JP2019500903A - カリマイシン（Ｃａｒｒｉｍｙｃｉｎ）生合成遺伝子クラスタ - Google Patents

Abstract

カリマイシン生合成遺伝子クラスタを提供する。全部で４４個の遺伝子オープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）を有し、このうちポリケチドシンテターゼをコードする５個のｏｒｆ（ｏｒｆ１０〜１４）、ポリケチド合成の伸長ユニットおよび修飾に関係する９個のｏｒｆ（ｏｒｆ１、４〜６、１５および３６〜３９）、グリコシル基の合成に関係する１６個のｏｒｆ（ｏｒｆ９、１６〜２２、２４、２６、２８、２９、３３〜３５および４１）、グリコシル基の転移に関係する６個のｏｒｆ（ｏｒｆ７、８、３０〜３２、４０）、抵抗性に関係する２個のｏｒｆ（ｏｒｆ３および２５）、調節に関係する可能性がある４個のｏｒｆ（ｏｒｆ２、２３、２７および４２）、ｔｓｒ抵抗性マーカー遺伝子のｏｒｆ（ｏｒｆ４３）、および４’’ミカロシルイソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子のｏｒｆ（ｏｒｆ４４）を含む。
【選択図】図１

Description

本発明は、微生物遺伝子資源および遺伝子工学の分野に属し、具体的に、遺伝子工学による抗生物質生合成遺伝子クラスタのクローニング、分析、機能研究およびその応用に関する。

カリマイシンは、かつてＳｈｅｎｇｊｉｍｙｃｉｎ、バイトスピラマイシンと呼ばれ、合成生物学技術を利用して開発された１６員環マクロライド系抗生物質（中国特許登録番号第９７１０４４４０６号明細書、中国特許登録番号第０２１４８７７１５号明細書）である。４’’−イソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、ＩＩ、Ｉを主成分とし、４’’−位のヒドロキシ基に対して数種のアシル化を行ったスピラマイシンであり、このうちＩＩＩは約３０％以上を占め、ＩＩは２５％前後であり、Ｉは１０％を超えない。

カリマイシンはグラム陽性菌に対して比較的高い活性を有し、エリスロマイシンおよびβ−ラクタム系抗生物質の耐性菌、インフルエンザ菌、淋菌、レジオネラ菌、バクテロイデスフラジリス、ウェルシュ菌に対して、抗菌活性を有する。特に、肺炎マイコプラズマ、クラミジア・トラコマチスおよび肺炎クラミジアに対して、比較的高い活性を有し（余蘭香ら、四川生理科学雑誌、１９９８年、２０（３）、中国特許番号第２００３１０１２２４２０９号明細書）、比較的良好な抗生物質持続効果および抗生物質のｓｕｂ ＭＩＣ効果を有する。これは同類薬と完全な交叉耐性を有さない。薬物動態学の研究により、カリマイシンは比較的高い親油性を有し、胞内抗菌活性が高く、経口吸収が速く、絶対的バイオアベイラビリティが高く、組織浸透性が高く、その組織濃度は血漿濃度より高く、組織分布が広く、消失半減期が長く、体内保持時間が長いことが明らかにされている（孫麗文ら、中国薬理学通報、２０００、１６（６）：６９４〜８；鍾大放ら、Ｊ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ．、２００３、７９１：４５；史向国ら、Ａｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ、２００３、３（２）：１３４；史向国ら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｅｔｔｅｒ、２００４、１５：４３１；史向国ら、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ、２００４、２５；１３９６）。薬理、毒性およびすでに完了した臨床三相の研究結果により、カリマイシンを呼吸器感染の治療に用いると、その治療効果は確かであり、副作用率は低く、特に肝損傷が少なく、安全性が良好であることが明らかにされている（林赴田ら、第八次全国抗生素学術会議論文彙編、１９９７、ｐ．１６７；趙春燕ら、中国抗生素雑誌、１９９８、２３（４）：３０６；孫涛ら、中国抗生素雑誌、２００１、２６（１）：４９〜５１）。カリマイシンは遺伝子組み換え技術を利用して得られる遺伝子工学菌を発酵させた直接産生物であり、調製工程は簡便で、化学的汚染を効果的に防止し、エネルギーを節約することができる。その経口剤は服用しやすく、毎日１回服用すればよく、患者の服薬コンプライアンスを高めるのに有利であり、基本医保薬物への登録にも都合が良い。

カリマイシンは遺伝子組み換え技術を利用し、カルボマイシン産生菌の４’’−イソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子をスピラマイシン産生菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ Ｆ２１）にクローニングして発現させ、遺伝子工学菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ＷＳＪ−１）の発酵産生物を得る。前記スピラマイシン産生菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ Ｆ２１）は、本研究室が１９８２年に中国の甘粛永昌県の土壌から分離したものであり、該菌の形態、培養的特徴、生理、生化学的特徴、細胞壁の化学組成、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列、および５つのハウスキーピング遺伝子のタンパク質レベルの系統樹解析における地位は、国外で報告されているスピラマイシン産生菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２３８７７およびすでに報告されているストレプトマイセスと共通する部分は無く、したがってストレプトマイセスの新種である可能性が高い（戴剣漉ら、微生物学通報、２０１２、３９（４）：５０３〜５１４）。

スピラマイシン産生菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２３８７７における、スピラマイシンの生合成に関係する遺伝子クラスタのシークエンシングはすでに完了しており（Ｋａｒｒａｙ Ｆ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、１５３：４１１１〜４１２２）、その他、アベルメクチン、コンカナマイシン、エリスロマイシン、カルコマイシン、タイロシンおよびミデカマイシンなどのマクロライド系抗生物質の生合成遺伝子クラスタの配列もすでに報告されている（Ｉｋｅｄａ Ｈ．ｅｔ ａｌ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００３、２１（５）：５２６〜５３１、Ｈａｙｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００５、１５１、３１６１〜３１６９；Ｏｌｉｙｎｙｋ Ｍ．ｅｔ ａｌ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００７、２５（４）：４４７〜４５３；Ｗａｒｄｓ Ｌ．ｅｔ ａｌ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ＆Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、２００４、４８（１２）：４７０３〜４７１２；Ｃｕｎｄｉｆｆｅ Ｅ．ｅｔ ａｌ、Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、２００１、７９（３〜４）：２２９〜２３４；Ｍｉｄｏｈ Ｎａｏｋｉ ｅｔ ａｌ、米国特許第７０７０９８０号明細書）。マクロライド系抗生物質の生合成遺伝子クラスタの全長は約５０〜８０ｋｂであり、その共通の特徴は、１６員環のマクロライド環の生合成モジュール構造をコードするポリケチドシンテターゼ（ＰＫＳ）、ポリケチド合成の伸長ユニットに関係する酵素、ラクトン環の様々な基の修飾を担う酵素、グリコシル基の合成および転移に関係する酵素の遺伝子と、抵抗性および調節機能に関係する遺伝子などとからなることである。マクロライドは、モジュール構造の形式のＰＫＳにより触媒され、脂肪酸の生合成に類似の方式で、連続縮合反応により、いくつかの簡単なカルボン酸分子を触媒して形成される。各モジュールはポリケチド鎖の形成過程で１段階の縮合反応のみを担い、各モジュールは１つのβ−ケトアシルシンテターゼ（ＫＳ）ドメイン、１つのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインおよび１つのアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメインを少なくとも含む。この他、各モジュールは１つのβ−ケトアシルレダクターゼ（ＫＲ）ドメイン、１つのデヒドラターゼ（ＤＨ）ドメインおよび１つのエノイルレダクターゼ（ＥＲ）ドメインを含む可能性もあり、それらは伸長ユニットを加える還元工程を決定している。さらに、チオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインの作用も必要とし、これによりポリケチド鎖の環化および放出を触媒する。最後に、さらにヒドロキシ化、メチル化、メトキシ化およびアシル化などの修飾工程を必要とし、様々なマクロライド系抗生物質の構造を形成する。通常のマクロライドは、いずれも異なる数量のグリコシル基（またはグルコサミン基）とつながり、例えばカリマイシンは３つのグリコシル基を含み、それぞれホロサミン、ミカミノースおよびミカロースである。これらは、グリコシル基の合成および転移に関係する酵素が担う。抵抗性遺伝子は、産生菌にそれ自体が抗生物質を産生する抵抗の能力を付与し、通常、ＡＢＣ輸送タンパクと関係する。調節機能に関係する遺伝子は、産生菌の抗生物質生合成の調節に関与する。

遺伝子クラスタの配列情報および構造の分析により、その産生菌に対してさらに遺伝子操作を行い、新規の、より効果的な抗生物質を得ることができる。例えば遺伝子操作により、ＰＫＳの合成モジュール構造を変更する、ラクトン環化後の修飾の変更、グリコシル基の置換または修飾を行うことにより、新しいマクロライド系抗生物質を作製する。抵抗性遺伝子または調節遺伝子の遺伝子操作により、抗生物質の産生量を高めることもできる（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ Ｂ． ｅｔ ａｌ、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、２０００、７（２）：１１１〜１１７；Ｋａｌｚ Ｌ．ｅｔ ａｌ、Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｒｅｖ、１９９９、１９（６）：５４３〜５８；Ｇｏｏｄｍａｎ ＣＤ ｅｔ ａｌ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１３、５７（２）：９０７〜９１３；Ｗａｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２０１４、１１１（１５）；５６８８〜９３；Ｓｔｒａｔｉｇｏｐｏｕｌｏｓ Ｇ ｅｔ ａｌ、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００４、５４（５）：１３２６〜３４；Ｎｏｖａｋｏｖａ Ｒ ｅｔ ａｌ、Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１１、５６（３）：２７６〜８２）。

中国特許登録番号第９７１０４４４０６号明細書 中国特許登録番号第０２１４８７７１５号明細書 中国特許番号第２００３１０１２２４２０９号明細書 米国特許第７０７０９８０号明細書

余蘭香ら、四川生理科学雑誌、１９９８年、２０（３） 孫麗文ら、中国薬理学通報、２０００、１６（６）：６９４〜８ 鍾大放ら、Ｊ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ．、２００３、７９１：４５ 史向国ら、Ａｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ、２００３、３（２）：１３４ 史向国ら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｅｔｔｅｒ、２００４、１５：４３１ 史向国ら、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ、２００４、２５；１３９６ 林赴田ら、第八次全国抗生素学術会議論文彙編、１９９７、ｐ．１６７ 趙春燕ら、中国抗生素雑誌、１９９８、２３（４）：３０６ 孫涛ら、中国抗生素雑誌、２００１、２６（１）：４９〜５１ 戴剣漉ら、微生物学通報、２０１２、３９（４）：５０３〜５１４ Ｋａｒｒａｙ Ｆ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、１５３：４１１１〜４１２２ Ｉｋｅｄａ Ｈ．ｅｔ ａｌ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００３、２１（５）：５２６〜５３１ Ｈａｙｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００５、１５１、３１６１〜３１６９ Ｏｌｉｙｎｙｋ Ｍ．ｅｔ ａｌ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００７、２５（４）：４４７〜４５３ Ｗａｒｄｓ Ｌ．ｅｔ ａｌ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ＆Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、２００４、４８（１２）：４７０３〜４７１２ Ｃｕｎｄｉｆｆｅ Ｅ．ｅｔ ａｌ、Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、２００１、７９（３〜４）：２２９〜２３４ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ Ｂ． ｅｔ ａｌ、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、２０００、７（２）：１１１〜１１７ Ｋａｌｚ Ｌ．ｅｔ ａｌ、Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｒｅｖ、１９９９、１９（６）：５４３〜５８ Ｇｏｏｄｍａｎ ＣＤ ｅｔ ａｌ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１３、５７（２）：９０７〜９１３ Ｗａｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２０１４、１１１（１５）；５６８８〜９３ Ｓｔｒａｔｉｇｏｐｏｕｌｏｓ Ｇ ｅｔ ａｌ、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００４、５４（５）：１３２６〜３４ Ｎｏｖａｋｏｖａ Ｒ ｅｔ ａｌ、Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１１、５６（３）：２７６〜８２

本発明は、カリマイシン生合成連鎖遺伝子クラスタを提供している。全部で４４個の遺伝子オープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）を有し、ヌクレオチド配列の全長は８９３１５ｂｐ（Ｓｅｑ．１）である。このうちポリケチドシンテターゼをコードする５つのｏｒｆ（ｏｒｆ１０〜１４）を含有し、これは８個のモジュール、３７個のドメインを含む。さらにポリケチド合成の伸長ユニットおよび修飾に関係するｏｒｆを９個（１、４〜６、１５、３６〜３９）有し、グリコシル基の合成に関係するｏｒｆを１６個（９、１６〜２２、２４、２６、２８、２９、３３〜３５、４１）有し、グリコシル基の転移に関係するｏｒｆを６個（７、８、３０〜３２、４０）有する。この他、抵抗性に関係するｏｒｆを２個（３および２５）有し、調節と関係する可能性があるｏｒｆを４個（２、２３、２７、４２）有する。これらのヌクレオチド配列は、それぞれＳｅｑ．１のｏｒｆ１（１−６４５）、ｏｒｆ２（１８１０−１２０８）、ｏｒｆ３（３１３３−２２８５）、ｏｒｆ４（３６１４−４８４０）、ｏｒｆ５（４８４６−５５１１）、ｏｒｆ６（７１５０−５８０１）、ｏｒｆ７（８４４４−７１７９）、ｏｒｆ８（９７２９−８４８２）、ｏｒｆ９（１０５４３−９８３０）、ｏｒｆ１０（１６２１５−１０５４３）、ｏｒｆ１１（２１０７６−１６３２８）、ｏｒｆ１２（３２５１１−２１１２４）、ｏｒｆ１３（３８５９９−３２５８５）、ｏｒｆ１４（５２２５９−３８６４３）、ｏｒｆ１５（５３０９９−５４３１０）、ｏｒｆ１６（５４４９５−５４８４５）、ｏｒｆ１７（５４８４２−５６０４１）、ｏｒｆ１８（５６０３８−５６９４６）、ｏｒｆ１９（５６９３０−５７９６７）、ｏｒｆ２０（５７９３７−６０１７４）、ｏｒｆ２１（６０８３６−６１９８４）、ｏｒｆ２２（６２７９６−６２０７７）、ｏｒｆ２３（６３６３３−６５６４５）、ｏｒｆ２４（６７３７９−６６３１８）、ｏｒｆ２５（６９００４−６７３５２）、ｏｒｆ２６（６９３４９−７０６５０）、ｏｒｆ２７（７２１５６−７０７０８）、ｏｒｆ２８（７２４２２−７３４６２）、ｏｒｆ２９（７４６０１−７３５６１）、ｏｒｆ３０（７４９１３−７６１６０）、ｏｒｆ３１（７６２１８−７７４８６）、ｏｒｆ３２（７７６０６−７８７８１）、ｏｒｆ３３（７８７８３−７９７７５）、ｏｒｆ３４（７９７７２−８０７７９）、ｏｒｆ３５（８２０５５−８０８２３）、ｏｒｆ３６（８３１６４−８２０５２）、ｏｒｆ３７（８４４００−８３２７９）、ｏｒｆ３８（８４７１３−８４３９３）、ｏｒｆ３９（８５５７６−８４７１０）、ｏｒｆ４０（８５８２５−８７０４２）、ｏｒｆ４１（８７０９４−８７７０２）、ｏｒｆ４２（８９３１５−８８１４３）である。この他、Ｓｅｑ．１と連鎖しない外来遺伝子Ｓｅｑ．２（全長２３３７ｂｐ）におけるｏｒｆ４３（８６６−６０）およびｏｒｆ４４（２３３７−１１７４）をさらに含有する。

本発明は、Ｓｅｑ．３配列の２１４個のアミノ酸からなる、４’ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴ）のアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ１と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の１−６４５塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．４配列の２００個のアミノ酸からなる、ＴｅｔＲファミリー転写調節因子のアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ２と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の１８１０−１２０８塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．５配列の２８２個のアミノ酸からなる、２３Ｓ ｒＲＮＡメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ３と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の３１３３−２２８５塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．６配列の４０８個のアミノ酸からなる、３−Ｏ−アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ４と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の３６１４−４８４０塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．７配列の２２１個のアミノ酸からなる、Ｏ−メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ５と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の４８４６−５５１１塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．８配列の４４９個のアミノ酸からなる、クロトニルＣｏＡレダクターゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ６と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の７１５０−５８０１塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．９配列の４２１個のアミノ酸からなる、グリコシドトランスフェラーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ７と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の８４４４−７１７９塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．１０配列の４１５個のアミノ酸からなる、グリコシドトランスフェラーゼの補助タンパク質のアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ８と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の９７２９−８４８２塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．１１配列の２３７個のアミノ酸からなる、ＮＤＰ−ヘキソサミンＮ−ジメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ９と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の１０５４３−９８３０塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．１２配列の１８９０個のアミノ酸からなり、ケトシンテターゼ（ＫＳ）_８−アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）_８−ケトレダクターゼ（ＫＲ）_８−アシルキャリアタンパク質ドメイン（ＡＣＰ）_８−鎖放出チオエステラーゼ（ＴＥ）を含むポリケチドシンテターゼドメインのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ１０と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の１６２１５−１０５４３塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．１３配列の１５８２個のアミノ酸からなり、ＫＳ_７−ＡＴ_７−ＫＲ_７−ＡＣＰ_７を含むポリケチドシンテターゼドメインのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ１１と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の２１０７６−１６３２８塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．１４配列の３７９５個のアミノ酸からなり、ＫＳ_５−ＡＴ_５−ＫＲ_５−ＡＣＰ_５−ＫＳ_６−ＡＴ_６−ＤＨ_６（デヒドラターゼ）−ＥＲ_６（エノイルレダクターゼ）−ＫＲ_６−ＡＣＰ_６を含むポリケチドシンテターゼドメインのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ１２と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の３２５１１−２１１２４塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．１５配列の２００４個のアミノ酸からなり、ＫＳ_４−ＡＴ_４−ＤＨ_４−ＫＲ_４−ＡＣＰ_４を含むポリケチドシンテターゼドメインのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ１３と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の３８５９９−３２５８５塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．１６配列の４５３８個のアミノ酸からなり、ＫＳ_１−ＡＴ_１−ＡＣＰ_１−ＫＳ_２−ＡＴ_２−ＫＲ_２−ＡＣＰ_２−ＫＳ_３−ＡＴ_３−ＤＨ_３−ＫＲ_３−ＡＣＰ_３を含むポリケチドシンテターゼドメインのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ１４と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の５２２５９−３８６４３塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．１７配列の４０３個のアミノ酸からなる、シトクロムＰ−４５０オキシダーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ１５と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の５３０９９−５４３１０塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．１８配列の１１６個のアミノ酸からなる、ＮＤＰ−ヘキソースイソメラーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ１６と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の５４４９５−５４８４５塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．１９の３９９個のアミノ酸からなる、ＮＤＰ−ヘキソースアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ１７と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の５４８４２−５６０４１塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．２０配列の３０２個のアミノ酸からなる、ＮＤＰ−グルコースシンテターゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ１８と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の５６０３８−５６９４６塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．２１配列の３４５個のアミノ酸からなる、ＮＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ１９と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の５６９３０−５７９６７塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．２２配列の７４５個のアミノ酸からなる、ＮＤＰ−ヘキソース２，３デヒドラターゼ／チオエステラーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ２０と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の５７９３７−６０１７４塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．２３配列の３８２個のアミノ酸からなる、ＮＤＰ−ヘキソースアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ２１と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の６０８３６−６１９８４塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．２４配列の２３９個のアミノ酸配列からなる、ＮＤＰ−ヘキソサミンＮジメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を提供し、ＩＡ−Ｗ２２と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の６２７９６−６２０７７塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．２５配列の６７０個のアミノ酸からなる、転写調節因子のアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ２３と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の６３６３３−６５６４５塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．２６配列の３５４個のアミノ酸からなる、ＮＤＰ−ヘキソサミンイソメラーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ２４と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の６７３７９−６６３１８塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．２７配列の５５０個のアミノ酸からなる、ＡＢＣ輸送タンパクのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ２５と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の６９００４−６７３５２塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．２８配列の４３３個のアミノ酸からなる、ＮＤＰ−ヘキソースデヒドラターゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ２６と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の６９３４９−７０６５０塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．２９配列の４８２個のアミノ酸からなる、ＧＴＰアーゼに類似したアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ２７と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の７２１５６−７０７０８塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．３０配列の３４６個のアミノ酸からなる、ＮＤＰ−糖イソメラーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ２８と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の７２４２２−７３４６２塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．３１配列の３４６個のアミノ酸からなる、ＮＤＰ−ヘキソースケトレダクターゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ２９と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の７４６０１−７３５６１塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．３２配列の４１５個のアミノ酸からなる、グリコシルトランスフェラーゼの補助タンパク質のアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ３０と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の７４９１３−７６１６０塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．３３配列の４２２個のアミノ酸からなる、グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ３１と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の７６２１８−７７４８６塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．３４配列の３９１個のアミノ酸からなる、グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ３２と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の７７６０６−７８７８１塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．３５配列の３３０個のアミノ酸からなる、ＮＤＰ−ヘキソースケトレダクターゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ３３と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の７８７８３−７９７７５塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．３６配列の３３５個のアミノ酸からなる、ＮＤＰ−ヘキソースレダクターゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ３４と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の７９７７２−８０７７９塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．３７配列の４１０個のアミノ酸からなる、ＮＤＰ−ヘキソースメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ３５と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の８２０５５−８０８２３塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．３８配列の３７０個のアミノ酸からなる、メトキシマロニルシンテターゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ３６と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の８３１６４−８２０５２塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．３９配列の３７３個のアミノ酸からなる、デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ３７と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の８４４００−８３２７９塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．４０配列の１０６個のアミノ酸からなる、アシルキャリアタンパク質のアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ３８と命名する。コード遺伝子のヌクレオチドは、Ｓｅｑ．１の８４７１３−８４３９３塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．４１配列の２８８個のアミノ酸からなる、メトキシマロニルデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ３９と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の８５５７６−８４７１０塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．４２配列の４０５個のアミノ酸からなる、グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ４０と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の８５８２５−８７０４２塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．４３配列の２０２個のアミノ酸からなる、ＮＤＰ−ヘキソースイソメラーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ４１と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の８７０９４−８７７０２塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．４４配列の３９０個のアミノ酸からなる、転写調節因子タンパク質のアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ４２と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．１の８９３１５−８８１４３塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．４５配列の２６９個のアミノ酸からなり、外部から挿入する２３Ｓ ｒＲＮＡメチラーゼ（チオストレプトンｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ、ｔｓｒ抵抗性マーカーに関係する）のアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ４３と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．２の８６６−５７塩基である。

本発明は、Ｓｅｑ．４６配列の３８８個のアミノ酸からなり、外部から挿入する４’’ミカロシルイソバレリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をさらに提供し、ＩＡ−Ｗ４４と命名する。コード遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．２の２３３７−１１７１塩基である。

カリマイシン生合成遺伝子クラスタ情報の取得と、遺伝子破壊および相同性比較により、各遺伝子がコードするタンパク質の可能性のある機能を分析することとを基に、本発明のカリマイシン生合成遺伝子クラスタの全４４個の遺伝子をさらに説明する。その遺伝子クラスタの構造は図１に示す通りであり、具体的に、
（１）ポリケチドシンテターゼ遺伝子はｏｒｆ１０〜１４であり、全部で５個の遺伝子である。
（２）ポリケチド合成の伸長ユニットおよび修飾に関係する遺伝子はｏｒｆ１、ｏｒｆ４〜６、１５、３６〜３９であり、全部で９個の遺伝子である。
（３）グリコシル基の合成に関係する遺伝子はｏｒｆ９、１６〜２２、２４、２６、２８、２９、３３〜３５、４１であり、全部で１６個の遺伝子である。
（４）グリコシル基の転移に関係する遺伝子はｏｒｆ７、８、３０〜３２、４０であり、全部で６個の遺伝子である。
（５）抵抗性に関係する遺伝子はｏｒｆ３および２５であり、全部で２個の遺伝子である。
（６）生合成の調節に関係する遺伝子はｏｒｆ２、２３、２７、４２であり、全部で４個の遺伝子である。
（７）外部から導入するのは、遺伝子工学菌のマーカー遺伝子ｏｒｆ４３（チオストレプトン−ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ、ｔｓｒ抵抗性遺伝子）と、これと連鎖するミカロース４’’−Ｏ−イソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子ｏｒｆ４４とであり、全部で２個の遺伝子である。

Ｓｅｑ．１に５個のポリケチドシンテターゼ遺伝子（ｏｒｆ１０〜１４）を有し、ヌクレオチドの相補配列およびそのアミノ酸配列は、カリマイシンのラクトン環の合成に必須である。このうち、８個のモジュール、３７個のドメインを含み、図２に示す通りである。Ｏｒｆ１４は３つのモジュールを含み、ローディングドメイン１とモジュール２および３とである。ローディングモジュール部において、ＫＳ_１、ＡＴ_１およびＡＣＰ_１はラクトン環の合成開始を担い、１つの酢酸を開始ユニットとして触媒する。モジュール２は、ＫＳ_２、ＡＴ_２、ＫＲ_２およびＡＣＰ_２ドメインを含有し、モジュール３はＫＳ_３、ＡＴ_３、ＤＨ_３、ＫＲ_３およびＡＣＰ_３ドメインを含有し、別の２つの酢酸伸長ユニットの取込を担い、最終的にカリマイシンＣ１１〜１５の炭素鎖骨格を形成する。Ｏｒｆ１３はモジュール４を含み、ＫＳ_４、ＡＴ_４、ＤＨ_４、ＫＲ_４、ＡＣＰ_４を含有し、３つ目の酢酸ユニットの伸長を担い、最終的にカリマイシンＣ９〜１０の炭素鎖骨格を形成する。Ｏｒｆ１２はモジュール５および６を含み、モジュール５はＫＳ_５−ＡＴ_５−ＫＲ_５−ＡＣＰ_５ドメインを含有し、プロピオン酸伸長ユニットの取込を担い；モジュール６はＫＳ_６−ＡＴ_６−ＤＨ_６−ＫＲ_６−ＥＲ_６−ＫＲ_６−ＡＣＰ_６ドメインを含有し、ブタン酸伸長ユニットの取込を担い、最終的にカリマイシンＣ５〜Ｃ８炭素鎖骨格を形成する。Ｏｒｆ１１はモジュール７を含み、ＫＳ_７−ＡＴ_７−ＫＲ_７−ＡＣＰ_７ドメインを含有し、グリコール酸伸長ユニットの取込を担い、最終的にカリマイシンＣ３〜Ｃ４炭素鎖骨格を形成する。Ｏｒｆ１０はモジュール８を含み、ＫＳ_８−ＡＴ_８−ＫＲ_８−ＡＣＰ_８−ＴＥドメインを含有し、１つの酢酸伸長ユニットの取込を担い、さらにチオエステラーゼ（ＴＥ）の関与下で炭素鎖の環化および放出を行う。カリマイシンのポリケチドシンテターゼ遺伝子構造の概要図を図２に示す。ポリケチドシンテターゼ遺伝子の各ドメインおよびそのアミノ酸の位置は、表１に示す通りである。

カリマイシンのポリケチド合成の伸長ユニットおよび修飾に関係する遺伝子ｏｒｆ１、ｏｒｆ４〜６、１５、３６〜３９のヌクレオチド配列または相補配列およびその相応するアミノ酸配列のうち、ＩＡ−Ｗ１は、ポリケチド合成のアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）を修飾し、活性を有するタンパク質にするＰＰＴをコードする。ＩＡ−Ｗ４は、カリマイシンにおける３位のヒドロキシ基のアシル化を担う３−Ｏ−アシルトランスフェラーゼをコードする。ＩＡ−Ｗ５およびＩＡ−Ｗ６は、それぞれポリケチドの伸長ユニットの供給を担うＯ−メチラーゼおよびクロトニルＣｏＡレダクターゼをコードする。ＩＡ−Ｗ１５は、ポリケチドの炭素鎖の酸化を担うＰ４５０シトクロムモノオキシダーゼをコードする。ＩＡ−Ｗ３６〜３９は、それぞれメトキシマロニルシンテターゼ、デヒドロゲナーゼ、アシルキャリアタンパク質およびメトキシマロニルデヒドロゲナーゼをコードし、これらはいずれもポリケチドの伸長ユニットの合成および修飾に関与する。

表１ ポリケチドシンテターゼ遺伝子の各ドメインおよびそのアミノ酸の位置
表１．１ ポリケチドシンテターゼ遺伝子ＩＡ−Ｗ１４の各ドメインおよびそのアミノ酸の位置

表１．２ ポリケチドシンテターゼ遺伝子ＩＡ−Ｗ１３の各ドメインおよびそのアミノ酸の位置

表１．３ ポリケチドシンテターゼ遺伝子ＩＡ−Ｗ１２の各ドメインおよびそのアミノ酸の位置

表１．４ ポリケチドシンテターゼ遺伝子ＩＡ−Ｗ１１の各ドメインおよびそのアミノ酸の位置

表１．５ ポリケチドシンテターゼ遺伝子ＩＡ−Ｗ１０の各ドメインおよびそのアミノ酸の位置

カリマイシンのグリコシル基の合成に関係する遺伝子は、ｏｒｆ９、１６〜２２、２４、２６、２８、２９、３３〜３５および４１で、全部で１２個の遺伝子であり、このうち、ｏｒｆ１８、１９および２８は、カリマイシンの主要なグリコシルユニットの合成、脱水および異性化に関与する酵素をコードする。ｏｒｆ９、２０、２１、２４、２６および２９は、ホロサミンの合成におけるＮＤＰ−ヘキソサミンのＮ−ジメチル化、２，３脱水、アミノ化、異性化、脱水およびケト還元に関与する酵素をコードする。ｏｒｆ１６、１７、２２は、ミカミノースＮＤＰ−ヘキソサミンの異性化、アミノ化およびＮ−ジメチル化に関与する酵素をコードする。ｏｒｆ３３、３４、３５および４１は、ミカロースＮＤＰ−ヘキソサミンのケト還元、メチル化および異性化酵素をコードする。

カリマイシンのグリコシル基の転移に関係する遺伝子は、ｏｒｆ７、８、３０〜３２、４０で、全部で６個の遺伝子であり、このうち、ｏｒｆ７は、ミカミノースグリコシラーゼをコードする。ｏｒｆ８は、そのグリコシル化の補助タンパク質をコードする。ｏｒｆ３１および３２は、ホロサミングリコシラーゼをコードする。ｏｒｆ３０は、そのグリコシル化の補助タンパク質をコードする。ｏｒｆ４０は、ミカロースグリコシラーゼをコードする。

カリマイシンの抵抗性に関係する遺伝子は、ｏｒｆ３および２５で、全部で２個の遺伝子であり、このうち、ｏｒｆ３は２３Ｓ ｒＲＮＡメチラーゼをコードし、ｏｒｆ２５はＡＢＣ輸送タンパクをコードする。これらは、リボソームＲＮＡのメチル化およびポンプ機構により、カリマイシン産生菌に、それ自体に抗生物質を産生する抵抗性を付与する。

カリマイシンの生合成の調節に関係する遺伝子は、ｏｒｆ２、２３、２７、４２で、全部で４個の遺伝子であり、このうち、ｏｒｆ２は、ＴｅｔＲファミリー転写調節抑制因子をコードし、カリマイシン生合成の負の調節に関与する可能性がある。ｏｒｆ２３、４２は、それぞれ２つの正の転写調節因子をコードし、後者は経路特異的正の調節因子であり、カリマイシンの生合成に対して直接調節を行う。ｏｒｆ２７はＧＴＰアーゼをコードし、細胞の機能を調節することにより、カリマイシンの生合成を調節する可能性がある。

カリマイシンの生合成に関係して、外部からｏｒｆ４３およびｏｒｆ４４を導入する。このうちｏｒｆ４３は、チオストレプトン抵抗性と関係する２３Ｓ ｒＲＮＡメチラーゼ遺伝子をコードする。該遺伝子は、ミカロース４’’−Ｏ−ヒドロキシイソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子ｏｒｆ４４と連鎖し、その抵抗性の発現により、カリマイシン遺伝子工学菌に識別マーカーを提供することができる。

本発明のＳｅｑ．１、２の相補配列は、ＤＮＡ塩基の相補性の原則に基づき、いつでも得ることができる。Ｓｅｑ．１、２のヌクレオチド配列または一部のヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、または適した制限酵素で相応するＤＮＡを切断して、またはその他の適した技術を使用して得ることができる。本発明が提供するヌクレオチド配列または一部のヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の方法、または本発明の配列を含むＤＮＡをプローブとしてＳｏｕｔｈｅｒｎハイブリダイゼーションを行う方法を利用し、その他の生物体からカリマイシンの生合成遺伝子に似た遺伝子を得ることができる。

本発明は、Ｓｅｑ．１、２中の一部のＤＮＡ配列を少なくとも取得し、組換ＤＮＡベクターを構築する手段をさらに提供している。

本発明は、カリマイシン生合成遺伝子を破壊する手段をさらに提供している。少なくてもそのうちの１つの遺伝子は、Ｓｅｑ．１中のヌクレオチド配列を含む。

本発明が提供するヌクレオチド配列もしくは少なくとも一部の配列のクローン化遺伝子またはＤＮＡ断片から、カリマイシンの生合成における１つまたは複数の工程を破壊することにより、新しいカリマイシン誘導体を得ることができる。ＤＮＡ断片または遺伝子を含むことにより、カリマイシンまたはその誘導体の産生量を高めることができる。

本発明が提供するヌクレオチド配列または少なくとも一部の配列のクローン化ＤＮＡにより、ゲノムライブラリーからより多くのライブラリープラスミドをマッピングすることができる。これらのライブラリープラスミドは、本発明の一部の配列を少なくとも含み、カリマイシン産生菌ゲノムにおける、これの隣接領域のＤＮＡも含む。

本発明が提供するヌクレオチド配列を、修飾または突然変異させることができる。その手段は挿入または置換、ポリメラーゼ連鎖反応、エラー導入ポリメラーゼ連鎖反応、部位特異的突然変異、異なる配列を新たに接続する、または紫外線もしくは化学試薬による突然変異を含む。

本発明が提供するヌクレオチド配列は、配列の異なる部分またはその他由来の相同配列により、ＤＮＡシャッフリング（ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）を行うことができる。

本発明のヌクレオチド配列もしくは少なくとも一部の配列の断片またはドメインまたはモジュールまたは遺伝子により、ポリケチドシンテターゼライブラリーまたはポリケチドシンテターゼ派生ライブラリーまたは組み合わせライブラリーを構築することができる。同じもしくは異なるポリケチドシンテターゼ系の１つまたは複数のポリケチドシンテターゼドメイン、モジュールもしくは遺伝子を欠損または不活化する、あるいは１つまたは複数のポリケチドシンテターゼドメイン、モジュールもしくは遺伝子を増加させることにより、新しいポリケチド化合物を産生する。

本発明は、本発明の生合成修飾遺伝子、グリコシルシンテターゼおよびグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に対して、これらのグリコシル基の合成、転移および修飾遺伝子を欠損、置換または再構築することにより、カリマイシン誘導体を得る手段を提供している。

本発明が提供するヌクレオチド配列もしくは少なくとも一部の配列の断片またはドメインまたはモジュールまたは遺伝子は、量を倍増させることにより、カリマイシンまたはその誘導体の産生量を高めることができる。

本発明のヌクレオチド配列または少なくとも一部の配列のクローン化遺伝子は、適した発現システムにより、外来宿主で発現させて、修飾された、またはより高い生物活性の、またはより高い産生量のカリマイシンを得ることができる。これらの外来宿主は、ストレプトマイセス、大腸菌、バシラス、酵母、植物および動物などを含む。

本発明のヌクレオチド配列もしくは少なくとも一部の配列の遺伝子または遺伝子クラスタは、異種宿主で発現させ、さらにＤＮＡチップ技術により、宿主の代謝鎖におけるそれらの機能を理解することができる。

本発明のアミノ酸配列または少なくとも一部の配列のポリペプチドは、ある１つもしくはいくつかのアミノ酸を除去または置換した後も生物活性を有し、さらには新しい生物活性、あるいは産生量を高める性質、またはタンパクの動力学的特徴を最適化する性質、またはその他得難い性質を有する可能性がある。適した技術的欠失により、本発明中のアミノ酸配列を接続し、新しいタンパク質または酵素を得ることができ、さらには新しいまたは関連する産生物を産生する。

本発明が提供するアミノ酸配列により、必要なタンパク質を分離して抗体調製することができる。

本発明に記載のアミノ酸配列は、ポリケチドシンテターゼの３次元構造を予測する可能性を提供している。

本発明が提供する遺伝子およびそのタンパク質、抗体は、スクリーニングに用いて、医薬、工業、農業に用いられる化合物またはタンパク質に発展させることもできる。

図１は、カリマイシン生合成遺伝子クラスタの構造である。 図２は、カリマイシンにおけるポリケチドシンテターゼの遺伝子構造である。 図３は、ＩＡ−Ｗ４である３−Ｏ−アシルトランスフェラーゼの遺伝子破壊による組換プラスミドの構築およびダブルクロスオーバーの概要図である。 図４は、ＩＡ−Ｗ４２の転写調節などの遺伝子の破壊により組換プラスミドを構築する概要図である。 図５Ａは、ＩＡ−Ｗ４である３−Ｏ−アシルトランスフェラーゼの遺伝子破壊に対するＰＣＲによる検証である。 図中、１−野生株；２、３、４−遺伝子破壊株；５−ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒＩＩＩ 図５Ｂは、その他の遺伝子破壊に対するＰＣＲによる検証である。 図中、ＩＩＩ−ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒＩＩＩ；Ｃ−野生株；Ｍ−遺伝子破壊株 図６は、ＩＡ−Ｗ４である３−Ｏ−アシルトランスフェラーゼの遺伝子破壊株の発酵産生物に対するＨＰＬＣ分析である。 図中、ａ−カリマイシン標準品 ｂ−遺伝子破壊株の発酵抽出物 Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ−それぞれカリマイシンの主成分であるイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩの３成分の吸収ピーク

本発明は、遺伝子破壊の実験により変異株を得、さらに遺伝子破壊により、変異株が産生するカリマイシンの成分が変化する、またはカリマイシンを産生しなくなることを実験により証明し、これにより得られた遺伝子クラスタ情報がカリマイシンの生合成と関係することを示す。本発明の外部から導入するチオストレプトンの抵抗性マーカー遺伝子（ｏｒｆ４３）と、これと連鎖するミカロース４’’Ｏ−ヒドロキシイソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子（ｏｒｆ４４）とは、遺伝子の相同組換により、染色体に組み込んだものであり、本研究室は、これらがカリマイシンの生合成に必須であることを研究によりすでに証明している（生物工程学報、１９９９年、１５巻２期１７１〜１７６）。

以下に提供する実施例は、当業者が本発明をより理解できるようにするためのものに過ぎず、いかなる方式でも本発明を制限しない。

《実施例１》カリマイシン産生菌（Ｓ．ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）から総ＤＮＡを抽出する
Ｒ_２ＹＥ培地の処方（ｇ／１００ｍｌ）
スクロース １０．３ グルコース １．０
酵母抽出液 ０．４ トリプトン ０．２
ペプトン ０．４ カゼイン加水分解液 ０．１
Ｋ_２ＳＯ_４ ０．０２５ ＣａＣｌ_２ ０．２１６
ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．００５ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ １．０１２
ＮａＯＨ（１Ｍ） ０．５ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（０．２５ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．２） １０ｍｌ
微量元素溶液０．２ｍｌを添加し、蒸留水で１００ｍｌに定容する（ｐＨ６．５）。
微量元素溶液（ｇ／１００ｍｌ）
ＺｎＣｌ_２ ０．００４ ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ ０．０２
ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．００１ ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ ０．００１
Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７・１０Ｈ_２Ｏ ０．００１ （ＮＨ_４）_６Ｍｏ_７Ｏ_２・４Ｈ_２Ｏ ０．００１
１５ポンドで１２１℃、２０ｍｉｎ滅菌する。

Ｓ．ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ菌を２５ｍｌのＲ_２ＹＥ培地に接種し、２８℃で４８時間振とう培養する。１００ｍｌのＲ_２ＹＥ培地に継代培養し、２８℃で２４時間振とう培養する。５０００ｒｐｍ、１０〜１５ｍｉｎ遠心分離して、菌体（約１０ｇ）を採取し、主にＵＰＴＥＣＨＴＭｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ社の製品説明書に基づいて操作する。５０ｍｌの２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を添加して振とう洗浄し、遠心分離して上清を捨てる；２５ｍｌのリゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ。１０ｍＭ、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で調製し、０．５ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅを添加する）で菌糸体を懸濁し、３７℃で約１〜２ｈ、細胞が半透明になるまでインキュベートする；２．５ｍｌのプロテアーゼＫ溶液を添加し、５５℃で３０ｍｉｎ置く；２０ｍｌの１０％ＳＤＳ溶液を添加し、７０℃で１０ｍｉｎ置く；同体積の無水エタノールを添加し、充分に振とうする；溶液をＤＮＡスピンカラムに移し、１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離する；５０ｍｌのプロテアーゼ含有溶液を添加してカラムを洗浄し、室温、１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離する；再び５０ｍｌの洗浄液でカラムを２回洗浄し、各回とも１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離する；５〜１０ｍｌのＴＥ溶出液を添加し、室温で２〜５ｍｉｎ放置し、１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離する；溶液を採取し、−２０℃で総ＤＮＡを保存する。

《実施例２》遺伝子破壊により、Ｓｅｑ．１遺伝子情報の機能を検証する
遺伝子クラスタの両端ＩＡ−Ｗ１およびＩＡ−Ｗ４２と、ＩＡ−Ｗ４、１７、２１、２３および２７などの遺伝子を選択して破壊し、変異株を得る。さらにこれらの破壊株により、カリマイシン産生能力が変化する、またはカリマイシンを産生しなくなることを実験により証明する。これにより、得られた遺伝子クラスタ情報は、カリマイシン産生に必須であることを示す。上記コード遺伝子およびその上流、下流のシークエンスに基づいてプライマーを設計し、適した制限酵素切断部位に挿入する。プライマー配列を表２に示す。

表２ 遺伝子破壊実験で設計、使用したプライマー配列

ＰＣＲ増幅により、それぞれ相応する相同遺伝子断片を得、相応する制限酵素切断部位を採用し、選択マーカーの抵抗性遺伝子（アプラマイシン−Ａｍ）を挿入して、温度感受性ベクターｐＫＣ１１３９（Ｂｉｅｒｍａｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ、Ｇｅｎｅ、１９９２；１１６（１）：４３〜９）または大腸菌／ストレプトマイセスベクターｐＧＨ１１２（優宝生物公司）に接続し、相同遺伝子を含む組換プラスミドを得る。プロトプラスト形質転換により、カリマイシン産生菌に導入し、培養後、モノコロニー分離を行い、相同断片のダブルクロスオーバー遺伝子破壊株を得る。ＩＡ−Ｗ４である３−Ｏ−アシルトランスフェラーゼの遺伝子破壊組換プラスミドの構築および相同遺伝子断片のダブルクロスオーバーの概要を図３に示す。ＩＡ−Ｗ４２の転写調節遺伝子などに対する破壊組換プラスミドの構築の概要を図４に示す。

相応するプライマーをそれぞれ採用し、破壊株および野生株の総ＤＮＡに対するＰＣＲ検証を行い、図５ＡおよびＢに示す。図５Ａの結果は、ＩＡ−Ｗ４遺伝子破壊株のコード遺伝子ｏｒｆ４から６１３ｂｐが欠損していることを示している。図５ＢにＰＣＲ検証結果を示しており、野生株と比較して、破壊株に関係するコード遺伝子は、選択マーカーである抵抗性遺伝子を挿入しているため、ＰＣＲ産物の長さが増加していることを示している。

発酵実験および産物に対するＨＰＬＣによる検証により、ＩＡ−Ｗ４破壊株が４’’−イソバレリルスピラマイシンＩＩＩおよびＩＩを産生せず、４’’−イソバレリルスピラマイシンＩを主成分とすることを証明している（図６）。本発明が提供するＳｅｑ．１遺伝子情報における、ＩＡ−Ｗ４である３−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ遺伝子がカリマイシンの生合成に関与し、該遺伝子の破壊により、変異株はカリマイシンにおけるラクトン環の３位のヒドロキシ基をアシル化する機能を喪失したことを証明する。

その他の遺伝子破壊株については、発酵実験と、産物の抗菌活性およびＨＰＬＣ測定により、破壊株が活性を有するカリマイシンを産生しなくなったことを証明する。本発明が提供するＳｅｑ．１遺伝子クラスタが、カリマイシンの生合成に関与すると説明できる。

《実施例３》カリマイシン産生菌の遺伝子導入および破壊株のスクリーニング
３．１ プロトプラストの調製：新鮮なカリマイシン産生菌の斜面培地の胞子を浸透フラスコのＲ_２ＹＥ液体培地に接種し、２８℃、２２０ｒｐｍで４８ｈ振とう培養する。培養液を１０％の量で、０．５％グリシンを追加した新鮮なＲ_２ＹＥ液体培地に継代培養し、２８℃で２０ｈ振とう培養する。１０ｍｌの菌液を遠心管に取り、３０００ｒｐｍで遠心分離して菌糸体を採取し、沈殿をＰ−ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄する。
Ｐ−ｂｕｆｆｅｒ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１ｍｏｌ／Ｌ ３．１ｍｌ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ３．６８
ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ２．０４ スクロース １０３
グルコース １．０ 微量元素溶液 ２．０ｍｌ
ｐＨ７．６ １５ポンドで１２１℃、３０ｍｉｎ滅菌する。
洗浄後、リゾチームを添加したＰ−ｂｕｆｆｅｒ溶液（終濃度は２ｍｇ／ｍｌ）を適量用いて懸濁し、均一に混合する。３７℃の水浴で３０〜４５ｍｉｎ保温し、１０〜１５ｍｉｎごとに１回振とうする。１０×４０の位相差顕微鏡でプロトプラストの形成状況を観察し、顕微鏡検査で大部分の菌糸がすでにプロトプラストを形成していることを示すとき、酵素分解を停止する。脱脂綿でろ過し、ろ液をＰ−ｂｕｆｆｅｒで２回遠心分離、洗浄する。最後に、１ｍｌのＰ−ｂｕｆｆｅｒでプロトプラストを懸濁し、ＥＰチューブに１００μｌ／チューブで分注し、−７０℃で保存する。

３．２ プラスミドＤＮＡをプロトプラストに形質転換する：１００μｌのプロトプラストに１０μｌのプラスミドＤＮＡ溶液を添加し、チューブの壁を軽くたたいて混合する。迅速に２５％ＰＥＧ−１０００（英国Ｋｏｃｈ−ｌｉｇｈｔ社製）含有Ｐ−ｂｕｆｆｅｒを４００μｌ添加し、ピペッティングで混合し、室温で５ｍｉｎ放置する。２００μｌを乾燥させたＲ_２ＹＥプレートに塗布し、２８℃で２０ｈ培養する。５０μｇ／ｍｌ ｔｓｒの滅菌水で覆い、２８℃で５〜７日培養し、形質転換体を選択する。

３．３ 遺伝子破壊株のスクリーニング
形質転換体を、Ｔｓｒを５０μｇ／ｍｌで添加した培地で選択する
大豆粉末 ２０ グルコース １０
デンプン ３０ ＣａＣＯ_３ ５．０
ＮａＣｌ ４．０ ａｇａｒ １８
脱イオン水で調製する（自然ｐＨ値）。１５ポンドで１２１℃、３０ｍｉｎ滅菌する。
２８℃で５〜７日培養し、薬品を添加していない培地で４〜５代継代し、単胞子を分離する。アプラマイシン（Ａｍ ５０μｇ／ｍｌ）を添加した培地で単胞子のスクリーニングをそれぞれ対応して行い、Ａｍで成長し、Ｔｓｒで成長しない遺伝子破壊株をスクリーニングする。抵抗性マーカーの発現が安定した破壊株を選択し、ゲノムＤＮＡを抽出し、実施例２の相応するプライマーを採用してＰＣＲ増幅させる。産物の大きさおよびＤＮＡシークエンシングに基づいて、遺伝子破壊の正確性を判断する。

《実施例４》カリマイシン産生菌および遺伝子破壊株の発酵、産生物の活性測定および同定
４．１ 発酵
菌を斜面培地（ｇ／Ｌ）で培養する
大豆粉末 ２０．０ グルコース １０．０
デンプン ３０．０ ＣａＣＯ_３ ５．０
ＮａＣｌ ４．０ 寒天１８．０
脱イオン水で調製する（自然ｐＨ値）。１５ポンドで１２１℃、３０ｍｉｎ滅菌する。
２８℃で１０〜１２ｄ培養し、菌の成長後、３０ｍｌの発酵培地を分注した１００ｍＬの三角フラスコに菌を接種し、２８℃で９６〜１２０ｈ振とう培養する。
発酵培地（ｇ／Ｌ）
グルコース ５．０ 塩化ナトリウム １０
デンプン ６０ 硫酸マグネシウム １．０
炭酸カルシウム ５．０ 硝酸アンモニウム ６．０
リン酸二水素カリウム ０．５ イーストパウダー ５．０
魚粉 ２０．０ 自然ｐＨ値
脱イオン水で調製し、１５ポンドで１２１℃、３０ｍｉｎ滅菌する。

４．２ 発酵産生物の活性測定
発酵液を遠心分離し、上清液を採取して希釈した後、枯草菌を検定菌とし、《中華人民共和国薬典》２００５年版（二部）のアセチルスピラマイシン微生物検定法を参考にする。カップ法を採用し、標準曲線法で測定する。

４．３ 発酵産生物の抽出および同定
発酵液を室温、３０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離し、上清液を１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ８．５に調整した後、１／２体積の酢酸エチルで抽出する。酢酸エチル相を採取してプレートで乾燥させ、乾燥後、クロマトグラフグレードのメタノールに溶解し、ろ過後、１０〜２０μｌをサンプリングする。クロマトグラフ：ＳＩＭＡＤＺＵ ＬＣ−１０ＡＴｖｐ液体クロマトグラフ、フォトダイオードアレイ検出器、クロマトグラフカラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ_１８（４．５ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ）、移動相：ＣＨ_３ＯＨ／１％ＮａＨ_２ＰＯ_４（５５：４５）、検出波長：２３１ｎｍ、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：２５℃。カリマイシン標準品を対照（中国薬品生物製品検定所から購入）とし、変異株の発酵産生物を同定する。

本発明の前記遺伝子およびタンパク質を配列表に示す。

Claims (10)

1. カリマイシン生合成遺伝子クラスタであって、前記生合成遺伝子クラスタは全部で４４個の遺伝子を有し、具体的に
   １）ポリケチドシンテターゼ遺伝子はｏｒｆ１０〜１４であり、全部で５個の遺伝子である；
   ２）ポリケチド合成の伸長ユニットおよび修飾に関係する遺伝子はｏｒｆ１、ｏｒｆ４〜６、１５、３６〜３９であり、全部で９個の遺伝子である；
   ３）グリコシル基の合成に関係する遺伝子はｏｒｆ９、１６〜２２、２４、２６、２８、２９、３３〜３５、４１であり、全部で１６個の遺伝子である；
   ４）グリコシル基の転移に関係する遺伝子はｏｒｆ７、８、３０〜３２、４０であり、全部で６個の遺伝子である；
   ５）抵抗性に関係する遺伝子はｏｒｆ３および２５であり、全部で２個の遺伝子である；
   ６）生合成の調節に関係する遺伝子はｏｒｆ２、２３、２７、４２であり、全部で４個の遺伝子である；
   ７）外部から導入するのは、遺伝子工学菌のマーカー遺伝子ｏｒｆ４３と、これと連鎖するミカロース４’’Ｏ−ヒドロキシイソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子ｏｒｆ４４とであり、全部で２個の遺伝子であることを特徴とする、カリマイシン生合成遺伝子クラスタ。
2. 前記５個のポリケチドシンテターゼ遺伝子はポリケチド生合成酵素をコードし、前記ポリケチド生合成酵素はカリマイシンの１６員環ラクトン環の合成を触媒し、前記５個のポリケチドシンテターゼ遺伝子ｏｒｆ１０〜１４のヌクレオチド配列または相補配列に対応するアミノ酸配列が、ＩＡ−Ｗ１０、ＩＡ−Ｗ１１、ＩＡ−Ｗ１２、ＩＡ−Ｗ１３およびＩＡ−Ｗ１４であることを特徴とする、請求項１に記載の生合成遺伝子クラスタ。
3. ５つのポリケチドシンテターゼが、ケトシンテターゼ（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、ケトレダクターゼ（ＫＲ）、デヒドラターゼ（ＤＨ）、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）、チオエステラーゼドメインのヌクレオチド配列または相補配列に対応するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の生合成遺伝子クラスタ。
4. ５つのポリケチドシンテターゼが、モジュールまたはドメインを含むことを特徴とする、請求項３に記載の生合成遺伝子クラスタ。
5. 前記ポリケチド合成の伸長ユニットおよび修飾に関係する遺伝子ｏｒｆ１、ｏｒｆ４〜６、１５、３６〜３９のヌクレオチド配列または相補配列に対応するアミノ酸配列が、ＩＡ−Ｗ１、ＩＡ−Ｗ４、ＩＡ−Ｗ５、ＩＡ−Ｗ６、ＩＡ−Ｗ１５、ＩＡ−Ｗ３６、ＩＡ−Ｗ３７、ＩＡ−Ｗ３８およびＩＡ−Ｗ３９であることを特徴とする、請求項１に記載の生合成遺伝子クラスタ。
6. 前記グリコシル基の合成に関係する遺伝子ｏｒｆ９、１６〜２２、２４、２６、２８、２９、３３〜３５、４１のヌクレオチド配列または相補配列に対応するアミノ酸配列が、ＩＡ−Ｗ９、ＩＡ−Ｗ１６、ＩＡ−Ｗ１７、ＩＡ−Ｗ１８、ＩＡ−Ｗ１９、ＩＡ−Ｗ２０、ＩＡ−Ｗ２１、ＩＡ−Ｗ２２、ＩＡ−Ｗ２４、ＩＡ−Ｗ２６、ＩＡ−Ｗ２８、ＩＡ−Ｗ２９、ＩＡ−Ｗ３３、ＩＡ−Ｗ３４、ＩＡ−Ｗ３５、ＩＡ−Ｗ４１であることを特徴とする、請求項１に記載の生合成遺伝子クラスタ。
7. 前記グリコシル基の転移に関係する遺伝子ｏｒｆ７、８、３０〜３２、４０のヌクレオチド配列または相補配列に対応するアミノ酸配列が、ＩＡ−Ｗ７、ＩＡ−Ｗ８、ＩＡ−Ｗ３０、ＩＡ−Ｗ３１、ＩＡ−Ｗ３２、およびＩＡ−Ｗ４０であることを特徴とする、請求項１に記載の生合成遺伝子クラスタ。
8. 前記抵抗性に関係する遺伝子ｏｒｆ３および２５のヌクレオチド配列または相補配列に対応するアミノ酸配列が、ＩＡ−Ｗ３およびＩＡ−Ｗ２５であることを特徴とする、請求項１に記載の生合成遺伝子クラスタ。
9. 前記生合成の調節に関係する遺伝子ｏｒｆ２、２３、２７、４２のヌクレオチド配列または相補配列に対応するアミノ酸配列が、ＩＡ−Ｗ２、ＩＡ−Ｗ２３、ＩＡ−Ｗ２７、ＩＡ−Ｗ４２であることを特徴とする、請求項１に生合成遺伝子クラスタ。
10. 外部から導入する遺伝子工学菌のマーカー遺伝子ｏｒｆ４３と、これと連鎖するｏｒｆ４４とのヌクレオチド配列または相補配列に対応するアミノ酸配列が、ＩＡ−Ｗ４３、ＩＡ−Ｗ４４であることを特徴とする、請求項１に記載の生合成遺伝子クラスタ。