCGGACATCT GCAGGTCAGG AATCCCCAAG CGTTCAATAC CGGGAATAAA 180 ACCCGCGCCC CCAAGAGAAC GCACGCCAGG CACTGACGTG GTTCCCTCAA GGAGAGTCCG 240 CCATCCCAAG CCGTGAAGCA ATTGCACTTT TTCGTCGAGC GTCATCTGCT GGATGACCAG 300 ATCGGCCCGC TCATCAGGAG AGAGGTATTT GTTTTCCCAT GGGCGTTCGG GTGCGGCATT 360 TACTGGTTGT CTGAATTGCG TGTACATTGG GGCCGAGGCG ACAAGAAAGA AGAATGCCAG 420 TATTAAATTA GCTGCTTTCA GCAGGGACCT GCGCAGAATC ATCGATTGCG CTCCAGAAAT 480 CTCGTCAGAT CGATCAGCTC CTCCGTTTCG GTTTTGACTT CCTGGGAAAT CATCGACCAT 540 CGCGGCCGGC CGAACCAGAT CACGTGCTCC GAGCTTGCGC TCGTGGCAAT GAGGTTCGGC 600 TTCG 604

【００６４】(2) 配列情報 SEQ ID NO:16: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 602 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (B) 株名: T18492 (xi) 配列: SEQ ID NO:16: CTCGGTGCCG ATGTGGTTGC CGTATTCGTA TGCGATTTCC TGGATCCCAG CTCGAGGCTT 60 CAGCCACGCC GGAAGGCAGC GCCGTGGAAT AGCGGCTACG CGGGGCTCCA CGCGCAACAC 120 CAACGGCGGC ATCGGACATC TGCAGGTCTG GAATCCCCAA GCGCTCGATA CCGGGGATGA 180 AACCCGCGCC CCCAAGAGAG CGCACACCAG GCACTGACGT GGTTCCCTCA AGAAGGATCC 240 GCCATCCCAA GCCGTGAAGC AACTGCACTT TTTCGTCGAG CGTCATCTGC TGGATGACCA 300 GATCAGCCCG CTCATCCGGA GAGAGATATT TGTTTTCCCA TGGGCGTATG GGCCCGGTAT 360 TTATGGGCTG TCCGAATTGC GTGTAGATTG GAGCCGAGGC GGCAAGAAAG AGGAACGCCA 420 GTAGGAGATT CGCTGCTTTC AGCAAAGACC TGCGCATAAT CATCTATCGG TGCTCCATAA 480 ACCTCGTCAG ACCGATCAGC TCCTATCGTT TCGGTTTTGN TTCCTTGTGC ACCATCGACC 540 ATCGCAACCA GCCACCAGAT CACCCGCTGC GCGCCTGCGC TTGGCAATGA GGTTCGGCTT 600 CG 602

【００６５】(2) 配列情報 SEQ ID NO:17: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 605 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (B) 株名: T11792 (xi) 配列: SEQ ID NO:17: CTCGGTGCCG ATGAGGTCCC CGTATTCGTA GGCGATTTCG GGATCCCAGC TCGAGGCCTC 60 GGCCACACCG GAAGGCAGCG CCGTGGAATA GCGGCTACGC GGTGCTCCAC GGGCAACACC 120 AACGGCGGCA TCGGACATCT GCAGGTCAGG AATCCCCAAG CGTTCAATAC CGGGAATAAA 180 ACCCGCGCCC CCAAGAGAAC GCACGCCAGG CACTGACGTG GTTCCCTCAA GGAGAGTCCG 240 CCATCCCAAG CCGTGAAGCA ATTGCACTTT TTCGTCGAGC GTCATCTGCT GGATGACCAG 300 ATCGGCCCGC TCATCAGGAG AGAGGTATTT GTTTTCCCAT GGGCGTTCGG GTGCGGCATT 360 TACTGGTTGT CTGAATTGCG TGTACATTGG GGCCGAGGCG ACAAGAAAGA AGAATGCCAG 420 TATTAAATTA GCTGCTTTCA GCAGGGACCT GCGCAGAATC ATCGATTGCG CTCCAGAAAT 480 CTCGTCAGAT CGATCAGCTC CTCCGTTTCG GTTTTGACTT CCTGGGAAAT CATCGACCAT 540 CGCGGCCGGC CGAACCAGAT CACGTGCTCC GAGCTTGCGC TCGTGGGCAA TGAGGTTCGG 600 CTTCG 605

【００６６】(2) 配列情報 SEQ ID NO:18: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 605 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (B) 株名: 5C8246 (xi) 配列: SEQ ID NO:18: CTCGGTGCCG ATGAGGTCAC CGTATTCGTA GGCGATTTCG GGATCCCAGC TCGAGGCCTC 60 GGCCACACCG GAAGGCAGCG CCGTGGAATA GCGGCTACGC GGTGCTCCAC GGGCAACACC 120 AACGGCGGCA TCGGACATCT GCAGGTCAGG AATCCCCAAG CGTTCAATAC CGGGAATAAA 180 ACCCGCGCCC CCAAGAGAAC GCACGCCAGG CACTGACGTG GTTCCCTCAA GGAGAGTCCG 240 CCATCCCAAG CCGTGAAGCA ATTGCACTTT TTCGTCGAGC GTCATCTGCT GGATGACCAG 300 ATCGGCCCGC TCATCAGGAG AGAGGTATTT GTTTTCCCAT GGGCGTTCGG GTGCGGCATT 360 TACTGGTTGT CTGAATTGCG TGTACATTGG GGCCGAGGCG ACAAGAAAGA AGAATGCCAG 420 TATTAAATTA GCTGCTTTCA GCAGGGACCT GCGCAGAATC ATCGATTGCG CTCCAGAAAT 480 CTCGTCAGAT CGATCAGCTC CTCCGTTTCG GTTTTGACTT CCTGGGAAAT CATCGACCAT 540 CGCGGCCGGC CGAACCAGAT CACGTGCTCC GAGCTTGCGC TCGTAGGCAA TGAGGTTCGG 600 CTTCG 605

【００６７】(2) 配列情報 SEQ ID NO:19: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 540 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (B) 株名: T8594 (xi) 配列: SEQ ID NO:19: GTATGCGATT TCTGGATCCC AGCTCGAGGC TTCAGCCACA CCGGACGGCA GCGCCGTAGA 60 ATAGCGGCTC CGTGGGGCTC CGCGCGCGAC GCCAAGGGCG GCATCCGACA TCTGCAGGTC 120 GGGAATCCCC AAACGCTCAA TACCCGGGNT GAAACCCGCG CCTCCAAGAG AACGCACGCC 180 CGGCCCGGAC GTGGTTCCGT CAAGGTAAAC TCGCCATCCC AGGCCATGAA GCAACTGCAC 240 TTTTTCGTCG AGCGTCATCT GCTGGATGAC CAGATCGGCC CGCTCATCCG GGGAAAGTAA 300 TTTGTTTGTC CATGGCCGTT TGGGTTGCGG TATTTACTGG CTGTCCGAAT TGCNTTTTAC 360 ATTGGANCCG AAGCGAACAA AAAAAGAAAA AATGCCCATT AGGAAATTAA CTGCTGTTCA 420 NCNAAAGGCC TGCNCAAATC ATCTATCCNT GCNCCCANAA TCCCTTCAGG TTCAAAAAAT 480 AACCCTTTCC GGTTTTTAAC TNCCCTTGAA AACCATCAAC ACGGANCCCC AATTNNGNGT 540

【００６８】(2) 配列情報 SEQ ID NO:20: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 558 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (vi) 起源: (B) 株名: T9294 (xi) 配列: SEQ ID NO:20: GTATGCGATT TCTGGATCCC AGCTCGAGGC TTCAGCCACA CCGGACGGCA GCGCCGTAGA 60 ATAGCGGCTC CGTGGGGCTC CGCGCGCGNC GCCAAGGGCG GCATCCGACA TCTGCAGGTC 120 GGGNATCCCC AAACGCTCAA TACCCGGGNT GAAACCCGCG CCTCCAAGNG NACGCACGCC 180 CGGCCCGGAC GTGGTTCCGT CAAGGTAAAC TCGCCATCCC AGGCCATGAA GCAACTGCAC 240 TTTTTCGTCG AGCGTCATCT GCTGGATGAC CAGATCGGCC CGCTCATCCG GGGAAAGTAA 300 TTTGTTTGTC CATGGCCGTT TGGGTGCGGT ATTTACTGGC TGTCCGAATT GCGTGTACAT 360 TGGAGCCGAG GCGACAAGAA AGAAGAATGC CAGTAGGAAA TTAGCTGCTG TCAGCAAAGG 420 CCTGCGCAGA ATCATCTANC GTGCTCCATA AANCNCGTCA GGTCGATCAG CTACTCGTTT 480 CGGTTTTTAC TTNCCTTGAA AACCATCGAC CACGGCAGCC AGCCGCCAGA CCACGTGCTC 540 CGAGCTTGCG CTTGTAGG 558

【００６９】(2) 配列情報 SEQ ID NO:21: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 705 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 二本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:21: CGTCATGCTG AAGTCCCTGG TCGCGWARCT CGGTGCCGAT GWGGTYVCCG TATTCGTAKG 60 CGATTTCCKG GATCCCAGCT CGAGGCYTCA GSCCACRCCG GAAGGCAGCC SCCGTGGAAT 120 AGCGGCTACG CGGKGCTCCA CGSGCAACAC CAACGGCGGC ATCGGACATC TGCAGGTCDG 180 GAATCCCCAA GCGYTCRATA CCGGGRATRA AACCCGCGCC CCCAAGAGRR CGCACRCCAG 240 GCACTGACGT GGYTCCCTCA AGRAGRRTCC GCCATCCCAA GCCGTGAAGC AAYTGCACTT 300 TTTCGTCGAG CGTCATCTGC TGGATGACCA GATCRGCCCG CTCATCMGGA GAGAGRTATT 360 TGTTTTCCCA TGGGCGTWYG GGYSCGGYAT TTAYBGGYTG TCYGAATTGC GTGTASATTG 420 GRGCCGAGGC GRCAAGAAAG ARGAAYGCCA GTAKKARATT MGCTGCTTTC AGCARRGACC 480 TGCGCAKAAT CATCKATYGG YGCTCCAKAA AYCTCGTCAG AYCGATCAGC TCCTAYCGTT 540 TCGGTTTTGR NTTCCTKGGA AATCATSSAC CATCGCRRCC ATSGCAACSA GGCCACCAGA 600 TCACSYGCTS CGMGCYTGCG CTYGTRGGCA ATGAGGTTCG GCTTCGCCCG KTCTCCAGTA 660 AAGRGCCTTT GRCCCTGATG CGTTTCCAGA GTGCCAGGAG ACAGA 705

【００７０】(2) 配列情報 SEQ ID NO:22: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 17 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:22: GGATCCCAGC TCGAGGC 17

【００７１】(2) 配列情報 SEQ ID NO:23: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 40 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:23: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGTGCACT TTTTCGTCGA 40

【００７２】(2) 配列情報 SEQ ID NO:24: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 39 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:24: CGATTGGGCT CCAGACTTCT CGGGTGCACT TTTTCGTCG 39

【００７３】(2) 配列情報 SEQ ID NO:25: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 38 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:25: CGATTGGGCT CCAGACTTCT CGGGGCACTT TTTCGTCG 38

【００７４】(2) 配列情報 SEQ ID NO:26: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 38 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:26: ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGTCTCCG GATGAGCG 38

【００７５】(2) 配列情報 SEQ ID NO:27: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 37 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:27: ACGGCATCGA ATGCATGTCT CGGGCCGGAT GAGCGGG 37

【００７６】(2) 配列情報 SEQ ID NO:28: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 36 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:28: ACGGCATCGA ATGCATGTCT CGGGCGGATG AGCGGG 36

【００７７】(2) 配列情報 SEQ ID NO:29: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 14 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:29: ATCCCAAGCC GTGA 14

【００７８】(2) 配列情報 SEQ ID NO:30: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 14 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:30: CCCAAACGCC CATG 14

【００７９】(2) 配列情報 SEQ ID NO:31: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 14 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:31: CCCAAGCCGT GAAG 14

【００８０】(2) 配列情報 SEQ ID NO:32: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 13 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:32: CCAAGCCGTG AAG 13

【００８１】(2) 配列情報 SEQ ID NO:33: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 13 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:33: CCAGGCCATG AAG 13

【００８２】(2) 配列情報 SEQ ID NO:34: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 13 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:34: CAAACGCCCA TGG 13

【００８３】(2) 配列情報 SEQ ID NO:35: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 14 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:35: TCATCTGCTG GATG 14

【００８４】(2) 配列情報 SEQ ID NO:36: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 15 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:36: GATCTGGTCA TCCAG 15

【００８５】(2) 配列情報 SEQ ID NO:37: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 16 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:37: TCATCTGCTG GATGAC 16

【００８６】(2) 配列情報 SEQ ID NO:38: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 16 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:38: GATCTGGTCA TCCAGC 16

【００８７】(2) 配列情報 SEQ ID NO:39: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 16 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:39: GTCATCCAGC AGATGA 16

【００８８】(2) 配列情報 SEQ ID NO:40: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 16 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi) 配列: SEQ ID NO:40: GCTGGATGAC CAGATC 16

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 595117091 １ＢＥＣＴＯＮＤＲＩＶＥ，ＦＲＡＮＫＬＩＮＬＡＫＥＳ，ＮＥＷＪＥＲＳＥＹ 07417−1880，ＵＮＩＴＥＤＳＴＡＴＥＳＯＦＡＭＥＲＩＣＡ (56)参考文献Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，122, 479−484（1982) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00 - 15/90 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｍ．カンザシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）
核酸の種特異的検出方法であって、ａ）配列番号３ないし５のいずれか１つ、または配列番
号１１ないし２１のいずれか１つの少なくとも１０の連
続するヌクレオチド、あるいはその相補体からなるプロ
ーブであって、配列番号３のヌクレオチド１２４−１４
３の少なくとも１０の連続するヌクレオチドのヌクレオ
チドを含まない前記プローブを、Ｍ．カンザシイ核酸に
ハイブリダイズし；そしてｂ）プローブハイブリダイゼーションを検出することに
よって、Ｍ．カンザシイ核酸を検出することを含む、前
記検出方法。
【請求項２】Ｍ．カンザシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）
核酸の種特異的検出方法であって、ａ）配列番号３ないし５のいずれか１つ、または配列番
号１１ないし２１のいずれか１つの少なくとも１０の連
続するヌクレオチド、あるいはその相補体からなる標的
結合配列であって、配列番号３のヌクレオチド１２４−
１４３の少なくとも１０の連続するヌクレオチドのヌク
レオチドを含まない前記標的結合配列、ならびに所望に
より標的核酸を増幅させる配列、からなる増殖プライマ
ーを、Ｍ．カンザシイ核酸にハイブリダイズし；ｂ）ハイブリダイズした増幅プライマーを伸長させるこ
とによって、Ｍ．カンザシイ核酸を増幅し；そしてｃ）増幅されたＭ．カンザシイ核酸を検出することを含
む、前記検出方法。
【請求項３】Ｍ．カンザシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）
核酸の種特異的検出方法であって、ａ）各々が、配列番号３ないし５のいずれか１つ、また
は配列番号１１ないし２１のいずれか１つの少なくとも
１０の連続するヌクレオチド、あるいはその相補体から
なる第一および第２の増幅プライマーであって、配列番
号３のヌクレオチド１２４−１４３の少なくとも１０の
連続するヌクレオチドのヌクレオチドを含まない前記プ
ライマーを、Ｍ．カンザシイ核酸にハイブリダイズさ
せ、ここにおいて、第一および第２の増幅プライマーは
Ｍ．カンザシイ核酸にハイブリダイズした際に近接し連
結できるように選択され；ｂ）ハイブリダイズした第一および第二の増幅プライマ
ーを連結して増幅生成物を生成させ；そしてｃ）増幅生成物を検出することを含む、前記検出方法。
【請求項４】配列番号３ないし５のいずれか１つ、また
は配列番号１１ないし２１のいずれか１つの少なくとも
１０の連続するヌクレオチド、あるいはその相補体から
なるオリゴヌクレオチドであって、配列番号３のヌクレ
オチド１２４−１４３の少なくとも１０の連続するヌク
レオチドのヌクレオチドを含まない前記オリゴヌクレオ
チド。
【請求項５】配列番号３ないし２２のいずれか１つ、配
列番号２３ないし２８のいずれか一つの標的結合配列、
配列番号２９ないし４０のいずれか一つ、およびその相
補体からなる郡より選択されるオリゴヌクレオチドであ
って、かつ、配列番号３のヌクレオチド１２４−１４３
の少なくとも１０の連続するヌクレオチドのヌクレオチ
ドを含まない、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】配列番号３ないし５のいずれか１つ、また
は配列番号１１ないし２１のいずれか１つの少なくとも
１０ないし７５の連続するヌクレオチド、あるいはその
相補体、ならびに標的核酸を増幅させるための配列から
なるオリゴヌクレオチドであって、前記ヌクレオチドは
配列番号３のヌクレオチド１２４−１４３の少なくとも
１０の連続するヌクレオチドのヌクレオチドを含まな
い、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項７】Ｍ．カンザシイ核酸の種特異的検出用キッ
トであって、ａ）ｉ）配列番号３ないし５のいずれか１つ、または配
列番号１１ないし２１のいずれか１つの少なくとも１０
の連続するヌクレオチド、あるいはその相補体からなる
ヌクレオチドであって、配列番号３のヌクレオチド１２
４−１４３の少なくとも１０の連続するヌクレオチドの
ヌクレオチドを含まない前記ヌクレオチド、またはｉｉ）配列番号３ないし５のいずれか１つ、または配列
番号１１ないし２１のいずれか１つの少なくとも１０の
連続するヌクレオチド、あるいはその相補体からなる標
的結合配列であって、配列番号３のヌクレオチド１２４
−１４３の少なくとも１０の連続するヌクレオチドのヌ
クレオチドを含まない前記標的結合配列、ならびに所望
により核酸を増幅させるため配列；からなるオリゴヌクレオチド；およびｂ）前記オリゴヌクレオチドを用いてＭ．カンザシイを
検出するための手段を含む、前記検出用キット。