JP2766165B2 - バクテリアセルロースの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アセトバクター属に属
しセルロース性物質を生産する能力を有する微生物が生
産するセルロース性物質の製造方法に関する。より具体
的には、セルロース生成促進因子として特定の有機酸を
含有する培地中での該微生物によるセルロース性物質の
生産に関する。

【０００２】このセルロース性物質は可食性であり食品
分野で利用されるほか水系分散性に優れているので食
品、化粧品又は塗料等の粘度の保持、食品原料生地の強
化、水分の保持、食品安定性向上、低カロリー添加物又
は乳化安定化助剤としての産業上利用価値がある。

【０００３】また、該セルロース性物質の離解物はミク
ロフィブリルの構造的物理的特徴に基づき高分子、特に
水系高分子用補強剤として各種の産業用用途がある。こ
のような離解物は高い引張弾性率を示すので該セルロー
ス性離解物を紙状または固型状に固化した物質はミクロ
フィブリルの構造的特徴に基づくすぐれた機械特性が期
待され、各種産業用素材としての応用がある。

【０００４】

【従来の技術】従来より、アセトバクター属に属する微
生物を培養して、セルロースを生産する方法は知られて
いる（この微生物を以後「セルロース生産性酢酸菌」と
称する）。例えば、特開昭６２−２６５９９０号公報、
特開昭６１−２２１２０１等に、その記載がある。セル
ロース生産性酢酸菌の培養を行なう際に適当とされてい
る栄養培地としては、炭素源、ペプトン、酵母エキス、
燐酸ナトリウム及びクエン酸からなる Schramm／Hestri
n 培地（Schramm ら、J. General Biology, 11,pp.123
〜129, 1954 ）が知られている。しかしながら、上記栄
養培地で振盪もしくは通気撹拌培養を行なった場合、得
られるセルロース生産量は低く、生成速度も必ずしも満
足のいくものではなかった。また、上記栄養培地の他
に、コーンスチープリカー（ＣＳＬ）や麦芽エキス等を
加えた培地が知られているが、これら天然栄養素（ペプ
トン、酵母エキス、ＣＳＬ、麦芽エキスなど）に含まれ
る特定成分がセルロース生成促進に関与していることは
知られていない。培地中の特定栄養素によるセルロース
生成促進因子として、現在知られているものにはイノシ
トール、フィチン酸、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）
（特公平５−１７１８号公報；高井光男，紙パ技協誌，
第４２巻，第３号，第２３７〜２４４頁）等があるが、
セルロース生成量はまだ不十分であり、またこれらの振
盪もしくは通気撹拌培養における効果も明確ではなかっ
た。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】有機酸と酢酸菌におけ
る研究は、Ｔａｋｅｕｃｈｉら、J. Ferment. Technol.
Vol.46, No.4, pp. 288〜291, 1968年、南場ら、日本
食品工業学会誌，第32巻，第５号，第 331〜337 頁，19
85年などに記載されているが、これらの文献は、酢酸菌
の酸生成に及ぼす影響について研究したものであり、セ
ルロース生産性酢酸菌のこれら有機酸によるセルロース
生産促進効果について言及したものは見当らない。

【０００６】本発明の目的は、セルロース生産性酢酸菌
を用いてセルロース性物質の生産性を向上させ安価に製
造する方法を開発することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために種々の研究を行ない、アセトバクタ
ー属に属しセルロース性物質を生産する能力を有する微
生物（すなわちセルロース生産性酢酸菌）を特定の有機
酸を添加した培地中で培養することにより、従来の製造
法に比べて著しくセルロース性物質の生産性が向上する
ことを見出した。

【０００８】即ち、本発明は、アセトバクター属に属し
セルロース性物質生産能を有する微生物を、セルロース
生成促進因子としてのカルボン酸又はその塩を添加した
培地中で培養し、培地中にセルロース、セルロース性物
質を生成蓄積せしめ該物質を採取することを包含するセ
ルロースの製造方法を提供する。

【０００９】本発明において使用される微生物はアセト
バクター属に属し、セルロース性物質を産生する微生物
であればどのようなものでもよい。例えば、アセトバク
ター・スピーシーズ（Acetobacter sp. ）ＢＰＲ２００
１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４６６）、アセトバクター・
キシリナム（Acetobacter xylinum ）ＡＴＣＣ２３７６
８、アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ２３７６９、
アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ１０８２１などが
挙げられる。

【００１０】本発明方法で使用される特定のカルボン酸
又はその塩は、セルロース生成促進因子として該微生物
のセルロース生合成系に作用して、セルロースの生産性
を著しく向上させる。すなわち、後述する実施例に示す
ように、培地中のセルロース蓄積量はカルボン酸無添加
の場合と比較して約１．５倍〜約１２倍に達する。本明
細書中「セルロース生成促進因子としてのカルボン酸又
はその塩」は、カルボン酸又はその塩を添加しない場合
と比較してセルロース蓄積量を増加させる、好ましくは
約１．５倍以上増加させるカルボン酸又は塩を指す。本
発明で使用し得るカルボン酸は飽和又は不飽和カルボン
酸のいずれでもよく、例えば、飽和カルボン酸として酢
酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、グルコン
酸、グルクロン酸などが挙げられ、また、不飽和カルボ
ン酸としてフマル酸、マレイン酸、アクリル酸、安息香
酸などが挙げられる。これらカルボン酸は、炭素数、カ
ルボキシル基数に特に制限はないが、水溶性であること
が望ましい。好ましいカルボン酸は乳酸、ピルビン酸、
酢酸である。カルボン酸を塩として使用するときは、特
に制限されないが、通常アルカリ金属又はアルカリ土類
金属の塩を使用し得る。これらのカルボン酸又はその塩
は単独で使用してもよいし、また２種以上組み合わせて
使用することもできる。また、カルボン酸又はその塩の
添加量は特に制限されないが、好ましくは１mmol〜２０
０mmol／Ｌである。本発明においては、カルボン酸又は
その塩は主要炭素源として培地に添加するよりはむし
ろ、セルロース生成促進因子として微量もしくは少量添
加するだけでセルロース生産性を顕著に向上させること
ができる。

【００１１】培地組成物中、炭素源としてはシュークロ
ス、グルコース、フラクトース、マンニトール、ソルビ
トール、ガラクトース、マルトース、エリスリット、ガ
ドニット、グリセリン、エチレングリコール、エタノー
ル等が単独或いは併用して用いられる。更にはこれらの
ものを含有する澱粉水解物、チトラスモラセス、ビート
モラセス、ビート搾汁、サトウキビ搾汁、柑橘類を始め
とする果汁等が使用できる。

【００１２】また、窒素源としては硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウ
ム塩、硝酸塩、尿素等有機或いは無機の窒素源が使用さ
れてもよいし、或いはＢａｃｔ−Ｐｅｐｔｏｎｅ、Ｂａ
ｃｔ−Ｓｏｙｔｏｎｅ、Ｙｅａｓｔ−Ｅｘｔｒａｃｔ、
豆濃などの含窒素天然栄養源が使用されてもよい。有機
微量栄養素としてアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、
２，７，９−トリカルボキシ−１Ｈピロロ［２，３−
５］−キノリン−４，５−ジオンを添加してもよい。

【００１３】生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変
異株を使用する場合には、要求される栄養素を補添する
ことが必要である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネ
シウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、コバルト
塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート金属類等が使用
される。

【００１４】培養のｐＨは３ないし７に、望ましくは５
付近に制御する。

【００１５】培養温度は１０〜４０℃、望ましくは２５
〜３５℃の範囲で行う。

【００１６】培養槽に供給する酸素濃度は１〜１００
％、望ましくは２１〜８０％であれば良い。

【００１７】本発明方法では、培養方法に制限を受け
ず、静置、振盪もしくは通気撹拌培養のいずれでもよ
い。振盪もしくは通気撹拌下での培養であってもセルロ
ース生産性に影響を及ぼさないことも本発明方法の特徴
の１つである。

【００１８】本発明の方法によって生成されるセルロー
ス性物質はそのまま採取してもよく、さらに本物質中に
含まれる菌体を始めとするセルロース性物質以外の物質
を取り除く処理をほどこしてもよい。

【００１９】不純物を取り除くためには水洗、加圧脱
水、希酸洗浄、アルカリ洗浄トルエン及び酢酸エチルな
どの極性有機溶媒による処理、次亜塩素酸ソーダ及び過
酸化水素などの漂白剤による処理、リゾチームなどの菌
体溶解酵素による処理、ラウリル硫酸ソーダ、デオキシ
コール酸などの界面活性剤による処理、常温から２００
℃の範囲の加熱洗浄などを単独及び併用してほどこすこ
とによりセルロース様物質から不純物を除去することが
できる。

【００２０】このようにして得られた本発明でいうセル
ロース性物質とは以下のものをいう。

【００２１】本発明のセルロース性物質とはセルロース
及び、セルロースを主鎖としたヘテロ多糖を含むもの及
びβ−１，３、β−１，２等のグルカンを含むものであ
る。ヘテロ多糖の場合のセルロース以外の構成成分はマ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、キシロース、
アラビノース、ラムノース、グルクロン酸等の六炭糖、
五炭糖及び有機酸等である。

【００２２】なおこれ等の多糖が単一物質である場合も
あるし２種以上の多糖が水素結合等により混在してもよ
い。

【００２３】

【実施例】以下の実施例により、本発明をさらに詳細に
説明する。

【００２４】培養条件 セルロース生産性酢酸菌をフラスコ培養法及びジャーフ
ァメンター培養法を用いて培養した。

【００２５】フラスコ培養法 フラクトース４０ｇ／Ｌ、リン酸一カリウム１．０ｇ／
Ｌ、硫酸マグネシウム０．３ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム
３ｇ／Ｌ、バクト−ペプトン５ｇ／Ｌ、乳酸１．４ｍ／
Ｌ、初発ｐＨ５．０の組成の基本培地１００ｍｌを張り
込んだ７５０ｍｌ容Ｒｏｕｘフラスコに、セルロース生
産性酢酸菌の凍結保存菌液１ｍｌを植菌し、低温培養器
内で２８℃で３日間静置培養を行った。このシード培養
後、前記Ｒｏｕｘフラスコをよく振盪した後、無菌条件
下で内容物をガーゼ濾過しセルロース片と菌体を分離し
た。次に１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、培
地成分と菌体（＋微小セルロース）を分離し、さらに滅
菌生理食塩水で１〜２回菌体（＋微小セルロース）を洗
浄、遠心分離を繰り返した。洗浄された菌体に必要量の
滅菌生理食塩水を加え、撹拌後これをシード菌液とし
た。

【００２６】次に、シード菌液７．５ｍｌを検討培地６
７．５ｍｌを張り込んだ３００ｍｌ容スパイラルバッフ
ルフラスコに植菌した。振盪培養機を用い、振幅２ｃ
ｍ、回転速度１８０ｒｐｍ、温度２８℃の条件で回転振
盪しながら４日間メイン培養を行った。

【００２７】産生されたバクテリアルセルロースの定量
は次のようにして行った。すなわち、各フラスコ内の固
形物を水洗して培地成分を除去した後、１％ＮａＯＨ水
溶液中で１１０℃、２０分間処理して菌体を除去し、さ
らに、洗浄液が中性付近になるまでセルロースを水洗
し、８０℃で真空乾燥して乾燥重量を測定した。

【００２８】ジャーファメンター培養法 上記基本培地１００ｍｌを張り込んだ７５０ｍｌ容Ｒｏ
ｕｘフラスコにセルロース生産性酢酸菌の凍結保存菌液
１ｍｌを植菌し、低温培養機内で２８℃で３日間静置培
養を行なった。静置培養終了後、Ｒｏｕｘフラスコをよ
く振盪し、その内容物を無菌条件下でガーゼ濾過してセ
ルロース片と菌体を分離した。得られた菌液７．５ｍｌ
を基本培地６７．５ｍｌを張り込んだ３００ｍｌ容スパ
イラルバッフルフラスコに植菌し、振盪培養機を用いて
振幅２ｃｍ、回転速度１８０ｒｐｍ、温度２８℃の条件
で回転振盪しながら３日間シード培養を行なった。

【００２９】培養終了後、フラスコの内容物を無菌ブレ
ンダーに移し、１０，０００ｒｐｍで３分間破砕処理を
行なった。この破砕された内容物をシード菌液とし、以
下のメイン培養に使用した。なお、シード菌液を１０，
０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清中に
乳酸が残留していないことを確認した。

【００３０】上記シード菌液６０ｍｌを滅菌済み検討培
地５４０ｍｌを張り込んだ小型ジャーファメンター（全
容量１，０００ｍｌ）に無菌的に植菌し、３０℃で２０
時間又は３０時間、ｐＨを１Ｎ ＮａＯＨもしくは１Ｎ
Ｈ₂ ＳＯ₄ でｐＨ５．０にコントロールしながら、ま
た、撹拌回転数を初発４００ｒｐｍで、溶存酸素量（Ｄ
Ｏ）が３．０〜２１．０％内に入るように回転数を自動
制御しながらメイン培養を行なった。

【００３１】培養終了後、ジャーファメンター内の固形
物を集積し、水洗して培地成分を除去した後、１％Ｎａ
ＯＨ水溶液中で１１０℃、２０分間処理して菌体を除去
した。さらに、洗浄液が中性付近になるまで生成セルロ
ースを水洗した後、８０℃で１２時間真空乾燥して乾燥
重量を測定した。

【００３２】実施例１ 各種有機窒素源における乳酸
添加効果 セルロース生産性酢酸菌としてアセトバクター・スピー
シーズＢＰＲ２００１株をまた、検討培地として異なる
下記有機窒素源を含有する下記組成： フラクトース ４０ｇ／Ｌ、 ＫＨ₂ ＰＯ₄ １．０ｇ／Ｌ、 ＭｇＳＯ₄ ０．３ｇ／Ｌ、 （ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ ３ｇ／Ｌ、 有機窒素（Ｎ）源 ５ｇ／Ｌ、 Ｂａｃｔ−Ｐｅｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）； Ｂａｃｔ−Ｓｏｙｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）； Ｙｅａｓｔ−Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）； または 豆濃（大豆蛋白質の酸加水分解濃縮液）、 乳 酸 ０または１．４ｍｌ／Ｌ、 初 発 ｐＨ ５．０ の培地を用いて、上記フラスコ培養法に従ってメイン培
養を２日間又は４日間行ない、乳酸の存在又は非存在下
でのセルロース蓄積量を評価した。

【００３３】その結果を表１に示した。

【００３４】

【表１】

【００３５】表１の結果から分かるように、培地に乳酸
を添加するときには、無添加の場合と比較していずれの
有機Ｎ源においてもセルロース蓄積量が約５倍〜約１２
倍増大した。使用した有機Ｎ源によるセルロース蓄積量
は、培養４日後でＢａｃｔ−Ｐｅｐｔｏｎｅ＜Ｂａｃｔ
−Ｓｏｙｔｏｎｅ＜Ｙｅａｓｔ−Ｅｘｔｒａｃｔ＜豆濃
の順に増大した。

【００３６】実施例２ 乳酸以外のカルボン酸添加効
果 有機窒素源としてＢａｃｔ−Ｓｏｙｔｏｎｅを、またカ
ルボン酸として乳酸の他に酢酸及びピルビン酸を１０ｍ
ｍｏｌ／Ｌ添加又は無添加で用いた以外は、実施例１と
同様に培養して、セルロース蓄積量に及ぼす乳酸以外の
カルボン酸の添加効果を調べた。

【００３７】その結果を表２に示した。

【００３８】

【表２】

【００３９】表２から、カルボン酸として酢酸及びピル
ビン酸を使用したときにも、セルロース蓄積量は無添加
の場合と比べて約２倍〜約６倍増大することが判明し
た。培養４日後で評価すると、セルロース蓄積量の程度
は、酢酸＜ピルビン酸＜乳酸の順に増大した。

【００４０】実施例３ セルロース蓄積量に及ぼすカ
ルボン酸添加量の影響 有機窒素源としてＢａｃｔ−Ｓｏｙｔｏｎｅを、また乳
酸を０．１ｍｌ／Ｌ、０．５ｍｌ／Ｌ、１．０ｍｌ／
Ｌ、５．０ｍｌ／Ｌ、１０．０ｍｌ／Ｌ、１５．０ｍｌ
／Ｌの添加量で用いた以外は、実施例１と同様に４日間
培養してそれぞれの添加量におけるセルロース蓄積量を
評価した。

【００４１】その結果を表３に示す。

【００４２】

【表３】

【００４３】表３の結果は、乳酸添加量０．１ｍｌ／Ｌ
から１０．０ｍｌ／Ｌまではセルロース蓄積量が漸増す
るが、さらに乳酸添加量を増量してもセルロース蓄積量
が逆に減少する傾向を示している。

【００４４】実施例４ セルロース蓄積量に及ぼす菌
株の影響 セルロース生産性酢酸菌としてアセトバクター・スピー
シーズＢＰＲ２００１株の他にアセトバクター・キシリ
ナムＡＴＣＣ２３７６８及びアセトバクター・キシリナ
ムＡＴＣＣ２３７６９を、また有機窒素源としてＢａｃ
ｔ−Ｓｏｙｔｏｎｅを用いた以外は実施例１と同様の方
法で４日間培養を行ない、各菌株についてセルロース蓄
積量を測定した。

【００４５】その結果を表４に示した。

【００４６】

【表４】

【００４７】表４の結果から、使用された３種の菌株間
で実質的なセルロース蓄積量は異なるけれども、いずれ
の菌株においても乳酸添加によりセルロース蓄積量が約
２．５倍〜約７倍に増加した。特に、アセトバクター・
スピーシーズＢＰＲ２００１株及びアセトバクター・キ
シリナムＡＴＣＣ２３７６９が高いセルロース産生を示
した。

【００４８】実施例５ セルロース生産性酢酸菌のジ
ャーファメンター培養 セルロース生産性酢酸菌としてアセトバクター・スピー
シーズＢＰＲ２００１株を、また検討培地として下記組
成： フラクトース ４０ｇ／Ｌ、 ＫＨ₂ ＰＯ₄ １．０ｇ／Ｌ、 ＭｇＳＯ₄ ０．３ｇ／Ｌ、 （ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ ３ｇ／Ｌ、 Ｂａｃｔ−Ｓｏｙｔｏｎｅ ５ｇ／Ｌ、 乳 酸 ０又は１．４ｍｌ／Ｌ、 初 発 ｐＨ ５．０ の培地を用いて、上記ジャーファメンター培養法に従っ
てメイン培養を２０時間又は３０時間行ない、乳酸の存
在又は非存在下でのセルロース蓄積量を評価した。

【００４９】その結果を表５に示す。

【００５０】

【表５】

【００５１】表５の結果は、ジャーファメンターを使用
してｐＨ、溶存酸素量等の発酵条件を制御するときに
は、乳酸無添加の場合でもセルロース産生が著しく向上
するが、乳酸添加により無添加の場合の約１．５倍〜約
２．５倍にセルロース蓄積量がさらに向上することを示
している。

【００５２】

【発明の効果】本発明方法による発酵法を利用したセル
ロース生産において、カルボン酸又はその塩を培地に微
量もしくは少量添加するだけでセルロース生産性が従来
法と比べて著しく向上する。このことは、本方法がセル
ロースを効率よくかつ安価に製造できることを示してい
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 19/04 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アセトバクター属に属しセルロース性物
   質生産能を有する微生物を、セルロース生成促進因子と
   してのカルボン酸又はその塩を添加した培地中で培養
   し、培地中にセルロース、セルロース性物質を生成蓄積
   せしめ、該物質を採取することを包含するセルロースの
   製造方法。
2. 【請求項２】 カルボン酸又はその塩が乳酸、ピルビン
   酸もしくは酢酸、又はそれらの塩であることを特徴とす
   る請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 カルボン酸又はその塩を培地中に１〜２
   ００mmol／Ｌ添加することを特徴とする請求項１又は２
   記載の方法。
4. 【請求項４】 培養が静置、振盪又は通気撹拌培養であ
   ることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載
   の方法。