Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

JP2017500013A - Suspension and population of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cells - Google Patents

Suspension and population of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cells Download PDF

Info

Publication number
JP2017500013A
JP2017500013A JP2016527450A JP2016527450A JP2017500013A JP 2017500013 A JP2017500013 A JP 2017500013A JP 2016527450 A JP2016527450 A JP 2016527450A JP 2016527450 A JP2016527450 A JP 2016527450A JP 2017500013 A JP2017500013 A JP 2017500013A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
cell
differentiation
hours
stage
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2016527450A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP2017500013A5 (en
Inventor
フライヤー，ベンジャミン
ラニアウスカス，ダイナ
ブラックムーア，マーシャ
ワン，ハイユン
リロヴァ，コスタディンカ
ネルソン，シェリー
ロソハ，エリザベス
Original Assignee
ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US13/998,974 external-priority patent/US10377989B2/en
Application filed by ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド, ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド filed Critical ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
Publication of JP2017500013A publication Critical patent/JP2017500013A/en
Publication of JP2017500013A5 publication Critical patent/JP2017500013A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/19—Growth and differentiation factors [GDF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/42—Notch; Delta; Jagged; Serrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2531/00—Microcarriers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

本発明は、分化のための凝集多能性幹細胞集団を調製する方法を提供する。特に、本発明は、懸濁培養を使用して、多能性細胞をβ細胞、心細胞、及び神経細胞系統に分化させる方法を開示する。この方法は、これらの集団の分化の前に、凝集細胞集団を調製することを伴う。The present invention provides methods for preparing aggregated pluripotent stem cell populations for differentiation. In particular, the present invention discloses a method for differentiating pluripotent cells into beta cells, cardiac cells, and neural cell lineages using suspension culture. This method involves preparing aggregated cell populations prior to differentiation of these populations.

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許出願第６１／７４７，７９９号（２０１２年１２月３１日に出願）及び米国仮特許出願第６１／９６２，１５８号に対する優先権を主張し、その全体が参照によって組み込まれる、米国特許出願第１３／９９８，９７４号（２０１３年１２月３０日に出願）の継続出願である。 (Cross-reference of related applications)
This application claims priority to US Provisional Patent Application No. 61 / 747,799 (filed December 31, 2012) and US Provisional Patent Application No. 61 / 962,158, which is incorporated by reference in its entirety. US patent application Ser. No. 13 / 998,974 (filed Dec. 30, 2013).

（発明の分野）
本発明は、凝集した細胞集団において、内胚葉前駆細胞、膵内分泌細胞、中胚葉細胞、又は外胚葉細胞への分化のための多能性を維持する、胚性幹細胞及びその他の多能性細胞を調製することを含む細胞分化の分野にある。一態様では、本発明は、多能性幹細胞の集団を生成し、膵臓内胚葉、膵内分泌前駆細胞、及び単一ホルモン膵内分泌細胞への分化のために、懸濁培養下でそれらを維持する方法を開示する。 (Field of Invention)
The present invention relates to embryonic stem cells and other pluripotent cells that maintain pluripotency for differentiation into endoderm progenitor cells, pancreatic endocrine cells, mesoderm cells, or ectoderm cells in an aggregated cell population In the field of cell differentiation, including the preparation of In one aspect, the present invention generates a population of pluripotent stem cells and maintains them in suspension culture for differentiation into pancreatic endoderm, pancreatic endocrine progenitor cells, and single hormone pancreatic endocrine cells. A method is disclosed.

Ｉ型真性糖尿病の細胞補充療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着に適したインスリン産生細胞、すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法として、胚性幹細胞などの多能性幹細胞から機能的β細胞を生成するものがある。   Advances in cell replacement therapy for type I diabetes mellitus and the lack of transplantable islets of Langerhans have attracted attention to the development of a source of insulin producing cells, i.e., beta cells, suitable for engraftment. One approach is to generate functional β cells from pluripotent stem cells such as embryonic stem cells.

脊椎動物の胚発生では、多能性細胞は、原腸形成として知られるプロセスにおいて３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）からなる細胞群を生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間段階は、胚体内胚葉の形成である。   In vertebrate embryogenesis, pluripotent cells produce a group of cells composed of three germ layers (ectoderm, mesoderm, and endoderm) in a process known as gastrulation. For example, tissues such as thyroid, thymus, pancreas, intestine, and liver develop from the endoderm through an intermediate stage. An intermediate step in this process is the formation of definitive endoderm.

原腸形成の終了までに、内胚葉は、内胚葉の前部、中間、及び後部の領域を特異的にマークする因子のパネルの発現によって認識することができる前部−後部ドメインに分割される。例えば、ＨＨＥＸ及びＳＯＸ２は内胚葉の前領域を特定し、ＣＤＸ１、２及び４は後半分を特定する。   By the end of gastrulation, the endoderm is divided into anterior-posterior domains that can be recognized by the expression of a panel of factors that specifically mark the anterior, middle, and posterior regions of the endoderm . For example, HHEX and SOX2 specify the anterior region of the endoderm, and CDX1, 2 and 4 specify the rear half.

内胚葉組織の移行は、内胚葉を腸管の領域化に役立つ異なった中胚葉組織に近接させる。これは、例えば、ＦＧＦ、Ｗｎｔ、ＴＧＦ−β、レチノイン酸（「ＲＡ」）、及びＢＭＰリガンド、並びにそれらのアンタゴニストのような多数の分泌された因子によって達成される。例えば、ＦＧＦ４及びＢＭＰは推定後腸内胚葉においてＣＤＸ２の発現を促進し、前方の遺伝子ＨＨＥＸ及びＳＯＸ２の発現を阻害することが報告されている（２０００ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２７：１５６３〜１５６７）。ＷＮＴシグナル伝達はまた、後腸の発達を促進し、前腸の運命を阻害するために、ＦＧＦシグナル伝達と平行して作用することが示されている（２００７ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３４：２２０７〜２２１７）。最後に、間葉によって分泌されるレチノイン酸は、前腸−後腸の境界を調節する（２００２ Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ、１２：１２１５〜１２２０）。   The transition of the endoderm tissue brings the endoderm into close proximity to different mesoderm tissue that serves to localize the intestinal tract. This is achieved by a number of secreted factors such as, for example, FGF, Wnt, TGF-β, retinoic acid (“RA”), and BMP ligands and their antagonists. For example, FGF4 and BMP have been reported to promote CDX2 expression in putative hind gut endoderm and inhibit the expression of anterior genes HHEX and SOX2 (2000 Development, 127: 1563-1567). WNT signaling has also been shown to act in parallel with FGF signaling to promote hindgut development and inhibit foregut fate (2007 Development, 134: 2207-2217). Finally, retinoic acid secreted by the mesenchyme regulates the foregut-hindgut boundary (2002 Curr Biol, 12: 1215-1220).

特異的転写因子の発現レベルは、組織のアイデンティティを指定するために使用できる可能性がある。原腸管への胚体内胚葉の形質転換中に、腸管は、制限された遺伝子発現パターンにより分子レベルで観察することができる広いドメインに領域化される。例えば、腸管で領域化された膵臓ドメインは、ＰＤＸ１の非常に高い発現並びにＣＤＸ２及びＳＯＸ２の非常に低い発現を示す。ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＦＴ１Ａ、及びＮＫＸ２．２は膵臓組織で高く発現し、また、ＣＤＸ２の発現は腸組織で高い。   The expression level of a specific transcription factor may be used to specify tissue identity. During transformation of definitive endoderm into the gastrointestinal tract, the intestinal tract is domaind into broad domains that can be observed at the molecular level due to restricted gene expression patterns. For example, pancreatic domains that are regionalized in the intestine show very high expression of PDX1 and very low expression of CDX2 and SOX2. PDX1, NKX6.1, PFT1A, and NKX2.2 are highly expressed in pancreatic tissue and CDX2 expression is high in intestinal tissue.

膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により生じる。背側と腹側の膵臓ドメインは、前腸上皮から生じる。また、前腸は、食道、気管、肺、甲状腺、胃、肝臓、膵臓、胆管系を生じさせる。   The formation of the pancreas occurs by the differentiation of definitive endoderm into pancreatic endoderm. The dorsal and ventral pancreatic domains arise from the foregut epithelium. The foregut also gives rise to the esophagus, trachea, lungs, thyroid, stomach, liver, pancreas, and bile duct system.

膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程を印している。成熟した膵臓は、膵臓内胚葉の分化から生じる外分泌組織及び内分泌組織の両方を含有する。   Pancreatic endoderm cells express the pancreas-duodenal homeobox gene PDX1. In the absence of PDX1, the pancreas does not develop beyond the formation of ventral and dorsal buds. Thus, PDX1 expression marks an important step in pancreatic organ formation. The mature pancreas contains both exocrine and endocrine tissues resulting from pancreatic endoderm differentiation.

Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下でのヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮培地の生産を記述している（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５，２３：１５３４〜１５４１；米国特許第７，７０４，７３８号）。マウスの腎臓被膜下でのこれらの細胞の移植は、報告によると、内胚葉組織の特徴を有する、より成熟した細胞への分化をもたらした（米国特許第７，７０４，７３８号）。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ１０及びレチノイン酸の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞に更に分化することができる（米国特許出願公開第２００５／０２６６５５４Ａ１号）。免疫不全マウスの脂肪パッド中のこれら膵臓前駆細胞のその後の移植は、３〜４ヶ月の成熟期の後に、機能的膵臓内分泌細胞の形成をもたらした（米国特許第７，９９３，９２０号及び米国特許第７，５３４，６０８号）。   D'Amour et al. Describe the production of concentrated media of definitive endoderm from human embryonic stem cells in the presence of high concentrations of activin and low serum (Nature Biotechnol 2005, 23: 1534-1541; US Patent). No. 7,704,738). Transplantation of these cells under the kidney capsule of mice reportedly led to differentiation into more mature cells with the characteristics of endoderm tissue (US Pat. No. 7,704,738). Definitive endoderm cells derived from human embryonic stem cells can be further differentiated into PDX1-positive cells after addition of FGF10 and retinoic acid (US Patent Application Publication No. 2005 / 0266554A1). Subsequent transplantation of these pancreatic progenitor cells in the fat pad of immunodeficient mice resulted in the formation of functional pancreatic endocrine cells after 3-4 months of maturity (US Pat. No. 7,993,920 and US). Patent No. 7,534,608).

Ｆｉｓｋらは、ヒト胚性幹細胞からの膵島細胞の産生のためのシステムを報告している（米国特許第７，０３３，８３１号）。小分子阻害剤もまた、膵内分泌前駆細胞の誘導のために使用されている。例えば、ＴＧＦ−β受容体及びＢＭＰ受容体の小分子阻害剤（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１１、１３８：８６１〜８７１；Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２０１１、６０：２３９〜２４７）は、膵内分泌細胞の数を有意に拡張するために使用されている。加えて、小分子活性化剤もまた、胚体内胚葉細胞又は膵臓前駆細胞を生成するために使用されている（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９、２１：７２７〜７３２；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９、５：２５８〜２６５）。   Fisk et al. Report a system for the production of islet cells from human embryonic stem cells (US Pat. No. 7,033,831). Small molecule inhibitors have also been used for the induction of pancreatic endocrine precursor cells. For example, small molecule inhibitors of TGF-β and BMP receptors (Development 2011, 138: 861-871; Diabetes 2011, 60: 239-247) are used to significantly expand the number of pancreatic endocrine cells Has been. In addition, small molecule activators have also been used to generate definitive endoderm cells or pancreatic progenitor cells (Curr Opin Cell Biol 2009, 21: 727-732; Nature Chem Biol 2009, 5: 258- 265).

多能性幹細胞などの前駆細胞を培養するためのプロトコルの改善において、大きな進歩がなされた。ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０２６３５３（Ａｍｉｔら）は、二次元培養系における未分化状態でのヒト胚性幹細胞の維持を開示する。Ｌｕｄｗｉｇら、２００６（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２４：１８５〜７）は、マトリックス上でのヒト胚性幹細胞の培養のためのＴｅＳＲ１画定培地を開示する。米国特許出願公開第２００７／０１５５０１３号（Ａｋａｉｋｅら）は、多能性幹細胞に接着するキャリアを使用して、懸濁液で多能性幹細胞を成長させる方法を開示し、米国特許出願公開第２００９／００２９４６２号（Ｂｅａｒｄｓｌｅｙら）は、マイクロキャリア又は細胞封入を使用して、懸濁液で多能性幹細胞を増殖させる方法を開示する。ＰＣＴ公開第ＷＯ ２００８／０１５６８２号（Ａｍｉｔら）は、基質接着の欠ける培養状況下において、懸濁培養下でヒト胚性幹細胞を増殖させ、維持する方法を開示する。   Significant progress has been made in improving protocols for culturing progenitor cells such as pluripotent stem cells. PCT Publication No. WO2007 / 026353 (Amit et al.) Discloses the maintenance of human embryonic stem cells in an undifferentiated state in a two-dimensional culture system. Ludwig et al., 2006 (Nature Biotechnology, 24: 185-7) discloses TeSR1 defined media for the culture of human embryonic stem cells on a matrix. US Patent Application Publication No. 2007/0155013 (Akaike et al.) Discloses a method for growing pluripotent stem cells in suspension using a carrier that adheres to the pluripotent stem cells. / 0029462 (Beardsley et al.) Discloses a method of growing pluripotent stem cells in suspension using microcarriers or cell encapsulation. PCT Publication No. WO 2008/015682 (Amit et al.) Discloses a method for growing and maintaining human embryonic stem cells in suspension culture in culture conditions lacking substrate adhesion.

米国特許出願公開第２００８／０１５９９９４号（Ｍａｎｔａｌａｒｉｓら）は、三次元培養システムにおいてアルギン酸ビーズ内に封入されたヒト胚性幹細胞を培養する方法を開示する。   US Patent Application Publication No. 2008/0159994 (Mantalaris et al.) Discloses a method of culturing human embryonic stem cells encapsulated in alginate beads in a three-dimensional culture system.

これらの進歩にもかかわらず、機能的内分泌細胞に分化し得る多能性幹細胞を三次元培養系にて正常に培養する方法のための必要性が、依然として残っている。   Despite these advances, there remains a need for a method of successfully culturing pluripotent stem cells that can differentiate into functional endocrine cells in a three-dimensional culture system.

上記の発明の概要、並びに以降の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良好に理解されるであろう。本発明を例示する目的で、図面の本発明の実施形態を示す。しかしながら、本発明は、示される正確な構成、実施例、及び手段に限定されない点は理解されるべきである。
実施例１に従った、剥離直後（左手パネル）及び非接着性静的培養下での２４時間後（右手パネル）のヒト胚性幹（「ｈＥＳ」）細胞株Ｈ１の、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）処理した細胞の顕微鏡写真を示す。剥離後の細胞（左手パネル）は、それぞれの断片が細胞の塊からなる、約２０〜３０マイクロメートルの平均断片直径を有する、単層の断片に類似した。非接着性静的培養下での２４時間後の細胞は、集団様構成を呈した。 実施例１に従った、２５ｍＬのｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を含有する１２５ｍＬのスピナーフラスコ内で、４日間培養した後のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）処理した細胞について、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＣＸＣＲ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１に関するフローサイトメトリーの結果を示す。細胞は、分化のマーカーであるＣＸＣＲ４の発現をほとんど呈せず、多能性（ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１）のマーカーの高い発現を呈した。 ステージ１の終了時の、分化から７２及び９６時間後の、ヒト胚性幹細株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（登録商標）処理した細胞の顕微鏡写真を示す。図１ｃにおいて可視であるのは、７２時間後の４Ｘ倍率（左手パネル）、９６時間後の４Ｘ倍率（中央パネル）、及び９６時間後の１０Ｘ倍率（右手パネル）の疎性細胞凝集体である。 マーカーＣＤ９、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、及びＣＤ９９に関する段階１の分化の終了時における、ヒト胚性幹細株Ｈ１をＤｉｓｐａｓｅ（登録商標）処理した細胞のフローサイトメトリー結果を示す（実施例１を参照のこと）。図１ｄに示すとおり、多能性のマーカー、ＣＤ９の発現がほぼ排除されている一方、胚体内胚葉分化のマーカー、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）及びＣＤ９９の発現は極めて高かった。 未分化Ｈ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞と比較した、ステージ１の終了時における、多能性に関連付けられている選択された遺伝子、及びヒト胚性幹細株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（登録商標）処理した細胞の胚体内胚葉に関連付けられている遺伝子の発現に関する、定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）結果を示す（実施例１を参照のこと）。ステージ１の終了時の細胞は、未分化のＷＡ９１ ｈＥＳ細胞と対比して、多能性遺伝子（ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４）の発現における劇的な減少、及び胚体内胚葉（ＣＸＣＲ４、ＣＥＲＢＥＲＵＳ（ＣＥＲ１）、ＧＳＣ、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、及びＳＯＸ１７）に関連付けられた遺伝子における大きな増加を示した。 細胞が胚体内胚葉から膵臓内胚葉へと更に分化したときの、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（登録商標）処理した細胞の顕微鏡写真を示す（実施例１を参照のこと）。分化がステージ２、１日目（上部左手パネル）からステージ２、３日目（上部右手パネル）、ステージ３、４日目（下部左手パネル）、及びステージ４、１日目（下部右手パネル）へと進行するにつれて、細胞及び細胞集団に対する明白な形態的変化が可視である。 実施例２に従って、ＥＤＴＡ処理後の撹拌された懸濁培養下で２日間の培養後、及び分化培養への遷移前の、多能性及び分化に関連付けられているマーカーについての、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞に関するフローサイトメトリーデータを示す。データは、分化のマーカー（ＣＳＣＲ４）の発現がほとんどなく、多能性のマーカー（ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１）の高い発現を示した。 実施例２に従って、スピナーフラスコ内で成長させたステージ１、３日目の細胞、並びにスピナーフラスコ又は三角フラスコ内で成長させたステージ２、２日目、ステージ４、１日目、及びステージ４、３日目の細胞に分化した、ヒト胚性幹細株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞の顕微鏡写真を示す。懸濁分化培養は、球状凝集体で、細胞のほぼ均一かつ同質の集団を形成した。 多能性及び内胚葉分化の細胞表面マーカーについて、ステージ１の終了時におけるヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞に関するフローサイトメトリーデータを示す。図２ｃで可視であるように、多能性のマーカー、ＣＤ９の発現がほぼ排除されている一方、胚体内胚葉分化のマーカー、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）の発現は極めて高かった。 未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞と比較した、ステージ１の終了時における、多能性に関連付けられている選択された遺伝子、及びヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞の胚体内胚葉に関連付けられている遺伝子の発現に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲの結果を示す（実施例２を参照のこと）。図２ｄは、多能性遺伝子（ＣＤ９、Ｎａｎｏｇ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４）の発現の減少、及び胚体内胚葉に関連付けられている遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＣＥＲＢＥＲＵＳ（「ＣＥＲ１」）、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、及びＳＯＸ１７）の大きな増加を示す。 実施例２に従った、スピナーフラスコ又は三角フラスコ内の懸濁によって、ステージ１から膵臓内胚葉へ分化された、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の、ＥＤＴＡ処理した細胞について、分化を示すマーカー（ＮＫＸ６．１、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、及びクロマグラニン）のフローサイトメトリーデータを示す。フローサイトメトリーデータは、機能的β細胞に必要な転写因子である、高いレベルのＮＫＸ６．１、及び両方の懸濁形式を有するシナプトフィジン（データ表示なし）及びクロマグラニンなどの高いレベルの内分泌膵臓マーカーを示す。 実施例２に従った、スピナーフラスコ又は三角フラスコ内の懸濁によって、ステージ１から膵臓内胚葉へ分化された、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の、ＥＤＴＡ処理した細胞について、分化を示すマーカー（ＮＫＸ６．１、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、及びクロマグラニン）のフローサイトメトリーデータを示す。フローサイトメトリーデータは、機能的β細胞に必要な転写因子である、高いレベルのＮＫＸ６．１、及び両方の懸濁形式を有するシナプトフィジン（データ表示なし）及びクロマグラニンなどの高いレベルの内分泌膵臓マーカーを示す。 実施例２に従った、スピナーフラスコ又は三角フラスコ内の懸濁によって、ステージ１から膵臓内胚葉へ分化された、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の、ＥＤＴＡ処理した細胞について、分化を示すマーカー（ＮＫＸ６．１、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、及びクロマグラニン）のフローサイトメトリーデータを示す。フローサイトメトリーデータは、機能的β細胞に必要な転写因子である、高いレベルのＮＫＸ６．１、及び両方の懸濁形式を有するシナプトフィジン（データ表示なし）及びクロマグラニンなどの高いレベルの内分泌膵臓マーカーを示す。 実施例２に従った、スピナーフラスコ又は三角フラスコ内の懸濁によって、ステージ１から膵臓内胚葉へ分化された、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の、ＥＤＴＡ処理した細胞について、分化を示すマーカー（ＮＫＸ６．１、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、及びクロマグラニン）のフローサイトメトリーデータを示す。フローサイトメトリーデータは、機能的β細胞に必要な転写因子である、高いレベルのＮＫＸ６．１、及び両方の懸濁形式を有するシナプトフィジン（データ表示なし）及びクロマグラニンなどの高いレベルの内分泌膵臓マーカーを示す。 実施例２に従った、スピナーフラスコ又は三角フラスコ内の懸濁によってステージ１から膵臓内胚葉へ更に分化された、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の、ＥＤＴＡ処理した細胞について、分化に関連付けられている選択された遺伝子の発現に関するｑＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。データをＷＡ０１ ｈＥＳ細胞の発現と比較する。ＲＴ−ＰＣＲの結果は、高いレベルの膵臓前駆遺伝子の発現を示す。 Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）での処理に続いて静的培養から剥離された、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の顕微鏡写真を示す。図３ａに示すように、細胞は、小さい凝集体として表面から除去された。 Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）での処理に続いて静的培養から剥離し、次いで、３日間懸濁培養系内で増殖させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の位相差顕微鏡写真を示す。図３ｂにおいて可視であるのは、細胞集団のほぼ均一な球状集団の形成である。 Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）での処理に続いて静的培養から剥離し、次いで、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）分離を使用して連続的に継代した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞集塊の顕微鏡写真を示す。 分化の異なるステージで指向された分化プロトコルを使用する、細胞株Ｈ１の懸濁培養したヒト胚性幹細胞の顕微鏡写真を示す。図４ａにおいて可視であるのは、分化のそれぞれのステージでの細胞の顕微鏡写真である。 分化の異なるステージでの指向された分化プロトコルを使用する、細胞株Ｈ１の懸濁培養したヒト胚性幹細胞の分化のマーカー（ＣＸＣＲ４、ＣＤ５６、及びＰＤＸ１）に関するフローサイトメトリーの結果を示す。ステージ４、４日目における分化プロセスの終了時に、高い割合の細胞がＰＤＸ１発現に対して陽性であった。 ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内に封入された分化細胞を移植した、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウスの非空腹時血糖レベルを示す。 分化培養への遷移前のヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡで処置した細胞に関する、多能性及び分化に関連付けられたマーカーについてのフローサイトメトリーデータを示す。図５ａに示すように、多能性マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８０の高い発現が観察された。 ステージ１での３つの異なる供給設定に関する、ＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４及びＣＤ９９（分化のマーカー）、並びにＣＤ９（多能性マーカー）の、細胞の位相差画像及びフローサイトメトリーデータを示す。テストされた条件は以下のとおりであった。（Ａ）分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間で培地変更なし、（Ｂ）分化開始から２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤を添加、並びに（Ｃ）ステージ１を通して培地を変更せず、分化開始から２４時間後にグルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を添加し、次いで、開始から４８時間後にグルコース巨塊剤を添加。 胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、膵臓内胚葉形態を呈する分化細胞の位相差画像を示す。（Ａ）分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間では培地変更なし、（Ｂ）分化開始から２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤を添加、並びに（Ｃ）ステージ１を通して培地を変更せず、分化開始から２４時間後にグルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を添加し、次いで、開始から４８時間後にグルコース巨塊剤を添加。 以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での膵臓遺伝子発現（ＮＫＸ６．１及びクロモグラニン）、及び分化した細胞の選択非膵臓遺伝子（ＣＤＸ２及びＳＯＸ２）の選択マーカーについての、フローサイトメトリーの結果を示す。（Ａ）分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間では培地変更なし。 以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での膵臓遺伝子発現（ＮＫＸ６．１及びクロモグラニン）、及び分化した細胞の選択非膵臓遺伝子（ＣＤＸ２及びＳＯＸ２）の選択マーカーについての、フローサイトメトリーの結果を示す。（Ｂ）分化開始から２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤を添加。 以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での膵臓遺伝子発現（ＮＫＸ６．１及びクロモグラニン）、及び分化した細胞の選択非膵臓遺伝子（ＣＤＸ２及びＳＯＸ２）の選択マーカーについての、フローサイトメトリーの結果を示す。（Ｃ）ステージ１の間は培地を変更せず、分化開始から２４時間後にグルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を添加し、開始から４８時間後にグルコース巨塊剤を添加。 胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での、分化した細胞の選択膵臓及び非膵臓遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。（Ａ）分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間では培地変更なし、（Ｂ）分化開始から２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤を添加、並びに（Ｃ）ステージ１の間は培地を変更せず、分化開始から２４時間後にグルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を添加し、開始から４８時間後にグルコース巨塊剤を添加。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における倍数差として示される。 胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での、分化した細胞の選択膵臓及び非膵臓遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。（Ａ）分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間では培地変更なし、（Ｂ）分化開始から２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤を添加、並びに（Ｃ）ステージ１の間は培地を変更せず、分化開始から２４時間後にグルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を添加し、開始から４８時間後にグルコース巨塊剤を添加。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における倍数差として示される。 胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での、分化した細胞の選択膵臓及び非膵臓遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。（Ａ）分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間では培地変更なし、（Ｂ）分化開始から２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤を添加、並びに（Ｃ）ステージ１の間は培地を変更せず、分化開始から２４時間後にグルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を添加し、開始から４８時間後にグルコース巨塊剤を添加。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における倍数差として示される。 胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での、分化した細胞の選択膵臓及び非膵臓遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。（Ａ）分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間では培地変更なし、（Ｂ）分化開始から２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤を添加、並びに（Ｃ）ステージ１の間は培地を変更せず、分化開始から２４時間後にグルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を添加し、開始から４８時間後にグルコース巨塊剤を添加。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における倍数差として示される。 条件Ａ（分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間では培地変更なし）に従って分化させた細胞を埋め込んだ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内のＣペプチドの発現を示す。それぞれのＳＣＩＤ−Ｂｇマウスの腎臓被膜下に、５００万個の細胞を埋め込んだ。図５ｆに示すように、埋め込み後１２週目までにヒトＣペプチドが１ｎｇ／ｍＬを超えるレベルで検出可能であり、１６週目でＣペプチドレベルは平均２．５ｎｇ／ｍＬであった。 条件Ａ（分化開始から２４時間後で培地変更、４８時間での培地変更なし）に従って分化させた細胞の前及び後投与（例えば、埋め込み）の、選択されたＳＣＩＤ−Ｂｇマウスに対するグルコース処理の影響を示す。図５ｇに示すように、グルコース処理は、空腹状態で平均０．９３ｎｇ／ｍＬから供給状態で２．３９ｎｇ／ｍＬまで、循環するヒトＣペプチドの有意な増加を誘導した。 条件Ａ（分化開始から２４時間後で培地変更、４８時間での培地変更なし）に従って分化させた細胞を投与した、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウスに対するストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の投与（すなわち、ＳＴＺ誘導糖尿病）の影響を示す。図５ｈから明白であるように、機能的ＧＳＩＳコンピテント組織の移植片を有する動物（すなわち、細胞を投与されたもの）は、真性糖尿病を発症した未処置の対照とは異なり、正常な血糖レベルを維持した。 分化前のＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３マイクロキャリアビーズ上で成長させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の顕微鏡写真を示す。 分化のさまざまなステージで、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３マイクロキャリアビーズ上で成長させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の顕微鏡写真を示す。 アクチビンＡ（ＡＡ）及びＷＮＴ３Ａを含有する培地内のプレート（ＷＴＮ３Ａ／ＡＡプレート）、アクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａを含有する培地内のマイクロキャリア（ＷＴＮ３Ａ／ＡＡマイクロキャリア）、ＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する培地内のプレート（ＭＣＸ／ＧＤＦ８プレート）、並びにＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する培地内のマイクロキャリア（ＭＣＸ／ＧＤＦ８マイクロキャリア）で、成長及び分化させたヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞に関する、分化の日数の関数としての細胞計数（細胞／ｃｍ2）を示す。 アクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａを含有する培地内のプレート（ＷＴＮ３Ａ／ＡＡプレート）、アクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａを含有する培地内のマイクロキャリア（ＷＴＮ３Ａ／ＡＡマイクロキャリア）、ＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する培地内のプレート（ＭＣＸ／ＧＤＦ８プレート）、並びにＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する培地内のマイクロキャリア（ＭＣＸ／ＧＤＦ８マイクロキャリア）で成長及び分化させたヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞に関する、分化の日数の関数としての細胞計数（細胞／ｍＬ）を示す。 ＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４（Ｙ軸）及びＣＤ９（Ｘ軸）の細胞発現のドットプロットとして、（ａ）ＷＮＴ３Ａ及びＡＡ、又は（２）ＭＣＸ及びＧＤＦ８が存在するときの、マイクロキャリア培養又は平面培養で成長させた、細胞の分化の第１ステージに関するフローサイトメトリーの結果を示す。 それぞれのマーカー（ＣＸＣＲ４及びＣＤ９）の合計発現として、（ａ）ＷＮＴ３Ａ及びＡＡ、又は（２）ＭＣＸ及びＧＤＦ８が存在するときの、マイクロキャリア培養又は平面培養で成長させた、細胞の分化の第１ステージに関するフローサイトメトリーの結果を示す。 （ａ）ＷＮＴ３Ａ及びＡＡ、又は（２）ＭＣＸ及びＧＤＦ８が存在するときの、平面培養、又は懸濁培養下のマイクロキャリアビーズ上で分化させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の分化に関連付けられている、選択された遺伝子の発現に関するｑＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。 実施例７のプロトコルに従って分化させた細胞について、ステージ１、１日目からステージ４、３日目までの、バイオリアクターにおける分化のさまざまなステージでの細胞計数を示す。細胞計数は、画像に基づいた血球計算（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標））によって決定される、１００万個の細胞／ｍＬとして示す。 実施例７の分化プロトコル中の時間（分化日数）の関数として、平均した毎日のバイオリアクター培地のｐＨレベルを示す。ｐＨレベルは、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって決定された。 実施例７の分化プロトコル中の時間（分化日数）の関数として、平均した毎日のバイオリアクター培地の乳酸レベルを示す。乳酸レベルは、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって決定された。 実施例７の分化プロトコル中の時間（分化日数）の関数として、平均した毎日のバイオリアクター培地のグルコースレベルを示す。グルコースレベルは、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって決定された。 多能性に関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイに関する、実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ０、１日目（すなわち、接種から２４時間後）の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、未分化の遺伝子発現を示す。 胚体内胚葉に関連付けられている選択遺伝子を含有する胚体内胚葉（「ＤＥ」）アレイに関する、ステージ０、１日目（すなわち、接種から２４時間）の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、未分化の遺伝子発現を示す（実施例７を参照のこと）。 多能性に関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイに関する、ステージ０、３日目（すなわち、接種から７２時間後）の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、未分化の遺伝子発現を示す（実施例７を参照のこと）。 ＤＥに関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイに関する、ステージ０、３日目（すなわち、接種から７２時間後）の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、未分化の遺伝子発現を示す（実施例７を参照のこと）。 未分化のステージ０、３日目（すなわち、接種から７２時間後）の細胞について、ＣＤ９、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１の蛍光活性細胞分別（ＦＡＣＳ）の結果を示す（実施例７を参照のこと）。この結果も表８に示す。 実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ０、１日目（すなわち、接種から２４時間後）及びステージ０、３日目（すなわち、接種から７２時間後）の細胞について、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、未分化の遺伝子発現を示す。特に、図１６は、ＧＡＴＡ４、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴの遺伝子発現の穏やかな増加、並びに指向された分化前のステージ０プロセス中のＧＡＴＡ２発現における≧１００ｘの増加を示す。 実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ０、１日目（すなわち、接種から２４時間後）及びステージ０、３日目（すなわち、接種から７２時間後）の細胞について、ＤＥに関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイに関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、未分化の遺伝子発現を示す。特に、図１７は、指向された分化前のステージ０プロセス中のＣＥＲ１、ＦＧＦ１７、及びＦＧＦ４の発現における≧１００ｘの増加を示す。 実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ１、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図１８は、ステージ１、１日目の細胞について、多能性に関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイに関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図１８は、ＦＯＸＡ２発現における約７００ｘの増加、及びＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴ発現における１０００ｘの増加などの、遺伝子発現パターンの有意な変化を示す。 実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ１、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図１９は、段階１、１日目の細胞について、ＤＥに関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイに関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。１９は、ＦＯＸＡ２発現における約７００ｘの増加、及びＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴ発現における１０００ｘの増加などの、遺伝子発現パターンの有意な変化を示す。 実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ１、３日目の細胞の遺伝子発現を示す。図２０は、ステージ１、３日目の細胞について、多能性に関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイに関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。 実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ１、３日目の細胞の遺伝子発現を示す。図２１は、段階１、３日目の細胞について、ＤＥに関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイに関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。 実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ１、３日目の細胞の、ＣＤ９、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４としても知られる）、及びＣＤ９９のＦＡＣＳの結果を示す。分化開始時のＣＤ９発現／ＣＸＣＲ４陰性多能性細胞集団（図１５）から、ステージ１の終了時のＣＸＣＲ４発現細胞（細胞の９８．３％がＣＸＣＲ４陽性、±１．９標準偏差）の均質な集団（図２２）へのほぼ完全な遷移が観察された。 実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ１、３日目、ステージ２、１日目、ステージ２、３日目の細胞について、ＤＥに関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイに関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図２３は、ステージ２、１及び３日目のＨＮＦ４ａ及びＧＡＴＡ６発現レベルが増加した一方、ステージ１、３日目に高いレベルで発現した遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＭＮＸ１、ＰＲＤＭ１、ＳＯＸ１７、及びＶＷＦ）がステージ２の終了時までに低減した発現を示したことを示す。 実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ２、１日目及びステージ２、３日目の細胞について、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、前腸遺伝子ＡＦＰ、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１の遺伝子発現を示す。図２４に示すように、これらの遺伝子の発現は増加した。 実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ３の培地で成長させたステージ３、３日目の細胞（表７）のＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、クロモグラニン、ＮＫＸ２．２、及びＳＯＸ２のＦＡＣＳの結果を示す。図２５に示すように、細胞は、ＰＤＸ１及びＦＯＸＡ２発現によって測定された（９０．９％±１１．９標準偏差のＰＤＸ１陽性、及び９９．２％±０．６標準偏差のＦＯＸＡ２陽性）、内胚葉膵臓系統と一貫したマーカーを発現した。 実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ３、１日目及びステージ３、３日目の細胞について、ステージ４に関連付けられた選択遺伝子を含有する、ステージ４アレイに関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図２６は、これらの細胞が、膵臓内で通常発現する遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の宿主の増加したレベルを呈することを示す。 実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ４、３日目の細胞について、ＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの結果を示す。図２７に示すように、ステージ４、３日目の細胞は、高いレベルのＰＤＸ１及びＦＯＸＡ２発現を保持し、膵内分泌細胞（２８．１％±１２．５標準偏差のクロマグラニン陽性）及び膵臓前駆細胞（ＮＫＸ６．１の場合、５８．３％±９．７標準偏差で陽性）の混合と一貫した発現パターンを更に発展させた。 実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ３、３日目、ステージ４、１日目、及びステージ４、３日目の細胞について、ステージ４に関連付けられた選択遺伝子を含有するステージ４アレイに関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図２８は、膵臓内で通常発現する遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＭＡＦＢ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の増加した発現レベルを示す。 実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ４、３日目の細胞について、ＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの平均結果を示す。特に、図２９は、異なる種材料ロットから３Ｌスケールで生成した、膵臓前駆物質の平均ＦＡＣＳ発現パターンを示す。 実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ４、３日目の細胞のＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤに関するＦＡＣＳの平均結果を示す。ステージ４の３日目の細胞における分化の前に、細胞を増殖させてＩＳＭを形成し、次いで、その両方を０．５％ ＢＳＡを添加した、カスタムの自家培地「ＩＨ３」又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）のいずれかにおいて、ステージ０で成長させた。ＩＨ３培地内で成長させた細胞は、「ＩＨ３−Ｐ成長細胞」であり、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）で成長させた細胞は、「ＥＺ８成長細胞」である。異なる培地で成長させた細胞間の発現パターンには、有意差は観察されなかった。 ステージ０で異なるｐＨレベルにあらかじめ成長させた、ステージ４、３日目の細胞のＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの平均結果を示す（実施例７を参照のこと）。ステージ４、３日目の細胞プロファイルには、有意な変化は観察されなかった。 アンチフォームＣで処理していないステージ４、３日目の細胞、及びアンチフォームＣ乳剤（９４ｐｐｍ）で処理したステージ４、３日目の細胞の、ＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの結果を比較する（実施例７を参照のこと）。アンチフォームＣ乳剤（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃Ａ８０１１）は、ステージ４、３日目の細胞のプロファイルに影響を及ぼすことは観察されなかった。 実施例８のプロトコルに従って分化した細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図３３は、分化開始の２４時間前の細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す（実施例８を参照のこと）。図３３に示すように、バイオリアクターからの細胞は、多能性に特徴的な遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、及びＺＦＰ４２）の発現を保持し、分化に特徴的な遺伝子（ＡＦＰ、及びＦＯＸＡ２：＜５０倍の増加、ＦＯＸＤ３、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＳＣ、ＨＡＮＤ２、及びＴ：＜１０倍の増加した発現）の誘導が最小限であるか又はまったくないことを示した。 実施例８のプロトコルに従って分化した細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図３３は、分化開始の２４時間前の細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す（実施例８を参照のこと）。図３４は、分化開始から２４時間後の細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。 実施例８のプロトコルに従って分化した細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図３３は、分化開始の２４時間前の細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す（実施例８を参照のこと）。図３５は、分化開始から７２時間後の細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された遺伝子発現を示す。 実施例８のプロトコルに従って、ステージ２からステージ３及び４へ分化させた細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２の１日目、ステージ２の２日目、ステージ２の３日目、ステージ３の３日目、及び遺伝子によってはステージ４の１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ａ）は、ＡＦＰ、ＡＴＯＨ１、及びＣＤＸ２の遺伝子発現を示す。 実施例８のプロトコルに従って、ステージ２からステージ３及び４へ分化させた細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２の１日目、ステージ２の２日目、ステージ２の３日目、ステージ３の３日目、及び遺伝子によってはステージ４の１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ｂ）は、ＧＡＳＴ、ＨＡＮＤ１、ＨＨＥＸ、及びＨＮＦ４ａの遺伝子発現を示す。 実施例８のプロトコルに従って、ステージ２からステージ３及び４へ分化させた細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２の１日目、ステージ２の２日目、ステージ２の３日目、ステージ３の３日目、及び遺伝子によってはステージ４の１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ｃ）は、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＯＳＲ１、及びＰＤＸ１の遺伝子発現を示す。 実施例８のプロトコルに従って、ステージ２からステージ３及び４へ分化させた細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２の１日目、ステージ２の２日目、ステージ２の３日目、ステージ３の３日目、及び遺伝子によってはステージ４の１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ｄ）は、ＰＲＯＸ１、ＰＦＴ１ａ、ＳＯＸ１７、及びＳＯＸ２の遺伝子発現を示す。 実施例８のプロトコルに従って、ステージ２からステージ３及び４へ分化させた細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２の１日目、ステージ２の２日目、ステージ２の３日目、ステージ３の３日目、及び遺伝子によってはステージ４の１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ｅ）は、ＳＯＸ９の遺伝子発現を示す。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における差異として示される。 実施例８のプロトコルに従った分化のステージ４、３日目の細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図３７に示すように、ステージ３、３日目の分化の終了時に、細胞は、ＰＤＸ１（＞１×１０6倍の誘導）及び他の膵臓遺伝子（ＡＲＸ、ＧＣＧ、ＧＡＳＴ、ＩＮＳ、ＩＳＬ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＴＦ１ａ、及びＳＳＴの＞１０００倍の誘導）の高い発現レベル、並びに未分化のＨ１ヒト胚性幹細胞と比較して、ＯＣＴ４／ＰＯＵ５Ｆ１発現のほぼ全損失を特徴とする膵臓前駆細胞に分化している。 実施例８に従った分化プロトコル中の毎日の細胞計数を示す。特に、図３８は、プロセス日の関数としての細胞密度を示す。図３８は、ｐＨ６．８及び７．２で実行した２度のリアクター運転（ＰＲＤ１２０５及びＰＲＤ１２０７）の、分化プロトコルの細胞計数を示す。比較のために、細胞ドリフトの細胞計数も示す。 実施例８のプロトコルに従って分化させ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内に埋め込んだ、ステージ４、３日目の細胞の生体内の生物活性を図示する。細胞は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して、腎臓被膜下の皮下に埋め込むか、又は超低級付着皿内でのインキュベーションの後に埋め込んだ。マウスは、血糖及びＣ−ペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視された。図３９（ａ）は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内の、５×１０6又は１０×１０6のステージ４、３日目の細胞の埋め込み後のＣ−ペプチドレベルを、時間の関数として示す。 実施例８のプロトコルに従って分化させ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内に埋め込んだ、ステージ４、３日目の細胞の生体内の生物活性を図示する。細胞は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して、腎臓被膜下の皮下に埋め込むか、又は超低級付着皿内でのインキュベーションの後に埋め込んだ。マウスは、血糖及びＣ−ペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視された。図３９（ｂ）は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内の、５×１０6又は１０×１０6のステージ４、３日目の細胞の埋め込み後の、動物における非空腹時グルコースレベルを示す。図３９（ｂ）のマウスは、埋め込み前の宿主のβ細胞機能をアブレーションするため、ＳＴＺで処理された。 実施例８のプロトコルに従って分化させ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内に埋め込んだ、ステージ４、３日目の細胞の生体内の生物活性を図示する。細胞は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して、腎臓被膜下の皮下に埋め込むか、又は超低級付着皿内でのインキュベーションの後に埋め込んだ。マウスは、血糖及びＣ−ペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視された。図３９（ｃ）は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内の、あらかじめ冷凍保存したステージ４、３日目の細胞の埋め込み後に産生されたＣ−ペプチドレベルを、時間の関数（埋め込み後の週）として示す。 実施例８のプロトコルに従って分化させ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内に埋め込んだ、ステージ４、３日目の細胞の生体内の生物活性を図示する。細胞は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して、腎臓被膜下の皮下に埋め込むか、又は超低級付着皿内でのインキュベーションの後に埋め込んだ。マウスは、血糖及びＣ−ペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視された。図３９（ｄ）では、解凍直後（０日目）又は解凍１日後（１日目）に埋め込んだ、腎臓移植片の、一度も冷凍保存しなかった／新鮮なステージ４、３日目の細胞、又は冷凍保存したステージ４、３日目の細胞によって処理された、マウスのＣ−ペプチドレベルを比較する。 ステージ１、１日目に、ＭＣＸ化合物及びＧＤＦ−８（図４０Ａ）で処理した、実施例９のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。図は、懸濁培養下で、分化の１日目のＴＧＦ−βファミリーメンバーの不在での３μＭのＭＣＸの添加が、１日目に３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで細胞が処理される際に得られるものに相当するレベルで、胚体内胚葉を生成することを示す。 ステージ１、１日目に、ＭＣＸのみ（図４０Ｂ）で処理した、実施例９のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。図は、懸濁培養下で、分化の１日目のＴＧＦ−βファミリーメンバーの不在での３μＭのＭＣＸの添加が、１日目に３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで細胞が処理される際に得られるものに相当するレベルで、胚体内胚葉を生成することを示す。 ステージ１、１日目に、ＷＮＴ３Ａ及びアクチビンＡ（図４０Ｃ）で処理した、実施例９のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。図は、懸濁培養下で、分化の１日目のＴＧＦ−βファミリーメンバーの不在での３μＭのＭＣＸの添加が、１日目に３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで細胞が処理される際に得られるものに相当するレベルで、胚体内胚葉を生成することを示す。 ステージ１、１日目に、ＷＮＴ３Ａのみ（図４０Ｄ）で処理した、実施例９のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。図は、懸濁培養下で、分化の１日目のＴＧＦ−βファミリーメンバーの不在での３μＭのＭＣＸの添加が、１日目に３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで細胞が処理される際に得られるものに相当するレベルで、胚体内胚葉を生成することを示す。 図４１Ａ及び図４１Ｂは、ステージ１、１日目に様々な量のＭＣＸで処理した、実施例１０のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。特に、ステージ１、１日目に、４μＭのＭＣＸ（図４１Ａ）、３μＭのＭＣＸ（図４１Ｂ）で細胞を処理した。 図４１Ｃ及び図４１Ｄは、ステージ１、１日目に様々な量のＭＣＸで処理した、実施例１０のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。特に、ステージ１、１日目に、２μＭのＭＣＸ（図４１Ｃ）、１．５μＭのＭＣＸ（図４１Ｄ）で細胞を処理した。 図４２Ａ及び図４２Ｂは、実施例１１のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。特に、これらの図は、懸濁培養下の培地交換頻度の役割を示す。図４２Ａは、ステージ１で完全な培地交換をして、実施例１０のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。図４２Ｂは、３日目の培地交換なしで、実施例１０のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。データは、懸濁培養系内で、分化の３日目に培地交換を受ける培養（図４２Ａ）が、３日目に培地交換を受けなかった培養（図４２Ｂ）に相当する効率を有する胚体内胚葉をもたらしたことを示唆する。 図４３Ａ及び図４３Ｂは、実施例１２のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。特に、これらの図は、懸濁培養下のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）の役割を示す。ステージ１では、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を添加した培地（図４３Ａ）内、又はＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）若しくはいかなるグルタミン（０ＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標））も含まない培地（図４３Ｂ）内で細胞を培養した。データは、懸濁培養系内で、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）の添加が、胚体内胚葉が生成される効率に影響を与えないようであることを示唆する。 図４４Ａ及び図４４Ｂは、実施例１３のプロトコルに従って分化した細胞に対する、さまざまな量の重炭酸ナトリウムの影響を示す。図４４Ａ及び図４４Ｂは、ステージ１で３．６４ｇ／ｌ（図４４Ａ）又は２．４９ｇ／ｌ（図４４Ｂ）のいずれかを添加して、実施例１３のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。 図４４Ｃ及び図４４Ｄは、実施例１３のプロトコルに従って分化した細胞に対する、さまざまな量の重炭酸ナトリウムの影響を示す。図４４Ｃ及び図４４Ｄは、ステージ１で３．６４ｇ／ｌ（図４４Ｃ）又は２．４９ｇ／ｌ（図４４Ｄ）のいずれかを添加して、実施例１３のプロトコルに従って３日間分化させた細胞の位相差顕微鏡写真を示す。 実施例１４のプロトコルに従って分化させた細胞について、細胞密度の毎日の細胞計数を分化の関数として示す。細胞計数は、画像に基づくサイトメター（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標））を使用して取得された。 実施例１４の分化プロトコル中の時間（分化日数）の関数として、平均した毎日のバイオリアクター培地のｐＨレベルを示す。ｐＨレベルは、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって決定された。 実施例１４の分化プロトコル中の時間（分化日数）の関数として、平均した毎日のバイオリアクター培地のグルコースレベルを示す。グルコースレベルは、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって決定された。 実施例１４の分化プロトコル中の時間（分化日数）の関数として、平均した毎日のバイオリアクター培地の乳酸レベルを示す。乳酸レベルは、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって決定された。 実施例１４のプロトコルに従って分化させたステージ０、１〜３日目及びステージ１、１日目〜３日目の細胞に関する、多能性と関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイの、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。 実施例１４のプロトコルに従って分化させたステージ０、１〜３日目、ステージ１、１日目〜３日目、及びステージ２、１日目〜３日目の細胞に関する、ＤＥと関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイの、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。 実施例１４のプロトコルに従って分化させる前の、ステージ０の細胞に関する、多能性に関連付けられているマーカー（ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１）のＦＡＣＳの結果を示す。特に、図５１は、多能性に関連付けられているマーカーの高い発現を示す。 実施例１４のプロトコルに従って、ステージ１の終了まで分化させた細胞の胚体内胚葉マーカーＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。 実施例１４のプロトコルに従って分化させた、ステージ２、１日目、ステージ２、２日目、及びステージ２、３日目の細胞に関する、ＧＡＰＤＨ、ＡＦＰ、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４α、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１の、未分化細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図５３は、前腸遺伝子（ＡＦＰ、ＨＨＥＸ、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１）の発現における増加を示す。 実施例１４のプロトコルに従って分化させた、ステージ２、１日目〜３日目及びステージ３、１日目〜３日目の細胞に関する、ＧＡＰＤＨ、ＡＦＰ、ＣＤＸ２、ＧＡＳＴ、ＨＮＦ４Ａ、ＮＫＸ２−２、ＯＳＲ１、ＰＤＸ１、及びＰＦＴ１Ａの、未分化細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図５４に示すように、ＰＤＸ１の発現は、ステージ２、３日目の終了時点で対照に対して１２，０００×から、ステージ３、３日目の終了時点で対照に対して７３９，０００×へと６０倍増加した。 実施例１４のプロトコルに従って分化させたステージ３、１〜３日目及びステージ４、１日目〜３日目の細胞に関する、特定の遺伝子の、未分化の細胞と対比した倍数発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。特に、図５５の上部パネルは、ＧＡＰＤＨ、ＡＦＰ、ＡＬＢ、ＡＲＸ、ＣＤＸ２、ＣＨＧＡ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＡＡＰ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、及びＭＡＦＢの遺伝子発現を示す。図５５の下部パネルは、ＭＡＦＢ、ＭＵＣＳ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＧ３、ＮＫＸ２−２、ＮＫＸ６−１、ＰＡＸ４、ＰＤＸ１、ＰＯＵＳＦ１、ＰＴＦ１Ａ、ＳＳＴ、及びＺ１Ｃ１の遺伝子発現を示す。 実施例１４のプロトコルに従って分化させた細胞の最後のステージの顕微鏡写真を示す。図５６において可視であるのは、ステージ０での、及びステージ１〜４の分化の終了時点での、細胞集団の代表的な顕微鏡写真（４×）である。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＡＦＰ（図５７）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＣＤ９９（図５８）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＣＤ９（図５９）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＣＤＨ１（図６０）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＣＤＨ２（図６１）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＣＤＸ２（図６２）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＣＥＲ１（図６３）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＣＸＣＲ４（図６４）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＦＧＦ１７（図６５）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＦＧＦ４（図６６）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＦＯＸＡ（図６７）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＧＡＤＰＨ（図６８）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＧＡＴＡ４（図６９）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＧＡＴＡ６（図７０）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＧＳＣ（図７１）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＫＩＴ（図７２）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＭＩＸＬ１（図７３）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＭＮＸ１（図７４）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＮＡＮＯＧ（図７５）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＯＴＸ２（図７６）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＰＯＵＦ５Ｆ１（図７７）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＳＯＸ１７（図７８）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＳＯＸ７（図７９）。 以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。Ｔ（図８０）。 実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞に関する、Ｇ０／Ｇ１の細胞周期にある細胞の割合を示す。特に、図８１は、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した集団の結果を示す。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。 実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞に関する、Ｇ０／Ｇ１の細胞周期にある細胞の割合を示す。特に、図８１は、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した集団の結果を示す。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。 実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞に関する、Ｇ０／Ｇ１の細胞周期にある細胞の割合を示す。特に、図８１は、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した集団の結果を示す。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。 実施例１５のプロトコルに従って分化させた細胞集団に対する、ＥＤＵ処理の影響を示す。左手パネルは、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞に関する、Ｇ２／Ｍの細胞周期にある細胞の割合を示す。特に、左手パネルは、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した集団の結果を示す。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。１組のデータにおいて、これらの集団をＥＤＵでも処理した。右手パネルは、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、ＥＤＵ陽性である細胞の％を示す。 実施例１５のプロトコルに従って分化させた細胞集団に対する、ＥＤＵ処理の影響を示す。左手パネルは、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞に関する、Ｇ２／Ｍの細胞周期にある細胞の割合を示す。特に、左手パネルは、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した集団の結果を示す。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。１組のデータにおいて、これらの集団をＥＤＵでも処理した。右手パネルは、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、ＥＤＵ陽性である細胞の％を示す。 実施例１５のプロトコルに従って分化させた細胞集団に対する、ＥＤＵ処理の影響を示す。左手パネルは、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞に関する、Ｇ２／Ｍの細胞周期にある細胞の割合を示す。特に、左手パネルは、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した集団の結果を示す。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。１組のデータにおいて、これらの集団をＥＤＵでも処理した。右手パネルは、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、ＥＤＵ陽性である細胞の％を示す。 実施例１５のプロトコルで使用された、一般的な操作パラメーターを示す。 実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞の、ＥＤＵ取り込みの量を示す。特に、図８４は、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した、ＥＤＵインキュベートした細胞集団の結果を示す。（１）無溶媒、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。 実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞に関する、Ｇ０／Ｇ１の細胞周期にある細胞の割合を示す。特に、図８５は、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した集団の結果を示す。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。 実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞に関する、Ｓ期の細胞周期にある細胞の割合を示す。特に、図８６は、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した集団の結果を示す。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。 実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞に関する、Ｓ期の細胞周期にある細胞の割合を示す。特に、図８７は、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した集団の結果を示す。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。 実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図８８Ａは、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＣＤ９９、ＣＤ９、ＣＤＨ１、及びＣＤＨ２の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。 実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図８８Ｂは、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＣＸＤ２、ＣＥＲ１、ＣＸＣＲ４、及びＦＧＦ１７の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。 実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図８８Ｃは、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＦＧＦ４、ＦＯＸＡ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ６の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。 実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図８８Ｄは、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＧＳＣ、ＫＩＴ、ＭＩＸＬ１、及びＭＮＸ１の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。 実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図８８Ｅは、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＮＡＮＯＧ、ＯＴＸ２、ＰＯＵＦ５Ｆ１、及びＳＯＸ１７の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。 未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＳＯＸ７及びＴの遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。 実施例１６のプロトコルに従って外胚葉分化培地内で培養した多能性細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現パターンを示す。図８９に示すとおり、細胞は神経細胞系統に向かって分化した。特に、図８９の左パネルは、臍帯組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の遺伝子発現パターンを示す。図８９の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの遺伝子発現パターンを示す。 実施例１６のプロトコルに従って中胚葉分化培地内で培養した多能性細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現パターンを示す。図９０に示すように、細胞は心性細胞系統に向かって分化した。特に、図９０の左パネルは、臍帯組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の遺伝子発現パターンを示す。図９０の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの遺伝子発現パターンを示す。 実施例１６のプロトコルに従って外胚葉分化培地内で培養した多能性細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現パターンを示す。図９１に示すように、細胞は神経細胞系統に向かって分化した。特に、図９１の左パネルは、臍帯組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の遺伝子発現パターンを示す。図９１の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの遺伝子発現パターンを示す。 実施例１６のプロトコルに従って外胚葉分化培地内で３日間培養した多能性細胞の、ＦＡＣＳによって決定された、ＰＡＸ６、ＳＯＸ２、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４のたんぱく質発現パターンを示す。特に、図９２の左パネルは、臍帯組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株のＰＡＸ６、ＳＯＸ２、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４の発現パターンを示す。図９２の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンのＰＡＸ６、ＳＯＸ２、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４のたんぱく質発現パターンを示す。 実施例１６のプロトコルに従って中胚葉分化培地内で培養した多能性細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現パターンを示す。図９３に示すように、細胞は心性細胞系統に向かって分化した。特に、図９３の左パネルは、臍帯組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の遺伝子発現パターンを示す。図９３の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの遺伝子発現パターンを示す。 実施例１６のプロトコルに従って中胚葉分化培地内で分化させた、細胞の顕微鏡写真を示す。図９４に示すように、細胞は心性細胞系統に向かって分化した。特に、図９４の左手パネルは、分化の３日目、５日目、及び１０日目におけるＨ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの細胞の顕微鏡写真を示す。図９４の右手パネルは、分化から１０日後の臍帯組織細胞（ＵＴＣ ｉＰＳＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の顕微鏡写真を示す。 実施例１６のプロトコルに従って外胚葉分化培地内で分化させた、細胞の顕微鏡写真を示す。図９５に示すとおり、細胞は神経細胞系統に向かって分化した。特に、図９５の左手パネルは、分化の３日目、５日目、及び１０日目におけるＨ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの細胞の顕微鏡写真を示す。図９５の右手パネルは、分化から１０日後の臍帯組織細胞（ＵＴＣ ｉＰＣＳ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の顕微鏡写真を示す。 The foregoing summary, as well as the following detailed description, will be better understood when read in conjunction with the appended drawings. For the purpose of illustrating the invention, there are shown in the drawings embodiments of the invention. However, it should be understood that the invention is not limited to the precise configuration, examples, and instrumentalities shown.
Dispase® of human embryonic stem (“hES”) cell line H1 immediately after detachment (left hand panel) and after 24 hours under non-adhesive static culture (right hand panel) according to Example 1 A micrograph of the treated cells is shown. Cells after detachment (left hand panel) were similar to monolayer fragments with an average fragment diameter of about 20-30 micrometers, each fragment consisting of a mass of cells. Cells after 24 hours in non-adherent static cultures exhibited a population-like configuration. For Discase® treated cells of human embryonic stem cell line H1 after 4 days in 125 mL spinner flask containing 25 mL mTeSR® 1 medium according to Example 1 Flow cytometry results for CD9, SSEA4, CXCR4, TRA-1-60, and TRA-1-81 are shown. Cells exhibited little expression of CXCR4, a marker of differentiation, and high expression of markers of pluripotency (CD9, SSEA4, TRA-1-60, and TRA-1-81). The micrographs of cells treated with Dispase (registered trademark) of human embryonic stem cell line H1 at the end of stage 1 after 72 and 96 hours from differentiation are shown. Visible in FIG. 1c are loose cell aggregates at 4X magnification after 72 hours (left hand panel), 4X magnification after 96 hours (middle panel), and 10X magnification after 96 hours (right hand panel). . Shown are flow cytometry results of cells treated with Dispass® of human embryonic stem cell line H1 at the end of stage 1 differentiation for markers CD9, CD184 (CXCR4), and CD99 (see Example 1) about). As shown in FIG. 1d, expression of the pluripotency marker, CD9, was almost eliminated, while markers of definitive endoderm differentiation, CXCR4 (CD184) and CD99 were very high. Comparison of selected genes associated with pluripotency at the end of stage 1 compared to undifferentiated H1 (WA01) hES cells, and Discase® treated cells of human embryonic stem cell line H1 1 shows quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) results for the expression of genes associated with definitive endoderm (see Example 1). Cells at the end of stage 1 showed a dramatic decrease in the expression of pluripotency genes (CD9, NANOG, and POU5F1 / OCT4), and definitive endoderm (CXCR4, CERBERUS) compared to undifferentiated WA91 hES cells. (CER1), GSC, FOXA2, GATA4, GATA6, MNX1, and SOX17) showed a large increase in genes. FIG. 2 shows a photomicrograph of a Dispase® treated cell of the human embryonic stem cell line H1 when the cells are further differentiated from definitive endoderm to pancreatic endoderm (see Example 1). Differentiation from stage 2, day 1 (upper left hand panel) to stage 2, day 3 (upper right hand panel), stage 3, day 4 (lower left hand panel), and stage 4, day 1 (lower right hand panel) As it progresses, overt morphological changes to cells and cell populations are visible. Human embryonic stem cells for markers associated with pluripotency and differentiation after 2 days in agitated suspension culture after EDTA treatment and before transition to differentiation culture according to Example 2 Flow cytometry data for EDTA treated cells of strain H1 is shown. The data showed little expression of differentiation markers (CSCR4) and high expression of pluripotency markers (CD9, SSEA4, TRA-1-60, and TRA-1-81). Stage 1, 3 days cells grown in spinner flasks according to Example 2, and Stage 2, 2 days, Stage 4, 1 days, and Stage 4, grown in spinner flasks or Erlenmeyer flasks, The micrograph of the cell which the EDTA process of the human embryonic stem cell line H1 differentiated into the cell of the 3rd day is shown. Suspension differentiation cultures were globular aggregates that formed a nearly homogeneous and homogeneous population of cells. Flow cytometry data for EDTA-treated cells of human embryonic stem cell line H1 at the end of stage 1 for cell surface markers of pluripotency and endoderm differentiation are shown. As can be seen in FIG. 2c, the expression of the pluripotent marker, CD9, was almost eliminated, while the expression of the definitive endoderm differentiation marker, CXCR4 (CD184), was very high. Selected genes associated with pluripotency at the end of stage 1 compared to undifferentiated H1 (WA01) hES cells and definitive endoderm of EDTA-treated cells of the human embryonic stem cell line H1 Shown are qRT-PCR results for the expression of the associated gene (see Example 2). FIG. 2d shows decreased expression of pluripotency genes (CD9, Nanog, and POU5F1 / OCT4) and genes associated with definitive endoderm (CXCR4, CERBERUS (“CER1”), FOXA2, GATA4, GATA6, MNX1) And a large increase in SOX 17). A marker (NKX6.5) indicating differentiation of human embryonic stem cell line H1 differentiated from stage 1 into pancreatic endoderm by suspension in a spinner flask or Erlenmeyer flask according to Example 2 and treated with EDTA. 1, CDX2, SOX2, and chromagranin) flow cytometry data. Flow cytometry data show high levels of endocrine pancreatic markers such as high levels of NKX6.1, a transcription factor required for functional beta cells, and synaptophysin (data not shown) and chromagranin with both suspension formats. Show. A marker (NKX6.5) indicating differentiation of human embryonic stem cell line H1 differentiated from stage 1 into pancreatic endoderm by suspension in a spinner flask or Erlenmeyer flask according to Example 2 and treated with EDTA. 1, CDX2, SOX2, and chromagranin) flow cytometry data. Flow cytometry data show high levels of endocrine pancreatic markers such as high levels of NKX6.1, a transcription factor required for functional beta cells, and synaptophysin (data not shown) and chromagranin with both suspension formats. Show. A marker (NKX6.5) indicating differentiation of human embryonic stem cell line H1 differentiated from stage 1 into pancreatic endoderm by suspension in a spinner flask or Erlenmeyer flask according to Example 2 and treated with EDTA. 1, CDX2, SOX2, and chromagranin) flow cytometry data. Flow cytometry data show high levels of endocrine pancreatic markers such as high levels of NKX6.1, a transcription factor required for functional beta cells, and synaptophysin (data not shown) and chromagranin with both suspension formats. Show. A marker (NKX6.5) indicating differentiation of human embryonic stem cell line H1 differentiated from stage 1 into pancreatic endoderm by suspension in a spinner flask or Erlenmeyer flask according to Example 2 and treated with EDTA. 1, CDX2, SOX2, and chromagranin) flow cytometry data. Flow cytometry data show high levels of endocrine pancreatic markers such as high levels of NKX6.1, a transcription factor required for functional beta cells, and synaptophysin (data not shown) and chromagranin with both suspension formats. Show. Selection associated with differentiation of human embryonic stem cell line H1 further differentiated from stage 1 to pancreatic endoderm by suspension in spinner flask or Erlenmeyer flask according to Example 2 The result of qRT-PCR regarding the expression of the produced gene is shown. The data is compared to the expression of WA01 hES cells. RT-PCR results show high levels of pancreatic progenitor gene expression. FIG. 2 shows a photomicrograph of cells of human embryonic stem cell line H1 detached from static culture following treatment with Accutase®. As shown in FIG. 3a, the cells were removed from the surface as small aggregates. FIG. 2 shows phase contrast micrographs of cells of human embryonic stem cell line H1, exfoliated from static culture following treatment with Accutase®, and then grown in suspension culture for 3 days. Visible in FIG. 3b is the formation of a nearly uniform spherical population of cell populations. Photomicrograph of a cell conglomerate of human embryonic stem cell line H1 detached from static culture following treatment with Accutase® and then serially passaged using Accutase® separation Indicates. FIG. 2 shows micrographs of human embryonic stem cells cultured in suspension in cell line H1, using differentiation protocols directed at different stages of differentiation. Visible in FIG. 4a are micrographs of cells at each stage of differentiation. Figure 8 shows flow cytometry results for markers of differentiation of human embryonic stem cells cultured in suspension in cell line H1 (CXCR4, CD56, and PDX1) using directed differentiation protocols at different stages of differentiation. At the end of the differentiation process on stage 4, day 4, a high percentage of cells were positive for PDX1 expression. FIG. 5 shows non-fasting blood glucose levels of SCID-Bg mice transplanted with differentiated cells encapsulated in a TheraCyte ™ device. FIG. 6 shows flow cytometry data for markers associated with pluripotency and differentiation for cells treated with EDTA of human embryonic stem cell line H1 prior to transition to differentiation culture. As shown in FIG. 5a, high expression of pluripotency markers CD9, SSEA4, TRA-1-60, and TRA-1-80 was observed. FIG. 6 shows cellular phase contrast images and flow cytometry data for CXCR4 / CD184 and CD99 (markers of differentiation) and CD9 (pluripotency markers) for three different feeding settings at stage 1. The conditions tested were as follows: (A) Medium change 24 hours after the start of differentiation, no medium change at 48 hours, (B) Medium change 24 hours after the start of differentiation, and addition of a glucose block agent at 48 hours, and (C) Medium through stage 1 Glucose and GDF8 block agent are added 24 hours after the start of differentiation, and then glucose block agent is added 48 hours after the start. FIG. 6 shows a phase contrast image of differentiated cells exhibiting pancreatic endoderm morphology, differentiated using the following supply settings during definitive endoderm formation. (A) Medium change 24 hours after the start of differentiation, no medium change at 48 hours, (B) Medium change 24 hours after start of differentiation, and addition of a glucose block agent at 48 hours, and (C) Medium through stage 1 Glucose and GDF8 block agent are added 24 hours after the start of differentiation, and then glucose block agent is added 48 hours after the start. For pancreatic gene expression at the end of stage 4 (NKX6.1 and chromogranin) differentiated using the following supply settings, and selectable markers of differentiated cells non-pancreatic genes (CDX2 and SOX2) The results of flow cytometry are shown. (A) Medium change after 24 hours from the start of differentiation, no medium change after 48 hours. For pancreatic gene expression at the end of stage 4 (NKX6.1 and chromogranin) differentiated using the following supply settings, and selectable markers of differentiated cells non-pancreatic genes (CDX2 and SOX2) The results of flow cytometry are shown. (B) The medium was changed 24 hours after the start of differentiation, and a glucose block agent was added at 48 hours. For pancreatic gene expression at the end of stage 4 (NKX6.1 and chromogranin) differentiated using the following supply settings, and selectable markers of differentiated cells non-pancreatic genes (CDX2 and SOX2) The results of flow cytometry are shown. (C) During stage 1, the medium was not changed, and glucose and GDF8 block were added 24 hours after the start of differentiation, and glucose block was added 48 hours after the start. Shown are qRT-PCR results of selected pancreatic and non-pancreatic gene expression of differentiated cells at the end of stage 4, differentiated using the following feeding settings during definitive endoderm formation. (A) Medium change 24 hours after the start of differentiation, no medium change at 48 hours, (B) Medium change 24 hours after the start of differentiation, and addition of a glucose block agent at 48 hours, and (C) During stage 1 Added the glucose and GDF8 block at 24 hours after the start of differentiation, and added the glucose block at 48 hours after the start. Data are presented as the fold difference in expression compared to undifferentiated H1 (WA01) hES cells (1 baseline expression). Shown are qRT-PCR results of selected pancreatic and non-pancreatic gene expression of differentiated cells at the end of stage 4, differentiated using the following feeding settings during definitive endoderm formation. (A) Medium change 24 hours after the start of differentiation, no medium change at 48 hours, (B) Medium change 24 hours after the start of differentiation, and addition of a glucose block agent at 48 hours, and (C) During stage 1 Added the glucose and GDF8 block at 24 hours after the start of differentiation, and added the glucose block at 48 hours after the start. Data are presented as the fold difference in expression compared to undifferentiated H1 (WA01) hES cells (1 baseline expression). Shown are qRT-PCR results of selected pancreatic and non-pancreatic gene expression of differentiated cells at the end of stage 4, differentiated using the following feeding settings during definitive endoderm formation. (A) Medium change 24 hours after the start of differentiation, no medium change at 48 hours, (B) Medium change 24 hours after the start of differentiation, and addition of a glucose block agent at 48 hours, and (C) During stage 1 Added the glucose and GDF8 block at 24 hours after the start of differentiation, and added the glucose block at 48 hours after the start. Data are presented as the fold difference in expression compared to undifferentiated H1 (WA01) hES cells (1 baseline expression). Shown are qRT-PCR results of selected pancreatic and non-pancreatic gene expression of differentiated cells at the end of stage 4, differentiated using the following feeding settings during definitive endoderm formation. (A) Medium change 24 hours after the start of differentiation, no medium change at 48 hours, (B) Medium change 24 hours after the start of differentiation, and addition of a glucose block agent at 48 hours, and (C) During stage 1 Added the glucose and GDF8 block at 24 hours after the start of differentiation, and added the glucose block at 48 hours after the start. Data are presented as the fold difference in expression compared to undifferentiated H1 (WA01) hES cells (1 baseline expression). The expression of C peptide in SCID-Bg mice in which cells differentiated according to condition A (medium change 24 hours after the start of differentiation, no medium change at 48 hours) is shown. Five million cells were embedded under the kidney capsule of each SCID-Bg mouse. As shown in FIG. 5f, human C-peptide was detectable at a level exceeding 1 ng / mL by 12 weeks after implantation, and the average C-peptide level was 2.5 ng / mL at 16 weeks. Effect of glucose treatment on selected SCID-Bg mice with pre- and post-administration (eg, implantation) of cells differentiated according to Condition A (medium change 24 hours after initiation of differentiation, no media change at 48 hours) Indicates. As shown in FIG. 5g, glucose treatment induced a significant increase in circulating human C-peptide from an average of 0.93 ng / mL in the fasted state to 2.39 ng / mL in the fed state. Effect of administration of streptozotocin (STZ) on SCID-Bg mice (ie, STZ-induced diabetes) administered with cells differentiated according to condition A (medium change 24 hours after initiation of differentiation, medium change not 48 hours) Indicates. As is evident from FIG. 5h, animals with functional GSIS competent tissue grafts (ie, those that received cells) had normal blood glucose levels, unlike untreated controls that developed diabetes mellitus. Maintained. 2 shows a photomicrograph of cells of human embryonic stem cell line H1 grown on Cytodex® 3 microcarrier beads prior to differentiation. FIG. 3 shows micrographs of cells of the human embryonic stem cell line H1 grown on Cytodex® 3 microcarrier beads at various stages of differentiation. Plate in medium containing activin A (AA) and WNT3A (WTN3A / AA plate), microcarrier in medium containing activin A and WNT3A (WTN3A / AA microcarrier), medium containing MCX and GDF8 As a function of the number of days of differentiation for cells of human embryonic stem cell line H1 grown and differentiated in plates (MCX / GDF8 plates) and microcarriers in media containing MCX and GDF8 (MCX / GDF8 microcarriers) Cell count (cells / cm 2 ). Plate in medium containing activin A and WNT3A (WTN3A / AA plate), microcarrier in medium containing activin A and WNT3A (WTN3A / AA microcarrier), plate in medium containing MCX and GDF8 (MCX / GDF8 plates) and cell counts as a function of days of differentiation for cells of human embryonic stem cell line H1 grown and differentiated in microcarriers in media containing MCX and GDF8 (MCX / GDF8 microcarriers) ( Cells / mL). As a dot plot of cell expression of CXCR4 / CD184 (Y-axis) and CD9 (X-axis), (a) grown in microcarrier culture or planar culture in the presence of WNT3A and AA, or (2) MCX and GDF8 Also shown are flow cytometry results for the first stage of cell differentiation. As the total expression of each marker (CXCR4 and CD9), the first of differentiation of cells grown in microcarrier culture or planar culture in the presence of (a) WNT3A and AA, or (2) MCX and GDF8. Flow cytometry results for the stage are shown. Associated with differentiation of cells of human embryonic stem cell line H1 differentiated on microcarrier beads in planar culture or suspension culture in the presence of (a) WNT3A and AA, or (2) MCX and GDF8 The result of qRT-PCR regarding the expression of the selected gene is shown. FIG. 5 shows cell counts at various stages of differentiation in a bioreactor from stage 1, day 1 to stage 4, day 3 for cells differentiated according to the protocol of Example 7. FIG. Cell counts are shown as 1 million cells / mL as determined by image-based blood cell count (NucleoCounter®). Figure 6 shows average daily bioreactor medium pH levels as a function of time (days of differentiation) during the differentiation protocol of Example 7. The pH level was determined by NOVA BioProfile® FLEX (Nova Biomedical Corporation, Waltham, Mass.). Figure 7 shows average daily bioreactor medium lactate levels as a function of time (days of differentiation) during the differentiation protocol of Example 7. Lactic acid levels were determined by NOVA BioProfile® FLEX (Nova Biomedical Corporation, Waltham, Mass.). Figure 6 shows average daily bioreactor medium glucose levels as a function of time (days of differentiation) during the differentiation protocol of Example 7. Glucose levels were determined by NOVA BioProfile® FLEX (Nova Biomedical Corporation, Waltham, Mass.). QRT− of cells at stage 0, day 1 (ie, 24 hours after inoculation) differentiated according to the protocol of Example 7 for a pluripotent array containing a selection gene associated with pluripotency. Shown is undifferentiated gene expression as determined by PCR. Determined by qRT-PCR of stage 0, day 1 cells (ie, 24 hours after inoculation) for definitive endoderm (“DE”) arrays containing selectable genes associated with definitive endoderm, Shows undifferentiated gene expression (see Example 7). Undifferentiated genes determined by qRT-PCR of stage 0, day 3 cells (ie 72 hours after inoculation) for pluripotent arrays containing selection genes associated with pluripotency Expression is shown (see Example 7). FIG. 4 shows undifferentiated gene expression as determined by qRT-PCR of cells at stage 0, day 3 (ie 72 hours after inoculation) for a DE array containing a selection gene associated with DE. See Example 7). CD9, CD184 / CXCR4, SSEA4, TRA-1-60, and TRA-1-81 fluorescently active cell sorting (FACS) for undifferentiated stage 0, day 3 (ie 72 hours after inoculation) The results are shown (see Example 7). The results are also shown in Table 8. Determined by qRT-PCR for stage 0, day 1 (ie, 24 hours after inoculation) and stage 0, day 3 (ie, 72 hours after inoculation) cells differentiated according to the protocol of Example 7. Shows undifferentiated gene expression. In particular, FIG. 16 shows a moderate increase in GATA4, GSC, MIXL1, and T gene expression and a ≧ 100 × increase in GATA2 expression during the directed pre-differentiation stage 0 process. Cells differentiated according to the protocol of Example 7, stage 0, day 1 (ie 24 hours after inoculation) and stage 0, day 3 (ie 72 hours after inoculation) are associated with DE. Figure 3 shows undifferentiated gene expression as determined by qRT-PCR for DE arrays containing selected genes. In particular, FIG. 17 shows a ≧ 100 × increase in the expression of CER1, FGF17, and FGF4 during the directed pre-differentiation stage 0 process. FIG. 6 shows the gene expression of cells on stage 1 and day 1, differentiated according to the protocol of Example 7. FIG. FIG. 18 shows gene expression as determined by qRT-PCR for a pluripotency array containing selected genes associated with pluripotency for stage 1, day 1 cells. FIG. 18 shows significant changes in gene expression patterns such as an approximately 700x increase in FOXA2 expression and a 1000x increase in CER1, EOMES, FGF17, FGF4, GATA4, GATA6, GSC, MIXL1, and T expression. FIG. 5 shows the gene expression of cells on stage 1 and day 1, differentiated according to the protocol of Example 7. FIG. 19 shows gene expression as determined by qRT-PCR for DE arrays containing selected genes associated with DE for stage 1 day 1 cells. 19 shows significant changes in gene expression patterns, such as an approximately 700x increase in FOXA2 expression and a 1000x increase in CER1, EOMES, FGF17, FGF4, GATA4, GATA6, GSC, MIXL1, and T expression. FIG. 2 shows gene expression of cells on stage 1 and day 3, differentiated according to the protocol of Example 7. FIG. FIG. 20 shows gene expression as determined by qRT-PCR for a pluripotent array containing selected genes associated with pluripotency for stage 1, day 3 cells. FIG. 2 shows gene expression of cells on stage 1 and day 3, differentiated according to the protocol of Example 7. FIG. FIG. 21 shows gene expression as determined by qRT-PCR for DE arrays containing selected genes associated with DE for stage 1 and day 3 cells. FIG. 9 shows FACS results for CD9, CD184 (also known as CXCR4), and CD99 of stage 1, day 3 cells differentiated according to the protocol of Example 7. FIG. From the CD9 expression / CXCR4 negative pluripotent cell population at the start of differentiation (FIG. 15), homogenous CXCR4 expressing cells (98.3% of the cells are CXCR4 positive, ± 1.9 standard deviation) An almost complete transition to the population (Figure 22) was observed. QRT for a DE array containing selected genes associated with DE for stage 1, day 3, stage 2, day 1, stage 2, stage 3 cells differentiated according to the protocol of Example 7 -Shows gene expression as determined by PCR. FIG. 23 shows that HNF4a and GATA6 expression levels increased on stage 2, 1 and 3 days, while genes expressed at higher levels on stage 1 and 3 days (CXCR4, EOMES, FGF17, FGF4, MNX1, PRDM1, SOX17). , And VWF) showed reduced expression by the end of stage 2. FIG. 4 shows gene expression of foregut genes AFP, PDX1, and PROX1, as determined by qRT-PCR for stage 2, day 1 and stage 2, 3 day cells differentiated according to the protocol of Example 7. FIG. As shown in FIG. 24, the expression of these genes increased. FIG. 7 shows FACS results of PDX1, FOXA2, chromogranin, NKX2.2, and SOX2 of stage 3, day 3 cells (Table 7) grown in stage 3 medium, differentiated according to the protocol of Example 7. As shown in FIG. 25, cells were measured by PDX1 and FOXA2 expression (90.9% ± 11.9 standard deviation PDX1 positive, and 99.2% ± 0.6 standard deviation FOXA2 positive), internal A marker consistent with the germ layer pancreatic lineage was expressed. Determined by qRT-PCR for stage 4 arrays containing selected genes associated with stage 4 for stage 3, day 1 and stage 3, 3 day cells differentiated according to the protocol of Example 7. In addition, gene expression is shown. FIG. 26 shows hosts in which these cells are normally expressed in the pancreas (ARX, GAST, GCG, INS, ISL1, NEUROD1, NGN3, NKX2.2, NKX6.1, PAX4, PAX6, PTF1A, and SST). It shows an increased level of. The FACS results of NKX6.1, Chromagranin (CHGA), CDX2, SOX2, NKX2.2, PDX1, FOXA2, and NEUROD are shown for stage 4, day 3 cells differentiated according to the protocol of Example 7. As shown in FIG. 27, stage 4 and day 3 cells retain high levels of PDX1 and FOXA2 expression, pancreatic endocrine cells (28.1% ± 12.5 standard deviation chromagranin positive) and pancreatic progenitor cells The expression pattern consistent with mixing (in the case of NKX6.1, positive with 58.3% ± 9.7 standard deviation) was further developed. Stage 4 array containing selected genes associated with stage 4 for stage 3, day 3, stage 4, day 1 and stage 4, day 3 cells differentiated according to the protocol of Example 7 , Shows gene expression as determined by qRT-PCR. FIG. 28 shows an increase in genes normally expressed in the pancreas (ARX, GAST, GCG, IAPP, INS, ISL1, MAFB, NEUROD1, NGN3, NKX2.2, NKX6.1, PAX4, PAX6, PTF1A, and SST) Expression levels are indicated. Shown are average FACS results for NKX6.1, Chromagranin (CHGA), CDX2, SOX2, NKX2.2, PDX1, FOXA2, and NEUROD for stage 4, day 3 cells differentiated according to the protocol of Example 7. . In particular, FIG. 29 shows the average FACS expression pattern of pancreatic precursors generated on a 3L scale from different seed material lots. Shown are the average FACS results for NKX6.1, Chromagranin (CHGA), CDX2, SOX2, NKX2.2, PDX1, FOXA2, and NEUROD of stage 4, day 3 cells differentiated according to the protocol of Example 7. Prior to differentiation in stage 4 day 3 cells, cells were expanded to form ISM, then both were added to custom autologous medium “IH3” or Essential 8 ™ with 0.5% BSA added. In either of the cases, growth was carried out at stage 0. Cells grown in IH3 medium are “IH3-P growth cells” and cells grown in Essential8 ™ are “EZ8 growth cells”. No significant difference was observed in the expression pattern between cells grown in different media. Average FACS results for NKX6.1, Chromagranin (CHGA), CDX2, SOX2, NKX2.2, PDX1, FOXA2, and NEUROD of Stage 4, Day 3 cells pre-grown to different pH levels at Stage 0 Shown (see Example 7). No significant changes were observed in the stage 4 and day 3 cell profiles. NKX6.1, Chromagranin (CHGA), CDX2, SOX2 of stage 4, 3 day cells not treated with anti-form C, and stage 4, 3 day cells treated with anti-form C emulsion (94 ppm) , NKX2.2, PDX1, FOXA2, and NEUROD FACS results are compared (see Example 7). Anti-form C emulsion (Sigma, Cat # A8011) was not observed to affect cell profiles at stage 4 and 3 days. FIG. 9 shows gene expression as determined by qRT-PCR for selected genes of cells differentiated according to the protocol of Example 8. FIG. FIG. 33 shows gene expression as determined by qRT-PCR for selected genes in cells 24 hours prior to the start of differentiation (see Example 8). As shown in FIG. 33, cells from the bioreactor retain the expression of genes characteristic of pluripotency (POU5F1, NANOG, SOX2, and ZFP42), and genes characteristic of differentiation (AFP and FOXA2: Induction of <50-fold increase, FOXD3, GATA2, GATA4, GSC, HAND2, and T: <10-fold increased expression) was shown to be minimal or none. FIG. 9 shows gene expression as determined by qRT-PCR for selected genes of cells differentiated according to the protocol of Example 8. FIG. FIG. 33 shows gene expression as determined by qRT-PCR for selected genes in cells 24 hours prior to the start of differentiation (see Example 8). FIG. 34 shows gene expression as determined by qRT-PCR for selected genes in cells 24 hours after the start of differentiation. FIG. 9 shows gene expression as determined by qRT-PCR for selected genes of cells differentiated according to the protocol of Example 8. FIG. FIG. 33 shows gene expression as determined by qRT-PCR for selected genes in cells 24 hours prior to the start of differentiation (see Example 8). FIG. 35 shows gene expression determined by qRT-PCR for selected genes in cells 72 hours after the start of differentiation. FIG. 10 shows gene expression determined by qRT-PCR for selected genes of cells differentiated from stage 2 to stages 3 and 4 according to the protocol of Example 8. FIG. In particular, these figures show the gene expression of the cells on stage 1 day 1, stage 2 day 2, stage 2 day 3, stage 3 day 3 and, depending on the gene, stage 4 day 1 Indicates. FIG. 36 (a) shows the gene expression of AFP, ATOH1, and CDX2. FIG. 10 shows gene expression determined by qRT-PCR for selected genes of cells differentiated from stage 2 to stages 3 and 4 according to the protocol of Example 8. FIG. In particular, these figures show the gene expression of the cells on stage 1 day 1, stage 2 day 2, stage 2 day 3, stage 3 day 3 and, depending on the gene, stage 4 day 1 Indicates. FIG. 36 (b) shows gene expression of GAST, HAND1, HHEX, and HNF4a. FIG. 10 shows gene expression determined by qRT-PCR for selected genes of cells differentiated from stage 2 to stages 3 and 4 according to the protocol of Example 8. FIG. In particular, these figures show the gene expression of the cells on stage 1 day 1, stage 2 day 2, stage 2 day 3, stage 3 day 3 and, depending on the gene, stage 4 day 1 Indicates. FIG. 36 (c) shows gene expression of NKX2.2, NKX6.1, OSR1, and PDX1. FIG. 10 shows gene expression determined by qRT-PCR for selected genes of cells differentiated from stage 2 to stages 3 and 4 according to the protocol of Example 8. FIG. In particular, these figures show the gene expression of the cells on stage 1 day 1, stage 2 day 2, stage 2 day 3, stage 3 day 3 and, depending on the gene, stage 4 day 1 Indicates. FIG. 36 (d) shows gene expression of PROX1, PFT1a, SOX17, and SOX2. FIG. 10 shows gene expression determined by qRT-PCR for selected genes of cells differentiated from stage 2 to stages 3 and 4 according to the protocol of Example 8. FIG. In particular, these figures show the gene expression of the cells on stage 1 day 1, stage 2 day 2, stage 2 day 3, stage 3 day 3 and, depending on the gene, stage 4 day 1 Indicates. FIG. 36 (e) shows the gene expression of SOX9. Data are presented as the difference in expression compared to undifferentiated H1 (WA01) hES cells (1 baseline expression). FIG. 9 shows gene expression as determined by qRT-PCR for selected genes in stage 4 and day 3 cells of differentiation according to the protocol of Example 8. FIG. As shown in FIG. 37, at the end of stage 3 and day 3 differentiation, the cells become PDX1 (> 1 × 10 6 High expression levels of other pancreatic genes (ARX, GCG, GAST, INS, ISL, NEUROD1, NGN3, NKX2.2, NKX6.1, PAX4, PTF1a, and SST), And differentiated into pancreatic progenitor cells characterized by almost total loss of OCT4 / POU5F1 expression compared to undifferentiated H1 human embryonic stem cells. Figure 8 shows daily cell counts during the differentiation protocol according to Example 8. In particular, FIG. 38 shows cell density as a function of process date. FIG. 38 shows the cell counts of the differentiation protocol for two reactor runs (PRD1205 and PRD1207) run at pH 6.8 and 7.2. For comparison, a cell count of cell drift is also shown. Figure 2 illustrates the in vivo biological activity of stage 4, day 3 cells differentiated according to the protocol of Example 8 and implanted in SCID-Bg mice. Cells were implanted subcutaneously under the kidney capsule via the TheraCyte ™ device or after incubation in ultra-low attachment dishes. Mice were monitored every 4 weeks after graft implantation for blood glucose and C-peptide levels. FIG. 39 (a) shows 5 × 10 in the TheraCyte ™ device. 6 Or 10x10 6 The C-peptide levels after cell implantation at stage 4, day 3 are shown as a function of time. Figure 2 illustrates the in vivo biological activity of stage 4, day 3 cells differentiated according to the protocol of Example 8 and implanted in SCID-Bg mice. Cells were implanted subcutaneously under the kidney capsule via the TheraCyte ™ device or after incubation in ultra-low attachment dishes. Mice were monitored every 4 weeks after graft implantation for blood glucose and C-peptide levels. FIG. 39 (b) shows 5 × 10 in the TheraCyte ™ device. 6 Or 10x10 6 Figure 4 shows non-fasting glucose levels in animals after implantation of cells on stage 4, day 3. The mouse in FIG. 39 (b) was treated with STZ to ablate the β-cell function of the host prior to implantation. Figure 2 illustrates the in vivo biological activity of stage 4, day 3 cells differentiated according to the protocol of Example 8 and implanted in SCID-Bg mice. Cells were implanted subcutaneously under the kidney capsule via the TheraCyte ™ device or after incubation in ultra-low attachment dishes. Mice were monitored every 4 weeks after graft implantation for blood glucose and C-peptide levels. FIG. 39 (c) shows C-peptide levels produced after implantation of pre-chilled stage 4, day 3 cells in the TheraCyte ™ device as a function of time (weeks after implantation). . Figure 2 illustrates the in vivo biological activity of stage 4, day 3 cells differentiated according to the protocol of Example 8 and implanted in SCID-Bg mice. Cells were implanted subcutaneously under the kidney capsule via the TheraCyte ™ device or after incubation in ultra-low attachment dishes. Mice were monitored every 4 weeks after graft implantation for blood glucose and C-peptide levels. In FIG. 39 (d), kidney grafts that were implanted immediately after thawing (day 0) or one day after thawing (day 1) were never cryopreserved / fresh stage 4, day 3 cells. Compare the C-peptide levels of mice treated with cells stored on stage 4, day 3 or cryopreserved. FIG. 2 shows FACS plots of CXCR4, CD99, and CD9 of cells treated with MCX compound and GDF-8 (FIG. 40A) and differentiated for 3 days according to the protocol of Example 9 on stage 1, day 1. The figure shows that in suspension culture, the addition of 3 μM MCX in the absence of TGF-β family members on day 1 of differentiation resulted in 3 μM MCX + 100 ng / mL GDF-8 on day 1 or 20 ng / mL. It shows that definitive endoderm is produced at a level corresponding to that obtained when cells are treated with WNT-3a + 100 ng / mL of activin A. FIG. 6 shows FACS plots of CXCR4, CD99, and CD9 of cells treated with MCX alone (FIG. 40B) and differentiated for 3 days according to the protocol of Example 9 on stage 1 and day 1. The figure shows that in suspension culture, the addition of 3 μM MCX in the absence of TGF-β family members on day 1 of differentiation resulted in 3 μM MCX + 100 ng / mL GDF-8 on day 1 or 20 ng / mL. It shows that definitive endoderm is produced at a level corresponding to that obtained when cells are treated with WNT-3a + 100 ng / mL of activin A. CXCR4, CD99, and CD9 FACS plots of cells treated with WNT3A and activin A (FIG. 40C) and differentiated for 3 days according to the protocol of Example 9 on stage 1, day 1. The figure shows that in suspension culture, the addition of 3 μM MCX in the absence of TGF-β family members on day 1 of differentiation resulted in 3 μM MCX + 100 ng / mL GDF-8 on day 1 or 20 ng / mL. It shows that definitive endoderm is produced at a level corresponding to that obtained when cells are treated with WNT-3a + 100 ng / mL of activin A. FIG. 2 shows FACS plots of CXCR4, CD99, and CD9 of cells treated with WNT3A alone (FIG. 40D) and differentiated for 3 days according to the protocol of Example 9 on stage 1 and day 1. The figure shows that in suspension culture, the addition of 3 μM MCX in the absence of TGF-β family members on day 1 of differentiation resulted in 3 μM MCX + 100 ng / mL GDF-8 on day 1 or 20 ng / mL. It shows that definitive endoderm is produced at a level corresponding to that obtained when cells are treated with WNT-3a + 100 ng / mL of activin A. 41A and 41B show FACS plots of CXCR4, CD99, and CD9 for cells treated with various amounts of MCX on stage 1, day 1 and differentiated for 3 days according to the protocol of Example 10. In particular, cells were treated with 4 μM MCX (FIG. 41A) and 3 μM MCX (FIG. 41B) on stage 1 and day 1. FIGS. 41C and 41D show FACS plots of CXCR4, CD99, and CD9 for cells differentiated for 3 days according to the protocol of Example 10 treated with various amounts of MCX on stage 1, day 1. In particular, cells were treated with 2 μM MCX (FIG. 41C), 1.5 μM MCX (FIG. 41D) on stage 1 and day 1. 42A and 42B show FACS plots of CXCR4, CD99, and CD9 of cells differentiated for 3 days according to the protocol of Example 11. In particular, these figures show the role of medium exchange frequency under suspension culture. FIG. 42A shows a FACS plot of CXCR4, CD99, and CD9 for cells differentiated for 3 days according to the protocol of Example 10 with a complete medium change at stage 1. FIG. 42B shows a FACS plot of CXCR4, CD99, and CD9 for cells differentiated for 3 days according to the protocol of Example 10 without medium change on day 3. Data show that in a suspension culture system, a culture that undergoes medium exchange on the third day of differentiation (FIG. 42A) has an efficiency comparable to that of a culture that did not undergo medium exchange on the third day (FIG. 42B). Suggests that it has resulted in germ layers. 43A and 43B show FACS plots of CXCR4, CD99, and CD9 of cells differentiated for 3 days according to the protocol of Example 12. In particular, these figures show the role of GlutaMAX ™ in suspension culture. In stage 1, cells were cultured in medium supplemented with 1X GlutaMAX ™ (FIG. 43A) or in media without GlutaMAX ™ or any glutamine (0M GlutaMAX ™) (FIG. 43B). The data suggests that in suspension culture systems, the addition of GlutaMAX ™ does not appear to affect the efficiency with which definitive endoderm is produced. Figures 44A and 44B show the effect of varying amounts of sodium bicarbonate on cells differentiated according to the protocol of Example 13. 44A and 44B show the cells differentiated for 3 days according to the protocol of Example 13 with the addition of either 3.64 g / l (FIG. 44A) or 2.49 g / l (FIG. 44B) at stage 1. FACS plots for CXCR4, CD99, and CD9 are shown. Figures 44C and 44D show the effect of varying amounts of sodium bicarbonate on cells differentiated according to the protocol of Example 13. 44C and 44D show that cells that were differentiated for 3 days according to the protocol of Example 13 with either 3.64 g / l (FIG. 44C) or 2.49 g / l (FIG. 44D) added at stage 1. A phase-contrast micrograph is shown. For cells differentiated according to the protocol of Example 14, the daily cell count of cell density is shown as a function of differentiation. Cell counts were obtained using an image-based cytometer (NucleoCounter®). Figure 6 shows the average daily bioreactor medium pH level as a function of time (days of differentiation) during the differentiation protocol of Example 14. The pH level was determined by NOVA BioProfile® FLEX (Nova Biomedical Corporation, Waltham, Mass.). Figure 6 shows average daily bioreactor medium glucose levels as a function of time (days of differentiation) during the differentiation protocol of Example 14. Glucose levels were determined by NOVA BioProfile® FLEX (Nova Biomedical Corporation, Waltham, Mass.). Figure 6 shows average daily bioreactor medium lactate levels as a function of time (days of differentiation) during the differentiation protocol of Example 14. Lactic acid levels were determined by NOVA BioProfile® FLEX (Nova Biomedical Corporation, Waltham, Mass.). Of a pluripotent array containing selectable genes associated with pluripotency for stage 0, day 1-3 and stage 1, day 1-3 days cells differentiated according to the protocol of Example 14 FIG. 2 shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to undifferentiated cells. Associated with DE for cells at stage 0, 1-3 days, stage 1, days 1-3, and stage 2, days 1-3, differentiated according to the protocol of Example 14 FIG. 5 shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression of DE arrays containing selection genes compared to undifferentiated cells. FACS results of markers associated with pluripotency (CD184 / CXCR4, SSEA4, TRA-1-60, and TRA-1-81) for stage 0 cells prior to differentiation according to the protocol of Example 14 Indicates. In particular, FIG. 51 shows high expression of markers associated with pluripotency. FIG. 5 shows FACS plots of definitive endoderm markers CXCR4, CD99, and CD9 for cells differentiated to the end of stage 1 according to the protocol of Example 14. FIG. GAPDH, AFP, HHEX, HNF4α, PDX1, and PROX1 for stage 2, day 1, stage 2, day 2, and stage 2, day 3 cells differentiated according to the protocol of Example 14 FIG. 2 shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression versus differentiated cells. FIG. 53 shows an increase in the expression of foregut genes (AFP, HHEX, PDX1, and PROX1). GAPDH, AFP, CDX2, GAST, HNF4A, NKX2-2, OSR1 for Stage 2, Day 1 to Day 3 and Stage 3, Day 1 to Day 3 cells differentiated according to the protocol of Example 14 Figure 2 shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression of PDX1 and PFT1A versus undifferentiated cells. As shown in FIG. 54, PDX1 expression was 12,000 × relative to the control at the end of stage 2, 3 days, and 739,000 × relative to the control at the end of stage 3, 3 days. Increased by 60 times. QRT− as a fold expression level of a specific gene relative to undifferentiated cells for the cells of stage 3, 1-3 days and stage 4, 1 day-3 days differentiated according to the protocol of Example 14 Gene expression determined by PCR is shown. In particular, the top panel of FIG. 55 shows gene expression of GAPDH, AFP, ALB, ARX, CDX2, CHGA, GAST, GCG, IAAP, INS, ISL1, and MAFB. The lower panel of FIG. 55 shows the gene expression of MAFB, MUCS, NEUROD1, NEUROG3, NKX2-2, NKX6-1, PAX4, PDX1, POUSF1, PTF1A, SST, and Z1C1. FIG. 6 shows a micrograph of the last stage of cells differentiated according to the protocol of Example 14. FIG. Visible in FIG. 56 are representative photomicrographs (4 ×) of the cell population at stage 0 and at the end of stage 1-4 differentiation. Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. AFP (FIG. 57). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. CD99 (Figure 58). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. CD9 (Figure 59). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. CDH1 (Figure 60). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. CDH2 (FIG. 61). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. CDX2 (FIG. 62). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. CER1 (FIG. 63). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. CXCR4 (FIG. 64). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. FGF17 (Figure 65). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. FGF4 (Figure 66). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. FOXA (Figure 67). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. GADPH (FIG. 68). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. GATA4 (FIG. 69). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. GATA6 (FIG. 70). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. GSC (Figure 71). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. KIT (FIG. 72). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. MIXL1 (FIG. 73). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. MNX1 (FIG. 74). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. NANOG (Figure 75). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. OTX2 (FIG. 76). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. POUF5F1 (FIG. 77). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. SOX17 (Figure 78). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. SOX7 (Figure 79). Undifferentiated cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15 at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation of the following genes: Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression compared to the cells. T (Figure 80). The percentage of cells in the G0 / G1 cell cycle for cells after 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation according to various embodiments of the protocol of Example 15. Show. In particular, FIG. 81 shows the results of a population treated on one of the following six conditions on the first day of differentiation. (1) undiluted, (2) 3 μM MCX + 100 ng / mL GDF-8 (catalog number 120-00, Peprotech), (3) 3 μM MCX only, (4) 100 ng / mL GDF-8 only, (5 ) 20 ng / mL WNT-3A (Catalog Number 1324-WN-002, R & D Systems, MN) + 100 ng / mL Activin A (Catalog Number 338-AC, R & D Systems, MN), or (6) 20 ng / mL WNT -3A only. The percentage of cells in the G0 / G1 cell cycle for cells after 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation according to various embodiments of the protocol of Example 15. Show. In particular, FIG. 81 shows the results of a population treated on one of the following six conditions on the first day of differentiation. (1) undiluted, (2) 3 μM MCX + 100 ng / mL GDF-8 (catalog number 120-00, Peprotech), (3) 3 μM MCX only, (4) 100 ng / mL GDF-8 only, (5 ) 20 ng / mL WNT-3A (Catalog Number 1324-WN-002, R & D Systems, MN) + 100 ng / mL Activin A (Catalog Number 338-AC, R & D Systems, MN), or (6) 20 ng / mL WNT -3A only. The percentage of cells in the G0 / G1 cell cycle for cells after 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation according to various embodiments of the protocol of Example 15. Show. In particular, FIG. 81 shows the results of a population treated on one of the following six conditions on the first day of differentiation. (1) undiluted, (2) 3 μM MCX + 100 ng / mL GDF-8 (catalog number 120-00, Peprotech), (3) 3 μM MCX only, (4) 100 ng / mL GDF-8 only, (5 ) 20 ng / mL WNT-3A (Catalog Number 1324-WN-002, R & D Systems, MN) + 100 ng / mL Activin A (Catalog Number 338-AC, R & D Systems, MN), or (6) 20 ng / mL WNT -3A only. FIG. 9 shows the effect of EDU treatment on cell populations differentiated according to the protocol of Example 15. FIG. The left hand panel shows G2 / M for cells at 0, 6, 24, 30, 48 and 72 hours after differentiation according to various embodiments of the protocol of Example 15. Shows the percentage of cells in the cell cycle. In particular, the left hand panel shows the results of a population treated on one day of differentiation with one of the following six conditions. (1) undiluted, (2) 3 μM MCX + 100 ng / mL GDF-8 (catalog number 120-00, Peprotech), (3) 3 μM MCX only, (4) 100 ng / mL GDF-8 only, (5 ) 20 ng / mL WNT-3A (Catalog Number 1324-WN-002, R & D Systems, MN) + 100 ng / mL Activin A (Catalog Number 338-AC, R & D Systems, MN), or (6) 20 ng / mL WNT -3A only. In one set of data, these populations were also treated with EDU. The right hand panel shows EDU positive cells at 0, 6, 24, 30, 48 and 72 hours after differentiation according to various embodiments of the protocol of Example 15. %. FIG. 9 shows the effect of EDU treatment on cell populations differentiated according to the protocol of Example 15. FIG. The left hand panel shows G2 / M for cells at 0, 6, 24, 30, 48 and 72 hours after differentiation according to various embodiments of the protocol of Example 15. Shows the percentage of cells in the cell cycle. In particular, the left hand panel shows the results of a population treated on one day of differentiation with one of the following six conditions. (1) undiluted, (2) 3 μM MCX + 100 ng / mL GDF-8 (catalog number 120-00, Peprotech), (3) 3 μM MCX only, (4) 100 ng / mL GDF-8 only, (5 ) 20 ng / mL WNT-3A (Catalog Number 1324-WN-002, R & D Systems, MN) + 100 ng / mL Activin A (Catalog Number 338-AC, R & D Systems, MN), or (6) 20 ng / mL WNT -3A only. In one set of data, these populations were also treated with EDU. The right hand panel shows EDU positive cells at 0, 6, 24, 30, 48 and 72 hours after differentiation according to various embodiments of the protocol of Example 15. %. FIG. 9 shows the effect of EDU treatment on cell populations differentiated according to the protocol of Example 15. FIG. The left hand panel shows G2 / M for cells at 0, 6, 24, 30, 48 and 72 hours after differentiation according to various embodiments of the protocol of Example 15. Shows the percentage of cells in the cell cycle. In particular, the left hand panel shows the results of a population treated on one day of differentiation with one of the following six conditions. (1) undiluted, (2) 3 μM MCX + 100 ng / mL GDF-8 (catalog number 120-00, Peprotech), (3) 3 μM MCX only, (4) 100 ng / mL GDF-8 only, (5 ) 20 ng / mL WNT-3A (Catalog Number 1324-WN-002, R & D Systems, MN) + 100 ng / mL Activin A (Catalog Number 338-AC, R & D Systems, MN), or (6) 20 ng / mL WNT -3A only. In one set of data, these populations were also treated with EDU. The right hand panel shows EDU positive cells at 0, 6, 24, 30, 48 and 72 hours after differentiation according to various embodiments of the protocol of Example 15. %. The general operating parameters used in the protocol of Example 15 are shown. FIG. 6 shows the amount of EDU uptake of cells after 6, 24, 30, 48 and 72 hours of differentiation according to various embodiments of the protocol of Example 15. In particular, FIG. 84 shows the results of an EDU incubated cell population treated on one day of differentiation with one of the following six conditions. (1) No solvent, (2) 3 μM MCX + 100 ng / mL GDF-8 (catalog number 120-00, Peprotech), (3) 3 μM MCX only, (4) 100 ng / mL GDF-8 only, (5 ) 20 ng / mL WNT-3A (Catalog Number 1324-WN-002, R & D Systems, MN) + 100 ng / mL Activin A (Catalog Number 338-AC, R & D Systems, MN), or (6) 20 ng / mL WNT -3A only. The percentage of cells in the G0 / G1 cell cycle for cells after 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation according to various embodiments of the protocol of Example 15. Show. In particular, FIG. 85 shows the results of a population treated on one of the following six conditions on the first day of differentiation. (1) undiluted, (2) 3 μM MCX + 100 ng / mL GDF-8 (catalog number 120-00, Peprotech), (3) 3 μM MCX only, (4) 100 ng / mL GDF-8 only, (5 ) 20 ng / mL WNT-3A (Catalog Number 1324-WN-002, R & D Systems, MN) + 100 ng / mL Activin A (Catalog Number 338-AC, R & D Systems, MN), or (6) 20 ng / mL WNT -3A only. FIG. 6 shows the percentage of cells in the S-phase cell cycle for cells after 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation according to various embodiments of the protocol of Example 15. . In particular, FIG. 86 shows the results of the population treated on one of the following six conditions on the first day of differentiation. (1) undiluted, (2) 3 μM MCX + 100 ng / mL GDF-8 (catalog number 120-00, Peprotech), (3) 3 μM MCX only, (4) 100 ng / mL GDF-8 only, (5 ) 20 ng / mL WNT-3A (Catalog Number 1324-WN-002, R & D Systems, MN) + 100 ng / mL Activin A (Catalog Number 338-AC, R & D Systems, MN), or (6) 20 ng / mL WNT -3A only. FIG. 6 shows the percentage of cells in the S-phase cell cycle for cells after 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation according to various embodiments of the protocol of Example 15. . In particular, FIG. 87 shows the results of a population treated on one of the following six conditions on the first day of differentiation. (1) undiluted, (2) 3 μM MCX + 100 ng / mL GDF-8 (catalog number 120-00, Peprotech), (3) 3 μM MCX only, (4) 100 ng / mL GDF-8 only, (5 ) 20 ng / mL WNT-3A (Catalog Number 1324-WN-002, R & D Systems, MN) + 100 ng / mL Activin A (Catalog Number 338-AC, R & D Systems, MN), or (6) 20 ng / mL WNT -3A only. Contrast with undifferentiated cells at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation for cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15. Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression. FIG. 88A shows the gene expression of CD99, CD9, CDH1, and CDH2 determined by qRT-PCR as fold expression compared to undifferentiated cells. The data underlying FIGS. 88A-88F is shown in FIGS. 58-67 and 69-80. Contrast with undifferentiated cells at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation for cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15. Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression. FIG. 88B shows the gene expression of CXD2, CER1, CXCR4, and FGF17 determined by qRT-PCR as fold expression compared to undifferentiated cells. The data underlying FIGS. 88A-88F is shown in FIGS. 58-67 and 69-80. Contrast with undifferentiated cells at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation for cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15. Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression. FIG. 88C shows gene expression of FGF4, FOXA, GATA4, and GATA6 determined by qRT-PCR as fold expression compared to undifferentiated cells. The data underlying FIGS. 88A-88F is shown in FIGS. 58-67 and 69-80. Contrast with undifferentiated cells at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation for cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15. Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression. FIG. 88D shows GSC, KIT, MIXL1, and MNX1 gene expression determined by qRT-PCR as fold expression versus undifferentiated cells. The data underlying FIGS. 88A-88F is shown in FIGS. 58-67 and 69-80. Contrast with undifferentiated cells at 0 hours, 6 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, and 72 hours after differentiation for cells differentiated according to various embodiments of the protocol of Example 15. Shows gene expression as determined by qRT-PCR as fold expression. FIG. 88E shows gene expression of NANOG, OTX2, POUF5F1, and SOX17 determined by qRT-PCR as fold expression compared to undifferentiated cells. The data underlying FIGS. 88A-88F is shown in FIGS. 58-67 and 69-80. Figure 2 shows the gene expression of SOX7 and T determined by qRT-PCR as fold expression compared to undifferentiated cells. The data underlying FIGS. 88A-88F is shown in FIGS. 58-67 and 69-80. FIG. 6 shows gene expression patterns determined by qRT-PCR of pluripotent cells cultured in ectoderm differentiation medium according to the protocol of Example 16. FIG. As shown in FIG. 89, the cells differentiated towards the neural cell lineage. In particular, the left panel of FIG. 89 shows the gene expression pattern of an induced pluripotent stem cell line generated from umbilical cord tissue cells (UTC). The right panel of FIG. 89 shows the gene expression pattern of the WB0106 subclone of the H1 hES cell line. FIG. 6 shows gene expression patterns determined by qRT-PCR of pluripotent cells cultured in mesoderm differentiation medium according to the protocol of Example 16. FIG. As shown in FIG. 90, the cells differentiated toward the cardiac cell lineage. In particular, the left panel of FIG. 90 shows the gene expression pattern of an induced pluripotent stem cell line generated from umbilical cord tissue cells (UTC). The right panel of FIG. 90 shows the gene expression pattern of the WB0106 subclone of the H1 hES cell line. FIG. 6 shows gene expression patterns determined by qRT-PCR of pluripotent cells cultured in ectoderm differentiation medium according to the protocol of Example 16. FIG. As shown in FIG. 91, the cells differentiated towards the neural cell lineage. In particular, the left panel of FIG. 91 shows the gene expression pattern of an induced pluripotent stem cell line generated from umbilical cord tissue cells (UTC). The right panel of FIG. 91 shows the gene expression pattern of the WB0106 subclone of the H1 hES cell line. FIG. 6 shows protein expression patterns of PAX6, SOX2, and POU5F1 / OCT4 as determined by FACS of pluripotent cells cultured in ectoderm differentiation medium for 3 days according to the protocol of Example 16. In particular, the left panel of FIG. 92 shows the expression pattern of PAX6, SOX2, and POU5F1 / OCT4 derived pluripotent stem cell lines generated from umbilical cord tissue cells (UTC). The right panel of FIG. 92 shows the protein expression pattern of PAX6, SOX2 and POU5F1 / OCT4 of the WB0106 subclone of the H1 hES cell line. FIG. 6 shows gene expression patterns determined by qRT-PCR of pluripotent cells cultured in mesoderm differentiation medium according to the protocol of Example 16. FIG. As shown in FIG. 93, the cells differentiated toward the cardiac cell lineage. In particular, the left panel of FIG. 93 shows the gene expression pattern of an induced pluripotent stem cell line generated from umbilical cord tissue cells (UTC). The right panel of FIG. 93 shows the gene expression pattern of the WB0106 subclone of the H1 hES cell line. FIG. 2 shows a photomicrograph of cells differentiated in mesoderm differentiation medium according to the protocol of Example 16. FIG. As shown in FIG. 94, the cells differentiated toward the cardiac cell lineage. In particular, the left hand panel of FIG. 94 shows photomicrographs of cells of the WB0106 subclone of the H1 hES cell line on days 3, 5 and 10 of differentiation. The right hand panel of FIG. 94 shows a photomicrograph of an induced pluripotent stem cell line generated from umbilical cord tissue cells (UTC iPSC) 10 days after differentiation. FIG. 2 shows a photomicrograph of cells differentiated in ectoderm differentiation medium according to the protocol of Example 16. FIG. As shown in FIG. 95, the cells differentiated toward the neural cell lineage. In particular, the left hand panel of FIG. 95 shows photomicrographs of cells of the WB0106 subclone of the H1 hES cell line on days 3, 5 and 10 of differentiation. The right hand panel of FIG. 95 shows a photomicrograph of an induced pluripotent stem cell line generated from umbilical cord tissue cells (UTC iPCS) 10 days after differentiation.

本出願は、凝集細胞集団において、内胚葉前駆細胞、膵内分泌細胞、中胚葉細胞、又は外胚葉細胞への分化のための多能性を維持する、胚性幹細胞及び他の多能性細胞の調製を目的とする。開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、「発明を実施するための形態」を、本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を説明又は例示する下記の小項目に分割する。   This application relates to embryonic stem cells and other pluripotent cells that maintain pluripotency for differentiation into endoderm progenitor cells, pancreatic endocrine cells, mesoderm cells, or ectoderm cells in an aggregated cell population. For the purpose of preparation. For purposes of clarity of disclosure, without limitation, the “DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION” is divided into the following subsections that illustrate or illustrate specific features, embodiments, or applications of the invention. .

定義
幹細胞は、単一細胞レベルでの自己再生能及び分化能の両方によって定義される未分化細胞である。幹細胞は、自己再生前駆細胞、非再生性前駆細胞、及び最終分化細胞を含む子孫細胞を生成することができる。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）からさまざまな細胞系統の機能的細胞へと生体外で分化する能力を特徴とする。幹細胞は、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞に注入後、実質的に（全てではないとしても）ほとんどの組織に寄与する。 Definitions Stem cells are undifferentiated cells defined by both self-renewal ability and differentiation ability at the single cell level. Stem cells can generate progeny cells including self-renewing progenitor cells, non-regenerative progenitor cells, and terminally differentiated cells. Stem cells are also characterized by the ability to differentiate in vitro from multiple germ layers (endoderm, mesoderm, and ectoderm) into functional cells of various cell lines. Stem cells give rise to multiple germ layer tissues after transplantation, and contribute substantially to most (if not all) tissues after injection into blastocysts.

幹細胞は、それらの発生上の潜在性によって分類される。「細胞培養」又は「培養」とは、全般的には、生体から取得され、制御条件下で増殖される（「培養下の」又は「培養される」）細胞を指す。「初代細胞培養」は、最初の継代培養の前に、生物から直接取得された細胞、組織、又は器官の培養である。細胞は、細胞成長及び細胞分裂のいずれか又は両方を促進する条件下で成長培地内に定置される場合に、培養下で増殖して、より大きな細胞の集団を生じさせる。細胞を培養下で増殖させる場合、細胞増殖の速度は、その細胞の数が倍加するために必要な時間量によって測定される場合がある（倍加時間と称する）。   Stem cells are classified according to their developmental potential. “Cell culture” or “culture” generally refers to cells obtained from a living organism and grown under controlled conditions (“under culture” or “incubated”). A “primary cell culture” is a culture of cells, tissues or organs obtained directly from an organism prior to the first subculture. Cells proliferate in culture to give a larger population of cells when placed in growth media under conditions that promote either or both cell growth and cell division. When cells are grown in culture, the rate of cell growth may be measured by the amount of time required for the number of cells to double (referred to as doubling time).

「増殖」は、本明細書で使用される場合、培養によって多能性幹細胞の数を、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７５％、９０％、１００％、２００％、５００％、１０００％以上など、及びこれらのパーセンテージ以内のレベルの分、増加させるプロセスである。単一の多能性幹細胞から得ることのできる多能性幹細胞の数は、多能性幹細胞の増殖能力に依存することが理解される。多能性幹細胞の増殖能力は、細胞の倍加時間、すなわち、細胞が培養下で有糸分裂を受けるために必要とされる時間、及び多能性幹細胞が未分化の状態で維持され得る期間（継代数に、それぞれの継代間の日数を掛けた数に等しい）によって計算され得る。   “Proliferation” as used herein reduces the number of pluripotent stem cells by at least about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 75%, 90%, 100%, 200%, 500%, 1000% or more, and the like, and levels that are within these percentages. It is understood that the number of pluripotent stem cells that can be obtained from a single pluripotent stem cell depends on the proliferative ability of the pluripotent stem cell. The proliferative capacity of a pluripotent stem cell is determined by the cell doubling time, i.e., the time required for the cell to undergo mitosis in culture, and the period during which the pluripotent stem cell can be maintained in an undifferentiated state ( The number of passages multiplied by the number of days between each passage.

分化は、特殊化されていない（「未拘束の」）又は比較的特殊化されていない細胞が、神経細胞又は筋細胞などの特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化細胞又は分化誘導された細胞とは、細胞の系統内でより特化した（「拘束された」）位置にある細胞である。分化プロセスに適用された際の用語「拘束された」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合への分化を続け、かつ通常の環境下で異なる細胞型に分化したり、又は低分化細胞型に戻ったりすることができない地点まで、分化経路において進行した細胞を指す。「脱分化」は、細胞が細胞の系統系内で比較的特殊化されて（又は拘束されて）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞の系統は、その細胞の遺伝性、すなわち、その細胞がどの細胞に由来するか、またその細胞がどのような細胞を生じさせ得るかを規定する。細胞の系統は、発達及び分化の遺伝スキームの範囲内で、その細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、拘束されていない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。   Differentiation is the process by which unspecialized (“unconstrained”) or relatively unspecialized cells acquire the characteristics of specialized cells such as nerve cells or muscle cells. A differentiated cell or cell that has been induced to differentiate is a cell that is in a more specialized (“restrained”) position within the lineage of cells. The term “constrained” when applied to the differentiation process continues to differentiate into a specific cell type or a subset of cell types under normal circumstances and differentiate into different cell types under normal circumstances. Or cells that have progressed in the differentiation pathway to a point where they cannot return to a poorly differentiated cell type. “Dedifferentiation” refers to the process by which a cell returns to a less specialized (or constrained) situation within the cell lineage. As used herein, the lineage of a cell defines the heritability of the cell, that is, from which cell the cell is derived and what cells it can give rise to. A cell lineage is one that positions the cell within the genetic scheme of development and differentiation. Lineage-specific markers refer to features that are specifically associated with the phenotype of cells of the target lineage and can be used to assess the differentiation of unrestrained cells into the target lineage. .

本明細書で使用するとき「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。これに関して、差異的発現とは、未分化細胞と比べて、陽性マーカーについては増殖したレベルを意味し、陰性マーカーについては減少したレベルを意味する。検出可能なレベルのマーカー核酸又はポリペプチドは、他の細胞と比較して対象とする細胞内で十分高く又は低く、そのため当該技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。   As used herein, a “marker” is a nucleic acid or polypeptide molecule that is differentially expressed in a cell of interest. In this regard, differential expression means increased levels for positive markers and reduced levels for negative markers compared to undifferentiated cells. The detectable level of the marker nucleic acid or polypeptide is sufficiently high or low in the cell of interest compared to other cells, and thus can be determined using any of a variety of methods known in the art. Cells can be identified and distinguished from other cells.

本明細書で使用するとき、細胞は、特異的マーカーが細胞内で十分に検出されたとき、特異的マーカー「について陽性」又は「陽性」である。同様に、細胞は、特異的マーカーが細胞内で十分に検出されないとき、特異的マーカー「について陰性」又は「陰性」である。とりわけ、ＦＡＣＳによる陽性は通常２％を超えるが、ＦＡＣＳによる陰性閾値は通常１％を下回る。ＰＣＲによる陽性は通常３４周期（Ｃｔｓ）を下回るが、ＰＣＲによる陰性は通常３４．５周期を超える。   As used herein, a cell is “positive” or “positive” for a specific marker when the specific marker is fully detected in the cell. Similarly, a cell is “negative” or “negative” for a specific marker when the specific marker is not fully detected in the cell. In particular, positive by FACS is usually above 2%, but negative threshold by FACS is usually below 1%. PCR positives are usually below 34 cycles (Cts), while PCR negatives are usually above 34.5 cycles.

本明細書で使用するとき、「細胞密度」及び「播種密度」は、本明細書において互換的に使用され、固体又は半固体平面又は湾曲基質の単位面積あたりに播種された細胞の数を指す。   As used herein, “cell density” and “seed density” are used interchangeably herein and refer to the number of cells seeded per unit area of a solid or semi-solid planar or curved substrate. .

本明細書で使用するとき、「懸濁培養」は、表面に接着するよりもむしろ、培地内で懸濁された細胞の培養、単一細胞、又は集団を指す。   As used herein, “suspension culture” refers to a culture, single cell, or population of cells suspended in a medium, rather than attached to a surface.

本明細書で使用するとき、「無血清」は、ヒト又は動物血清を欠くことを指す。したがって、無血清培養培地は、血清又は血清の部分を含まない。   As used herein, “serum free” refers to the lack of human or animal serum. Thus, a serum-free culture medium does not contain serum or a portion of serum.

細胞培養での多能性幹細胞の機能的膵内分泌細胞への分化を複製する試みにおいて、分化プロセスは、しばしばいくつかの連続したステージを通して進行していると見なされる。本明細書で使用するとき、さまざまなステージは、培養時間、及び本明細書に含まれる実施例において説明される試薬によって定義される。   In an attempt to replicate the differentiation of pluripotent stem cells into functional pancreatic endocrine cells in cell culture, the differentiation process is often considered to proceed through several successive stages. As used herein, the various stages are defined by the incubation time and reagents described in the examples included herein.

本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する。ＦＯＸＡ２（肝細胞核因子３−β（ＨＮＦ３β）としても知られる）、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ケルベロス、ＯＴＸ２、短尾奇形、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１。胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーは、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７を含む。したがって、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７の発現で特徴付けられ得る。加えて、細胞がステージ１に留まることができる時間の長さに応じて、ＨＮＦ４αにおける増加が観察され得る。   As used herein, “definitive endoderm” refers to cells that originate from the upper blastoder layer during gastrulation and retain the characteristics of the cells forming the gastrointestinal tract and its derivatives. Definitive endoderm cells express at least one of the following markers. FOXA2 (also known as hepatocyte nuclear factor 3-β (HNF3β)), GATA4, GATA6, MNX1, SOX17, CXCR4, Kerberos, OTX2, short tail malformation, goosecoid, C-Kit, CD99, and MIXL1. Markers characteristic of definitive endoderm cells include CXCR4, FOXA2, and SOX17. Thus, definitive endoderm cells can be characterized by the expression of CXCR4, FOXA2, and SOX17. In addition, an increase in HNF4α can be observed depending on the length of time that the cells can remain at stage 1.

本明細書で使用するとき、「膵内分泌細胞」とは、以下のホルモンのうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す。インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、及び膵臓ポリペプチド。これらのホルモンに加え、膵内分泌細胞に得直的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、及びＰＡＸ６のうちの１つ又は２つ以上を含む。β細胞に特徴的なマーカーを発現する膵内分泌細胞は、インスリン及び以下の転写因子の少なくとも１つによって特徴付けられ得る。ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮｕｅｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６。   As used herein, “pancreatic endocrine cell” refers to a cell capable of expressing at least one of the following hormones. Insulin, glucagon, somatostatin, ghrelin, and pancreatic polypeptide. In addition to these hormones, markers that are direct to pancreatic endocrine cells include one or more of NGN3, NeuroD1, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, ARX, NKX2.2, and PAX6 . Pancreatic endocrine cells that express markers characteristic of β cells can be characterized by insulin and at least one of the following transcription factors. PDX1, NKX2.2, NKX6.1, NueroD1, ISL1, HNF3β, MAFA, PAX4, and PAX6.

本明細書では、「ｄ１」、「ｄ １」、及び「１日目」、「ｄ２」、「ｄ ２」、及び「２日目」、「ｄ３」、「ｄ ３」及び「３日目」などは互換的に使用される。これらの数字の組み合わせは、本願の段階的分化プロトコル中の異なるステージにおけるインキュベーションの特定の日を指す。   In this specification, “d1”, “d1”, and “day 1”, “d2”, “d2”, and “second day”, “d3”, “d3”, and “third day” Are used interchangeably. These number combinations refer to specific days of incubation at different stages in the staged differentiation protocol of the present application.

「グルコース」及び「Ｄ−グルコース」は、本明細書で互換的に使用され、天然に一般に見出される糖、デキストロースを指す。   “Glucose” and “D-glucose” are used interchangeably herein and refer to the sugar commonly found in nature, dextrose.

膵内分泌前駆細胞において発現されるたんぱく質及びそれをコードする遺伝子を特定する「ＮｅｕｒｏＤ」及び「ＮｅｕｒｏＤ１」は、本明細書で互換的に使用される。   “NeuroD” and “NeuroD1”, which identify proteins expressed in pancreatic endocrine precursor cells and the genes that encode them, are used interchangeably herein.

「ＬＤＮ」及び「ＬＤＮ−１９３１８９」は、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡからＳＴＥＭＯＬＥＣＵＬＥ（商標）の商標で入手可能なＢＭＰ受容体阻害剤である、（（６−（４−（２−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン，塩酸；ＤＭ−３１８９））を指す。   “LDN” and “LDN-193189” are described in Stemgent, Inc. ((6- (4- (2- (piperidin-1-yl) ethoxy) phenyl) -3- (pyridine) is a BMP receptor inhibitor available from Cambridge, MA, USA under the trademark STEMOLECULE ™. -4-yl) pyrazolo [1,5-a] pyrimidine, hydrochloric acid; DM-3189)).

多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞は、指定されたＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１抗体の１つ又は２つ以上を発現し得る（Ｔｈｏｍｓｏｎｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜１１４７）。生体外での多能性幹細胞の分化は、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１の発現の喪失をもたらす。未分化の多能性幹細胞は、典型的には、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）によって記載されるようにＶｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｒｅｄを基質として現像することによって検出することができる、アルカリホスファターゼ活性を有する。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、一般にＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。 Isolation, proliferation and culture of pluripotent stem cells Pluripotent stem cells can express one or more of the designated TRA-1-60 and TRA-1-81 antibodies (Thomson et al., 1998, Science 282: 1145 to 1147). Differentiation of pluripotent stem cells in vitro results in loss of expression of TRA-1-60 and TRA-1-81. Undifferentiated pluripotent stem cells are typically obtained from Vector® Red as described by the manufacturer (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, Calif.) After fixing the cells with 4% paraformaldehyde. Has alkaline phosphatase activity which can be detected by developing as a substrate. Undifferentiated pluripotent stem cells also generally express OCT4 and TERT, as detected by RT-PCR.

増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の３胚葉のすべての細胞に分化する能力である。幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（「ＳＣＩＤ」）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれらの３胚葉由来の細胞型の根拠について組織学的に調べることによって確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に対して評価することにより決定することができる。   Another desirable phenotype of expanded pluripotent stem cells is the ability to differentiate into all three germ layers of endoderm, mesoderm, and ectoderm tissue. Stem cell pluripotency is achieved, for example, by injecting cells into severe combined immunodeficiency (“SCID”) mice, fixing the teratomas formed with 4% paraformaldehyde, and then cell types derived from these three germ layers. It can be confirmed by histological examination of the grounds. Alternatively, pluripotency can be determined by forming an embryoid body and evaluating this embryoid body for the presence of markers associated with the three germ layers.

増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用して核型を決定し、次いで確立された、対応する霊長類種の核型と比較することができる。細胞は「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体がすべて揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。多能性細胞は、さまざまなフィーダー層を用いて、又はマトリックスたんぱく質被覆した容器を用いて、容易に培養で増殖させることができる。あるいは、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）のような明確な培地との組み合わせで、化学的に明確な表面を、細胞の常用増殖のために使用してよい。   Proliferated pluripotent stem cell lines can be karyotyped using standard G-band methods and then compared to the established primate species karyotype. It is desirable for cells to acquire cells with a “normal karyotype”, which means that the cells are euploid, have all human chromosomes and have no noticeable changes. means. Pluripotent cells can be easily grown in culture using various feeder layers or using a matrix protein coated container. Alternatively, a chemically defined surface in combination with a defined medium such as mTeSR® 1 medium (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada) may be used for routine growth of cells.

本発明のいくつかの実施形態の方法に従った懸濁培養下での培養は、細胞の生存及び増殖を促進するが分化を制限する細胞密度で、培養容器内に多能性幹細胞を播種することによって達成される。典型的に、細胞の未分化を維持する播種密度が使用される。幹細胞の単一細胞懸濁液も播種され得るが、細胞の小さな集団が有利であり得ることが理解されよう。   Culturing in suspension culture according to the methods of some embodiments of the invention seeds pluripotent stem cells in a culture vessel at a cell density that promotes cell survival and proliferation but limits differentiation. Is achieved. Typically, a seeding density that maintains undifferentiated cells is used. It will be appreciated that a single cell suspension of stem cells can also be seeded, but a small population of cells can be advantageous.

懸濁培養下にある間、栄養素及び成長因子の十分かつ一定の供給を多能性幹細胞に提供するために、培養培地は、毎日、又は１〜５日毎といった所定のスケジュールで交換又は補充され得る。多能性幹細胞の大きな集団は、細胞分化を引き起こし得るため、大きな多能性幹細胞凝集体を回避するための手段が取られ得る。本発明のいくつかの実施形態に従って、形成された多能性幹細胞集団は、例えば、２〜７日毎に分離され、単一細胞又は細胞の小さな塊は追加の培養容器内に分割される（すなわち、継代される）か、又は同一の培養容器内に保持され、交換又は追加の培養培地で処理される。   To provide a pluripotent stem cell with a sufficient and constant supply of nutrients and growth factors while in suspension culture, the culture medium can be changed or supplemented daily or on a predetermined schedule, such as every 1-5 days. . Since a large population of pluripotent stem cells can cause cell differentiation, steps can be taken to avoid large pluripotent stem cell aggregates. In accordance with some embodiments of the invention, the formed pluripotent stem cell population is separated, for example, every 2-7 days, and single cells or small masses of cells are divided into additional culture vessels (ie, Or maintained in the same culture vessel and treated with a replacement or additional culture medium.

遠心分離から生じる多能性幹細胞のペレットを含む、大きな多能性幹細胞の塊は、酵素消化及び機械的分離のいずれか又は両方を受け得る。多能性幹細胞の塊の酵素消化は、ＩＶ型コラゲナーゼ、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）、又はＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）等の酵素に塊をさらすことによって実行され得る。大きな多能性幹細胞の塊の機械的分離は、塊を所定のサイズに破断するように設計されたデバイスを使用して実行され得る。加えて、又は別の方法として、機械的分離は、針又はピペットを使用して手動で実行され得る。   Large pluripotent stem cell clusters, including pellets of pluripotent stem cells resulting from centrifugation, can undergo either or both enzymatic digestion and mechanical separation. Enzymatic digestion of pluripotent stem cell mass can be performed by exposing the mass to an enzyme such as type IV collagenase, Dispase®, or Accutase®. Mechanical separation of large pluripotent stem cell clumps can be performed using a device designed to break the clumps to a predetermined size. Additionally or alternatively, the mechanical separation can be performed manually using a needle or pipette.

本発明のいくつかの実施形態の方法に従った、懸濁において多能性幹細胞を培養するために使用される培養容器は、その中で培養される多能性幹細胞が、そのような表面に接着又は結合することができないように設計された内部表面を有する任意の組織培養容器（例えば、多能性幹細胞を培養するために好適な純度等級を有するもの）であり得る（例えば、表面への結合又は接着を防ぐために非組織培養処理した容器）。好ましくは、計測可能な培養を得るために、本発明のいくつかの実施形態に従った培養は、温度、撹拌、ｐＨ、及び酸素などの培養パラメーターが、好適なデバイスを使用して自動的に監視及び制御される、制御下の培養系（好ましくは、コンピュータで制御される培養系）を使用して達成される。所望の培養パラメーターが決定されると、系は、多能性幹細胞の増殖及び分化を増すために必要とされる培養パラメーターの自動調整のために設定され得る。   A culture vessel used to culture pluripotent stem cells in suspension, according to the method of some embodiments of the present invention, wherein the pluripotent stem cells cultured therein are on such a surface. It can be any tissue culture vessel (eg, having a suitable purity grade for culturing pluripotent stem cells) having an internal surface that is designed to be unable to adhere or bind (eg, to the surface) Non-tissue culture treated container to prevent binding or adhesion). Preferably, in order to obtain a measurable culture, the culture according to some embodiments of the present invention is such that culture parameters such as temperature, agitation, pH, and oxygen are automatically determined using a suitable device. This is accomplished using a controlled culture system (preferably a computer controlled culture system) that is monitored and controlled. Once the desired culture parameters are determined, the system can be set up for automatic adjustment of the culture parameters needed to increase proliferation and differentiation of pluripotent stem cells.

多能性幹細胞は、複数の継代に渡ってそれらの増殖性、多能性能力、及び核型安定性を維持しながら、動的条件下（すなわち、多能性幹細胞が懸濁培養内にある間、一定の運動（を受ける条件下（例えば、撹拌懸濁培養系））、又は非動的条件下（すなわち、静的培養）で培養され得る。   Pluripotent stem cells maintain their proliferative, pluripotent ability, and karyotypic stability over multiple passages, while the pluripotent stem cells are in suspension culture. For some time, it can be cultured under constant movement (under conditions (eg, stirred suspension culture system)) or non-dynamic conditions (ie, static culture).

多能性幹細胞の非動的培養について、多能性幹細胞は、コーティングされた又はされていない、ペトリ皿、Ｔフラスコ、ＨｙｐｅｒＦｌａｓｋ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、ＣｅｌｌＳｔａｃｋｓ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、又はＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ（ＮＵＮＣ（商標）Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（商標）Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ））内で培養され得る。多能性幹細胞の動的培養について、多能性幹細胞は、スピナーフラスコ又は三角フラスコ、ステンレス鋼、ガラス又は単一使用プラスチック振とう器又は撹拌槽などの好適な容器内で培養され得る。培養容器は、制御ユニットに接続され、それにより制御された培養系を提供し得る。培養容器（例えば、スピナーフラスコ又は三角フラスコ）は、連続的又は断続的に撹拌され得る。好ましくは、培養容器は、多能性幹細胞を懸濁状態に維持するために十分に撹拌される。   For non-dynamic culture of pluripotent stem cells, pluripotent stem cells are coated or uncoated, Petri dishes, T-flasks, HyperFlash® (Corning Incorporated, Corning, NY), CellStacks® (Corning Incorporated, Corning, NY), or Cell Factories (NUNC ™ Cell Factory ™ Systems (Thermo Fisher Scientific, Inc., Pittsburgh, PA)). For dynamic culture of pluripotent stem cells, the pluripotent stem cells can be cultured in a suitable container such as a spinner flask or Erlenmeyer flask, stainless steel, glass or a single use plastic shaker or stirrer. The culture vessel may be connected to a control unit and thereby provide a controlled culture system. Culture vessels (eg, spinner flasks or Erlenmeyer flasks) can be stirred continuously or intermittently. Preferably, the culture vessel is sufficiently agitated to maintain the pluripotent stem cells in suspension.

多能性幹細胞は、成長及び増殖を促進するために十分な栄養素及び環境的刺激を提供する、任意の培地内で培養され得る。好適な培地は、Ｅ８（商標）、ＩＨ３、及びｍＴｅＳＲ（登録商標）１、又はＴｅＳＲ（登録商標）２を含む。培地は、栄養素供給を補充し、細胞の副産物を除去するために、定期的に変更され得る。本発明のいくつかの実施形態に従って、培養培地は毎日変更される。   Pluripotent stem cells can be cultured in any medium that provides sufficient nutrients and environmental stimuli to promote growth and proliferation. Suitable media include E8 (TM), IH3, and mTeSR (R) 1, or TeSR (R) 2. The medium can be changed periodically to replenish the nutrient supply and remove cellular byproducts. According to some embodiments of the invention, the culture medium is changed daily.

多能性幹細胞の供給源
本発明の方法では、任意の多能性幹細胞が使用され得る。使用が可能な多能性幹細胞の例示の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば、胚盤胞など）、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）又はヒト胚生殖細胞の樹立株であり、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（米国ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）などである。フィーダー細胞の非存在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。 Source of pluripotent stem cells Any pluripotent stem cell may be used in the method of the present invention. Exemplary types of pluripotent stem cells that can be used include pre-embryonic tissues collected at any time during pregnancy (although not usually before about 10-12 weeks of gestation) (eg, Pluripotent cells derived from tissues formed after pregnancy, such as blastocysts, embryonic tissues or fetal tissues. Non-limiting examples are human embryonic stem cells (hESCs) or established lines of human embryonic germ cells, such as human embryonic stem cell lines H1, H7, and H9 (WiCell Research Institute, Madison, Wis., USA). is there. Also suitable are cells harvested from a pluripotent stem cell population already cultured in the absence of feeder cells.

また、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、及びＺＦＰ４２など多数の多能性に関係する転写因子の強制発現を用いて、成体体細胞から誘導することができる誘導性多能性細胞（ＩＰＳ）又は再プログラム化された多能性細胞も好適である（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，２０１１，１２：１６５〜１８５）。本発明の方法に使用されるヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎらによって記述されたように調製してもよい（米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５〜１１４７、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９９８，３８：１３３〜１６５、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９５，９２：７８４４〜７８４８）。また、例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，Ｇａ．）などの変異体ヒト胚性幹細胞株、又は例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３１：１〜１２（２００７）に開示されている細胞などの成人ヒト体性細胞に由来する細胞も好適である。本発明での使用に好適な多能性幹細胞は、Ｌｉｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４：１６〜１９，２００９）、Ｍａｈｅｒａｌｉｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １：５５〜７０，２００７）、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：２３０〜２４０）、Ｎａｋａｇａｗａｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：１０１〜１０６，２００８）、Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ １３１：８６１〜８７２，２００７）、及び米国特許出願公開第２０１１−０１０４８０５号に記載された方法に従って誘導され得る。多能性幹細胞の他の供給源は、誘導された多能性細胞（ＩＰＳ，Ｃｅｌｌ，１２６（４）：６６３〜６７６）を含む。本発明の方法における使用のために好適な細胞の他の供給源は、ヒト臍帯組織由来細胞、ヒト羊水由来細胞、ヒト胎盤由来細胞、及びヒト単為生殖生物を含む。一実施形態において、臍帯組織由来細胞は米国特許第７，５１０，８７３号の方法を使用して得られ得、その開示は、それが細胞の隔離及び特性評価に関連するために、参照によりその全体が組み込まれる。別の実施形態において、胎盤組織由来細胞は、米国出願公開第２００５／００５８６３１号の方法を使用して得られ得、その開示は、それが細胞の隔離及び特性評価に関連するために、参照によりその全体が組み込まれる。別の実施形態において、羊水由来細胞は、米国出願公開第２００７／０１２２９０３号の方法を使用して得られ得、その開示は、それが細胞の隔離及び特性評価に関連するために、参照によりその全体が組み込まれる。   Also, inducible pluripotent cells (IPS) or regenerative cells that can be derived from adult somatic cells using forced expression of numerous pluripotency-related transcription factors such as OCT4, NANOG, Sox2, KLF4, and ZFP42. Programmed pluripotent cells are also suitable (Annu Rev Genomics Hum Genet, 2011, 12: 165-185). Human embryonic stem cells used in the methods of the present invention may be prepared as described by Thomson et al. (US Pat. No. 5,843,780, Science, 1998, 282: 1114-1147, Curr Top). Dev Biol 1998, 38: 133-165, Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92: 7844-7848). In addition, for example, a mutant human embryonic stem cell line such as BG01v (BresaGen, Athens, Ga.) Or the like, for example, Takahashi et al. Also suitable are cells derived from adult human somatic cells, such as the cells disclosed in Cell 131: 1-12 (2007). Pluripotent stem cells suitable for use in the present invention are described in Liet al. (Cell Stem Cell 4: 16-19, 2009), Maheralit al. (Cell Stem Cell 1: 55-70, 2007), Stadtfeldt al. (Cell Stem Cell 2: 230-240), Nakagawa et al. (Nature Biotechnology 26: 101-106, 2008), Takahashi et al. (Cell 131: 861-872, 2007), and may be derived according to the methods described in US Patent Application Publication No. 2011-0104805. Other sources of pluripotent stem cells include induced pluripotent cells (IPS, Cell, 126 (4): 663-676). Other sources of cells suitable for use in the methods of the present invention include human umbilical cord tissue-derived cells, human amniotic fluid-derived cells, human placenta-derived cells, and human parthenogenetic organisms. In one embodiment, umbilical cord tissue-derived cells can be obtained using the method of US Pat. No. 7,510,873, the disclosure of which is incorporated by reference as it relates to cell sequestration and characterization. The whole is incorporated. In another embodiment, placental tissue-derived cells can be obtained using the method of US Application Publication No. 2005/0058631, the disclosure of which is incorporated by reference as it relates to cell sequestration and characterization. The whole is incorporated. In another embodiment, amniotic fluid-derived cells can be obtained using the method of US Application Publication No. 2007/0122903, the disclosure of which is incorporated by reference as it relates to cell sequestration and characterization. The whole is incorporated.

多能性幹細胞の特性は当業者には周知であり、多能性幹細胞の更なる特性が引き続き同定されている。多能性幹細胞マーカーとして、例えば、以下のうちの１つ又は２つ以上（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は全て）の発現が挙げられる。ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１。一実施形態において、本発明の方法での使用に好適な多能性幹細胞は、フローサイトメトリーによって検出される、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１のうちの１つ又は２つ以上（例えば、１、２、３、又は全て）を発現し、分化のマーカーＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４としても知られる）の発現を欠く。別の実施形態において、本発明の方法における使用のために好適な多能性幹細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって検出される、ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４のうちの１つ又は２つ以上（例えば、１、２、又は全て）を発現する。   The properties of pluripotent stem cells are well known to those skilled in the art, and further properties of pluripotent stem cells have been identified. As pluripotent stem cell markers, for example, one or more of the following (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or all ) Expression. ABCG2, clipto, FOXD3, CONEXIN43, CONEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81. In one embodiment, a pluripotent stem cell suitable for use in the method of the invention is one of CD9, SSEA4, TRA-1-60, and TRA-1-81, detected by flow cytometry. Or express two or more (eg, 1, 2, 3, or all) and lack expression of the differentiation marker CXCR4 (also known as CD184). In another embodiment, pluripotent stem cells suitable for use in the methods of the invention are one or more of CD9, NANOG, and POU5F1 / OCT4 detected by RT-PCR (eg, , 1, 2, or all).

例示的な多能性幹細胞として、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。一実施形態では、多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞、例えば、Ｈ１ ｈＥＳ細胞である。代替の実施形態において、非胚性起源の多能性幹細胞が使用され得る。   Exemplary pluripotent stem cells include human embryonic stem cell line H9 (NIH code: WA09), human embryonic stem cell line H1 (NIH code: WA01), human embryonic stem cell line H7 (NIH code: WA07), and human Embryonic stem cell line SA002 (Cellartis, Sweden). In one embodiment, the pluripotent stem cell is a human embryonic stem cell, eg, an H1 hES cell. In an alternative embodiment, pluripotent stem cells of non-embryonic origin can be used.

多能性幹細胞から膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の分化
多能性幹細胞の増殖
本発明は、以下に記載される実施形態のいくつかにおいて、幹細胞の隔離及び培養、特に動的懸濁培養系において多能性を保持する幹細胞集団の培養に関する。多能性細胞集団は、機能的β細胞を産生するように分化され得る。 Differentiation of cells expressing markers characteristic of pancreatic endoderm lineage from pluripotent stem cells Proliferation of pluripotent stem cells The invention relates to the cultivation of a stem cell population that retains pluripotency in a typical suspension culture system. A pluripotent cell population can be differentiated to produce functional β cells.

本発明の方法で使用される多能性幹細胞は、好ましくは、所望の終点に向けた分化の前に、動的懸濁培養下で増殖される。有利なことに、多能性幹細胞は、多能性を損失することなく、好適な培地内に懸濁状態で細胞の集団として培養され、増殖され得ることが発見されている。そのような培養は、多能性の損失を防ぐために、細胞又は細胞集団が十分に移植させられ続ける、動的懸濁培養系内で生じ得る。有用な動的懸濁培養系は、撹拌、振とう、再循環、又は培地を通したガスのバブリングなどを介して、培養内容物を撹拌するための手段を備えた系を含む。そのような撹拌は、増殖を促進し、早期分化を防ぐための細胞集団の十分な運動が維持される限り、断続的又は連続的であってよい。好ましくは、撹拌は、特定の速度で回転する羽根車などを介する連続的撹拌を含む。羽根車は、円形又は平坦な底部を有してよい。羽根車の撹拌速度は、集団が懸濁状態に維持され、沈降が最小化されるようなものであるべきである。更に、羽根車ブレードの角度は、沈降を回避するための細胞及び集団の上方運動を補助するために、調整され得る。また、羽根車の型、角度、及び回転速度は全て、細胞及び集団が均一なコロイド懸濁液のようなものにあるように調整され得る。   The pluripotent stem cells used in the methods of the invention are preferably grown in dynamic suspension culture prior to differentiation towards the desired endpoint. Advantageously, it has been discovered that pluripotent stem cells can be cultured and expanded as a population of cells in suspension in a suitable medium without loss of pluripotency. Such culture can occur in a dynamic suspension culture system in which cells or cell populations continue to be fully transplanted to prevent loss of pluripotency. Useful dynamic suspension culture systems include systems equipped with means for agitating the culture contents, such as by agitation, shaking, recirculation, or bubbling gas through the medium. Such agitation may be intermittent or continuous as long as sufficient movement of the cell population is maintained to promote proliferation and prevent premature differentiation. Preferably, the agitation includes continuous agitation such as through an impeller rotating at a specific speed. The impeller may have a circular or flat bottom. The impeller agitation speed should be such that the population is maintained in suspension and settling is minimized. Furthermore, the angle of the impeller blades can be adjusted to assist the upward movement of cells and populations to avoid settling. Also, the impeller mold, angle, and rotational speed can all be adjusted so that the cells and populations are in a uniform colloidal suspension.

多能性幹細胞集団の懸濁培養及び増殖は、使い捨て可能なプラスチック、再利用可能なプラスチック、ステンレス鋼又はガラス容器、例えば、スピナーフラスコ又は三角フラスコなどの適した動的培養系に、静的培養した幹細胞を移植することによって達成され得る。例えば、接着性静的環境、すなわち、プレート又は皿表面で培養した幹細胞は、まずキレート剤又は酵素で処理することによって表面から除去され得る。好適な酵素として、限定するものではないが、Ｉ型コラゲナーゼ、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＬＬＣ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、又はＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＬＬＣ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）の商標名で販売される商業的に入手可能な製剤が挙げられる。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）は、コラーゲン分解性又はたんぱく分解酵素（甲殻類から隔離される）を含み、哺乳類又は細菌由来の産物を含有しない、細胞剥離液である。したがって、一実施形態において、酵素は、コラーゲン分解酵素若しくはたんぱく分解酵素、又はコラーゲン分解及びたんぱく質分解酵素を含む細胞剥離液である。好適なキレート剤としては、限定するものではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞培養は、好ましくは、群体の縁部が丸まって持ち上がり始めるまで、ただし培養表面からの群体の完全な剥離の前に、酵素又はキレート剤と共にインキュベートされる。一実施形態において、細胞培養は室温でインキュベートされる。一実施形態において、細胞は、２０℃を超える、２５℃を超える、３０℃を超える、又は３５℃を超える温度で、例えば、約２０℃〜約４０℃の間、約２５℃〜約４０℃の間、約３０℃〜約４０℃の間の温度、例えば、約３７℃で、インキュベートされる。一実施形態において、細胞は、少なくとも約１、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０分間、例えば、約１〜約３０分の間、約５〜約３０分の間、約１０〜約２５分の間、約１５〜約２５分の間、例えば、約２０分間、インキュベートされる。一実施形態において、この方法は、処理の後に細胞培養から酵素又はキレート剤を除去する工程を含む。一実施形態において、細胞培養は、酵素又はキレート剤の除去の後、１度又は２度以上洗浄される。一実施形態において、細胞培養は、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）などの適切な培養培地で洗浄される。一実施形態において、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（例えば、Ｙ−２７６３２，Ａｘｘｏｒａカタログ番号ＡＬＸ−２７０−３３３，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、約１〜約１００μＭ、約１〜９０μＭ、約１〜約８０μＭ、約１〜約７０μＭ、約１〜約６０μＭ、約１〜約５０μＭ、約１〜約４０μＭ、約１〜約３０μＭ、約１〜約２０μＭ、約１〜約１５μＭ、約１〜約１０μＭ、又は約１０μＭの濃度であってよい。一実施形態において、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、少なくとも１μＭ、少なくとも５μＭ、又は少なくとも１０μＭ添加される。細胞は、スクレーパ又はゴム製ポリスマンで静的培養系の表面から剥離され得る。培地及び細胞は、ガラスピペット又は他の好適な手段を使用して動的培養系に移植され得る。好ましい実施形態において、動的培養系内の培地は、毎日変更される。   Suspension culture and growth of pluripotent stem cell populations can be performed by static culture in a suitable dynamic culture system such as disposable plastic, reusable plastic, stainless steel or glass containers such as spinner flasks or Erlenmeyer flasks. Can be achieved by transplanting the stem cells. For example, an adherent static environment, i.e. stem cells cultured on a plate or dish surface, can be removed from the surface by first treating with a chelating agent or enzyme. Suitable enzymes include, but are not limited to, type I collagenase, Dispase® (Sigma Aldrich LLC, St. Louis, MO), or Accutase® (Sigma Aldrich LLC, St. Louise, MO). Commercially available formulations sold under the trade name Accutase (R) is a cell detachment fluid that contains collagen-degrading or proteolytic enzymes (isolated from crustaceans) and does not contain mammalian or bacterial-derived products. Thus, in one embodiment, the enzyme is a collagen degrading enzyme or proteolytic enzyme or a cell detachment solution comprising collagen degrading and proteolytic enzymes. Suitable chelating agents include, but are not limited to, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). In some embodiments, the pluripotent stem cell culture is preferably incubated with an enzyme or chelating agent until the rim of the colon begins to curl up and before complete detachment of the colony from the culture surface . In one embodiment, the cell culture is incubated at room temperature. In one embodiment, the cells are at a temperature above 20 ° C, above 25 ° C, above 30 ° C, or above 35 ° C, such as between about 20 ° C and about 40 ° C, between about 25 ° C and about 40 ° C. During incubation at a temperature between about 30 ° C. and about 40 ° C., for example at about 37 ° C. In one embodiment, the cells are at least about 1, at least about 5, at least about 10, at least about 15, at least about 20 minutes, such as between about 1 and about 30 minutes, between about 5 and about 30 minutes, Incubate for 10 to about 25 minutes, for about 15 to about 25 minutes, for example for about 20 minutes. In one embodiment, the method includes removing the enzyme or chelator from the cell culture after treatment. In one embodiment, the cell culture is washed once or more after removal of the enzyme or chelating agent. In one embodiment, the cell culture is washed with a suitable culture medium, such as mTeSR® 1 (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada). In one embodiment, a Rho kinase inhibitor (eg, Y-27632, Axxora catalog number ALX-270-333, San Diego, CA). Rho kinase inhibitors are from about 1 to about 100 μM, from about 1 to 90 μM, from about 1 to about 80 μM, from about 1 to about 70 μM, from about 1 to about 60 μM, from about 1 to about 50 μM, from about 1 to about 40 μM, from about 1 to about The concentration may be about 30 μM, about 1 to about 20 μM, about 1 to about 15 μM, about 1 to about 10 μM, or about 10 μM. In one embodiment, the Rho kinase inhibitor is added at least 1 μM, at least 5 μM, or at least 10 μM. Cells can be detached from the surface of the static culture system with a scraper or rubber policeman. Media and cells can be transplanted into a dynamic culture system using a glass pipette or other suitable means. In preferred embodiments, the medium in the dynamic culture system is changed daily.

本発明は、一実施形態において、三次元の懸濁培養内で多能性幹細胞を培養し、増殖させる方法を提供する。とりわけ、この方法は、これらの多能性幹細胞の凝集細胞集団を形成することによって、多能性幹細胞の培養及び増殖をもたらす。細胞集団は、細胞を培養する前に、酵素（例えば、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）などの中性プロテアーゼ）又はキレート剤で多能性幹細胞培養を処理した結果として形成し得る。細胞は、好ましくは、撹拌又は振とうされる懸濁培養系内で培養され得る。一実施形態において、本発明は、多能性幹細胞のそのような集団から、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成を更に提供する。   In one embodiment, the present invention provides a method of culturing and expanding pluripotent stem cells in a three-dimensional suspension culture. In particular, this method results in the culture and expansion of pluripotent stem cells by forming an aggregated cell population of these pluripotent stem cells. A cell population can be formed as a result of treating a pluripotent stem cell culture with an enzyme (eg, a neutral protease such as Dispase®) or a chelating agent prior to culturing the cells. The cells can preferably be cultured in suspension culture systems that are agitated or shaken. In one embodiment, the present invention further provides the formation of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm lineage from such populations of pluripotent stem cells.

好ましくは、細胞集団は、凝集多能性幹細胞である。凝集幹細胞は、多能性の１つ又は２つ以上のマーカー、例えば、マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、又は全て）を発現し、分化に関する１つ又は２つ以上のマーカーの発現を欠く（例えば、ＣＸＣＲ４の発現を欠く）。一実施形態において、凝集幹細胞は、多能性のマーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１を発現し、分化に関するマーカーＣＸＣＲ４の発現を欠く。   Preferably, the cell population is aggregated pluripotent stem cells. Aggregated stem cells can be one or more markers of pluripotency, such as one or more of the markers CD9, SSEA4, TRA-1-60, and TRA-1-81 (eg, 1, 2, 3 Or all) and lacks expression of one or more markers for differentiation (eg, lacks expression of CXCR4). In one embodiment, the aggregated stem cells express the pluripotent markers CD9, SSEA4, TRA-1-60, and TRA-1-81 and lack the expression of the marker CXCR4 for differentiation.

一実施形態は、懸濁培養内で多能性幹細胞を細胞集団として培養する方法である。細胞集団は、動的撹拌又は振とうされる懸濁培養系において培養された、凝集多能性幹細胞である。細胞集団は、中性プロテアーゼ、例えば、Ｄｉｓｐａｓｅなどの酵素を細胞の剥離剤として使用して、平面接着培養から撹拌又は振とうされる懸濁培養系へ移植され得る。例示的な好適な酵素としては、限定されるものではないが、ＩＶ型コラゲナーゼ、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）、又はＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）が挙げられる。細胞は、撹拌又は振とうされる懸濁培養系において、特に撹拌される懸濁培養系において、多能性を維持する。   One embodiment is a method of culturing pluripotent stem cells as a cell population in suspension culture. Cell populations are aggregated pluripotent stem cells cultured in a suspension culture system that is dynamically agitated or shaken. The cell population can be transplanted from a flat adhesion culture to a stirred or shaken suspension culture system using a neutral protease, eg, an enzyme such as Dispase, as a cell stripper. Exemplary suitable enzymes include, but are not limited to, type IV collagenase, Dispase®, or Accutase®. Cells maintain pluripotency in suspension culture systems that are agitated or shaken, particularly in suspension culture systems that are agitated.

本発明の別の実施形態は、懸濁培養内で多能性幹細胞を細胞集団として培養する方法であって、細胞集団は、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡを使用して平面接着培養から移植され、撹拌又は振とうされる懸濁培養系内で培養される、凝集多能性幹細胞である。細胞集団は、撹拌又は振とうされる懸濁培養系、特に撹拌される（動的に撹拌される）懸濁培養系で多能性を維持する。   Another embodiment of the invention is a method of culturing pluripotent stem cells as a cell population in suspension culture, wherein the cell population is transplanted from a planar adhesion culture using a chelating agent, such as EDTA, Aggregated pluripotent stem cells that are cultured in a suspension culture system that is agitated or shaken. The cell population maintains pluripotency in a suspension culture system that is agitated or shaken, particularly a suspension culture system that is agitated (dynamically agitated).

本発明の別の実施形態は、懸濁培養内で多能性幹細胞を細胞集団として培養する方法であって、細胞集団は、酵素Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を使用して平面接着培養から移植され、撹拌又は振とうされる懸濁培養系内で培養される、凝集多能性幹細胞である。細胞集団は、動的に撹拌される懸濁培養系で多能性を維持する。   Another embodiment of the invention is a method of culturing pluripotent stem cells as a cell population in suspension culture, wherein the cell population is transplanted from a planar adhesion culture using the enzyme Accutase®, Aggregated pluripotent stem cells that are cultured in a suspension culture system that is agitated or shaken. The cell population maintains pluripotency in a dynamically stirred suspension culture system.

本発明の細胞集団は、心性細胞などの中胚葉細胞、神経細胞などの外胚葉細胞、単一ホルモン陽性細胞、又は膵臓内胚葉細胞に分化し得る。この方法は、分化、例えば、膵臓内胚葉細胞の膵臓前駆細胞及び膵臓ホルモン発現細胞への分化を更に含み得る。別の実施形態において、膵臓前駆細胞は、β細胞転写因子ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現によって特性化される。   The cell population of the present invention can differentiate into mesodermal cells such as cardiac cells, ectodermal cells such as nerve cells, single hormone positive cells, or pancreatic endoderm cells. The method can further include differentiation, eg, differentiation of pancreatic endoderm cells into pancreatic progenitor cells and pancreatic hormone-expressing cells. In another embodiment, pancreatic progenitor cells are characterized by expression of the beta cell transcription factors PDX1 and NKX6.1.

一実施形態において、分化の工程は、懸濁培養系において少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、少なくとも１６８時間、少なくとも１９６時間以上、好ましくは約４８時間〜約７２時間後に実行される。分化は、実施例に記載されるもののような、培地成分のステージ式の進行を使用して実行され得る（例えば、表Ａ、並びに表１ａ及び１ｃを参照のこと）。   In one embodiment, the step of differentiation is at least 12 hours, at least 24 hours, at least 36 hours, at least 48 hours, at least 72 hours, at least 96 hours, at least 120 hours, at least 144 hours, at least 168 hours in a suspension culture system. For at least 196 hours, preferably from about 48 hours to about 72 hours. Differentiation can be performed using a staged progression of media components, such as those described in the Examples (see, eg, Table A and Tables 1a and 1c).

好ましい実施形態において、三次元の細胞集団は、平面接着培養下で多能性幹細胞を成長させることと、多能性幹細胞を凝集細胞集団に増殖させることと、酵素又はキレート剤を使用して、多能性幹細胞の集団を平面接着培養から動的懸濁培養へ移植することと、によって産生される。更に好ましい実施形態は、平面接着培養系内で多能性幹細胞を成長させることと、多能性幹細胞を凝集細胞集団に増殖させることと、酵素又はキレート剤を使用して、多能性幹細胞の集団を平面接着培養から動的懸濁培養へ移植することと、動的撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞集団を分化させて、膵臓前駆細胞集団を生成することと、によって、動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性幹細胞を増殖及び分化させる方法である。   In a preferred embodiment, the three-dimensional cell population comprises growing pluripotent stem cells in flat adhesion culture, expanding the pluripotent stem cells into an aggregate cell population, and using an enzyme or chelating agent, Transplanting a population of pluripotent stem cells from a planar adhesion culture to a dynamic suspension culture. Further preferred embodiments include growing pluripotent stem cells in a planar adhesion culture system, expanding the pluripotent stem cells into an aggregated cell population, and using an enzyme or chelator to pluripotent stem cells. Transplanting the population from a planar adhesion culture to a dynamic suspension culture and differentiating the pluripotent cell population in a dynamically agitated suspension culture system to produce a pancreatic progenitor cell population, This is a method for proliferating and differentiating pluripotent stem cells in a dynamically stirred suspension culture system.

別の実施形態は、膵臓前駆細胞へと分化された、増殖した多能性幹細胞集団の懸濁から調製された、分化した幹細胞を含む、移植可能な幹細胞由来の細胞産物である。より具体的には、移植可能な幹細胞由来の産物は、平面接着培養下で多能性幹細胞を成長させることと、多能性幹細胞を凝集細胞集団に増殖させることと、酵素又はキレート剤を使用して、多能性幹細胞の集団を平面接着培養から動的懸濁培養へ移植することと、動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞集団を分化させることと、によって産生される。移植可能な幹細胞由来の細胞産物は、好ましくは、糖尿病を治療するために使用される。   Another embodiment is a transplantable stem cell-derived cell product comprising differentiated stem cells prepared from a suspension of expanded pluripotent stem cell populations that have been differentiated into pancreatic progenitor cells. More specifically, transplantable stem cell-derived products use pluripotent stem cells to grow in planar adhesion cultures, propagate pluripotent stem cells into aggregated cell populations, and use enzymes or chelating agents Produced by transplanting a population of pluripotent stem cells from planar adhesion culture to dynamic suspension culture and differentiating the pluripotent cell population in a dynamically agitated suspension culture system Is done. Cell products derived from transplantable stem cells are preferably used to treat diabetes.

別の実施形態において、この方法は、機能的膵内分泌細胞への更なる生体内での成熟のための、糖尿病の動物内への移植を含む。   In another embodiment, the method comprises transplantation into a diabetic animal for further in vivo maturation into functional pancreatic endocrine cells.

別の実施形態は、平面接着培養下で多能性幹細胞を成長させることと、酵素を使用して、多能性幹細胞を平面接着培養から除去することと、静的培養下で多能性幹細胞をマイクロキャリアに接着させることと、動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞を増殖することと、動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞を分化させて、膵臓前駆細胞集団を生成することと、を含む、懸濁培養系内で多能性幹細胞を増殖し、分化させる方法である。   Another embodiment includes growing pluripotent stem cells in flat adhesion culture, using an enzyme to remove pluripotent stem cells from flat adhesion culture, and pluripotent stem cells in static culture. Adhere to a microcarrier, grow pluripotent cells in a dynamically stirred suspension culture, and differentiate pluripotent cells in a dynamically stirred suspension culture. Producing a pancreatic progenitor cell population, and proliferating and differentiating pluripotent stem cells in a suspension culture system.

マイクロキャリアは、接着細胞について当該技術分野において既知の任意の形態であり得、とりわけ、マイクロキャリアはビーズであり得る。マイクロキャリアは、天然又は合成的に由来する材料からなり得る。例としては、コラーゲンベースのマイクロキャリア、デキストランベースのマイクロキャリア、又はセルロースベースのマイクロキャリアが挙げられる。例えば、マイクロキャリアビーズは、表面に結合して、マイクロキャリアに対して正に帯電している表面を提供するカチオントリメチルアンモニウムを有する、改質ポリスチレンビーズであり得る。ビーズ直径は、約９０〜約２００μｍ、あるいは約１００〜約１９０μｍ、あるいは約１１０〜約１８０μｍ、あるいは約１２５〜１７５μｍの範囲であり得る。マイクロキャリアビーズはまた、架橋デキストランのマトリックスに化学的に連結した変性コラーゲンの薄層であり得る。マイクロキャリアビーズは、ガラス、セラミックス、ポリマー（ポリスチレンなど）、又は金属であり得る。更に、マイクロキャリアは、シリコン、又はコラーゲンなどのたんぱく質などでコーティングされても、又はコーティングされなくてもよい。更なる態様では、マイクロキャリアは、マイクロキャリアへの細胞の結合性を高める、及びマイクロキャリアからの細胞の放出を高める化合物（限定するものではないが、ヒアルロン酸ナトリウム、ポリ（モノステアロイルグリセリドココハク酸）、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、リジン、ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ビトロネクチン、及びコラーゲンが挙げられる）で構成されるか、又はコーティングされてもよい。実施例は、低レベルの生物学的に関連する電気を産生する、亜鉛及び銅の微粒子ガルバーニ電気連結を有するマイクロキャリア、又は常磁性カルシウムアルギン酸マイクロキャリアなどの常磁性のマイクロキャリアといった、微小電流を有するマイクロキャリアを更に含む。   The microcarrier can be in any form known in the art for adherent cells, and in particular the microcarrier can be a bead. Microcarriers can consist of materials that are naturally or synthetically derived. Examples include collagen-based microcarriers, dextran-based microcarriers, or cellulose-based microcarriers. For example, the microcarrier bead can be a modified polystyrene bead having a cationic trimethylammonium that binds to the surface and provides a surface that is positively charged to the microcarrier. The bead diameter can range from about 90 to about 200 μm, alternatively from about 100 to about 190 μm, alternatively from about 110 to about 180 μm, alternatively from about 125 to 175 μm. The microcarrier beads can also be a thin layer of denatured collagen chemically linked to a matrix of cross-linked dextran. The microcarrier beads can be glass, ceramics, polymers (such as polystyrene), or metals. Furthermore, the microcarriers may or may not be coated with a protein such as silicon or collagen. In a further aspect, the microcarrier is a compound that increases cell binding to the microcarrier and enhances cell release from the microcarrier (including but not limited to sodium hyaluronate, poly (monostearoylglyceride succinate). Acid), poly-D, L-lactide-co-glycolide, fibronectin, laminin, elastin, lysine, n-isopropylacrylamide, vitronectin, and collagen) or may be coated. Examples include microcurrents such as microcarriers with fine galvanic coupling of zinc and copper, or paramagnetic microcarriers such as paramagnetic calcium alginate microcarriers that produce low levels of biologically relevant electricity. And further comprising a microcarrier.

いくつかの実施形態において、膵臓内胚葉細胞集団は、多能性細胞集団の段階的分化によって取得される。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性幹細胞である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。   In some embodiments, the pancreatic endoderm cell population is obtained by stepwise differentiation of a pluripotent cell population. In some embodiments, the pluripotent cell is a human embryonic pluripotent stem cell. In one aspect of the invention, the cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage are primitive streak precursor cells. In another aspect, the cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm lineage are mesendoderm cells.

いくつかの実施形態において、本発明は、動的懸濁培養でステージ３〜５の細胞を培養することを含む、多能性細胞を分化する段階的な方法に関する。いくつかの実施形態において、生成される膵臓内胚葉集団は、機能的膵内分泌細胞への更なる生体内での成熟のために、糖尿病の動物内に移植される。本発明はまた、本発明の方法で使用する系又はキットを提供する。   In some embodiments, the present invention relates to a stepwise method for differentiating pluripotent cells comprising culturing stage 3-5 cells in dynamic suspension culture. In some embodiments, the resulting pancreatic endoderm population is transplanted into a diabetic animal for further in vivo maturation into functional pancreatic endocrine cells. The invention also provides a system or kit for use in the methods of the invention.

本発明はまた、本発明の方法によって取得可能な細胞、又は細胞の集団を提供する。本発明はまた、本発明の方法によって取得される細胞、又は細胞の集団を提供する。   The invention also provides a cell or population of cells obtainable by the method of the invention. The present invention also provides a cell or population of cells obtained by the method of the present invention.

本発明は、治療法を提供する。とりわけ、本発明は糖尿病に罹患しているか、又は糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。   The present invention provides a therapeutic method. In particular, the present invention provides a method of treating a patient suffering from or at risk for developing diabetes.

本発明はまた、治療法で使用するために、本発明の方法によって取得可能な、又は得られる、細胞又は細胞の集団を提供する。とりわけ、本発明は、糖尿病に罹患しているか、又は糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法で使用する、本発明の方法によって取得可能な、又は得られる、細胞又は細胞の集団を提供する。糖尿病は、１型又は２型糖尿病であり得る。   The invention also provides a cell or population of cells obtainable or obtainable by the method of the invention for use in therapy. In particular, the invention provides a cell or population of cells obtainable or obtainable by a method of the invention for use in a method of treating a patient suffering from or at risk of developing diabetes. To do. Diabetes can be type 1 or type 2 diabetes.

一実施形態において、治療法は、本発明の方法によって得られる、又は取得可能な細胞を患者に埋め込むことを含む。   In one embodiment, the treatment comprises implanting cells obtained or obtainable by the method of the invention in a patient.

一実施形態において、治療法は、生体外で多能性幹細胞をステージ１、ステージ２、ステージ３、ステージ４、又はステージ５の細胞に分化させることと、例えば、本明細書に記載するように、分化した細胞を患者内に埋め込むことと、を含む。   In one embodiment, the treatment includes differentiating pluripotent stem cells in vitro into stage 1, stage 2, stage 3, stage 4, or stage 5 cells, eg, as described herein. Implanting the differentiated cells into the patient.

一実施形態において、この方法は、例えば、本明細書に記載するように、多能性幹細胞を分化させる工程の前に、多能性幹細胞を培養する工程を更に含む。   In one embodiment, the method further comprises culturing the pluripotent stem cell prior to the step of differentiating the pluripotent stem cell, eg, as described herein.

一実施形態において、この方法は、埋め込みの工程の後に、生体内で細胞を分化させる工程を更に含む。   In one embodiment, the method further comprises the step of differentiating the cells in vivo after the step of implantation.

一実施形態において、患者は哺乳類、好ましくはヒトである。   In one embodiment, the patient is a mammal, preferably a human.

一実施形態において、細胞は、分散した細胞として埋め込まれてもよく、又は肝門脈内に注入され得る集団として形成されてもよい。あるいは、細胞は、生体適合性の分解性ポリマー支持体、多孔性の非分解性デバイス内に提供されてもよく、又は宿主免疫応答から保護されるよう封入されてもよい。細胞は、レシピエント内の適切な部位内に埋め込まれてもよい。埋め込み部位としては、例えば、肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、又は皮下ポケットが挙げられる。   In one embodiment, the cells may be implanted as dispersed cells or formed as a population that can be injected into the hepatic portal vein. Alternatively, the cells may be provided in a biocompatible degradable polymer support, a porous non-degradable device, or encapsulated to be protected from a host immune response. The cells may be implanted within an appropriate site within the recipient. Examples of implantation sites include the liver, natural pancreas, subrenal space, net, peritoneum, subserosa space, intestine, stomach, or subcutaneous pocket.

生体内で埋め込まれた細胞の更なる分化、生存、又は活性を向上するために、増殖因子、抗酸化剤、又は抗炎症剤などの追加の因子を、細胞の投与前に、投与と同時に、又は投与後に投与してもよい。これらの因子は、内在性細胞により分泌され、投与された細胞にその場で曝露されてもよい。埋め込まれた細胞は、当該技術分野において既知の内因性の成長因子、及び当該技術分野において既知の外因性の成長因子の任意の組み合わせにより、分化を誘導され得る。   In order to improve further differentiation, survival, or activity of cells implanted in vivo, additional factors, such as growth factors, antioxidants, or anti-inflammatory agents, may be added prior to administration of the cells, Or you may administer after administration. These factors may be secreted by endogenous cells and exposed in situ to the administered cells. The implanted cells can be induced to differentiate by any combination of endogenous growth factors known in the art and exogenous growth factors known in the art.

埋め込みに使用する細胞の量は、患者の状態及び治療に対する応答を含む、多数のさまざまな要因に基づいて当業者により決定され得る。   The amount of cells used for implantation can be determined by those skilled in the art based on a number of different factors, including the patient's condition and response to therapy.

一実施形態において、治療法は、埋め込み前に、細胞を三次元の支持体内に取り込むことを更に含む。細胞は、患者に埋め込む前に、生体外でこの支持体上に維持されてもよい。あるいは、細胞を含む支持体は、更に生体外で培養することなく、直接患者に埋め込んでもよい。支持体は、場合により、埋め込まれた細胞の生存及び機能を促進する少なくとも１つの医薬品を組み込んでもよい。   In one embodiment, the treatment further comprises taking the cells into a three-dimensional support prior to implantation. The cells may be maintained on this support ex vivo prior to implantation in the patient. Alternatively, the support containing the cells may be directly implanted in the patient without further in vitro culture. The support may optionally incorporate at least one pharmaceutical agent that promotes the survival and function of the implanted cells.

本発明の特定の実施形態において、以下の１つ又は２つ以上が本発明の方法で使用され得る。   In certain embodiments of the invention, one or more of the following may be used in the method of the invention.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

本明細書を通して引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。   Publications cited throughout this specification are hereby incorporated by reference in their entirety. The present invention will be further explained by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.

本発明を以下の非限定的な実施例によって更に説明する。   The invention is further illustrated by the following non-limiting examples.

（実施例１）
ディスパーゼ／中性プロテアーゼを使用した細胞株Ｈ１のヒト胚性幹細胞の懸濁及び集団化
継代４１でのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１細胞，ＷｉＣｅｌｌ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）をＰＢＳ（カタログ番号１４１９０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１度洗浄し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１３３０，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）内で、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）（中性プロテアーゼ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ ＬＬＣ，カタログ番号Ｄ４８１８，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）の１ｍｇ／ｍＬの溶液で処理した。群体の縁部が丸まって持ち上がり始めるまで、ただし培養表面からの群体の完全な剥離の前に、細胞を３７℃で１５〜２５分間インキュベートした。Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）をその後に除去し、１０μＭのＹ−２７６３２（Ａｘｘｏｒａカタログ番号ＡＬＸ−２７０−３３３，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）培地で２度洗浄した。次いで、１０μＭ Ｙ−２７６３２を含むｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を、５ｍＬ／６０ｃｍ2の培養皿に添加し、スクレーバ又はゴム製ポリスマンを使用して表面から細胞を剥離した。次いで、培地及び細胞を、ガラスピペットを使用して５０ｍＬの円錐チューブに移植し、集団を９０ｇ（ｒｃｆ）で３分間遠心分離させた。 Example 1
Suspension and population of human embryonic stem cells of cell line H1 using dispase / neutral protease Human embryonic stem cell line H1 cells (WA01 cells, WiCell, Madison WI) at passage 41 were washed with PBS (Cat. No. 14190). , Invitrogen), and once in DMEM / F12 (Invitrogen catalog number 11330, Grand Island, NY) Dispase® (neutral protease, Sigma Aldrich Co LLC, catalog number D4818, St. Louise, MO). ) With a 1 mg / mL solution. Cells were incubated for 15-25 minutes at 37 ° C. until the rim of the colony began to curl up and before complete detachment of the colony from the culture surface. Dispase® was subsequently removed and mTeSR® 1 (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada) containing 10 μM Y-27632 (Axxora catalog number ALX-270-333, San Diego, Calif.). ) Washed twice with medium. The mTeSR® 1 medium containing 10 μM Y-27632 was then added to a 5 mL / 60 cm 2 culture dish and the cells were detached from the surface using a scraper or rubber policeman. The media and cells were then transplanted into a 50 mL conical tube using a glass pipette and the population was centrifuged at 90 g (rcf) for 3 minutes.

遠心分離の後、培地を吸引し、細胞を徐々に再懸濁して、全平面培養のうち、２２５〜２４０ｃｍ2につき１０μＭのＹ−２７６３２を含有する１２ｍＬのｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（１つのＴ２２５フラスコ又は４枚の１０ｃｍ皿に等しい、約９０００万個の細胞）内で簡潔に微粉化した。次いで、細胞懸濁液を、１０μＭのＹ−２７６３２を有する、２ｍＬ／ウェルの新鮮なｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を含有する超低級結合培養６ウェルの皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，カタログ番号３４７１，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に移植した。この方法で剥離させた細胞は、剥離させた断片の平均直径がおよそ２０〜３０マイクロメートル（図１ａ）で、それぞれが細胞の塊からなる、単層の断片に類似していた。これらの単層断片を懸濁状態で２時間インキュベートし（インキュベーション時間は、０．５〜４時間の範囲であり得る）、この時点で断片の凝集体が観察された。次いで、凝集体を、ガラスの１０ｍＬピペットを使用して短時間で微粉化し、低結合プレートで一晩インキュベートした（凝集体は、懸濁へ直接進行し得る）（凝集体はまた、無処理の細胞培養プラスチック及び標準組織培養処理したプラスチック内でインキュベートされ得る）。 After centrifugation, the medium is aspirated and the cells are gradually resuspended and, of all planar cultures, 12 mL of mTeSR® 1 medium containing 10 μM Y-27632 per 225-240 cm 2 (one Micronized briefly in about 90 million cells, equal to a T225 flask or four 10 cm dishes. The cell suspension was then added to an ultra-low binding culture 6-well dish containing 2 mL / well of fresh mTeSR® 1 medium with 10 μM Y-27632 (Corning Incorporated, Catalog No. 3471, Corning, NY). Cells exfoliated in this way were similar to monolayer fragments, each with an average diameter of exfoliated fragments of approximately 20-30 micrometers (FIG. 1a), each consisting of a cell mass. These monolayer fragments were incubated in suspension for 2 hours (incubation time could range from 0.5 to 4 hours), at which point fragment aggregation was observed. Aggregates were then micronized briefly using a 10 mL glass pipette and incubated overnight on low binding plates (aggregates can proceed directly to suspension) (aggregates are also untreated). Can be incubated in cell culture plastic and standard tissue culture treated plastic).

一晩のインキュベーション（１８〜２４時間）後、５０ｒｐｍ（３０〜８０＋ｒｐｍの範囲であり得る）で撹拌される、２５ｍＬのｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を含有する、１２５ｍＬのスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，カタログ番号４５００−１２５，Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）に細胞及び培地を直接移植し、約７５ｍＬの最終体積を作製した。培地を４日間、毎日交換した。培養下での４日後に多能性が決定され、フローサイトメトリー結果は、多能性のマーカー（ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１）の高い発現を示したが、分化のマーカー（ＣＸＣＲ４）の発現はほとんど示さなかった。図１ｂを参照されたい。これらのデータは、細胞剥離剤としてＤｉｓｐａｓｅ（登録商標）を使用して平面接着培養形式からＨ１ ｈＥＳ細胞を細胞集団として正常に移植し、撹拌（動的）懸濁培養系内で多能性を維持し得ることを実証する。この実施例はまた、プレート及び三角フラスコの、撹拌よりもむしろ振とうされる懸濁系において、同等の結果で実行され得る。   125 mL spinner flask (Corning Incorporated, catalog) containing 25 mL of mTeSR® 1 medium, stirred at 50 rpm (can range from 30-80 + rpm) after overnight incubation (18-24 hours) No. 4500-125, Corning NY) cells and media were transplanted directly to make a final volume of about 75 mL. The medium was changed daily for 4 days. Although pluripotency was determined after 4 days in culture, flow cytometry results showed high expression of pluripotency markers (CD9, SSEA4, TRA-1-60, and TRA-1-81). The expression of the differentiation marker (CXCR4) was hardly shown. See FIG. 1b. These data show that normal H1 hES cells were transplanted as a cell population from a flat adhesion culture format using Dispase® as a cell detachment agent, and pluripotency was observed in a stirred (dynamic) suspension culture system. Demonstrate that it can be maintained. This example can also be performed with comparable results in suspension systems of plates and Erlenmeyer flasks that are shaken rather than stirred.

懸濁培養下での４日間後に（分化はまた、凝集体の形成から２４〜１２０時間後に開始し、好ましくは、分化開始前の２〜３日間培養し得る）、多能性細胞凝集体が培地成分のステージ式の進行で分化されて、膵臓の運命を形成するように細胞が誘導された。スピナ撹拌については、凝集体の分化のために６５ｒｐｍまで速度を上げた。培地及び成分を表１ａに示す。   After 4 days in suspension culture (differentiation also starts 24 to 120 hours after formation of the aggregates, preferably 2 to 3 days before the start of differentiation), the pluripotent cell aggregates Cells were induced to differentiate through the staged progression of media components to form the fate of the pancreas. For spinner agitation, the speed was increased to 65 rpm for aggregation differentiation. The media and components are shown in Table 1a.

ステージ１の終了時に、試料に対してフローサイトメトリー及びＰＣＲを実行した。懸濁分化培養は、ステージ１（図１ｃ）の終了時に、疎性の凝集体の、均一かつ均質な細胞の集団を形成し、多能性のマーカー（ＣＤ９）の発現はほぼ除去されたが、胚体内胚葉分化のマーカーはかなり高く、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）については９７．２％の陽性、及びＣＤ９９については９７．３％の陽性であった（図１ｄ）。これらの結果は、未分化のＷＡ０１ ｈＥＳ細胞と対比した、多能性遺伝子（ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４）の発現における劇的な減少、並びに胚体内胚葉と関連付けられている遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＣＥＲＢＥＲＵＳ、ＧＳＣ、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、及びＳＯＸ１７）における大きな増加を示す、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果と相関した（図１ｅ）。   At the end of stage 1, flow cytometry and PCR were performed on the samples. Suspension differentiation culture formed a homogeneous and homogeneous population of loose aggregates at the end of stage 1 (FIG. 1c), although the expression of the pluripotent marker (CD9) was almost eliminated. The markers of definitive endoderm differentiation were fairly high, 97.2% positive for CXCR4 (CD184) and 97.3% positive for CD99 (FIG. 1d). These results show a dramatic decrease in the expression of pluripotency genes (CD9, NANOG, and POU5F1 / OCT4) compared to undifferentiated WA01 hES cells, as well as genes associated with definitive endoderm (CXCR4, Correlation with qRT-PCR results showing a large increase in CERBERUS, GSC, FOXA2, GATA4, GATA6, MNX1, and SOX17) (FIG. 1e).

その後、ＴＧＦ−βファミリーメンバー、ＧＤＦ８を除去し、ＦＧＦ７を培地に添加することによって、胚体内胚葉集団を原始前腸に更に分化させた。ＦＧＦ７での３日間の培養後、高いグルコース（２５ｍＭ）及び低濃度の脂質豊富なウシ血清アルブミン（ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有する培地、又は比較的低いグルコース濃度（８ｍＭ）及び２％の脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンを含有する培地のいずれかへの、オールトランスレチノイン酸の添加によって、膵臓ＰＤＸ１発現運命に集団を分化させた。これらの培地への成分の詳細な添加を表１ａに示す。分化の終了時に、膵臓前駆細胞のマーカーの発現について、試料を分析した。フローサイトメトリーによって測定される、いずれかの条件（グルコース＋２％のＦＡＦ−ＢＳＡ（Ａ）又は高いグルコース＋０．１％のＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）（Ｂ）で分化させた集団は、機能的β細胞に必要とされる転写因子である高レベルのＮＫＸ６．１、及び高レベルの内分泌膵臓マーカー（シナプトフィジン及びクロモグラニンなど）を発現することが観察された（表１ｂ）。これらの結果は、条件Ａ及びＢの両方からの試料内で発現した、高レベルの複数の膵臓前駆体遺伝子を示す、ＲＴ−ＰＣＲ結果と一貫した（データの表示なし）。   Thereafter, the TGF-β family member, GDF8, was removed and FGF7 was added to the medium to further differentiate the definitive endoderm population into the primitive foregut. Medium containing high glucose (25 mM) and low concentration of lipid-rich bovine serum albumin (AlbuMAX® (Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.) After 3 days of culture with FGF7, or relatively low glucose concentration Populations were differentiated to pancreatic PDX1 expression fate by addition of all-trans retinoic acid to either medium containing (8 mM) and 2% fatty acid free bovine serum albumin. Detailed additions are shown in Table 1. At the end of differentiation, samples were analyzed for expression of markers of pancreatic progenitor cells, either condition (glucose + 2% FAF-BSA (A ) Or high glucose + 0.1% Albu Populations differentiated with MAX® (B) express high levels of NKX6.1, a transcription factor required for functional β cells, and high levels of endocrine pancreatic markers such as synaptophysin and chromogranin (Table 1b) These results are consistent with RT-PCR results showing high levels of multiple pancreatic progenitor genes expressed in samples from both conditions A and B ( No data displayed).

それらが胚体内胚葉（ＤＥ）（図１ｃ）から原始前腸への、及び膵臓内胚葉（図１ｆ）への分化を通して進行した際の、細胞集団の典型的な形態は、細胞及び細胞集団に対する可視の形態的な変化を実証した。典型的に、多能性集団は、位相差顕微鏡法では高密度かつ暗く見え、その後、細胞がステージ２において原始前腸へと進行するにつれて外観がより疎性になる。この形態は、続くオールトランスレチノイン酸処理を反転させ、集団は再び、平滑な集団境界を有した更に高密度かつ均一なものとなる。   The typical morphology of cell populations as they progress through differentiation from definitive endoderm (DE) (FIG. 1c) to primitive foregut and into pancreatic endoderm (FIG. 1f) Visible morphological changes were demonstrated. Typically, pluripotent populations appear dense and dark in phase contrast microscopy, after which the appearance becomes more lenient as the cells progress to the primitive foregut in stage 2. This form reverses subsequent all-trans retinoic acid treatment, and the population again becomes denser and more uniform with smooth population boundaries.

ステージ４を通して条件Ｂに従って分化させた細胞は、ＡＬＫ５阻害剤を含有するステージ５の培地内で更に５日間保持された（表１ｃを参照のこと）。培養下でのこの追加の成熟は、内分泌マーカー発現（ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰＹ、及びＰＣＳＫ１）における有意な増加をもたらした。その後、ＩＡＣＵＣ承認の研究プロトコルに従って、細胞集団をＳＣＩＤ−Ｂｇマウスの腎臓被膜内に埋め込み、マウスを２０週間観察し、２〜４週間毎に空腹／供給の状態でＣ−ペプチドを測定した。埋め込みから４週間後、２０時間の空腹、及びその後グルコース刺激の後、Ｃ−ペプチドは検出不可能であった。６週目までに、５匹中２匹の陽性マウスがいくらかの（０．０８７及び０．１３７ｎｇ／ｍＬ）ヒトＣ−ペプチドを示し、１０週目までに、５匹中５匹のマウスがＣ−ペプチドに対して陽性（０．０８５〜０．２９１ｎｇ／ｍＬ）であった。１６週目で、２０時間の空腹及びグルコース刺激の後、４匹のマウス全て（４／４）がＣ−ペプチド発現に対して陽性（０．３７７〜３．６２７ｎｇ／ｍＬ）であった。   Cells differentiated according to Condition B through Stage 4 were maintained for an additional 5 days in Stage 5 medium containing an ALK5 inhibitor (see Table 1c). This additional maturation in culture resulted in a significant increase in endocrine marker expression (INS, GCG, SST, PPY, and PCSK1). Subsequently, according to the IACUC approved research protocol, the cell population was embedded in the kidney capsule of SCID-Bg mice, the mice were observed for 20 weeks, and C-peptide was measured every 2-4 weeks in a fasting / feeding state. 4 weeks after implantation, C-peptide was undetectable after 20 hours of fasting and then glucose stimulation. By week 6, 2 out of 5 positive mice showed some (0.087 and 0.137 ng / mL) human C-peptide, and by week 10 5 out of 5 mice had C -Positive for peptide (0.085-0.291 ng / mL). At 16 weeks, after 20 hours of fasting and glucose stimulation, all 4 mice (4/4) were positive (0.377-3.627 ng / mL) for C-peptide expression.

これらの結果は、多能性細胞凝集体が形成され、次いで、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１のようなβ細胞転写因子の発現によって特徴付けられる、膵臓前駆細胞集団を生成するように、懸濁培養系内で分化し得ることを示す。更に、生体内に埋め込んで成熟可能にさせた、分化した細胞集団は、生理学的に適切なレベルでのグルコースチャレンジに反応して、インスリンを発現した。   These results indicate that the suspension culture system is such that pluripotent cell aggregates are formed and then generate a pancreatic progenitor cell population characterized by expression of β-cell transcription factors such as PDX1 and NKX6.1. It can be differentiated within. In addition, differentiated cell populations that were implanted in vivo and allowed to mature expressed insulin in response to glucose challenge at physiologically relevant levels.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

この実施例で、及び本明細書全体で使用されるとおり、ＴｐｐＢ（ＴｐＢとしても知られる）は、化学名（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエニルアミノ）ベンゾラクタム及びＣＡＳ番号４９７２５９−２３−１を有するＰＫＣ賦活物質である。   In this example and as used throughout this specification, TppB (also known as TpB) is given the chemical name (2S, 5S)-(E, E) -8- (5- (4- (tri PKC activator with fluoromethyl) phenyl) -2,4-pentadienylamino) benzolactam and CAS number 497259-23-1.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

Figure 2017500013
Figure 2017500013

（実施例２）
ＥＤＴＡを使用した細胞株Ｈ１のヒト胚性幹細胞の懸濁及び集団化
継代４１でのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１細胞，ＷｉＣｅｌｌ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を、ＰＢＳ（カタログ番号１４１９０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１度洗浄し、非酵素的細胞剥離／継代剤であるＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号１７−７−１１Ｅ）で処理した。細胞を８分間室温でインキュベートした。次いで、ＥＤＴＡを除去し、１〜２分以上（９〜１０分の全ＥＤＴＡ露出）の後、１０μＭのＹ−２７６３２（Ａｘｘｏｒａカタログ番号ＡＬＸ−２７０−３３３，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地でプレートを濯ぎ、ガラスピペットを使用して、除去された細胞を５０ｍＬの円錐チューブに収集した。１０μＭのＹ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地でプレートの濯ぎをもう１度実行し、除去された細胞と共に貯留した。室温でのＥＤＴＡへの露出から９〜１０分後に、いくつかの細胞はプレート上に留まり、剥離された細胞は、単一の細胞懸濁液に完全には脱凝集されなかったことに留意されたい。代わりに、表面から小さな凝集体として細胞が除去された。培地及び細胞をその後、ガラスピペットを使用して５０ｍＬの円錐チューブに移植し、細胞計数を実行した（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）−ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ Ａ／Ｓ，Ｃａｔ＃ＹＣ−Ｔ１００，Ｄｅｎｍａｒｋ）。必要に応じて、１０μＭのｙ−２７６３２を含有する追加のｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を添加して、１００〜１５０万個の細胞／ｍＬの細胞の濃度を作製した。 (Example 2)
Suspension and population of human embryonic stem cells of cell line H1 using EDTA Cells of human embryonic stem cell line H1 at passage 41 (WA01 cells, WiCell, Madison WI) were added to PBS (Cat. No. 14190, Invitrogen). And then treated with EDTA (Lonza, catalog number 17-7-11E), a non-enzymatic cell detachment / passaging agent. Cells were incubated for 8 minutes at room temperature. EDTA is then removed and after 1-2 minutes (9-10 minutes total EDTA exposure) mTeSR containing 10 μM Y-27632 (Axxora catalog number ALX-270-333, San Diego, Calif.) The plate was rinsed with 1 medium and the removed cells were collected in a 50 mL conical tube using a glass pipette. The plate was rinsed one more time with mTeSR® 1 medium containing 10 μM Y-27632 and pooled with the removed cells. Note that after 9-10 minutes of exposure to EDTA at room temperature, some cells remained on the plate and the detached cells were not completely disaggregated into a single cell suspension. I want. Instead, the cells were removed from the surface as small aggregates. Media and cells were then transplanted into 50 mL conical tubes using a glass pipette and cell counts were performed (NucleoCounter®-Chemometec A / S, Cat # YC-T100, Denmark). As needed, additional mTeSR® 1 medium containing 10 μM y-27632 was added to make a concentration of cells between 1 and 1.5 million cells / mL.

集団が疎性に凝集しており、ペレットに遠心分離してピペットで再懸濁すると、単一の細胞に分離するであろうことから、細胞を遠心分離しなかった。代わりに、均一な懸濁液が形成されるまで、チューブ内の培地及び細胞を静かに渦流した。所望の場合、更に、ＥＤＴＡ処理の期間を延長し、細胞をほぼ単一の細胞懸濁液にすることもできる。その後、ガラスピペットを使用して、３７℃、加湿、５％のＣＯ2インキュベーター内に３ｍＬ／ウェルで、２枚の非組織培養処理した６ウェルの皿（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カタログ番号Ｆａｌｃｏｎ ３５１１４６，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に細胞懸濁液を移植した。細胞を懸濁状態で２時間インキュベートし、この時点で凝集体が観察された。次いで、ガラスピペットでの静かなピぺッティングによって、凝集体を微粉化して、大きな凝集体を破壊し、均質で均一な集団懸濁液を作製してから、撹乱せずに一晩インキュベートした。 Cells were not centrifuged because the population was loosely aggregated and would be separated into single cells when centrifuged into a pellet and resuspended with a pipette. Instead, the medium and cells in the tube were gently swirled until a uniform suspension was formed. If desired, the duration of EDTA treatment can also be extended to bring the cells into a nearly single cell suspension. Then, using a glass pipette, 2 non-tissue culture treated 6-well dishes (Becton Dickinson, Cat. No. Falcon 351146, Franklin Lakes, 3 mL / well in a humidified, 5% CO 2 incubator. , NJ) was transplanted with the cell suspension. Cells were incubated for 2 hours in suspension, at which point aggregates were observed. The aggregates were then micronized by gentle pipetting with a glass pipette to break up large aggregates, creating a homogeneous and homogeneous mass suspension, and then incubated overnight without disturbance.

次いで、１８〜２４時間後に、細胞及び培地を５０ｍＬの円錐チューブ内で、９０ｇ（ｒｃｆ）で３分間遠心沈降させた。使用済みの培地の上澄を破棄し、新鮮なｍＴｅＳＲ（登録商標）１内で細胞凝集体を懸濁させ、３７℃、加湿、５％のＣＯ2インキュベーター内にて５５ｒｐｍで撹拌されるスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，カタログ番号４５００−１２５，Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）に、懸濁液を移植した。培地を２日間、毎日交換した。多能性は、撹拌される懸濁培養下での２日後、分化培養への遷移前に決定された。ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、及びＣＸＣＲ４発現のフローサイトメトリー結果を、散布図形式で図２ａに示す。これらのデータは、多能性のマーカー（ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）の高い発現を示すが、分化のマーカー（ＣＸＣＲ４）の発現はほとんど又は全く示さない。これらの結果は、Ｈ１ ｈＥＳ細胞が、非酵素的剥離方法を使用して、平面接着培養系形式から懸濁培養へと移植され、動的撹拌される懸濁培養系で多能性を維持し得ることを示す。 The cells and media were then spun down at 90 g (rcf) for 3 minutes in a 50 mL conical tube after 18-24 hours. Discard spent media supernatant, suspend cell aggregates in fresh mTeSR® 1 and spinner flask stirred at 55 rpm in a 37 ° C., humidified, 5% CO 2 incubator (Corning Incorporated, Catalog No. 4500-125, Corning NY) was implanted with the suspension. The medium was changed daily for 2 days. Pluripotency was determined after 2 days under agitated suspension culture and before transition to differentiation culture. The flow cytometry results for CD9, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, and CXCR4 expression are shown in FIG. These data show high expression of pluripotency markers (CD9, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81), but little or no expression of differentiation markers (CXCR4). These results show that H1 hES cells maintain pluripotency in a suspension culture system that is transplanted from a flat adhesion culture format to suspension culture and dynamically stirred using a non-enzymatic detachment method. Show you get.

懸濁培養下での２日後、多能性細胞凝集体が培地成分のステージ式の進行で分化され、膵臓の運命を形成するように細胞が誘導された。スピナ撹拌は、５５ｒｐｍの速度に維持した。培地及び成分を表２ａに示す。   After 2 days in suspension culture, the pluripotent cell aggregates were differentiated by a staged progression of the media components and the cells were induced to form pancreatic fate. Spinner agitation was maintained at a speed of 55 rpm. The media and components are shown in Table 2a.

ステージ１の終了時に、試料に対してフローサイトメトリー及びＰＣＲを実行した。懸濁分化培養は、ステージ１（図２ｂ）の終了時に、疎性の凝集体における細胞の均一かつ均質な集団を形成し、多能性のマーカー（ＣＤ９）の発現はほぼ除去されたが、胚体内胚葉分化のマーカーであるＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）はかなり高く、３つのスピナーフラスコにわたって、９５．９％±１．８ｓｄ（図２ｃ）であった。これらの結果は、未分化のＷＡ０１ ｈＥＳ細胞と対比した、多能性遺伝子（ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４）の発現における劇的な減少、並びに胚体内胚葉と関連付けられている遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＣＥＲＢＥＲＵＳ、ＧＳＣ、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、及びＳＯＸ１７）における大きな増加を示す、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果と相関した（図２ｄ）。   At the end of stage 1, flow cytometry and PCR were performed on the samples. Suspension differentiation culture formed a uniform and homogeneous population of cells in loose aggregates at the end of stage 1 (FIG. 2b), with almost no expression of the pluripotent marker (CD9), CXCR4 (CD184), a marker of definitive endoderm differentiation, was fairly high, 95.9% ± 1.8 sd (FIG. 2c) across the three spinner flasks. These results show a dramatic decrease in the expression of pluripotency genes (CD9, NANOG, and POU5F1 / OCT4) compared to undifferentiated WA01 hES cells, as well as genes associated with definitive endoderm (CXCR4, CERBERUS, GSC, FOXA2, GATA4, GATA6, MNX1, and SOX17) correlated with qRT-PCR results showing a large increase (FIG. 2d).

次いで、スピナーフラスコからの胚体内胚葉集団を貯留し、別のスピナーフラスコ又は三角フラスコ（振とうされる撹拌系）のいずれかに分配し、ＧＤＦ８を除去し、ＦＧＦ７を培地に添加することによって原始前腸への更なる分化に差し向けた。ＦＧＦ７での３日間の培養後、比較的低いグルコース濃度（８ｍＭ）及び２％の脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンを含有する培地のいずれかへの、オールトランスレチノイン酸の添加によって、膵臓ＰＤＸ１発現運命に集団を分化させた。これらの培地への成分の詳細な添加を表２ａに示す。分化の終了時に、膵臓前駆細胞のマーカーの発現について、試料を分析した。フローサイトメトリーを使用して、機能的β細胞に必要とされる転写因子である、高レベルのＮＫＸ６．１、及びシナプトフィジン及びクロモグラニンなどの高レベルの内分泌膵臓マーカー（表２ｂ及び図２ｅ）が、両方の懸濁形式で観察された。これらの結果は、スピナーフラスコ形式又は三角フラスコ形式で生成した試料内で発現した、非常に類似した高レベルの複数の膵臓前駆体遺伝子を示した、ＲＴ−ＰＣＲ結果と一貫した（図２ｆ）。   The definitive endoderm population from the spinner flask is then pooled and distributed to either another spinner flask or an Erlenmeyer flask (shaking agitation system), GDF8 is removed, and FGF7 is added to the medium by adding it to the medium. Directed to further differentiation into the foregut. After 3 days in culture with FGF7, pancreatic PDX1 expression fate by addition of all-trans retinoic acid to either medium containing relatively low glucose concentration (8 mM) and 2% fatty acid free bovine serum albumin Differentiated the population. The detailed addition of ingredients to these media is shown in Table 2a. At the end of differentiation, samples were analyzed for expression of pancreatic progenitor cell markers. Using flow cytometry, high levels of NKX6.1, which are transcription factors required for functional β cells, and high levels of endocrine pancreatic markers such as synaptophysin and chromogranin (Table 2b and FIG. 2e) Observed in both suspension formats. These results were consistent with RT-PCR results showing very similar high levels of multiple pancreatic precursor genes expressed in samples generated in spinner flask format or Erlenmeyer flask format (Figure 2f).

これらの結果は、多能性細胞凝集体が形成され、その後、撹拌される系又は振とうされる懸濁系を含む、複数の懸濁培養形式の懸濁培養下で分化され、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１のようなβ細胞転写因子の発現によって特徴付けられる膵臓前駆細胞集団を生成し得ることを実証する。   These results indicate that pluripotent cell aggregates are formed and then differentiated under suspension culture in multiple suspension culture formats, including stirred or shaken suspension systems, and PDX1 and NKX6 Demonstrate that a pancreatic progenitor cell population characterized by the expression of β-cell transcription factors such as .1 can be generated.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

Figure 2017500013
Figure 2017500013

（実施例３）
細胞株Ｈ１のヒト胚性幹細胞の懸濁集団化及び連続懸濁継代
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）でコーティングされた、組織培養処理したポリスチレン上で成長させた、継代４０でのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１細胞，ＷｉＣｅｌｌ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を、ＰＢＳ（カタログ番号１４１９０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２度洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（１部のＰＢＳ対１部のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標），Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号Ａ−６９６４，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の半強度の溶液で処理した。細胞を室温で３分半インキュベートした（Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）は、コラーゲン分解性又はたんぱく分解酵素（甲殻類から隔離される）で構成され、哺乳類又は細菌由来の産物を含有しない、細胞剥離液である）。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）をその後に除去し、３分以上（６分半の全Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）露出）の後、１０μＭのＹ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地でプレートを濯ぎ、ガラスピペットを使用して、除去された細胞を５０ｍＬの円錐チューブに収集した。１０μＭのＹ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地でプレートの濯ぎをもう１度実行し、除去された細胞と共に貯留した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）への露出後に、いくつかの細胞はプレート上に留まり、剥離された細胞は、単一の細胞懸濁液に完全には脱凝集されなかった。代わりに、表面から小さな凝集体として細胞が除去された（図３ａ）。培地及び細胞をその後、ガラスピペットを使用して５０ｍＬの円錐チューブに移植し、細胞計数を実行した。必要に応じて、１０μＭのｙ−２７６３２を含有する追加のｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を添加して、１００〜１５０万個の細胞／ｍＬの細胞の濃度を作製した。 (Example 3)
Suspension population and continuous suspension passage of human embryonic stem cells of cell line H1 passage 40 grown on tissue culture treated polystyrene coated with Matrigel® (Corning Incorporated, Corning NY) Cells of human embryonic stem cell line H1 (WA01 cells, WiCell, Madison WI) in PBS were washed twice with PBS (Cat. No. 14190, Invitrogen) and Accutase® (1 part PBS vs 1 part Accutase). (Trademark), Sigma-Aldrich, catalog number A-6964, St. Louis, MO). Cells were incubated for 3 and a half minutes at room temperature (Accutase® is a cell detachment solution composed of collagenolytic or proteolytic enzymes (isolated from crustaceans) and containing no mammalian or bacterial products. is there). Accutase® is then removed, and after 3 minutes or more (6 and a half minutes total Accutase® exposure), the plate is rinsed with mTeSR® 1 medium containing 10 μM Y-27632. The removed cells were collected in a 50 mL conical tube using a glass pipette. The plate was rinsed one more time with mTeSR® 1 medium containing 10 μM Y-27632 and pooled with the removed cells. After exposure to Accutase®, some cells remained on the plate and the detached cells were not completely disaggregated into a single cell suspension. Instead, the cells were removed from the surface as small aggregates (FIG. 3a). The media and cells were then transplanted into a 50 mL conical tube using a glass pipette and a cell count was performed. As needed, additional mTeSR® 1 medium containing 10 μM y-27632 was added to make a concentration of cells between 1 and 1.5 million cells / mL.

集団が疎性に凝集しており、ペレットに遠心分離してピペットで再懸濁すると、単一の細胞に分離するであろうことから、細胞を遠心分離しなかった。代わりに、均一な懸濁液が形成されるまで、チューブ内の培地及び細胞を静かに渦流した。次いで、ガラスピペットを使用して、３７℃、加湿、５％のＣＯ2インキュベーター内に、２枚の超低結合培養の６ウェルの皿に細胞懸濁液を移植した。細胞を懸濁状態で９０分間インキュベートし、この時点で凝集体が観察された。次いで、凝集体を短時間で微粉化し、５５ｒｐｍで撹拌される２５ｍＬのｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を含有する、１２５ｍＬのスピナーフラスコに直接移植した（合計最終体積は、約７５ｍＬであった）。培地を３日間毎日変更し、多能性を培養下での３日目に決定した。集団の位相差顕微鏡画像は、静的懸濁培養下で９０分後に形成され、培養下で３日間にわたって増殖した、集団の均一な球状集団を示している（図３ｂ）。懸濁培養下での３日間の終了時に、マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、及びＣＸＣＲ４のフローサイトメトリー結果によって、細胞の多能性を分析した。細胞は、分化のマーカーである、ＣＸＣＲ４の発現がほとんどなく、多能性のマーカー（ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１）の高い発現を維持した。これらのデータは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞が、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）などの酵素的剥離方法を使用して、平面接着培養形式から懸濁培養に移植可能であり、動的撹拌される懸濁培養系内に多能性を維持することを示している。 Cells were not centrifuged because the population was loosely aggregated and would be separated into single cells when centrifuged into a pellet and resuspended with a pipette. Instead, the medium and cells in the tube were gently swirled until a uniform suspension was formed. The cell suspension was then transferred into two ultra-low binding culture 6-well dishes using a glass pipette in a 37 ° C., humidified, 5% CO 2 incubator. Cells were incubated in suspension for 90 minutes, at which point aggregates were observed. Aggregates were then micronized briefly and implanted directly into a 125 mL spinner flask containing 25 mL of mTeSR® 1 medium stirred at 55 rpm (total final volume was about 75 mL). The medium was changed daily for 3 days and pluripotency was determined on day 3 in culture. The phase contrast microscopic image of the population shows a uniform spherical population of the population that was formed after 90 minutes in static suspension culture and grown for 3 days in culture (FIG. 3b). At the end of 3 days in suspension culture, cell pluripotency was analyzed by flow cytometry results for markers CD9, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, and CXCR4. The cells had little expression of CXCR4, a marker of differentiation, and maintained high expression of pluripotency markers (CD9, SSEA4, TRA-1-60, and TRA-1-81). These data show that H1 hES cells can be transplanted from a flat adherent culture format to suspension culture using an enzymatic detachment method such as Accutase®, and in a dynamically stirred suspension culture system. To maintain pluripotency.

その後、更に２０回の継代のために、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）分離を使用して、多能性集団を連続的に継代させた。各継代で、５０００万個の細胞を２分間、５０ｍＬの円錐チューブ内で重力沈降させ、ＰＢＳで２度洗浄し、３７℃の水浴内で、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の添加の２及び４分後にチューブを静かに渦流することで、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の半強度の溶液で処理した。６分間のインキュベーションの後、細胞ペレットを撹乱させずに、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）をチューブから吸引した。次いで、細胞を３分以上インキュベートした（９分間の総Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）露出）。次いで、１０μＭのＹ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地でチューブを濯ぎ、ガラスピペットを使用して２度微粉化し、懸濁された細胞を７０マイクロメートルの細胞ストレーナ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ，Ｃａｔ＃３５２３５０，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に通過させた。１０μＭのＹ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地で、チューブの追加濯ぎを２度実行し、細胞ストレーナに通過させた。   Subsequently, the pluripotent population was serially passaged using Accutase® separation for another 20 passages. At each passage, 50 million cells were gravity settled for 2 minutes in a 50 mL conical tube, washed twice with PBS, and 2 and 4 minutes of Accutase® addition in a 37 ° C. water bath. Later, the tube was gently swirled to treat it with a half-strength solution of Accutase®. After 6 minutes of incubation, Accutase® was aspirated from the tube without disturbing the cell pellet. Cells were then incubated for more than 3 minutes (9 minutes total Accutase® exposure). The tube was then rinsed with mTeSR® 1 medium containing 10 μM Y-27632, micronised twice using a glass pipette, and the suspended cells were suspended in a 70 micrometer cell strainer (BD Falcon, Cat # 352350, Franklin Lakes, NJ). Two additional tube rinses were performed with mTeSR® 1 medium containing 10 μM Y-27632 and passed through the cell strainer.

均一な懸濁液が形成されるまで、チューブ内の培地及び細胞を静かに渦流した。その後、ガラスピペットを使用して３ｍＬ／ウェルで、３７℃、加湿、５％のＣＯ2インキュベーター内の超低結合培養６ウェルの皿に細胞懸濁液を移植し、懸濁状態で２時間インキュベートし（０〜２８時間テスト）、この時点で、凝集体を培地の最終体積８０ｍＬでガラススピナーフラスコに移植した。あるいは、細胞懸濁液を、５５ｒｐｍで撹拌されるスピナーフラスコ、又は４０ｒｐｍで振とうされる三角フラスコへ直接定置してもよく、集団は培地の最終体積８０ｍＬで、撹拌懸濁液（図３ｃ）内に形成された。 The medium and cells in the tube were gently swirled until a uniform suspension was formed. The cell suspension is then transferred to a 6-well dish of ultra-low binding culture in a 37 mL, humidified, 5% CO 2 incubator at 3 mL / well using a glass pipette and incubated for 2 hours in suspension. (0-28 hours test) At this point, the aggregates were transferred to a glass spinner flask with a final volume of 80 mL of media. Alternatively, the cell suspension may be placed directly into a spinner flask stirred at 55 rpm, or an Erlenmeyer flask shaken at 40 rpm, and the population is at a final volume of 80 mL of medium with a stirred suspension (FIG. 3c). Formed within.

この連続継代方法を使用して、それぞれの継代でおよそ１：３の分割比で、細胞を２０回継代させた。多能性をそれぞれの継代でフローサイトメトリーによって測定し、染色体１２及び１７（ｈＥＳ細胞内で潜在的に不安定なものとして識別される２つの染色体）について、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを使用して、核型を決定した。ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、及びＣＸＣＲ４発現のフローサイトメトリー結果を散布図形式で示す。この結果が、多能性のマーカーが高い発現であること、及び分化のマーカー（ＣＸＣＲ４）の発現がほとんど又は全くないことを示す一方、染色体１２及び１７のＦＩＳＨアッセイは、正常なコピー数を示した。これらのデータは、非哺乳類の酵素的細胞分離方法である、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を使用する、常用の連続継代によって、懸濁培養下でＨ１ ｈＥＳ細胞が維持され得、２０回の継代にわたっては、最初の入力細胞あたりに１×１０9細胞を生成する、動的撹拌される懸濁培養系で多能性及び安定した核型を維持することを示す。ＥＤＴＡもまた、この連続懸濁液に、６回の継代用として使用され得る。 Using this serial passage method, cells were passaged 20 times with a split ratio of approximately 1: 3 at each passage. Pluripotency is measured by flow cytometry at each passage, and fluorescence in situ hybridization (FISH) assay for chromosomes 12 and 17 (two chromosomes identified as potentially unstable in hES cells) Was used to determine the karyotype. Flow cytometry results for CD9, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, and CXCR4 expression are shown in scatter plot format. While this result indicates that the pluripotency marker is highly expressed and that there is little or no expression of the differentiation marker (CXCR4), the FISH assay on chromosomes 12 and 17 shows normal copy number It was. These data show that H1 hES cells can be maintained in suspension culture by routine continuous passage using Accutase®, a non-mammalian enzymatic cell separation method, with 20 passages. Over time, it is shown to maintain a pluripotent and stable karyotype in a dynamically stirred suspension culture system that produces 1 × 10 9 cells per initial input cell. EDTA can also be used in this continuous suspension for 6 passages.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

（実施例４）
細胞株Ｈ１の懸濁培養されたヒト胚性幹細胞の指向された分化
継代４０でのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１細胞，ＷｉＣｅｌｌ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を使用して平面接着培養から剥離し、懸濁培養系形式に移植した。実施例３に述べた方法を使用する３０回の継代用に、細胞を動的撹拌される懸濁培養系に維持した。 Example 4
Directed differentiation of human embryonic stem cells in suspension culture of cell line H1 Cells of human embryonic stem cell line H1 at passage 40 (WA01 cells, WiCell, Madison WI) were used with Accutase®. And detached from the flat adhesion culture and transplanted to a suspension culture system. Cells were maintained in a dynamically agitated suspension culture system for 30 passages using the method described in Example 3.

表３に示すとおり、多能性は最初の２０回の継代を通して確認され、フローサイトメトリーによって測定される、安定した高レベルの多能性マーカーが培養を通して維持された。多能性を確認し、糖尿病の治療のための細胞供給源を提供するそれらの能力を実証するために、正常な膵臓発達を繰り返すことを意図したモルフォゲン又は成長因子を含有する、異なる培地の段階式進行を通して、動的撹拌される懸濁培養系で細胞を膵臓前駆体に分化させた。このプロセスは、高いＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の同時発現によって特徴付けられる、膵臓前駆細胞集団を生じさせる。これらの細胞は、移植される際に、グルコースに反応してインスリンを分泌し、糖尿病のストレプトゾトシン誘導モデルにおいて正常血糖を維持することができる、機能的グルコース刺激インスリン分泌組織に更に成熟した。図４ｃ及び表４ｃを参照されたい。   As shown in Table 3, pluripotency was confirmed through the first 20 passages, and stable high levels of pluripotency markers were maintained throughout the culture as measured by flow cytometry. Different media stages containing morphogens or growth factors intended to repeat normal pancreatic development to confirm their pluripotency and demonstrate their ability to provide a cell source for the treatment of diabetes Throughout the formula progression, cells were differentiated into pancreatic progenitors in a dynamically stirred suspension culture system. This process yields a pancreatic progenitor cell population characterized by high PDX1 and NKX6.1 co-expression. When transplanted, these cells matured into functional glucose-stimulated insulin-secreting tissues that secrete insulin in response to glucose and can maintain normoglycemia in a streptozotocin-induced model of diabetes. See Figure 4c and Table 4c.

これらの膵臓前駆細胞を生成するため、１６回の継代用に動的撹拌される懸濁培養系で増殖し、維持したＨ１ヒト胚性幹細胞を、実施例３に述べた方法を使用して分化させた。要約すると、細胞を３０回の継代用に増殖し、これらの継代の最初の２０回分の多能性をテストした。細胞は、１６回目の継代で分化された。集団形式の多能性細胞を４℃で３時間、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地からＦＢＣ溶液（表４ａ）へ移植した。その後、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｓｔａｔ Ｂ−ＤＣＵ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）制御ユニットによって調節される、３リットルのガラス懸濁バイオリアクターに細胞集団を移植し、表４ｂに従って、５５万個の細胞／ｍＬで、分化培地内で懸濁した。細胞を、温度、ｐＨ、及び溶存酸素（ＤＯ）を調節した、閉鎖された無菌懸濁バイオリアクター（Ｆｅｒｍｐｒｏｂｅ（登録商標）ｐＨ電極２２５ｍｍ、モデル番号Ｆ−６３５、及びＢｒｏａｄｌｅｙ−Ｊａｍｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）提供の溶存酸素Ｏｘｙｐｒｏｂｅ（登録商標）１２ｍｍセンサー、モデル番号Ｄ−１４５）内で１４日間維持した。   To generate these pancreatic progenitor cells, H1 human embryonic stem cells grown and maintained in a suspension culture system that is dynamically agitated for 16 passages are differentiated using the method described in Example 3. I let you. In summary, cells were grown for 30 passages and tested for pluripotency for the first 20 of these passages. Cells were differentiated at the 16th passage. Population pluripotent cells were transplanted from mTeSR® 1 medium to FBC solution (Table 4a) at 4 ° C. for 3 hours. The cell population was then transplanted into a 3 liter glass suspension bioreactor controlled by a Sartorius Stedim Biostat B-DCU (Goettingen, Germany) control unit and differentiated media at 550,000 cells / mL according to Table 4b. Suspended within. Cells were closed, sterile suspension bioreactor with controlled temperature, pH, and dissolved oxygen (DO) (Ferprobe® pH electrode 225 mm, Model No. F-635, and Broadley-James Corporation, Irvine CA) Maintained in the provided dissolved oxygen Oxyprobe® 12 mm sensor, model number D-145) for 14 days.

運転を通して、合計培地体積≦１．６リットル内でのＣＯ2流量の調節によって、ｐＨをｐＨ７．４に維持しながら、培地の重炭酸塩レベルを３．６４ｇ／Ｌに維持した。１５０ｃｃ／分の一定のガス流量で、ステージ１について２０％の溶存酸素設定値、及びステージ２以降について３０％の溶存酸素設定値を使用したＳａｒｔｏｒｉｏｕｓ制御システムの制御の下で、ＣＯ2、空気、及びＯ2でバイオリアクターヘッドスペースを連続的に灌流した。溶存酸素含量に応じて酸素流量を調節し、ｐＨに応じてＣＯ2流量を調節した。温度は、電熱ジャケットにより、運転を通して３７℃に維持した。運転の開始時に、それぞれの培地交換（１回の交換ごとに培地の９３％を除去）について、羽根車（７０ｒｐｍで動作する３インチステンレス鋼ピッチブレード羽根車）を停止し、閉鎖系を維持するために、Ｔｅｒｕｍｏ（商標）チューブ接合装置を使用する、Ｃ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングに接続したバイオリアクター内で、ディップチューブを通した蠕動ポンプによって、培地を除去又は添加した。分化の各ステージの終了時に、細胞／集団の画像を撮影し、フローサイトメトリー試料を収集し、ステージ１、３日目、及び３日後のステージ２の終了時にＣＸＣＲ４発現について分析した（図４ａ）。分化の開始時（表３、継代１６）で、ＣＸＣＲ４陰性多能性細胞集団からＣＸＣＲ４発現（細胞の９８．５％がＣＸＣＲ４陽性、図４ｂ）細胞の集団へのほぼ完全な集団遷移が観察された。次いで、３日後のステージ２の終了時に、これらの細胞をほぼＣＸＣＲ４陰性状態に遷移し（細胞の７．０％がＣＸＣＲ４陽性）、ステージ３の終了時までに、細胞はほとんど完全にＣＤ５６陽性状態に遷移した。ステージ４の４日目の分化プロセスの終了時に、細胞はＰＤＸ１発現に対して８８．５％陽性（図４ｂ）であり、膵内分泌細胞（３３．５％クロモグラニン陽性）と膵臓前駆細胞（ＮＫＸ６．１に対して６５．７％陽性）との混合物と一貫した発現パターンを示した。このステージに特異的なマーカー発現パターンは、多能性集団から膵臓細胞への効率的なステージ式分化を示した。分化プロセスの終了時に、２７７万個の細胞／ｍＬが生成され（１．５リットルで４１億個の細胞）、インプットされたｈＥＳ細胞ごとに分化細胞５個の総質量増殖を示した。 Throughout the run, the bicarbonate level of the medium was maintained at 3.64 g / L while maintaining the pH at pH 7.4 by adjusting the CO 2 flow rate within a total medium volume ≦ 1.6 liters. Under the control of a Sartorius control system using 20% dissolved oxygen set point for stage 1 and 30% dissolved oxygen set point for stage 2 and beyond at a constant gas flow rate of 150 cc / min, CO 2 , air, And O 2 continuously perfused the bioreactor headspace. The oxygen flow rate was adjusted according to the dissolved oxygen content, and the CO 2 flow rate was adjusted according to the pH. The temperature was maintained at 37 ° C. throughout the run by an electrothermal jacket. At the start of operation, for each medium change (removing 93% of the medium with each change), the impeller (3 inch stainless steel pitch blade impeller operating at 70 rpm) is stopped and the closed system is maintained. To do this, media was removed or added by a peristaltic pump through a dip tube in a bioreactor connected to C-Flex® tubing using a Terumo ™ tube splicer. At the end of each stage of differentiation, cell / population images were taken and flow cytometry samples were collected and analyzed for CXCR4 expression at the end of stage 1, day 3, and stage 2 after 3 days (FIG. 4a). . At the start of differentiation (Table 3, passage 16), an almost complete population transition from a CXCR4 negative pluripotent cell population to CXCR4 expression (98.5% of cells are CXCR4 positive, FIG. 4b) cells is observed It was done. Then, at the end of stage 2 after 3 days, these cells transition to a nearly CXCR4 negative state (7.0% of the cells are CXCR4 positive), and by the end of stage 3, the cells are almost completely CD56 positive. Made a transition. At the end of the differentiation process on day 4 of stage 4, the cells are 88.5% positive for PDX1 expression (FIG. 4b), pancreatic endocrine cells (33.5% chromogranin positive) and pancreatic progenitor cells (NKX6. 1) showed a consistent expression pattern with a mixture of 65.7% positive to 1). This stage-specific marker expression pattern showed efficient staged differentiation from pluripotent populations to pancreatic cells. At the end of the differentiation process, 2.77 million cells / mL were generated (4.1 billion cells in 1.5 liters), showing a total mass growth of 5 differentiated cells for each input hES cell.

運転の終了時に、５００ｍＬを遠心分離及び洗浄のために除去し、生着、成熟、及び機能の動物モデルでテストした。残りの１０００ｍＬの細胞懸濁液を、ｋＳｅｐ（登録商標）４００システム（ＫＢＩ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｕｒｈａｍ ＮＣ）内で処理して、完全な閉ループ系において細胞産物を洗浄、濾過、及び濃縮した。細胞産物を、１リットルの開始体積から、最終濃度４１００万個の細胞／ｍＬに濃縮された細胞５０ｍＬまで濃縮した。次いで、自動化バイアル充填機（Ｆｉｌｌ−Ｉｔ，ＴＡＰ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ ＵＫ）を使用して、１．２ｍＬの充填体積を有する２４個のバイアル内に、これらの濃縮された細胞を分注し、液体窒素冷凍庫内に定置することによって凍結した。   At the end of the run, 500 mL was removed for centrifugation and washing and tested in an animal model of engraftment, maturation, and function. The remaining 1000 mL of cell suspension was processed in a kSep® 400 system (KBI Biosystems, Durham NC) to wash, filter, and concentrate the cell product in a complete closed loop system. Cell products were concentrated from a starting volume of 1 liter to 50 mL of cells concentrated to a final concentration of 41 million cells / mL. The concentrated cells were then dispensed into 24 vials with a 1.2 mL fill volume using an automated vial filling machine (Fill-It, TAP, Hertfordshire UK) and liquid nitrogen freezer Frozen by placing in.

洗浄され、標準遠心分離によって濃縮された５００ｍＬの分化細胞を、腎臓被膜下に直接定置するか、又は皮下に埋め込まれた免疫保護マクロ封入デバイス（ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標），Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）内に定置するかのいずれかで、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス１匹当たり５００万個の細胞の用量で移植した（１条件につき６体の動物）。埋め込みから１２週間後までに、埋め込まれた細胞は、空腹及びその後の供給に反応して、ＥＬＩＳＡ（ヒトＣ−ペプチドカスタムＥＬＩＳＡ Ｍｅｒｃｏｄｉａ，ｃａｔ＃ １０−１１４１−０１）によって検出される、有意なレベルの循環ヒトＣ−ペプチド（＞０．１ｎｇ／ｍＬ）を発現し、１６〜２０週後までに、動物は１ｎｇ／ｍＬを超える循環Ｃ−ペプチドを有した（表４ｃ）。   Whether 500 mL of differentiated cells that have been washed and concentrated by standard centrifugation are placed directly under the kidney capsule or placed in an immunoprotective macroencapsulation device (TheraCyte ™, Irvine CA) implanted subcutaneously In any of the cases, a dose of 5 million cells per SCID-Bg mouse was transplanted (6 animals per condition). By 12 weeks post-implantation, the implanted cells responded to hunger and subsequent feeding in a significant level detected by ELISA (human C-peptide custom ELISA Mercasia, cat # 10-1141-01) Of circulating human C-peptide (> 0.1 ng / mL) and by 16-20 weeks, animals had more than 1 ng / mL circulating C-peptide (Table 4c).

埋め込みから２７週間（１９０日）後に、デバイス封入された免疫保護移植片を有する２体の動物を、単一の高用量のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）でそれぞれ処理して、全ての内因性マウスβ島細胞を選択的に殺し、糖尿病を誘導した（２５０ｍｇ／Ｋｇ）。対照動物において真性糖尿病を誘導するために十分なＳＴＺ処理から翌２週間は、移植された動物の血糖レベルが正常な範囲（＜１５０ｍｇ／ｄＬ）内に留まった。埋め込みから２９週間後、及びＳＴＺ投与の２週間後に、２体の動物がグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）についてテストされ、グルコース投与に反応する循環ヒトＣ−ペプチドにおける著しい増加を示した。更に、埋め込みから２０９日（２９．５週間）後、それぞれの移植片を除去する際に、動物の血糖レベルが＞５００ｍｇ／ｄＬへと劇的に増加した。   Twenty-seven weeks (190 days) after implantation, two animals with device-encapsulated immunoprotective grafts were each treated with a single high dose of streptozotocin (STZ) to produce all endogenous mouse beta islet cells. Was selectively killed to induce diabetes (250 mg / Kg). The blood glucose levels of the transplanted animals remained within the normal range (<150 mg / dL) for 2 weeks following the STZ treatment sufficient to induce diabetes mellitus in the control animals. Two weeks after implantation and 2 weeks after STZ administration, two animals were tested for glucose stimulated insulin secretion (GSIS) and showed a marked increase in circulating human C-peptide in response to glucose administration. In addition, 209 days (29.5 weeks) after implantation, the blood glucose level of the animals increased dramatically to> 500 mg / dL upon removal of each graft.

これらの結果は、糖尿病を治療するためのヒト胚性幹細胞由来の細胞産物が、増殖及び分化された幹細胞の懸濁液から調製され得ることを実証する。産物は、計測可能な、撹拌される閉ループバイオリアクター系で生成され得、細胞産物は、商業的ｃＧＭＰの製造に必要とされる、閉ループ洗浄及び濃度で処理され得る。このヒト胚性幹細胞由来の細胞産物は、血糖を調節する能力であるＧＳＩＳ能力、及び細胞治療の除去時の糖尿病状態への回帰に示されるように、広く使用される糖尿病の動物モデルにおいて糖尿病を治療し得る。   These results demonstrate that cell products derived from human embryonic stem cells for treating diabetes can be prepared from a suspension of expanded and differentiated stem cells. The product can be produced in a measurable, agitated closed loop bioreactor system, and the cell product can be processed with the closed loop wash and concentration required for commercial cGMP production. This human embryonic stem cell-derived cell product is effective in diabetics in widely used animal models of diabetes, as shown by its ability to regulate blood glucose, GSIS ability, and the return to diabetic state upon removal of cell therapy. Can be treated.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

Figure 2017500013
Figure 2017500013

（専門用語：時間０＝新しいステージの最初の供給、時間２４、４８、又は９６時間＝新しいステージ培地の経過時間）   (Terminology: time 0 = initial supply of new stage, time 24, 48, or 96 hours = elapsed time of new stage medium)

Figure 2017500013
Figure 2017500013

（実施例５）
細胞株Ｈ１の接着培養されたヒト胚性幹細胞の懸濁形式における指向された分化
継代４１でのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１細胞，ＷｉＣｅｌｌ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を、ＥＤＴＡを使用して平面接着培養から剥離し、例２に述べた方法を使用して懸濁培養系形式に移植した。 (Example 5)
Directed differentiation in suspension format of adherent cultured human embryonic stem cells of cell line H1 Cells of human embryonic stem cell line H1 at passage 41 (WA01 cells, WiCell, Madison WI) were used using EDTA. Peel from the flat adhesion culture and transfer to suspension culture format using the method described in Example 2.

図５ａに示すとおり、フローサイトメトリーによって細胞凝集体の多能性を測定し、細胞が高度に多能性であることを示す、多能性マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６１、及びＴＲＡ−１−８０の高い発現が観察された。次いで、正常な膵臓発達のモルフォゲン駆動体を繰り返すことを意図した、小分子及び成長因子を含有する、培地の段階式進行を通して、これらの多能性細胞を動的に撹拌される懸濁培養系で膵臓前駆体に分化させた。このプロセスは、膵臓細胞転写因子、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の同時発現によって特徴付けられる、膵臓前駆細胞集団を産生する。これらの細胞が移植される際、それらは、糖尿病のストレプトゾトシン誘導モデルにおける高血糖を補正し得る、機能的なグルコース刺激インスリン分泌組織に更に成熟する。   As shown in FIG. 5a, pluripotency markers CD9, SSEA4, TRA-1-61, and TRA, which measure the pluripotency of cell aggregates by flow cytometry and indicate that the cells are highly pluripotent High expression of -1-80 was observed. A suspension culture system in which these pluripotent cells are then dynamically agitated through a step-by-step progression of medium containing small molecules and growth factors, intended to repeat normal pancreatic development morphogen drivers To differentiate into pancreatic precursors. This process produces a pancreatic progenitor cell population characterized by the co-expression of pancreatic cell transcription factors, PDX1 and NKX6.1. When these cells are transplanted, they mature further into functional glucose-stimulated insulin-secreting tissues that can correct hyperglycemia in a streptozotocin-induced model of diabetes.

膵臓前駆細胞集団を生成するために、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地内で維持された集団形式の多能性細胞を、制御装置で調整した温度、ｐＨ、及び溶存酸素を有する、０．２リットルのガラス製の撹拌懸濁バイオリアクター（Ｄａｓｇｉｐ，カタログ番号ＤＳ０２００ ＴＢＳＣ，Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ，ＭＡ）に移植した。多能性細胞集団をバイオリアクターで２日間培養した。その時点（ステージ１、０日目）で培地を交換し、分化を開始させながら、表５ａに従って分化培地内において細胞約７０万個／ｍＬで、細胞凝集体を懸濁させた。その後、この閉鎖された無菌懸濁バイオリアクター内で、細胞を１４日間維持した。分化全体を通して、合計体積０．３リットル内でのＣＯ2流量の調節によって、ｐＨをｐＨ７．４に維持しながら、培地の重炭酸塩レベルを３．６４ｇ／Ｌに維持した。５リットル／時間の一定のガス流量において、３０％の溶存酸素設定値でのＤａｓｇｉｐ制御システムの制御下で、バイオリアクターヘッドスペースにＣＯ2及び空気を注入した。溶存酸素含量に応じて空気流量を調節し、ｐＨに応じてＣＯ2流量を調節した。 To produce a pancreatic progenitor cell population, a pluripotent cell in a population format maintained in mTeSR® 1 medium is 0.2 liters with temperature, pH, and dissolved oxygen adjusted by a controller. In a glass stirred suspension bioreactor (Dasgip, catalog number DS0200 TBSC, Shrewsbury, Mass.). The pluripotent cell population was cultured in a bioreactor for 2 days. At that time (stage 1, day 0), the medium was changed and cell differentiation was started, and cell aggregates were suspended at about 700,000 cells / mL in the differentiation medium according to Table 5a. Cells were then maintained for 14 days in this closed sterile suspension bioreactor. Throughout the differentiation, the bicarbonate level of the medium was maintained at 3.64 g / L while maintaining the pH at pH 7.4 by adjusting the CO 2 flow rate within a total volume of 0.3 liters. CO 2 and air were injected into the bioreactor headspace under control of the Dasgip control system with a dissolved oxygen set point of 30% at a constant gas flow rate of 5 liters / hour. The air flow rate was adjusted according to the dissolved oxygen content, and the CO 2 flow rate was adjusted according to the pH.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

この実施例で、及び本明細書全体で使用されるとおり、ＳＣＩＯは、化学名４−｛［２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−ｙｌ］アミノ｝−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）ピリジン−３−カルボキサミド及びＣＡＳ番号６７４７９４−９７−９を有する、Ａｌｋ５阻害剤である。ＳＣＩＯの化学構造を以下に示す。   As used in this example and throughout this specification, SCIO is given the chemical name 4-{[2- (5-chloro-2-fluorophenyl) -5- (1-methylethyl) pyrimidine-4- yl] amino} -N- (2-hydroxypropyl) pyridine-3-carboxamide and an Alk5 inhibitor having CAS number 675794-97-9. The chemical structure of SCIO is shown below.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

温度は、運転を通して３７℃に維持した。運転開始時に、それぞれの培地交換（１回の交換につき培地の９５％を除去）について、羽根車を停止し、Ｔｅｒｕｍｏ（商標）チューブ接合装置を使用したＣ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングに接続した、バイオリアクターディップチューブを通る蠕動ポンプによって、培地を除去してから添加して、閉鎖系を維持した。   The temperature was maintained at 37 ° C throughout the run. At the start of operation, for each medium change (removing 95% of the medium per change), the impeller was stopped and connected to C-Flex® tubing using a Terumo ™ tube splicer. The medium was removed and added by a peristaltic pump through the bioreactor dip tube to maintain a closed system.

ステージ１において、いくつかの異なる供給設定、（ａ）分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし、（ｂ）分化開始から２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤添加、及び（ｃ）グルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を分化開始から２４時間後に添加して、その後開始から４８時間後にグルコース巨塊剤を添加して、ステージ１を通して培地変更なし、をテストした。   In stage 1, several different feeding settings: (a) medium change 24 hours after start of differentiation, no medium change at 48 hours, (b) medium change 24 hours after start of differentiation, and glucose mass at 48 hours And (c) glucose and GDF8 block were added 24 hours after the start of differentiation, and then the glucose block was added 48 hours after the start, and no change of medium was tested through stage 1.

表５ｂに示すとおり、リアクターごとに、プロセスの開始、中間、及び終了時の細胞計数を取得した。ステージ１の終了時に、フローサイトメトリーによるたんぱく質発現パターンについて、細胞を試料採取した。条件Ａ（分化開始から２４時間後に胚体内胚葉に培地変更、その後４８時間培地変更なし）において分化した細胞が、分化のマーカー（ＣＤ９９及びＣＸＣＲ４）の誘導、並びに多能性マーカー発現（ＣＤ９）の低減によって測定される、最良の結果を示した（図５ｂ）。胚体内胚葉形成の終了時点での、ＣＤ９のより低い発現との組み合わせにおけるＣＸＣＲ４及びＣＤ９９のより高い発現は、膵臓遺伝子のより高い発現、及び分化における後の代替器官運命を示す遺伝子のより低い発現と相関した（図５ｄ及び５ｅ）。具体的には、分化の第１のステージを通して培地を変更しないこと、又はステージ１においてバルク供給形式でグルコースを培地に添加することのいずれか又は両方は、４つのステージの分化の終了時の非常に異なる凝集体形態と相関する、ステージ１の終了時のより低いＣＸＣＲ４レベルをもたらした（図５ｃ）。具体的には、条件Ｂ及びＣは、ステージ４の終了時に、フローサイトメトリーによって測定される、より低い膵臓遺伝子発現（ＮＫＸ６．１及びＣＨＧＡ）、及び非膵臓遺伝子（ＣＤＸ２及びＳＯＸ２）のより高い発現を有した（図５ｄ及び表５ｂ）。これらの発見はｑＲＴ−ＰＣＲ（図５ｅ）によって裏付けられており、条件Ａは条件Ｃよりも膵臓遺伝子の発現が有意に高く、条件ＢはＡ及びＣの中間であることを示した。更に、条件Ｃは、例えば、ＣＤＸ２、ＡＦＰ、及びアルブミン（図５ｅ）など、代替の非膵臓運命を示す有意により高いレベルの遺伝子を発現した。これらのデータは、ＤＥ形成の最後の４８時間に培地変更なしで生成される、均質で高いＣＸＣＲ４を発現する胚体内胚葉（ＤＥ）が、純粋な膵臓内胚葉集団に後から変換できることを示す。   Cell counts at the beginning, middle, and end of the process were obtained for each reactor as shown in Table 5b. At the end of stage 1, cells were sampled for protein expression patterns by flow cytometry. Cells differentiated under the condition A (the medium change to definitive endoderm 24 hours after the start of differentiation, and then no medium change for 48 hours) induced differentiation markers (CD99 and CXCR4) and pluripotency marker expression (CD9). The best results, measured by reduction, were shown (Figure 5b). Higher expression of CXCR4 and CD99 in combination with lower expression of CD9 at the end of definitive endoderm formation is higher expression of pancreatic genes and lower expression of genes that indicate later alternative organ fate in differentiation (FIGS. 5d and 5e). Specifically, either or both of not changing the medium throughout the first stage of differentiation, or adding glucose to the medium in a bulk-fed form in stage 1, is an emergency at the end of the differentiation of the four stages. Resulted in lower CXCR4 levels at the end of stage 1, correlating with different aggregate forms (FIG. 5c). Specifically, Conditions B and C are lower pancreatic gene expression (NKX6.1 and CHGA) and higher non-pancreatic genes (CDX2 and SOX2) as measured by flow cytometry at the end of stage 4 Had expression (Figure 5d and Table 5b). These findings are supported by qRT-PCR (FIG. 5e), showing that condition A has significantly higher pancreatic gene expression than condition C, and condition B is intermediate between A and C. In addition, Condition C expressed significantly higher levels of genes exhibiting alternative non-pancreatic fate, such as CDX2, AFP, and albumin (FIG. 5e). These data indicate that homogenous and high CXCR4 expressing definitive endoderm (DE) produced without media change in the last 48 hours of DE formation can be later converted to a pure pancreatic endoderm population.

４つのステージの分化の終了時に、条件Ａに従って分化した細胞をバイオリアクターから除去し、０．１％のＦＡＦ−ＢＳＡを含有するＭＣＤＢ１３１培地で洗浄し、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウスに埋め込んだ。それぞれのマウスに、５００万個の細胞を腎臓被膜下に直接移植した。埋め込み後４週間毎に、採血を実行し、血糖及びＣペプチドを測定した。埋め込みの１２週間後までに、ヒトＣペプチドは、ＥＬＩＳＡによって１ｎｇ／ｍＬを超えるレベルで検出可能であり、１６週目でＣペプチドレベルは平均２．５ｎｇ／ｍＬであった（図５ｆ）。埋め込み後２０週で、空腹にさせてから供給した状態の動物でＣペプチドを測定した。グルコース処理は、空腹状態の０．９３ｎｇ／ｍＬから、供給状態の２．３９ｎｇ／ｍＬまで、循環ヒトＣペプチドにおける有意な増加を誘導し（図５ｇ）、移植された細胞が機能的ＧＳＩＳコンピテント組織へと成熟したことを示した。更に、動物にストレプトゾトシン（ＳＴＺ）投与（マウスβ細胞は、ヒトβ細胞と比較して、より敏感であり、ＳＴＺによって優先的に破壊される）を与えて、糖尿病の状態を誘導した際、機能的ＧＳＩＳコンピテント組織の移植片を有する動物は、真性糖尿病を発症した未処理の対照とは異なり、正常な血糖レベルを維持した（図５ｈ）。これらの結果は、ｈＥＳ分化細胞移植片を有する動物が、機能的膵臓組織移植片によって、ＳＴＺ誘導糖尿病から保護されたことを実証する。   At the end of the four stages of differentiation, cells differentiated according to Condition A were removed from the bioreactor, washed with MCDB131 medium containing 0.1% FAF-BSA, and embedded in SCID-Bg mice. Each mouse was transplanted directly with 5 million cells directly under the kidney capsule. Blood sampling was performed every 4 weeks after implantation, and blood glucose and C peptide were measured. By 12 weeks after implantation, human C-peptide was detectable by ELISA at levels above 1 ng / mL, and at 16 weeks C-peptide levels averaged 2.5 ng / mL (Figure 5f). Twenty weeks after implantation, C-peptide was measured in animals fed after being fasted. Glucose treatment induced a significant increase in circulating human C-peptide from 0.93 ng / mL in the fasted state to 2.39 ng / mL in the fed state (Figure 5g), and the transplanted cells were functional GSIS competent. Shows that it has matured into an organization. Furthermore, when the animals were given streptozotocin (STZ) administration (mouse β cells are more sensitive and preferentially destroyed by STZ compared to human β cells), Animals with experimental GSIS competent tissue grafts maintained normal blood glucose levels, unlike untreated controls that developed diabetes mellitus (FIG. 5h). These results demonstrate that animals with hES differentiated cell grafts were protected from STZ-induced diabetes by functional pancreatic tissue grafts.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

（実施例６）
細胞株Ｈ１のマイクロキャリア接着培養されたヒト胚性幹細胞の懸濁液形式における指向された分化
Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３マイクロキャリアビーズ（Ｃ３）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ ＬＬＣ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，カタログ番号Ｃ３２７５）を、１５ｍＬのＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（ＤＰＢＳ）を含有する、２０ｍＬの体積のシリコンコーティングされたガラスシンチレーションバイアル瓶内に、４００ｍｇのビーズを４〜２４時間浸漬することによって、培養用に調製した。Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３は、架橋デキストランのマトリックスに化学結合させた、変性コラーゲンの薄い層から構成される。Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３の変性コラーゲン層は、トリプシン及びコラゲナーゼが挙げられる、さまざまなプロテアーゼにより消化されやすく、細胞の生存率、機能及び完全性を最大限維持しつつ、細胞をマイクロキャリアから取り外すという性能を提供する。 (Example 6)
Directed differentiation in suspension format of human embryonic stem cells cultured in microcarrier adhesion culture of cell line H1 Cytodex® 3 microcarrier beads (C3) (Sigma-Aldrich Co LLC, St. Louis, MO, Catalog No. C3275) was prepared for culture by immersing 400 mg beads in a 20 mL volume silicon coated glass scintillation vial containing 15 mL Dulbecco's PBS (DPBS) for 4-24 hours. . Cytodex® 3 is composed of a thin layer of denatured collagen chemically bonded to a matrix of cross-linked dextran. Cytodex® 3's denatured collagen layer is easily digested by various proteases, including trypsin and collagenase, and removes cells from microcarriers while maintaining maximum cell viability, function and integrity. Provides performance.

浸漬後、ビーズを加圧滅菌し、無菌ＤＰＢＳで濯ぎ、１０μＭのＹ２７６３２を添加したマウス胚性繊維芽細胞調湿培地（ＭＥＦ−ＣＭ）内で再懸濁した。その後、１２５ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ガラススピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に、ビーズ１００ｍｇ／フラスコの密度でビーズを移植した。Ｙ２７６３２と共にビーズ及びＭＥＦ−ＣＭを含有するスピナを、３７℃、加湿、５％のＣＯ2インキュベーター内で少なくとも６０分間均衡化した。 After soaking, the beads were autoclaved, rinsed with sterile DPBS, and resuspended in mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) supplemented with 10 μM Y27632. The beads were then implanted at a density of 100 mg beads / flask into a 125 mL Corning® glass spinner flask (Corning Incorporated, Corning, NY). A spinner containing beads and MEF-CM with Y27632 was equilibrated for at least 60 minutes in a 37 ° C., humidified, 5% CO 2 incubator.

継代４４での、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１細胞、ＷｉＣｅｌｌ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用して平面接着培養から剥離した（３７℃で８分間インキュベーションして、単一の細胞懸濁液を形成）。次いで、細胞を洗浄し、Ｙ−２７６３２を有するＭＥＦ−ＣＭ内で懸濁し、１１００万個のｈＥＳ細胞を、静的（静止）インキュベーション期間中６時間、ビーズに接着させた。次いで、Ｙ−２７６３２を有するＭＥＦ−ＣＭをスピナーフラスコに添加して、７５ｍＬの最終培地体積を作製し、細胞及びビーズをガラススピナーフラスコ内で５０ｒｐｍの羽根車速度で撹拌した。ＭＥＦ−ＣＭを毎日５０ｍＬの培地交換をしながら、この様式で５日間細胞を成長させた。培養下で５日後に、フラスコは５３×１０6個の細胞（±１２×１０6ＳＤ）を含有した。対照として、１００万個のＨ１ ｈＥＳ細胞もまた、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）の１：３０希釈でコーティングされた、６ウェルの組織培養ポリスチレン皿に播種し、ＭＥＦ−ＣＭの毎日の培地変更を維持した。 Cells of human embryonic stem cell line H1 (WA01 cells, WiCell, Madison WI) at passage 44 were detached from planar adhesion culture using TrypLE ™ (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY) ( Incubate at 37 ° C. for 8 minutes to form a single cell suspension). The cells were then washed and suspended in MEF-CM with Y-27632 and 11 million hES cells were allowed to adhere to the beads for 6 hours during the static (stationary) incubation period. MEF-CM with Y-27632 was then added to the spinner flask to make a final media volume of 75 mL and the cells and beads were agitated in a glass spinner flask at an impeller speed of 50 rpm. Cells were grown in this manner for 5 days with 50 ml medium change daily for MEF-CM. After 5 days in culture, the flask contained 53 × 10 6 cells (± 12 × 10 6 SD). As a control, 1 million H1 hES cells were also seeded in 6-well tissue culture polystyrene dishes coated with a 1:30 dilution of Matrigel ™ to maintain daily media changes in MEF-CM.

多能性培養下で５日後に、正常な膵臓発達モルフォゲンを繰り返すことを意図した、小分子及び／又は成長因子のいずれか又は両方を含有する異なる培地の段階式進行を通して、これらの細胞はその後、動的撹拌される懸濁培養系で膵臓前駆体に分化した。正常な膵臓発達を繰り返すための方法として、２つの培地製剤、アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａを使用してＤＥを形成したもの、及びＧＤＦ８を有するＭＣＸ化合物を使用してＤＥを形成したもの（それぞれ、表６ａ及び６ｂ）をテストした。培地を毎日変更し、ＲＴ−ＰＣＲ及びフローサイトメトリーによって試料を特徴付け、細胞特性を決定した。マイクロキャリア上の細胞の位相差画像を撮影し、細胞の分化が開始する前の、多能性培養系としての細胞形態の時間経過を図６ａに示す。培養分化を示す時間経過を図６ｂに示す。また、実験を通してさまざまな時点で細胞計数を取得し、結果を、平面培養下又は懸濁マイクロキャリア培養下のいずれかの培地製剤について、表面積の関数（図６ｃの細胞／ｃｍ2）又は培地体積（図６ｄの細胞／ｍＬ）として示した。 After 5 days in pluripotent culture, these cells are then passed through a staged progression of different media containing small molecules and / or growth factors intended to repeat normal pancreatic development morphogens. Differentiated into pancreatic progenitors in a suspension culture system with dynamic stirring. Methods for repeating normal pancreatic development include the formation of DE using two media formulations, activin A and Wnt3A, and the formation of DE using MCX compounds with GDF8 (Table 6a, respectively) And 6b) were tested. The medium was changed daily and samples were characterized by RT-PCR and flow cytometry to determine cell characteristics. FIG. 6a shows the time course of cell morphology as a pluripotent culture system before phase differentiation images of cells on microcarriers were taken and cell differentiation started. The time course showing culture differentiation is shown in FIG. 6b. Also, cell counts were obtained at various time points throughout the experiment and the results were obtained as a function of surface area (cells / cm 2 in FIG. 6c) or media volume for either a planar culture or a suspension microcarrier culture. (Cells / mL in FIG. 6d).

プロセスを通したさまざまな点で、フローサイトメトリー及びＲＴ−ＰＣＲによって、細胞が特徴付けられた。分化の第１のステージのフローサイトメトリーの結果、胚体内胚葉の形成を、ＣＸＣＲ４（Ｙ軸）及びＣＤ９（Ｘ軸）の細胞発現のドットプロットとして図６ｅに示し、結果をまた、各マーカーの全発現として図６ｆに表す。結果は、全ての条件において、ＣＸＣＲ４発現の利得、及び多能性表面マーカー、ＣＤ９の損失によって定義されるように、実質的に大多数の細胞が胚体内胚葉を形成することを示す。更に、胚体内胚葉のより効率的な形成が、ＭＣＸ／ＧＤＦ８マイクロキャリア＞ＭＣＸ／ＧＤＦ８平面＞ＷＮＴ３Ａ／ＡＡマイクロキャリア＞ＷＮＴ３Ａ／ＡＡ平面からの処理の順位で生じる。ＭＣＸ／ＧＤＦ８で処理した細胞は、ＣＥＲＢＥＲＵＳ（Ｃｅｒ１）、グースコイド、及びＦＧＦ１７（図６ｇ）のより低い発現を示すため、細胞に対する、培地に特異的な影響はないように見えるが、全ての処理条件は、胚体内胚葉遺伝子であるＣＤ９９、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＫＩＴ、及びＳＯＸ１７の類似した発現レベルを示す（図６ｇ及び表６ｃ）。これらのプロセスは、膵臓細胞転写因子、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の同時発現によって特徴付けられる、膵臓前駆細胞集団を生成する。これらの細胞が移植される際、それらは、糖尿病のストレプトゾトシン誘導モデルにおける高血糖を補正し得る、機能的なグルコース刺激インスリン分泌組織に更に成熟する。   At various points throughout the process, cells were characterized by flow cytometry and RT-PCR. As a result of flow cytometry of the first stage of differentiation, definitive endoderm formation is shown in FIG. 6e as a dot plot of cell expression of CXCR4 (Y axis) and CD9 (X axis), and the results are also shown for each marker. Total expression is shown in FIG. The results show that in all conditions, substantially the majority of cells form definitive endoderm as defined by the gain of CXCR4 expression and the loss of the pluripotent surface marker, CD9. Furthermore, more efficient formation of definitive endoderm occurs in order of treatment from MCX / GDF8 microcarrier> MCX / GDF8 plane> WNT3A / AA microcarrier> WNT3A / AA plane. Cells treated with MCX / GDF8 show lower expression of CERBERUS (Cer1), goosecoid, and FGF17 (FIG. 6g), so there appears to be no media specific effect on the cells, but all treatment conditions Shows similar expression levels of the definitive endoderm genes CD99, CXCR4, FOXA2, KIT, and SOX17 (FIG. 6g and Table 6c). These processes generate a pancreatic progenitor cell population characterized by the co-expression of pancreatic cell transcription factors, PDX1 and NKX6.1. When these cells are transplanted, they mature further into functional glucose-stimulated insulin-secreting tissues that can correct hyperglycemia in a streptozotocin-induced model of diabetes.

下の表６ａで使用するとおり、Ｂ２７はＧｉｂｃｏ（登録商標）Ｂ−２７（登録商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。   As used in Table 6a below, B27 is Gibco (R) B-27 (R) Supplement (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA).

この実施例で使用するとおり、ＭＣＸ化合物は、１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オンであり、以下の式（式１）を有する。   As used in this example, the MCX compound is 14-prop-2-en-1-yl-3,5,7,14,17,23,27-heptazatetracyclo [19.3.1.1. ~ 2, 6 ~. 1-8,12-] heptacosa-1 (25), 2 (27), 3,5,8 (26), 9,11,1,23-nonaen-16-one, and the following formula (formula 1 ).

Figure 2017500013
Figure 2017500013

上記のＭＣＸ化合物の代わりに、他の環式アニリンピリジノトリアジンもまた使用され得る。かかる化合物としては、限定されるものではないが、１４−メチル−３，５，７，１４，１８，２４，２８−ヘプタアザテトラシクロ［２０．３．１．１〜２，６〜．−１〜８，１２〜］オクタコサ−１（２６），２（２８），３，５，８（２７），９，１１，２２，２４−ノナエン−１７−ｏｎ−ｅ、及び５−クロロ−１，８，１０，１２，１６，２２，２６，３２−オクタアザペンタシクロ［２４．２．２．１〜３，７〜−１〜９，１３〜．１〜１４，１８〜］トリトリアコンタ−３（３３），４，６，９（３２），１０−，１２，１４（３１），１５，１７−ノナエン−２３−オンが挙げられる。これらの配合物を以下に示す（式２及び式３）。   Instead of the above MCX compounds, other cyclic aniline pyridinotriazines can also be used. Such compounds include, but are not limited to, 14-methyl-3,5,7,14,18,24,28-heptazatetracyclo [20.3.1.1-2,6-. -1-8, 12-] octacosa-1 (26), 2 (28), 3, 5, 8 (27), 9, 11, 22, 24-nonaene-17-one-e, and 5-chloro- 1,8,10,12,16,22,26,32-octazaazapentacyclo [24.2.2.1,3-, 7--1 to 9,13-. 1-14, 18-] Tritria contour-3 (33), 4, 6, 9 (32), 10-, 12, 14 (31), 15, 17-nonaen-23-one. These formulations are shown below (Formula 2 and Formula 3).

Figure 2017500013
Figure 2017500013

例示の好適な化合物は、米国特許出願公開第２０１０／００１５７１１号に開示され、その開示は、ＭＣＸ化合物、関連する環式アニリンピリジノトリアジン、及びそれらの合成に関連するため、その全体が組み込まれる。   Exemplary suitable compounds are disclosed in US Patent Application Publication No. 2010/0015711, the disclosure of which is incorporated in its entirety as it relates to MCX compounds, related cyclic aniline pyridinotriazines, and their synthesis. .

この実施例のステージ４で使用したＣｙｐ２６阻害剤は、Ｎ−｛４−［２−エチル−１−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ブチル］フェニル｝−１，３−ベンゾチアゾール−２−アミンであり、これは、ＣＡＳ番号２０１４１０−５３−９及び以下の構造を有する。   The Cyp26 inhibitor used in stage 4 of this example is N- {4- [2-ethyl-1- (1H-1,2,4-triazol-1-yl) butyl] phenyl} -1,3- Benzothiazol-2-amine, which has CAS number 201410-53-9 and the following structure:

Figure 2017500013
Figure 2017500013

このＣｙｐ２６阻害剤は、「Ｃｙｐｉ」としても知られている。このＣｙｐ２６阻害剤の構造及び合成は、米国特許番号第７，３７８，４３３号に開示されており、その開示はＣｙｐ２６阻害剤及びそれらの合成に関連することから、その全体が組み込まれる。   This Cyp26 inhibitor is also known as “Cypi”. The structure and synthesis of this Cyp26 inhibitor is disclosed in US Pat. No. 7,378,433, the disclosure of which is incorporated in its entirety as it relates to Cyp26 inhibitors and their synthesis.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

Figure 2017500013
Figure 2017500013

Figure 2017500013
Figure 2017500013

（実施例７）
この実施例には、Ｈ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞株のサブクローン、ＷＢ０１０６を使用した。ＷＢ０１０６を、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で、ＤＤＬ−１３と呼ばれるＨ１株種材料から誘導した。Ｈ１株のＷＢ０１０６サブクローンを、継代２３で解凍したＤＤＬ−１３バイアルから、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）基質上のｍＴＥＳＲ１（登録商標）１培地内に誘導し、続いてＥＤＴＡを使用して継代した。ＷＢ０１０６を継代２８で凍結し、正常な核型（ＦＩＳＨ及びＧバンド）、膵臓前駆細胞に分化する能力、及び集団を形成し、懸濁培養下で増殖する適格性に基づいて、これらの研究のために選択した。 (Example 7)
In this example, a subclone of the H1 (WA01) hES cell line, WB0106 was used. WB0106 was derived from an H1 strain seed material called DDL-13 at the WiCell Research Institute (Madison, Wis.). H1 strain WB0106 subclone was induced from DDL-13 vial thawed at passage 23 into mTESR1® 1 medium on Matrigel ™ substrate, followed by passage using EDTA. These studies were based on freezing WB0106 at passage 28, normal karyotype (FISH and G band), ability to differentiate into pancreatic progenitor cells, and the ability to form populations and grow in suspension culture. Selected for.

その後、Ｔ２２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）内のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）の基質上の培地内に、ＷＢ０１０６ ＷＣＢバイアルを解凍し、第１の継代で細胞を複数のＴ２２５フラスコへ増殖させた。第２の継代で、単一の２層Ｃｅｌｌ Ｓｔａｃｋ（商標）（ＣＳ２）を播種するため、複数のＴ２２５フラスコからの細胞を結合して使用した。ＣＳ２が７０％コンフルエントになると、隣接するポンプチュービングを有するＣ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングアセンブリキャップを培地ポートに結合し、系を閉鎖した。Ｃ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングによって系を閉鎖した後、袋又はボトルをＴｅｒｕｍｏ接合装置で溶接し、蠕動ポンプを使用して液体体積（培地、ＰＢＳ-/-、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）、又は懸濁細胞）を移した。 The WB0106 WCB vial was then thawed into the medium on Matrigel ™ substrate in a T225 flask (Corning Incorporated, Corning, NY) and cells were grown to multiple T225 flasks at the first passage. At the second passage, cells from multiple T225 flasks were combined and used to seed a single bilayer Cell Stack ™ (CS2). When CS2 was 70% confluent, a C-Flex® tubing assembly cap with adjacent pump tubing was connected to the media port and the system was closed. After closing the system with C-Flex® tubing, the bag or bottle is welded with a Terumo joining device and the peristaltic pump is used to liquid volume (medium, PBS − / − , Accutase®, or suspension). Turbid cells) were transferred.

細胞をＣＳ２から剥離するために、細胞をＰＢＳ-/-で１度洗浄し、その後ＰＢＳ-/-で希釈したＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の半強度の溶液で処理し、４〜５分間インキュベートした。次いで、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を除去し、酵素溶液の適用から３分後に、ＣＳ２を軽打して細胞の剥離を促進した。０．５％のＢＳＡを添加し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤であるＹ−２７６３２を含有する、培地のボトルを、ＣＳ２内にポンプで注入することで残留のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を濯ぎ、不活性化してから、濯ぎ液を収集した。第２の濯ぎ液の体積を添加し、収集し、第１の濯ぎ液と共に貯留した。その後、２００ｍＬ中の２．０〜２．５×１０8個の細胞を、１層のＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）内に移植し、加湿、５％のＣＯ2インキュベーター内で２時間、３７℃でインキュベートした。２つのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）培地ポート間に結合したポンプチュービングを有する、Ｃ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングの閉ループを使用して、細胞懸濁液を蠕動ポンプによって７５ｒｐｍで５分間微粉化して、凝集体を均質化した。閉ループチュービングを無菌０．２マイクロメートル濾過器と交換して、ガス交換を可能にし、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）を加湿、５％のＣＯ2インキュベーター内で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション（１２〜２２時間、最適１８時間）の後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）内の細胞は、多能性細胞の丸い球状の凝集体（集団）を形成した。 To peel the cells from CS2, cells PBS - / - was washed once with, and then PBS - / - in and treated with a solution of half the strength of Accutase diluted (registered trademark), and incubated for 4-5 minutes. Next, Accutase (registered trademark) was removed, and 3 minutes after application of the enzyme solution, CS2 was tapped to promote cell detachment. Rinse residual Accutase® by adding 0.5% BSA and pumping a bottle of media containing 10 micromolar Rho kinase inhibitor Y-27632 into CS2. After inactivation, the rinse was collected. A second rinse solution volume was added, collected, and stored with the first rinse solution. Thereafter, 2.0-2.5 × 10 8 cells in 200 mL were transplanted into a single layer of CellSTACK® and incubated at 37 ° C. for 2 hours in a humidified, 5% CO 2 incubator. did. Using a closed loop of C-Flex® tubing with pump tubing coupled between the two CellSTACK® media ports, the cell suspension is micronized with a peristaltic pump at 75 rpm for 5 minutes to coagulate. The collection was homogenized. The closed loop tubing was replaced with a sterile 0.2 micrometer filter to allow gas exchange and the CellSTACK® was incubated overnight in a humidified, 5% CO 2 incubator. After overnight incubation (12-22 hours, optimal 18 hours), the cells in CellSTACK® formed round spherical aggregates (populations) of pluripotent cells.

懸濁細胞集団を含有する０．５％のＢＳＡを添加した培地を、０．５％のＢＳＡを添加し、５５〜６５ｒｐｍで維持した０．４リットルの新鮮な培地と共に、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）から１リットルの使い捨てスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）へと移植した。移植から２４時間後に、１リットルの使い捨てスピナーフラスコを加湿、５％のＣＯ2インキュベーターから除去し、集団を５〜１０分間沈降させた。その後、容器内に２００ｍＬが残るまで培地を吸引してから、４００ｍＬの追加の新鮮な培養培地をスピナーフラスコに添加した。このプロセスを２日目（移植から４８時間後）の終了時に繰り返した。 The medium supplemented with 0.5% BSA containing the suspension cell population was added to CellSTACK® with 0.4 liters of fresh medium supplemented with 0.5% BSA and maintained at 55-65 rpm. To 1 liter disposable spinner flasks (Corning; Corning, NY). Twenty-four hours after implantation, the 1 liter disposable spinner flask was removed from the humidified 5% CO 2 incubator and the population was allowed to settle for 5-10 minutes. The medium was then aspirated until 200 mL remained in the container, and then 400 mL of additional fresh culture medium was added to the spinner flask. This process was repeated at the end of the second day (48 hours after transplantation).

３日目の終了時（ＣＳ２からスピナーフラスコへの移植から７２時間後）に、継代及び更なる増殖のために、細胞集団をＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）処理によって分離した。１リットルの使い捨てスピナーフラスコを加湿、５％のＣＯ2インキュベーターから除去することによって、継代プロセスを開始した。細胞の均質な懸濁液を維持するため、フラスコをバイオセーフティーキャビネット内のスピナプレート上に定置した。細胞懸濁液を、１００ｍＬのピペットによってスピナーフラスコから除去し、４つの１７５ｍＬの円錐ポリカーボネートチューブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ−Ｎａｌｇｅｎｅ；Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）間に均等に分配し、８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。細胞ペレットを撹乱させずに、使用済みの培地を吸引した。その後、カルシウム又はマグネシウムを含まない２５ｍＬのＤＰＢＳ（ＤＰＢＳ-/-）を各チューブに添加し、細胞を円錐チューブ内に結合し、８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。ＤＰＢＳ-/-を円錐チューブから吸引し、３０ｍＬの５０％のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）／５０％のＤＰＢＳ-/-溶液をチューブに添加した。細胞集団をピペットで１〜３度上下させてから、断続的に４分間旋回させ、その後８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。その後、細胞ペレットを撹乱させずに、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を可能な限り完全に吸引し、細胞懸濁液が均一な乳白色に見えるまで、円錐チューブを３〜５分間、連続的にそっと軽打した。１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する、０．５％のＢＳＡを添加した培地１０ｍＬを細胞懸濁液に添加し、２〜４度微粉化して、残留のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を不活性化した。１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する、０．５％のＢＳＡを添加した培地９０ｍＬを細胞に添加し、懸濁液を４０マイクロメートルの細胞ストレーナ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に通過させた。 At the end of day 3 (72 hours after transfer from CS2 to spinner flask), cell populations were separated by Accutase® treatment for passage and further expansion. The passage process was initiated by removing the 1 liter disposable spinner flask from the humidified, 5% CO 2 incubator. To maintain a homogenous suspension of cells, the flask was placed on a spinner plate in a biosafety cabinet. The cell suspension was removed from the spinner flask with a 100 mL pipette, evenly distributed between four 175 mL conical polycarbonate tubes (ThermoFisher-Nalgene; Buffalo, NY) and centrifuged at 80-200 rcf for 5 minutes. Spent media was aspirated without disturbing the cell pellet. Thereafter, 25 mL of DPBS without calcium or magnesium (DPBS − / − ) was added to each tube, the cells were bound in a conical tube and centrifuged at 80-200 rcf for 5 minutes. DPBS − / − was aspirated from the conical tube and 30 mL of 50% Accutase® / 50% DPBS − / − solution was added to the tube. The cell population was pipetted up and down 1-3 degrees, then swirled intermittently for 4 minutes, and then centrifuged at 80-200 rcf for 5 minutes. Then aspirate Accutase® as completely as possible without disturbing the cell pellet and gently tap the conical tube continuously for 3-5 minutes until the cell suspension appears to be uniform milky white. did. 10 mL medium containing 0.5% BSA containing 10 micromolar Rho kinase inhibitor Y-27632 is added to the cell suspension and micronized 2-4 times to give residual Accutase®. ) Was inactivated. 90 mL of medium containing 0.5% BSA containing 10 micromolar Rho kinase inhibitor, Y-27632, was added to the cells and the suspension was added to a 40 micrometer cell strainer (BD Falcon; Franklin Lakes, NJ).

濾過した細胞懸濁液の１００ｍＬの体積における細胞密度を、ＮＣ−１００ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ Ａ／Ｓ，Ａｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で決定し、追加の培地を添加して、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する、０．５％のＢＳＡを添加した培地内に、１×１０6個の細胞／ｍＬの最終細胞濃度をもたらした。その後、２２５ｍＬ（２億２５００万個の細胞）の細胞懸濁液を１リットルの使い捨てスピナーフラスコに移植し、加湿、５％のＣＯ2インキュベーター内で、撹拌せずに１時間インキュベートした。フラスコをその後、インキュベーターから除去し、バイオセーフティーキャビネット内のスピナプレート上にて１００ｒｐｍで１〜３分間撹拌した。細胞懸濁液を混合している間、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する、０．５％のＢＳＡを添加した培地の追加の２２５ｍＬを細胞懸濁液に添加した。スピナーフラスコをその後、加湿、５％のＣＯ2インキュベーターに３０分間戻した。フラスコをその後、インキュベーターから除去し、バイオセーフティーキャビネット内のスピナプレート上にて１００ｒｐｍで１〜３分間撹拌した。細胞懸濁液を混合している間、最終体積が６００ｍＬとなるように、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する、０．５％のＢＳＡを添加した培地の追加の１５０ｍＬを細胞懸濁液に添加して、フラスコをインキュベーター内の撹拌懸濁液に戻した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）分離から２４及び４８時間後の両方で、細胞集団をフラスコの底部に５〜１０分間沈降させた。あらゆる集団の損失を確実に最小化するために、４００ｍＬの使用済み培地を吸引によってフラスコから除去し、新鮮な培地と交換した。このプロセスを使用して、Ｈ１細胞を基質上の接着培養から、細胞集団としての懸濁培養へ変換した。 The cell density in a 100 mL volume of the filtered cell suspension was determined with an NC-100 NucleoCounter® (ChemoMetec A / S, Allerod, Denmark) and additional medium was added to add 10 micromolar Rho. A final cell concentration of 1 × 10 6 cells / mL was produced in medium supplemented with 0.5% BSA containing the kinase inhibitor, Y-27632. Thereafter, 225 mL (225 million cells) of the cell suspension was transferred to a 1 liter disposable spinner flask and incubated in a humidified, 5% CO 2 incubator for 1 hour without agitation. The flask was then removed from the incubator and stirred at 100 rpm for 1-3 minutes on a spinner plate in the biosafety cabinet. While mixing the cell suspension, an additional 225 mL of medium containing 10 micromolar Rho kinase inhibitor, Y-27632 and supplemented with 0.5% BSA was added to the cell suspension. The spinner flask was then returned to the humidified, 5% CO 2 incubator for 30 minutes. The flask was then removed from the incubator and stirred at 100 rpm for 1-3 minutes on a spinner plate in the biosafety cabinet. While mixing the cell suspension, an additional 150 mL of medium supplemented with 0.5% BSA containing 10 micromolar Rho kinase inhibitor, Y-27632 to a final volume of 600 mL. Was added to the cell suspension and the flask was returned to the stirred suspension in the incubator. At both 24 and 48 hours after Accutase® separation, the cell population was allowed to settle for 5-10 minutes at the bottom of the flask. To ensure that any population loss was minimized, 400 mL of spent media was removed from the flask by aspiration and replaced with fresh media. Using this process, H1 cells were converted from an adherent culture on a substrate to a suspension culture as a cell population.

最初のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）処理から７２時間後、細胞集団分離及びスピナーフラスコ播種（継代）のプロセスを繰り返して、複数の継代中（検査範囲：１〜１０回の継代）細胞を懸濁液に維持した。最初の２４時間後に培地を除去しなかったことを除き、上記のプロセスに従って、２００ｍＬの新鮮な培地を添加した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）分離から４８時間後に、集団をフラスコの底部に５〜１０分間沈降させ、６００ｍＬを吸引し、４００ｍＬの新鮮な培地をフラスコに添加した。   72 hours after the first Accutase® treatment, the process of cell population separation and spinner flask seeding (passage) was repeated to suspend cells during multiple passages (test range: 1 to 10 passages). Maintained in suspension. 200 mL of fresh medium was added according to the above process except that the medium was not removed after the first 24 hours. 48 hours after Accutase® separation, the population was allowed to settle to the bottom of the flask for 5-10 minutes, 600 mL was aspirated and 400 mL of fresh media was added to the flask.

これらの懸濁液で継代し、培養した細胞はその後、将来の使用のために冷凍保存し、保管することができる。冷凍保存用に懸濁増殖細胞を調製するために、細胞を４０マイクロメートルの細胞ストレーナに通過させなかったことを除き、懸濁継代に関して上記に述べたとおりに、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）で細胞集団を分離した。それぞれの１リットルの使い捨てフラスコから生成された、１００ｍＬの細胞懸濁液の細胞計数を決定した。次に、細胞懸濁液を結合し、８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。次に、細胞ペレットを撹乱させることなく、遠心管からの培地を可能な限り完全に除去した。次に、１ｍＬ当たり１億５０００万個の細胞の最終濃度を得るために、低温の（＜４℃）ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）１０（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を滴下により添加して、１．８ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）クライオバイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）又は１５ｍＬのＭｉｌｔｅｎｙｉクライオバック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に移植する間、細胞溶液を氷浴内で保持した。   Cells passaged and cultured in these suspensions can then be stored frozen and stored for future use. To prepare suspension-grown cells for cryopreservation, cells in Accutase® as described above for suspension passage, except that the cells were not passed through a 40 micrometer cell strainer. The population was separated. The cell count of the 100 mL cell suspension produced from each 1 liter disposable flask was determined. The cell suspension was then bound and centrifuged at 80-200 rcf for 5 minutes. The media from the centrifuge tube was then removed as completely as possible without disturbing the cell pellet. Next, to obtain a final concentration of 150 million cells per mL, cold (<4 ° C.) CryoStor® 10 (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada) was added dropwise. Add and transfer the cell solution in an ice bath while transplanting into a 1.8 mL Corning® cryovial (Corning Incorporated, Corning, NY) or 15 mL Miltenyi cryoback (Miltenyi Biotec Inc. Auburn, CA). Retained.

次いで、以下のとおり、バイアル内の懸濁増殖細胞を自動凍結保存装置内に高密度で凍結した。チャンバを４℃に予冷し、試料バイアル温度が６℃に達するまで、温度を保持した。次いで、試料が−７℃に達するまで、チャンバ温度を２℃／分で下げた。試料バイアルが−７℃に達すると、チャンバが−４５℃に達するまで、チャンバを２０℃／分で冷却した。次いで、チャンバ温度が−２５℃に達するまで、チャンバ温度を１０℃／分で素早く上昇させ、その後、試料バイアルが−４５℃に達するまで、チャンバを０．８℃／分で更に冷却した。次いで、チャンバが−１６０℃に達するまで、チャンバ温度を３５℃／分で冷却した。次いで、チャンバ温度を−１６０℃で少なくとも１０分間保持してから、バイアルをガス相液体窒素保管容器に移植した。   Then, the suspension-grown cells in the vial were frozen at high density in an automatic cryopreservation apparatus as follows. The chamber was pre-cooled to 4 ° C and the temperature was held until the sample vial temperature reached 6 ° C. The chamber temperature was then reduced at 2 ° C / min until the sample reached -7 ° C. When the sample vial reached -7 ° C, the chamber was cooled at 20 ° C / min until the chamber reached -45 ° C. The chamber temperature was then quickly increased at 10 ° C./min until the chamber temperature reached −25 ° C., after which the chamber was further cooled at 0.8 ° C./min until the sample vial reached −45 ° C. The chamber temperature was then cooled at 35 ° C./min until the chamber reached −160 ° C. The chamber temperature was then held at −160 ° C. for at least 10 minutes before the vial was implanted into a gas phase liquid nitrogen storage container.

撹拌槽バイオリアクターに接種するために、高密度で冷凍保存された細胞を、液体窒素保管容器から取り出し、解凍し、閉鎖された３リットルのガラスバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ；Ｊｕｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種するために使用した。４〜５のバイアルを、ガス相液体窒素保管容器から除去し、３７℃の水浴内に１０５秒間直接定置した。次いで、２ｍＬのガラスピペットを介して、解凍されたバイアル内容物を５０ｍＬの円錐チューブに移植した。次いで、０．５％のＢＳＡを含有し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を添加した９ｍＬの培地（ＩＨ３又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）培地（「Ｅ８（商標）」））を滴下によりチューブに添加した。次に、細胞を８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。チューブから上澄を吸引して、０．５％のＢＳＡを含有し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を添加した１０ｍＬの新鮮な培地（ＩＨ３又はＥ８（商標））を添加して、細胞を含有する体積を培地移植ボトル（Ｃａｐ２Ｖ８（登録商標），Ｓａｎｉｓｕｒｅ，Ｍｏｏｒｐａｒｋ，ＣＡ）内に分注した。その後、蠕動ポンプによって、無菌Ｃ−ｆｌｅｘチュービング溶接を介して、ボトル内容物をバイオリアクター内に直接ポンプで注入した。多能性幹細胞接種用の調製において、バイオリアクターを１．５Ｌの培地（０．５％のＢＳＡを添加し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する、ＩＨ３又はＥ８（商標））で調製し、３７℃に予熱し、７０ｒｐｍで撹拌し、溶存酸素設定値を３０％として（ＣＯ2、空気、Ｏ2、及びＮ2を調節）、ＣＯ2によって６．８〜７．１ｐＨに調節した。接種の直後、バイオリアクターを細胞計数用に試料採取し、０．２２５×１０6個の細胞／ｍＬの最終細胞濃度をもたらすよう、必要に応じて培地体積を調整した。 To inoculate a stirred tank bioreactor, cells stored at high density and cryopreserved are removed from a liquid nitrogen storage container, thawed, and seeded into a closed 3 liter glass bioreactor (DASGIP; Julich, Germany). Used for. Four to five vials were removed from the gas phase liquid nitrogen storage container and placed directly in a 37 ° C. water bath for 105 seconds. The thawed vial contents were then implanted into a 50 mL conical tube via a 2 mL glass pipette. Then 9 mL of medium (IH3 or Essential8 ™ medium (“E8 ™”)) containing 0.5% BSA and supplemented with 10 micromolar Rho kinase inhibitor, Y-27632, was added dropwise. Added to the tube. The cells were then centrifuged at 80-200 rcf for 5 minutes. Aspirate the supernatant from the tube and add 10 mL of fresh medium (IH3 or E8 ™) containing 0.5% BSA and supplemented with 10 micromolar Rho kinase inhibitor, Y-27632. The volume containing the cells was dispensed into media transplant bottles (Cap2V8®, Sanisure, Moopark, Calif.). The bottle contents were then pumped directly into the bioreactor by a peristaltic pump via sterile C-flex tubing welding. In preparation for pluripotent stem cell inoculation, the bioreactor was treated with 1.5 L medium (0.5% BSA and containing 10 micromolar Rho kinase inhibitor, Y-27632, IH3 or E8 ™ )) in preparing, preheated to 37 ° C., stirred at 70 rpm, dissolved oxygen set point (CO 2 as a 30% adjusting air, O 2, and N 2), CO 2 by 6.8 to 7. Adjusted to 1 pH. Immediately after inoculation, the bioreactor was sampled for cell counting and the media volume was adjusted as necessary to give a final cell concentration of 0.225 × 10 6 cells / mL.

撹拌槽バイオリアクターに接種した細胞は、連続的に撹拌されるタンクで細胞集団を形成し、合計３日間リアクター内の多能性培地（ＩＨ３又はＥ８（商標）、０．５％のＢＳＡを添加）に維持された。培地は毎日変更し、部分的な培地交換を接種から２４時間後に行い、１〜１．３リットルの使用済み培地を除去して、１．５リットルの新鮮な培地を添加した。接種から４８時間後に、１．５〜１．８リットルの使用済み培地を除去し、１．５リットルの新鮮な培地を添加した。接種から７２時間後に、＞９０％の使用済み培地を除去して、分化培地を添加することにより、多能性細胞分化を開始した（表７）。   Cells inoculated into the stirred tank bioreactor form a cell population in a continuously stirred tank and added pluripotent medium (IH3 or E8 ™, 0.5% BSA in the reactor for a total of 3 days ). The medium was changed daily and a partial medium change was performed 24 hours after inoculation, removing 1-1.3 liters of spent medium and adding 1.5 liters of fresh medium. Forty-eight hours after inoculation, 1.5-1.8 liters of spent medium was removed and 1.5 liters of fresh medium was added. 72 hours after inoculation, pluripotent cell differentiation was initiated by removing> 90% spent media and adding differentiation media (Table 7).

ステージ式の分化プロセスを開始した後は、温度（３７℃）、ｐＨ（分化用に７．４）、及び溶存酸素（ステージ１については１０％のＤＯ設定値、それ以外は常時３０％のＤＯ設定値、ＣＯ2、Ｏ2、Ｎ2、及び空気の調節）が調節された、閉鎖した撹拌懸濁バイオリアクターに、細胞を１２日間以上維持した分化プロセスを通して、培地交換のたびに、ディップチューブを介して培地を除去する前に羽根車を５〜２０分停止して、集団を沈降させた。Ｔｅｒｕｍｏ（商標）チューブ接合装置を使用したＣ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングに接続したディップチューブを通る蠕動ポンプによって、バイオリアクター内の培地を閉鎖されたボトル又は袋から除去するか、又はそこに添加して、閉鎖系を維持した。十分な培地を容器に添加して、羽根車を完全に浸らせた後で、羽根車及び加熱器に再び電圧を加えた。 After initiating the staged differentiation process, the temperature (37 ° C.), pH (7.4 for differentiation), and dissolved oxygen (10% DO setpoint for stage 1, otherwise 30% DO always) In a closed stirred suspension bioreactor with controlled settings (CO 2 , O 2 , N 2 , and air conditioning), a dip tube for each medium change through a differentiation process that maintained the cells for 12 days or more. The impeller was stopped for 5-20 minutes before the medium was removed via to allow the population to settle. Remove or add media in bioreactor from closed bottle or bag by peristaltic pump through dip tube connected to C-Flex® tubing using Terumo ™ tube splicer And maintained a closed system. Enough medium was added to the container to completely soak the impeller, and then the voltage was reapplied to the impeller and heater.

バイオリアクターのプロセスを監視するため、細胞集団を含有する培地の試料を毎日取り出して、図７に示すとおり、細胞の数及び生存性を決定した（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標））。プロセスの間は、細胞の一般的な増殖が観察され、０．２２５×１０6個の生育細胞／ｍＬの接種材料が、ステージ４、３日目で平均０．９２×１０6個の生育細胞／ｍＬを生成するように増殖した。バイオリアクター接種並びに多能性細胞の集団化及び培養の間は、酸性設定値（ｐＨ７．０〜６．８）で細胞を維持することによって、ステージ４、３日目の平均細胞産出量が、平均１．３×１０6個の細胞／ｍＬに増加した（図７）。 To monitor the bioreactor process, samples of media containing cell populations were taken daily to determine cell number and viability as shown in FIG. 7 (NucleoCounter®). During the process, general proliferation of cells was observed, with 0.225 × 10 6 growing cells / mL inoculum averaging 0.92 × 10 6 growing cells on stage 4 and 3 days. / ML to grow. During bioreactor inoculation and pluripotent cell population and culture, maintaining the cells at an acidic set point (pH 7.0-6.8), the average cell yield on stage 4, day 3, The average increased to 1.3 × 10 6 cells / mL (FIG. 7).

毎日の計数に加え、バイオリアクター培地試料をＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって分析した。リアクター設定値によって、ほとんどの培養培地に共通する安定な標準ｐＨ７．４に対し、ステージ０の培地のｐＨは酸性であり、細胞代謝の結果として、リアクター培地のｐＨがステージ０を経て低下したことが観察された。これらの結果は、分化６日目の終了を経て増加する乳酸濃度、及び低下するグルコースレベルの傾向と相関した（図９及び１０）。合わせて、これらのデータは、ステージ０及び分化の最初の２ステージ（１〜６日目）でリアクター内の細胞が最も迅速に成長し、グルコースを消耗したことを示した。しかしながら、ステージ３以降は、リアクター内の細胞代謝（乳酸レベル減少及びグルコースレベル増加）が低下し、ステージ３の細胞数のピーク、及びそれに続くステージ４にわたる細胞密度の低下と相関した。   In addition to daily counting, bioreactor media samples were analyzed by NOVA BioProfile® FLEX (Nova Biomedical Corporation, Waltham, Mass.). Depending on the reactor settings, the pH of the stage 0 medium was acidic compared to the stable standard pH 7.4 common to most culture media, and as a result of cell metabolism, the pH of the reactor medium decreased through stage 0. Was observed. These results correlated with increasing lactic acid concentrations after the end of differentiation day 6 and decreasing glucose level trends (FIGS. 9 and 10). Together, these data indicated that the cells in the reactor grew most rapidly and depleted glucose at stage 0 and the first two stages of differentiation (days 1-6). However, after stage 3, cell metabolism in the reactor (decreased lactate level and increased glucose level) decreased, correlating with the peak cell number in stage 3 and the subsequent decrease in cell density across stage 4.

ｐＨ及び代謝におけるステージに特異的な変化が、ｍＲＮＡ発現パターンにおけるステージの変化に一致したかどうかを判断するため。４つのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）指定の多能性、胚体内胚葉（ＤＥ）、腸管（ＧＴ）、又はステージ４（Ｓ４）を使用して、バイオリアクター細胞試料のテストを実行し、すべての運転及びアレイにわたる発現を標準化するため、過去の未分化のＨ１（ＷＢ０１０６）ｈＥＳ細胞試料を対照として、結果を比較した。   To determine if stage-specific changes in pH and metabolism were consistent with stage changes in mRNA expression patterns. Using 4 Applied Biosystems® Low Density Arrays (Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.) Designated pluripotency, definitive endoderm (DE), intestinal tract (GT), or stage 4 (S4) In order to perform a test of the reactor cell sample and normalize expression across all runs and arrays, the results were compared using a previous undifferentiated H1 (WB0106) hES cell sample as a control.

これらのアレイを使用して、分化のステージごとの遺伝子発現を決定した。バイオリアクターに解凍した種材料細胞は、ステージ０、１日目及びステージ０、３日目（バイオリアクター接種から２４及び７２時間後：図１１、１２、１３、及び１４）には、未分化の遺伝子発現パターンを示したこともまた、観察された。これらの結果は、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１の高い発現レベル、並びにＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４の欠損を示した、フローサイトメトリー結果とよく相関した（図１５及び表８）。遺伝子発現に関するフローサイトメトリー及びｑＲＴ−ＰＣＲアッセイは、安定な多能性状態と一貫した、多能性（ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＴＤＧＦ、及びＺＦＰ４２）の遺伝子に関する、堅牢かつ安定な発現パターンを示したが、ＧＡＴＡ４、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴの遺伝子発現における穏やかだが可変である増加と、指向された分化の前のステージ０プロセス中の、いくつかの試料におけるＣＥＲ１、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、及びＧＡＴＡ２発現の≧１００ｘ増加と、もまた認められた。   These arrays were used to determine gene expression at each stage of differentiation. Seed material cells thawed in the bioreactor were undifferentiated at stage 0, day 1 and stage 0, day 3 (24 and 72 hours after bioreactor inoculation: FIGS. 11, 12, 13, and 14). It was also observed that it showed a gene expression pattern. These results correlated well with flow cytometry results that showed high expression levels of CD9, SSEA4, TRA-1-60, and TRA-1-81, as well as CXCR4 / CD184 deficiency (FIG. 15 and Table 8). ). Flow cytometry and qRT-PCR assays for gene expression are robust and stable expression patterns for pluripotent (CD9, NANOG, POU5F1, SOX2, TDGF, and ZFP42) genes consistent with a stable pluripotent state Showed a moderate but variable increase in GATA4, GSC, MIXL1, and T gene expression and CER1, FGF17, FGF4, and in several samples during the stage 0 process prior to directed differentiation A ≧ 100 × increase in GATA2 expression was also observed.

ステージ０の完了時（リアクター接種から７２時間後）に、ＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する分化培地（表７）に細胞を移植した。この培地変更の２４時間後、ＦＯＸＡ２発現の約７００ｘの増加、及びＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴ発現の１０００ｘの増加といった、遺伝子発現パターンに有意な変化が認められた（図１８及び１９）。これらの増加した発現レベルは、細胞が中内胚葉運命を経て遷移していることを示した。未分化細胞と対比して、ステージ１、１日目にはＣＤＸ２レベルが上昇したことも認められたが（対照に対して発現が４７０ｘの増加）、これは発現の一過性の増加であり、ＣＤＸ２レベルはステージ１、１日目からステージ１、３日目までに９４％下降し、分化の誘導前に観察されたレベルと同等のレベルに戻った（図１４、１９、及び２１）。   At the completion of stage 0 (72 hours after reactor inoculation), cells were transplanted into differentiation medium (Table 7) containing MCX and GDF8. Twenty-four hours after this medium change, there was a significant change in gene expression patterns, such as an approximately 700x increase in FOXA2 expression and a 1000x increase in CER1, EOMES, FGF17, FGF4, GATA4, GATA6, GSC, MIXL1, and T expression. It was observed (FIGS. 18 and 19). These increased expression levels indicated that the cells had transitioned through mesendoderm fate. In contrast to undifferentiated cells, increased levels of CDX2 were also observed on stage 1 and day 1 (expression increased by 470x relative to control), which is a transient increase in expression. The CDX2 level dropped by 94% from stage 1, day 1 to stage 1, day 3, and returned to a level comparable to that observed before induction of differentiation (FIGS. 14, 19, and 21).

ＤＥ分化培地への露出から７２時間後に、細胞は胚体内胚葉の仕様と一貫したプロファイルを発現し、ＣＸＣＲ４レベルがピークに達し、ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７は過去の対照に対して＞１０００ｘで発現した。胚体内胚葉と一貫して、遺伝子ＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴが、ステージ１、１日目に観察された、上昇したレベルから下降したこともまた認められた（図２０及び２１）。   72 hours after exposure to DE differentiation medium, cells expressed a profile consistent with definitive endoderm specifications, CXCR4 levels peaked, and FOXA2 and SOX17 were expressed> 1000 × relative to past controls. Consistent with the definitive endoderm, we also observed that the genes CER1, EOMES, FGF17, FGF4, GATA4, GATA6, GSC, MIXL1, and T were lowered from the elevated levels observed on stage 1, day 1. (FIGS. 20 and 21).

ｑＲＴ−ＰＣＲによって観察された遺伝子発現の変化は、フローサイトメトリーによって観察された結果と相関した。分化開始時（図１５）のＣＤ９発現／ＣＸＣＲ４陰性多能性細胞集団から、ステージ１の終了時（図２２）のＣＸＣＲ４発現細胞（９８．３％のＣＸＣＲ４陽性細胞、±１．９ＳＤ）の均質な集団まで、ほぼ完全な遷移も見られた。   The changes in gene expression observed by qRT-PCR correlated with the results observed by flow cytometry. Homogeneity of CXCR4-expressing cells (98.3% CXCR4-positive cells, ± 1.9SD) at the end of stage 1 (FIG. 22) from the CD9-expressing / CXCR4-negative pluripotent cell population at the start of differentiation (FIG. 15) There was also almost complete transition up to a large group.

胚体内胚葉の形成（ステージ１）の完了後、原始前腸の形成（ステージ２）の誘導に使用するモルフォゲンである、ＦＧＦ７を含有するものに、培地を変更した。原始前腸の形成と一貫して、ステージ２、１及び３日目のＨＮＦ４α及びＧＡＴＡ６発現レベルが増加した一方、ステージ１の３日目に高いレベルで発現した遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＭＮＸ１、ＰＲＤＭ１、ＳＯＸ１７、及びＶＷＦ）はステージ２の終了までに発現の減少を示した（図２３）。前腸遺伝子（ＡＦＰ、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１）の発現が増加した（図２４）。   After completion of definitive endoderm formation (stage 1), the medium was changed to one containing FGF7, a morphogen used to induce primitive foregut formation (stage 2). Consistent with the formation of the primitive foregut, levels of HNF4α and GATA6 expression increased on stage 2, 1 and 3 days, while genes expressed at higher levels on stage 3 (CXCR4, EOMES, FGF17, FGF4 , MNX1, PRDM1, SOX17, and VWF) showed a decrease in expression by the end of stage 2 (FIG. 23). Expression of foregut genes (AFP, PDX1, and PROX1) increased (FIG. 24).

細胞をステージ２の培地で７２時間培養した後、培養をステージ３の培地に切り替えた（表７）。この培地では一度、細胞は、この図２５に示す、ＰＤＸ１及びＦＯＸＡ２発現（９０．９％±１１．９ＳＤ ＰＤＸ１陽性及び９９．２％±０．６ＳＤ ＦＯＸＡ２陽性）によって測定された内肺葉膵臓系統と一貫したマーカーを発現した。これらの結果は、遺伝子発現に対するｑＲＴ−ＰＣＲによって分析された、試料からのデータによって確認された。ＰＤＸ１の遺伝子発現は、ステージ２、３日目の終了（Ｈ１と対比して３８，０００ｘ）からステージ３、１日目（Ｈ１と対比して２００，０００ｘ）まで、２４時間で５倍増加し、更に４８時間後のステージ３、１日目で再び倍増した（Ｈ１と対比して４３５，０００ｘ）。これらのデータは、細胞が膵臓運命に特定化していたことを示す（図２６）。この観察は、図２６に示すとおり、膵臓内で通常発現する遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の宿主の増加したレベルによって、更に支持された。加えて、ＯＣＴ４／ＰＯＵ５Ｆ１発現がほとんど又は全くないこと（対照の２〜１０％又はｑＲＴ−ＰＣＲによる３２〜３７試料Ｃｔｓ）及び内胚葉系統のその他のマーカーＡＦＰ、ＡＬＢ、及びＣＤＸ２の発現レベルが高いことも見られ、比較的形成力のある腸管運命から膵臓運命まで、バイオリアクター内の細胞集団の仕様及び遷移を更に示した。   The cells were cultured in stage 2 medium for 72 hours, after which the culture was switched to stage 3 medium (Table 7). Once in this medium, the cells are shown in this FIG. 25 with the endolobular pancreatic lineage measured by PDX1 and FOXA2 expression (90.9% ± 11.9SD PDX1 positive and 99.2% ± 0.6SD FOXA2 positive) A consistent marker was expressed. These results were confirmed by data from the samples analyzed by qRT-PCR for gene expression. PDX1 gene expression increased 5-fold in 24 hours from the end of stage 2 and 3 days (38,000x compared to H1) to stage 3 and day 1 (200,000x compared to H1). 48 hours later, stage 3 doubled again on day 1 (435,000x compared to H1). These data indicate that the cells were specific for pancreatic fate (FIG. 26). This observation shows that genes normally expressed in the pancreas (ARX, GAST, GCG, INS, ISL1, NEUROD1, NGN3, NKX2.2, NKX6.1, PAX4, PAX6, PTF1A, and SST) as shown in FIG. Supported further by increased levels of host. In addition, there is little or no expression of OCT4 / POU5F1 (2-10% of control or 32-37 samples Cts by qRT-PCR) and high expression levels of other markers of endoderm lineage AFP, ALB, and CDX2 This also showed the specification and transition of the cell population within the bioreactor, from relatively intestinal fate to pancreatic fate.

図２７に示すように、ステージ４、３日目の分化プロセスの終了時に、細胞は、高いレベルのＰＤＸ１及びＦＯＸＡ２発現を保持し、膵内分泌細胞（２８．１％±１２．５ＳＤクロマグラニン陽性）及び膵臓前駆細胞（ＮＫＸ６．１の場合、５８．３％±９．７ＳＤ陽性）の混合と一貫した発現パターンを更に発達させた。このステージに特異的なマーカー発現パターンは、多能性集団から膵臓前駆細胞への効率的なステージ式分化を示した。フローサイトメトリーで観察された結果を、ｑＲＴ−ＰＣＲからのデータで更に確認した。膵臓内で通常発現する遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＭＡＦＢ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の宿主は全て、増加した発現レベルを示した。（図２８）。   As shown in FIG. 27, at the end of the stage 4, day 3 differentiation process, the cells retain high levels of PDX1 and FOXA2 expression, pancreatic endocrine cells (28.1% ± 12.5 SD chromagranin positive) and An expression pattern consistent with a mixture of pancreatic progenitor cells (58.3% ± 9.7SD positive for NKX6.1) was further developed. This stage-specific marker expression pattern showed efficient staged differentiation from pluripotent populations to pancreatic progenitor cells. The results observed by flow cytometry were further confirmed with data from qRT-PCR. Hosts of genes normally expressed in the pancreas (ARX, GAST, GCG, IAPP, INS, ISL1, MAFB, NEUROD1, NGN3, NKX2.2, NKX6.1, PAX4, PAX6, PTF1A, and SST) all increased Expression levels are shown. (FIG. 28).

異なる種材料、ステージ０の培地、ステージ０の培地のｐＨ、及びアンチフォームの使用など、複数の可変的なプロセスをテストしたが、図２７で観察された発現パターンは、複数回の運転にわたって一貫性を保持した。種材料の複数の供給源がテストされ、それぞれ、＞９０％ ＦＯＸＡ２、＞７５％ ＰＤＸ１、及び＞５０％ ＮＫＸ６．１で膵臓内胚葉運命を効率的に生成した（図２９）。更に、０．５％のＢＳＡを添加した「ＩＨ３」と呼ばれるカスタムの自家培地、又は０．５％のＢＳＡを添加した市販の培地Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）のステージ０で細胞を成長させた際に、バイオリアクター産物の発現パターンに有意差がなかったことが認められた。ステージ０の培養下のｐＨの役割を実験した際に、比較的低いｐＨ（６．９）でステージ０において成長させた細胞は、平均的な運転に対し、バイオリアクター内での増殖が増加したが（図７）、ステージ４、３日目の細胞プロファイルにおいては有意な変化がなかった（図３１）ことが認められた。加えて、９４百万分率でアンチフォームＣ乳剤（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃Ａ８０１１）の使用は、スパージングによって産生される泡を減少させることがわかったが、ステージ０の終了からステージ４、３日目の細胞まで、細胞のプロファイルに影響する様子は見られなかった（表９及び図３２）。   Although multiple variable processes were tested, including different seed materials, stage 0 media, stage 0 media pH, and use of anti-foam, the expression pattern observed in FIG. 27 was consistent across multiple runs. Retained sex. Multiple sources of seed material were tested and efficiently produced pancreatic endoderm fate with> 90% FOXA2,> 75% PDX1, and> 50% NKX6.1, respectively (FIG. 29). Furthermore, when cells were grown on stage 0 of a custom autologous medium called “IH3” supplemented with 0.5% BSA, or the commercial medium Essential8 ™ supplemented with 0.5% BSA, It was observed that there was no significant difference in the expression pattern of the bioreactor product. When experimenting with the role of pH under stage 0 culture, cells grown at stage 0 at a relatively low pH (6.9) increased proliferation in the bioreactor versus average run. However (FIG. 7), it was observed that there was no significant change in the cell profile at stage 4 and 3 (FIG. 31). In addition, the use of anti-form C emulsion (Sigma Cat # A8011) at 94 parts per million was found to reduce the foam produced by sparging, but from the end of stage 0 on stage 4, day 3 Up to the cells, no influence on the cell profile was observed (Table 9 and FIG. 32).

それぞれのバイオリアクター分化の終了時に、産生細胞を冷凍保存した。３．６３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを有するＭＣＤＢ１３１、又は３．６３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、グルコース（８ｍＭ最終）、及び１ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘを有するＭＣＤＢ１３１で細胞を洗浄してから、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、３０％のゼノフリーＫＳＲ、１０％のＤＭＳＯ、及び２．５％のＨＥＰＥＳ（最終濃度２５ｍＭ）を有する５７．５％のＭＣＤＢ１３１からなる、低温の（＜４℃）冷凍保存培地に移植した。次いで、冷凍保存培地内の細胞集団を周囲温度で最大１５分間維持し、４５分間温度を４℃まで下げ、２．００℃／分で−７．０℃（試料）まで更に下げる、冷却プロファイルを使用して、自動凍結保存装置（ＣＲＦ）で細胞を凍結させた。次いで、試料をすばやく冷却し、チャンバ温度を２５．０℃／分の速度で−４５．０℃まで下げた。次いで、チャンバ温度を１０．０℃／分で−２５．０℃（チャンバ）に上げることによって、補償の増加を提供した。次いで、温度が−４０．０℃に達するまで、試料を０．２℃／分で冷却した。次いで、チャンバを３５．０℃／分の速さで−１６０℃に冷却し、その温度で１５分間保持した。ＣＲＦ運転の終了時に、試料をガス相液体窒素保管容器に移植した。   At the end of each bioreactor differentiation, producer cells were stored frozen. Cells were washed with MCDB131 with 3.63 g / L sodium bicarbonate, or MCDB131 with 3.63 g / L sodium bicarbonate, glucose (8 mM final), and 1 × Glutamax, then 2.43 g / L. Transplanted into cold (<4 ° C.) cryopreservation medium consisting of 57.5% MCDB131 with sodium bicarbonate, 30% xenofree KSR, 10% DMSO, and 2.5% HEPES (final concentration 25 mM) did. The cell population in the cryopreservation medium is then maintained at ambient temperature for a maximum of 15 minutes, the temperature is lowered to 4 ° C. for 45 minutes and further reduced to −7.0 ° C. (sample) at 2.00 ° C./minute, the cooling profile is In use, cells were frozen in an automated cryopreservation device (CRF). The sample was then quickly cooled and the chamber temperature was reduced to -45.0 ° C at a rate of 25.0 ° C / min. An increase in compensation was then provided by raising the chamber temperature at 10.0 ° C / min to -25.0 ° C (chamber). The sample was then cooled at 0.2 ° C./min until the temperature reached −40.0 ° C. The chamber was then cooled to −160 ° C. at a rate of 35.0 ° C./min and held at that temperature for 15 minutes. At the end of CRF operation, the sample was implanted into a gas phase liquid nitrogen storage container.

細胞は、蒸気相液体窒素保管容器から取り出し、バイアルを３７℃の水浴に移植することによって解凍可能であった。小さい氷晶がバイアルに残るまで、バイアルを２分未満水浴内で静かに渦流した。次いで、バイアル内容物を５０ｍＬの円錐に移植し、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム及び２％のＢＳＡを有するＭＣＤＢ１３１培地を使用して、合計２０ｍＬの最終体積になるまで、滴下式で２分以上希釈した。次いで、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）で合計細胞数を決定し、細胞懸濁液を超低級付着培養皿に１時間移植させた。次いで、５０ｍＬの円錐内の培地から細胞を単離し、上澄を除去し、分析用又は生体内研究用に、細胞をステージ４の培地で再懸濁した。   Cells could be thawed by removing them from the vapor phase liquid nitrogen storage container and transplanting the vials into a 37 ° C. water bath. The vial was gently swirled in a water bath for less than 2 minutes until small ice crystals remained in the vial. The vial contents are then transplanted into a 50 mL cone and added dropwise using MCDB131 medium with 2.43 g / L sodium bicarbonate and 2% BSA to a final volume of 20 mL total. Diluted above. The total cell number was then determined with a NucleoCounter® and the cell suspension was transplanted to an ultra-low adhesion culture dish for 1 hour. The cells were then isolated from the 50 mL conical medium, the supernatant was removed, and the cells were resuspended in Stage 4 medium for analytical or in vivo studies.

あるいは、解凍後、バイアルに入れた細胞を空の１２５ｍＬのガラス製Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）スピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に移植し、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム及び２％のＢＳＡを含有する１０ｍＬのＭＣＤＢ１３１培地を滴下によりフラスコに添加した。次いで、最終体積を同一培地の８０ｍＬに調節した。ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）で合計細胞数を決定し、細胞懸濁液を４０〜６５ｒｐｍで一晩（１２〜２８時間）かき回した。次いで、細胞を特性化するか、又は生体内研究に使用した。   Alternatively, after thawing, the cells in the vial are transplanted into an empty 125 mL glass Corning® spinner flask (Corning, Incorporated, Corning, NY) and 2.43 g / L sodium bicarbonate and 2% 10 mL of MCDB131 medium containing BSA was added dropwise to the flask. The final volume was then adjusted to 80 mL of the same medium. The total cell number was determined with a NucleoCounter® and the cell suspension was agitated overnight (12-28 hours) at 40-65 rpm. The cells were then characterized or used for in vivo studies.

ＩＨ３培地の組成は、以下、並びに米国公開特許第２０１３／０２３６９７３に示されており、その開示は、公的な細胞培養培地に関連することから、その全体が組み込まれる。ＩＨ３培地内のＢＳＡの量は、変わり得る。   The composition of the IH3 medium is shown below, as well as in US 2013/0236973, the disclosure of which is incorporated in its entirety as it relates to the official cell culture medium. The amount of BSA in IH3 medium can vary.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

Figure 2017500013
Figure 2017500013

Figure 2017500013
Figure 2017500013

Figure 2017500013
Figure 2017500013

材料：
・人胚性幹細胞（ｈＥＳ）細胞株Ｈ１（ＷＡ０１細胞、ＷｉＣｅｌｌ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）
・ＰＢＳ（カタログ番号１４１９０，Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）
・Ｙ−２７６３２（Ａｘｘｏｒａカタログ番号ＡＬＸ−２７０−３３３，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
・ＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ，カタログ番号１７−７−１１Ｅ）
・ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）−（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ Ａ／Ｓ，カタログ番号ＹＣ−Ｔ１００，Ａｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）
・非組織培養処理した６ウェルの皿（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カタログ番号Ｆａｌｃｏｎ ３５１１４６，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）
・Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ａ−６９６４，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
・ｐＨ、及び溶存酸素（ＤＯ）バイオリアクタープローブ（ＦｅｒｍＰｒｏｂｅ（登録商標）ｐＨ電極２２５ｍｍ、モデル番号Ｆ−６３５、及びＤＯ ＯｘｙＰｒｏｂｅ（登録商標）１２ｍｍセンサー、モデル番号Ｄ−１４５（Ｂｒｏａｄｌｅｙ−Ｊａｍｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）
・免疫保護マクロ封入デバイス（ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標），Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）
・Ｍｍ ＨＵＭＡＮ Ｃ−ＰＥＰＴＩＤＥ ＥＬＩＳＡ（ＭＥＲＣＯＤＩＡ ＣＡＴ＃ １０−１１４１−０１）
・ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、ＭＣＤＢ１３１、及びＩＴＳ−Ｘ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
・ＦＡＦ−ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ）
・レチノイン酸、グルコース４５％（２．５Ｍ）、ＳＡＮＴ（Ｓｈｈ阻害剤）（Ｓｉｇｍａ）
・ＧＤＦ８（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
・ＭＣＸ
・ＦＧＦ７（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）
・ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体アンタゴニスト）（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）
・ＴＰＰＢ（ＰＫＣ賦活物質）（ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ）
・ＭＣＤＢ １３１カスタム培地 material:
-Human embryonic stem cell (hES) cell line H1 (WA01 cells, WiCell, Madison WI)
・ PBS (Catalog No. 14190, Invitrogen)
Y-27632 (Axxora catalog number ALX-270-333, San Diego, CA)
・ EDTA (Lonza, catalog number 17-7-11E)
NucleoCounter (registered trademark)-(ChemoMetec A / S, catalog number YC-T100, Allerod, Denmark)
Non-tissue culture treated 6-well dish (Becton Dickinson, catalog number Falcon 351146, Franklin Lakes, NJ)
Accutase (registered trademark) (Sigma, catalog number A-6964, St. Louis, MO)
PH and dissolved oxygen (DO) bioreactor probe (FermProbe® pH electrode 225 mm, model number F-635, and DO OxyProbe® 12 mm sensor, model number D-145 (Bradley-James Corporation, Irvine) CA)
・ Immunoprotective macro encapsulation device (TheraCyte (TM), Irvine CA)
・ Mm HUMAN C-PEPTIDE ELISA (MERCODIA CAT # 10-1141-01)
GlutaMAX ™, MCDB131, and ITS-X Invitrogen
・ FAF-BSA (Proliant)
Retinoic acid, glucose 45% (2.5M), SANT (Shh inhibitor) (Sigma)
・ GDF8 (Peprotech)
・ MCX
・ FGF7 (R & D Systems)
LDN-193189 (BMP receptor antagonist) (Stemgent)
・ TPPB (PKC activator) (ChemPartner)
MCDB 131 custom medium

（実施例８）
冷凍保存されたバイオリアクターによって生成された膵臓前駆集団の成熟及び機能
それぞれのバイオリアクター研究に十分な細胞を生成するため、Ｈ１ ｈＥＳ（ＷＢ０１０６）細胞の１つの継代３１のマスター細胞バンクバイアルを解凍した。５つのＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングされた２層ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（ＣＳ２）を播種するのに十分な細胞が生成されるまで、ＥＤＴＡ継代を使用し、Ｍａｔｒｉｇｅｔ（商標）での複数の継代に対応するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地における接着状況下で、細胞を増殖した。ＣＳ２内で成長する接着細胞が７０％コンフルエントになると、隣接するポンプチュービングを有するＣ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングアセンブリキャップを培地ポートに結合し、系を閉鎖した。系が閉鎖した後、袋又はボトルを、Ｔｅｒｕｍｏ接合装置を介してＣ−Ｆｌｅｘ（登録商標）で溶接し、全ての液体体積（培地、ＰＢＳ-/-、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）、又は懸濁細胞）を、蠕動ポンプを使用して移植した。 (Example 8)
Maturation and function of the pancreatic progenitor population generated by a cryopreserved bioreactor To thaw enough cells for each bioreactor study, thaw one passage 31 master cell bank vial of H1 hES (WB0106) cells did. EDTA passage is used until multiple cells are generated to seed 5 Matrigel (TM) coated bilayer CellSTACK (R) (CS2) and multiple passages in Matriget (TM) are used. Cells were grown under adherence in mTeSR® 1 medium corresponding to the generation. When adherent cells growing in CS2 were 70% confluent, a C-Flex® tubing assembly cap with adjacent pump tubing was connected to the media port and the system was closed. After the system is closed, bags or bottles are welded with C-Flex® via a Terumo junction and all liquid volumes (medium, PBS − / − , Accutase®, or suspended cells) ) Was implanted using a peristaltic pump.

ＣＳ２から細胞を剥離するため、カルシウム又はマグネシウムを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ-/-）で細胞を１度洗浄してから、等分のＰＢＳ-/-で希釈したＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の半強度の溶液で処理し、４〜５分間インキュベートした。次いで、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）溶液を除去し、酵素溶液の適用から３分後に、ＣＳ２を軽打して細胞の剥離を促進した。１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１のボトルをポンプでＣＳ２に注入して濯ぎ、残留のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を不活性化してから、濯ぎ剤を収集した。第２の濯ぎ液の体積を添加し、収集し、第１の濯ぎ液と共に貯留した。１．６〜２．０×１０9個の細胞が、最終体積２リットルでＣＳ２から回復された。１層当たり２．０〜２．５×１０8個の細胞を４つのＣＳ２、又は８個の１層Ｃｅｌｌ Ｓｔａｃｋ（商標）に移植し、１層当たり２００ｍＬの体積で、加湿、５％のＣＯ2インキュベーター内で２時間、３７℃でインキュベートした。 To detach the cells from CS2, the cells were washed once with Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS − / − ) without calcium or magnesium, and then diluted with PBS − / − in equal amounts of Accutase ( Treated with a half-strength solution of ® and incubated for 4-5 minutes. The Accutase® solution was then removed and 3 minutes after application of the enzyme solution, CS2 was tapped to promote cell detachment. A bottle of mTeSR® 1 containing 10 micromolar Rho kinase inhibitor, Y-27632, is pumped into CS2 and rinsed to inactivate the remaining Accutase® and then rinsed. Collected. A second rinse solution volume was added, collected, and stored with the first rinse solution. 1.6-2.0 × 10 9 cells were recovered from CS2 in a final volume of 2 liters. 2.0-2.5 × 10 8 cells per layer are implanted into 4 CS2 or 8 1-layer Cell Stack ™, humidified, 5% CO 2 in a volume of 200 mL per layer 2 hours in a 2 incubator and incubated at 37 ° C..

ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）培地ポート間に結合された、隣接したポンプチュービングを有する、Ｃ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングの閉ループを使用して、細胞懸濁液を蠕動ポンプによって７５ｒｐｍで５分間微粉化して、凝集体を均質化した。次いで、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）を、加湿、５％のＣＯ2インキュベーターで１８時間、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、Ｃｅｌｌ Ｓｔａｃｋから２リットルの細胞及び培地を貯留し、１バイオリアクター当たり１．５リットルの新鮮なｍＴｅＳＲ（登録商標）培地と共に、２つの３リットルＤＡＳＧＩＰバイオリアクター内へ１リットルずつ移植した。バイオリアクター接種から２４時間後に培地全体を交換して、分化を開始する前に、ＴｅＳＲ（登録商標）培地で更に２日間細胞を維持した。次いで、分化を開始し、表１０に記載のとおりに指向した。温度（３７℃）、ｐＨ（ドリフト、又は多能性細胞用に６．８若しくは７．２及び分化用に７．４へＣＯ2によって調節）、及び溶存酸素（３０％のＤＯ設定値、ＣＯ2／空気調節）に対して調節された、閉鎖した無菌懸濁バイオリアクター内で、細胞を合計１４又は１５日間（２日間のｍＴｅＳＲ（登録商標）＋１２又は１３日間のステージ式の分化）維持した。それぞれの培地交換の前に羽根車を５〜２０分停止して、集団を沈降させた。Ｔｅｒｕｍｏ（商標）チューブ接合装置を使用したＣ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービング（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ，ＩＬ）に接続したディップチューブを通る蠕動ポンプによって、培地を除去又は添加して、閉鎖系を維持した。羽根車を浸らせるのに十分な培地を添加した後で、電熱ジャケットに再び電圧を加えた。 Using a closed loop of C-Flex® tubing with adjacent pump tubing connected between the CellSTACK® media ports, the cell suspension is micronized with a peristaltic pump at 75 rpm for 5 minutes. The agglomerates were homogenized. CellSTACK® was then incubated at 37 ° C. overnight in a humidified, 5% CO 2 incubator for 18 hours. Two liters of cells and medium were then pooled from the Cell Stack and transplanted one liter at a time into two 3 liter DASGIP bioreactors with 1.5 liters of fresh mTeSR® medium per bioreactor. Twenty-four hours after bioreactor inoculation, the entire medium was changed and cells were maintained in TeSR® medium for an additional 2 days before initiating differentiation. Differentiation was then initiated and directed as described in Table 10. Temperature (37 ° C.), pH (drift or adjusted to 6.8 or 7.2 for pluripotent cells and CO 2 to 7.4 for differentiation), and dissolved oxygen (30% DO setting, CO The cells were maintained for a total of 14 or 15 days (2 days of mTeSR® + 12 or 13 days of staged differentiation) in a closed sterile suspension bioreactor adjusted to 2 / air conditioning). . The impeller was stopped for 5-20 minutes before each medium change to allow the population to settle. The medium was removed or added by a peristaltic pump through a dip tube connected to C-Flex® tubing (Cole-Parmer North America, Vernon Hills, IL) using a Terumo ™ tube splicer and closed The system was maintained. After enough medium was added to soak the impeller, voltage was again applied to the electrothermal jacket.

これらの方法を使用して、３リットルリアクターで２回の産生運転を開始した。最初のリアクター運転では、多能性培養培地の最初の２日間で、２つの異なるｐＨ設定値をテストした。細胞の代謝活動によって時間の経過と共にリアクター環境が酸性化するにつれ、ｐＨが下方に「ドリフト」するように、固定のＣＯ2ガス注入率５％で、リアクター１をｐＨ７．２に設定した。リアクター２は、ＣＯ2ガスレベルで調節されたｐＨ ７．２に設定した。２回目のリアクター運転では、リアクター１のｐＨを６．８、及びリアクター２を７．２に設定し、いずれもＣＯ2ガスレベルで調節した。 Using these methods, two production runs were started in a 3 liter reactor. In the first reactor run, two different pH settings were tested in the first two days of the pluripotent culture medium. Reactor 1 was set to pH 7.2 with a fixed CO 2 gas injection rate of 5% so that the pH would “drift” as the reactor environment acidified over time due to cellular metabolic activity. Reactor 2 was set to pH 7.2 adjusted with CO 2 gas level. In the second reactor operation, the pH of the reactor 1 was set to 6.8, and the reactor 2 was set to 7.2, both of which were adjusted with the CO 2 gas level.

バイオリアクタープロセスを監視するため、分化のそれぞれのステージの終了時に細胞集団を採取し、フローサイトメトリーで分析した（表１１、表１２）。分化開始時のＣＤ９発現／ＣＸＣＲ４陰性多能性細胞集団から、胚体内胚葉形成の完了時のＣＸＣＲ４発現細胞（９６．９〜９８．１％のＣＸＣＲ４陽性細胞）の均質集団へのほぼ完全な遷移が観察された。   To monitor the bioreactor process, cell populations were collected at the end of each stage of differentiation and analyzed by flow cytometry (Table 11, Table 12). Almost complete transition from a CD9-expressing / CXCR4-negative pluripotent cell population at the start of differentiation to a homogeneous population of CXCR4-expressing cells (96.9-98.1% CXCR4-positive cells) upon completion of definitive endoderm formation Was observed.

フローサイトメトリーで観察された結果は、ｒｔ−ＰＣＲで分析した２つの試料の結果と相関した。多能性から膵臓運命へのステージ式分化に特徴的な遺伝子発現について、プロセスを通して試料をテストした。指向された分化の開始前に、多能性又は早期の分化運命に関連付けられた遺伝子のパネルについて、低密度アレイでバイオリアクター細胞集団からのｍＲＮＡをテストした。   The results observed by flow cytometry correlated with the results of the two samples analyzed by rt-PCR. Samples were tested throughout the process for gene expression characteristic of staged differentiation from pluripotency to pancreatic fate. Prior to the initiation of directed differentiation, mRNA from bioreactor cell populations was tested in a low density array on a panel of genes associated with pluripotency or early differentiation fate.

未分化のＨ１対照と比較すると（図３３）、バイオリアクターからの細胞は、多能性に特徴的な遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、及びＺＦＰ４２）の発現を保持し、分化に特徴的な遺伝子（ＡＦＰ、及びＦＯＸＡ２：＜５０倍増、ＦＯＸＤ３、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＳＣ、ＨＡＮＤ２、及びＴ：＜１０倍増の発現）の誘導が最小値である又はまったくないことを示した。ただし、細胞がステージ１、１日目の分化培地に接触すると、遺伝子発現パターンが劇的に変化し、ＣＤＸ２、ＣＥＲ１、ＦＧＦ１７ｍ、ＦＧＦ４、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＭＮＸ１、及び短尾奇形（Ｔ）発現のレベルが、未分化のＨ１ ｈＥＳ細胞よりも１００〜１０００倍増加した（図３４）。ステージ１、３日目（胚体内胚葉の形成）の終了までに、ＣＤ９、ＣＤＸ２、ＦＧＦ４、ＭＩＸＬ１、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、及び短尾奇形（Ｔ）は、ステージ１、１日目に対して発現が減少した一方、ＣＤ９９、ＣＥＲ１、ＣＸＣＲ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＫＩＴ、ＯＴＸ、又はＳＯＸ１７などの特徴的な胚体内胚葉遺伝子の発現はピークに達した（図３５）。   Compared to the undifferentiated H1 control (FIG. 33), cells from the bioreactor retain the expression of genes characteristic of pluripotency (POU5F1, NANOG, SOX2, and ZFP42), and genes characteristic of differentiation Induction of (AFP and FOXA2: <50 fold increase, FOXD3, GATA2, GATA4, GSC, HAND2, and T: <10 fold increase expression) showed minimal or no induction. However, when the cells come into contact with the differentiation medium on stage 1 and day 1, the gene expression pattern changes dramatically, and CDX2, CER1, FGF17m, FGF4, FOXA2, GATA4, GATA6, GSC, MIXL1, MNX1, and short tail The level of malformation (T) expression was increased 100-1000 fold over undifferentiated H1 hES cells (FIG. 34). By the end of stage 1, day 3 (formation of definitive endoderm), CD9, CDX2, FGF4, MIXL1, NANOG, POU5F1, and short tail malformation (T) are expressed relative to stage 1, day 1. While decreased, expression of characteristic definitive endoderm genes such as CD99, CER1, CXCR4, FGF17, GATA4, GATA6, KIT, OTX, or SOX17 peaked (FIG. 35).

ステージ１の終了時に、ＧＤＦ８を含有するものからＦＧＦ７を含有する培地へ細胞培養培地を変更した。ステージ２にわたる特定の遺伝子の増加（ＡＦＰ、ＡＴＯＨ１、ＨＨＥＸ、ＯＳＲ１、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＳＯＸ２、及びＳＯＸ９）、発現の減少（ＨＡＤ１及びＳＯＸ１７）、全体的に安定な高い発現（ＨＮＦ４α）、又は低い発現／発現なし（ＣＤＸ２、ＧＡＳＴ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、及びＰＴＦ１ａ）といった、いくつかの異なる遺伝子発現パターンが認められた（図３６ａ〜ｅ）。これらのパターンは、リアクター内の細胞が、減少する中胚葉（ＨＡＮＤ１及びＳＯＸ１７）のマーカーに対応する前腸（ＡＦＰ、ＡＴＯＨ１、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４α、ＯＳＲ１、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＳＯＸ２、及びＳＯＸ９）発現になっていることを示した。しかしながら、ステージの終了までに、細胞はより成熟した腸又は膵臓運命（ＣＤＸ２、ＧＡＳＴ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、及びＰＴＦ１ａ）にまだ特定化していなかった。   At the end of stage 1, the cell culture medium was changed from one containing GDF8 to one containing FGF7. Increase in specific genes over stage 2 (AFP, ATOH1, HHEX, OSR1, PDX1, PROX1, SOX2, and SOX9), decreased expression (HAD1 and SOX17), overall stable high expression (HNF4α), or low expression Several different gene expression patterns were observed, such as / no expression (CDX2, GAST, NKX2.2, NKX6.1, and PTF1a) (FIGS. 36a-e). These patterns result in cells in the reactor expressing foregut (AFP, ATOH1, HHEX, HNF4α, OSR1, PDX1, PROX1, SOX2, and SOX9) corresponding to markers of decreasing mesoderm (HAND1 and SOX17). Showed that. However, by the end of the stage, the cells had not yet been specified for more mature intestinal or pancreatic fate (CDX2, GAST, NKX2.2, NKX6.1, and PTF1a).

未分化の対照に対してｍＲＮＡにおける＞１００，０００倍の増加（図３６）、及びフローサイトメトリーによるＰＤＸ１を発現する細胞の７６〜９８％（表１１）によって実証された、ＰＤＸ１発現によって測定されるとおり、ステージ３の終了までに、細胞は膵臓系統に特定化していた。また、膵臓（ＧＡＳＴ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＲＯＸ１、ＰＴＦ１ａ、及びＳＯＸ９）、並びにＡＦＰ及びＣＤＸ２などの腸の他の遺伝子の誘導も観察され、細胞がより成熟した運命に特定化し始めたことを示した。   Measured by PDX1 expression, demonstrated by> 100,000-fold increase in mRNA relative to undifferentiated controls (FIG. 36), and 76-98% of cells expressing PDX1 by flow cytometry (Table 11). As shown, by the end of stage 3, the cells had been specified in the pancreatic lineage. In addition, induction of other genes in the intestine such as pancreas (GAST, NKX2.2, NKX6.1, PROX1, PTF1a, and SOX9) and AFP and CDX2 was also observed and cells began to specify a more mature fate Showed that.

表１１及び１２に示すように、ステージ４の３又は４日目の分化プロセスの終了までに、細胞は、膵内分泌細胞（４７〜５４％クロマグラニン陽性）及び膵臓前駆細胞（ＮＫＸ６．１の場合、３３〜５２％陽性）の混合と一貫した発現パターンを示した。このステージの特異的なマーカー発現パターンは、未分化のＨ１ヒト胚性幹細胞と比べて高い発現レベルのＰＤＸ１（誘導倍率＞１×１０6）及びその他の膵臓遺伝子（誘導倍率＞１０００のＡＲＸ、ＧＣＧ、ＧＡＳＴ、ＩＮＳ、ＩＳＬ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＴＦ１ａ、及びＳＳＴ）、並びにＯＣＴ４／ＰＯＵ５Ｆ１発現のほぼ全損失に特徴付けられる膵臓前駆細胞への、多能性集団からの効率的なステージ式分化を示した。 As shown in Tables 11 and 12, by the end of the stage 4 or 3 day 4 differentiation process, the cells were pancreatic endocrine cells (47-54% chromagranin positive) and pancreatic progenitor cells (in the case of NKX6.1, 33-52% positive) showed a consistent expression pattern. The specific marker expression pattern at this stage is higher than that of undifferentiated H1 human embryonic stem cells, PDX1 (induction ratio> 1 × 10 6 ) and other pancreatic genes (induction ratio> 1000 ARX, GCG) , GAST, INS, ISL, NEUROD1, NGN3, NKX2.2, NKX6.1, PAX4, PTF1a, and SST), and pluripotent populations to pancreatic progenitor cells characterized by almost total loss of OCT4 / POU5F1 expression Efficient stage expression differentiation from was demonstrated.

分化プロセスの終了時に、０．０８〜０．４５×１０6個の細胞／ｍＬが生成された（図３８：毎日の細胞計数）。次いで、このプロセスで生成された細胞を冷凍保存するか、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して動物の皮下に直接埋め込むか、又は腎臓被膜下に定置した。細胞を冷凍保存するため、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、３０％のゼノフリーＫＳＲ、１０％のＤＭＳＯ、及び２．５％のＨＥＰＥＳ（最終濃度２５ｍＭ）を有する５７．５％のＭＣＤＢ１３１からなる冷凍保存培地に、細胞を移植した。細胞集団を周囲温度で冷凍保存培地内に懸濁した後で、クライオバイアルを自動凍結保存装置（ＣＲＴ）に１５分以内で移植した。次いで、チャンバ温度を４５分間４℃に下げ、２．００℃／分でー７．０℃（試料）まで更に下げた。次いで、試料をすばやく冷却し、チャンバ温度を２５．０℃／分の速度で−４５．０℃まで下げた。次いで、チャンバ温度を１０．０℃／分で−２５．０℃（チャンバ）に上げることによって、補償の増加を提供した。次いで、温度が−４０．０℃に達するまで、試料を０．２℃／分で冷却した。次いで、チャンバを３５．０℃／分の速さで−１６０℃に冷却し、その温度で１５分間保持した。ＣＲＦ運転の終了時に、試料をガス相液体窒素保管容器に移植した。 At the end of the differentiation process, 0.08-0.45 × 10 6 cells / mL were generated (FIG. 38: daily cell count). Cells generated by this process were then stored frozen, implanted directly under the animal's skin via the TheraCyte ™ device, or placed under the kidney capsule. For cryopreservation of cells, consisting of 57.5% MCDB131 with 2.43 g / L sodium bicarbonate, 30% xenofree KSR, 10% DMSO, and 2.5% HEPES (final concentration 25 mM) Cells were transplanted into a frozen storage medium. After the cell population was suspended in cryopreservation medium at ambient temperature, the cryovials were transplanted to an automated cryopreservation device (CRT) within 15 minutes. The chamber temperature was then lowered to 4 ° C. for 45 minutes and further reduced to −7.0 ° C. (sample) at 2.00 ° C./min. The sample was then quickly cooled and the chamber temperature was reduced to -45.0 ° C at a rate of 25.0 ° C / min. An increase in compensation was then provided by raising the chamber temperature at 10.0 ° C / min to -25.0 ° C (chamber). The sample was then cooled at 0.2 ° C./min until the temperature reached −40.0 ° C. The chamber was then cooled to −160 ° C. at a rate of 35.0 ° C./min and held at that temperature for 15 minutes. At the end of CRF operation, the sample was implanted into a gas phase liquid nitrogen storage container.

細胞をガス相液体窒素で保存した後、保管場所から除去することによって細胞を解凍し、３７℃の水浴に移植した。小さい氷晶がバイアルに残るまで、バイアルを２分未満水浴内で静かに渦流した。次いで、バイアル内容物を５０ｍＬの円錐に移植し、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム及び２％のＢＳＡを有するＭＣＤＢ１３１培地を使用して、合計２０ｍＬの最終体積になるまで、滴下式で２分以上希釈した。次いで、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）で合計細胞数を決定し、細胞懸濁液を超低級付着培養皿に１時間移植した。次いで、５０ｍＬの円錐内の培地から細胞を単離し、上澄を除去し、細胞をステージ４の培地で再懸濁した。次いで、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して動物の皮下に、若しくは腎臓被膜下に細胞を埋め込むか、又は超低級付着皿内で細胞を一晩インキュベートしてから、動物に埋め込んだ。   Cells were stored in gas phase liquid nitrogen and then thawed by removal from storage and transplanted into a 37 ° C. water bath. The vial was gently swirled in a water bath for less than 2 minutes until small ice crystals remained in the vial. The vial contents are then transplanted into a 50 mL cone and added dropwise using MCDB131 medium with 2.43 g / L sodium bicarbonate and 2% BSA to a final volume of 20 mL total. Diluted above. The total cell number was then determined with a NucleoCounter® and the cell suspension was transplanted to an ultra-low adhesion culture dish for 1 hour. The cells were then isolated from the 50 mL conical medium, the supernatant was removed, and the cells were resuspended in Stage 4 medium. Cells were then implanted subcutaneously or under the kidney capsule through a TheraCyte ™ device, or cells were incubated overnight in ultra-low attachment dishes before being implanted in the animal.

動物は、血糖及びＣペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視された。ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内部で非冷凍保存の膵臓前駆細胞を用いて、又は腎臓被膜下への細胞の直接定置によって処理した動物は、１６週目までに１ｎｇ／ｍＬを超えるＣペプチドを発現するまで成熟し、埋め込み後２０週目までに２ｎｇ／ｍＬのＣペプチドに達した（図３９ａ及び３９ｄ）。更に、宿主のβ細胞機能をアブレーションするためにＳＴＺで処理する際に、移植片が除去されるまで、移植された動物は正常血糖を維持し、単一の高用量のＳＴＺによって誘導される糖尿病から動物を保護する能力が、移植片にあることを示した。   Animals were monitored every 4 weeks after graft implantation for blood glucose and C-peptide levels. Animals treated with non-cryopreserved pancreatic progenitor cells inside the TheraCyte ™ device or by direct placement of cells under the kidney capsule until more than 1 ng / mL of C-peptide is expressed by week 16 It matured and reached 2 ng / mL C peptide by 20 weeks after implantation (FIGS. 39a and 39d). Furthermore, when treated with STZ to ablate host β-cell function, the transplanted animals maintain normoglycemia until the graft is removed and diabetes induced by a single high dose of STZ. The ability to protect the animals from the graft was shown to be.

このパターンは、冷凍保存された細胞で処理した動物でも観察された。解凍後１時間培養した、冷凍保存した膵臓前駆細胞を有する腎臓被膜移植片によって処理した動物（１２０７Ｂ）は、１６及び２０週目でそれぞれ平均０．５６ｎｇ／ｍＬ及び１．０９ｎｇ／ｍＬのＣペプチドを有した一方、解凍後一晩培養した細胞（１２０７Ｃ）は、１６及び２０週目でそれぞれ平均０．８１ｎｇ／ｍＬ及び１．３５ｎｇ／ｍＬのＣペプチドを有した（図３９ｄ）。ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内で冷凍保存した膵臓前駆細胞で処理した動物は、１６週までに１ｎｇ／ｍＬを超えるＣペプチドを有し、非冷凍保存の対照と同様に、ＳＴＺ処理から１週間後にＣペプチドの治療用レベルを発現することができた（０．９８ｎｇ／ｍＬ、図３９ｃ）。これらの結果は、動物モデルでテストしたときに、冷凍保存された膵臓前駆細胞が、非冷凍保存の対照と同等に機能し得ることを示す。   This pattern was also observed in animals treated with cryopreserved cells. Animals treated with kidney capsule grafts with cryopreserved pancreatic progenitor cells cultured for 1 hour after thawing (1207B) averaged 0.56 ng / mL and 1.09 ng / mL C peptides at 16 and 20 weeks, respectively. On the other hand, cells cultured overnight after thawing (1207C) had an average of 0.81 ng / mL and 1.35 ng / mL C peptide at 16 and 20 weeks, respectively (FIG. 39d). Animals treated with pancreatic progenitor cells cryopreserved in a TheraCyte ™ device had more than 1 ng / mL C peptide by 16 weeks and, like non-frozen control, C A therapeutic level of peptide could be expressed (0.98 ng / mL, FIG. 39c). These results show that cryopreserved pancreatic progenitor cells can function as well as non-cryopreserved controls when tested in animal models.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

注：
・上記の表１０の基本培地は、Ｇｌｕｔａｍａｘを栄養補助剤に使用しない場合、ステージ１〜５で５ｍＭを任意追加的に含む。
・Ｃｙｐｉ（［１００ｎＭ］）は、上記の表１０のステージ４に、任意追加的に追加し得る。 note:
The basal medium in Table 10 above optionally contains 5 mM at stages 1-5 when Glutamax is not used as a nutritional supplement.
Cypi ([100 nM]) can be optionally added to stage 4 in Table 10 above.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

Figure 2017500013
Figure 2017500013

撹拌槽バイオリアクター内の細胞凝集体が経験するずれ応力の計算
３１ ＤＡＳＧＩＰバイオリアクターにおいて７０ｒｐｍの撹拌速度で混合される、２．７リットルのＤＡＳＧＩＰ撹拌懸濁バイオリアクター内の細胞凝集体が経験する、ずれ応力を決定した。ずれ応力値を計算するため、以下に述べる前提条件を作製した。 Calculation of shear stress experienced by cell aggregates in a stirred tank bioreactor 31 Cell aggregates in a 2.7 liter DASGIP stirred suspension bioreactor mixed at a stirring speed of 70 rpm in a DASGIP bioreactor The shear stress was determined. In order to calculate the shear stress value, the following preconditions were prepared.

前提条件：
１．細胞凝集体に課される最大ずれ応力は、乱流渦の結果ではない。
２．細胞凝集体に課される最大ずれ応力は、凝集−凝集又は凝集−羽根車の衝突の結果ではない。
３．隔壁（すなわち、ディップチューブ及びプローブ）が課すずれ応力は、これらの計算では取り組まれない。 Prerequisite:
1. The maximum shear stress imposed on cell aggregates is not a result of turbulent vortices.
2. The maximum shear stress imposed on the cell aggregate is not the result of an aggregation-aggregation or aggregation-impeller collision.
3. The shear stress imposed by the septum (ie, dip tube and probe) is not addressed in these calculations.

本明細書の計算の目的のため、以下に示す専門用語及び物理的パラメーターを使用する。   For the purposes of calculation herein, the following terminology and physical parameters are used.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

Figure 2017500013
Figure 2017500013

Figure 2017500013
Figure 2017500013

列記した培地及びバイオリアクタオーパラメーターを以下の等式に適用した。   The listed media and bioreactor O-parameters were applied to the following equation:

等式：
レイノルズ数： Equation:
Reynolds number:

Figure 2017500013
凝集体に対する最大ずれ応力（Ｃｈｅｒｒｙ ａｎｄ Ｋｗｏｎ １９９０）
Figure 2017500013
 Maximum shear stress on aggregates (Cherry and Kwon 1990)

Figure 2017500013
１単位質量当たりの散逸される電力（ε）
Figure 2017500013
 Dissipated power per unit mass (ε)

Figure 2017500013
消費電力（Ｐ）
Figure 2017500013
 Power consumption (P)

Figure 2017500013
動力数計算は、整流装置を含まない撹拌槽に対して、Ｎａｇａｔａ（１９７５）が導出した実験的相関関係に基づいている。
Figure 2017500013
 The power number calculation is based on an experimental correlation derived by Nagata (1975) for a stirred tank that does not include a rectifier.

Figure 2017500013
式中、
Figure 2017500013
 Where

Figure 2017500013
Figure 2017500013

２．７ＬのＤＡＳＧＩＰバイオリアクター内において撹拌速度７０ｒｐｍで細胞凝集体に課された、少なくとも０．２５パスカル（２．５ｄｙｎ／ｃｍ2）の最大ずれ応力を計算した。集団の最も外側を含む細胞は、最も高いレベルのずれ応力を経験する。これらのずれ応力値は、記述した前提条件に大きく依存する。 A maximum shear stress of at least 0.25 Pascal (2.5 dyn / cm 2 ) imposed on the cell aggregate at a stirring speed of 70 rpm in a 2.7 L DASGIP bioreactor was calculated. Cells containing the outermost of the population experience the highest level of shear stress. These shear stress values are highly dependent on the described preconditions.

（実施例９）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養下でのＭＣＸ／ＧＤＦ８の役割
２％の脂肪酸フリーのＢＳＡ（カタログ番号６８７００，Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、追加の２．５ｍＭグルコース（カタログ番号Ｇ８７６９，Ｓｉｇｍａ）、及び１：５０，０００のストック濃度のＩＴＳ−Ｘ（カタログ番号５１５０００５６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を添加した、３．６４ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム及び５．５ｍＭのグルコース（カタログ番号Ａ１３０５１ ＤＪ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を含有するＭＣＤＢ−１３１培地で、三角／振とうフラスコ、スピナーフラスコ、又はコーティングされていない超低級結合若しくは非組織培養処理した６ウェルプレートに、０．２５×１０6〜２×１０6個の細胞／ｍＬの範囲の細胞密度で、多能性ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からの集団を播種した。この様式で添加されたＭＣＤＢ−１３１培地は、この適用の目的で「ステージ１基本培地」と称される。この培地内の集団を、３μＭ ＭＣＸ（ＧＳＫ３Ｂ阻害剤、１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン、米国特許出願第１２／４９４，７８９号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）及び１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、又は３μＭのＭＣＸのみ、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ、のいずれかで、分化の第１日目に処理した。２日目に、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８又は１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡのいずれかを添加した、新鮮なステージ１の基本培地に細胞を移植した。分化開始から時間０（補助剤を加えた基本培地の添加直前）から７２時間後の範囲のさまざまな時点で、フローサイトメトリー、ＰＣＲ、及びウエスタンプロット用に試料を収集した。 Example 9
Differentiation of human embryonic stem cells from cell line WA01 to definitive endoderm: role of MCX / GDF8 in suspension culture 2% fatty acid free BSA (Catalog No. 68700, Proliant, IA), 1X GlutaMAX ™ ( Catalog number 35050-079, Invitrogen, CA), an additional 2.5 mM glucose (catalog number G8769, Sigma), and a stock concentration of ITS-X of 1: 50,000 (catalog number 51500056, Invitrogen, CA) were added. MCDB-131 medium containing 3.64 g / mL sodium bicarbonate and 5.5 mM glucose (Cat. No. A13051 DJ, Invitrogen, Calif.), Triangular / shaking flask, spinner flask, or uncoated Ultra lower binding or non-tissue culture treated 6-well plates, 0.25 × 10 6 in the cell density in the range of to 2 × 10 6 cells / mL, pluripotent human embryonic stem cell line H1 (NIH code: A population from WA01) was seeded. MCDB-131 medium added in this manner is referred to as “stage 1 basal medium” for purposes of this application. The population in this medium was added to 3 μM MCX (GSK3B inhibitor, 14-prop-2-en-1-yl-3,5,7,14,17,23,27-heptazatetracyclo [19.3.1]. .1, 2, 6 to .1 to 8, 12 to] heptacosa-1 (25), 2 (27), 3, 5, 8 (26), 9, 11, 21, 23-nonaen-16-one, US patent application Ser. No. 12 / 494,789, which is hereby incorporated by reference in its entirety) and 100 ng / mL GDF-8 (Cat. No. 120-00, Peprotech), or 3 μM MCX only, or 20 ng / mL of WNT-3A (Catalog No. 1324-WN-002, R & D Systems, MN) + 100 ng / mL of Activin A (Catalog No. 338-AC, R & D Systems, MN), Or treated with either 20 ng / mL WNT-3A alone, on day 1 of differentiation. On day 2, cells were transplanted into fresh stage 1 basal medium supplemented with either 100 ng / mL GDF8 or 100 ng / mL activin A. Samples were collected for flow cytometry, PCR, and Western plots at various time points ranging from time 0 (immediately prior to the addition of basal media with supplements) to 72 hours after the start of differentiation.

フローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカーＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９を発現する細胞の割合を測定することにより、分化の３日後にそれぞれの条件下で、胚体内胚葉が生成された効率を決定した。データは（図４０ａ〜ｂのＦＡＣＳプロットに示され、表１３に要約されているとおり）、懸濁培養下で、分化の１日目のＴＧＦ−βファミリーメンバーの不在での３μＭのＭＣＸの添加が、１日目に３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで細胞が処理される際に得られるものに相当するレベルで、胚体内胚葉を生成することを示す。   Using flow cytometry, determine the efficiency of definitive endoderm production under each condition after 3 days of differentiation by measuring the percentage of cells expressing the cell surface markers CXCR4, CD99, and CD9 did. Data (as shown in the FACS plots of FIGS. 40a-b and summarized in Table 13), in suspension culture, addition of 3 μM MCX in the absence of TGF-β family members on day 1 of differentiation. At a level equivalent to that obtained when cells are treated with 3 μM MCX + 100 ng / mL GDF-8 or 20 ng / mL WNT-3A + 100 ng / mL activin A on day one. Indicates to generate.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

（実施例１０）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養下でのＭＣＸ化合物濃度の用量反応
実施例９に記載したとおり、ステージ１基本培地で、三角／振とうフラスコ又はスピナーフラスコに、０．２５×１０6〜２×１０6個の細胞／ｍＬの範囲の細胞密度で、多能性ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からの集団を播種した。分化の１日目に、１．５、２、３、又は４μＭ ＭＣＸを含有するステージ１の基本培地、及び２日目に１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８を含有する新鮮なステージ１の基本培地で、集団を処理した。３日目に培地交換は行わなかった。分化の３日目の終了時に、フローサイトメトリー及びＰＣＲ分析用の試料を収集した。 (Example 10)
Human Embryonic Stem Cell Differentiation from Cell Line WA01 to Definitive Endoderm: Dose Response of MCX Compound Concentration in Suspension Culture As described in Example 9, in stage 1 basal medium, triangle / shaking flask or spinner flask Were seeded with a population from the pluripotent human embryonic stem cell line H1 (NIH code: WA01) at a cell density ranging from 0.25 × 10 6 to 2 × 10 6 cells / mL. On day 1 of differentiation, in stage 1 basal medium containing 1.5, 2, 3, or 4 μM MCX and on day 2 in fresh stage 1 basal medium containing 100 ng / mL GDF-8 , Treated the population. The medium was not changed on the third day. At the end of the third day of differentiation, samples for flow cytometry and PCR analysis were collected.

次いで、フローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカーＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９を発現する細胞の割合を測定することにより、胚体内胚葉が生成された効率を決定した。データは（図４１Ａ〜ＤのＦＡＣＳプロットに示され、表１４に要約されているとおり）、懸濁培養下で、２μＭ未満の濃度のＭＣＸを添加した結果、（ＣＸＣＲ４陽性のより低い割合及びＣＤ９陽性細胞のより高い割合によって証明されるとおり）胚体内胚葉陽性細胞が次第に少なくことを示している。更に、４μＭを上回る濃度のＭＣＸは、細胞に対する有害な影響を呈し、細胞生存性の低下をもたらす。ただし、ＢＳＡ濃度を高めることによって、濃度≧４マイクロモルを使用し得るように、ＭＣＸの影響を調節することができる。反対に、より低いＢＳＡ濃度で使用する際は、濃度≦１．５マイクロモルを使用して、胚体内胚葉を生成し得る。   Flow cytometry was then used to determine the efficiency with which definitive endoderm was generated by measuring the percentage of cells expressing the cell surface markers CXCR4, CD99, and CD9. The data (as shown in the FACS plots of FIGS. 41A-D and summarized in Table 14) resulted in the addition of MCX at a concentration of less than 2 μM in suspension culture (lower percentage of CXCR4 positive and CD9 It shows progressively fewer definitive endoderm-positive cells (as evidenced by a higher proportion of positive cells). Furthermore, concentrations of MCX above 4 μM have a detrimental effect on the cells, resulting in decreased cell viability. However, by increasing the BSA concentration, the effect of MCX can be adjusted so that a concentration ≧ 4 micromolar can be used. Conversely, when used at lower BSA concentrations, concentrations ≦ 1.5 micromolar can be used to produce definitive endoderm.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

（実施例１１）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養下での培地交換頻度の役割
実施例９に記載したとおり、ステージ１の基本培地で、三角／振とうフラスコ又はスピナーフラスコに、０．２５×１０6〜２×１０6個の細胞／ｍＬの範囲の細胞密度で、多能性ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からの集団を播種した。分化の１日目に、３μＭ ＭＣＸを含有するステージ１の基本培地、及び２日目に１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８を含有する新鮮なステージ１の基本培地で、集団を処理した。対照集団は、３日目に培地交換を受けたが、３日目に別個の容器への培地交換は行われなかった。分化の３日目の終了時に、フローサイトメトリー及びＰＣＲ分析用の試料を収集した。 (Example 11)
Human Embryonic Stem Cell Differentiation from Cell Line WA01 to Definitive Endoderm: Role of Medium Exchange Frequency under Suspension Culture Were seeded with a population from the pluripotent human embryonic stem cell line H1 (NIH code: WA01) at a cell density ranging from 0.25 × 10 6 to 2 × 10 6 cells / mL. On day 1 of differentiation, the population was treated with stage 1 basal medium containing 3 μM MCX and day 2 with fresh stage 1 basal medium containing 100 ng / mL GDF-8. The control population received a medium change on day 3 but no medium change to a separate container on day 3. At the end of the third day of differentiation, samples for flow cytometry and PCR analysis were collected.

次いで、フローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカーＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９を発現する細胞の割合を測定することにより、それぞれの条件下で、胚体内胚葉が生成された効率を決定した。結果を図４２Ａ及びＢのＦＡＣＳプロットに示し、表１５に要約する。   Flow cytometry was then used to determine the efficiency with which definitive endoderm was produced under each condition by measuring the percentage of cells expressing the cell surface markers CXCR4, CD99, and CD9. Results are shown in the FACS plots of FIGS. 42A and B and summarized in Table 15.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

（実施例１２）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養下でのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）の使用
三角／振とうフラスコ又はスピナーフラスコに、０．２５×１０6〜２×１０6個の細胞／ｍＬの範囲の細胞密度で、多能性ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からの集団を播種した。 (Example 12)
Human Embryonic Stem Cell Differentiation from Cell Line WA01 to Definitive Endoderm: Use of GlutaMAX ™ in Suspension Culture 0.25 × 10 6 to 2 × 10 6 in Triangle / Shake Flask or Spinner Flask A population from the pluripotent human embryonic stem cell line H1 (NIH code: WA01) was seeded at cell densities in the range of cells / mL.

分化の１日目に３μＭのＭＣＸを、２日目に１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８を含有する新鮮なステージ１の基本培地を添加した、ステージ１の基本培地（例９に記載）＋又は−ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）内で集団を懸濁することによって、胚体内胚葉の生成にＧｌｕｔａｍｘ（商標）の添加が必要かどうかを決定するため、この実施例を実行した。３日目に培地交換は行わなかった。分化の３日目の終了時に、フローサイトメトリー及びＰＣＲ分析用の試料を収集した。   Stage 1 basal medium (described in Example 9) plus 3 μM MCX on day 1 of differentiation and fresh stage 1 basal medium containing 100 ng / mL GDF-8 on day 2 + or − This example was performed to determine whether the addition of Glutamx ™ was required for definitive endoderm production by suspending the population in GlutaMAX ™. The medium was not changed on the third day. At the end of the third day of differentiation, samples for flow cytometry and PCR analysis were collected.

フローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカーＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９を発現する細胞の割合を測定することにより、それぞれの条件下で、胚体内胚葉が生成された効率を決定した。結果を図４３Ａ及びＢのＦＡＣＳプロットに示し、表１６に要約する。   Flow cytometry was used to determine the efficiency with which definitive endoderm was produced under each condition by measuring the percentage of cells expressing the cell surface markers CXCR4, CD99, and CD9. Results are shown in the FACS plots of FIGS. 43A and B and summarized in Table 16.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

（実施例１３）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養下での重炭酸ナトリウム濃度の役割
実施例９に記載したとおりのステージ１の基本培地（３．６４ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを含有）、又は、２．４３ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する変性されたステージ１の基本培地で、三角／振とうフラスコ又はスピナーフラスコに、０．２５×１０6〜２×１０6個の細胞／ｍＬの範囲の細胞密度で、多能性ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からの集団を播種した。実施例１２に記載したとおり、ＭＣＸ及びＧＤＦ−８を含有するステージ１の基本培地で集団を処理した。分化の３日目の終了時に、フローサイトメトリーのための試料を収集した。分化のそれぞれの日に、位相差画像もまたキャプチャした。 (Example 13)
Differentiation of human embryonic stem cells from cell line WA01 to definitive endoderm: role of sodium bicarbonate concentration in suspension culture Stage 1 basal medium (3.64 g / L bicarbonate as described in Example 9) 0.25 × 10 6 to 2 × 10 6 in a triangular / shaking flask or spinner flask with a modified Stage 1 basal medium containing 2.43 g / L sodium bicarbonate. A population from the pluripotent human embryonic stem cell line H1 (NIH code: WA01) was seeded at cell densities in the range of cells / mL. The population was treated with stage 1 basal media containing MCX and GDF-8 as described in Example 12. At the end of the third day of differentiation, samples for flow cytometry were collected. A phase contrast image was also captured on each day of differentiation.

次いで、フローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカーＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９を発現する細胞の割合を測定することにより、胚体内胚葉が生成された効率を決定した。データを図４４Ａ及びＢのＦＡＣＳプロットに示し、表１７に要約する。懸濁培養では、３．６４ｇ／Ｌを含有する培地で細胞を分化したときより（平均して９７．３５％の細胞発現ＣＸＣＲ４）、２．４３ｇ／Ｌほどの低さの重炭酸ナトリウムレベルのほうが、胚体内胚葉を生成する効率が低いように見える（平均して、８７．４％の細胞発現ＣＸＣＲ４）。また、位相差顕微鏡で観察したとおり（図４４Ｃ及びＤ）、ステージ１の終了時に、重炭酸塩レベルの差異は集団形態の差異と相関したことが観察された。また、高い重炭酸塩レベル下で分化した細胞は、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸塩で分化した細胞よりも疎性の集団を形成することが認められた。   Flow cytometry was then used to determine the efficiency with which definitive endoderm was generated by measuring the percentage of cells expressing the cell surface markers CXCR4, CD99, and CD9. Data are shown in the FACS plots of FIGS. 44A and B and summarized in Table 17. Suspension culture has sodium bicarbonate levels as low as 2.43 g / L than when cells were differentiated in media containing 3.64 g / L (97.35% cell expression CXCR4 on average). It appears that the efficiency of producing definitive endoderm is lower (on average, 87.4% cell expression CXCR4). Also, as observed with a phase contrast microscope (FIGS. 44C and D), it was observed that at the end of stage 1, the difference in bicarbonate level correlated with the difference in population morphology. It was also observed that cells differentiated under high bicarbonate levels formed a looser population than cells differentiated with 2.43 g / L bicarbonate.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

（実施例１４）
計測可能バイオリアクタープロセスでの人為的な多能性幹細胞からの膵臓前駆集団の生成
細胞治療には、１用量当たりに多数の（＞１０8）細胞が必要とされる。この実施例は、現在の細胞療法製造基準で可能であるよりも、３〜５桁大きい誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）質量を分化させることができるプロセスを実証する。 (Example 14)
Generation of pancreatic progenitor populations from artificial pluripotent stem cells in a measurable bioreactor process Cell therapy requires a large number (> 10 8 ) of cells per dose. This example demonstrates a process that can differentiate induced pluripotent stem cell (iPS cell) masses 3 to 5 orders of magnitude larger than is possible with current cell therapy manufacturing standards.

この実施例では、ｉＰＳ細胞株、ＵＴＣ（米国特許出願１３／３３０，９３１（米国公開特許第２０１３／０１５７３６５）で以前に記述された臍帯組織細胞由来で、その開示は、それがｉＰＳ細胞株の誘導に関連するために、参照により組み込まれる）を使用した。細胞は、「フットプリント」フリーの様式でプラスミド遺伝子移入を使用して、マウスの胚性フィーダー細胞に誘導され、継代１５で冷凍保存した。   In this example, an iPS cell line, derived from umbilical cord tissue cells previously described in UTC (US Patent Application 13 / 330,931 (US Published Patent No. 2013/0157365), the disclosure of which Incorporated by reference to relate to induction) was used. Cells were induced into mouse embryonic feeder cells using plasmid gene transfer in a “footprint” free manner and stored frozen at passage 15.

これらの冷凍保存した細胞から、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）のＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）培地（Ｅ８（商標））で、供給源の培地バイアルをヒト組み換えラミニン（ｈｒＬａｍｉｎｉｎ，カタログ番号ＬＮ−５２１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ））へ直接解凍することによって、一連の細胞バンクを生成して、自家種材料を生成した。この解凍し、増殖した材料を、将来のバンク用の種材料として役立つ、「プレ−プレマスター細胞バンク」（プレ−プレＭＣＢ）と呼んだ。次いで、プレ−プレＭＣＢ ３を使用して、連続細胞バンク、プレ−ＭＣＢ、ＭＣＢ、及びワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）を生成した。次いで、１つのＷＣＢバイアルを解凍し、Ｅ８（商標）での３回の継代用に、ＥＤＴＡ継代を使用してｈｒＬａｍｉｎで増殖した。細胞はまず、解凍からＴ２２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃｏｒｎｉｎ，ＮＹ）へ播種してから、複数のＴ２２５フラスコへ継代した。次いで、複数のＴ２２５フラスコを継代し、単一の１層Ｃｅｌｌ Ｓｔａｃｋ（商標）（ＣＳ１）を播種するために結合した。ＣＳ１内の細胞がコンフルエントになると、細胞をＰＢＳ-/-で１度洗浄し、ＰＢＳ-/-で希釈したＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の半強度の溶液で処理し、４〜５分間インキュベートした。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）をその後除去し、酵素溶液の適用から３分後に、ＣＳ１を軽打して細胞の剥離を促進した。０．５％のＢＳＡを添加し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有するＥ８（商標）をＣＳ１に添加して、残留のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を濯ぎ、不活性化した。次いで、濯ぎ液を収集し、第２の濯ぎ液の体積を添加し、収集し、第１の濯ぎ液と共に貯留した。 From these cryopreserved cells, Life Technologies Corporation (Grand Island, NY) Essental 8 ™ medium (E8 ™), and the source media vial was human recombinant laminin (hrLaminin, catalog number LN-521 (Biolaminamin). , Stockholm, Sweden)) to generate a series of cell banks to generate autologous material. This thawed and expanded material was called the “pre-premaster cell bank” (pre-pre MCB), which served as seed material for future banks. Pre-pre-MCB 3 was then used to generate a continuous cell bank, pre-MCB, MCB, and working cell bank (WCB). One WCB vial was then thawed and grown in hrLamin using EDTA passage for 3 passages on E8 ™. Cells were first thawed and seeded into T225 flasks (Corning; Cornin, NY) and then passaged to multiple T225 flasks. Multiple T225 flasks were then passaged and combined to inoculate a single single layer Cell Stack ™ (CS1). When cells in the CS1 becomes confluent, cells were PBS - / - was washed once with, PBS - / - in and treated with a solution of half the strength of Accutase diluted (registered trademark), and incubated for 4-5 minutes. Accutase® was then removed, and 3 minutes after application of the enzyme solution, CS1 was tapped to promote cell detachment. 0.5% BSA was added and E8 ™ containing 10 micromolar Rho kinase inhibitor, Y-27632 was added to CS1 to rinse and inactivate residual Accutase ™. . The rinse solution was then collected and a second rinse solution volume was added, collected, and stored with the first rinse solution.

０．５％のＢＳＡを添加し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する培地内の細胞を、２２５ｍＬリットル中１×１０6個の細胞／ｍＬの濃度で、１リットルの使い捨てスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）へ移植した。加湿、５％のＣＯ2インキュベーター内において、６０分間静的懸濁液内で細胞を集団化させ、次いで、５５〜６５ｒｐｍで５分間撹拌し、０．５％のＢＳＡを添加し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する追加の培地２２５ｍＬを添加した。細胞を更に３０分間静的培養下で沈降させ、次いで、０．５％のＢＳＡを添加し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する追加の培地１５０ｍＬをスピナーフラスコに添加した。その後、加湿、５％のＣＯ2インキュベーター内において、５０〜７０ｒｐｍで、細胞を連続的に撹拌した。２４時間後、スピナーフラスコをインキュベーターから除去し、集団を５〜１０分間沈降させた。その後、容器内に２００ｍＬが残るまで培地を吸引してから、４００ｍＬの追加の新鮮な培養培地をスピナーフラスコに添加した。このプロセスを２日目（移植から４８時間後）の終了時に繰り返した。 Cells in medium containing 0.5% BSA and containing 10 micromolar Rho kinase inhibitor, Y-27632, were added at a concentration of 1 × 10 6 cells / mL in 225 mL liters. Transplanted into a disposable spinner flask (Corning; Corning, NY). Cells are clustered in a static suspension for 60 minutes in a humidified, 5% CO 2 incubator, then stirred for 5 minutes at 55-65 rpm, 0.5% BSA is added, 10 micromolar An additional 225 mL of medium containing a Rho kinase inhibitor, Y-27632, was added. Cells were allowed to settle for an additional 30 minutes under static culture, then 0.5% BSA was added and an additional 150 mL of medium containing 10 micromolar Rho kinase inhibitor, Y-27632 was added to the spinner flask. . Thereafter, the cells were continuously agitated at 50-70 rpm in a humidified, 5% CO 2 incubator. After 24 hours, the spinner flask was removed from the incubator and the population was allowed to settle for 5-10 minutes. The medium was then aspirated until 200 mL remained in the container, and then 400 mL of additional fresh culture medium was added to the spinner flask. This process was repeated at the end of the second day (48 hours after transplantation).

次いで、最初のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）処理から７２時間後、細胞集団分離及びスピナーフラスコ播種（継代）のプロセスを繰り返して、複数の継代中（検査範囲：１〜１０回の継代）、細胞を懸濁液に維持した。   Then, 72 hours after the first Accutase® treatment, the process of cell population separation and spinner flask seeding (passage) was repeated, during multiple passages (test range: 1-10 passages), Cells were maintained in suspension.

このプロセスを使用して、ＵＴＣ ｉＰＳ細胞を基質上の接着培養から、細胞集団として懸濁培養へ変換し、その後、懸濁液内で増殖した。これらの懸濁液で継代し、培養した細胞はその後、後の使用のために冷凍保存し、保管した。冷凍保存用に懸濁液で増殖した細胞集団を調製するために、細胞を４０マイクロメートルの細胞ストレーナに通過させなかったことを除き、上記に述べたとおりに、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）で細胞集団を分離した。   Using this process, UTC iPS cells were converted from an adherent culture on a substrate to a suspension culture as a cell population and then grown in suspension. Cells passaged and cultured in these suspensions were then stored frozen and stored for later use. To prepare a cell population grown in suspension for cryopreservation, the cell population was obtained with Accutase® as described above, except that the cells were not passed through a 40 micrometer cell strainer. Separated.

次いで、１リットルの使い捨てフラスコから細胞を計数し、必要に応じて結合し、８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを撹乱させることなく、上澄を可能な限り完全に除去した。次いで、１ｍＬ当たり１億５０００万個の細胞の最終濃度を得るために、低温（＜４℃）のＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）１０を滴下により添加して、１．８ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇクライオバイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）又は１５ｍＬのＭｉｌｔｅｎｙｉクライオバック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に移植する間、細胞溶液を氷浴内で保持した。   Cells were then counted from a 1 liter disposable flask, combined as needed, and centrifuged at 80-200 rcf for 5 minutes. The supernatant was then removed as completely as possible without disturbing the cell pellet. Then, to obtain a final concentration of 150 million cells per mL, cold (<4 ° C.) CryoStor® 10 was added dropwise to provide a 1.8 mL Corning cryovial (Corning; Corning). , NY) or 15 mL of Miltenyi cryoback (Miltenyi Biotec Inc. Auburn, Calif.), While maintaining the cell solution in an ice bath.

次いで、以下のとおり、バイアル内の懸濁増殖細胞を自動凍結保存装置内に高密度で凍結した。チャンバを４℃に予冷し、試料バイアル温度が６℃に達するまで、温度を保持した。次いで、試料が−７℃に達するまで、チャンバ温度を２℃／分で下降させた。試料バイアルが−７℃に達すると、チャンバが−４５℃に達するまで、チャンバを２０℃／分で冷却した。次いで、チャンバ温度が−２５℃に達するまで、チャンバ温度を１０℃／分で素早く上昇させ、その後、試料バイアルが−４５℃に達するまで、チャンバを０．８℃／分で更に冷却した。次いで、チャンバが−１６０℃に達するまで、チャンバ温度を３５℃／分で冷却した。次いで、チャンバ温度を−１６０℃で少なくとも１０分間保持してから、バイアルをガス相液体窒素保管容器に移植した。   Then, the suspension-grown cells in the vial were frozen at high density in an automatic cryopreservation apparatus as follows. The chamber was pre-cooled to 4 ° C and the temperature was held until the sample vial temperature reached 6 ° C. The chamber temperature was then decreased at 2 ° C / min until the sample reached -7 ° C. When the sample vial reached -7 ° C, the chamber was cooled at 20 ° C / min until the chamber reached -45 ° C. The chamber temperature was then quickly increased at 10 ° C./min until the chamber temperature reached −25 ° C., after which the chamber was further cooled at 0.8 ° C./min until the sample vial reached −45 ° C. The chamber temperature was then cooled at 35 ° C./min until the chamber reached −160 ° C. The chamber temperature was then held at −160 ° C. for at least 10 minutes before the vial was implanted into a gas phase liquid nitrogen storage container.

撹拌槽バイオリアクターを接種するために、高密度で冷凍保存された細胞を、液体窒素保管容器から取り出し、解凍し、閉鎖された０．２リットルのガラスバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ；Ｊｕｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を播種するために使用した。クライオバイアルを、ガス相液体窒素保管容器から除去し、３７℃の水浴内に１０５秒間直接定置した。次いで、２ｍＬのガラスピペットを介して、解凍されたバイアル内容物を５０ｍＬの円錐チューブに移植した。次いで、０．５％のＢＳＡを含有し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を添加された９ｍＬのＥ８（商標）を、滴下によりチューブに添加した。次に、細胞を８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。その後、チューブから上澄を吸引し、０．５％のＢＳＡを含有し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を添加された、１０ｍＬの新鮮なＥ８を添加した。細胞を含有するこの体積を培地移植ボトル（Ｃａｐ２Ｖ８（登録商標），ＳａｎｉＳｕｒｅ，Ｍｏｏｒｐａｒｋ，ＣＡ）へ分注し、蠕動ポンプによって、無菌Ｃ−ｆｌｅｘチュービング溶接を介して、ボトル内容物をバイオリアクター内に直接ポンプで注入した。多能性幹細胞接種用の調製において、０．５％のＢＳＡ及び１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を添加し、３７℃に予熱し、７０ｒｐｍで撹拌し、ＣＯ2によって６．８〜７．１ｐＨに調節した、０．１５ＬのＥ８（商標）を用いて、溶存酸素設定値を３０％（ＣＯ2、空気、Ｏ2、及びＮ2を調節）として、バイオリアクターを調製した。接種の直後、バイオリアクターを細胞計数用に試料採取し、細胞０．２２５×１０6個／ｍＬの最終細胞濃度をもたらすよう、必要に応じて培地体積を調整した。 To inoculate the stirred tank bioreactor, the densely frozen cells are removed from the liquid nitrogen storage container, thawed, and seeded with a closed 0.2 liter glass bioreactor (DASGIP; Julich, Germany). Used to do. The cryovial was removed from the gas phase liquid nitrogen storage container and placed directly in a 37 ° C. water bath for 105 seconds. The thawed vial contents were then implanted into a 50 mL conical tube via a 2 mL glass pipette. Then 9 mL of E8 ™ containing 0.5% BSA and supplemented with 10 micromolar Rho kinase inhibitor, Y-27632, was added dropwise to the tube. The cells were then centrifuged at 80-200 rcf for 5 minutes. The supernatant was then aspirated from the tube and 10 mL of fresh E8 containing 0.5% BSA, supplemented with 10 micromolar Rho kinase inhibitor, Y-27632, was added. This volume containing the cells is dispensed into a media transplant bottle (Cap2V8®, SaniSure, Moopark, Calif.) And the bottle contents are placed into the bioreactor via a peristaltic pump via sterile C-flex tubing welding. Directly pumped. In preparation for pluripotent stem cell inoculation, 0.5% BSA and 10 micromolar Rho kinase inhibitor, Y-27632, are added, preheated to 37 ° C., stirred at 70 rpm, and 6.8 by CO 2 . A bioreactor was prepared using 0.15 L of E8 ™, adjusted to ˜7.1 pH, with a dissolved oxygen setting of 30% (CO 2 , air, O 2 and N 2 adjusted). Immediately after inoculation, the bioreactor was sampled for cell counting and the media volume was adjusted as necessary to give a final cell concentration of 0.225 × 10 6 cells / mL.

撹拌槽バイオリアクターに接種された細胞は、連続的に撹拌されるタンク内に細胞集団を形成した。接種後、リアクター内の、０．５％のＢＳＡで添加したＥ８（商標）培地に、細胞集団を３日間維持した。培地は毎日変更し、接種から２４時間後に使用済み培地の９０％を除去して、０．１５リットルの新鮮な培地を添加した。接種から４８時間後に、使用済み培地の９０％を除去して、０．１５リットルの新鮮な培地を添加した。接種から７２時間後に、＞９０％の使用済み培地を除去して、分化培地を添加することにより、多能性細胞分化を開始した（表１８）。   Cells inoculated into the stirred tank bioreactor formed a cell population in a continuously stirred tank. After inoculation, the cell population was maintained in E8 ™ medium supplemented with 0.5% BSA in the reactor for 3 days. The medium was changed daily, 90% of spent medium was removed 24 hours after inoculation and 0.15 liters of fresh medium was added. Forty-eight hours after inoculation, 90% of the spent medium was removed and 0.15 liters of fresh medium was added. 72 hours after inoculation, pluripotent cell differentiation was initiated by removing> 90% spent media and adding differentiation media (Table 18).

ステージ式の分化プロセスを開始した後は、温度（３７℃）、ｐＨ（分化用に７．４）、及び溶存酸素（ステージ１については１０％のＤＯ設定値、それ以外は常時３０％のＤＯ設定値、ＣＯ2、Ｏ2、Ｎ2、及び空気の調節）が調節された、閉鎖した撹拌懸濁バイオリアクターに、細胞を１２日間以上維持した。分化プロセス全体を通し、培地交換のたびに、ディップチューブを介して培地を除去する前に羽根車を５〜２０分停止して、集団を沈降させた。Ｔｅｒｕｍｏ（商標）チューブ接合装置を使用したＣ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングに接続したディップチューブを通る蠕動ポンプによって、バイオリアクター内の培地を閉鎖されたボトル又は袋から除去するか、又はそこに追加して、閉鎖系を維持した。十分な培地を容器に添加して、羽根車を完全に浸らせた後で、羽根車及び加熱器に再び電圧を加えた。 After initiating the staged differentiation process, the temperature (37 ° C.), pH (7.4 for differentiation), and dissolved oxygen (10% DO setpoint for stage 1, otherwise 30% DO always) The cells were maintained in a closed stirred suspension bioreactor with controlled settings (CO 2 , O 2 , N 2 , and air conditioning) for over 12 days. Throughout the differentiation process, each time the medium was changed, the impeller was stopped for 5-20 minutes before the medium was removed via the dip tube to allow the population to settle. Remove or add media in bioreactor from closed bottle or bag by peristaltic pump through dip tube connected to C-Flex® tubing using Terumo ™ tube splicer And maintained a closed system. Enough medium was added to the container to completely soak the impeller, and then the voltage was reapplied to the impeller and heater.

バイオリアクターのプロセスを監視するため、細胞集団を含有する培地の試料を毎日取り出して、図４５に示すとおり、細胞の数及び生存性を決定した（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標））。プロセスの間は、細胞の一般的な増殖が観察され、生育細胞０．２２５×１０6個／ｍＬの接種材料が、ステージ４、３日目で０．６５×１０6個の生育細胞／ｍＬを生成するように増殖した（図４５）。 To monitor the bioreactor process, a sample of the media containing the cell population was taken daily to determine cell number and viability as shown in FIG. 45 (NucleoCounter®). During the process, general proliferation of cells is observed, and 0.225 × 10 6 inoculum of grown cells is inoculated with 0.65 × 10 6 grown cells / mL on stage 4, day 3. (FIG. 45).

毎日の計数に加え、バイオリアクター培地試料をＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって分析した。ステージ０のリアクター設定値（ｐＨ６．８）によって、ステージ０の培地のｐＨは、ステージ０を通して酸性であった（ｐＨ６．８）（図４６）ことが観察された。ステージ０の酸性設定値は、細胞の代謝活動を低減させるようであり、ステージの０培地では、比較的低い乳酸及び高いグルコースレベルが観察された。細胞がステージ３の終了までの分化を開始すると、細胞は、培地内のほとんど全てのグルコースを消費し（図４７）、高いレベルの乳酸を生成した（図４８）。また、細胞密度の増加が、ステージ１及び２にわたって観察された（図４５）。   In addition to daily counting, bioreactor media samples were analyzed by NOVA BioProfile® FLEX (Nova Biomedical Corporation, Waltham, Mass.). It was observed that the pH of the stage 0 medium was acidic throughout stage 0 (pH 6.8) (FIG. 46), depending on the stage 0 reactor setting (pH 6.8). Stage 0 acidic settings appear to reduce cellular metabolic activity, with relatively low lactic acid and high glucose levels observed in stage 0 medium. When cells began to differentiate to the end of stage 3, they consumed almost all the glucose in the medium (FIG. 47) and produced high levels of lactic acid (FIG. 48). An increase in cell density was also observed across stages 1 and 2 (FIG. 45).

ｐＨ及び代謝におけるステージに特異的な変化が、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたとおりの、ｍＲＮＡ発現パターンにおけるステージの変化に一致したかどうかを判断するため、以下のことを行った。多能性、胚体内胚葉（ＤＥ）、腸管（ＧＴ）又はステージ４（Ｓ４）を指定する、４つのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙｓ（Ｌｉｆｅ（商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用した。全ての運転及びアレイにわたって発現を標準化するため、未分化のＵＴＣｉＰＳ細胞試料を対照として対比した、倍率差として結果を表示した。   To determine whether stage specific changes in pH and metabolism were consistent with stage changes in mRNA expression patterns as measured by qRT-PCR, the following was performed. Four Applied Biosystems Low Density Arrays (Life ™, Carlsbad, CA) were used that specify pluripotency, definitive endoderm (DE), intestinal tract (GT) or stage 4 (S4). To normalize expression across all runs and arrays, the results were displayed as fold differences compared to undifferentiated UTCiPS cell samples as controls.

これらのアレイを使用して、分化のステージごとに遺伝子発現を決定した。次いで、バイオリアクターに解凍した種材料細胞は、ステージ０の１、２、及び３日目（バイオリアクター接種から２４、４８、及び７２時間後：図４９及び５０）には、未分化の遺伝子発現パターンを示したことが観察された。これらの結果は、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１の高い発現レベル、並びにＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４の欠損を示した、フローサイトメトリー結果とうまく相関した（図５１）。これらのフローサイトメトリー及びｑＲＴ−ＰＣＲデータは、多能性（ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＴＤＧＦ、及びＺＦＰ４２）の遺伝子に関する、堅牢かつ安定な発現パターンと、安定な多能性状態と一貫した分化（ＣＤ９９、ＣＤＨ２、ＣＤＸ２、ＣＥＲ１、ＣＸＣＲ４、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＨＡＮＤ２、ＨＮＦ４α、ＫＩＴ、ＭＮＸ１、ＭＩＸＬ１、ＰＲＤＭ１、ＰＴＨＲ１Ｒ、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、Ｔ、ＴＭＰＲＳＳ２、及びＶＷＦ）の間に特徴的に発現する遺伝子の発現がないことと、を示した。   These arrays were used to determine gene expression at each stage of differentiation. The seed material cells thawed in the bioreactor then showed undifferentiated gene expression on days 1, 2, and 3 of stage 0 (24, 48, and 72 hours after bioreactor inoculation: FIGS. 49 and 50). It was observed that it showed a pattern. These results correlated well with flow cytometry results that showed high expression levels of CD9, SSEA4, TRA-1-60, and TRA-1-81, as well as CXCR4 / CD184 deficiency (FIG. 51). These flow cytometry and qRT-PCR data are consistent with a robust and stable expression pattern and a stable pluripotent state for genes of pluripotency (CD9, NANOG, POU5F1, SOX2, TDGF, and ZFP42) Differentiation (CD99, CDH2, CDX2, CER1, CXCR4, EOMES, FGF17, FGF4, FOXA2, GATA2, GATA4, GATA6, GSC, HAND2, HNF4α, KIT, MNX1, MIXL1, PRDM1, PTHR1R, SOX17, SOX7, TOX7, SOX7 And VWF), there was no expression of genes that are characteristically expressed.

ステージ０の完了時（リアクター接種から７２時間後）に、ＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する分化培地（表１８）に細胞を移植した。この培地変更の２４時間後、ＦＯＸＡ２、ＨＡＮＤ２、ＰＲＤＭ１、ＰＴＨ１Ｒ、及びＳＯＸ１７発現の＞１０ｘの増加、ＣＥＲ１、ＦＧＦ４、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、及びＭＩＮＸ１の＞１００ｘ増加、及びＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＭＩＸＬ１、及びＴ発現の＞１０００ｘの増加といった、遺伝子発現パターンに有意な変化（図４９及び５０の未分化の対照と対比した倍数発現）が認められた。これらの増加した発現レベルは、細胞が中内胚葉運命を経て遷移していることを示した。未分化細胞と対比して、ＣＤＸ２レベルがステージ１、１日目に上昇したことも認められたが（対照に対して発現が２７００ｘの増加）、これは発現の一過性の増加であり、ＣＤＸ２レベルはステージ１、３日目までに、分化の誘導前に観察されたレベルと同等のレベルまで、９７％下降した（図４９及び５０の未分化の対照と対比した倍数発現）。   At the completion of stage 0 (72 hours after reactor inoculation), cells were transplanted into differentiation medium (Table 18) containing MCX and GDF8. 24 hours after this media change,> 10x increase in FOXA2, HAND2, PRDM1, PTH1R, and SOX17 expression,> 100x increase in CER1, FGF4, GATA4, GATA6, GSC, and MINX1, and EOMES, FGF17, MIXL1, and Significant changes in gene expression patterns (fold expression compared to undifferentiated controls in FIGS. 49 and 50) were observed, such as> 1000 × increase in T expression. These increased expression levels indicated that the cells had transitioned through mesendoderm fate. In contrast to undifferentiated cells, it was also observed that CDX2 levels were increased on stage 1, day 1 (2700x increase in expression relative to controls), which is a transient increase in expression, CDX2 levels were reduced by 97% by stage 1 and day 3 to a level comparable to that observed before induction of differentiation (fold expression compared to undifferentiated controls in FIGS. 49 and 50).

ステージ１の分化培地への露出から７２時間後に、細胞は胚体内胚葉の仕様と一貫したプロファイルを発現し、ＣＸＣＲ４レベルが過去の対照に対して約４００ｘでピークに達し、ＦＯＸＡ２は過去の対照に対して１３６ｘで発現し、ＳＯＸ１７は過去の対照に対して４７０，０００ｘで発現した。胚体内胚葉と一貫して、ステージ１（３日目）の終了時のＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ４、ＧＳＣ、ＭＩＸ１、及びＴの遺伝子発現が、ステージ１、１日目に観察された上昇レベルから下降したこともまた認められた（図４９及び５０の未分化の対照と対比した倍数発現）。   72 hours after exposure to stage 1 differentiation media, cells expressed a profile consistent with definitive endoderm specifications, CXCR4 levels peaked at about 400x relative to past controls, and FOXA2 In contrast, SOX17 was expressed at 470,000x relative to the past control. Consistent with definitive endoderm, CER1, EOMES, FGF4, GSC, MIX1, and T gene expression at the end of stage 1 (day 3) declined from the elevated levels observed on stage 1 and day 1. It was also observed (fold expression relative to the undifferentiated controls of FIGS. 49 and 50).

ｑＲＴ−ＰＣＲによって観察された遺伝子発現のこれらの変化は、フローサイトメトリーによって観察された結果と相関した。分化開始時（図５１）のＣＤ９発現／ＣＸＣＲ４陰性多能性細胞集団から、ステージ１の終了時（図５２）のＣＸＣＲ４発現細胞（９８．６％のＣＸＣＲ４陽性）の均質な集団まで、ほぼ完全な遷移が見られた。   These changes in gene expression observed by qRT-PCR correlated with the results observed by flow cytometry. From a CD9-expressing / CXCR4-negative pluripotent cell population at the start of differentiation (FIG. 51) to a homogeneous population of CXCR4-expressing cells (98.6% CXCR4-positive) at the end of stage 1 (FIG. 52) Transition was seen.

胚体内胚葉の形成（ステージ１）の完了後、原始前腸の形成の誘導に使用するモルフォゲンである、ＦＧＦ７を含有するものに、培地を変更した。原始前腸の形成と一貫して、ステージ２、１及び３日目のＨＮＦ４α及びＧＡＴＡ６発現レベルが増加した一方、ステージ１、３日目に高いレベルで発現した遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＭＮＸ１、ＰＲＤＭ１、ＳＯＸ１７、及びＶＷＦ）はステージ２の終了までに発現の減少を示した（図５０及び５３の未分化の対照と対比した倍数発現）。前腸遺伝子（ＡＦＰ、ＨＨＥＸ、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１）の発現が増加した（図５３の未分化の対照と対比した倍数発現）。   After completion of definitive endoderm formation (stage 1), the medium was changed to one containing FGF7, a morphogen used to induce the formation of primitive foregut. Consistent with the formation of the primitive foregut, levels of HNF4α and GATA6 expression increased on stage 2, 1 and 3 days, while genes expressed at high levels on stage 1 and 3 (CXCR4, EOMES, FGF17, FGF4 , MNX1, PRDM1, SOX17, and VWF) showed decreased expression by the end of stage 2 (fold expression compared to undifferentiated controls in FIGS. 50 and 53). Expression of foregut genes (AFP, HHEX, PDX1, and PROX1) was increased (fold expression compared to undifferentiated control in FIG. 53).

細胞をステージ２の培地で７２時間培養した後、培養をステージ３の培地に切り替えた（表１８）。この培地で一度、細胞は、遺伝子発現に関するｑＲＴ−ＰＣＲアッセイによって測定されたとおり、内胚葉膵臓系統と一貫したマーカーを発現した。ＰＤＸ１の遺伝子発現は、ステージ２、３日目の終了時点で対照に対して１２，０００×から、ステージ３、３日目の終了時点で対照に対して７３９，０００×へと、６０倍増加した。これらのデータは、細胞が膵臓運命に特定化していたことを示した（図５４）。この観察を支持するものは、図５４及び５５に示すとおり、膵臓内で通常発現する遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の宿主に関して、未分化の対照と対比した発現レベルの増加であった。興味深いことに、ＯＣＴ４／ＰＯＵ５Ｆ１発現（ｑＲＴ−ＰＣＲによる３７試料Ｃｔｓ）がないことと、内胚葉系統ＡＦＰ、ＡＬＢ、及びＣＤＸ２の他のマーカーの発現レベルが高いことと、がまた観察された。このことは、バイオリアクター内の細胞集団が、多能性細胞集団から最初に比較的形成力のある腸管運命へ分化してから、膵臓運命へ更に分化したことを示す（図５４及び５５）。   Cells were cultured in stage 2 medium for 72 hours, then the culture was switched to stage 3 medium (Table 18). Once in this medium, cells expressed markers consistent with the endoderm pancreatic lineage as measured by qRT-PCR assay for gene expression. PDX1 gene expression increased 60-fold from 12,000 × vs. control at the end of stage 2, 3 days to 739 ×× control at the end of stage 3, 3 days did. These data indicated that the cells were specific for pancreatic fate (FIG. 54). Supporting this observation, as shown in FIGS. 54 and 55, genes normally expressed in the pancreas (ARX, GAST, GCG, INS, ISL1, NEUROD1, NGN3, NKX2.2, NKX6.1, PAX4, PAX6, For PTF1A and SST) hosts, there was an increase in expression levels compared to undifferentiated controls. Interestingly, the absence of OCT4 / POU5F1 expression (37 samples Cts by qRT-PCR) and high expression levels of other markers of the endoderm lines AFP, ALB and CDX2 were also observed. This indicates that the cell population in the bioreactor first differentiated from the pluripotent cell population into a relatively forming intestinal fate and then further differentiated into pancreatic fate (FIGS. 54 and 55).

４ステージ分化プロセスの終了時に、細胞は、高いレベルのＰＤＸ１（ＦＡＣＳによる９５．６％陽性、ｑＲＴ−ＰＣＲによる対照に対する約１，０００，０００倍の誘導）発現を維持した。細胞は、膵臓前駆細胞（ＦＡＣＳによるＮＫＸ６．１の３９．２％陽性）及び膵臓分泌細胞の集団（ＰＡＸ６の９．４％陽性、クロモグラニンの１２．４％陽性、ＮＫＸ２．２の１５．２％陽性、全てＦＡＣＳによる）と一貫した発現パターンを示した。このステージに特異的なマーカー発現パターンは、多能性集団から膵臓前駆細胞への効率的なステージ式分化を示した。フローサイトメトリーで観察されたこれらの結果を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって確認した。膵臓内で通常発現する遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＭＡＦＢ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の宿主は全て、ステージ４、３日目に発現レベルが増加していることも認められた。（図５５）。参照のため、それぞれのステージ終了時の細胞集団の代表的な顕微鏡写真（４ｘ）を、図５６に示す。   At the end of the 4-stage differentiation process, cells maintained high levels of PDX1 (95.6% positive by FACS, approximately 1,000,000 fold induction relative to control by qRT-PCR) expression. Cells were pancreatic progenitor cells (39.2% positive for NKX6.1 by FACS) and pancreatic secretory cells (9.4% positive for PAX6, 12.4% positive for chromogranin, 15.2% for NKX2.2) Positive, all by FACS). This stage-specific marker expression pattern showed efficient staged differentiation from pluripotent populations to pancreatic progenitor cells. These results observed by flow cytometry were confirmed by qRT-PCR. All hosts of genes normally expressed in the pancreas (ARX, GAST, GCG, IAPP, INS, ISL1, MAFB, NEUROD1, NGN3, NKX2.2, NKX6.1, PAX4, PAX6, PTF1A, and SST) are all stage 4 It was also observed that the expression level increased on the third day. (FIG. 55). For reference, a representative photomicrograph (4x) of the cell population at the end of each stage is shown in FIG.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

Figure 2017500013
Figure 2017500013

Figure 2017500013
Figure 2017500013

材料：
・人胚性幹細胞（ｈＥＳ）細胞株Ｈ１（ＷＡ０１細胞、ＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）
・ＰＢＳ（カタログ番号１４１９０、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）
・Ｙ−２７６３２（Ａｘｘｏｒａカタログ番号ＡＬＸ−２７０−３３３，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
・ＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号１７−７−１１Ｅ）
・ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）−（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ Ａ／Ｓ、カタログ番号ＹＣ−Ｔ１００−（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ Ａ／Ｓ，カタログ番号ＹＣ−Ｔ１００，Ａｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）
・非組織培養処理した６ウェルの皿（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カタログ番号Ｆａｌｃｏｎ ３５１１４６，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）
・Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号Ａ−６９６４，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
・ｐＨ、及び溶存酸素（ＤＯ）バイオリアクタープローブ（ＦｅｒｍＰｒｏｂｅ（登録商標）ｐＨ電極２２５ｍｍ、モデル番号Ｆ−６３５、及びＤＯ ＯｘｙＰｒｏｂｅ（登録商標）１２ｍｍセンサー、モデル番号Ｄ−１４５（Ｂｒｏａｄｌｅｙ−Ｊａｍｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）
・免疫保護マクロ封入デバイス（ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標），Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ））
・ＨＵＭＡＮ Ｃ−ＰＥＰＴＩＤＥ ＥＬＩＳＡ（ＭＥＲＣＯＤＩＡ，カタログ番号１０−１１４１−０１）
・ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、ＭＣＤＢ１３１及びＩＴＳ−Ｘ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
・ＦＡＦ−ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ）
・レチノイン酸、グルコース４５％（２．５Ｍ）、ＳＡＮＴ（Ｓｈｈ阻害剤）（Ｓｉｇｍａ）
・ＧＤＦ８（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
・ＭＣＸ
・ＦＧＦ７（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）
・ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体アンタゴニスト）（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）
・ＴＰＰＢ（ＰＫＣ賦活物質）（ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ） material:
-Human embryonic stem cell (hES) cell line H1 (WA01 cells, WiCell (Madison WI)
・ PBS (Catalog No. 14190, Invitrogen)
Y-27632 (Axxora catalog number ALX-270-333, San Diego, CA)
・ EDTA (Lonza, catalog number 17-7-11E)
NucleoCounter (registered trademark)-(ChemoMetec A / S, catalog number YC-T100- (ChemoMetec A / S, catalog number YC-T100, Allerod, Denmark)
Non-tissue culture treated 6-well dish (Becton Dickinson, catalog number Falcon 351146, Franklin Lakes, NJ)
Accutase (registered trademark) (Sigma-Aldrich, catalog number A-6964, St. Louis, MO)
PH and dissolved oxygen (DO) bioreactor probe (FermProbe® pH electrode 225 mm, model number F-635, and DO OxyProbe® 12 mm sensor, model number D-145 (Bradley-James Corporation, Irvine) CA)
・ Immunoprotective macro encapsulation device (TheraCyte (TM), Irvine CA))
・ HUMAN C-PEPTIDE ELISA (MERCODIA, catalog number 10-1141-01)
GlutaMAX (trademark), MCDB131 and ITS-X Invitrogen
・ FAF-BSA (Proliant)
Retinoic acid, glucose 45% (2.5M), SANT (Shh inhibitor) (Sigma)
・ GDF8 (Peprotech)
・ MCX
・ FGF7 (R & D Systems)
LDN-193189 (BMP receptor antagonist) (Stemgent)
・ TPPB (PKC activator) (ChemPartner)

（実施例１５）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養下でのＭＣＸ／ＧＤＦ８の細胞周期制御としての役割
２％の脂肪酸フリーのＢＳＡ（カタログ番号６８７００，Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、追加の２．５ｍＭグルコース（カタログ番号Ｇ８７６９，Ｓｉｇｍａ）、及び１：５０，０００のストック濃度のＩＴＳ−Ｘ（カタログ番号５１５０００５６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を追加した、３．６４ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム及び５．５ｍＭのグルコース（カタログ番号Ａ１３０５１ ＤＪ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を含有するＭＣＤＢ−１３１培地において、三角／振とうフラスコ内に０．５×１０6個の細胞／ｍＬで、多能性ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からの集団を播種した。この様式で添加したＭＣＤＢ−１３１培地は、この実施例の目的でステージ１基本培地、又は「未希釈」培地と称される。ＧＳＫ３Ｂ阻害剤（１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン、米国特許出願第１２／４９４，７８９号は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、「ＭＣＸ」と称される。 (Example 15)
Differentiation of human embryonic stem cells from cell line WA01 to definitive endoderm: role of MCX / GDF8 as cell cycle control in suspension culture 2% fatty acid free BSA (Catalog No. 68700, Proliant, IA), 1X GlutaMAX ™ (Catalog No. 35050-079, Invitrogen, CA), additional 2.5 mM glucose (Catalog No. G8769, Sigma), and ITS-X with a stock concentration of 1: 50,000 (Catalog No. 51500056, Invitrogen, In MCDB-131 medium containing 3.64 g / mL sodium bicarbonate and 5.5 mM glucose (Cat. No. A13051 DJ, Invitrogen, Calif.) Supplemented with CA), 0.5% in an Erlenmeyer / shaking flask. × 10 6 pieces A population from the pluripotent human embryonic stem cell line H1 (NIH code: WA01) was seeded at cells / mL. MCDB-131 medium added in this manner is referred to as stage 1 basal medium, or “undiluted” medium for the purposes of this example. GSK3B inhibitor (14-prop-2-en-1-yl-3,5,7,14,17,23,27-heptazatetracyclo [19.3.1.1-2, 6-.1-1. 8,12-] heptacosa-1 (25), 2 (27), 3,5,8 (26), 9,11,21,3-nonaen-16-one, U.S. Patent Application No. 12 / 494,789 Is incorporated herein by reference in its entirety) is referred to as “MCX”.

分化の第１日目に、以下の６つの条件のいずれかで集団を処理した。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。   On the first day of differentiation, the population was treated under any of the following six conditions. (1) undiluted, (2) 3 μM MCX + 100 ng / mL GDF-8 (catalog number 120-00, Peprotech), (3) 3 μM MCX only, (4) 100 ng / mL GDF-8 only, (5 ) 20 ng / mL WNT-3A (Catalog Number 1324-WN-002, R & D Systems, MN) + 100 ng / mL Activin A (Catalog Number 338-AC, R & D Systems, MN), or (6) 20 ng / mL WNT -3A only.

それぞれの条件下の培地を、分化の開始から２４及び４８時間後に変更した。これらの時間に、条件１、２、３、及び４の細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８を添加した新鮮なステージ１の基本培地に変更し、条件５及び６の細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加した新鮮なステージ１の基本培地に変更した。   The medium under each condition was changed 24 and 48 hours after the start of differentiation. At these times, cells in conditions 1, 2, 3, and 4 were changed to fresh stage 1 basal medium supplemented with 100 ng / mL GDF8, and cells in conditions 5 and 6 were changed to 100 ng / mL activin. The medium was changed to a fresh stage 1 basal medium supplemented with A.

分化開始の１時間前、及び分化開始から５、２３、２９、４７、７１時間後（「時間０」と称する）に、懸濁試料を非組織培養で処理した６ウェルの皿に移植し、ＥｄＵ（Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）ＥｄＵ Ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で１時間インキュベートした。次いで、ＥｄＵでインキュベートした細胞を、分化の開始から０、６、２４、３０、４８、又は７２時間後の時間に、フローサイトメトリーによって評価して、Ｇ０／Ｇ１、Ｓ、又はＧ２／Ｍステージの細胞周期にある細胞の割合を測定した。   1 hour before the start of differentiation and 5, 23, 29, 47, 71 hours after the start of differentiation (referred to as “time 0”), the suspension sample was transferred to a 6-well dish treated with non-tissue culture, Incubated with EdU (Click-iT® EdU Kit, Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.) For 1 hour. Cells incubated with EdU were then evaluated by flow cytometry at 0, 6, 24, 30, 48, or 72 hours after the onset of differentiation to determine the G0 / G1, S, or G2 / M stage. The percentage of cells in the cell cycle was measured.

このプロトコルに続き、Ｇ０／Ｇ１、Ｓ、又はＧ２／Ｍステージの細胞周期にある細胞の割合における有意差が観察され（図８２〜８７）、かつ、ＭＣＸ及びＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した細胞は、他の４つの処理状況と比べ、ＥｄＵの取り込みにおいて４０％近く低減したことが認められた（図８１）。ＥｄＵ取り込みにおけるこの低減は、ＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した試料からのＧ０／Ｇ１細胞の３８％増加、及びＭＣＸのみで処理した細胞についてはＧ０／Ｇ１細胞で５４％の増加に一致した。ＧＤＦ８、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ−３Ａ＋アクチビンＡ、又は未希釈培地で処理した細胞では、分化の開始から６時間後に、ＥｄＵ取り込みのこれらの変化及びＧ０／Ｇ１への増加した遷移は観察されなかった。むしろ、図８１及び８２に示すとおり、ＧＤＦ８、ＷＮＴ−３Ａ、ＷＮＴ−３Ａ＋アクチビンＡ、又は未希釈培地で処理された細胞は、分化の開始から６時間後に、ＥｄＵ取り込みでの細胞の割合における最小限の減少（平均、４８．１％、ＳＤ±１．２）と、Ｇ０／Ｇ１内の細胞数の平均１３％の減少と（標準偏差、±５％）を実証した。   Following this protocol, a significant difference in the proportion of cells in the cell cycle of the G0 / G1, S, or G2 / M stage was observed (FIGS. 82-87), and cells treated with MCX and MCX + GDF8 were A reduction of nearly 40% in EdU incorporation was observed compared to the four treatment situations (FIG. 81). This reduction in EdU incorporation was consistent with a 38% increase in G0 / G1 cells from samples treated with MCX + GDF8 and a 54% increase in G0 / G1 cells for cells treated with MCX alone. In cells treated with GDF8, WNT3A, WNT-3A + activin A, or undiluted medium, these changes in EdU uptake and an increased transition to G0 / G1 were not observed 6 hours after the start of differentiation. Rather, as shown in FIGS. 81 and 82, cells treated with GDF8, WNT-3A, WNT-3A + activin A, or undiluted medium are minimal in the percentage of cells with EdU incorporation 6 hours after the start of differentiation. Limited reduction (mean, 48.1%, SD ± 1.2) and mean 13% reduction in the number of cells in G0 / G1 (standard deviation, ± 5%) were demonstrated.

ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した細胞のＧ０／Ｇ１値間の範囲には、他の処理条件に比べ、プロセスの後半に類似の差異が観察された。時間０から３０時間後に、ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した細胞は、ＷＮＴ−３Ａ＋アクチビンＡ、ＧＤＦ８、ＷＮＴ−３Ａ、又は未希釈培地で処理した細胞と比べ、Ｇ０／Ｇ１内に４３〜４５％少ない細胞を有した。Ｇ０／Ｇ１細胞の割合間のこのギャップは、分化の開始から４８時間後も維持されており、ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理された細胞の７１．９〜７５．５％がＧ０／Ｇ１の細胞周期にある一方、ＧＤＦ８で処理した細胞の４８．５％、ＷＮＴ３Ａで処理した細胞の５５．８％、ＷＮＴ−３Ａ＋アクチビンＡで処理した細胞の５７．７％、又は未希釈培地で処理した細胞の４９％がＧ０／Ｇ１内にあった。ＥＤＵ取り込み及びＧ０／Ｇ１プロファイルで観察された差異に加え、ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した細胞は、ＷＮＴ３Ａ＋アクチビン、ＧＤＦ８、ＷＮＴ−３Ａ、又は未希釈培地で処理した細胞と比べ、時間０から３０及び４８時間後にはＳ期の細胞周期にある細胞が１５〜３３％多かった。   Similar differences were observed in the latter half of the process in the range between G0 / G1 values of cells treated with MCX or MCX + GDF8 compared to other treatment conditions. After 0 to 30 hours, cells treated with MCX or MCX + GDF8 are 43-45% fewer cells in G0 / G1 than cells treated with WNT-3A + Activin A, GDF8, WNT-3A, or undiluted medium Had. This gap between the ratios of G0 / G1 cells is maintained 48 hours after the onset of differentiation, with 71.9-75.5% of cells treated with MCX or MCX + GDF8 entering the cell cycle of G0 / G1. On the other hand, 48.5% of cells treated with GDF8, 55.8% of cells treated with WNT3A, 57.7% of cells treated with WNT-3A + activin A, or 49 of cells treated with undiluted medium. % Was in G0 / G1. In addition to the differences observed in EDU uptake and G0 / G1 profiles, cells treated with MCX or MCX + GDF8 are time 0 to 30 and 48 compared to cells treated with WNT3A + Activin, GDF8, WNT-3A, or undiluted media. After time, there were 15 to 33% more cells in the S-phase cell cycle.

胚体内胚葉形成の終了時の遺伝子発現によって測定されたとおり、データ（図５７〜８０及び８８ａ〜ｆに示す、ＣＤ９９、ＣＤ９、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＸ２、ＣＥＲ１、ＣＸＣＲ４、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＫＩＴ、ＭＩＸＬ１、ＭＮＸ１、ＮＡＮＯＧ、ＯＴＸ２、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、及びＴの遺伝子発現）は、懸濁培養下で、第１日目のＴＧＦ−βファミリーメンバー、ＧＤＦ８を含む又は含まないＭＣＸの添加が、１日目に２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで細胞が処理されるときに得られるものに相当する胚体内胚葉を生成したことを示した。ただし、胚体内胚葉の形成のプロセスを通して観察された細胞周期における差異と一貫して、遺伝子発現における中間差異が見られた。ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理された試料では、遺伝子Ｔ（短尾奇形）、ＧＡＴＡ４、及びＣＤＸ２は、分化の最初の２４時間内に、ＷＮＴ−３Ａ＋アクチビンＡ又はその他の３つのテスト条件で処理された細胞よりも、実質的に高いレベルで誘導された。逆に、多能性の遺伝子（ＮＡＮＯＧ及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４）の発現は、最初の細胞多能性、又はテストされたその他の４つの条件と比べて、ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した試料内で、２４時間までに劇的に減少した（図８８ｅ）。ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８試料における、ＦＧＦ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７などの遺伝子の発現誘導の大きさは、分化の開始から２４時間後にテストされた他の４つの条件と比べてはるかに小さかったが、４８時間までには、全ての試料がＦＧＦ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７を相当するレベルで発現した。（図８８ｃ及びｅ）。   As measured by gene expression at the end of definitive endoderm formation, data (CD99, CD9, CDH1, CDH2, CDX2, CER1, CXCR4, FGF17, FGF4, FOXA2, GATA4, as shown in FIGS. 57-80 and 88a-f. , GATA6, GSC, KIT, MIXL1, MNX1, NANOG, OTX2, POU5F1, SOX17, SOX7, and T gene expression) in suspension culture contains the TGF-β family member, GDF8, on day 1 or It was shown that the addition of no MCX produced definitive endoderm corresponding to that obtained when cells were treated with 20 ng / mL WNT-3A + 100 ng / mL activin A on day 1. However, intermediate differences in gene expression were seen, consistent with differences in cell cycle observed throughout the definitive endoderm formation process. In samples treated with MCX or MCX + GDF8, genes T (short tail malformation), GATA4, and CDX2 were treated with WNT-3A + Activin A or three other test conditions within the first 24 hours of differentiation. Than at a substantially higher level. Conversely, the expression of pluripotent genes (NANOG and POU5F1 / OCT4) is 24% in samples treated with MCX or MCX + GDF8 compared to the initial cellular pluripotency, or the other four conditions tested. It decreased dramatically by time (Figure 88e). The magnitude of expression induction of genes such as FGF4, FOXA2, and SOX17 in MCX or MCX + GDF8 samples was much smaller compared to the other four conditions tested 24 hours after the start of differentiation, but up to 48 hours All samples expressed FGF4, FOXA2, and SOX17 at corresponding levels. (FIGS. 88c and e).

（実施例１６）
測定可能な懸濁分化プロセスを使用した外胚葉及び中胚葉性組織の生成
この実施例は、外胚葉又は中胚葉性組織の生成を目的とした、測定可能な製造プロセスを得るために、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の増殖及び分化の両方を行えるプロセスを実証する。 (Example 16)
Production of ectoderm and mesoderm tissue using a measurable suspension differentiation process This example is a multipotent to obtain a measurable manufacturing process aimed at producing ectoderm or mesoderm tissue. Demonstrate a process capable of both proliferation and differentiation of sex stem cells (PSC).

２つの細胞株、すなわち、Ｈ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞株のサブクローン、ＷＢ０１０６と、臍帯組織細胞（ＵＴＣ）から生成された、誘導型多能性幹細胞株（ｉＰＳＣ）は、これらの研究用の種材料を提供するために懸濁増殖された。前の実施例に記載したとおり、懸濁増殖した細胞を、自動凍結保存装置内にて高密度で冷凍してから、解凍して、閉鎖された３リットルのガラスバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ，Ｊｕｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又は使い捨て可能な３リットルの１回使用バイオリアクター（Ｍｏｂｉｕｓ（登録商標）、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に、最終細胞濃度０．２２５×１０6個の細胞／ｍＬで接種した。撹拌槽バイオリアクターに接種した細胞は、連続的に撹拌されるタンクで細胞集団を形成し、合計３日間リアクター内の多能性培地（Ｅ８（商標）、０．５％のＢＳＡを添加）に維持された。接種から７２時間後に、中胚葉／心組織（１）又は外胚葉／神経組織（２）を形成するため、それぞれの分化培地内で、細胞集団をプラスチックの使い捨て三角フラスコ（ＰＥＴＧ １２５ｍＬフラスコ，カタログ番号４１１２，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ）へ移植することにより、多能性細胞分化を開始した。 Two cell lines, an inducible pluripotent stem cell line (iPSC), generated from a subclone of the H1 (WA01) hES cell line, WB0106, and umbilical cord tissue cells (UTC) are the species for these studies. Suspended to provide material. As described in the previous examples, cells grown in suspension were frozen at high density in an automated cryopreservation apparatus and then thawed to a closed 3 liter glass bioreactor (DASGIP, Julich, Germany). ) Or a disposable 3 liter single use bioreactor (Mobius®, EMD Millipore Corporation, Billerica, Mass.) At a final cell concentration of 0.225 × 10 6 cells / mL. Cells inoculated into the stirred tank bioreactor form a cell population in a continuously stirred tank and added to the pluripotent medium (E8 ™, 0.5% BSA added) in the reactor for a total of 3 days. Maintained. 72 hours after inoculation, in order to form mesoderm / heart tissue (1) or ectoderm / nerve tissue (2), the cell population was placed in a plastic disposable Erlenmeyer flask (PET 125 mL flask, catalog number) in the respective differentiation medium. 4112, Thermo Scientific Rochester NY), pluripotent cell differentiation was initiated.

ステージ式分化プロセスを開始した後、細胞は、振とう器プラットフォーム（ＭＡＸＱ ４１６ｈｐ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ）上の加湿、５％のＣＯ2インキュベーター内に、１００ｒｐｍで１０日間維持した。分化の開始から１日後、３日後、５日後、及び７日後に、フラスコ内の培地を、表１９に記載したとおりに作製した新鮮な培地に交換した。参照用に分化の開始前、次いで分化の開始から３、５、７、及び１０日後に、ｑＲＴ−ＰＣＲ試料を採取した。 After initiating the staged differentiation process, the cells were maintained at 100 rpm for 10 days in a humidified, 5% CO 2 incubator on a shaker platform (MAXQ 416hp, Thermo Scientific, Rochester NY). One day, three days, five days, and seven days after the start of differentiation, the medium in the flask was replaced with a fresh medium prepared as described in Table 19. For reference, qRT-PCR samples were taken before the start of differentiation and then 3, 5, 7, and 10 days after the start of differentiation.

ｍＲＮＡ発現パターンにおける外胚葉又は中胚葉に特異的な変化が、ｑＲＴ−ＰＣＲによって検出されるかどうかを決定するため、３つのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ（Ｌｉｆｅ（商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）指定の多能性、胚体内胚葉（ＤＥ）及びステージ６（Ｓ６）を使用し、発現を標準化するため、適切な未分化の多能性幹細胞試料を対照として結果を比較した。   Three Applied Biosystems Low Density Array (Life ™, Carlsbad, Calif.) designated multiple to determine whether ectodermal or mesoderm specific changes in mRNA expression patterns are detected by qRT-PCR To standardize expression using potency, definitive endoderm (DE) and stage 6 (S6), the results were compared using appropriate undifferentiated pluripotent stem cell samples as controls.

これらのアレイを使用して、外胚葉（図８９）又は中胚葉（図９０）の分化培地で培養した、多能性細胞の遺伝子発現パターンを決定した。それぞれの条件において振とうフラスコ内で分化された細胞は、多能性アレイで測定されたとおり、３日目〜１０日目の延長培養にわたり、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４、ＴＤＧＦ１、及びＺＦＰ４２のような多能性の遺伝子に関する、減少した多能性遺伝子発現を実証した。外胚葉又は中胚葉に分化したｈＥＳ又はｉＰＳ細胞からの試料では、ＣＸＣＲ４の発現が増加した。これらの結果は、分化に特徴的な遺伝子の高い発現を示す、ｑＲＴ−ＰＣＲデータと相関した。外胚葉分化培地で処理された細胞は、分化の開始から３〜１０日後に、ｑＲＴ−ＰＣＲによる、増加したレベルのＡＲＸ、ＮＥＵＲＯＤ、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ６（＞１００倍）、及びＺＩＣ１（＞１０００倍）を発現した（図９１）。これらのデータはＦＡＣＳアレイによって確認され、このＦＡＣＳアレイは、外胚葉運命への分化の開始から３日後に、ｉＰＳＣ及びｈＥＳ細胞の両方が、ＳＯＸ２（多能性及び神経幹細胞の両方に必要な遺伝子）の高い発現を維持したが、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４（多能性に必要な遺伝子）の発現を失い、ＰＡＸ６発現（神経及び内分泌分化の遺伝子）を増したことを示した（図９２）。   These arrays were used to determine gene expression patterns of pluripotent cells cultured in ectoderm (FIG. 89) or mesoderm (FIG. 90) differentiation medium. Cells differentiated in shake flasks in each condition, such as NANOG, POU5F1 / OCT4, TDGF1, and ZFP42, over extended cultures from day 3 to day 10, as measured by pluripotency arrays Reduced pluripotency gene expression for pluripotency genes was demonstrated. Expression of CXCR4 was increased in samples from hES or iPS cells differentiated into ectoderm or mesoderm. These results correlated with qRT-PCR data showing high expression of genes characteristic of differentiation. Cells treated with ectoderm differentiation medium were found to have increased levels of ARX, NEUROD, NKX6.1, PAX6 (> 100 fold), and ZIC1 (> 1000) by qRT-PCR 3-10 days after the start of differentiation. Times) was expressed (FIG. 91). These data are confirmed by the FACS array, which shows that after 3 days from the start of differentiation to ectoderm fate, both iPSCs and hES cells are genes that are required for both SOX2 (both pluripotent and neural stem cells). The expression of POU5F1 / OCT4 (gene required for pluripotency) was lost and PAX6 expression (genes of neural and endocrine differentiation) was increased (FIG. 92).

中胚葉分化培地で処理した細胞における分化の類似の運動もまた、観察された。多能性遺伝子発現は、１０日間の分化にわたって下降したが（図９０）、３日目には早期の一過性中内胚葉運命（ＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＣＫＩＴ、及びＶＷＦ）に特徴的な遺伝子の早期の誘導が観察され、１０日目には、これらの遺伝子発現レベルが基準値近くまで低下した（図９３）。また、分化の開始から３、５、７、及び１０日後の特徴的な中胚葉遺伝子の発現が、早期かつ増加する遺伝子発現を示したことも観察された（図９３のＣＤＨ２、ＣＤＸ２、ＧＡＴＡ６、ＨＮＦ４α、ＭＮＸ１、ＰＲＤＭ１、及びＳＯＸ１７）。ｉＰＳ及びｈＥＳ細胞試料の両方で、遺伝子誘導の同一パターンが観察され、分化プロセスが指向されたものであり、事実上自然発生ではないことを示した。   Similar movements of differentiation in cells treated with mesoderm differentiation medium were also observed. Pluripotent gene expression declined over 10 days of differentiation (FIG. 90), but on day 3 the genes characteristic of early transient mesendoderm fate (CER1, EOMES, CKIT, and VWF) Early induction was observed, and on day 10 these gene expression levels decreased to near baseline values (FIG. 93). It was also observed that characteristic mesoderm gene expression at 3, 5, 7 and 10 days after the start of differentiation showed early and increasing gene expression (CDH2, CDX2, GATA6, FIG. 93). HNF4α, MNX1, PRDM1, and SOX17). In both iPS and hES cell samples, the same pattern of gene induction was observed, indicating that the differentiation process was directed and not practically spontaneous.

ｑＲＴ−ＰＣＲによって観察された遺伝子発現のこれらの変化は、位相差顕微鏡によって観察され、かつ集団の凍結切片によって免疫染色された結果と相関した。中胚葉の分化懸濁培養下で１０日目までに、１０個の集団の中の約１つが自発的に「拍動」を開始し、細胞が心筋組織に分化されたことを示唆した（図９４、左パネル、１０日目、白い棒線）。いくつかの集団の染色した断片は、筋形成を示す、線状の末端から末端のβチューブリン染色パターンを示した（図９４、右パネル）。   These changes in gene expression observed by qRT-PCR correlated with the results observed by phase contrast microscopy and immunostained by frozen sections of the population. By day 10, under differentiation suspension culture of mesoderm, about 1 out of 10 populations spontaneously began to “beat”, suggesting that the cells were differentiated into myocardial tissue (Fig. 94, left panel, 10th day, white bar). Stained fragments of several populations showed a linear end-to-end β-tubulin staining pattern indicating myogenesis (Figure 94, right panel).

外胚葉運命に分化した集団については、中胚葉に分化した集団と比べたときに（図９４）、著しく異なる形態パターンが観察された（図９５、左パネル）。外胚葉分化の間、集団は、中胚葉運命に分化した細胞よりも大きく、かつ濃密であり、外胚葉分化した細胞はより少ない合計βチューブリンを発現した。βチューブリンを発現した細胞は、神経細胞に特徴的な、より樹状突起パターンの染色（図９５、右パネル、白矢印）を示した。   For the population differentiated to ectoderm fate, a markedly different morphological pattern was observed when compared to the population differentiated to mesoderm (FIG. 94) (FIG. 95, left panel). During ectoderm differentiation, the population was larger and denser than cells differentiated to mesoderm fate, and ectoderm differentiated cells expressed less total β-tubulin. Cells expressing β-tubulin showed more dendritic pattern staining (FIG. 95, right panel, white arrow) characteristic of neurons.

これらの結果は、ｑＲＴ−ＰＣＲ及びＦＡＣＳデータとの組み合わせにおいて、懸濁状態で積み重なって増殖した細胞は、指向された再現可能な様式で、懸濁培養下で中胚葉又は外胚葉運命に分化し得ることを示す。   These results show that, in combination with qRT-PCR and FACS data, cells stacked and grown in suspension differentiate into mesoderm or ectoderm fate in suspension culture in a directed and reproducible manner. Show you get.

Figure 2017500013
Figure 2017500013

Figure 2017500013
Figure 2017500013

以上、本発明を、様々な特定の材料、手順及び実施例を参照しながら本明細書に説明及び例示したが、本発明は、その目的のために選択された特定の材料及び手順の組み合わせに限定されない点は理解されるであろう。当業者には認識されるように、このような細部には多くの変更を行い得ることが示唆される。本明細書及び実施例はあくまで例示的なものとしてみなされるべきものであり、発明の真の範囲及び趣旨は以下の「特許請求の範囲」によって示されるものである。本出願において引用される参照文献、特許及び特許出願は、いずれもそれらの全容を参照により本明細書に援用するものとする。   Although the present invention has been described and illustrated herein with reference to various specific materials, procedures and examples, the present invention is not limited to specific material and procedure combinations selected for that purpose. It will be understood that this is not a limitation. As will be appreciated by those skilled in the art, it is suggested that many changes can be made to such details. The specification and examples are to be regarded as illustrative only, with the true scope and spirit of the invention being indicated by the following claims. All references, patents and patent applications cited in this application are hereby incorporated by reference in their entirety.

Claims (21)

動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞を増殖させ、分化させる方法であって、多能性細胞を平面接着培養下で凝集細胞集団に培養することと、動的撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞集団を分化させることと、を含み、前記分化の工程がＣｙｐ２６阻害剤の使用を含む、方法。   A method of growing and differentiating pluripotent cells in a suspension culture system that is dynamically agitated, wherein the pluripotent cells are cultured in an aggregated cell population under flat adhesion culture, and are dynamically agitated. Differentiating a pluripotent cell population in a suspension culture, wherein the step of differentiation comprises the use of a Cyp26 inhibitor. 前記方法が、Ｇ０／Ｇ１期の細胞周期にある細胞の割合を増加させる、請求項１に記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the method increases the proportion of cells in the G0 / G1 phase cell cycle. 前記培養することが、約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む環境を含む、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, wherein the culturing comprises an environment comprising about 0.1% to about 2% bovine serum albumin. 前記環境が、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を更に含む、請求項３に記載の方法。   4. The method of claim 3, wherein the environment further comprises a Rho kinase inhibitor. 前記多能性細胞が接着性である、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, wherein the pluripotent cell is adherent. Ｇ０／Ｇ１期の細胞周期にある細胞の割合を増加させる方法であって、約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む環境内の平面接着培養下で、多能性細胞を凝集細胞集団に増殖させることと、前記平面接着培養から動的懸濁液へ多能性幹細胞の前記集団を移植することと、小分子及び任意追加的にＴＧＦβファミリーメンバーを添加した培地において、前記動的懸濁液内で前記細胞を培養することと、を含む、方法。   A method for increasing the proportion of cells in the cell cycle of G0 / G1 phase, aggregating pluripotent cells in a flat adhesion culture in an environment containing about 0.1% to about 2% bovine serum albumin In a medium supplemented with a small molecule and optionally a TGFβ family member, growing into a cell population, transplanting the population of pluripotent stem cells from the planar adhesion culture to a dynamic suspension. Culturing said cells in a typical suspension. 前記小分子がＭＣＸであり、前記ＴＧＦβファミリーメンバーがＧＤＦ−８である、請求項６に記載の方法。   7. The method of claim 6, wherein the small molecule is MCX and the TGFβ family member is GDF-8. 前記増殖させることが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む環境を含む、請求項６に記載の方法。   7. The method of claim 6, wherein the growing comprises an environment comprising a Rho kinase inhibitor. 多能性細胞を胚体内胚葉へ分化させる方法であって、約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む環境内の平面接着培養下で、多能性を凝集細胞集団に増殖させることと、前記平面接着培養から動的懸濁液へ多能性幹細胞の前記集団を移植することと、ＭＣＸ及びＧＤＦ８又はＷＮＴ３Ａ及びアクチビンＡを添加した培地において、前記動的懸濁液内で前記細胞を培養することと、を含む、方法。   A method of differentiating pluripotent cells into definitive endoderm, wherein the pluripotency is propagated to an aggregated cell population in a planar adherent culture in an environment containing about 0.1% to about 2% bovine serum albumin And transplanting the population of pluripotent stem cells from the planar adhesion culture to a dynamic suspension, and in a medium supplemented with MCX and GDF8 or WNT3A and activin A in the dynamic suspension Culturing the cells. 前記増殖させることが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む環境を含む、請求項９に記載の方法。   The method of claim 9, wherein the growing comprises an environment comprising a Rho kinase inhibitor. 動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性幹細胞を増殖させ、分化させる方法であって、多能性幹を平面接着培養下で凝集細胞集団に増殖させることと、前記平面接着培養から動的懸濁液へ多能性幹細胞の前記集団を移植することと、動的撹拌される懸濁培養系内で前記多能性細胞集団を分化させることと、を含み、前記細胞を、約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む環境内で凝集細胞集団に増殖させる、方法。   A method of proliferating and differentiating pluripotent stem cells in a suspension culture system that is dynamically stirred, wherein the pluripotent stem is grown into an aggregated cell population under flat adhesion culture, and the flat adhesion culture Transplanting the population of pluripotent stem cells into a dynamic suspension from the cell, and differentiating the population of pluripotent cells in a dynamically stirred suspension culture system, the cells comprising: Growing the aggregated cell population in an environment comprising about 0.1% to about 2% bovine serum albumin. 前記多能性細胞集団が、膵臓前駆細胞集団、神経前駆細胞集団、又は、心筋前駆細胞集団を生成するために分化される、請求項１１に記載の方法。   12. The method of claim 11, wherein the pluripotent cell population is differentiated to produce a pancreatic progenitor cell population, a neural progenitor cell population, or a myocardial progenitor cell population. 前記多能性幹細胞が、誘導型多能性幹細胞、ヒト臍帯組織由来細胞、単為生殖生物、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）、及び羊水由来細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。   12. The pluripotent stem cell is selected from the group consisting of induced pluripotent stem cells, human umbilical cord tissue-derived cells, parthenogenetic organisms, human embryonic stem cells (hES), and amniotic fluid-derived cells. the method of. 請求項１１に記載の方法によって産生される、分化した膵臓前駆細胞の前記集団を含む、移植可能幹細胞由来の細胞産物。   12. A cell product derived from transplantable stem cells comprising the population of differentiated pancreatic progenitor cells produced by the method of claim 11. 動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞を増殖させ、分化させる方法であって、
ａ．約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む環境内の平面接着培養下で、前記多能性細胞を凝集細胞集団に増殖させることと、
ｂ．酵素又はキレート剤を使用して、前記平面接着培養から動的懸濁培養へ多能性細胞の前記集団を移植することと、
ｃ．動的に撹拌される懸濁培養系内で前記細胞集団を維持することと、
ｄ．膵臓前駆細胞集団、神経前駆細胞集団、又は心筋前駆細胞集団を生成するために、動的撹拌される懸濁培養系内で前記多能性細胞集団を分化させることと、を含み、
前記分化環境が、ほぼ低酸素から周囲の約３０％の範囲の酸素、０．１％〜約２％の範囲の脂質、又はそれらの組み合わせを含む、方法。 A method of growing and differentiating pluripotent cells in a dynamically stirred suspension culture system,
a. Growing the pluripotent cells into an aggregated cell population under planar adhesion culture in an environment comprising about 0.1% to about 2% bovine serum albumin;
b. Transplanting the population of pluripotent cells from the planar adhesion culture to a dynamic suspension culture using an enzyme or a chelating agent;
c. Maintaining the cell population in a dynamically agitated suspension culture system;
d. Differentiating said pluripotent cell population in a dynamically agitated suspension culture system to generate a pancreatic progenitor cell population, a neural progenitor cell population, or a myocardial progenitor cell population,
The method wherein the differentiation environment comprises approximately hypoxic to ambient about 30% oxygen, 0.1% to about 2% lipid, or combinations thereof. 前記幹細胞集団が、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１を発現し、ＣＸＣＲ４の発現を欠く、請求項１５に記載の方法。   16. The method of claim 15, wherein the stem cell population expresses CD9, SSEA4, TRA-1-60, and TRA-1-81 and lacks CXCR4 expression. 増殖させるための前記環境がＲｈｏキナーゼ阻害剤を更に含む、請求項１５に記載の方法。   16. The method of claim 15, wherein the environment for growing further comprises a Rho kinase inhibitor. 前記分化環境が、約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む、請求項１５に記載の方法。   16. The method of claim 15, wherein the differentiation environment comprises about 0.1% to about 2% bovine serum albumin. 前記多能性細胞が、誘導型多能性幹細胞、ヒト臍帯組織由来細胞、単為生殖生物、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）、及び羊水由来細胞からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。   16. The pluripotent cell is selected from the group consisting of inducible pluripotent stem cells, human umbilical cord tissue-derived cells, parthenogenetic organisms, human embryonic stem cells (hES), and amniotic fluid-derived cells. the method of. 前記方法が、β細胞転写因子を発現する膵臓前駆細胞を生成する、請求項１５に記載の方法。   16. The method of claim 15, wherein the method produces pancreatic progenitor cells that express a beta cell transcription factor. 前記転写因子がＰＤＸ１及び／又はＮＫＸ６．１である、請求項１５に記載の方法。   The method according to claim 15, wherein the transcription factor is PDX1 and / or NKX6.1.
JP2016527450A 2013-11-01 2014-06-17 Suspension and population of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cells Pending JP2017500013A (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361962158P 2013-11-01 2013-11-01
US61/962,158 2013-11-01
US13/998,974 2013-12-30
US13/998,974 US10377989B2 (en) 2012-12-31 2013-12-30 Methods for suspension cultures of human pluripotent stem cells
PCT/US2014/042796 WO2015065537A1 (en) 2013-11-01 2014-06-17 Suspension and clustering of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2017500013A true JP2017500013A (en) 2017-01-05
JP2017500013A5 JP2017500013A5 (en) 2018-03-29

Family

ID=53004904

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016527338A Pending JP2016534731A (en) 2013-11-01 2014-05-21 Suspension and population of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cells
JP2016527450A Pending JP2017500013A (en) 2013-11-01 2014-06-17 Suspension and population of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cells

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016527338A Pending JP2016534731A (en) 2013-11-01 2014-05-21 Suspension and population of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cells

Country Status (12)

Country Link
EP (2) EP3063268A4 (en)
JP (2) JP2016534731A (en)
KR (4) KR20180128529A (en)
CN (2) CN105793413A (en)
AU (4) AU2014342995C1 (en)
BR (1) BR112016009393A8 (en)
CA (2) CA2928639A1 (en)
MX (2) MX2016005657A (en)
PH (2) PH12016500783A1 (en)
RU (2) RU2689710C2 (en)
SG (2) SG11201603045VA (en)
WO (2) WO2015065524A2 (en)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105793413A (en) * 2013-11-01 2016-07-20 詹森生物科技公司 Suspension and clustering of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cells
KR20190029587A (en) * 2016-06-23 2019-03-20 티톤 바이오테크, 인크. Cells expressing the parathyroid hormone 1 receptor and uses thereof
WO2018090084A1 (en) * 2016-11-16 2018-05-24 Cynata Therapeutics Limited Pluripotent stem cell assay
US10391156B2 (en) 2017-07-12 2019-08-27 Viacyte, Inc. University donor cells and related methods
EP3654996A4 (en) * 2017-07-21 2021-03-24 Semma Therapeutics, Inc. Re-aggregation of stem cell-derived pancreatic beta cells
JP7000896B2 (en) * 2017-08-23 2022-01-19 王子ホールディングス株式会社 Cell sheet forming member, method for manufacturing cell sheet forming member, and method for manufacturing cell sheet
EP3735457A4 (en) * 2018-01-05 2021-08-25 Platelet Biogenesis, Inc. Compositions and methods for producing megakaryocytes
SG11202006731VA (en) * 2018-01-18 2020-08-28 Agency Science Tech & Res Method for differentiation of human pluripotent stem cell lines in suspension culture
KR102115360B1 (en) * 2018-05-30 2020-05-26 주식회사 바이블리오테카 Adult stem cell culture fluid and a producing method thereof
US20200080107A1 (en) 2018-09-07 2020-03-12 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
US20220370184A1 (en) 2019-05-31 2022-11-24 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
CA3139585C (en) 2019-05-31 2024-01-23 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
US20220233299A1 (en) 2019-05-31 2022-07-28 W. L. Gore & Associates, Inc. Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances
WO2020243663A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
WO2021044379A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
US11116798B2 (en) 2019-09-05 2021-09-14 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
CN114729323B (en) * 2019-11-22 2024-09-17 诺和诺德股份有限公司 Rotationally aggregated neural microsphere and application thereof
JP2024503290A (en) 2020-12-31 2024-01-25 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト universal donor cells
US20240191185A1 (en) * 2021-03-25 2024-06-13 Kaneka Corporation Method for producing pluripotent stem cell population
CN116218766A (en) * 2023-04-21 2023-06-06 北京意胜生物科技有限公司 Method for preparing pancreatic precursor cells, culture medium and application of pancreatic precursor cells

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008015682A2 (en) * 2006-08-02 2008-02-07 Technion Research & Development Foundation Ltd. Methods of expanding embryonic stem cells in a suspension culture
US20100112691A1 (en) * 2008-11-04 2010-05-06 Chad Green Stem Cell Aggregate Suspension Compositions and Methods of Differentiation Thereof
JP2011514169A (en) * 2008-03-17 2011-05-06 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ Microcarrier for stem cell culture

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050044393A (en) * 2001-11-09 2005-05-12 아르테셀 사이언스, 인크. Endocrine pancreas differentiation of adipose tissue-derived stromal cells and uses thereof
JP5067949B2 (en) * 2006-11-09 2012-11-07 独立行政法人国立国際医療研究センター Method for culturing and subculture of primate embryonic stem cells and method for inducing differentiation thereof
WO2008148105A1 (en) * 2007-05-25 2008-12-04 Medistem Laboratories, Inc. Endometrial stem cells and methods of making and using same
EP2173862B1 (en) * 2007-07-01 2017-04-19 Lifescan, Inc. Single pluripotent stem cell culture
GB0800524D0 (en) * 2008-01-14 2008-02-20 Univ Brighton Cell culture system
MX2011000125A (en) * 2008-06-30 2011-02-25 Centocor Ortho Biotech Inc Differentiation of pluripotent stem cells.
US8895300B2 (en) * 2008-11-04 2014-11-25 Viacyte, Inc. Scalable primate pluripotent stem cell aggregate suspension culture and differentiation thereof
CA2770753C (en) * 2009-08-12 2019-01-15 Kyoto University Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural precursor cells
US8932857B2 (en) * 2010-06-15 2015-01-13 Kyoto University Method for selecting reduced differentiation resistance human induced pluripotent stem cells
US9085757B2 (en) * 2010-06-17 2015-07-21 Regents Of The University Of Minnesota Production of insulin producing cells
AU2011296382B2 (en) * 2010-08-31 2016-04-14 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
WO2012117333A1 (en) * 2011-02-28 2012-09-07 Stempeutics Research Malaysia Sdn Bhd Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof
US8951798B2 (en) * 2011-10-13 2015-02-10 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells
CN105143446B (en) * 2011-12-22 2020-11-03 詹森生物科技公司 Differentiation of human embryonic stem cells into single hormone insulin positive cells
US10519422B2 (en) * 2012-02-29 2019-12-31 Riken Method of producing human retinal pigment epithelial cells
EP2938722B1 (en) * 2012-12-31 2021-12-08 Janssen Biotech, Inc. Suspension and clustering of human pluripotent cells for differentiation into pancreatic endocrine cells
CN105793413A (en) * 2013-11-01 2016-07-20 詹森生物科技公司 Suspension and clustering of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cells

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008015682A2 (en) * 2006-08-02 2008-02-07 Technion Research & Development Foundation Ltd. Methods of expanding embryonic stem cells in a suspension culture
JP2011514169A (en) * 2008-03-17 2011-05-06 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ Microcarrier for stem cell culture
US20100112691A1 (en) * 2008-11-04 2010-05-06 Chad Green Stem Cell Aggregate Suspension Compositions and Methods of Differentiation Thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, 2004, VOL.86, P.493-502, JPN6018028514, ISSN: 0004176825 *
NATURE PROTOCOLS, 2012, 7(11):2029-2040, JPN6018015640, ISSN: 0004176824 *
STEM CELL RES., 2013, 11(3):1103-1116, JPN6018015639, ISSN: 0004176823 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2928639A1 (en) 2015-05-07
PH12016500782A1 (en) 2016-06-13
RU2016121409A3 (en) 2018-03-29
SG11201603047PA (en) 2016-05-30
KR20180130001A (en) 2018-12-05
PH12016500783A1 (en) 2016-06-13
CA2928741A1 (en) 2015-05-07
AU2014342995C1 (en) 2018-08-09
EP3063268A2 (en) 2016-09-07
RU2016121404A3 (en) 2018-03-29
KR20160079071A (en) 2016-07-05
WO2015065524A2 (en) 2015-05-07
KR20160079072A (en) 2016-07-05
AU2014342995B2 (en) 2018-04-26
AU2014343007A1 (en) 2016-05-05
WO2015065524A3 (en) 2015-08-13
KR20180128529A (en) 2018-12-03
MX2016005658A (en) 2017-01-05
CN105793413A (en) 2016-07-20
MX2016005657A (en) 2017-01-05
AU2014343007C1 (en) 2018-08-09
AU2014342995A1 (en) 2016-05-05
EP3063269A1 (en) 2016-09-07
JP2016534731A (en) 2016-11-10
SG11201603045VA (en) 2016-05-30
RU2016121404A (en) 2017-12-04
CN105683362A (en) 2016-06-15
AU2018208707A1 (en) 2018-08-16
AU2014343007B2 (en) 2018-04-26
EP3063269A4 (en) 2017-07-12
BR112016009393A8 (en) 2020-03-24
RU2689710C2 (en) 2019-05-29
WO2015065537A1 (en) 2015-05-07
EP3063268A4 (en) 2017-11-29
RU2016121409A (en) 2017-12-04
AU2018208717A1 (en) 2018-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6529440B2 (en) Suspension and clustering of human pluripotent cells for differentiation to pancreatic endocrine cells
JP2017500013A (en) Suspension and population of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cells
JP6800854B2 (en) Suspension culture of pluripotent stem cells
US10370644B2 (en) Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170619

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20170619

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180209

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20180424

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180508

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20180807

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20181009

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20181108

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190507

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20191224