JP2019533139A - ネフローゼ症候群を診断及び処置するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明者らは、タンパク質のイスミン−１（ＩＳＭ−１）が、動物及びヒトのモデルにおいて腎レベルで発現されていることを示した。本発明者らはまた、このタンパク質が、循環白血球の表面上だけでなく、細胞内にも発現されていることを示した。本発明者らは、被験者が特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）、微小変化型ネフローゼ（ＭＣＮ）、又は巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）に苦しんでいる場合に、その発現が健康な対照と比較して増加することを観察した。ネフローゼ症候群の様々な原因の中で、ＩＳＭ−１の白血球での発現は、特発性ネフローゼ症候群、微小変化型ネフローゼ、又は巣状分節性糸球体硬化症を有する患者において劇的に増加している。したがって、本発明は、ｉ）被験者から得られた生物学的試料中の循環白血球上のイスミン−１の膜発現レベルを測定する工程；ｉｉ）工程ｉ）で測定された発現レベルを、その予め決定された基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）イスミン−１の膜発現レベルがその予め決定された基準値よりも高い場合、該被験者は特発性ネフローゼ症候群、微小変化型ネフローゼ、若しくは巣状分節性糸球体硬化症を患っていると結論付ける工程を含む、被験者における特発性ネフローゼ症候群、微小変化型ネフローゼ、又は巣状分節性糸球体硬化症を診断するための方法に関する。

Description

発明の分野：
本発明は、腎臓病学の分野にあり、特に本発明はネフローゼ症候群を診断及び処置するための方法に関する。

発明の背景：
ネフローゼ症候群は、大量のタンパク尿（３ｇ/日を超える、又は小児では体表面積１平方メートルあたり１ｇ/日を超える尿タンパク）及び低アルブミン血症（３０ｇ/ｌ未満）によって定義される希少疾患であり、糸球体ろ過障壁の完全性の消失から生じる。主な原因は遺伝性又は免疫性である。ネフローゼ症候群（ＮＳ）の原因の診断は、臨床データ、漸進的データ、生化学的データ、治療データ及び病理学的データのセットに基づく。特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）は、小児ではネフローゼ症候群の原因の８０％、成人では２５％を占める。特発性ネフローゼ症候群は、光学顕微鏡上では病変が存在しないこと、及び免疫グロブリン又は補体の沈着がないことと時々さらに巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）病変を伴うことによって組織学的に特徴付けられる。最初の症例では微小変化型ネフローゼ（ＭＣＮ）の特色を規定し、もう一方はＦＳＧＳを規定する。現在の慣行では、ネフローゼ症候群の正確な原因を診断するために、腎生検が必要とされる。成人では、ネフローゼ症候群が観察されると、腎生検が体系的に実施される。小児では、ステロイドによる処置後にネフローゼ症候群の寛解が観察されると、ＩＮＳの診断が確立する。ＭＣＮ及びＦＳＧＳは、足細胞内に共通した糸球体病変を共有する臨床病理症候群のグループであると考えられる。電子顕微鏡上では、足突起の平板化又は消滅が主な病変である。ネフローゼ症候群の他の免疫学的原因としては、膜性腎症、免疫性ループス腎炎、ＡＮＣＡ血管炎、グッドパスチャー症候群、ベルジェ病が挙げられ、これはそれらの特定の免疫沈着物及び／又は光学顕微鏡による病変によって容易に診断され得る。移植後に再発する可能性のある少なくともその初期の形態のＩＮＳの病態生理は依然として不明である。ＩＮＳは、推定上の循環中の透過性増強因子を伴う免疫学的原因を有することが認められている。タンパク尿の発生は、その糸球体基底膜上の足細胞の接着の変化、細胞骨格及びスリット膜の再編成に関連している。共通したシグナル伝達経路が疾患のプロセスを開始し、Ｓｒｃ、ＦＡＫ、ＩＬＫという異なるキナーゼによって、ネフリン、及び接着分子、例えばＶＥ−カドヘリン、β−カテニンのチロシン残基のリン酸化が起こる。これらのリン酸化により、複雑な接着の破壊及び膜の透過性亢進が起こる。主な処置は、利尿薬（例えばフロセミド又はスピロノラクトン）と併用する副腎皮質ステロイドである。処置は、成人患者と小児患者で異なり、国際腎臓病予後改善機構（ＫＤＩＧＯ）は、成人及び小児における特発性ネフローゼ症候群の処置に関する勧告を含む指針を２０１２年に発行した。残念なことに、患者によっては再発し、ＩＮＳに苦しみ続け、１０％が末期腎疾患に進行するだろう。したがって、原因をより良く理解することを可能とする新規なマーカー、診断し、患者の処置に対する応答及び再発を予測するための新規なアプローチを同定することが必要である。

発明の要約：
本発明は、ｉ）被験者から得られた血液試料中の循環白血球上のイスミン（isthmin）−１の膜発現レベルを測定する工程；ｉｉ）工程ｉ）で測定された発現を、その予め決定された基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）イスミン−１の膜発現レベルがその予め決定された基準値よりも高い場合、該被験者は特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）、微小変化型ネフローゼ（ＭＣＮ）、若しくは初期巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を患っていると結論付け、又は、イスミン−１の膜発現レベルがその予め決定された基準値よりも低い場合、該被験者はネフローゼ症候群の別の原因に苦しんでいると結論付ける工程を含む、小児における特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）、被験者における微小変化型ネフローゼ又は初期巣状分節性糸球体硬化症を診断するための方法に関する。特に、本発明は特許請求の範囲によって定義される。

発明の詳細な説明：
初めて、本発明者らは、タンパク質のイスミン−１（ＩＳＭ−１）が、動物及びヒトのモデルにおいて腎レベルで足細胞上に生理学的に発現されていることを示した。本発明者らはまた、このタンパク質が、循環白血球の表面上だけでなく、細胞内にも発現されていることを示した。本発明者らは、被験者がネフローゼ症候群の全ての原因に苦しんでいる場合に、その発現が健康な対照と比較して増加することを観察した。ネフローゼ症候群の様々な原因の中で、ＩＳＭ−１の白血球での発現は、特発性ネフローゼ症候群、微小変化型ネフローゼ、及び初期巣状分節性糸球体硬化症を有する患者において劇的に増加する。したがって、本発明者らは、ネフローゼ症候群の他の原因からＩＮＳ、ＭＣＮ、又は初期ＦＳＧＳを診断し、ステロイドによる処置に対する応答を予測し、ＩＮＳ、ＭＣＮ、又はＦＳＧＳに罹患している被験者の再発を予測するのに適した新規なバイオマーカーを同定した。

ネフローゼ症候群を診断するための方法
したがって、第一の態様では、本発明は、ｉ）被験者から得られた生物学的試料中の循環白血球上のイスミン−１の膜発現レベルを測定する工程；ｉｉ）工程ｉ）で測定された発現レベルを、その予め決定された基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）イスミン−１の膜発現レベルがその予め決定された基準値よりも高い場合、該被験者は特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）、微小変化型ネフローゼ（ＭＣＮ）、若しくは巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を患っていると結論付け、又は、イスミン−１の膜発現レベルがその予め決定された基準値よりも低いか若しくは類似している場合、該被験者はＩＮＳ、ＭＣＮ、若しくはＦＳＧＳを患っていないと結論付ける工程を含む、該被験者における特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）、微小変化型ネフローゼ（ＭＣＮ）、又は初期巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を診断するための方法に関する。

本明細書において使用する「診断する」という用語は、疾患又は症状を分類すること、疾患の重症度を決定すること、疾患の進行をモニタリングすること、疾患の転帰及び／又は回復の見込みを予見することを指す。

本明細書において使用する「特発性ネフローゼ症候群」（ＩＮＳ）という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、小児におけるネフローゼ症候群（ＮＳ）の原因の８０％、及び成人における２５％を占める。ＩＮＳは、光学顕微鏡上では病変が存在しないこと、及び免疫グロブリン又は補体の沈着がないことと時々さらに巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）病変を伴うことによって組織学的に特徴付けられる。本明細書において使用する「ＭＣＮ」という用語は、微小変化群（ＭＣＤ）、リポイドネフローシス、又はニル（nil）疾患としても知られているが、これは微小変化型ネフローゼを指す。それは糸球体の組織病理学的病変から生じ、強力なタンパク尿によって特徴付けられ、これにより浮腫及び血管内体液量喪失がもたらされる。それは小児における最も一般的な１つのネフローゼ症候群の型であるが、それはまた成人でも起こり得る。特定の実施態様では、ネフローゼ症候群は、特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）によって引き起こされる。本明細書において使用する「ＦＳＧＳ」という用語は、恒久的な腎障害及びさらには腎不全に至る重篤な瘢痕を引き起こす腎のフィルタリングユニット（糸球体）を攻撃する希少疾患を指す。「巣状」という用語が加えられるのは、ＦＳＧＳでは、糸球体フィルターのほんのいくつかしか損なわれていないからである。「分節性」という用語は、糸球体のほんのいくつかの区画だけが、それらの一部だけが損なわれるようになることを意味する。

特定の実施態様では、ＩＮＳ、ＭＣＮ又はＦＳＧＳはネフローゼ症候群を引き起こす。本明細書において使用する「ネフローゼ症候群」という用語は、身体が尿中にあまりにも多くのタンパク質を排泄することを引き起こす腎障害である。初期腎疾患、例えば微小変化型ネフローゼ、巣状糸球体硬化症、及び膜性腎症をはじめとする、ネフローゼ症候群は多くの原因を有する。ネフローゼ症候群は、多量のタンパク尿、低アルブミン血症、高脂血症、及び浮腫によって特徴付けられる。

本明細書において使用する「被験者」という用語は、任意の哺乳動物、例えばげっ歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類を指す。特に、本発明では、被験者はヒトである。特定の実施態様では、被験者は、ネフローゼ症候群に罹りやすいヒトである。より特定すると、被験者は、ネフローゼ症候群を引き起こすＩＮＳ、ＭＣＮ、又はＦＳＧＳに罹りやすい。

本明細書において使用する「イスミン−１」すなわちＩＳＭ−１という用語は、アフリカツメガエルにおいて初めて同定された分泌タンパク質を指す。それは、機能が不明である、アフリカツメガエルにおける中脳後脳境界部オーガナイザーにおいて高度に発現されている。ＩＳＭ−１遺伝子は、中央領域におけるトロンボスポンジン１型（ＴＳＲ１）反復ドメイン、及びＭＵＣ４における接着関連ドメイン、及びＣ末端における他のタンパク質（ＡＭＯＰ）ドメインを含有している、６０ｋＤの分泌タンパク質をコードしている。天然に存在しているヒトイスミン遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０８０８２６に示されているようなヌクレオチド配列を有し、天然に存在しているヒトイスミンタンパク質は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿５４３０１６．１に示されているようなアミノ酸配列を有する。マウスヌクレオチド配列及びアミノ酸配列も記載されている（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２７６４８９及びＮＰ＿００１２６３４１８．１）。

本明細書において使用する「循環白血球」という用語は、白血球（white blood cell）（ＷＢＣ）又は白血球（leukocyte）とも呼ばれるが、感染及び全ての外来の侵入者から生体を防御することに関与する免疫系の細胞を指す。「白血球」という用語は、好中球、単球／マクロファージ、リンパ球、及びその混合物を包含する。「循環」という用語は、被験者の血流中で「循環」している天然に存在する細胞を指し、それらは被験者に注入され、被験者から取り出され、培養され、及び／又は被験者に再注入されなかったことを意味する。いくつかの実施態様では、循環白血球は、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球（例えばＢ細胞、Ｔ細胞、又はＮＫ細胞）、又は単球（例えばマクロファージ）である。循環白血球は、生物学的試料から得られる。

本明細書において使用する「生物学的試料」という用語は、被験者から得られた試料、例えば、血液、唾液、母乳、尿、精液、血漿、関節液、又は血清を指す。特定の実施態様では、試料は血液試料である。「血液試料」という用語は、被験者から得られた任意の血液試料を意味する。末梢血が好ましく、単核細胞（ＰＢＭＣ）が好ましい細胞である。典型的には、これらの細胞は、血液の層を分離する親水性多糖であるフィコールを使用して全血から抽出することができ、ＰＢＭＣは血漿の層の下に細胞環を形成する。さらに、ＰＢＭＣは、赤血球細胞を優先的に溶血するであろう低張溶解を使用して全血から抽出することができる。このような手順は、当技術分野の専門家には公知である。

本明細書において使用する「膜発現レベルを測定する」という用語は、細胞表面上の発現レベルを定量することを指す。細胞表面上のマーカーの発現レベルを決定又は測定するための方法は、当技術分野において周知である。細胞によって発現されているマーカーの検出及び定量は、フローサイトメトリーによって行なわれる。いくつかの実施態様では、このような方法は、試料を、関心対象のタンパク質（すなわちイスミン−１）と選択的に相互作用することのできる少なくとも１つの選択的結合剤と接触させる工程を含む。選択的結合剤は、ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、抗体断片、合成抗体、又は他のタンパク質特異的薬剤、例えば核酸若しくはペプチドアプタマーであり得る。マーカーの存在を顕微鏡又は自動分析システムによって検出可能とさせる抗体の検出のために、該抗体を、酵素、色素原、又は蛍光プローブなどの検出可能な標識で直接タグ化しても、又は、検出可能な標識とコンジュゲートさせた二次抗体を用いて間接的に検出してもよい。抗体又はアプタマーなどの結合剤は、検出可能な分子若しくは物質、例えば優先的には蛍光分子、又は放射性分子、又は当技術分野において公知の任意の他の標識を用いて標識され得る。本明細書において使用する「標識」及び「検出可能な標識」という用語は、放射性同位体、蛍光剤、化学発光剤、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、発色団、色素、金属イオン、金属溶液、リガンド（例えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、又はハプテン）、インターカレーター性色素などを含むがこれらに限定されない、検出することのできる分子を指す。「蛍光剤」という用語は、検出可能な範囲の蛍光を示すことのできる物質又はその一部を指す。関心対象の標識は、直接的に及び間接的に検出可能な標識の両方を含む。本明細書に記載の方法に使用するのに適した標識としては、分光学的な手段、光化学的な手段、生化学的な手段、免疫化学的な手段、電気的な手段、光学的な手段、化学的な手段、又は他の手段によって間接的に又は直接的に検出可能である任意の分子が挙げられる。関心対象の標識としては、フルオレセイン及びその誘導体；ローダミン及びその誘導体；シアニン及びその誘導体；クマリン及びその誘導体；カスケードブルー及びその誘導体；ルシファーイエロー及びその誘導体；ＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体などが挙げられるがこれらに限定されない。関心対象の標識としてはまた、フルオロフォア、例えばインドカルボシアニン（Ｃ３）、インドジカルボシアニン（Ｃ５）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、テキサスレッド、パシフィックブルー、オレゴングリーン４８８、アレクサフルオル−３５５、アレクサフルオル４８８、アレクサフルオル５３２、アレクサフルオル５４６、アレクサフルオル−５５５、アレクサフルオル５６８、アレクサフルオル５９４、アレクサフルオル６４７、アレクサフルオル６６０、アレクサフルオル６８０、アレクサフルオル７００、ＪＯＥ、リサミン、ローダミングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、フィコエリトリン、ローダミン、ジクロロローダミン（ｄローダミン）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、ＬＩＺ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＳＹＢＲ、ピコグリーン、リボグリーンなども挙げられる。蛍光標識は、発光を検出するための光検出器（例えばフローサイトメーターにおける）を使用して検出され得る。酵素標識は典型的には、酵素に基質を与え、基質上での酵素の作用によって生成された反応生成物を検出することによって検出され、比色定量標識は、着色された標識を単に可視化することによって検出され得、抗原性標識は、抗原性標識に特異的に結合する抗体（又はその結合断片）を与えることによって検出され得る。抗原性標識に特異的に結合する抗体は、直接的に又は間接的に検出可能であり得る。例えば、抗体を、シグナル（例えば蛍光）を与える標識部分（例えばフルオロフォア）にコンジュゲートさせることができ；抗体を、適切な基質（例えば蛍光性チラミド、ファストレッドなど）を与えると検出可能な生成物（例えば蛍光性生成物）を生成する酵素（例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）にコンジュゲートさせることができる。前記アッセイは、固相支持体への結合剤（すなわち抗体又はアプタマー）の結合を含み得る。固体表面は、結合対でコーティングされたマイクロタイタープレートであり得る。あるいは、固体表面は、ビーズ、例えば活性化ビーズ、磁気応答性ビーズであり得る。ビーズは、ガラス、プラスチック、ポリスチレン、及びアクリルを含むがこれらに限定されない、様々な材料から製造され得る。さらに、ビーズは好ましくは蛍光標識されている。好ましい実施態様では、蛍光ビーズは、ベクトン・ディッキンソン・バイオサイエンシーズ社（サンノゼ、カリフォルニア州）から入手可能なＴｒｕＣｏｕｎｔ（商標）チューブに含有されているものである。本発明によると、フローサイトメトリー法は、関心対象のタンパク質（すなわちイスミン−１）のレベルを測定するための好ましい方法である。フローサイトメトリーは、ユーザーが試料液体中の成分を迅速に分析し選別することを可能とする研究において十分に認められているツールである。フローサイトメーターは、試料成分を実質的には一度に１つを照射ゾーンに通過させるためのキャリア液（例えばシース液）を使用する。各試料成分は、レーザーなどの光源によって照射され、各試料成分によって散乱した光が検出及び分析される。試料成分は、それらが照射ゾーンから出る時のそれらの光学的特徴及び他の特徴に基づいて分離され得る。該方法は当技術分野において周知である。特定の実施態様では、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、ＩＳＭ−１の発現レベルを測定する。実質的には製造業者の説明書に従って使用された、ＢＤバイオサイエンシーズ社のＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）フローサイトメーターなどの複数のフルオロフォアの同時励起及び検出を行なうことのできるフローサイトメーターを使用することを含む。細胞数測定システムとしては、以下に記載のような、細胞数測定用試料流体サブシステムが挙げられ得る。さらに、細胞数測定システムは、細胞数測定用試料流体サブシステムに流体的に連結させたサイトメーターを含む。本開示のシステムは、多くの追加の成分、例えばデータ出力装置、例えばモニター、プリンター、及び／又はスピーカー、データ入力装置、例えばインターフェースポート、マウス、キーボードなど、流体処理コンポーネント、電源などを含み得る。

別の実施態様では、ＩＳＭ−１の発現レベルの測定は、免疫学的検出によって行なわれる。典型的には、ＩＳＭ−１発現レベルの免疫学的検出又は定量は、ＩＳＭ−１に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を使用して、当技術分野において公知の任意の方法によって成し遂げられる。該方法の例としては、標準的な電気泳動技術及び免疫診断技術、例えばウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイなど）、補体結合アッセイ、プロテインＡアッセイ、免疫電気泳動アッセイ、高速液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、固相親和性などが挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、ＩＳＭ−１の発現レベルは、ＥＬＩＳＡによって測定される。

本明細書において使用する「予め決定された基準値」という用語は、閾値又はカットオフ値を指す。典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は、実験的に、経験的に、又は理論的に決定され得る。閾値はまた、当業者によって認識されているであろうように、既存の実験条件及び／又は臨床条件に基づいて自由に選択されてもよい。例えば、予め決定された基準値を確立するために、適切に預けられた歴史的被験者サンプルにおける遡及的測定が使用され得る。閾値は、試験の関数及びベネフィット／リスクのバランス（偽陽性及び偽陰性の臨床結果）に従って最適な感度及び特異度が得られるように決定されなければならない。典型的には、最適な感度及び特異度（よって、閾値）は、実験データに基づいて受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して決定され得る。例えば、基準群から選択されたペプチドの発現レベルを決定した後、試験される予定の試料において決定された発現レベルの統計学的処理のためにアルゴリズム分析を使用することができ、これにより、試料の分類について有意性を有する分類標準を得ることができる。ＲＯＣ曲線の正式名は、受信者動作特性曲線であり、これは受診者操作特性曲線としても知られる。それは主に、臨床的な生化学的診断試験のために使用される。ＲＯＣ曲線は、真陽性率（感度）及び偽陽性率（１−特異度）の連続変数を反映する総合的な指標である。それは、画像合成法を用いて感度と特異度との間の関係を明らかとする。一連の様々なカットオフ値（診断試験の正常な結果と異常な結果との間の境界値である閾値又は臨界値）は、一連の感度及び特異度の値を計算するための連続変数として設定される。次いで、曲線を描くために、感度は縦軸座標として使用され、特異度は横軸座標として使用される。曲線下面積（ＡＵＣ）が高ければ高いほど、診断の正確度は高くなる。ＲＯＣ曲線上では、座標図のはるか上の左に近い点は、高い感度及び高い特異度の値の両方を有する臨界点である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は、１．０〜１．５である。ＡＵＣ＞０．５である場合、ＡＵＣが１に近づくにつれて診断結果は段々と良好になる。ＡＵＣが０．５〜０．７である場合、正確度は低い。ＡＵＣが０．７〜０．９である場合、正確度は中程度である。ＡＵＣが０．９より高い場合、正確度は高い。このアルゴリズム法は好ましくはコンピューターを用いて行なわれる。ＭｅｄＣａｌｃ９．２．０．１医学統計ソフトウェア、ＳＰＳＳ９．０、ＲＯＣＰＯＷＥＲ．ＳＡＳ、ＤＥＳＩＧＮＲＯＣ．ＦＯＲ、ＭＵＬＴＩＲＥＡＤＥＲ ＰＯＷＥＲ．ＳＡＳ、ＣＲＥＡＴＥ−ＲＯＣ．ＳＡＳ、ＧＢ ＳＴＡＴ ＶＩ０．０（ダイナミック・マイクロシステムズ社、シルバースプリング、Ｍｄ州、米国）などの当技術分野における既存のソフトウェア又はシステムをＲＯＣ曲線の描写のために使用し得る。

本発明者らは、イスミン−１が、循環白血球中の細胞内発現も有することを示した。本発明者らは、イスミン−１の膜発現に対するイスミン−１の細胞内発現の比が、特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）、微小変化型ネフローゼ（ＭＣＮ）、又は巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）に罹りやすい被験者を診断するのに適していることを確立した。したがって、本発明は、ネフローゼ症候群を引き起こすこれらの疾患を診断することに関する。

したがって、第二の態様では、本発明は、ｉ）被験者から得られた試料中の循環白血球中のイスミン−１の細胞内発現レベルを測定する工程；ｉｉ）該試料中の循環白血球上のイスミン−１の膜発現レベルを測定する工程；ｉｉｉ）工程ｉｉ）で決定されたイスミン−１の膜発現レベルに対する、工程ｉ）で決定されたイスミン−１の細胞内発現レベルの比を計算する工程；ｉｖ）工程ｉｉｉ）で決定された比を、予め決定された基準値と比較する工程、及びｖ）工程ｉｉｉ）で決定された比が、予め決定された基準値よりも高い場合、該被験者は特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）、微小変化型ネフローゼ（ＭＣＮ）、又は巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を患っていると結論付け、又は工程ｉｖ）で決定された比が、予め決定された基準値よりも低い場合、該被験者はネフローゼ症候群を患っていないと結論付ける工程を含む、被験者における特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）、微小変化型ネフローゼ（ＭＣＮ）、又は巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を診断するための方法に関する。

本明細書において使用する「細胞内発現レベルを測定する」という用語は、細胞内におけるマーカーの発現又は存在を決定又は定量することを指す。細胞内のマーカーの発現を決定又は測定するための方法は、当技術分野において周知である。細胞によって発現されているマーカーの検出及び定量は、フローサイトメトリーによって行なわれる。また細胞内にも局在しているので、イスミンの発現は、標識された抗イスミン−１抗体を使用して細胞内フローサイトメトリーによって評価され得る。細胞内フローサイトメトリーは典型的には、細胞（例えばＴ細胞）の透過性処理及び固定を含む。細胞を透過性処理及び固定するための任意の簡便な手段を、当該方法を実践するために使用し得る。例えば、透過剤としては典型的には、サポニン、メタノール、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、トリトンＸ−１００ＴＭが挙げられる。特定の実施態様では、ＩＳＭ−１の細胞内発現レベルは、上記のような免疫学的検出によって実施される。

毛細血管透過性の機能障害を診断するための方法
本発明者らはイスミン−１が血管透過性において役割を有することを示し、特に本発明者らはイスミン−１が毛細血管透過性を上昇させることを実証した。したがって、ＩＳＭ−１は、血管透過性機能障害を患っている被験者を予測又は診断するのに適している。

したがって、別の態様では、本発明は、ｉ）被験者から得られた生物学的試料中の循環白血球上のイスミン−１の膜発現レベルを測定する工程；ｉｉ）工程ｉ）で測定された発現レベルを、その予め決定された基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）イスミン−１の膜発現レベルがその予め決定された基準値よりも高い場合、該被験者は毛細血管透過性の機能障害を患っていると結論付け、又は、イスミン−１の膜発現レベルがその予め決定された基準値よりも低いか若しくは類似している場合、該被験者は毛細血管透過性の機能障害を患っていないと結論付ける工程を含む、被験者における毛細血管透過性の機能障害を診断するための方法に関する。

本明細書において使用する「毛細血管透過性」という用語は、血管壁が、低分子（薬物、栄養分、水、イオン）又はさらには完全細胞（炎症部位への途中にいるリンパ球）が血管内へ及び血管外へと流れることを可能とする能力を指す。特定の実施態様では、毛細血管透過性は、糸球体毛細血管透過性を指す。健康な被験者における「糸球体毛細血管透過性」という用語は、その開窓のために糸球体の毛細血管内皮が、血球及びコロイドを除く全ての血液構成成分に対して透過性であり、よって糸球体ろ過液は、血漿及び間質液と非常に類似しているが、そのどちらよりも低いタンパク質濃度を有することを指す。「糸球体毛細血管透過性の機能障害」又は「障害を受けた糸球体毛細血管透過性」という用語は、例えば糸球体の脈管構造の構造及び／又は機能の妨害又は障害をはじめとする、様々な異常を指す。血管透過性の上昇は、特に急性炎症の症例における、刺激に対する生体の炎症応答の主な特徴の１つである。炎症中に、血漿から導かれ炎症刺激によってトリガーされた化学物質因子は、罹患部位において多くの血管応答及び細胞応答を媒介する。微小脈管構造におけるこれらの構造的変化により血管膜の透過性は上昇し、血漿中のタンパク質及び細胞、例えば白血球の、循環中から間質への移動を引き起こす。炎症における血管透過性上昇の主な機序としては、とりわけ、内皮細胞の収縮、接合部の退縮、直接的な損傷、白血球依存性漏出、再生中の内皮が挙げられる。間質に向かうろ過体液量の増加は、炎症性メディエーターの細動脈血管拡張作用によってさらに増強され、これは血流、灌流される表面積、及び毛細血管の静水圧を増加させる。

特定の実施態様では、本発明は、ｉ）被験者から得られた試料中の循環白血球中のイスミン−１の細胞内発現レベルを測定する工程；ｉｉ）該試料中の循環白血球上のイスミン−１の膜発現レベルを測定する工程；ｉｉｉ）工程ｉｉ）で決定されたイスミン−１の膜発現レベルに対する、工程ｉ）で決定されたイスミン−１の細胞内発現レベルの比を計算する工程；ｉｖ）工程ｉｉｉ）で決定された比を、予め決定された基準値と比較する工程、及びｖ）工程ｉｉｉ）で決定された比が、予め決定された基準値よりも高い場合、該被験者は糸球体の毛細血管透過性の機能障害を患っていると結論付け、又は、工程ｉｖ）で決定された比が、予め決定された基準値よりも低い場合、該被験者は糸球体の毛細血管透過性の機能障害を患っていないと結論付ける工程を含む、被験者における糸球体毛細血管透過性の機能障害を診断する方法に関する。

ステロイドに対する応答及び再発のリスクを予測するための方法
本発明者らのデータは、特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）、微小変化群（ＭＣＤ）、又は初期巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を有しかつ白血球におけるイスミン−１の高い発現レベルを有する患者が、ステロイドによる処置に対して非常に良好な応答を有することを示す。全ての患者が、数週間以内に、特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）、微小変化群（ＭＣＤ）、又は巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の完全寛解を示し、イスミン−１の低い発現を有さない患者とは対照的であった。したがって、本発明は、ネフローゼ症候群を引き起こすこれらの疾患を診断することに関する。

したがって、第三の態様では、本発明は、ｉ）被験者から得られた試料中の循環白血球上のイスミン−１の膜発現レベルを測定する工程；ｉｉ）工程ｉ）で測定された発現レベルを、その予め決定された基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）イスミン−１の膜発現レベルがその予め決定された基準値よりも高い場合、該被験者は処置に対する再発のリスクがあると結論付け、又は、イスミン−１の膜発現レベルがその予め決定された基準値よりも低い場合、該被験者は再発のリスクがないと結論付ける工程を含む、特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）、微小変化型ネフローゼ（ＭＣＮ）、又は巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を患っている被験者における処置に対する再発のリスクを予測するための方法に関する。

本明細書において使用する「予測する」という用語は、本発明の方法によって分析される予定の被験者が、処置後に再発するであろう被験者の群、又は再発しないであろう被験者の群のいずれかに割り当てられることを意味する。

本明細書において使用する本発明の脈絡における「リスク」という用語は、再発への転換のように、ある事象が特定の期間かけて起こるであろう確率に関し、被験者の「絶対的」リスク又は「相対的」リスクを意味し得る。絶対的リスクは、妥当な時間コホートについて測定後の実際の観察を参考にして、又は妥当な期間かけて経過観察されてきた統計学的に有効な歴史的コホートから作成された指標値を参考にして測定され得る。相対的リスクは、低リスクのコホートの絶対的リスク又は平均的な母集団のリスクのいずれかと比較した、被験者の絶対的リスクの比を指し、これはどのように臨床的リスク因子が評価されるかによって変化し得る。所与の試験結果についての負の事象に対する正の事象の比率であるオッズ比も一般的に無転換に使用される（オッズは式ｐ/（１−ｐ）に従い、ここでのｐは事象の確率であり、（１−ｐ）は無事象の確率である）。本発明の脈絡における「リスク評価」又は「リスクの評価」は、事象又は疾患状態が起こり得る確率、オッズ、又は可能性、すなわち、事象又はある疾患状態から別の疾患状態への転換、すなわち正常な容態から再発又は再発を発症するリスクのある容態への転換の発生率の予測を行なうことを包含する。リスク評価は、以前に測定された集団を参考にした、将来の臨床パラメーター、従来の臨床検査値に基づいたリスク因子の数値、又は絶対的な若しくは相対的な他の再発の指数の予測も含み得る。本発明の方法を使用して、再発へと転換するリスクの連続的測定又は分類別測定を行なうことができ、これにより、再発するリスクがあると規定された被験者のカテゴリーを診断しそのリスク範囲を規定することができる。分類別の概要では、本発明を使用して、正常な被験者のコホートと、再発のリスクがより高い他の被験者コホートを区別することができる。いくつかの実施態様では、本発明は、再発のリスクがある者と正常な者を、再発した疾患を有する者と正常な者を区別するために使用され得る。

本明細書において使用する「再発」という用語は、被験者が処置後に寛解した後に、疾患の兆候及び症状が復帰することを指す。したがって、当初は標的疾患が寛解若しくは治癒されるか、又は疾患の進行が停止若しくは減速し、その後、疾患若しくは疾患の１つ以上の特徴が戻った場合、被験者は「再発」していると言われる。

いくつかの実施態様では、本発明の方法は、被験者が、免疫抑制薬及び副腎皮質ステロイドからなる群より選択された少なくとも１つの薬剤を用いて処置されたか又は処置される場合に、再発のリスクを予測するのに特に適している。本明細書において使用する「免疫抑制薬」という用語は、免疫抑制作用、例えば免疫応答の予防又は減少を生じることのできるあらゆる物質を指す。免疫抑制薬としては、チオプリン薬、例えばアザチオプリン（ＡＺＡ）及びその代謝物；ヌクレオシド三リン酸阻害剤、例えばミコフェノール酸（セルセプト）及びその誘導体（マイフォーティック）；その誘導体；そのプロドラッグ；並びにその組合せが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、免疫抑制薬は、強力な免疫抑制特性を有する競合的なカルシニューリン阻害剤である、シクロスポリン（「シクロスポリン」Ａ又は「ＣｙＡ」とも命名されている）である。

本明細書において使用する「副腎皮質ステロイド」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、抗炎症活性の付与された水素化されたシクロペントペルヒドロフェナントレン環系を有する活性成分のクラスを指す。副腎皮質ステロイド薬としては典型的には、コルチゾン、コルチゾール、ヒドロコルチゾン（１１β，１７−ジヒドロキシ，２１−（ホスホノオキシ）−４−プレグネン、３，２０−ジオン二ナトリウム）、ジヒドロキシコルチゾン、デキサメタゾン（２１−（アセチルオキシ）−９−フルオロ−１β，１７−ジヒドロキシ−１６α−ｍ−エチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン）、及び高度に誘導体化されたステロイド薬、例えばベコナーゼ（ベクロメタゾンジプロピオン酸塩、これは９−クロロ−１１−β，１７，２１，トリヒドロキシ−１６β−メチルプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン１７，２１−ジプロピオナート）が挙げられる。副腎皮質ステロイドの他の例としては、フルニソリド、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、デフラザコート、及びベタメタゾンが挙げられる。副腎皮質ステロイド、例えば、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾン、トリアムシノロンアセトニド、ベタメタゾン、フルオシノロン、フルオシノニド、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、デソニド、デソキシメタゾン、フルオシノロン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、プロピオン酸クロベタゾール、及びデキサメタゾン。

第四の態様では、本発明は、ｉ）被験者から得られた試料中の循環白血球中のイスミン−１の細胞内発現レベルを測定する工程；ｉｉ）該試料中の循環白血球上のイスミン−１の膜発現レベルを測定する工程；ｉｉｉ）工程ｉｉ）で決定された発現レベルに対する、工程ｉ）で決定された発現レベルの比を計算する工程；ｉｖ）工程ｉｉｉ）で決定された比を、予め決定された基準値と比較する工程、及びｖ）工程ｉｉｉ）で決定された比が、その予め決定された基準値よりも高い場合、該被験者は再発のリスクがあると結論付け、又は工程ｉｉｉ）で決定された比が、その予め決定された基準値よりも低い場合、該被験者は再発のリスクがないと結論付ける工程を含む、特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）、微小変化型ネフローゼ（ＭＣＮ）、又は巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を患っている被験者における、処置に対する再発のリスクを予測するための方法に関する。

いくつかの実施態様では、循環白血球上のイスミン−１の発現が、その予め決定された基準値よりも低い場合、被験者は再発のリスクはない（例えば寛解）と結論付けられる。

腎生検が被験者において必要とされるか否かを決定するための方法
本発明の方法は、腎生検が被験者において必要とされるかどうかを決定するのに特に適している。

典型的には、上記のような診断法により、被験者は、特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）、微小変化型ネフローゼ（ＭＣＮ）、又は巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を患っていないと結論付けられる場合、医師は、診断をはっきりさせるために、腎生検の実施を決断することができる。

腎生検は、被験者を、重度の合併症、例えば重度の血尿、出血、動脈損傷に曝し、輸血、時には動脈塞栓術、腎摘出術、及び長期入院を必要とする。小児では、腎生検の実施は困難であることが多い。よって本発明の方法は、腎生検が必要でない場合には、腎生検を回避する手段を与える。実際に、ＩＮＳの診断が、フローサイトメータデータ又はＥＬＩＳＡに基づき可能性が高いと結論付けられた場合、医師は腎生検の回避を決断することができる。逆に、この検査がＩＮＳ疾患に賛同していない場合には、医師は、診断をはっきりさせるために腎生検の実施を決断することができる。結果として、本発明の方法は、ＩＳＭ−１の発現に依存した、ＩＳＮ、ＭＣＮ、及び初期ＦＳＧＳの新規な分類法を提供するだろう。

ネフローゼ症候群の進行をモニタリングするための方法
いくつかの実施態様では、本発明は、被験者における特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）、微小変化群（ＭＣＤ）、又は巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の進行をモニタリングし（ここで、該被験者から得られた試料中の循環白血球上のイスミン−１の１回目の測定を処置の経過中に実施し、試料中の２回目のイスミン−１の測定を後に（数時間後、数日後、又は数カ月後に）実施する）、イスミン−１の発現が２回の測定の間で増加している場合には、該被験者は高い再発のリスクがあるであろうと結論付けるための方法に関する。

したがって、本発明の方法は、例えば、投与量を調整し、新規な薬物の投与と組み合わせ、現在の処置を新しい処置と置き換えることによって、被験者の処置を調整するのに特に適している。

ＩＮＳを診断するための又は再発のリスクを予測するためのキット
第五の態様では、本発明は、本発明の方法を実施するための手段を含むキットに関する。典型的には、該キットは、イスミン−１の発現を検出するための手段を含む。いくつかの実施態様では、手段は、標識された抗体である。典型的には、上記のキットはまた、例えば洗浄用試薬及び／又は結合した抗体の存在を定量的に検出することのできる他の試薬を含有している、１つ以上の他の容器も含むだろう。該キットはまた、フローサイトメトリー又はＥＬＩＳＡを実施するのに適した薬剤も含有している。典型的には、コンパートメント化されたキットは、試薬が別々の容器に含有されている任意のキットを含み、小型のガラス製の容器、プラスチック製容器、又はプラスチック片若しくは紙片を含み得る。このような容器は、試料及び試薬の相互混入を回避しつつ一方のコンパートメントから別のコンパートメントへと試薬を効率的に移動させることを可能とし得、及び、一方のコンパートメントから別のコンパートメントへと各容器の薬剤又は溶液の定量的な添加を可能とし得る。このようなキットはまた、血液試料を受容するであろう容器、アッセイで使用される抗体（群）を含有している容器、洗浄用試薬（例えばリン酸緩衝食塩水、トリス緩衝液など）を含有している容器、及び検出用試薬を含有している容器を含み得る。

ネフローゼ症候群を処置するための方法及び組成物
第六の態様では、本発明は、治療有効量のイスミン−１阻害剤を被験者に投与する工程を含む、それを必要とする被験者における、特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）、微小変化型ネフローゼ（ＭＣＮ）、又は巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を処置する方法に関する。

より特定すると、本発明の方法は、特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）、微小変化型ネフローゼ（ＭＣＮ）、又は巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）によって引き起こされるネフローゼ症候群を処置するのに適している。

本明細書において使用する「処置する」又は「処置」という用語は、予防的処置又は防止的処置、並びに、治癒的処置又は疾患修飾的処置（疾患に罹るリスクがあるか又は疾患に罹っていることが疑われる被験者、並びに、病気であるか又は疾患若しくは医学的容態を患っていると診断されている被験者の処置を含む）の両方を指し、これは臨床的再発の抑制も含む。障害又は再発している障害の１つ以上の症状を予防、治癒、その発症を遅延、その重症度を低減、又は寛解するために、あるいは、このような処置を行なわなかった時に予想される生存期間を超えて被験者の生存期間を延長するために、医学的障害を有するか又は最終的に障害に罹る可能性のある被験者に処置が投与され得る。「治療処方計画」によって、病気の処置のパターン、例えば療法中に使用される投薬パターンを意味する。治療処方計画は、誘導処方計画及び維持処方計画を含み得る。「誘導処方計画」又は「誘導期間」という語句は、疾患の初期処置に使用される治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。誘導処方計画の一般的目標は、処置処方計画の初期期間中に被験者に高いレベルの薬物を提供することである。誘導処方計画は、（部分的に又は全体に）「負荷処方計画」を使用し得、これは医師が維持処方計画中に使用するであろうよりも多くの用量の薬物を投与すること、医師が維持処方計画中に薬物を投与するであろうよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含み得る。「維持処方計画」又は「維持期間」という語句は、例えば、被験者が長期間（数か月又は数年間）にわたり寛解を保つために、病気の処置中に被験者の維持のために使用される、治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。維持処方計画は、連続的療法（例えば、定期的な間隔で、例えば週１回、月１回、年１回などに薬物を投与）又は断続的療法（例えば、間断的処置、断続的処置、再発時における処置、又は特定の予め決定された基準［例えば、疼痛、疾患の徴候など］）の到達時の処置を使用し得る。

本明細書において使用する「被験者」という用語は、任意の哺乳動物、例えばげっ歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類を指す。特に、本発明では、被験者はヒトである。特定の実施態様では、被験者は、ネフローゼ症候群の特発性ネフローゼ症候群に罹りやすいヒトである。より特定すると、被験者は、ネフローゼ症候群を引き起こす、ＩＮＳ、ＭＣＮ、又はＦＳＧＳに罹りやすい。本明細書において使用する「イスミン−１阻害剤」という用語は、転写物及び／又はタンパク質の活性又は発現を阻害又は有意に減少させる生物学的効果を有する天然化合物又は合成化合物を指す。したがって、「ＩＳＭ−１阻害剤」は、ＩＳＭ−１転写物及び／又はタンパク質の活性又は発現を阻害又は有意に減少させる生物学的効果を有する天然化合物又は合成化合物を指す。特定の実施態様では、ＩＳＭ−１阻害剤は、ＩＳＭ−１活性阻害剤である。「ＩＳＭ−１活性阻害剤」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＩＳＭ−１の活性を減少又は選択的に抑制する能力を有する化合物を指す。典型的には、ＩＳＭ−１活性阻害剤は、有機低分子、ポリペプチド、アプタマー、又は抗体である。

いくつかの実施態様では、イスミン−１活性阻害剤は、有機低分子である。

本明細書において使用する「有機低分子」という用語は、医薬品において一般的に使用される有機分子と同等なサイズの分子を指す。該用語は、生物学的な高分子（例えばタンパク質、核酸など）を除外する。典型的には、有機低分子は、約５０００Ｄａまでの、より好ましくは２０００Ｄａまでの、最も好ましくは約１０００Ｄａまでのサイズの範囲である。

いくつかの実施態様では、イスミン−１活性阻害剤は抗体である。より特定すると、該抗体は、白血球の膜上に存在するＩＳＭ−１を阻害するのに適している。したがって、「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すために使用され、この用語は、抗原結合ドメイン、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ又はＶＨＨ）、タンデムディアボディ抗体ダイマー、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、鎖状抗体、ミニ抗体、ディアボディーズ、二重特異的抗体断片、ビボディ、トリボディ（それぞれ二重特異的又は三重特異的なｓｃＦｖ−Ｆａｂ融合物）；ｓｃ−ディアボディ；κ（λ）ボディーズ（ｓｃＦｖ−ＣＬ融合物）；ＤＶＤ−Ｉｇ（デュアル可変ドメイン抗体、二重特異的フォーマット）；ＳＩＰ（小型免疫タンパク質、一種のミニ抗体）；ＳＭＩＰ（「小型モジュラー免疫医薬」ｓｃＦｖ−Ｆｃダイマー）；ＤＡＲＴ（二本鎖安定化ディアボディ「デュアル親和性再標的化」）；１つ以上のＣＤＲを含む小型抗体模倣体などを含む、抗体断片を含む。様々な抗体をベースとした構築物及び断片を調製及び使用するための技術は当技術分野において周知である。いくつかの実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は内部移行しない。本明細書において使用する「内部移行しない抗体」という用語は、細胞表面上に存在する標的抗原に結合し、その標的抗原に結合した場合、細胞内に進入してリソソーム内で分解されることのない、それぞれ抗体を指す。特に、本発明の脈絡において、抗体は単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、天然的には軽鎖を欠失しているラクダ科哺乳動物に見られ得る種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このような単一ドメイン抗体は、ＶＨＨ又は「ナノボディ（登録商標）」とも呼ばれる。（単一）ドメイン抗体の一般的な説明のために、上記に引用されている先行技術、並びに、欧州特許第０３６８６８４号、Ward et al.（Nature 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6）、 Holt et al.、Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490；及び国際公開公報第０６／０３０２２０号、国際公開公報第０６／００３３８８号も参照されたい。本発明の脈絡において、単一ドメイン抗体のアミノ酸残基は、国際免疫遺伝学的情報システムのアミノ酸番号付け（http://imgt.cines.fr/）によって付与されたＶＨドメインについての一般的な番号付けに従って番号付けされる。特に、本発明の脈絡において、抗体は一本鎖可変断片である。「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ断片」という用語は、リンカー分子を通して連結された抗体のＶＨドメインとＶＬドメインとを含む、単一の折り畳まれたポリペプチドを指す。このようなｓｃＦｖ断片では、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ＶＨ−リンカー−ＶＬ又はＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれの順であってもよい。その生成を促進することに加えて、ｓｃＦｖ断片は、スペーサーを介してｓｃＦｖに連結されたタグ分子を含有し得る。したがって、ｓｃＦｖ断片は、抗原の認識に関与するＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むが、対応する抗体の免疫原性定常ドメインは含まない。

いくつかの実施態様では、イスミン−１活性阻害剤はアプタマーである。アプタマーは、分子認識に関して抗体の代替選択肢である分子のクラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性で任意のクラスの標的分子を実質的に認識する能力を有する、オリゴヌクレオチド配列又はオリゴペプチド配列である。

いくつかの実施態様では、イスミン−１活性阻害剤はポリペプチドである。「ポリペプチド」という用語は、ＩＳＭ−１に特異的に結合するポリペプチドを指し、ＩＳＭ−１タンパク質に結合して捕捉し、これによりＩＳＭ−１タンパク質がシグナル伝達するのを妨げる、ＩＳＭ−１阻害剤として使用され得る。ポリペプチドは、少なくとも２アミノ酸残基長、最大でも１０アミノ酸残基長を有する短いペプチド、オリゴペプチド（１１〜１００個のアミノ酸残基）、及びより長いペプチド（「ポリペプチド」の通常の解釈、すなわち、１００個超のアミノ酸残基長）、並びに、タンパク質（グリコシル化されることによって、脂質化されることによって、又は補欠分子族を含むことによって化学的に修飾されていてもよい、少なくとも１つのペプチド、オリゴペプチド、又はポリペプチドを含む、機能的実体）の両方を指す。ポリペプチドの定義はまた、マイコバクテリア内の天然形のペプチド／タンパク質、並びに、あらゆる種類の宿主を形質転換するあらゆる種類の発現ベクター内の組換えタンパク質又はペプチド、並びにまた化学合成されたペプチドも含む。

特定の実施態様では、イスミン−１阻害剤は、イスミン−１発現阻害剤である。「イスミン−１発現阻害剤」は、ＩＳＭ−１をコードしている遺伝子の発現を阻害又は有意に減少する生物学的効果を有する天然化合物又は合成化合物を指す。典型的には、イスミン−１発現阻害剤は、以下の１つ以上の事象に対して生物学的効果を及ぼす：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の生成（例えば転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップの形成、及び／又は３’末端の形成による）；（３）ＲＮＡからポリペプチド又はタンパク質への翻訳；並びに／あるいは（４）ポリペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾。

いくつかの実施態様では、イスミン−１発現阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＩＳＭ−１ｍＲＮＡに結合し、これによりタンパク質の翻訳を妨げるか又はｍＲＮＡの分解を増加させ、これにより、ＩＳＭ−１タンパク質のレベルを減少させ、これにより、細胞内の活性を減少させることによって、ＩＳＭ−１ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するように作用するだろう。例えば、少なくとも約１５塩基でありかつＩＳＭ−１をコードしているｍＲＮＡ転写物配列の特有な領域に対して相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、慣用的なホスホジエステル技術によって合成し、例えば静脈内注射又は注入によって投与することができる。その配列が公知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に軽減するためのアンチセンス技術を使用するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；第６，５６６，１３１号；第６，３６５，３５４号；第６，４１０，３２３号；第６，１０７，０９１号；第６，０４６，３２１号；及び第５，９８１，７３２号を参照されたい）。

いくつかの実施態様では、イスミン−１発現阻害剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ＩＳＭ−１の発現は、被験者若しくは細胞を、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、又は低分子二本鎖ＲＮＡの生成を引き起こすベクター若しくは構築物と接触させ、これにより、ＩＳＭ−１の発現が特異的に阻害される（すなわちＲＮＡ干渉すなわちＲＮＡｉ）ことによって減少させ得る。その配列が公知である遺伝子に対する、適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードしているベクターを選択するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Tuschl, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第６，５７３，０９９号及び第６，５０６，５５９号；並びに国際特許公開公報第ＷＯ０１／３６６４６号、ＷＯ９９／３２６１９号、及びＷＯ０１／６８８３６号を参照）。

いくつかの実施態様では、イスミン−１発現阻害剤はリボザイムである。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することのできる酵素性ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機序は、相補的な標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、その後のヌクレオチド鎖切断を含む。よって、ＩＳＭ−１ ｍＲＮＡ配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効率的に触媒する、工学操作されたヘパリン又はハンマーヘッドモチーフのリボザイム分子が、本発明の範囲内において有用である。任意のＲＮＡ標的候補内の特異的なリボザイム切断部位を、典型的には以下の配列、すなわちＧＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位について標的分子を走査することによってまず同定する。一旦同定されたら、切断部位を含有している標的遺伝子の領域に対応する約１５から２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切なものとさせる可能性のある二次構造などの予測される構造の特色について評価することができる。候補標的の適切性はまた、例えばリボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを行なえるかを試験することによっても評価され得る。

いくつかの実施態様では、イスミン−１発現阻害剤は、エンドヌクレアーゼである。「エンドヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。デオキシリボヌクレアーゼＩなどのいくつかは、比較的非特異的に（配列に関係なく）ＤＮＡを切断するが、多くの、典型的には制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素と呼ばれるものは、非常に特定のヌクレオチド配列においてしか切断しない。エンドヌクレアーゼに基づいたゲノム不活化の背後にある機序は一般的に、ＤＮＡの一本鎖又は二本鎖の切断という第一工程を必要とし、これは次いで、ＤＮＡの失活のために利用され得る、ＤＮＡの修復のための２つの明確に異なる細胞機序（エラーを起こしがちな非相同末端再結合（ＮＨＥＪ）及び高忠実度の相同組換え修復（ＨＤＲ））をトリガーすることができる。特定の実施態様では、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓである。本明細書において使用する「ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、短い塩基反復配列を含有している原核細胞ＤＮＡのセグメントである、クラスター化され規則的に間隔があいた短い回文構造の反復配列関連を指す。いくつかの実施態様では、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９であり、化膿性連鎖球菌に由来する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、米国特許第８６９７３５９Ｂ１号及び米国特許第２０１４／００６８７９７号に記載されている。いくつかの実施態様では、エンドヌクレアーゼは、Zetsche et al.（“Cpf1 is a Single RNA-guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System (2015); Cell; 163, 1-13）においてプレボテラ（Provotella）及びフランシセラ（Francisella）１（Ｃｐｆ１）から最近になって特徴付けられたＣＲＩＳＰＲである、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１である。

特定の実施態様では、イスミン−１阻害剤は、イスミン−１受容体の阻害剤である。当技術分野において公知であるように、ＩＳＭ−１の受容体はαｖβ５インテグリンある。「αｖβ５インテグリン」という用語は、インテグリンαＶ及びインテグリンβ５を指す。αｖβ５インテグリンは、とりわけ、細胞間相互作用、細胞−細胞外マトリックス（ＥＣＭ）相互作用、及び細胞−病原体相互作用を媒介する非共有結合的に会合したα/βヘテロダイマーを含む、接着分子ファミリーの一員である。αｖβ５は、β５サブユニットを含有している唯一のインテグリンである。αｖβ５はＲＧＤペプチド配列を認識し、ビトロネクチン（例えばHynes, Cell 69:11-25 (1992)を参照）に結合し、脳卒中、心筋梗塞、がん（すなわち血管新生）及び眼新生血管疾患をはじめとする複数の障害に関与している。いくつかの実施態様では、ＩＳＭ−１阻害剤は、αｖβ５インテグリンの阻害剤である。典型的には、αｖβ５インテグリン阻害剤は、αｖβ５インテグリン上の利用可能なリガンド結合部位についてαｖβ５リガンドと競合する任意の化合物である。本発明の脈絡において、リガンドはＩＳＭ−１である。したがって、αｖβ５インテグリン阻害剤は、αｖβ５インテグリンとＩＳＭ−１の相互作用を妨げる。αｖβ５インテグリン阻害剤としては、αｖβ５若しくはβ５に特異的に結合するか、又はαｖβ５インテグリンの活性若しくは発現を阻害することができる化合物が挙げられる。例としては、抗体、低分子阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡが挙げられる。典型的には、αｖβ５インテグリン阻害剤は、低分子である。特定の実施態様では、低分子は、国際公開公報第２００００４７５５２号に記載のようなチロシンアルコキシグアニジンである。特定の実施態様では、低分子は、米国特許第７３５１７１１号に記載のような三環式インダニルである。特定の実施態様では、低分子は、国際公開公報第２０１１０９８６０３号に記載のような化合物である。特定の実施態様では、低分子は、国際公開公報第０２１６３２３号に記載のようなビフェニル及びその誘導体である。特定の実施態様では、低分子は、国際公開公報第００１５２４４号に記載のようなシレンジチド（ＥＭＤ１２１９７４）である。特定の実施態様では、αｖβ５インテグリン阻害剤は抗体である。特定の実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、モノクローナル抗体は欧州特許第７１９８５９号に記載のようなｍＡｂ１７Ｅ６（ＥＭＤ７３０３４）である。特定の実施態様では、モノクローナル抗体は、国際公開公報第２００９０１０２９０号に記載のような組換え抗αｖインテグリンハイブリッド抗体である。特定の実施態様では、モノクローナル抗体は、Shoucheng Ning et al 2008に記載のようなＣＮＴＯ ９５である。

特定の実施態様では、イスミン−１阻害剤は、ＧＲＰ−７８（ＢｉＰ）阻害剤である。当技術分野においては公知であるように、ＩＳＭ−１阻害剤はＧＲＰ−７８でもある。本明細書において使用する「ＧＲＰ−７８」という用語は、結合性免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）、７８ｋＤａのグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ−７８）又は熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）としても知られているが、これはヒトにおいてはＨＳＰＡ５遺伝子によってコードされているタンパク質である。ＧＲＰ−７８は、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を調節する際に中心的な役割を果たし、哺乳動物細胞におけるオートファジーの必須成分である。典型的には、ＧＲＰ−７８阻害剤は、ＧＲＰ−７８上の利用可能なリガンド結合部位についてＧＲＰ−７８リガンドと競合する任意の化合物である。本発明の脈絡において、リガンドはＩＳＭ−１である。したがって、ＧＲＰ−７８阻害剤は、ＧＲＰ−７８とＩＳＭ−１との間の相互作用を妨げる。ＧＲＰ−７８阻害剤としては、ＧＲＰ−７８に特異的に結合するか、又はＧＲＰ−７８の活性若しくは発現を阻害することができる化合物が挙げられる。例としては、抗体、低分子阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡが挙げられる。典型的には、ＧＲＰ−７８阻害剤は低分子である。特定の実施態様では、低分子は、国際公開公表第２０１４０７２４８６号及びCerezo et al 2016, Oncoscience, Vil 3(11-12), November 2016に記載のようなＨＡ１５などの分子である。別の実施態様では、低分子は、セレコキシブ誘導体であるＯＳＵ−０３０１２（ＡＲ−１２）である。ＯＳＵ−０３０１２（ＡＲ−１２）はＣＡＳ番号７４２１１２−３３−０を有し、Booth L et al, J Cell Physiol. 2015 Jul;230(7):1661-76. doi: 10.1002/jcp.24919; Liu J et al, Anticancer Drugs. 2013 Aug;24(7):690-8. doi: 10.1097/CAD.0b013e328362469に記載されている。別の実施態様では、低分子はＩＴ−１３９である。ＮＫＰ−１３３９とも呼ばれるＩＴ−１３９は、インテザイン・テクノロジーズ社によって開発され市販されている。ＦＤＡは、２０１７年６月に膵臓癌についてＩＴ−１３９にオーファンドラッグの指定を認可している。特定の実施態様では、低分子は、Kosakowska Cholody et al Cell Death and Disease (2014) 5, e1240; doi:10.1038/cddis.2014.203に記載のようなＨＫＨ４０Ａである。特定の実施態様では、ＧＲＰ−７８阻害剤は抗体である。特定の実施態様では、該抗体はモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、モノクローナル抗体は、Ren Liu et al Clin Cancer Res. 2013 Dec 15; 19(24): 6802-6811に記載のようなＭＡｂ１５９である。

「治療有効量」は、被験者に治療的利点を付与するのに必要とされる最小量の活性薬剤を意図する。例えば、被験者に対する「治療有効量」は、病的症状、疾患の進行、又は障害に負けることを伴う若しくは障害に負けることに対する抵抗性を伴う生理学的容態の改善を誘導するか、寛解するか、又は別様に引き起こすような量である。本発明の化合物の１日総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当の医師によって決断されるであろうことが理解されるであろう。任意の特定の被験者に対する具体的な治療有効量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成；被験者の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食事；使用される具体的な化合物の投与時刻、投与経路、及び排泄速度；処置期間；使用される具体的な化合物と組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医学分野において周知である同様な因子をはじめとする、様々な因子に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を次第に増加させることは、十分に当業者の技能範囲内である。しかしながら、製品の１日量は、成人１人あたり１日あたり０．０１〜１，０００mgの広い範囲におよび変更されてもよい。典型的には、該組成物は、処置される予定の被験者への症状による用量の調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mgの活性成分を含有している。医薬品は典型的には、約０．０１mgから約５００mgの活性成分、好ましくは１mgから約１００mgの活性成分を含有している。薬物の有効量は通常、０．０００２mg/kgから約２０mg/kg（体重）/日、特に約０．００１mg/kgから７mg/kg（体重）/日の用量レベルで供給される。

上記のようなイスミン−１阻害剤を、薬学的に許容される賦形剤、及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせることにより、医薬組成物を形成し得る。「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、適宜、哺乳動物、特にヒトに投与された場合に、有害反応、アレルギー反応、又は他の望ましくない反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、無毒性の固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、又はあらゆる種類の製剤化助剤を指す。経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、又は直腸投与のための本発明の医薬組成物において、活性成分を単独で又は別の活性成分と組み合わせて、単位投与形で、従来の薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与剤形は、経口経路剤形、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、及び経口用懸濁剤又は液剤、舌下及び頬側投与剤形、エアゾール、埋込剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、くも膜下腔内、及び鼻腔内投与剤形、並びに直腸投与剤形を含む。典型的には、医薬組成物は、注射され得る製剤にとって薬学的に許容されるビヒクルを含有している。これらは、特に、等張で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水を添加すると注射液の復元を可能とする乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であり得る。注射用途に適した医薬剤形としては、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び、無菌注射液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、シリンジが容易に扱える程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から防腐されていなければならない。本発明の化合物を遊離塩基又は薬理学的に許容される塩として含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中において調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物中において並びに油中において調製され得る。通常の保存及び使用の条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐ保存剤を含有している。該ポリペプチド（又はそれをコードする核酸）は、中性形又は塩の形の組成物へと製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられ、これは無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸、又はこのような有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などを用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄、及びこのような有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導され得る。担体はまた、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、及び植物油を含有している溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の吸収延長は、該組成物中に吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することによってもたらされ得る。無菌注射液は、必要量の活性ポリペプチドを適切な溶媒中に、必要であれば上記に列挙された他のいくつかの成分と共に取り込み、その後、滅菌ろ過することによって調製される。一般的に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本分散媒体と上記に列挙された成分の中からの必要とされる他の成分とを含有している無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより、以前に滅菌ろ過されたその溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。製剤化時に、液剤は、投与製剤と適合性の様式で、かつ治療的に有効な量で投与されるだろう。製剤は、様々な剤形で、例えば上記のようなタイプの注射液で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。水溶液での非経口投与のために、例えば、液剤は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は、まず、十分な食塩水又はブドウ糖を用いて等張とすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与のために特に適している。これに関連して、使用され得る無菌水性媒体は、本開示に鑑みて当業者には公知であろう。例えば、１用量を等張ＮａＣｌ溶液１mlに溶解し、皮下点滴療法用の液体１０００mlに加えるか又は提案された注入部位に注射し得る。用量の幾分の変更が、処置される被験者の容態に依存して必然的に行なわれるだろう。投与責任者は、いずれの事象においても、個々の被験者に対する適切な用量を決定するだろう。

特定の実施態様では、本発明は、ｉ）被験者が、上記のような方法に従ってＩＮＳ、ＭＣＮ、又はＦＧＦＳを患っているかどうかを決定することからなる第一工程、及びｉｉ）イスミン−１の膜発現レベル又はイスミン−１の膜発現レベル対する細胞内発現レベルの比が、その予め決定された基準値より高い場合、治療量のＩＳＭ−１阻害剤を該被験者に投与する工程を含む、それを必要とする被験者におけるＩＮＳ、ＭＣＮ、又はＦＧＦＳを処置する方法に関する。

毛細血管透過性の機能障害を処置するための方法及び組成物
第七の態様では、本発明は、治療有効量のイスミン−１阻害剤を被験者に投与する工程を含む、それを必要とする被験者における毛細血管透過性の機能障害を処置する方法に関する。

特定の実施態様では、本発明は、ｉ）被験者が、上記のような方法に従って糸球体毛細血管透過性を患っているかどうかを決定することからなる第一工程、及びｉｉ）イスミン−１の膜発現レベル又はイスミン−１の膜発現レベル対する細胞内発現レベルの比が、その予め決定された基準値より高い場合、治療量のイスミン−１阻害剤を該被験者に投与する工程を含む、それを必要とする被験者における毛細血管透過性を処置する方法に関する。

特定の実施態様では、本発明による方法は、それを必要とする被験者における糸球体毛細血管透過性の機能障害を処置するのに適している。

本明細書において使用する「イスミン−１阻害剤」という用語は、転写物及び／又はタンパク質の活性又は発現を阻害又は有意に減少させる生物学的効果を有する天然化合物又は合成化合物を指す。このような阻害剤は上記されている。

本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

健康な対照（塗りつぶされた丸）及びネフローゼ症候群の様々な原因を有する患者（白抜きの三角）におけるＦＡＣＳによって測定された白血球の膜上でのイスミン−１の発現。 （Ａ）ネフローゼ症候群の様々な原因を有する患者におけるＦＡＣＳによって測定された白血球の膜上でのイスミン−１の発現。微小変化群（ＭＣＤ）（星印）；続発性ＭＣＤ（続発性ＭＣＤ）（塗りつぶされた四角）；初期ＦＳＧＳ（塗りつぶされた丸）、続発性ＦＳＧＳ（塗りつぶされた三角）、膜性腎症（ＭＮ）（白抜きの三角）；糖尿病性腎症（白抜きの丸）；アミロイドーシス（塗りつぶされた三角）；感染後糸球体腎炎（ばつ印）；ループス糸球体腎炎（白抜きの菱形）；膜増殖性糸球体腎炎（ＧＮＭＰ）（塗りつぶされた菱形）；ＡＮＣＡ血管炎（半分塗りつぶされた丸）。（Ｂ）ネフローゼ症候群の様々な原因を有する患者におけるＦＡＣＳによる白血球の細胞膜内でのイスミン−１の発現。微小変化群（ＭＣＤ）（星印）；続発性ＭＣＤ（続発性ＭＣＤ）（塗りつぶされた四角）；膜性腎症（ＭＮ）（白抜きの三角）；糖尿病性腎症（白抜きの丸）；アミロイドーシス（塗りつぶされた三角）；感染後糸球体腎炎（Ｘ）；ループス糸球体腎炎（白抜きの菱形）；膜増殖性糸球体腎炎（ＧＮＭＰ）（塗りつぶされた菱形）；ＡＮＣＡ血管炎（半分塗りつぶされた丸）。 アンチセンス剤を使用したＩＳＭ１の阻害は、ネフローゼを有するラットにおけるタンパク尿及びアルブミン尿のレベルを低減させる。ラットは、ネフローゼ症候群を発症させるためにアドリアマイシンの静脈内注射を受けたか、又は等張食塩水溶液（対照群）を受けた。尿中アルブミン対クレアチニンの比、及び尿中タンパク質対クレアチニンの比を、アドリアマイシンの注射から１０日後、２０日後、及び３０日後に測定した。ネフローゼを有するラットを、１週間あたり３回、アンチセンス混合物又はＩＳＭ−１アンチセンス剤のいずれかを用いて腹腔内に処置した（１群あたりｎ＝６匹）。 アンチセンス剤を使用したＩＳＭ１の阻害は、ネフローゼを有するラットにおける血漿中アルブミンのレベルを増加させる。アドリアマイシン又は食塩水溶液の注射から３０日後、ネフローゼを有するラット及び対照ラットにおける血漿中アルブミンを測定した（１群あたりｎ＝６匹）。 全ての群において腎機能は不変であった。血漿中クレアチニン及び尿を、アドリアマイシン又は食塩水の注射から３０日後に測定した。 糸球体のＩＳＭ−１及びβ５インテグリンのｍＲＮＡの発現。アドリアマイシン又は食塩水の注射から３０日後に、ネフローゼを有するラット及び対照ラットを麻酔し、糸球体の単離のために腎臓を回収した。ＩＳＭ−１及びβ５インテグリンｍＲＮＡ発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した（１群あたりｎ＝６匹）。 アンチセンス剤を使用したＩＳＭ１の阻害は、ＦＳＧＳ病変及び癒着の発症を予防する。アドリアマイシン又は食塩水の注射から３０日後の、ネフローゼを有するラット及び対照ラット由来の光学顕微鏡による腎切片を、マッソントリクローム染色にかけた。ボウマン嚢への綿状沈降物の癒着及びＦＳＧＳ病変を、１切片あたり２０個の無作為に選択した糸球体において定量した（１群あたりｎ＝６匹のラット）。 アンチセンス剤を使用したＩＳＭ１の阻害は、ネフローゼを有するラットにおける足突起の消滅の発生を予防する。アドリアマイシン又は食塩水の注射から３０日後のネフローゼを有するラット及び対照ラット由来の電子顕微鏡用の切片を研究した。腎糸球体基底膜の長さあたりの足細胞の足突起の数を、同じ拡大率を用いて実施された各画像上で計算した（１群あたりｎ＝６匹のラット）。

実施例：
材料及び方法
集団：
選択基準を有し参加に同意した腎臓科からの外来患者及び入院患者から血液試料を回収した。

プロトコール：
選択基準：
−定義されているようなネフローゼ症候群を有する全ての成人患者及び小児患者（タンパク尿≧３ｇ/日、＞５０mg/kg/m²/日及び低アルブミン血症＜３０g/l）、
−成人におけるＭＣＮ若しくは初期ＦＳＧＳの組織学的診断、又は小児におけるＩＮＳの漸進的診断。

除外基準：免疫抑制療法（副腎皮質ステロイド及び／又は免疫抑制剤）を受けているネフローゼ患者。

主要アウトカム：ＩＳＭ−１の試験感度：ネフローゼ症候群の診断時におけるフローサイトメトリーによる循環白血球におけるＩＳＭ−１の発現が、健康な対照の平均値の２０倍を超える場合に診断がなされる。

二次アウトカム：
−成人における、特異度の試験、ＰＰＶ、ＮＰＶの試験。
−Ｍｉｓｓ−１の単球及び顆粒球の膜上での発現のサイトメトリーにおける、感度、特異度、ＰＰＶ、ＮＰＶの試験。

ＦＡＣＳによる白血球によるＩＳＭ−１の発現の測定
選択基準を示す患者からＥＤＴＡ血液試料 １０mlを回収する。試料を、ＩＳＭ−１の測定のために血液科に迅速に提出する。

方法
全血試料を、ＥＤＴＡ含有無菌チューブに回収し、室温で１５００×ｇで１５分間遠心分離にかけ、白血球バンド（バフィーコート）、血漿、及び赤血球のペレット（ＲＢＣ）を分離した。遠心分離後、バフィーコートを回収し、赤血球をＫＣｌ溶液を用いて溶解した。白血球を、２５００×ｇで１０分間遠心分離した後に回収し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、細胞を、４℃で３０分間の間に１％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＴＷＥＥＮ０．１％（５分間、４℃）を用いて透過性処理した。

フローサイトメトリー分析のために使用される予定の細胞を、様々な抗体と共に暗所で３０分間インキュベートした：抗ＣＤ３抗体（Ａ０７７４６、ベックマンコールター社）、抗ＣＤ５６抗体（ＩＭ２４７４、ベックマンコールター社）、抗ＣＤ１４抗体（Ａ０７７６５、ベックマンコールター社）、抗ＣＤ１９抗体（ＩＭ３６２８、ベックマンコールター社）、及び抗ＩＳＭ−１抗体。ＩｇＧアイソタイプを各実験のために使用した（マウスＩｇＧ１−ＦＩＴＣ、Ａ０７７９５；ＩｇＧ１−ＡＰＣ、ＩＭ２４７５、ＩｇＧ２Ａ−ＰＣ５及びＩｇＧ１ ＰＣ７、ベックマンコールター社）。細胞を再び洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーターＦＣ５００機器（ベックマンコールター社）を使用して分析した。

イスミン−１：糸球体毛細血管透過性因子
この問題に対処するために、組換えイスミン−１タンパク質（バイオレジェンド社）を麻酔したマウスに注射する。尿中アルブミン−クレアチニン比を、市販のキット（参考文献）を使用してＩＳＭ−１の注射の前後に測定する。

イスミン−１の阻害は、タンパク尿を改善する
ネフローゼ症候群の最中におけるＩＳＭ−１の阻害の効果を試験するために、本発明者らは、ラットへのアドリアマイシンの静脈内注射によってネフローゼ症候群を誘発した。これらのラットは、時間と共に重度のタンパク尿及び低アルブミン血症を発症し、ＩＳＭ−１に対するアンチセンス剤又はアンチセンス混合物のいずれかを用いて１週間に３回３０日間腹腔内に処置した。そうした群を、等張ナトリウム食塩水の注射された群と比較した。尿中アルブミン及びタンパク質対クレアチニンの比の測定値を、１０日毎に３０日間測定し、群間で比較した。図３及び４に示されているように、ＩＳＭ１アンチセンス剤は、アドリアマイシンの注射から３０日後にネフローゼを有するラットにおいてタンパク尿及びアルブミン尿のレベルを有意に減少させた。さらに、図５は、ＩＳＭ１アンチセンス剤が、ネフローゼを有するラットにおいて血漿中アルブミンのレベルを増加させたことを示す。この腎症モデルでは、腎機能は変化せず、ＩＳＭ１アンチセンス剤は、腎機能に対して全く影響を及ぼさなかった（図６）。さらに、本発明者らは、図８及び９において、ＩＳＭ１アンチセンス剤が、ネフローゼを有するラットにおいてＦＳＧＳ病変（光学顕微鏡による研究）及び足突起消滅（電子顕微鏡）の発症を予防することを示す。図７は、ＩＳＭ−１阻害の有益な効果は、糸球体のＩＳＭ−１及びβ５インテグリンの発現とは関係ないようであるが、ＩＳＭ１の阻害の腎臓以外の効果に起因する可能性があることを示唆する。

したがって、結果は、ＩＳＭ１の阻害が、ＩＮＳ、ＭＣＮ及びＦＳＧＳを予防しその回復を支持し得、よって、ネフローゼ症候群を処置することができることを示す。

参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照によって本明細書に組み込まれる。

Claims (15)

1. ｉ）被験者から得られた生物学的試料中の循環白血球上のイスミン（isthmin）−１の膜発現レベルを測定する工程；ｉｉ）工程ｉ）で測定された発現レベルを、その予め決定された基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）イスミン−１の膜発現レベルがその予め決定された基準値よりも高い場合、該被験者は特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）、微小変化型ネフローゼ（ＭＣＮ）、若しくは巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を患っていると結論付け、又は、イスミン−１の膜発現レベルがその予め決定された基準値よりも低いか若しくは類似している場合、該被験者はＩＮＳ、ＭＣＮ、若しくはＦＳＧＳを患っていないと結論付ける工程を含む、該被験者におけるＩＮＳ、ＭＣＮ、又は初期ＦＳＧＳを診断するための方法。
2. ｉ）被験者から得られた試料中の循環白血球中のイスミン−１の細胞内発現レベルを測定する工程；ｉｉ）該試料中の循環白血球上のイスミン−１の膜発現レベルを測定する工程；ｉｉｉ）工程ｉｉ）で決定されたイスミン−１の膜発現レベルに対する、工程ｉ）で決定されたイスミン−１の細胞内発現レベルの比を計算する工程；ｉｖ）工程ｉｉｉ）で決定された比を、予め決定された基準値と比較する工程、及びｖ）工程ｉｉｉ）で決定された比が、予め決定された基準値よりも高い場合、該被験者はＩＮＳ、ＭＣＮ、若しくはＦＳＧＳを患っていると結論付け、又は工程ｉｖ）で決定された比が、予め決定された基準値よりも低い場合、該被験者はＩＮＳ、ＭＣＮ、若しくはＦＳＧＳを患っていないと結論付ける工程を含む、該被験者におけるＩＮＳ、ＭＣＮ、又はＦＳＧＳを診断するための方法。
3. ｉ）被験者から得られた生物学的試料中の循環白血球上のイスミン−１の膜発現レベルを測定する工程；ｉｉ）工程ｉ）で測定された発現レベルを、その予め決定された基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）イスミン−１の膜発現レベルがその予め決定された基準値よりも高い場合、該被験者は毛細血管透過性の機能障害を患っていると結論付け、又はイスミン−１の膜発現レベルがその予め決定された基準値よりも低いか若しくは類似している場合、該被験者は毛細血管透過性の機能障害を患っていないと結論付ける工程を含む、該被験者における毛細血管透過性の機能障害を診断するための方法。
4. ｉ）被験者から得られた試料中の循環白血球中のイスミン−１の細胞内発現レベルを測定する工程；ｉｉ）該試料中の循環白血球上のイスミン−１の膜発現レベルを測定する工程；ｉｉｉ）工程ｉｉ）で決定されたイスミン−１の膜発現レベルに対する、工程ｉ）で決定されたイスミン−１の細胞内発現レベルの比を計算する工程；ｉｖ）工程ｉｉｉ）で決定された比を、予め決定された基準値と比較する工程、及びｖ）工程ｉｉｉ）で決定された比が、予め決定された基準値よりも高い場合、該被験者は毛細血管透過性の機能障害を患っていると結論付け、又は、工程ｉｖ）で決定された比が、予め決定された基準値よりも低い場合、該被験者は毛細血管透過性の機能障害を患っていないと結論付ける工程を含む、該被験者における毛細血管透過性の機能障害を診断する方法。
5. ｉ）被験者から得られた試料中の循環白血球上のイスミン−１の膜発現レベルを測定する工程；ｉｉ）工程ｉ）で測定された発現レベルを、その予め決定された基準値と比較する工程、及びｉｉｉ）イスミン−１の膜発現レベルが、その予め決定された基準値よりも高い場合、該被験者は処置に対する再発のリスクがあると結論付け、又は、イスミン−１の膜発現レベルが、その予め決定された基準値よりも低い場合、該被験者は再発のリスクがないと結論付ける工程を含む、ＩＮＳ、ＭＣＮ、又はＦＳＧＳを患っている被験者における処置に対する再発のリスクを予測するための方法。
6. ｉ）被験者から得られた試料中の循環白血球中のイスミン−１の細胞内発現レベルを測定する工程；ｉｉ）該試料中の循環白血球上のイスミン−１の膜発現レベルを測定する工程；ｉｉｉ）工程ｉｉ）で決定された発現レベルに対する、工程ｉ）で決定された発現レベルの比を計算する工程；ｉｖ）工程ｉｉｉ）で決定された比を、予め決定された基準値と比較する工程、及びｖ）工程ｉｉｉ）で決定された比が、その予め決定された基準値よりも高い場合、該被験者は再発のリスクがあると結論付け、又は、工程ｉｉｉ）で決定された比が、その予め決定された基準値よりも低い場合、該被験者は再発のリスクがないと結論付ける工程を含む、ＩＮＳ、ＭＣＮ、又はＦＧＦＳを患っている被験者における処置に対する再発のリスクを予測するための方法。
7. イスミン−１の発現レベルが細胞選別（ＦＡＣＳ）によって測定される、請求項１〜６に記載の方法。
8. イスミン−１の発現レベルがＥＬＩＳＡによって測定される、請求項１〜６に記載の方法。
9. 治療有効量のイスミン−１阻害剤を被験者に投与する工程を含む、それを必要とする被験者におけるＩＮＳ、ＭＣＮ、又はＦＳＧＳを処置する方法。
10. ｉ）請求項１又は２に従って、被験者がＩＮＳ、ＭＣＮ、又はＦＳＧＳを患っているかどうかを決定することからなる第一の工程、及びｉｉ）イスミン−１の膜発現レベル、又はイスミン−１の膜発現レベルに対する細胞内発現レベルの比が、その予め決定された基準値よりも高い場合、治療量のイスミン−１阻害剤を該被験者に投与する工程を含む、請求項１０記載の方法。
11. 治療有効量のイスミン−１阻害剤を被験者に投与する工程を含む、それを必要とする被験者における毛細血管透過性の機能障害を処置する方法。
12. ｉ）請求項３又は４に従って被験者が毛細血管透過性の機能障害を患っているかどうかを決定することからなる第一の工程、及びｉｉ）イスミン−１の膜発現レベル、又はイスミン−１の膜発現レベルに対する細胞内発現レベルの比が、その予め決定された基準値よりも高い場合、治療量のイスミン−１阻害剤を該被験者に投与する工程を含む、請求項１１記載の方法。
13. イスミン−１阻害剤が抗体である、請求項１０〜１２に記載の方法。
14. イスミン−１阻害剤が低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１０〜１３に記載の方法。
15. イスミン−１阻害剤が低分子である、請求項１０〜１３に記載の方法。

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