JP2022032795A - Method for predicting onset of endometrial cancer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、子宮内膜癌の発症を予測するための方法及び検出薬に関する。 The present invention relates to a method and a detection agent for predicting the onset of endometrial cancer.
子宮体癌とも呼ばれる子宮内膜癌は、罹患率とともに死亡率も増加傾向を示している婦人科悪性腫瘍である。子宮内膜癌は臨床および病理組織学そして分子生物学的に2つのタイプ(タイプ1及びタイプ2)に分類されているが、最も頻度の高い組織型である子宮内膜癌はタイプ1に属している。 Endometrial cancer, also called endometrial cancer, is a gynecologic malignancies whose mortality rate is increasing as well as its morbidity. Endometrial cancer is classified into two types (type 1 and type 2) clinically, histologically, and molecular biology, but the most common histological type, endometrial cancer, belongs to type 1. ing.
子宮内膜癌は、プロゲステロンによる拮抗作用のないエストロゲン過剰（unopposed estrogen）環境下において、初期段階でDNAミスマッチ修復遺伝子の機能異常に原因があり、その結果として癌抑制遺伝子であるPTEN、癌原遺伝子であるKRASなどの変異が加わり、前癌病変である子宮内膜増殖症を経て子宮内膜癌が発生すると考えられている。発癌には多様な経路があり、それぞれに多数の遺伝子が関与していることが推定される。 Endometrial cancer is caused by dysfunction of DNA mismatch repair gene at an early stage in an unopposed estrogen environment without antagonism by progesterone, and as a result, PTEN, a tumor suppressor gene, is a protooncogene. It is thought that endometrial cancer develops through endometrial proliferation, which is a precancerous lesion, with the addition of mutations such as KRAS. There are various pathways for carcinogenesis, and it is presumed that many genes are involved in each pathway.
現在、子宮内膜癌の診断は、超音波検査にて子宮内膜肥厚像や子宮内腔に腫瘤が疑われる患者に対し、子宮内膜細胞および組織の採取を行い、病理学的に癌細胞および癌の組織構築を確認して行っている。子宮内膜癌の発生において、形態学的な変化が起こる以前より、分子生物学的な変化が子宮内膜で起こっていると考えられているが、将来的な子宮内膜癌のリスクを形態学的変化が軽度な時期に的確に評価するパラメーターは報告されていない。 Currently, the diagnosis of endometrial cancer is pathologically cancer cells by collecting endometrial cells and tissues from patients with suspected endometrial thickening images or tumors in the uterine cavity by ultrasonography. And we are confirming the tissue construction of the cancer. In the development of endometrial cancer, molecular biological changes are thought to occur in the endometrium even before morphological changes occur, but morphology of future risk of endometrial cancer No parameters have been reported to accurately assess when physiologic changes are mild.
子宮内膜癌の悪性度を規定する因子として、p53遺伝子変異と予後との相関が報告されている。そこで本発明者等は、後方視的に子宮内膜癌の臨床データとp53の免疫染色性及び遺伝子変異との関連をあらためて解析した。その結果、p53が癌細胞の10-50％しか染色されない通常p53陰性と判定される群(Low-positiveと定義)において、遺伝子変異はわずか15％程度であったものの、p53過剰発現群(80％以上陽性) (High-positiveと定義)と同様の頻度でリンパ節/遠隔転移・術後再発を確認している。 Correlation between p53 gene mutation and prognosis has been reported as a factor that determines the malignancy of endometrial cancer. Therefore, the present inventors retrospectively analyzed the relationship between clinical data of endometrial cancer and immunostainability of p53 and gene mutation. As a result, in the group (defined as low-positive) where p53 is normally stained to 10-50% of cancer cells and is judged to be p53 negative, the gene mutation was only about 15%, but the p53 overexpressing group (80). Lymph node / distant metastasis / postoperative recurrence is confirmed at the same frequency as (defined as High-positive).
次いでp53タンパク質の代謝カスケードに関係する可能性のあるエストロゲン受容体β（ERβ）の発現を免疫染色学的に観察して同様の検討をおこなったところ、リンパ節転移・術後再発群はすべてERβを高発現しており、悪性度と高い相関を示すことを見出している（非特許文献１）。 Next, the expression of estrogen receptor β (ERβ), which may be involved in the metabolic cascade of p53 protein, was observed immunostainingly and the same examination was performed. Has been found to be highly expressed and highly correlated with malignancy (Non-Patent Document 1).
一方、ブルーム症候群（Bloom syndrome）は生下時からの小柄な体型、日光過敏性紅斑、免疫不全症を特徴とする常染色体劣性の遺伝性疾患であり、なかでも際立った特徴は癌腫の合併が高率に認められることである。病因遺伝子はRecQヘリカーゼファミリーに属するBLM遺伝子である。 On the other hand, Bloom syndrome is an autosomal recessive hereditary disease characterized by a small body shape from birth, sun-sensitive erythema, and immunodeficiency, and the most prominent feature is the complication of cancer. It is recognized at a high rate. The causative gene is a BLM gene belonging to the RecQ helicase family.
BLMタンパク質は精巣、卵巣、胸腺、脾臓など細胞周期を活発に繰り返している増殖活性の高い組織に強く発現しているとされている。腎臓、肺、大腸、乳腺などの悪性腫瘍においてはBLMの発現が免疫組織学的に低下していること、また実際にBLM遺伝子ノックアウトマウスでは様々な部位に悪性腫瘍が発生することが報告されているが、子宮内膜癌を含めて婦人科悪性腫瘍に関わるBLMの分子生物学的意義については報告例がない。 The BLM protein is said to be strongly expressed in tissues with high proliferative activity, such as the testis, ovary, thymus, and spleen, which actively repeat the cell cycle. It has been reported that BLM expression is immunohistologically reduced in malignant tumors such as kidney, lung, colon, and mammary gland, and that malignant tumors actually develop in various sites in BLM gene knockout mice. However, there are no reports on the molecular biological significance of BLM related to gynecologic malignancies, including endometrial cancer.
子宮内膜癌の患者のほとんどは閉経後に発症しており、子宮内膜癌の増悪化をエストロゲン依存機構で説明するのは疑問の余地があると考えられた。 Most patients with endometrial cancer develop after menopause, and it seems questionable to explain the exacerbation of endometrial cancer by estrogen-dependent mechanisms.
また、子宮内膜癌のうちグレード1及び2は比較的悪性度が低いと考えられているが、しばしば原発病変部の進行程度に比して予想に反するリンパ節転移や遠隔転移、あるいは再発をきたしてくる症例が存在し、臨床的に問題となっている。しかしながら、上記の通り、現在術前にグレード1及び2の子宮内膜癌の悪性度を的確に予測できる臨床的に有効なパラメーターはない。 In addition, grades 1 and 2 of endometrial cancer are considered to be relatively low-grade, but often have unexpected lymph node metastasis, distant metastasis, or recurrence compared to the degree of progression of the primary lesion. There are cases that have come and are clinically problematic. However, as mentioned above, there are currently no clinically effective parameters that can accurately predict the malignancy of grade 1 and 2 endometrial cancer before surgery.
多くの抗癌治療と同様に、子宮内膜癌においても、早期発見及び早期治療は非常に重要であり、子宮内膜癌の発症を検出するためのマーカーが求められている。子宮内膜形態変化の初期段階で癌化のリスクを正確に判定することが可能となれば、子宮内膜検査の頻度を患者ごとに調整することができる。 As with many anti-cancer treatments, early detection and treatment are very important for endometrial cancer, and markers for detecting the onset of endometrial cancer are sought. If the risk of canceration can be accurately determined in the early stages of endometrial morphological changes, the frequency of endometrial examinations can be adjusted for each patient.
本発明者等は、ERβに並行して発現が変化する因子を探索する目的で、抗ERβ抗体に交差反応する可能性のある候補分子群について探索した。その中で、遺伝子の複製・修復に必須なRecQヘリカーゼファミリーに属するBLMに着目し、手術検体におけるBLMの免疫組織学的発現を調べた結果、その発現が子宮内膜癌の発症の予測因子となり得ることを見出した。 The present inventors searched for a group of candidate molecules that may cross-react with the anti-ERβ antibody for the purpose of searching for factors whose expression changes in parallel with ERβ. Among them, we focused on BLM belonging to the RecQ helicase family, which is essential for gene replication and repair, and investigated the immunohistological expression of BLM in surgical specimens. As a result, the expression became a predictor of the onset of endometrial cancer. Found to get.
BLMの発現検討は核移行シグナル(NLS)と呼ばれる塩基性のアミノ酸配列を含む領域を免疫原として作成された抗体を使用して実験を行ったところ、正常子宮内膜では腺上皮細胞の核にBLMの発現が認められるのに対し、子宮内膜癌では上皮細胞においてBLMの発現が認められないあるいは限局的に弱く発現が認められる程度であった。またその染色様式に子宮内膜癌の再発の有無や悪性度との関連は観察されなかったものの、子宮内膜癌の前癌病変である子宮内膜増殖症においてもBLMの発現低下が確認された。この結果は病変部においてBLMの核内移行機構に何らかの機能異常が存在することを示唆する。 BLM expression was investigated using an antibody prepared using a region containing a basic amino acid sequence called nuclear localization signal (NLS) as an immunogen, and found in the nucleus of glandular epithelial cells in the normal endometrium. BLM expression was observed, whereas in endometrial cancer, BLM expression was not observed in epithelial cells or was localized and weakly expressed. In addition, although the presence or absence of recurrence of endometrial cancer and the association with malignancy were not observed in the staining pattern, decreased expression of BLM was confirmed in endometrial hyperplasia, which is a precancerous lesion of endometrial cancer. rice field. This result suggests that there is some dysfunction in the nuclear translocation mechanism of BLM in the lesion.
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１． 被験体由来の生物学的サンプル中のブルーム症候群タンパク質（Bloom syndrome protein, BLM）の機能異常を検出することを特徴とする、被験体における子宮内膜癌の発症の予測方法。
２． 機能異常が、BLMタンパク質又はBLM mRNAの発現低下である、上記１記載の方法。
３． 被験体由来のサンプル中のBLMタンパク質又はBLM mRNAの発現が、正常の対照サンプルにおける発現又は基準値と比較して低下した場合に子宮内膜癌の発症の可能性があると判定するステップを含む、上記２記載の方法。
４． 機能異常がBLMタンパク質の核内移行機構の異常である、上記１記載の方法。
５． 被験体由来のサンプル中のBLMタンパク質の核内移行が、正常の対照サンプルにおける核内移行と比較して低下した場合に子宮内膜癌の発症の可能性があると判定するステップを含む、上記４記載の方法。
６． 生物学的サンプルが、被験体から採取された子宮内膜組織である、上記１～５のいずれか記載の方法。
７． BLMタンパク質に特異的に結合する抗体を用いてBLMタンパク質の発現を検出する、上記１～６のいずれか記載の方法。
８． ウェスタンブロット法、免疫組織学的検出法、免疫沈降法、又はELISA法によってBLMタンパク質の発現を検出する、上記７記載の方法。
９． BLM mRNAの発現を検出する、上記１～６のいずれか記載の方法。
１０． RT-PCRによってBLM mRNAの発現を検出する、上記９記載の方法。
１１． BLMタンパク質若しくはBLM mRNAに特異的に結合する試薬を含有する、被験体における子宮内膜癌の発症の予測のための検出薬。
１２． BLMタンパク質若しくはBLM mRNAに特異的に結合する試薬を含有する、被験体における子宮内膜癌の発症の予測のための検出キット。
That is, the present invention provides the following.
1. 1. A method for predicting the development of endometrial cancer in a subject, which comprises detecting dysfunction of Bloom syndrome protein (BLM) in a biological sample derived from the subject.
2. 2. The method according to 1 above, wherein the dysfunction is a decrease in the expression of BLM protein or BLM mRNA.
3. 3. Includes the step of determining the likelihood of developing endometrial cancer if the expression of BLM protein or BLM mRNA in a subject-derived sample is reduced compared to the expression in a normal control sample or reference value. , The method according to 2 above.
4. The method according to 1 above, wherein the dysfunction is an abnormality in the nuclear translocation mechanism of the BLM protein.
5. The above, comprising the step of determining the potential for developing endometrial cancer if the nuclear transfer of BLM protein in a subject-derived sample is reduced compared to the nuclear transfer in a normal control sample. 4 The method described.
6. The method according to any one of 1 to 5 above, wherein the biological sample is endometrial tissue taken from a subject.
7. The method according to any one of 1 to 6 above, wherein the expression of the BLM protein is detected by using an antibody that specifically binds to the BLM protein.
8. 7. The method according to 7 above, wherein the expression of BLM protein is detected by Western blotting, immunohistological detection, immunoprecipitation, or ELISA.
9. The method according to any one of 1 to 6 above, which detects the expression of BLM mRNA.
10. 9. The method according to 9 above, wherein the expression of BLM mRNA is detected by RT-PCR.
11. A detection agent for predicting the development of endometrial cancer in a subject, which contains a reagent that specifically binds to a BLM protein or BLM mRNA.
12. A detection kit for predicting the development of endometrial cancer in a subject, which contains a reagent that specifically binds to BLM protein or BLM mRNA.
本発明により、子宮内膜癌の発症を予測するための新たな分子マーカーが提供される。 The present invention provides new molecular markers for predicting the development of endometrial cancer.
本発明は、被験体由来の生物学的サンプル中のブルーム症候群タンパク質（Bloom syndrome protein, 以下BLM又はBLMタンパク質という）の機能異常を検出することを特徴とする、被験体における子宮内膜癌の発症の予測方法を提供する。
本明細書において、BLMの「機能異常」とは、BLMタンパク質が本来有する機能が発揮されていない状態をいい、いかなるメカニズムによるものであっても良く、例えばBLMタンパク質若しくはBLM mRNAの発現低下又は消失、BLMタンパク質が本来有するRecQヘリカーゼ活性の低下又は消失、核移行シグナル(NLS)領域等でのBLMタンパク質の変異、あるいはBLMタンパク質が作用を発揮するために必要な核内移行の異常等を挙げることができる。
The present invention is characterized by detecting dysfunction of Bloom syndrome protein (hereinafter referred to as BLM or BLM protein) in a biological sample derived from a subject. Provides a prediction method for.
As used herein, the term "dysfunction" of BLM refers to a state in which the original function of BLM protein is not exerted, and may be due to any mechanism, for example, decreased expression or disappearance of BLM protein or BLM mRNA. , Decrease or disappearance of RecQ helicase activity inherent in BLM protein, mutation of BLM protein in nuclear localization signal (NLS) region, etc., or abnormality of nuclear translocation necessary for BLM protein to exert its action. Can be done.
本発明の一実施形態では、検出すべき機能異常は、BLMタンパク質又はBLM mRNAの発現低下である。すなわち、本発明は、被験体由来の生物学的サンプル中のBLMタンパク質又はBLM mRNAの発現を検出することを特徴とする、被験体における子宮内膜癌の発症の予測方法であり、被験体由来のサンプル中のBLMタンパク質又はBLM mRNAの発現が、正常の対照サンプルにおける発現又は基準値と比較して低下した場合に子宮内膜癌の発症の可能性があると判定するステップを含む。 In one embodiment of the invention, the dysfunction to be detected is decreased expression of BLM protein or BLM mRNA. That is, the present invention is a method for predicting the onset of endometrial cancer in a subject, which comprises detecting the expression of BLM protein or BLM mRNA in a biological sample derived from the subject, and is derived from the subject. Includes the step of determining the likelihood of developing endometrial cancer if the expression of BLM protein or BLM mRNA in the sample is reduced compared to the expression or baseline in a normal control sample.
本明細書において、「発現」とは、遺伝子と相補的なRNA（転写産物）の発現、及び遺伝子がコードするタンパク質（翻訳産物）の発現の双方を含めるものとする。従って、本明細書において、「発現量（発現レベル）」とは、転写産物又は翻訳産物の発現量又は発現強度をいう。発現量は通常、遺伝子に対応する転写産物の産生量、又はその翻訳産物の産生量、翻訳産物であるタンパク質の活性等により解析することができる。 As used herein, "expression" shall include both the expression of RNA (transcription product) complementary to the gene and the expression of the protein (translation product) encoded by the gene. Therefore, as used herein, the term "expression level (expression level)" refers to the expression level or expression intensity of a transcript or translation product. The expression level can usually be analyzed by the production amount of the transcript corresponding to the gene, the production amount of the translation product, the activity of the protein as the translation product, and the like.
従って、BLMの「発現」とは、BLM遺伝子からのBLM mRNAの転写、及びBLMタンパク質への翻訳のいずれも含み得る。 Thus, "expression" of BLM can include both transcription of BLM mRNA from the BLM gene and translation into BLM protein.
本明細書において、理解を容易にするために、BLMタンパク質についてはBLMと記載し、BLMタンパク質をコードする遺伝子（DNA又はmRNA）についてはBlmと記載することがあるが、当分野において、これらの記載は必ずしも明確に区別されない場合があることは理解されたい。 In the present specification, for ease of understanding, the BLM protein may be referred to as BLM, and the gene encoding the BLM protein (DNA or mRNA) may be referred to as Blm. It should be understood that the statements may not always be clearly distinguished.
本発明の別の実施形態では、検出すべき機能異常はBLMタンパク質の核内移行機構の異常である。すなわち、本発明は、被験体由来のサンプル中のBLMタンパク質の核内移行が、正常の対照サンプルにおける核内移行と比較して低下した場合に子宮内膜癌の発症の可能性があると判定するステップを含む。
核内移行の異常又は低下は、例えば子宮内膜組織サンプルを用いた免疫組織化学的染色によって、細胞におけるBLMタンパク質の発現を検出することによって確認することができる。
In another embodiment of the invention, the dysfunction to be detected is an abnormality in the nuclear translocation mechanism of the BLM protein. That is, the present invention determines that endometrial cancer may develop when the nuclear translocation of BLM protein in a subject-derived sample is reduced compared to the nuclear translocation in a normal control sample. Includes steps to do.
Abnormalities or reductions in nuclear translocation can be confirmed by detecting the expression of BLM protein in cells, for example by immunohistochemical staining with endometrial tissue samples.
本発明において、被験体は、哺乳動物であり、特に限定するものではないが、ヒトであることが好ましい。子宮内膜癌の発症を検出する目的の場合、被験体は、子宮癌検診を受診する被験体であり得る。また、子宮内膜癌の転移又は再発を検出する目的の場合、被験体は、子宮内膜癌を有するとして診断された被験体、及び子宮摘出等の子宮癌治療を受けた被験体であり得る。あるいは、本発明の方法を治療薬の開発等の研究で利用するためには、被験体は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル等の非ヒト哺乳動物であり得る。 In the present invention, the subject is a mammal, and is not particularly limited, but is preferably a human. For the purpose of detecting the development of endometrial cancer, the subject may be the subject undergoing uterine cancer screening. In addition, for the purpose of detecting metastasis or recurrence of endometrial cancer, the subject may be a subject diagnosed as having endometrial cancer and a subject who has undergone uterine cancer treatment such as hysterectomy. .. Alternatively, in order to utilize the method of the present invention in studies such as the development of therapeutic agents, the subject may be a non-human mammal such as a mouse, rat, rabbit, pig, monkey or the like.
本発明において、生物学的サンプルは、特に限定するものではないが、被験体から採取された全血、血漿、血清、又は子宮組織であり得る。好ましくは、生物学的サンプルは、子宮癌検診、あるいは子宮摘出等の外科手術等の際に採取された細胞診検体又は子宮組織、特に子宮内膜組織である。 In the present invention, the biological sample can be, but is not limited to, whole blood, plasma, serum, or uterine tissue collected from a subject. Preferably, the biological sample is a cytological sample or uterine tissue, particularly endometrial tissue, taken during uterine cancer screening, surgical operations such as hysterectomy, and the like.
ヒトBLMタンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する1417アミノ酸からなる分子量159kDaのタンパク質である。
ヒトBLMタンパク質のアミノ酸配列の更なる情報は、米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information, NCBI）が管理するデータベース等からAccession No.: AAW62255として取得することができる。また、ヒトBLMタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列については、同様にAccession No.: AY886902として取得することができる。非ヒト哺乳動物におけるBLMタンパク質のアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列等の情報についても、同様に取得することができる。
The human BLM protein is a protein having a molecular weight of 159 kDa consisting of 1417 amino acids having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
Further information on the amino acid sequence of human BLM protein can be obtained as Accession No .: AAW62255 from a database managed by the National Center for Biotechnology Information (NCBI). The nucleotide sequence of the gene encoding the human BLM protein can also be obtained as Accession No .: AY886902. Information such as the amino acid sequence of the BLM protein in non-human mammals and the base sequence of the gene encoding the same can also be obtained in the same manner.
BLMタンパク質におけるヘリカーゼ活性に関与する領域はタンパク質分子のほぼ中央に位置している。ヘリカーゼは核酸のリン酸エステル骨格に沿って動きながら絡み合う核酸をほどく酵素であり、核内で機能すると考えられるが、細胞質で合成されたタンパク質が核膜を通過して核に入るには核移行シグナル(NLS)と呼ばれる塩基性のアミノ酸配列が必要であり、NLSはC末端に近い領域に存在している。NLSが不完全なタンパク質は、たとえ生化学的な酵素活性がほぼ正常であったとしても、核内への移行が妨げられ、細胞内で正常に機能することができないと考えられる。 The region involved in helicase activity in BLM proteins is located approximately in the center of the protein molecule. Helicase is an enzyme that unwinds entangled nucleic acids while moving along the phosphate ester skeleton of nucleic acids, and is thought to function in the nucleus. A basic amino acid sequence called a signal (NLS) is required, and NLS is located near the C-terminal. Proteins with incomplete NLS are thought to be unable to function normally in cells because their biochemical enzyme activity is almost normal, but their translocation into the nucleus is impeded.
BLMの発現の検出は、サンプル中のBLMの存在又は増減（変動）を検出することを含む。更に、本発明の方法は、例えば、被験体由来のサンプル中のBLM発現を検出するステップに加えて、子宮内膜癌を有さない正常の対照サンプルにおけるBLM発現、又は予め作成した基準値と比較して子宮内膜癌の発症の可能性があると判定するステップを含み得る。 Detection of BLM expression involves detecting the presence or increase / decrease (variation) of BLM in a sample. Further, the method of the present invention, for example, in addition to the step of detecting BLM expression in a sample derived from a subject, BLM expression in a normal control sample without endometrial cancer, or a reference value prepared in advance. It may include a step of determining the possibility of developing endometrial cancer in comparison.
BLMタンパク質の発現は、特に限定するものではないが、一般的には、当分野で通常行われているように、BLMタンパク質に特異的に結合する試薬を用いて検出することができる。BLMタンパク質に対して特異的に結合する試薬としては、限定するものではないが、例えば、抗体又はアプタマーが挙げられる。 The expression of the BLM protein is not particularly limited, but can be generally detected by using a reagent that specifically binds to the BLM protein, as is usually performed in the art. Reagents that specifically bind to the BLM protein include, but are not limited to, antibodies or aptamers.
試薬は、BLMタンパク質のいずれの領域を認識するものであっても良く、例えばヘリカーゼ活性に関与する領域、N末端領域、C末端領域、NLSを含む領域等を認識する試薬を適宜使用することができる。例えばNLSを含む領域を認識する試薬を用いて、BLMの核内移行の異常の有無について確認することができる。 The reagent may recognize any region of the BLM protein, and for example, a reagent that recognizes a region involved in helicase activity, an N-terminal region, a C-terminal region, a region containing NLS, etc. may be appropriately used. can. For example, using a reagent that recognizes a region containing NLS, it is possible to confirm the presence or absence of abnormalities in the nuclear translocation of BLM.
本発明において用いる抗体は、BLMタンパク質を特異的に認識して結合し得る抗体であって、BLMタンパク質に結合し、他のタンパク質には結合しない抗体であることが好ましい。 The antibody used in the present invention is preferably an antibody capable of specifically recognizing and binding to a BLM protein, and is preferably an antibody that binds to the BLM protein and does not bind to other proteins.
本明細書において、「結合する」及び「特異的に結合する」とは、特に限定するものではないが、抗原と抗体との結合が10-8M以下、好ましくは10-9M以下、より好ましくは10-10M以下のKD値の結合親和性を有するものであることを意味し得る。 In the present specification, "binding" and "specifically binding" are not particularly limited, but the binding between the antigen and the antibody is 10 -8 M or less, preferably 10 -9 M or less, and more. It may mean that it has a binding affinity of KD value of 10 -10 M or less.
あるいはまた、本明細書において「BLMタンパク質に特異的に結合する」とは、BLMタンパク質に対する結合が、一般的な結合アッセイで検出して、BLMタンパク質以外の物質に対する結合と比較して2倍以上、3倍以上、4倍以上である場合を意味し得る。例えば、当分野で通常使用される蛍光標識によって結合を検出する場合に、S/N比が2以上、3以上、4以上である場合を意味し得る。 Alternatively, as used herein, "specifically binds to a BLM protein" means that the binding to the BLM protein is detected by a general binding assay and is more than twice as much as the binding to a substance other than the BLM protein. , 3 times or more, can mean 4 times or more. For example, when the binding is detected by a fluorescent label commonly used in the art, it may mean that the S / N ratio is 2 or more, 3 or more, or 4 or more.
本発明において用いる抗体は、BLMタンパク質に特異的に結合するものである限り、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体であっても良いが、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、本発明の抗体は、子宮内膜癌の発症の検出のためにin vitroで使用することが意図され、従って、マウス、ウサギ、ヤギ等の非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれであっても良く、特に限定するものではない。 The antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it specifically binds to the BLM protein, but a monoclonal antibody is preferable. The antibodies of the present invention are also intended for use in vitro for the detection of the development of endometrial cancer, and are therefore non-human antibodies such as mice, rabbits, goats, chimeric antibodies, humanized antibodies, humans. It may be any of the antibodies and is not particularly limited.
抗原が特定されている場合の抗体の作製方法は当分野において周知である。本発明において使用し得る抗体は、BLMタンパク質又はその断片を非ヒト哺乳動物に免疫して、公知の手法によってポリクローナル抗体として取得することができる。また、モノクローナル抗体は、BLMタンパク質に対する抗体を産生する抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させて得られるハイブリドーマから得ることができる。 Methods for producing antibodies when an antigen has been identified are well known in the art. The antibody that can be used in the present invention can be obtained as a polyclonal antibody by immunizing a non-human mammal with a BLM protein or a fragment thereof by a known method. Monoclonal antibodies can also be obtained from hybridomas obtained by fusing antibody-producing cells that produce antibodies against the BLM protein with myeloma cells.
本発明において使用し得る抗体はまた、活性が実証された抗体のアミノ酸配列情報又は該抗体をコードするポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づいて、遺伝子工学的手法を用い、あるいは化学合成手段を用いて、合成によって取得することもできる。活性が実証された抗体の配列情報に基づいて更なる抗体を作製する場合、特に元の抗体の相補性決定領域（CDR）の配列を考慮して、同一又は同等の結合親和性を有する抗体を作製することができ、また更に結合親和性の高い抗体を得ることもできる。 Antibodies that can be used in the present invention are also based on the amino acid sequence information of the antibody whose activity has been demonstrated or the base sequence information of the polynucleotide encoding the antibody, using genetic engineering techniques or using chemical synthesis means. , Can also be obtained by synthesis. When making further antibodies based on the sequence information of an antibody whose activity has been demonstrated, an antibody having the same or equivalent binding affinity is selected, especially considering the sequence of complementarity determining regions (CDRs) of the original antibody. It can be produced, and an antibody having a higher binding affinity can also be obtained.
遺伝子工学的手法によって抗体を作製する場合、重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に導入して発現させ、組換えタンパク質として得ることができる。この場合、ポリヌクレオチドはDNAであってもRNAであっても良く、また宿主細胞への導入手段は当分野で使用されているものを適宜利用することができる。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するためのベクターとして、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクター等を適宜使用することができる。宿主細胞としては、例えば大腸菌等の細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等を利用することができる。ここで、重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、別個のベクターに導入しても、同一のベクターに連結して導入しても良い。 When an antibody is produced by a genetic engineering technique, a polynucleotide encoding a heavy chain and a light chain can be introduced into an appropriate host cell and expressed to obtain a recombinant protein. In this case, the polynucleotide may be DNA or RNA, and as the means for introduction into the host cell, those used in the art can be appropriately used. As a vector for introducing a polynucleotide into a host cell, a viral vector, a plasmid vector, a phage vector and the like can be appropriately used. As the host cell, for example, bacteria such as Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells and the like can be used. Here, the polynucleotides encoding the heavy chain and the light chain may be introduced into separate vectors or linked to the same vector.
例えば、本発明において使用し得る抗体の重鎖及び軽鎖をコードするcDNAを、場合によってシグナル配列、ポリA配列、更にプロモーター配列等の調節配列、選択マーカーと共に含むベクターに組み込んで、適切な宿主細胞中に導入して培養することで、BLMタンパク質又はその断片を特異的に認識し得る抗体を組換えタンパク質として取得することができる。 For example, a cDNA encoding a heavy chain and a light chain of an antibody that can be used in the present invention is optionally incorporated into a vector containing a signal sequence, a poly A sequence, a regulatory sequence such as a promoter sequence, and a selection marker to be a suitable host. By introducing into cells and culturing, an antibody capable of specifically recognizing a BLM protein or a fragment thereof can be obtained as a recombinant protein.
従って、本発明において使用し得る抗体は、上記のようにして作製された抗体であり、例えば遺伝子工学的手法を用いて取得された組換えタンパク質であるか、あるいは化学合成手段を用いて合成されたタンパク質であり得る。 Therefore, the antibody that can be used in the present invention is an antibody produced as described above, for example, a recombinant protein obtained by using a genetic engineering technique, or synthesized by using a chemical synthesis means. Can be a protein.
本発明において使用し得る抗体をモノクローナル抗体として使用する場合、抗体は、IgG抗体分子、IgM抗体分子、又はそれらの抗原結合性断片及び抗原結合性誘導体であり得る。例えば、抗体は、完全抗体、Fab、Fab'、F(ab')2断片、また重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）をリンカーで連結した一本鎖抗体（scFv）断片、scFv-Fc、sc(Fv)2、Fv、ダイアボディー等であり得る。 When an antibody that can be used in the present invention is used as a monoclonal antibody, the antibody can be an IgG antibody molecule, an IgM antibody molecule, or an antigen-binding fragment thereof and an antigen-binding derivative thereof. For example, the antibody is a complete antibody, a Fab, Fab', F (ab') fragment, or a single - chain antibody (scFv) fragment in which a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) are linked with a linker. , ScFv-Fc, sc (Fv) 2 , Fv, diabody, etc.
scFv、scFv-Fc、及びsc(Fv)2はリンカーで可変領域を連結した合成ポリペプチドである。リンカーとしては、当分野で通常使用されるものであればいずれでも良く、特に限定するものではないが、例えば5～25個、好ましくは10～20個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカー、例えばGSリンカー等を好適に使用することができる。 scFv, scFv-Fc, and sc (Fv) 2 are synthetic polypeptides in which variable regions are linked with a linker. The linker may be any as long as it is usually used in the art, and is not particularly limited, but is, for example, a peptide linker consisting of 5 to 25 amino acid residues, preferably 10 to 20 amino acid residues, for example, GS. A linker or the like can be preferably used.
本発明において使用し得る抗体には更に、抗原結合性に影響しない範囲で当業者に理解され得る誘導体、例えば抗体精製を容易にしたり安定性を高めたりするための修飾が施された誘導体も含まれる。本明細書においては、BLMタンパク質との結合性を保持する断片及び誘導体を、文脈に矛盾のない限り、便宜的に「抗体」に含めることが意図される。 Antibodies that can be used in the present invention further include derivatives that can be understood by those skilled in the art to the extent that they do not affect antigen binding, such as derivatives that have been modified to facilitate antibody purification or enhance stability. Will be. As used herein, fragments and derivatives that retain binding to the BLM protein are intended to be conveniently included in "antibodies" as long as the context is consistent.
本発明において使用し得る抗体はまた、二量体、三量体、四量体等の多量体として合成することもできる。更に、本発明において使用し得る抗体は、BLMタンパク質に結合する第1の特異性と、他の抗原に対して結合する第2の特異性とを有する二重特異性抗体であっても良い。当業者であれば、本明細書の記載、及び当分野における技術常識に基づいて、本発明の抗体を用途に応じた適切な形態のものとして取得することができる。 Antibodies that can be used in the present invention can also be synthesized as multimers such as dimers, trimers and tetramers. Further, the antibody that can be used in the present invention may be a bispecific antibody having a first specificity that binds to a BLM protein and a second specificity that binds to another antigen. A person skilled in the art can obtain the antibody of the present invention in an appropriate form according to the intended use, based on the description of the present specification and the common general knowledge in the art.
本発明において使用し得る抗体として、BLMタンパク質に対する結合特異性を有する抗体として市販されているものを使用しても良く、またそのような抗体の合成を依頼することもできる。例えばInvitrogen社、Santa Cruz Biotechnology社、Sigma-Aldrich社等からヒトBLMに対する反応性を有するものが提供されており、これらを適宜入手して使用することができる。 As the antibody that can be used in the present invention, a commercially available antibody having binding specificity to the BLM protein may be used, or the synthesis of such an antibody may be requested. For example, Invitrogen, Santa Cruz Biotechnology, Sigma-Aldrich and the like have provided products having reactivity with human BLM, and these can be appropriately obtained and used.
更に、本発明において使用し得る抗体は、検出のために標識された抗体であっても良く、標識は、特に限定するものではないが、例えば蛍光色素標識、酵素標識、放射性標識等であって良い。検出のための抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても良い。 Further, the antibody that can be used in the present invention may be an antibody labeled for detection, and the label is not particularly limited, but may be, for example, a fluorescent dye label, an enzyme label, a radioactive label, or the like. good. The antibody for detection may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
抗体の検出のためには、限定するものではないが、例えばウェスタンブロット法、免疫組織学的検出法、免疫沈降法、又はELISA法を利用することができる。 For antibody detection, for example, but not limited to, Western blotting, immunohistological detection, immunoprecipitation, or ELISA can be utilized.
ウェスタンブロット法による検出は、BLMタンパク質を含み得る生物学的サンプルを、SDS-PAGEによって展開した後、タンパク質を疎水性膜に転写し、BLMタンパク質に特異的に結合し得る抗体を用いて検出することを含む。 For Western blotting detection, a biological sample that may contain the BLM protein is developed by SDS-PAGE, then the protein is transferred to a hydrophobic membrane and detected using an antibody that can specifically bind to the BLM protein. Including that.
免疫組織学的検出法は、被験体から採取した組織切片を固定した後、BLMタンパク質とこれに対する抗体との結合を可視化することによって行う。可視化のための方法としては、オートラジオグラフィー、金コロイド法、蛍光抗体法、酵素抗体法等が挙げられ、また、抗体の標識は、BLMタンパク質に対して結合する抗体を直接標識するものであっても、標識した二次抗体を使用するものであっても良い。可視化された検出結果から、BLMタンパク質の発現の低下又は消失が生じているか否かを視覚的に確認することができる。 Immunohistological detection is performed by fixing a tissue section taken from a subject and then visualizing the binding of the BLM protein to an antibody against it. Examples of the method for visualization include autoradiography, colloidal gold method, fluorescent antibody method, enzyme antibody method and the like, and antibody labeling directly labels an antibody that binds to a BLM protein. However, it may be one that uses a labeled secondary antibody. From the visualized detection results, it is possible to visually confirm whether or not the expression of the BLM protein is reduced or eliminated.
免疫沈降法は、生物学的サンプル中のBLMタンパク質と、これに対する抗体との反応で得られる複合体を形成させ、ビーズに固相化したプロテインA若しくはG又は二次抗体と結合させた後、未結合の物質と分離することを含む。 The immunoprecipitation method forms a complex obtained by reacting a BLM protein in a biological sample with an antibody against the BLM protein, binds the protein A or G immobilized on beads, or a secondary antibody, and then binds the BLM protein to a secondary antibody. Includes separation from unbound substances.
ELISA法は、抗原抗体反応の後、酵素標識した一次抗体又は二次抗体による酵素活性を測定して数値化することを含み、直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法が知られ、当分野において広く使用されている検出・定量方法である。 The ELISA method includes measuring and quantifying the enzyme activity of an enzyme-labeled primary antibody or secondary antibody after an antigen-antibody reaction, and direct methods, indirect methods, sandwich methods, and competitive methods are known in the art. It is a detection / quantification method widely used in the art.
アプタマーは、DNA又はRNA等の核酸分子、あるいはペプチドであり得る。アプタマーを用いたタンパク質の検出は、限定するものではないが、アプタマーとタンパク質との結合を、抗体と同様に複数のアプタマーを用いるサンドイッチアッセイ等のイムノアッセイ、結合若しくは結合によるアプタマーの構造変化を電気化学センサー等のセンサーを利用してアッセイすること等で行うことができる。アプタマーは、抗体と同様に蛍光標識、放射性標識、酵素、ビオチン等による標識をすることができ、また、例えば核酸分子であるアプタマーとハイブリダイズし得る第２の核酸分子をそのように標識して検出のために用いても良い。 Aptamers can be nucleic acid molecules such as DNA or RNA, or peptides. Detection of proteins using aptamers is not limited, but the binding between aptamers and proteins is measured by immunoassays such as sandwich assays using multiple aptamers as in antibodies, and structural changes of aptamers due to binding or binding. It can be performed by assaying using a sensor such as a sensor. The aptamer can be labeled with a fluorescent label, a radioactive label, an enzyme, biotin, etc. like an antibody, and for example, a second nucleic acid molecule capable of hybridizing with the aptamer, which is a nucleic acid molecule, is labeled as such. It may be used for detection.
BLMタンパク質に対して特異的に結合し得るアプタマーは、例えばSELEX法等を用いたスクリーニングによってBLMタンパク質に対して特異的に結合するものを取得することができる。あるいは、アプタマーは、そのようなスクリーニングの実施を業者に委託して取得することもできる。 As the aptamer that can specifically bind to the BLM protein, for example, one that specifically binds to the BLM protein can be obtained by screening using the SELEX method or the like. Alternatively, the aptamer may outsource the implementation of such screening to a vendor.
本発明の方法はまた、生物学的サンプル中、例えば子宮内膜組織サンプル中のBLM mRNAの検出により行っても良い。mRNAの代わりに、mRNAから逆転写されて得られるcDNAの検出であっても良い。 The method of the invention may also be performed by detection of BLM mRNA in a biological sample, eg, an endometrial tissue sample. Instead of mRNA, it may be the detection of cDNA obtained by reverse transcription from mRNA.
BLM mRNAの発現量の測定は、例えばBLM mRNAの塩基配列の全部又は一部を含むヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして用いてサンプル中の遺伝子発現の程度を測定すればよく、例えばマイクロアレイ（マイクロチップ）を用いた方法、ノーザンブロット法、定量的PCR法等で測定することが可能である。定量的PCR法としては、アガロースゲル電気泳動法、蛍光プローブ法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、ATAC-PCR法(Kato,K.et al.,Nucl.Acids Res.,25,4694-4696,1997)、Taqman PCR法（SYBR（登録商標）グリーン法）（Schmittgen TD,Methods25,383-385,2001）、Body Map法(Gene,174,151-158(1996))、Serial analysis of gene expression(SAGE)法（米国特許第527,154号、第544,861号、欧州特許公開第0761822号）、MAGE法(Micro-analysis of Gene Expression)（特開2000-232888号）等が知られており、これらを適宜使用することができる。これらの方法を用いて、mRNAの量を、該mRNAにハイブリダイズするヌクレオチドプローブ又はプライマーの使用により測定することができる。測定に用いるプローブ又はプライマーの塩基長は、10～50bp、好ましくは15～25bpである。これらのプローブ及びプライマーの塩基配列は、目的のmRNAの塩基配列等に基づいて、当業者が適宜設計することができ、場合によっては市販品を利用することもできる。 The expression level of BLM mRNA may be measured, for example, by using a nucleotide containing all or part of the base sequence of BLM mRNA as a probe or primer to measure the degree of gene expression in the sample, for example, a microarray (microchip). It can be measured by the method used, Northern blotting, quantitative PCR method, or the like. Quantitative PCR methods include agarose gel electrophoresis, fluorescent probe method, RT-PCR method, real-time PCR method, and ATAC-PCR method (Kato, K. et al., Nucl. Acids Res., 25, 4694-4696). , 1997), Taqman PCR method (SYBR® green method) (Schmittgen TD, Methods25,383-385,2001), Body Map method (Gene, 174,151-158 (1996)), Serial analysis of gene expression (SAGE) ) Method (US Patent No. 527,154, 544,861, European Patent Publication No. 0761822), MAGE Method (Micro-analysis of Gene Expression) (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-232888), etc. are known, and these are used as appropriate. can do. Using these methods, the amount of mRNA can be measured by the use of nucleotide probes or primers that hybridize to the mRNA. The base length of the probe or primer used for the measurement is 10 to 50 bp, preferably 15 to 25 bp. The base sequences of these probes and primers can be appropriately designed by those skilled in the art based on the base sequences of the target mRNA and the like, and commercially available products can also be used in some cases.
BLMの発現の検出は、サンプル中のBLMタンパク質若しくはBLM mRNAの存在又は増減（変動）を検出することを含む。更に、本発明の方法は、例えば、被験体由来のサンプル中のBLM発現を検出するステップに加えて、子宮内膜癌を有さない正常の対照サンプルにおけるBLM発現、又は予め作成した基準値と比較して子宮内膜癌の発症の可能性があると判定するステップを含み得る。「基準値」は、例えばサンプル中のBLMタンパク質若しくはBLM mRNA濃度、BLMタンパク質に結合する試薬、例えば抗体若しくはアプタマー量（絶対量若しくは標識に由来する蛍光強度等）等として得ることができる。あるいは、「基準値」は、ウェスタンブロットで検出されたバンド強度から算出することもできる。 Detection of BLM expression involves detecting the presence or increase (variation) of BLM protein or BLM mRNA in a sample. Further, the method of the present invention, for example, in addition to the step of detecting BLM expression in a sample derived from a subject, BLM expression in a normal control sample without endometrial cancer, or a reference value prepared in advance. It may include a step of determining the possibility of developing endometrial cancer in comparison. The "reference value" can be obtained, for example, as the BLM protein or BLM mRNA concentration in the sample, the reagent that binds to the BLM protein, for example, the amount of antibody or aptamer (absolute amount, fluorescence intensity derived from the label, etc.) and the like. Alternatively, the "reference value" can be calculated from the band intensity detected by Western blotting.
発現量は、絶対値で表してもよく、また相対値で表してもよい。従って、「発現の低下」は、基準値に対して低下した発現レベルとして、あるいはまた、発現の「変化倍率（fold-change）」として表すことができる。本発明の方法において、子宮内膜癌の発症の予測のために好適な「発現の低下」における発現の変動は、例えば2倍以上、3倍以上、4倍以上である。従って、「変化倍率」は、発現の低下においては0.80倍以下（未満）であることが好ましい。 The expression level may be expressed as an absolute value or a relative value. Thus, "decreased expression" can be expressed as a reduced expression level relative to a reference value or also as a "fold-change" of expression. In the method of the present invention, the variation in expression in "decreased expression" suitable for predicting the onset of endometrial cancer is, for example, 2-fold or more, 3-fold or more, 4-fold or more. Therefore, the "magnification of change" is preferably 0.80 times or less (less than) in the decrease in expression.
例えば、子宮内膜癌患者と健常者、あるいは子宮内膜癌への進行段階、例えば子宮内膜増殖症患者における臨床的症状との相関性を考慮して2群（高発現群及び低発現群）又はそれ以上に分けた数値を多数の被験体由来のデータからそれぞれ取得し、統計学的に得られるカットオフ値を基準値として使用することができる。 For example, two groups (high expression group and low expression group) considering the correlation with clinical symptoms in patients with endometrial cancer and healthy subjects, or in the stage of progression to endometrial cancer, for example, patients with endometrial hyperplasia. ) Or more can be obtained from data derived from a large number of subjects, and the statistically obtained cutoff value can be used as a reference value.
上記のような基準値を、対象となる被験体での発現の検出と同時に対照サンプルでの発現を検出することで取得し、発現の比較を行うことができる。あるいはまた、対照サンプルの発現を予め測定し、標準的な発現レベルとして、場合によっては一定の範囲内の発現レベルとして準備しておくこともできる。 The above reference values can be obtained by detecting the expression in the control sample at the same time as the detection of the expression in the target subject, and the expression can be compared. Alternatively, the expression of the control sample can be measured in advance and prepared as a standard expression level, and in some cases, an expression level within a certain range.
上記の基準値を使用して、被験体由来のサンプルからの検出結果に基づいて、その被験体の状態、例えば子宮内膜癌の発症の可能性を予測することが可能となる。上記の基準値と比較して被験体由来のBLMタンパク質の検出結果が低い場合に、その被験体が子宮内膜癌を発症する可能性があると予測することが可能である。 Using the above reference values, it is possible to predict the condition of the subject, for example, the possibility of developing endometrial cancer, based on the detection results from the sample derived from the subject. If the detection result of the BLM protein derived from the subject is lower than the above reference value, it is possible to predict that the subject may develop endometrial cancer.
本発明の方法は、被験体由来のサンプル、例えば細胞診検体中のBLMタンパク質を新たなバイオマーカーとして検出するものである。被験体由来の検出結果から、被験体由来の生物学的サンプル中でBLMタンパク質の発現が低下している場合に、被験体が子宮内膜癌を発症する可能性が示される。 The method of the present invention is to detect a BLM protein in a sample derived from a subject, for example, a cytopathological sample, as a new biomarker. Subject-derived detection results indicate that a subject may develop endometrial cancer if BLM protein expression is reduced in a subject-derived biological sample.
本発明の方法ではまた、BLMの発現に加えて、他の遺伝子／タンパク質の発現を同時に検出しても良い。他の遺伝子／タンパク質としては、子宮内膜癌の発症との関連が報告されているものであっても良く、また他の疾患についてのマーカー遺伝子であっても良い。
例えば、BLMの発現と組み合わせて検出することが好適である遺伝子／タンパク質としては、PTEN、Ras（例えばKRAS）、p53、及び／又はFoxP4遺伝子、及びこれらがコードするタンパク質が挙げられる。
In addition to the expression of BLM, the method of the present invention may also detect the expression of other genes / proteins at the same time. Other genes / proteins may be those that have been reported to be associated with the development of endometrial cancer, or may be marker genes for other diseases.
For example, genes / proteins that are suitable for detection in combination with BLM expression include PTEN, Ras (eg, KRAS), p53, and / or FoxP4 genes, and the proteins they encode.
PTENは、癌抑制遺伝子であることが知られており、ヒトPTEN（phosphatase and tensin homolog）遺伝子がコードするタンパク質は、403アミノ酸からなる。PTEN遺伝子の変異又は発現異常を検出することで、子宮内膜癌が発症する可能性についての情報を提供することができる。ヒトPTENのアミノ酸配列の情報は、米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information, NCBI）が管理するデータベースからGenBank: AAD13528として取得することができる。また、ヒトPTENタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列については、同様にGene ID: 5728として取得することができる。非ヒト哺乳動物におけるPTENタンパク質のアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列等の情報についても、同様に取得することができる。 PTEN is known to be a tumor suppressor gene, and the protein encoded by the human PTEN (phosphatase and tensin homolog) gene consists of 403 amino acids. By detecting mutations or abnormal expression of the PTEN gene, it is possible to provide information on the possibility of developing endometrial cancer. Information on the amino acid sequence of human PTEN can be obtained as GenBank: AAD13528 from a database maintained by the National Center for Biotechnology Information (NCBI). The base sequence of the gene encoding the human PTEN protein can also be obtained as Gene ID: 5728. Information such as the amino acid sequence of the PTEN protein in non-human mammals and the base sequence of the gene encoding the same can also be obtained in the same manner.
ヒトKRAS（KRAS proto-oncogene, GTPase）は、188～189アミノ酸からなるタンパク質であり、Ras GTPアーゼファミリーのメンバーである。KRAS遺伝子の変異又は発現異常を検出することで、子宮内膜癌が発症する可能性についての情報を提供することができる。ヒトJRASタンパク質として複数のアイソフォームが報告されているが、そのアミノ酸配列の情報は、米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information, NCBI）が管理するデータベースからNP_001356715.1等として取得することができる。また、ヒトKRASタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列については、同様にGene ID: 3845として取得することができる。非ヒト哺乳動物におけるKRASタンパク質のアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列等の情報についても、同様に取得することができる。 Human KRAS (KRAS proto-oncogene, GTPase) is a protein consisting of 188 to 189 amino acids and is a member of the Ras GTPase family. By detecting mutations or abnormal expression of the KRAS gene, it is possible to provide information on the possibility of developing endometrial cancer. Although multiple isoforms have been reported as human JRAS proteins, information on their amino acid sequences should be obtained as NP_001356715.1. From a database managed by the National Center for Biotechnology Information (NCBI). Can be done. The base sequence of the gene encoding the human KRAS protein can also be obtained as Gene ID: 3845. Information such as the amino acid sequence of the KRAS protein in non-human mammals and the base sequence of the gene encoding the same can also be obtained in the same manner.
ヒトp53タンパク質は、393アミノ酸からなる癌抑制タンパク質として知られており、p53遺伝子の変異又は発現異常を検出することで、子宮内膜癌が発症する可能性についての情報を提供することができる。ヒトp53タンパク質のアミノ酸配列の情報は、米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information, NCBI）が管理するデータベースからGenBank: BAC16799として取得することができる。また、ヒトp53タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列については、同様にGenBank: AB082923として取得することができる。非ヒト哺乳動物におけるp53タンパク質のアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列等の情報についても、同様に取得することができる。 The human p53 protein is known as a tumor suppressor protein consisting of 393 amino acids, and by detecting a mutation or abnormal expression of the p53 gene, it is possible to provide information on the possibility of developing endometrial cancer. Information on the amino acid sequence of human p53 protein can be obtained as GenBank: BAC16799 from a database maintained by the National Center for Biotechnology Information (NCBI). The base sequence of the gene encoding the human p53 protein can also be obtained as GenBank: AB082923. Information such as the amino acid sequence of the p53 protein in non-human mammals and the base sequence of the gene encoding the same can also be obtained in the same manner.
ヒトFOXP4タンパク質（フォークヘッドボックスタンパク質P4）は、フォークヘッドボックス（Fox）転写因子ファミリーのメンバーである。本発明者等のグループでは、FOXP4が子宮内膜癌のリンパ節/遠隔転移及び術後の再発群で選択的に発現亢進しており、FOXP4発現が子宮内膜癌のリンパ節/遠隔転移・術後再発の予測因子となり得ることを見出している（特願2018-207653）。 The human FOXP4 protein (folkheadbox protein P4) is a member of the forkheadbox (Fox) transcription factor family. In the group of the present inventors, FOXP4 is selectively upregulated in the lymph node / distant metastasis of endometrial cancer and the recurrence group after surgery, and the expression of FOXP4 is lymph node / distant metastasis of endometrial cancer. It has been found that it can be a predictor of postoperative recurrence (Japanese Patent Application No. 2018-207653).
FOXP4のアミノ酸配列の情報は、米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information, NCBI）が管理するデータベースからGenBank: AAH52803として取得することができる。また、ヒトFOXP4タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列については、同様にGene ID: 116113として取得することができる。非ヒト哺乳動物におけるFOXP4タンパク質のアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列等の情報についても、同様に取得することができる。 Information on the amino acid sequence of FOXP4 can be obtained as GenBank: AAH52803 from a database managed by the National Center for Biotechnology Information (NCBI). The base sequence of the gene encoding the human FOXP4 protein can also be obtained as Gene ID: 116113. Information such as the amino acid sequence of the FOXP4 protein in non-human mammals and the base sequence of the gene encoding the same can also be obtained in the same manner.
＜検出薬＞
本発明はまた、BLMタンパク質若しくはBLM mRNAに特異的に結合する試薬を含有する、被験体における子宮内膜癌の発症の予測についての検出薬を提供する。
<Detective drug>
The present invention also provides a detection agent for predicting the development of endometrial cancer in a subject, which comprises a reagent that specifically binds to a BLM protein or BLM mRNA.
第1の態様において、検出薬は、サンプル中のBLMタンパク質との特異的結合のための試薬、例えば抗体又はアプタマーであり得る。アプタマーは、DNA若しくはRNA等の核酸分子又はペプチドであり得る。検出に用いる抗体及びアプタマーは、当分野において用いられる方法により、安定性向上等のために改変されたものであっても良い。また、検出薬は、検出のために必要な標識等を適宜施すことができる。例えば上記抗体、又は上記抗体に対する二次抗体を蛍光試薬や発色試薬等で標識し、蛍光又は発色を検出することで確認することができる。 In a first aspect, the detection agent can be a reagent for specific binding to the BLM protein in the sample, such as an antibody or an aptamer. Aptamers can be nucleic acid molecules or peptides such as DNA or RNA. The antibody and aptamer used for detection may be modified for stability improvement or the like by a method used in the art. In addition, the detection agent can be appropriately labeled or the like necessary for detection. For example, it can be confirmed by labeling the above-mentioned antibody or a secondary antibody against the above-mentioned antibody with a fluorescence reagent, a color-developing reagent, or the like, and detecting fluorescence or color development.
第2の態様において、検出薬は、サンプル中のBLM mRNAとのハイブリダイゼーションのためのDNA又はRNAである。DNA又はRNAは、ハイブリダイゼーションを蛍光標識等で検出し得るプローブである。あるいはまた、DNA又はRNAは、mRNAの増幅に使用可能なプライマーである。 In the second embodiment, the detection agent is DNA or RNA for hybridization with BLM mRNA in the sample. DNA or RNA is a probe capable of detecting hybridization with a fluorescent label or the like. Alternatively, DNA or RNA is a primer that can be used to amplify mRNA.
本発明の検出薬は、被験体に由来する生物学的サンプルと接触させ、サンプル中のBLMタンパク質若しくはBLM mRNAの発現の有無及び／又は発現量を検出することができる。 The detection agent of the present invention can be contacted with a biological sample derived from a subject to detect the presence / absence and / or the expression level of BLM protein or BLM mRNA in the sample.
＜キット＞
上記の本発明の検出薬は、検出キットに含めて提供することもできる。従って本発明はまた、BLMタンパク質若しくはBLM mRNAに特異的に結合する試薬を含有する、被験体における子宮内膜癌の発症の予測のための検出キットを提供する。本キットは、上記の本発明の方法において好適に使用することができる。
<Kit>
The above-mentioned detection agent of the present invention can also be provided by being included in a detection kit. Accordingly, the present invention also provides a detection kit for predicting the development of endometrial cancer in a subject, which comprises a reagent that specifically binds to a BLM protein or BLM mRNA. The kit can be suitably used in the above-mentioned method of the present invention.
本発明のキットにより、上記の本発明の検出薬を被験体に由来する生物学的サンプルと接触させ、サンプル中のBLMタンパク質若しくはBLM mRNAの発現の有無及び／又は発現量を検出することができる。例えば検出薬として抗体を用いる場合、本発明のキットは、抗体とBLMとの結合反応のための反応液、反応容器、検出のための標識試薬、二次抗体、緩衝剤、使用説明書等を含むことができる。 The kit of the present invention allows the above-mentioned detection agent of the present invention to be contacted with a biological sample derived from a subject to detect the presence / absence and / or the expression level of BLM protein or BLM mRNA in the sample. .. For example, when an antibody is used as a detection agent, the kit of the present invention contains a reaction solution for a binding reaction between the antibody and BLM, a reaction vessel, a labeling reagent for detection, a secondary antibody, a buffer, an instruction manual, and the like. Can include.
検出薬としてBLM mRNAとハイブリダイゼーションし得るDNA又はRNAを用いる場合、本発明のキットは、検出のために必要な他の試薬、例えば緩衝剤、各種ヌクレオチド、mRNAのハイブリダイゼーションのために必要な他の試薬等を含むことができる。 When DNA or RNA capable of hybridizing with BLM mRNA is used as the detection agent, the kit of the present invention is necessary for hybridization of other reagents necessary for detection, such as buffers, various nucleotides, and mRNA. Can contain reagents and the like.
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be specifically described with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
［実施例１］
本研究の対象となる被験者は、2008年1月から2014年12月までの間に金沢大学附属病院産婦人科で子宮内膜癌の初期治療として子宮全摘術を受けた患者、そして診断のための子宮内膜掻把術にて子宮内膜増殖症と診断された患者である。全ての患者は、初期治療として手術療法に先立って化学療法や放射線療法を受けておらず、子宮内膜癌の手術標本では組織型が子宮内膜癌と病理組織診断された患者である。
[Example 1]
The subjects of this study were patients who underwent total hysterectomy as the initial treatment for endometrial cancer at the Department of Obstetrics and Gynecology, Kanazawa University Hospital between January 2008 and December 2014, and for diagnosis. This is a patient diagnosed with endometrial hyperplasia by endometrial scraping. All patients have not received chemotherapy or radiation therapy prior to surgical treatment as initial treatment, and are patients whose histological type is endometrial cancer and histopathologically diagnosed in surgical specimens of endometrial cancer.
手術進行期はFIGO（International Federation of Gynecology and Obstetrics）分類に基づいて、決定されている。対象症例は子宮内膜癌に対する標準的な手術方法として、子宮全摘および両側付属器摘出に加え、後腹膜腔の所属リンパ節郭清術を受けているが、術前に頸部浸潤が疑われた症例については、子宮摘出は広汎子宮全摘術を選択している。
腫瘍組織の使用は対象患者から文書で同意が得られており、また、本研究とヒトの腫瘍組織の使用については金沢大学倫理委員会から承認を受けている。
The stage of surgery is determined based on the FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics) classification. The target cases underwent total hysterectomy and bilateral adnexectomy as standard surgical methods for endometrial cancer, as well as regional lymph node dissection of the retroperitoneal cavity, but cervical invasion was suspected before surgery. For our cases, hysterectomy has been selected for radical hysterectomy.
The use of tumor tissue has been agreed in writing by the target patients, and the study and the use of human tumor tissue have been approved by the Kanazawa University Institutional Review Board.
正常子宮内膜症例、子宮内膜増殖症15例、子宮内膜癌23例から取得した手術標本を20％ホルマリンで固定後にパラフィン包埋し、4μmに薄切した組織をHE染色にて病理組織学的検査を行った。本研究では、各症例において代表的な手術標本スライドにおける腫瘍組織に対してBLMの免疫組織学的発現を解析した。 Surgical specimens obtained from normal endometrial cases, 15 cases of endometrial hyperplasia, and 23 cases of endometrial cancer were fixed with 20% formalin, then embedded in paraffin, and the tissue sliced to 4 μm was histopathologically stained by HE staining. A physiologic examination was performed. In this study, we analyzed the immunohistological expression of BLM in tumor tissues in typical surgical specimen slides in each case.
腫瘍組織におけるBLMタンパク質の局在は、ABC法による免疫染色(VECTASTAIN ABC Kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)にて確認された。BLMに対する抗体として、塩基性のアミノ酸配列を含む核移行シグナル(NLS)領域を免疫原として作成された抗体(Thermo Fischer Scientific)、及びNLSを含まない領域を免疫原として作成された抗体(Sigma-Aldrich)の2種類（いずれもウサギ抗BLM抗体）を使用して、免疫組織学的発現を観察した。 Localization of BLM protein in tumor tissue was confirmed by immunostaining by ABC method (VECTASTAIN ABC Kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Antibodies to BLM include an antibody (Thermo Fischer Scientific) prepared using a nuclear localization signal (NLS) region containing a basic amino acid sequence as an immunogen, and an antibody (Sigma-) created using a region not containing NLS as an immunogen. Two types of Aldrich) (both are rabbit anti-BLM antibodies) were used to observe immunohistologic expression.
免疫染色の手順は、次に述べる通りである。パラフィン包埋ブロックを薄切し、スライドガラスに乗せた組織を、キシレンにて脱パラフィン化し、次いでエタノールにて水和化した。引き続いて、0.01 M クエン酸バッファー（pH 6.0）により抗原賦活化後に、内在性のペルオキシダーゼ活性をブロックするために3％過酸化水素に10分間スライドを浸し、0.05 M リン酸緩衝生理食塩水（PBS, pH 7.4）で洗浄を行った。 The procedure for immunostaining is as described below. The paraffin-embedded block was sliced and the tissue placed on a slide glass was deparaffinized with xylene and then hydrated with ethanol. Subsequently, after antigen activation with 0.01 M citrate buffer (pH 6.0), the slide was immersed in 3% hydrogen peroxide for 10 minutes to block endogenous peroxidase activity and 0.05 M phosphate buffered saline (PBS). , pH 7.4).
洗浄後、一次抗体として用いるウサギ抗BLM抗体を添加して4℃で一晩反応させた。PBSにて洗浄後、二次抗体としてビオチン標識ヤギ抗ウサギIgGを添加して室温で30分間反応させ、引き続いてアビジン-ビオチン複合体を添加して室温で30分間反応させた。
ペルオキシダーゼ活性のある部位はジアミノベンジジン（Liquid DAB+ Substrate Chromogen System; Dako, Carpinteria, CA, USA）にて可視化され、その後ヘマトキシリンにて対比染色が行われた。
After washing, a rabbit anti-BLM antibody used as a primary antibody was added and reacted at 4 ° C. overnight. After washing with PBS, biotin-labeled goat anti-rabbit IgG was added as a secondary antibody and reacted at room temperature for 30 minutes, and then an avidin-biotin complex was added and reacted at room temperature for 30 minutes.
Sites with peroxidase activity were visualized with diaminobenzidine (Liquid DAB + Substrate Chromogen System; Dako, Carpinteria, CA, USA) and then counterstained with hematoxylin.
その結果、NLSを含む領域を免疫原として作成されたBLM抗体を使用した場合、正常子宮内膜由来のサンプルでは腺上皮細胞の核にBLMの発現が認められるのに対し、子宮内膜癌では23例中6例で上皮細胞においてBLMの発現が認められず、残りの17例は限局的に弱く発現が認められる程度であった（図２）。 As a result, when BLM antibody prepared using the region containing NLS as an immunogen, BLM is expressed in the nucleus of glandular epithelial cells in the sample derived from normal endometrium, whereas in endometrial cancer, it is observed. BLM expression was not observed in epithelial cells in 6 of the 23 cases, and the remaining 17 cases were localized and weakly expressed (Fig. 2).
また、その染色様式に子宮内膜癌の再発の有無や悪性度との関連は観察されなかった。子宮内膜癌の前癌病変である子宮内膜増殖症においても、15例全てでBLMの発現低下が確認された。
一方、NLSを含まない領域を免疫原として作成されたBLM抗体を使用して同様に腫瘍組織におけるBLMの発現を観察したところ、正常子宮内膜、子宮内膜増殖症、子宮内膜癌全ての症例で上皮細胞の核にびまん性にBLMの発現が観察された。
In addition, the presence or absence of recurrence of endometrial cancer and the association with malignancy were not observed in the staining pattern. In endometrial hyperplasia, which is a precancerous lesion of endometrial cancer, decreased expression of BLM was confirmed in all 15 cases.
On the other hand, when the expression of BLM in tumor tissue was similarly observed using a BLM antibody prepared using a region containing no NLS as an immunogen, normal endometrial, endometrial hyperplasia, and endometrial cancer were all observed. Diffuse expression of BLM was observed in the nucleus of epithelial cells in the case.
この結果は、子宮内膜癌の病変部においてBLMの核内移行機構に何らかの機能異常が存在することを示唆している。また、前癌病変である子宮内膜増殖症になる以前の段階からBLMの発現が低下している可能性が示唆される。 This result suggests that there is some dysfunction in the nuclear translocation mechanism of BLM in the lesion of endometrial cancer. In addition, it is suggested that the expression of BLM may have decreased from the stage before the precancerous lesion, endometrial hyperplasia.
本発明により、子宮内膜形態変化の初期段階で癌化のリスクを正確に判定できる評価法の開発を提供することが可能となる。本発明の方法を更なるマーカーの検出と組み合わせて用いることで、被験体における子宮内膜癌の発生、転移、及び再発のリスクについての詳細な情報を取得することも可能となる、更には、子宮内膜癌の発症のメカニズムの解明にも有用な知見を提供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it becomes possible to provide an evaluation method capable of accurately determining the risk of canceration at an early stage of endometrial morphological change. By using the method of the present invention in combination with the detection of further markers, it is possible to obtain detailed information on the risk of developing, metastasis, and recurrence of endometrial cancer in a subject, and further. It can also provide useful findings for elucidating the mechanism of onset of endometrial cancer.
Claims (12)
A detection kit for predicting the development of endometrial cancer in a subject, which contains a reagent that specifically binds to BLM protein or BLM mRNA.
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