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JP2016510319A - 多価結合タンパク質組成物 - Google Patents

多価結合タンパク質組成物 Download PDF

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Abstract

提供されるのは、１以上の所望の標的抗原に特異的に結合する多価の結合タンパク質である。本開示はまた、多価の結合タンパク質をコードする核酸、ベクター及び宿主細胞、多価の結合タンパク質の製造方法及び使用方法も提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０１２年１２月２８日に出願された米国仮特許出願番号６１／７４６，６２９、６１／７４６，６５９、６１／７４６，６６３、６１／７４６，６１７、６１／７４６，６１５及び６１／７４６，６１９、２０１３年１月２２に出願された米国仮特許出願６１／７５５，２８８、及び２０１３年３月１５に出願された米国仮特許出願６１／７８６，８２９の優先権を主張する。前述の出願それぞれの内容はその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
本開示は１以上の所望の標的抗原に特異的に結合する多価結合タンパク質を提供する。本開示はまた、多価結合タンパク質をコードする核酸、ベクター及び宿主細胞、多価結合タンパク質の製造方法及び使用方法も提供する。
多種多様な多重特異性抗体の構成が開発されている（Kriangkum, J., et al., Biomol Eng, 2001. 18(2): p. 31-40を参照）。中でも、直列単鎖Ｆｖ分子及び二重特異性抗体、及びそれらの種々の誘導体は組換え二重特異性の抗体を構築するのに最も広く使用される構成である。さらに最近、二重特異性抗体をＦｃに融合させて、四価の二重特異性抗体と呼ばれるさらにＩｇ様の分子を生成している（Lu, D., et al., J Biol Chem, 2004. 279(4): p. 2856-65を参照）。加えて、ＩｇＧの重鎖にて２つのＦａｂ反復を含み、４つの抗原分子に結合することが可能である多価抗体構築物が記載されている（WO 0177342A1, and Miller, K., et al., J Immunol, 2003. 170(9): p. 4854-61を参照）。
技量のある熟練者にとって利用可能な多数の多重特異性の抗体の構成にもかかわらず、改善された多重特異性の結合タンパク質の構成に対するニーズが当該技術に存在する。
国際公開２００１／０７７３４２号
Kriangkum, J., et al., Biomol Eng, 2001. 18(2): p. 31-40 Lu, D., et al., J Biol Chem, 2004. 279(4): p. 2856-65 Miller, K., et al., J Immunol, 2003. 170(9): p. 4854-61
本開示は２以上の抗原を同時に結合することが可能である新規の多価結合タンパク質を提供する。
従って、態様の１つでは、本開示は一般式ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｘ２−ＶＬ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＬ２を有する単鎖多価結合タンパク質を提供し、式中、ＶＨ１は第１の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ２は第２の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ２はリンカーであり、ＶＬ１は第１の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ２は第２の抗体軽鎖可変ドメインであり、ｎは０又は１であり、ＶＨ１とＶＬ１及びＶＨ２とＶＬ２はそれぞれ組合わされて２つの機能的な抗原結合部位を形成する。
別の態様では、本開示は一般式ＣＨ１−（Ｘ０）ｎ−ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｘ２−ＣＬ１−Ｘ４−ＶＬ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＬ２を有する単鎖多価結合タンパク質を提供し、式中、ＣＨ１は重鎖定常ドメインであり、Ｘ０は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ１は第１の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ２は第２の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ２はリンカーであり、ＣＬ１は軽鎖定常ドメインであり、Ｘ４は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ１は第１の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ２は第２の抗体軽鎖可変ドメインであり、ｎは０又は１であり、ＶＨ１とＶＬ１及びＶＨ２とＶＬ２はそれぞれ組合わされて２つの機能的な抗原結合部位を形成する。
別の態様では、本開示は一般式（ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｘ２−ＶＨ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＨ２を有する単鎖多価結合タンパク質を提供し、式中、ＶＬ１は第１の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ２は第２の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ２はリンカーであり、ＶＨ１は第１の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ２は第２の抗体重鎖可変ドメインであり、ｎは０又は１であり、ＶＨ１とＶＬ１及びＶＨ２とＶＬ２はそれぞれ組合わされて２つの機能的な抗原結合部位を形成する。
別の態様では、本開示は一般式ＣＬ１−（Ｘ０）ｎ−ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｘ２−ＣＨ１−Ｘ４−ＶＨ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＨ２を有する単鎖多価結合タンパク質を提供し、式中、ＣＨ１は重鎖定常ドメインであり、Ｘ０は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ１は第１の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ２は第２の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ２はリンカーであり、ＣＬ１は軽鎖定常ドメインであり、Ｘ４は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ１は第１の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ２は第２の抗体軽鎖可変ドメインであり、ｎは０又は１であり、ＶＨ１とＶＬ１及びＶＨ２とＶＬ２はそれぞれ組合わされて２つの機能的な抗原結合部位を形成する。
特定の実施形態では、前述の単鎖多価結合タンパク質は単鎖二重可変ドメイン免疫グロブリン分子（ｓｃＤＶＤ）である。
特定の実施形態では、前述の単鎖多価結合タンパク質は単鎖二重可変ドメインＦａｂ免疫グロブリン分子（ｓｃＤＶＤＦａｂ）である。特定の実施形態では、単鎖二重可変ドメインＦａｂ免疫グロブリン分子のＣＬ１ドメインはκ（ｈｃκｏｒ ｃκ）定常ドメインである。特定の実施形態では、単鎖二重可変ドメインＦａｂ免疫グロブリン分子のＣＬ１ドメインはλ（ｈｃλｏｒ ｃλ）定常ドメインである。
特定の実施形態では、Ｘ２は（Ｇ４Ｓ）ｎであり、ｎ＝１〜１０である。特定の実施形態では、Ｘ２は一般式Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄを有するアミノ酸配列を含み、式中、Ａ及びＣは柔軟性のアミノ酸リンカー領域であり、Ｃ及びＤは剛性のアミノ酸リンカー領域である。特定の実施形態では、Ｘ２は一般式Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄを有し、式中、ＡはＧＧＧＳＧＧＧであり；ＢはＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴ、ＴＰＡＰＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴ、ＴＰＡＰＬＰＡＰＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴ又はＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴであり；ＣはＧＧＳＧＧであり；且つＤはＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴ、ＴＰＬＰＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴ、ＴＰＬＰＡＰＬＰＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴ又はＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴである。特定の実施形態では、Ｘ２は図１４にて示されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、Ｘ１は図５にて示されるアミノ酸配列から選択される。特定の実施形態では、Ｘ３は図５にて示されるアミノ酸配列から選択される。
別の態様では、本開示は交差多価結合タンパク質を提供する。特定の実施形態では、本開示は第１と第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質を提供し、その際、前記第１のポリペプチド鎖はＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−（Ｘ２）ｎ−ＣＬ−（Ｘ３）ｎを含み、式中、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３はＸ６がＦｃ領域でなければＦｃ領域であり；前記第２のポリペプチド鎖はＶＨ２−（Ｘ４）ｎ−ＶＨ１−（Ｘ５）ｎ−ＣＨ−（Ｘ６）ｎを含み、式中、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６はＸ３がＦｃ領域でなければＦｃ領域であり、ｎは０又は１であり、ＶＬ１とＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成し、ＶＬ２とＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成する。
特定の実施形態では、本開示は第１と第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質を提供し、その際、前記第１のポリペプチド鎖はＶＨ２−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ１−（Ｘ２）ｎ−ＣＬ−（Ｘ３）ｎを含み、式中、ＶＨ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３はＸ６がＦｃ領域でなければＦｃ領域であり；前記第２のポリペプチド鎖はＶＬ１−（Ｘ４）ｎ−ＶＬ２−（Ｘ５）ｎ−ＣＨ−（Ｘ６）ｎを含み、式中、ＶＬ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６はＸ３がＦｃ領域でなければＦｃ領域であり、ｎは０又は１であり、ＶＬ１とＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成し、ＶＬ２とＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成する。
特定の実施形態では、本開示は第１と第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質を提供し、その際、前記第１のポリペプチド鎖はＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−（Ｘ２）ｎ−ＣＬ−（Ｘ３）ｎを含み、式中、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３はＸ６がＦｃ領域でなければＦｃ領域であり；前記第２のポリペプチド鎖はＶＬ２−（Ｘ４）ｎ−ＶＨ１−（Ｘ５）ｎ−ＣＨ−（Ｘ６）ｎを含み、式中、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６はＸ３がＦｃ領域でなければＦｃ領域であり、ｎは０又は１であり、ＶＬ１とＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成し、ＶＬ２とＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成する。
特定の実施形態では、本開示は第１と第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質を提供し、その際、前記第１のポリペプチド鎖はＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−（Ｘ２）ｎ−ＣＬ−（Ｘ３）ｎを含み、式中、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３はＸ６がＦｃ領域でなければＦｃ領域であり；前記第２のポリペプチド鎖はＶＨ２−（Ｘ４）ｎ−ＶＬ１−（Ｘ５）ｎ−ＣＨ−（Ｘ６）ｎを含み、式中、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６はＸ３がＦｃ領域でなければＦｃ領域であり、ｎは０又は１であり、ＶＬ１とＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成し、ＶＬ２とＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成する。
前述の交差多価結合タンパク質は以下の追加の特徴を有することができる。特定の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５は表８２にて示されるアミノ酸配列から独立して選択される。特定の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５は表８３にて示されるアミノ酸リンカー配列の組み合わせを含む。
特定の実施形態では、交差多価結合タンパク質は２本の第１のポリペプチド鎖と２本の第２のポリペプチド鎖を含み、ポリペプチド鎖のうち２本はＦｃ領域を含む。特定の実施形態では、ポリペプチド鎖の少なくとも１本が変異を含み、前記変異は可変ドメインに位置し、前記変異は特定の抗原と変異体の結合ドメインとの間の標的とされる結合を阻害する。特定の実施形態では、Ｆｃ領域を有する２本のポリペプチド鎖のＦｃ領域はそれぞれ変異を含み、２つのＦｃ領域における前記変異は２本のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を増進する。
別の態様では、本開示は一価の多価結合タンパク質を提供する。特定の実施形態では、本開示は４本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質を提供し、その際、前記４本のポリペプチド鎖のうち２本はＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤＨは重鎖可変ドメインであり、Ｘ１は、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、Ｃは重鎖定常ドメインであり、Ｘ２はＦｃ領域であり、ｎは０又は１であり；前記４本のポリペプチド鎖のうち２本はＶＤＬ−（Ｘ３）ｎ−Ｃ−（Ｘ４）ｎを含み、式中、ＶＤＬは軽鎖可変ドメインであり、Ｘ３は、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、Ｃは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ４はＦｃ領域を含まず、ｎは０又は１であり；前記４本のポリペプチド鎖の少なくとも１本が変異を含み、前記変異は可変ドメインに位置し、前記変異は特定の抗原と変異体の結合ドメインとの間の標的とされる結合を阻害する。特定の実施形態では、式ＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｃ−（Ｘ２）ｎを有する２本のポリペプチド鎖のＦｃ領域はそれぞれ変異を含み、２つのＦｃ領域における前記変異は２本のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を増進する。
特定の実施形態では、本開示は４本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質を提供し、その際、前記４本のポリペプチド鎖のうち２本はＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域であり、ｎは０又は１であり；前記４本のポリペプチド鎖のうち２本はＶＤＬ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＤＬ２−Ｃ−（Ｘ４）ｎを含み、式中、ＶＤＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ３は、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ４はＦｃ領域を含まず、ｎは０又は１であり；前記４本のポリペプチド鎖の少なくとも１本が変異を含み、前記変異は第１の可変ドメイン又は第２の可変ドメインに位置し、前記変異は特定の抗原と変異体の結合ドメインとの間の標的とされる結合を阻害する。
特定の実施形態では、変異は第１の重鎖可変ドメイン又は第２の重鎖可変ドメインに位置する。特定の実施形態では、変異は第１の軽鎖可変ドメイン又は第２の軽鎖可変ドメインに位置する。
特定の実施形態では、前記４本のポリペプチド鎖の少なくとも１本は２つの変異を含み、一方の変異は第１の可変ドメインに位置し、他方の変異は第２の可変ドメインに位置し、その際、２つの変異は２つの変異体結合ドメインとそのそれぞれの特定の抗原との間での標的とされる結合を阻害する。
特定の実施形態では、式ＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを有する２本のポリペプチド鎖のＦｃ領域はそれぞれ変異を含み、その際、２つのＦｃ領域における前記変異は２本のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を増進する。
特定の実施形態では、本開示は第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質を提供し、前記第１のポリペプチド鎖はＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−（Ｘ３）ｍ−Ｙ１を含み、式中、ＶＤＨは重鎖可変ドメインであり、Ｘ１はＸ１が、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ２はＣＨ１であり、Ｘ３はリンカーであり、Ｙ１はＣＨ２−ＣＨ３又はＣＨ３又はＣＨ３の一部であり、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、前記第２のポリペプチド鎖はＶＤＬ−（Ｘ４）ｎ−Ｘ５−（Ｘ６）ｍ−Ｙ２を含み、式中、ＶＤＬは軽鎖可変ドメインであり、Ｘ４はＸ４が、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ５はＣＬ１であり、Ｘ６はリンカーであり、Ｙ２はＣＨ２−ＣＨ３又はＣＨ３又はＣＨ３の一部であり、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ変異を含み、Ｙ１及びＹ２における変異はＹ１とＹ２との相互作用を増進する。
特定の実施形態では、本開示は第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質を提供し、前記第１のポリペプチド鎖はＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｘ２−（Ｘ３）ｍ−Ｙ１を含み、式中、ＶＤＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、Ｘ１はＸ１が、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、ＶＤＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、Ｘ２はＣＨ１であり、Ｘ３はリンカーであり、Ｙ１はＣＨ２−ＣＨ３又はＣＨ３又はＣＨ３の一部であり、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、前記第２のポリペプチド鎖はＶＤＬ１−（Ｘ４）ｎ−ＶＤＬ２−Ｘ５−（Ｘ６）ｍ−Ｙ２を含み、式中、ＶＤＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、Ｘ４はＸ４が、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、ＶＤＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｘ５はＣＬ１であり、Ｘ６はリンカーであり、Ｙ２はＣＨ２−ＣＨ３又はＣＨ３又はＣＨ３の一部であり、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ変異を含み、Ｙ１及びＹ２における変異はＹ１とＹ２との相互作用を増進する。
別の態様では、本開示は第１、第２、第３及び第４のポリペプチド鎖を含む多価の多価結合タンパク質を提供し、前記第１のポリペプチド鎖はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−ＣＨ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域であり；前記第２のポリペプチド鎖はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−ＣＬ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域を含まず；前記第３のポリペプチド鎖はＶＤ３−（Ｘ３）ｎ−ＶＤ４−ＣＬ−（Ｘ４）ｎを含み、式中、ＶＤ３は第３の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ４は第４の重鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ４はＦｃ領域であり；前記第４のポリペプチド鎖はＶＤ３−（Ｘ３）ｎ−ＶＤ４−ＣＨ−（Ｘ４）ｎを含み、式中、ＶＤ３は第３の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ４は第４の軽鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ４はＦｃ領域を含まず；ｎは０又は１であり、第１と第２のポリペプチド鎖におけるＶＤ１ドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成し、第１と第２のポリペプチド鎖におけるＶＤ２ドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成し、第３と第４のポリペプチド鎖におけるＶＤ３ドメインは抗原Ｃに対する機能的な結合部位を１つ形成し、第３と第４のポリペプチド鎖におけるＶＤ４ドメインは抗原Ｄに対する機能的な結合部位を１つ形成する。
特定の実施形態では、第１と第３のポリペプチド鎖におけるＦｃ領域はそれぞれ変異を含み、２つのＦｃ領域における前記変異は第１と第３のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を増進する。
別の態様では、本開示は本明細書で開示される結合タンパク質と薬学上許容可能なキャリア又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、抗原活性が有害である障害を治療する方法を提供し、該方法はそれを必要とする対象に有効量の本明細書で開示される結合タンパク質を投与することを含む。
別の態様では、本開示は本明細書で開示される結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
別の態様では、本開示は本明細書で開示される結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
別の態様では、本開示は本明細書で開示される結合タンパク質を発現する宿主細胞を提供する。
別の態様では、本開示は、結合タンパク質が発現されるような条件下にて本明細書で開示される宿主細胞を培養することを含む、結合タンパク質を作製する方法を提供する。
例となる多価結合タンパク質の構成及び細胞で表示する方法を示す図である。 酵母細胞表面を用いて多価結合タンパク質を選択する例となる方法の模式図である。抗原結合、結合タンパク質を発現する酵母細胞は２回のＭＡＣＳ（磁気活性化細胞仕分け）及び２回のＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞仕分け）によって選択される。 ＤＶＤ-Ｆａｂ酵母ディスプレイライブラリの例となる構築方法の模式図である。 （Ａ）例となる単鎖二重可変ドメイン（ｓｃＤＶＤ）分子、（Ｂ）例となる完全長ＤＶＤ−Ｉｇ分子及び（Ｃ）例となる単鎖Ｆｖ分子を示す図である。 ｓｃＤＶＤ分子の模式図及び例となる内側可変ドメインのリンカーのアミノ酸配列を示す図である。 酵母細胞上のｓｃＤＶＤ又はｓｃＦｖの細胞表面発現を測定するフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。 （Ａ）細胞表面のＤＬＬ４／ＶＥＧＦを結合するｓｃＤＶＤを発現する酵母細胞へのＤＬＬ４及び／又はＶＥＧＦの結合、及び（Ｂ）細胞表面のＳＯＳＴ／ＴＮＦαを結合するｓｃＤＶＤを発現する酵母細胞へのＳＯＳＴ及び／又はＴＮＦαの結合を測定するフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。 種々のエピトープタグを付けた、細胞表面のＳＯＳＴ／ＴＮＦαを結合するｓｃＤＶＤを発現する酵母細胞へのＳＯＳＴ及び／又はＴＮＦαの結合を測定するフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。 （Ａ）例となるＳＯＳＴ／ＴＮＦαを結合するｓｃＤＶＤ分子のアミノ酸配列（配列番号５７）、（Ｂ）ＶＨ３−９、ＳＯＳＴ ＶＨ、Ｖ１−１６及びＭＳＬ１０ＶＬの配列を伴った、例となるＳＯＳＴ／ＴＮＦα結合ｓｃＤＶＤライブラリの設計を示す図である。 （Ｃ）親の又は親和性成熟させた細胞表面ＳＯＳＴ／ＴＮＦαを結合するｓｃＤＶＤを発現する酵母細胞へのＳＯＳＴの結合を測定するフローサイトメトリーアッセイの結果；及び（Ｄ）親の又は親和性成熟させた細胞表面ＳＯＳＴ／ＴＮＦαを結合するｓｃＤＶＤを発現する酵母細胞へのＳＯＳＴの結合を測定するフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。 （Ａ）ｓｃＤＶＤ分子の模式図及び例となる内側ＶＬドメインのリンカーのアミノ酸配列、並びに（Ｂ）種々の内側ＶＬドメインのリンカーのアミノ酸配列を含むＳＯＳＴ／ＴＮＦα結合ｓｃＤＶＤライブラリの酵母ディスプレイスクリーニングの結果（濃縮倍率として）を示す図である。 本明細書で開示される例となるｓｃＤＶＤライブラリ及びこれらのライブラリを用いた多重化方法の模式図である。 本明細書で開示される例となるｓｃＤＶＤライブラリ及びこれらのライブラリを用いた多重化方法の模式図である。 本明細書で開示される例となるｓｃＤＶＤライブラリ及びこれらのライブラリを用いた多重化方法の模式図である。 本明細書で開示される例となるｓｃＤＶＤライブラリ及びこれらのライブラリを用いた多重化方法の模式図である。 本明細書で開示される例となるｓｃＤＶＤライブラリの模式図である。 （Ａ）例となる単鎖二重可変ドメインＦａｂ（ｓｃＤＶＤＦａｂ）、（Ｂ）例となる完全長ＤＶＤ−Ｉｇ分子、及び（Ｃ）例となる単鎖ＤＶＤ分子を示す図である。 （Ａ）ｓｃＤＶＤＦａｂ分子の模式図、（Ｂ）ＧＳ剛性リンカーのアミノ酸配列及び（Ｃ）ＧＳ剛性リンカーを伴ったｓｃＤＶＤＦａｂの模式図である。 酵母の表面上で特定のｓｃＤＶＤＦａｂの発現を測定するフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。 酵母上で発現されたＩＢ／ＩＬ１７ｓｃＤＶＤＦａｂがＩＬ１Ｂ及び／又はＩＬ１７の双方に結合する能力を保持することを示すフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。 ｓｃＤＶＤＦａｂ及びＤＶＤ−Ｆａｂが酵母の表面にてＩＬ１Ｂ及び／又はＩＬ１７の双方に対して類似の結合特性の結合を有したことを示すフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。 本明細書で開示される４つの結合タンパク質の構成の模式図である。 ＶＨＣＤＲ３アラニン走査による抗原結合の不活化後の一価抗体の抗原結合親和性を示す図である。 ノブ・イントゥ・ホール方式の変異を有するｃＭｅｔＭＢｏｄｙの抗原結合親和性を示す図である。 異なる数及び種類の可変ドメインを含有する半Ｉｇ構築物と同様に種々の親抗体の全分子を模式図で示す。 ｃ−Ｍｅｔ半Ｉｇの機能性の変化を示す図である。 ＥＲＢＢ２／ＥＲＢＢ２ＤＶＤ−Ｉｇ及びＤＶＤ−Ｉｇに由来する半Ｉｇの（Ａ）機能性及び（Ｂ）アゴニスト活性を示す図である。 親抗体の価数及び特異性を調整することによって異なる数及び種類の可変ドメインを含有する構築物の追加の例を模式図で示す。 ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物の構成１バージョン１のモデルを示す図である。 ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物の構成１バージョン２のモデルを示す図である。 ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物の構成１バージョン３のモデルを示す図である。 ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物の構成２バージョン１のモデルを示す図である。 ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物の構成２バージョン２のモデルを示す図である。 ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物の構成２バージョン３のモデルを示す図である。 ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物の構成２バージョン４のモデルを示す図である。 ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物の構成３バージョン１のモデルを示す図である。 ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物の構成３バージョン２のモデルを示す図である。 ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物の構成３バージョン３のモデルを示す図である。 ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物の構成３バージョン４のモデルを示す図である。 ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物の構成３バージョン５のモデルを示す図である。 ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物の構成３バージョン６のモデルを示す図である。 ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）分子の標的親和性及び／又は定比性のダイヤルアップ又はダイヤルダウンを示す図である。 複数の病原体に由来する異なる抗原を標的とするための多重特異性結合タンパク質を生成するためのｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物の使用を示す図である。 多重特異性のラクダＩｇの創製を示す図である。 「還元に次いで酸化」の方法を用いてタンパク質製造段階で２つの別々の半ＩｇＧ分子を対合することによる四重特異性の結合タンパク質の生成を示す図である。 「還元に次いで酸化」の方法を用いてタンパク質製造段階で２つの別々の半ＩｇＧ分子を対合することによる三重特異性の結合タンパク質の生成を示す図である。 ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＴＮＦ及びＩＬ−１７に同時に結合するｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）の能力を判定する実験の結果を示す図である。
本発明は、高い親和性で２以上の抗原を同時に結合することが可能である改善された多価結合タンパク質の生成に有用な新規の組成物及び方法を提供する。
Ｉ．定義
本明細書で定義されない限り、本発明との関連で使用される科学用語及び専門用語は当業者によって一般的に理解される意味を有するべきである。用語の意味及び範囲は明瞭であるべきであるが、潜在的な曖昧性の事象では、本明細書で提供される定義は辞書又は非本質的な定義を越えた先例を取る。さらに、文脈によって要求されない限り、単数用語は複数を含むべきであり、複数用語は単数を含むべきである。一般に、本明細書で記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質及び核酸の化学及びハイブリッド形成との関連で使用される及びそれらの技法で使用される命名法は、周知のものであり、当該技術で一般に使用される。
本発明がさらに容易に理解され得るために、特定の用語を先ず定義する。
用語「多価結合タンパク質」は２以上の抗原結合部位を含み、そのそれぞれが独立して抗原に結合することができる結合タンパク質を示すのに本明細書全体を通して使用される。実施形態では、多価結合タンパク質は３以上の抗原結合部位を有するように操作され、天然に存在する抗体ではない。実施形態では、多価結合タンパク質は３以上の抗原結合部位を有するように操作され、天然に存在する抗体ではない。
用語「多重特異性結合タンパク質」は２以上の関連した又は関連しない標的を結合することが可能である結合タンパク質を指す。実施形態では、本明細書で提供される結合タンパク質は受容体の１以上のリガンド結合ドメインを含む。用語「二重可変ドメイン免疫グロブリン」又は「ＤＶＤ−Ｉｇ」は、たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，２５８，２６８号で開示された多価結合タンパク質を指す。
用語「リガンド」は、周知であり、当該技術で一般に使用されるように、別の物質に結合する又は結合されることが可能である物質を指す。同様に用語「抗原」は、周知であり、当該技術で一般に使用されるように、それに対して抗体が生成され得る物質を指す。「抗原」は抗体が結合する物質を参照して一般に使用され、「リガンド」は受容体が結合する物質を参照する際使用されることが多いが、これらの用語は互いに区別されず、広い範囲の重複する化学実体を包含する。誤解を避けるために、抗原及びリガンドは本明細書全体を通して相互交換可能に使用される。抗原／リガンドはペプチド、ポリペプチド、タンパク質、アプタマー、多糖、糖分子、炭水化物、脂質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、合成分子、無機分子、有機分子及びそれらの組み合わせであってもよい。
用語「多価結合タンパク質」は各抗原について１つの抗原（リガンド）結合部位を含む結合タンパク質を指す。用語「多価結合タンパク質」は同一抗原について２以上の抗原（リガンド）結合部位を含む結合タンパク質を指す。実施形態では、多価結合タンパク質は３以上の抗原結合部位を有するように操作され、天然に存在する抗体ではない。用語「多価結合タンパク質」は２以上の関連する又は関連しない標的を結合することが可能である結合タンパク質を指す。実施形態では、多価結合タンパク質は異なる標的抗原のそれぞれについて１つの結合ドメインを持つという点で多重特異性であってもよい。
用語「ＤＶＤ−Ｆａｂ」は抗体のＦａｂ断片に類似するＤＶＤ分子の抗原結合断片を指す。例となるＤＶＤ−Ｆａｂは本明細書では図１に描かれる。
用語「単鎖二重可変ドメイン免疫グロブリン」又は「ｓｃＤＶＤ」は抗体の単鎖Ｆｖ断片に類似するＤＶＤ分子の抗原結合断片を指す。ｓｃＤＶＤは一般に式ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｘ２−ＶＬ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＬ２ものであり、式中、ＶＨ１は第１の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ２は第２の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ２はリンカーであり、ＶＬ１は第１の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ２は第２の抗体軽鎖可変ドメインであり、ｎは０又は１であり、ＶＨ１とＶＬ１及びＶＨ２とＶＬ２はそれぞれ組合わされて２つの機能的な抗原結合部位を形成する。
用語「単鎖二重可変ドメイン免疫グロブリンＦａｂ」又は「ｓｃＤＶＤＦａｂ」はＤＶＤ−ＩＧの可変の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）を含むＤＶＤ分子の抗原結合断片を指す。ｓｃＤＶＤは一般に式ＣＨ１−Ｘ０−ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｘ２−ＣＬ１−Ｘ４−ＶＬ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＬ２のものであり、式中、ＣＨ１は重鎖定常ドメインでり、Ｘ０は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ１は第１の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ２は第２の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ２はリンカーであり、ＣＬ１は軽鎖定常ドメインであり、Ｘ４は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ１は第１の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ２は第２の抗体軽鎖可変ドメインであり、ｎは０又は１であり、ＶＨ１とＶＬ１及びＶＨ２とＶＬ２はそれぞれ組合わされて２つの機能的な抗原結合部位を形成する。任意で、ＣＬ１ドメインはκ（ｈｃκｏｒ ｃκ）又はλ（ｈｃλｏｒ ｃλ）の定常ドメインであることができる。特定の実施形態では、ＣＬ１はｃκである。例となるｓｃＤＶＤＦａｂは本明細書では図１０Ａにて描かれる。
用語「二重特異性抗体」は２つの結合アームのうちの１つ（ＨＣ／ＬＣの１対）にて１つの抗原（又はエピトープ）を結合し、第２の結合アーム（ＨＣ／ＬＣの異なる対）にて異なる抗原（又はエピトープ）を結合する抗体を指す。二重特異性抗体は２つの異なる抗原結合アーム（特異性及びＣＤＲ配列の双方にて）を有し、それが結合する各抗原について一価である。二重特異性抗体には、２つの異なるモノクローナル抗体の化学抱合による（Staerz et al. (1985) Nature 314(6012): 628-31 Staerz et al. (1985) Nature 314(6012): 628-31）、又はＦｃ領域に変異を導入するノブ・イントゥ・ホール又は類似のアプローチによる（Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(14): 6444-6448）クアドローマ技術によって生成されるものが挙げられる。二重特異性タンパク質は少なくとも２つの異なる剤、たとえば、２つの異なるタンパク質に結合する能力を持つタンパク質を指す。二重特異性抗体の技術分野の十分な概説については、参照によって本明細書に組み入れられるKontermann, Roland E. (ed.), Bispecific Antibodies, Springer, NY (2011)を参照のこと。
用語「抗体」は本明細書で使用されるとき、４つのポリペプチド鎖、２つの重鎖（Ｈ）及び２つの軽鎖（Ｌ）で構成される、又はＩｇ分子の本質的なエピトープ結合性を保持する、その機能的な断片、変異体、変形体又は誘導体で構成される免疫グロブリン分子を指す。そのような変異体、変形体又は誘導体の抗体構成は当該技術で既知である。その非限定の実施形態は以下で議論される。完全長抗体の実施形態では、各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略記）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略記）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬで構成される。ＶＨ及びＶＬの領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるさらに保存された領域によって中断される相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。一般に各ＶＨ及びＶＬはアミノ末端からカルボキシ末端に以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される。免疫グロブリン分子は、任意の種類（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであり得る。
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＨ１ドメイン」及び「ＣＬ１ドメイン」は単一抗体の重鎖及び軽鎖の定常領域を指す。ＣＬ１ドメインはＣκ又はＣλドメインであることができる。
用語「変異体」は、アミノ酸の付加（たとえば、挿入）、欠失又は保存的な置換によって所与のポリペプチドとアミノ酸配列が異なるが、所与のポリペプチドの生物活性を保持する（たとえば、変異体ＩＬ−１７抗体はＩＬ−１７へｗの結合について抗ＩＬ−１７抗体と競合することができる）ポリペプチドを意味する。アミノ酸の保存的な置換、すなわち、類似の特性（たとえば、疎水性及び荷電した領域の程度と分布）のアミノ酸によるアミノ酸の置き換えは通常軽微な変化を含むとして当該技術で認識されている。これらの軽微な変化は、部分的には、当該技術で理解されるようなアミノ酸の疎水性指標を検討することによって特定することができる（たとえば、Kyte et al. (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132を参照）。アミノ酸の疎水性指標はその疎水性及び電荷の検討に基づく。タンパク質における類似の疎水性指標のアミノ酸を置換することができ、タンパク質はタンパク質の機能をそのまま保持することが当該技術で知られている。態様の１つでは、±２の疎水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の疎水性を用いて生物機能を保持するタンパク質を生じる置換を明らかにすることもできる。ペプチドの文脈でのアミノ酸の疎水性の検討は、抗原性及び免疫原性と上手く相関することが報告されている有用な手段である、そのペプチドの最大局所平均疎水性の算出を可能にする（たとえば、米国特許第４，５５４，１０１を参照）。類似の疎水性値を有するアミノ酸の置換は生物活性、たとえば、当該技術で理解されるような免疫原性を保持するペプチドを生じることができる。態様の１つでは、互いに±２以内での疎水性を有するアミノ酸で置換を実施する。アミノ酸の疎水性指標及び疎水性値の双方はそのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。その所見に一致して、生物機能に適合性であるアミノ酸の置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ及び他の特性によって明らかにされるようにアミノ酸、特にそれらアミノ酸の側鎖の類似性に左右されると理解される。用語「変異体」には、たとえば、タンパク質分解、リン酸化又は他の翻訳後修飾によって差次的に処理されているが、その生物活性又は抗原反応性、たとえば、ＩＬ−１７に結合する能力を保持するポリペプチド又はその断片も含まれる。用語「変異体」は定義されない限り変異体の断片を包含する。変異体は、野生型配列に対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、又は７５％同一であってもよい。
用語「エピトープ」は、結合タンパク質、たとえば、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的に結合することが可能であるポリペプチド及び／又は他の決定基によって結合される抗原の領域を意味する。特定の実施形態では、エピトープ決定基にはアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルのような分子の化学的に活性のある表面グループ分けが含まれ、特定の実施形態では、特定の三次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有し得る。実施形態では、エピトープは特定の結合相手における相補性部位に結合することが知られる抗原（又はその断片）の領域のアミノ酸残基を含む。抗原性断片は１を超えるエピトープを含有することができる。特定の実施形態では、結合タンパク質は、それがタンパク質及び／又は高分子の複合体混合物にてその標的抗原を認識すると特異的に抗原を結合する。抗体が交差競合する（一方が他方の結合又は調節効果を妨げる）のであれば、結合タンパク質は「同じエピトープに結合する」。加えて、エピトープ（重複する、類似の、同一の）の構造的な定義は情報参考になり；機能的な定義は構造（結合）及び機能（調節、競合）のパラメータを包含する。タンパク質の異なる領域は異なる機能を実施する。たとえば、サイトカインの特定の領域はサイトカイン受容体と相互作用して受容体の活性化もたらすのに対してタンパク質の他の領域はサイトカインの安定化に必要とされ得る。サイトカインのシグナル伝達の負の効果を無効にするために、受容体の相互作用領域に特異的に結合する結合タンパク質によってサイトカインを標的化し、それによって受容体の結合を妨げ得る。或いは、結合タンパク質はサイトカインの安定化に関与する領域を標的化し、それによって分解のためにタンパク質を指定する。エピトープ認識の視覚化及びモデル化の方法は当業者に既知である（ＵＳ２００９０３１１２５３）。
用語「Ｆｃ領域」は、無傷の抗体のパパイン消化によって生成され得る、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに使用される。Ｆｃ領域は生来の配列のＦｃ領域又は変異体Ｆｃ領域であり得る。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に２つの定常領域ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、任意でＣＨ４ドメインを含む。抗体のエフェクター機能を変えるＦｃ部分におけるアミノ酸残基の置換は当該技術で既知である（Ｗｉｎｔｅｒらの米国特許第５，６４８，２６０号；同第５，６２４，８２１号）。抗体のＦｃ部分は、幾つかの重要なエフェクター機能、たとえば、サイトカインの誘導、ＡＤＣＣ、貪食、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、及び抗体と抗原/抗体複合体の半減期／クリアランス速度に介在する。症例によってはこれらのエフェクター機能は治療用抗体に望ましいが、他の症例では、治療目的によっては不必要であり得又はさらに有害であり得る。特定のヒトＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３はそれぞれＦｃガンマＲｓ及び補体Ｃ１ｑへの結合を介してＡＤＣＣ及びＣＤＣに介在する。新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）は抗体の循環半減期を決定する重要な成分である。さらに別の実施形態では、抗体の定常領域、たとえば、抗体のＦｃ領域で少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されるので、抗体のエフェクター機能が変化する。免疫グロブリンの２つの同一重鎖の二量体化は、ＣＨ３ドメインの二量体化に介在され、ヒンジ領域内でのジスルフィド結合によって安定化される（Huber et al. Nature; 264: 415-20; Thies et al 1999 J Mol Biol; 293: 67-79）。重鎖／重鎖のジスルフィド結合を妨げるヒンジ領域内でのシステイン残基の変異はＣＨ３ドメインの二量体化を不安定化するであろう。ＣＨ３の二量体化に関与する残基は特定されている（Dall’Acqua 1998 Biochemistry 37: 9266-73.）。従って、一価の半Ｉｇを生成することが可能である。興味深いことに、これらの一価の半Ｉｇ分子は実際、ＩｇＧ及びＩｇＡのサブクラス双方について見いだされている（Seligman 1978 Ann Immunol 129: 855-70; Biewenga et al 1983 Clin Exp Immunol 51: 395-400）。ＦｃＲｎ：ＩｇのＦｃ領域の定比性は２：１であると決定されており（West et al 2000 Biochemistry 39: 9698-708）、半ＦｃはＦｃＲｎの結合に介在するのに十分である（Kim et al 1994 Eur J Immunol; 24: 542-548）。ＣＨ３の二量体化を崩壊させる変異は、ＣＨ３の二量体化に重要な残基がＣＨ３シート構造の内側界面に位置するのに対してＦｃＲｎの結合に関与する領域がＣＨ２−ＣＨ３ドメインの外側界面に位置するので、そのＦｃＲｎの結合に対して大きな有害効果を有し得ない。しかしながら、半Ｉｇ分子は、通常の抗体のサイズより小さなサイズのお蔭で組織浸透にて特定の利点を有し得る。一実施形態では、本発明の結合タンパク質、特にＦｃ領域の定常領域にて少なくとも１つのアミノ酸残基が置き換えられるので、重鎖の二量体化が破壊され、半ＤＶＤＩｇ分子を生じる。
用語、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）は本明細書で使用されるとき、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は完全長抗体の断片によって実施することができることが示されている。そのような抗体の実施形態は、二重特異性、二重の特異性又は多重の特異性の構成であってもよく；２以上の異なる抗原に特異的に結合する。用語、抗体の「抗原結合部分」の中に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１のドメインから成る一価の断片であるＦａｂ断片、；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１のドメインから成るＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨのドメインから成るＦｖ断片；（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片（参照によって本明細書に組み入れられるWard et al., (1989) Nature 341:544-546, Winter et al., PCT publication WO 90/05144 A1）；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、組換え法を用いて、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる：たとえば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）として作られるのを可能にする合成リンカーによってそれらを連結することができる。そのような単鎖抗体は、用語、抗体の「抗原結合部分」の中に包含されるようにも意図される。二重特異性抗体のような単鎖抗体の他の形態も包含される。二重特異性抗体は、ＨＬドメインとＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖で発現されるが、同一の鎖にて２つのドメイン間で対合できるには短すぎるリンカーを用い、それによってそのドメインを強制的に別の鎖の相補性のドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を創る二価の二重特異性の抗体である（たとえば、Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123を参照）。そのような抗体結合部分は当該技術で既知である（Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5）。加えて、単鎖抗体には、相補性の軽鎖ポリペプチドと一緒に抗原結合領域の対を形成する直列Ｆｖ断片（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む「線状抗体」も含まれる（Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995); and U.S. Pat. No. 5,641,870）。
本明細書で使用されるとき、用語「ＶＨドメイン」及び「ＶＬドメイン」はＦＲ（フレームワーク領域）１、２、３及び４とＣＤＲ（相補性決定領域）１、２及び３を含む、それぞれ単一抗体の重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインを指す（Kabat et al. (1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest. (NIH Publication No. 91-3242, Bethesdaを参照）。
用語「ＣＤＲ」は免疫グロブリンの可変領域配列内の相補性決定領域を意味する。重鎖及び軽鎖の可変領域のそれぞれについてＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と指定される、重鎖及び軽鎖の可変領域のそれぞれには３つのＣＤＲがある。用語「ＣＤＲセット」は抗原を結合することが可能である単一の可変領域に存在する３つのＣＤＲの群を指す。これらＣＤＲの正確な境界は異なる方式に従って異なって定義されている。Ｋａｂａｔ（Kabat et al. (1987) and (1991)）によって記載された方式は、抗体の可変領域に適用できる明白な残基の番号付け方式を提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基の境界も提供する。これらのＣＤＲはＫａｂａｔのＣＤＲと呼ばれ得る。Ｃｈｏｔｈｉａ及び共同研究者ら（Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883）は、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにもかかわらず、ＫａｂａｔのＣＤＲの中での特定の細部分がほぼ同一のペプチド主鎖構造を採用することを見いだした。これらの細部分はＬ１、Ｌ２及びＬ３又はＨ１、Ｈ２及びＨ３と名付けられたが、「Ｌ」及び「Ｈ」はそれぞれ、軽鎖領域及び重鎖領域を示す。これらの領域はＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲと呼ばれ、ＫａｂａｔのＣＤＲと重複する境界を有する。ＫａｂａｔのＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Padlan (1995) FASEB J. 9:133-139 and MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5):732-45)によって記載されている。さらに他のＣＤＲの境界の定義は、特定の残基又は残基の群又はさらにＣＤＲ全体が抗原結合に有意に影響しないという予測又は実験的知見を考慮するとそれらは短縮されてもよいし、又は長くされてもよいけれども、本明細書の方式の１つに厳密に従わなくてもよいが、それでもなお、ＫａｂａｔのＣＤＲと重複するであろう。特定の実施形態はＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａの定義したＣＤＲを使用するが、本明細書で使用される方法はこれらの方式のいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用し得る。
用語「Ｋａｂａｔの番号付け」、「Ｋａｂａｔの定義」及び「Ｋａｂａｔの標識」は本明細書では相互交換可能に使用される。当該技術で認識されているこれらの用語は、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域又はその抗原結合部分における他のアミノ酸残基よりもさらに可変である（すなわち、超可変である）アミノ酸残基を番号付けする方式を指す（Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391 and, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。重鎖可変領域については、超可変領域はＣＤＲ１の３１〜３５位のアミノ酸、ＣＤＲ２の５０〜６５位のアミノ酸、及びＣＤＲ３の９５〜１０２位のアミノ酸の範囲に及ぶ。軽鎖可変領域については、超可変領域はＣＤＲ１２４〜３４位のアミノ酸、ＣＤＲ２の５０〜５６位のアミノ酸、及びＣＤＲ３の８９〜９７位のアミノ酸の範囲に及ぶ。
用語「ＣＤＲ移植抗体」は、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域の１以上の配列が別の抗体のＣＤＲ配列で置き換えられる重鎖及び軽鎖の可変領域配列を含む抗体を指す。たとえば、２つの抗体は、たとえば、マウスのＣＤＲの１以上がヒトのＣＤＲの配列で置き換えられているマウスの重鎖及び軽鎖の可変領域を有する抗体のように異なる種に由来することができる。
用語「抗イディオタイプ抗体」は別の抗体の抗原結合部位のアミノ酸配列に対して産生させた抗体を指す。抗イディオタイプ抗体を投与して抗原に対する免疫応答を高め得る。
用語「親抗体」、「親受容体」又はさらに一般的に「親結合タンパク質」は、その機能的な結合ドメインが新規の結合タンパク質構築物で利用される、既存の又は以前単離された結合タンパク質を指す。
「親和性成熟した」抗体は、それらの変化を持たない親抗体に比べて抗原に対する抗体の親和性で改善を生じる、その１以上のＣＤＲにて１以上の変化を持つ抗体を指す。例となる親和性成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモル又はさらにピコモルの親和性を有するであろう。親和性成熟した抗体は当該技術で既知の手順によって製造される。Marks et al. (1992) BioTechnology 10:779-783はＶＨ及びＶＬのドメインのシャフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワークの残基の無作為変異誘発はBarbas et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813; Schier et al. (1995) Gene 169:147-155; Yelton et al. (1995) J. Immunol. 155:1994-2004; Jackson et al. (1995) J. Immunol. 154(7):3310-9; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896によって記載されており、活性を高めるアミノ酸残基による選択的変異誘発位置、接触位置又は超変異の位置での変異は米国特許第６，９１４，１２８号に記載されている。
用語「ヒト化抗体」は、さらにヒト様に、すなわち、ヒトの生殖細胞系列の配列にさらに類似するように改変されている非ヒト種に由来する抗体を指す。ヒト化抗体の１種はＣＤＲ移植抗体であり、非ヒトＣＤＲ配列がヒトのＶＨ及びＶＬの配列に導入されて相当するヒトのＣＤＲ配列を置き換える。「ヒト化抗体」は、実質的に（たとえば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である）ヒト抗体のアミノ酸配列を有するフレームワーク領域（ＦＲ）と非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する少なくとも１つのＣＤＲを含む抗体又はその変異体、誘導体、類似体又は断片でもある。ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべて又は実質的にすべての配列が非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のそれに相当し、ＦＲ領域のすべて又は実質的にすべての配列がヒト免疫グロブリンのそれに相当する、少なくとも１つ及び通常２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の実質的にすべてを含み得る。ヒト化抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４の領域も含み得る。実施形態では、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部も含み得る。一部の実施形態では、ヒト化抗体のみがヒト化軽鎖を含有する。一部の実施形態では、ヒト化抗体のみがヒト化重鎖を含有する。一部の実施形態では、ヒト化抗体のみが軽鎖のヒト化可変ドメイン及び／又は重鎖のヒト化可変ドメインを含有する。一部の実施形態では、ヒト化抗体は重鎖の少なくとも可変ドメインと同様に軽鎖を含有する。一部の実施形態では、ヒト化抗体は軽鎖の少なくとも可変ドメインと同様に重鎖を含有する。
本明細書で使用されるとき、用語「フレームワーク（ＦＲ）のアミノ酸残基」は免疫グロブリン鎖のフレームワーク領域におけるそれらのアミノ酸を指す。用語「フレームワーク領域」又は「ＦＲ領域」は本明細書で使用されるとき、可変領域の部分であるが、ＣＤＲの部分ではないアミノ酸残基を含む（たとえば、ＣＤＲのＫａｂａｔの定義を用いて）。
本明細書で使用されるとき、用語「に特異的に結合する」は、少なくとも約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ以上のＫｄで抗原に結合する及び／又は非特異的な抗原に対する親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で抗原に結合する結合ポリペプチドの能力を指す。しかしながら、結合ポリペプチドは配列で関連する２以上の抗原に特異的に結合することが可能であることが理解されるべきである。たとえば、本発明の結合ポリペプチドは、抗原のヒト及び非ヒト（たとえば、マウス又は非ヒト霊長類）のオルソログに特異的に結合することができる。用語「ポリペプチド」は本明細書で使用されるとき、アミノ酸の高分子鎖を指す。用語「ペプチド」及び「タンパク質」は用語、ポリペプチドと相互交換可能に使用され、アミノ酸の高分子鎖を指す。用語「ポリペプチド」は生来の又は人工のタンパク質、タンパク質断片及びタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは単量体であっても、又は多量体であってもよい。
用語「リンカー」はペプチド結合によって連結される２以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドを意味するのに使用され、１以上の抗原結合部分を連結するのに使用される。そのようなリンカーポリペプチドは当該技術で周知である（たとえば、Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994を参照）。好まれるリンカーには、本明細書の表７及び／又は１１にて示されるアミノ酸リンカーが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「生物活性」は、分子（生体内で見いだされる、組換え手段によって提供される又は可能にされるとき、天然に存在しようとしまいと）の１以上の生物学的な特性を指す。生物学的な特性には、受容体又は受容体リガンドを結合すること、細胞増殖を誘導すること、細胞増殖を抑制すること、他のサイトカインを誘導すること、アポトーシスを誘導すること、及び酵素活性が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「中和すること」は結合タンパク質が抗原／リガンドに特異的に結合すると、抗原／リガンドの生物活性に対抗することを指す。実施形態では、中和する結合タンパク質が抗原／リガンド（たとえば、サイトカイン）に結合し、生物活性を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％以上低下させる。
用語「特異性」は抗原／リガンドを選択的に結合する結合タンパク質の能力を指す。
用語「親和性」は、結合タンパク質と抗原／リガンドとの間での相互作用の強さを指し、結合タンパク質の結合ドメインの配列によって、と同様にたとえば、サイズ、形状、及び／又は電荷のような抗原／リガンドの性質によって決定される。結合タンパク質は、所望の治療終点を提供する一方で否定的な副作用をできるだけ抑える親和性について選択され得る。当業者に既知の方法を用いて親和性が測定され得る（ＵＳ２００９０３１１２５３）。用語「効能」は所望の効果を達成する結合タンパク質の能力を指し、治療有効性の測定値である。当業者に既知の方法を用いて効能が評価され得る（ＵＳ２００９０３１１２５３）。
用語「交差反応性」は、それに対して産生されるもの以外の標的を結合する結合タンパク質の能力を指す。一般に、結合タンパク質は適宜高い親和性で標的の組織／抗原を結合するが、非標的の正常組織については適宜低い親和性を提示するであろう。個々の結合タンパク質は一般に、２つの基準を満たすように選択される。（１）抗体標識の既知の発現に適する組織染色。（２）同じ臓器に由来するヒト組織と毒性試験種（マウス及びカニクイザル）組織の間での類似の染色パターン。交差反応性を評価するこれらの方法及び他の方法は当業者に既知である（ＵＳ２００９０３１１２５３）。
用語「生物学的な機能」は結合タンパク質の特定の試験管内又は生体内の作用を指す。結合タンパク質は幾つかのクラスの抗原／リガンドを標的とし、作用の複数のメカニズムを介して所望の治療成果を達成し得る。結合タンパク質は、可溶性タンパク質、細胞表面抗原並びに細胞外のタンパク質堆積物を標的とし得る。結合タンパク質はその標的の活性を刺激し、拮抗し、又は中和し得る。結合タンパク質はそれらが結合する標的のクリアランスを支援し得る、又は細胞に結合した際、細胞傷害性を生じ得る。２以上の抗体の一部が多価の構成に組み入れられて単一の結合タンパク質分子にて区別できる機能を達成し得る。生物学的な機能を評価するのに使用される試験管内のアッセイ及び生体内のモデルは当業者に既知である（ＵＳ２００９０３１１２５３）。
「安定な」結合タンパク質は、結合タンパク質が保存の際、その物理学的な安定性、化学的な安定性及び／又は生物学的な活性を本質的に保持するものである。長い時間、種々の温度にて試験管内で安定である多価結合タンパク質が望ましい。結合タンパク質を安定化し、種々の温度でその安定性を評価する方法は当業者に既知である（ＵＳ２００９０３１１２５３）。
用語「溶解性」は水溶液にて分散されたままであるタンパク質の能力を指す。水溶液におけるタンパク質の溶解性は、疎水性及び親水性のアミノ酸残基の適正な分布に左右されるので、溶解性は正しく折り畳まれたタンパク質の作出に相関し得る。当業者は日常のＨＰＬＣ法及び当業者に既知の方法（ＵＳ２００９０３１１２５３）用いて結合タンパク質の溶解性の増減を検出することができる。
結合タンパク質は、種々の宿主細胞を用いて産生させてもよく、又は試験管内で産生させてもよく、試行当たりの相対的な収率は「産生効率」を決定する。産生効率に影響する因子には、宿主細胞の種類（原核又は真核）、発現ベクターの選択、ヌクレオチド配列の選択、及び採用される方法が挙げられるが、これらに限定されない。結合タンパク質の産生と同様に産生効率の測定に使用される材料及び方法は当業者に既知である（ＵＳ２００９０３１１２５３）。
用語「免疫原性」は免疫応答を誘導する物質の能力を意味する。治療用結合タンパク質の投与は免疫応答の特定の発生を生じ得る。多価構成にて免疫原性を誘導し得る潜在的な要素は親結合タンパク質の選択の間に解析されてもよく、そのようなリスクを減らす工程を利用してその配列を多価結合タンパク質の構成に組み入れる前に親結合タンパク質を最適化することができる。抗体及び結合タンパク質の免疫原性を減らす方法は当業者に既知である（ＵＳ２００９０３１１２５３）。
用語「標識」及び「検出可能な標識」は、たとえば、抗体又はその検体のような特定の結合対のメンバーに結合させて特定の結合対のメンバー間の反応を検出可能にする部分を意味する。特定の結合対の標識されたメンバーは「検出可能に標識された」と言われる。従って、用語「標識された結合タンパク質」は結合タンパク質の特定を提供する組み込まれた標識を伴ったタンパク質を指す。実施形態では、標識は、視覚的手段又は計測手段によって、たとえば、放射性標識したアミノ酸の取り込み又は印を付けたアビジン（たとえば、蛍光マーカー間又は光学的な方法又は比色法によって検出することができる酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの連結によって検出可能であるシグナルを生じることができる検出可能なマーカーである。ポリペプチド用の標識の例には、以下：放射性同位元素又は放射性核種（たとえば、３Ｈ、 １４Ｃ、 ３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、又は１５３Ｓｍ）；色原体、蛍光標識（たとえば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランダニド蛍光体）、酵素標識（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；化学発光マーカー；ビオチニル基；二次受容体によって認識される所定のポリペプチドエピトープ（たとえば、ロイシンジッパー対の配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）；及びガドリニウムキレート剤のような磁気剤が挙げられるが、これらに限定されない。免疫アッセイに一般的に採用される標識の代表例には、光を生じる部分、たとえば、アクリジニウム化合物、及び蛍光を生じる部分、たとえば、フルオレセインが挙げられる。この点で、部分自体が検出可能に標識されなくてもよいが、さらに別の部分によって反応の際に検出可能になり得る。
用語「抱合体」は、たとえば、治療剤又は細胞傷害剤のような第２の化学部分に化学的に連結される抗体のような結合タンパク質を指す。用語「剤」には、化合物、化合物の混合物、生物学的高分子、又は生物材料から作製される抽出物が含まれる。実施形態では、治療剤又は細胞傷害剤には、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びプロマイシン及びそれらの類似体及びホモログが挙げられるが、これらに限定されない。免疫アッセイの文脈で採用される場合、抱合体抗体は、検出抗体として使用される検出可能に標識された抗体であり得る。
用語「結晶」及び「結晶化された」は、結晶の形態で存在する結合タンパク質（たとえば、抗体）、又はその抗原結合部分を指す。結晶は物体の固体状態の一形態であり、たとえば、非晶性の固体状態又は液体結晶状態のような他の形態から区別可能である。結晶は、原子、イオン、分子（たとえば、抗体のようなタンパク質）、又は分子の集合体（たとえば、抗原／抗体複合体）の規則的な反復する三次元の列で構成される。これらの三次元の列は当該分野で十分に理解されている特定の数学的関係に従って配置される。結晶にて繰り返される基本的な単位又は基礎的要素は非対称単位と呼ばれる。所与の明確に定義された結晶学的対称性に一致する配置における非対称単位の反復は結晶の「単位格子」を提供する。三次元すべてにおける規則的な変換による単位格子の反復は結晶を提供する。Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999)を参照のこと。
用語「薬物動態」は生物によって薬剤が吸収され、分配され、代謝され、排泄される過程を指す。所望の薬物動態特性を持つ多価結合タンパク質分子を生成するために、類似の所望の薬物動態特性を持つ親結合タンパク質が選択される。選択された親結合タンパク質のＰＫ特性は当業者に既知の方法を用いて齧歯類にて容易に決定することができる（ＵＳ２００９０３１１２５３）。
用語「生体利用効率」は投与の後、その標的に達する活性薬剤の量を指す。生体利用効率は、安定性、溶解性、免疫原性及び薬物動態を含む以前記載された特性の幾つかの関数であり、当業者に既知の方法を用いて評価することができる（ＵＳ２００９０３１１２５３）。
用語「表面プラスモン共鳴」は、たとえば、BIAcore（Ｒ） system (BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)を用いたバイオセンサーマトリクス内でのタンパク質濃度の変化の検出によってリアルタイムの二重特異性相互作用の解析を可能にする光学現象意味する。さらなる説明については、Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26を参照のこと。用語「Ｋｏｎ」は、たとえば、ＤＶＤ−Ｉｇ／抗原複合体を形成するための結合タンパク質（たとえば、抗体又はＤＶＤ−Ｉｇ）の抗原への会合のためのオン速度定数を意味する。用語「Ｋｏｎ」はまた本明細書では相互交換可能に使用されるような「会合速度定数」又は「ｋａ」も意味する。結合タンパク質のその標的抗原への結合速度を示す又は結合タンパク質、たとえば、抗体と抗原の間での複合体形成の速度を示すこの値はまた以下の方程式
抗体（「Ａｂ」）＋抗原（「Ａｇ」）→Ａｂ-Ａｇ
によっても示される。
用語「Ｋｏｆｆ」は、当該技術で既知であるような、結合タンパク質（たとえば、抗体又はＤＶＤ−Ｉｇ）のたとえば、ＤＶＤ−Ｉｇ／抗原複合体からの解離のためのオフ速度定数又は「解離速度定数」を意味する。この値は、結合タンパク質、たとえば、抗体のその標的抗原からの解離速度、又は以下の方程式：
Ａｂ＋Ａｇ←Ａｂ-Ａｇ
によって示されるような遊離の抗体と抗原へのＡｂ／Ａｇ複合体の経時的な分離を指し示す。
用語「Ｋｄ」及び「平衡解離定数」は、平衡での滴定測定で得られる又は会合速度定数（Ｋｏｎ）によって解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を割ることによって得られる値である。会合速度定数、解離速度定数及び平衡解離定数用いて結合タンパク質（たとえば、抗体又はＤＶＤ−Ｉｇ）の抗原への結合親和性を表す。会合速度定数及び解離速度定数を決定する方法は当該技術で周知である。蛍光に基づく技法を用いることは、平衡にて生理的緩衝液で試料を調べる高い感度及び能力を提供する。たとえば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（生体分子相互作用解析）アッセイのような他の実験法及び機器を使用することができる（たとえば、BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Swedenから入手可能な機器）。さらにSapidyne Instruments (Boise, Idaho) から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（動態排除アッセイ）も使用することができる。
用語「ベクター」は本明細書で使用されるとき、連結されている別の核酸を輸送することが可能である核酸分子を指すように意図される。ベクターの１種がプラスミドであり、それは追加のＤＮＡ断片が連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、追加のＤＮＡ断片はウイルスのゲノムに連結され得る。他のベクターにはＲＮＡベクターが挙げられる。特定のベクターはそれらが導入される宿主細胞にて自律的な複製が可能である（たとえば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソーム型哺乳類ベクター）。他のベクター（たとえば、非エピソーム型哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに統合されることができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが操作可能に連結される遺伝子の発現を指揮することが可能である。そのようなベクターは本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ法で有用な発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。本明細書では、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるので、「プラスミド」及び「ベクター」は相互交換可能に使用され得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（たとえば、複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）のような他の形態の発現ベクターを含むように意図される。ｐＨｙｂＥベクターの群（米国特許出願番号６１／０２１，２８２）は、たとえば、親結合タンパク質をクローニングするために及び一価の結合タンパク質のクローニングのために使用された。
「形質転換」は本明細書で使用されるとき、外来性のＤＮＡが宿主細胞に入る過程を指す。形質転換は当該技術で周知の種々の方法を用いて天然の又は人工の条件下で起こり得る。形質転換は、外来の核酸配列の原核又は真核の宿主細胞への挿入の既知の方法に頼り得る。方法は、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、それには、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクチン及び粒子衝突が挙げられ得るが、これらに限定されない。そのような「形質転換された」細胞には、挿入されたＤＮＡが自律複製プラスミドとして又は宿主の染色体の一部として複製することが可能である安定して形質転換された細胞が挙げられる。それらにはまた限定された時間の間、挿入されたＤＮＡ又はＲＮＡを一時的に発現する細胞も挙げられる。
用語「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）は本明細書で使用されるとき、外来性のＤＮＡが導入されている細胞を指すことが意図される。そのような用語は特定の対象細胞だけを指すのではなく、そのような細胞の子孫も指すことが理解されるべきである。変異又は環境の影響のいずれかのために連続する世代では特定の修飾が起きうるので、そのような子孫は実際、親細胞と同一ではないが、本明細書で使用されるとき、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。実施形態では、宿主細胞には生命界のいずれかから選択される原核細胞及び真核細胞が挙げられる。実施形態では、真核細胞には、原生生物、真菌、植物及び動物の細胞が挙げられる。別の実施形態では、宿主細胞には原核細胞株、大腸菌；哺乳類細胞株、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＳＰ２及びＰＥＲ．Ｃ６；昆虫細胞株、Ｓｆ９並びに真菌細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが挙げられるが、これらに限定されない。
ＩＩ．多価結合タンパク質
Ａ．ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）Ｆａｂ断片
態様の１つでは、本発明は２以上の抗原に同時に結合することができる多価結合タンパク質を提供する。これらの結合タンパク質は一般に、一般式ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを有する第１のポリペプチド鎖を含み、式中、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは重鎖定常ドメインであり、Ｘ２は細胞表面タンパク質であり、ｎは０又は１である。結合タンパク質は、一般式ＶＬ１−（Ｙ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃを有する第２のポリペプチド鎖も含み、式中、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、Ｙ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは軽鎖定常ドメインであり、ｎは０又は１であり、結合タンパク質の第１のポリペプチド鎖のＶＨ１とＶＨ２及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ１とＶＬ２は結合して２つの機能的な結合部位を形成する。
特定の実施形態では、多価結合タンパク質は二重可変ドメインの免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））分子、又はその断片（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）Ｆａｂ）（図１を参照）である。そのようなＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子は少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含む。重鎖は、組換えＤＮＡ法によって直列に連結された２つの異なる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続く定常ドメインＣＨ１及びＦｃ領域を含む。同様に、軽鎖は、組換えＤＮＡ法により直列に（直接又は短いリンカーを介して）連結された２つの異なる親モノクローナル抗体に由来する２つの異なる軽鎖可変ドメイン、それに続く軽鎖定常ドメインを含む。
可変ドメインは、当該技術で既知の方法によって生成された親抗体から組換えＤＮＡ法を用いて得ることができる。特定の実施形態では、可変ドメインはマウスの重鎖又は軽鎖の可変ドメインである。特定の実施形態では、可変ドメインはＣＤＲを移植した又はヒト化した重鎖又は軽鎖の可変ドメインである。特定の実施形態では、可変ドメインはヒトの重鎖又は軽鎖の可変ドメインである。
特定の実施形態では、第１の可変ドメイン及び第２の可変ドメインは組換えＤＮＡ法を用いて互いに直接連結される。特定の実施形態では、可変ドメインはリンカー配列を介して連結される。特定の実施形態では、２つの可変ドメインが連結される。３以上の可変ドメインも直接又はリンカー配列を介して連結される。可変ドメインは同一の抗原を結合してもよく又は異なる抗原を結合してもよい。本開示の多価結合タンパク質は免疫グロブリンの可変ドメイン１つと、受容体のリガンド結合ドメイン、酵素の活性ドメインのような非免疫グロブリンの可変ドメイン１つを含み得る。多価結合タンパク質は２以上の非Ｉｇドメインも含み得る。
リンカー配列は単一のアミノ酸又はポリペプチド配列であってもよい。好ましくはリンカー配列は表７及び／又は１１で示されるアミノ酸配列から成る群から選択される。
特定の実施形態では、定常ドメインは組換えＤＮＡ法を用いて２つの連結された可変ドメインに連結される。特定の実施形態では、重鎖可変ドメインは重鎖定常ドメインに連結され、軽鎖可変ドメインは軽鎖定常ドメインに連結される。特定の実施形態では、定常ドメインはそれぞれヒト重鎖定常ドメイン及びヒト軽鎖定常ドメインである。特定の実施形態では、重鎖又は軽鎖はさらにＦｃ領域に連結される。Ｆｃ領域は生来の配列のＦｃ領域又は変異体のＦｃ領域であり得る。特定の実施形態では、Ｆｃ領域はヒトのＦｃ領域である。好適なＦｃ領域は本明細書で開示される。
特定の実施形態では、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドが結合してＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子を形成する。特定の実施形態では、１つの軽鎖と１つの重鎖（Ｆｃ領域を欠く）が結合してＤＶＤ−Ｉｇ（商標）Ｆａｂを形成する。
Ｂ．単鎖多価結合タンパク質
別の態様では、本開示は２つの抗原に同時に結合することができる単鎖多価結合タンパク質を提供する。特定の実施形態では、単鎖多価結合タンパク質は一般に式ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｘ２−ＶＬ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＬ２のポリペプチドを含み、式中、ＶＨ１は第１の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ２は第２の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ２はリンカーであり、ＶＬ１は第１の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ２は第２の抗体軽鎖可変ドメインであり、ｎは０又は１であり、ＶＨ１とＶＬ１及びＶＨ２とＶＬ２はそれぞれ組合わされて２つの機能的な抗原結合部位を形成する。
特定の実施形態では、単鎖結合タンパク質は式ＣＨ１−（Ｘ０）ｎ−ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｘ２−ＣＬ１−Ｘ４−ＶＬ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＬ２を有し、式中、ＣＨ１は重鎖定常ドメインであり、Ｘ０は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ１は第１の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ２は第２の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ２はリンカーであり、ＣＬ１は軽鎖重ドメインであり、Ｘ４は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ１は第１の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ２は第２の抗体軽鎖可変ドメインであり、ｎは０又は１であり、ＶＨ１とＶＬ１及びＶＨ２とＶＬ２はそれぞれ組合わされて２つの機能的な抗原結合部位を形成する。任意でＣＬ１ドメインはκ（ｈｃκｏｒ ｃκ）又はλ（ｈｃλｏｒ ｃλ）の定常ドメインであることができる。特定の実施形態では、ＣＬ１はｃκである。
特定の実施形態では、単鎖結合タンパク質は式ＣＬ１−（Ｘ０）ｎ−ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｘ２−ＣＨ１−Ｘ４−ＶＨ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＨ２有し、式中、ＣＬ１は軽鎖定常ドメインであり、Ｘ０は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ１は第１の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ２は第２の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ２はリンカーであり、ＣＨ１は重鎖定常ドメインであり、Ｘ４は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ１は第１の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ２は第２の抗体重鎖可変ドメインであり、ｎは０又は１であり、ＶＨ１とＶＬ１及びＶＨ２とＶＬ２はそれぞれ組合わされて２つの機能的な抗原結合部位を形成する。任意でＣＬ１ドメインはκ（ｈｃκｏｒ ｃκ）又はλ（ｈｃλｏｒ ｃλ）の定常ドメインであることができる。特定の実施形態では、ＣＬ１はｃκである。
リンカー配列は単一のアミノ酸又はポリペプチド配列であってもよい。特定の実施形態では、Ｘ１及びＸ３のリンカー配列は本明細書の図５にて示されるアミノ酸配列から成る群から選択される。
特定の実施形態では、Ｘ２は（Ｇ４Ｓ）ｎであり、たとえば、ｎ＝１〜１０である。特定の実施形態では、Ｘ２は（Ｇ４Ｓ）ｎであり、ｎ＝７である。特定の実施形態では、Ｘ２は、一般式Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄを有するアミノ酸配列を含むＧＳ−剛性リンカー配列であり、式中、Ａ及びＢは柔軟性のアミノ酸リンカー領域であり、Ｃ及びＤは剛性のアミノ酸リンカー領域である。特定の実施形態では、ＡはＧＧＧＳＧＧＧであり；ＢはＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴ、ＴＰＡＰＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴ、ＴＰＡＰＬＰＡＰＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴ又はＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴであり；ＣはＧＧＳＧＧであり；且つＤはＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴ、ＴＰＬＰＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴ、ＴＰＬＰＡＰＬＰＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴ又はＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴである。特定の実施形態では、ＧＳ剛性リンカー配列は図１４Ｂにて示される群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
特定の実施形態では、単鎖多価結合タンパク質は一般に、式ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｘ２−ＶＨ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＨ２のポリペプチドを含み、式中、ＶＬ１は第１の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ２は第２の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ２はリンカーであり、ＶＨ１は第１の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ２は第２の抗体重鎖可変ドメインであり、ｎは０又は１であり、ＶＨ１とＶＬ１及びＶＨ２とＶＬ２はそれぞれ組合わされて２つの機能的な抗原結合部位を形成する。
特定の実施形態では、単鎖多価結合タンパク質は単鎖二重可変ドメイン免疫グロブリン分子（ｓｃＤＶＤ）である。例となるｓｃＤＶＤは本明細書の図４にて描かれる。他の実施形態では、単鎖多価結合タンパク質は単鎖二重可変ドメイン免疫グロブリンＦａｂ分子（ｓｃＤＶＤＦａｂ）である。例となるｓｃＤＶＤＦａｂは本明細書の図１４Ａにて描かれる。
本明細書で開示される単鎖多価結合タンパク質で使用するための抗体の可変ドメインは、当該技術で既知の方法によって生成される親抗体（又はＤＶＤ−Ｉｇ（商標））から組換えＤＮＡ法を用いて得ることができる。特定の実施形態では、可変ドメインはマウスの重鎖又は軽鎖の可変ドメインである。特定の実施形態では、可変ドメインはＣＤＲを移植した又はヒト化した重鎖又は軽鎖の可変ドメインである。特定の実施形態では、可変ドメインはヒトの重鎖又は軽鎖の可変ドメインである。
特定の実施形態では、第１の可変ドメイン及び第２の可変ドメインは組換えＤＮＡ法を用いて互いに直接連結される。特定の実施形態では、可変ドメインはリンカー配列を介して連結される。好ましくは２つの可変ドメインは連結される。３以上の可変ドメインも直接又はリンカー配列を介して連結され得る。可変ドメインは同一の抗原を結合してもよく又は異なる抗原を結合してもよい。本明細書で開示される単鎖多価結合タンパク質は、免疫グロブリンの可変ドメイン１つと、受容体のリガンド結合ドメイン、酵素の活性ドメインのような非免疫グロブリンの可変ドメイン１つを含み得る。単鎖多価結合タンパク質は２以上の非Ｉｇドメインも含み得る。
特定の実施形態では、組換えＤＮＡ法を用いて重鎖又は軽鎖の定常ドメインが単鎖多価結合タンパク質ドメインに連結される。Ｆｃ領域は生来の配列のＦｃ領域又は変異体のＦｃ領域であり得る。特定の実施形態では、Ｆｃ領域はヒトのＦｃ領域である。好適なＦｃ領域は本明細書で開示される。
Ｃ．交差多価結合タンパク質
別の態様では、本開示は、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）Ｉｇ又はＩｇ様のタンパク質の軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインを交差させることによって生成される交差二重可変ドメインＩｇを提供する。得られるタンパク質はこの開示では、交差ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）（「ｃｏＤＶＤＩｇ（商標）」）構築物又はＶＤ（可変ドメイン）交差結合タンパク質と呼ばれる。
特定の実施形態では、可変ドメインの交差は、一部のＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子の内側抗原結合ドメインにおける親和性損失の課題を解くのに役立つ。特定の実施形態では、可変ドメインを連結するリンカーの長さ及び配列を各構成及び抗体の配列／構造（フレームワーク）について最適化して望ましい特性を達成し得る。開示される概念及び方法論は、２を超える抗原結合ドメインを有するＩｇ又はＩｇ様のタンパク質にも拡大され得る。十数個の二重特異性の交差ＤＶＤ−Ｉｇが開示される。ベクターの設計、及びベクターを構築する方法、及びタンパク質を発現させ、精製し、性状分析する方法も開示される。
特定の実施形態では、米国特許第７，６１２，１８１号にて開示された代表的なＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子の１つに類似して、本開示の結合タンパク質は以下の構成（「構成１」とも呼ばれる）：ＶＬ１−リンカー−ＶＬ２−ＣＬ及びＶＨ１−リンカー−ＶＨ２−ＣＨ１−Ｆｃを有し得る。態様の１つでは、第１のポリペプチド鎖は式ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−ＣＬ−（Ｘ２）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域を含まず；第２のポリペプチド鎖は式ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−ＣＨ−（Ｘ２）ｎによって表される構造を含んでもよく、式中、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域であり、ｎは０又は１であり、第１と第２のポリペプチド鎖におけるＶＬ１とＶＨ１（「ＶＤ１」及びまとめて「ＶＤ１ｓ」とも呼ばれる）のドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成し、第１と第２のポリペプチド鎖におけるＶＬ２とＶＨ２（「ＶＤ２」及びまとめて「ＶＤ２ｓ」とも呼ばれる）のドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成する。特定の実施形態では、結合タンパク質は抗原Ａ及び抗原Ｂの双方を同時に結合することが可能である。
構成１では、異なるポリペプチド鎖に由来するＶＤ１ｓはＮ末端（外側）での抗原結合ドメインを形成する一方で、異なるポリペプチド鎖に由来するＶＤ２ｓはＣ末端（内側）での抗原結合ドメインを形成する。２つの機能的な抗原結合ドメインは直列接続である。構成１における一部のＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は内側抗原結合ドメインにて位置効果を示す。内側抗原結合ドメインによって認識される抗原の配列及び性質に応じて、結合タンパク質はその抗原に対する親和性の低下（すなわち、親抗体に比べたオン速度の損失）を提示する。この所見の考えられる説明の１つは、外側抗原結合ドメインが内側抗原結合ドメインでの立体障害とバランスを取り得ると、内側抗原結合ドメインを抗原、特に大きな動的サイズ又は膜分子を伴う抗原に幾分アクセスしにくくすることである。
ＴＥＭによって観察される構造の一部では、外側抗原結合ドメインが内側抗原結合ドメインでの立体障害とバランスを取った。構成１のＤＶＤ−Ｉｇ（商標）では、内側抗原結合ドメインについて最も広い構造でさえ、内側抗原結合ドメインの抗原結合に利用できる３−Ｄの空間は依然として特定の限定に制約され、内側ドメインの抗原が大きなサイズのタンパク質又は膜結合性のタンパク質である場合、このことが内側抗原結合ドメインの親和性、特にオン速度を低下させ得る。この問題を解決するには、可変ドメインが交差して親抗体に比べて標的抗原にさらに完全に暴露される２つの抗原結合ドメインを形成するように修飾された結合タンパク質を設計し得る。
態様の１つでは、本開示は、少なくとも２つのポリペプチド鎖、すなわち、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含有する結合タンパク質（「構成２」とも呼ばれる）を提供する。特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は式ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−（Ｘ２）ｎ−ＣＬ−（Ｘ３）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３はＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は式ＶＨ２−（Ｘ４）ｎ−ＶＨ１−（Ｘ５）ｎ−ＣＨ−（Ｘ６）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６はＸ３がＦｃ領域を含有するのであれば、Ｘ６はＦｃ領域を含有しないという条件でＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、ｎは０又は１であってもよく、ＶＬ１とＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成し、ＶＬ２とＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成する。特定の実施形態では、結合タンパク質は抗原Ａ及び抗原Ｂの双方を同時に結合することが可能である。
別の態様では、少なくとも２つのポリペプチド鎖、すなわち、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含有する結合タンパク質（「構成３」とも呼ばれる）が開示される。特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は式ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−（Ｘ２）ｎ−ＣＬ−（Ｘ３）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３はＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は式ＶＨ１−（Ｘ４）ｎ−ＶＬ２−（Ｘ５）ｎ−ＣＨ−（Ｘ６）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６はＸ３がＦｃ領域を含有するのであれば、Ｘ６はＦｃ領域を含有しないという条件でＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、ＶＬ１とＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい一方で、ＶＬ２とＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい。特定の実施形態では、結合タンパク質は抗原Ａ及び抗原Ｂの双方を同時に結合することが可能である。
別の態様では、少なくとも２つのポリペプチド鎖、すなわち、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含有する結合タンパク質（「構成４」とも呼ばれる）が開示される。特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は式ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−−（Ｘ２）ｎ ＣＬ−（Ｘ３）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３はＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は式ＶＬ１−（Ｘ４）ｎ−（Ｘ５）ｎ ＶＨ２−ＣＨ−（Ｘ６）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６はＸ３がＦｃ領域を含有するのであれば、Ｘ６はＦｃ領域を含有しないという条件でＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、ＶＬ１とＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい一方で、ＶＬ２とＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい。特定の実施形態では、結合タンパク質は抗原Ａ及び抗原Ｂの双方を同時に結合することが可能である。
別の態様では、少なくとも２つのポリペプチド鎖、すなわち、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含有する結合タンパク質（「構成５」とも呼ばれる）が開示される。特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は式ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ ＶＨ２−（Ｘ２）ｎ−ＣＬ−（Ｘ３）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３はＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は式ＶＬ１−（Ｘ４）ｎ−ＶＬ２−（Ｘ５）ｎ−ＣＨ−（Ｘ６）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６はＸ３がＦｃ領域を含有するのであれば、Ｘ６はＦｃ領域を含有しないという条件でＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、ＶＬ１とＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい一方で、ＶＬ２とＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい。特定の実施形態では、結合タンパク質は抗原Ａ及び抗原Ｂの双方を同時に結合することが可能である。
別の態様では、少なくとも２つのポリペプチド鎖、すなわち、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含有する結合タンパク質（「構成６」とも呼ばれる）が開示される。特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は式ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ１−（Ｘ２）ｎ−ＣＬ−（Ｘ３）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３はＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は式ＶＬ２−（Ｘ４）ｎ−ＶＨ２−（Ｘ５）ｎ ＣＨ−（Ｘ６）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６はＸ３がＦｃ領域を含有するのであれば、Ｘ６はＦｃ領域を含有しないという条件でＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、ＶＬ１とＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい一方で、ＶＬ２とＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい。特定の実施形態では、結合タンパク質は抗原Ａ及び抗原Ｂの双方を同時に結合することが可能である。
別の態様では、少なくとも２つのポリペプチド鎖、すなわち、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含有する結合タンパク質（「構成７」とも呼ばれる）が開示される。特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は式ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ１−（Ｘ２）ｎ−ＣＬ−（Ｘ３）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３はＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は式ＶＨ２−（Ｘ４）ｎ−ＶＬ２−（Ｘ５）ｎ−ＣＨ−（Ｘ６）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６はＸ３がＦｃ領域を含有するのであれば、Ｘ６はＦｃ領域を含有しないという条件でＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、ＶＬ１とＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい一方で、ＶＬ２とＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい。特定の実施形態では、結合タンパク質は抗原Ａ及び抗原Ｂの双方を同時に結合することが可能である。
別の態様では、少なくとも２つのポリペプチド鎖、すなわち、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含有する結合タンパク質（「構成８」とも呼ばれる）が開示される。態様の１つでは、第１のポリペプチド鎖は式ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ１−（Ｘ２）ｎ ＣＬ−（Ｘ３）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３はＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は式ＶＨ２−（Ｘ４）ｎ−ＶＬ２−（Ｘ５）ｎ−ＣＨ−（Ｘ６）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６はＸ３がＦｃ領域を含有するのであれば、Ｘ６はＦｃ領域を含有しないという条件でＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、ＶＬ１とＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい一方で、ＶＬ２とＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい。特定の実施形態では、結合タンパク質は抗原Ａ及び抗原Ｂの双方を同時に結合することが可能である。
別の態様では、少なくとも２つのポリペプチド鎖、すなわち、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含有する結合タンパク質（「構成９」とも呼ばれる）が開示される。態様の１つでは、第１のポリペプチド鎖は式ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ１−（Ｘ２）ｎ−ＣＬ−（Ｘ３）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３はＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は式ＶＬ２−（Ｘ４）ｎ−ＶＨ２−（Ｘ５）ｎ−ＣＨ−（Ｘ６）ｎよって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６はＸ３がＦｃ領域を含有するのであれば、Ｘ６はＦｃ領域を含有しないという条件でＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、ＶＬ１とＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい一方で、ＶＬ２とＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい。特定の実施形態では、結合タンパク質は抗原Ａ及び抗原Ｂの双方を同時に結合することが可能である。
別の態様では、少なくとも２つのポリペプチド鎖、すなわち、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含有する結合タンパク質（「構成１０」とも呼ばれる）が開示される。態様の１つでは、第１のポリペプチド鎖は式ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−（Ｘ２）ｎ−ＣＬ−（Ｘ３）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３はＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は式ＶＬ２−（Ｘ４）ｎ−ＶＨ１−（Ｘ５）ｎ−ＣＨ−（Ｘ６）ｎよって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６はＸ３がＦｃ領域を含有するのであれば、Ｘ６はＦｃ領域を含有しないという条件でＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、ＶＬ１とＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい一方で、ＶＬ２とＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい。特定の実施形態では、結合タンパク質は抗原Ａ及び抗原Ｂの双方を同時に結合することが可能である。
別の態様では、少なくとも２つのポリペプチド鎖、すなわち、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含有する結合タンパク質（「構成１１」とも呼ばれる）が開示される。態様の１つでは、第１のポリペプチド鎖は式ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−（Ｘ２）ｎ−ＣＬ−（Ｘ３）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３はＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は式ＶＨ２−（Ｘ４）ｎ−ＶＬ１−（Ｘ５）ｎ−ＣＨ−（Ｘ６）ｎよって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６はＸ３がＦｃ領域を含有するのであれば、Ｘ６はＦｃ領域を含有しないという条件でＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、ＶＬ１とＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい一方で、ＶＬ２とＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい。特定の実施形態では、結合タンパク質は抗原Ａ及び抗原Ｂの双方を同時に結合することが可能である。
別の態様では、少なくとも２つのポリペプチド鎖、すなわち、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含有する結合タンパク質（「構成１２」とも呼ばれる）が開示される。態様の１つでは、第１のポリペプチド鎖は式ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−（Ｘ２）ｎ−ＣＬ−（Ｘ３）ｎによって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３はＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は式ＶＬ２−（Ｘ４）ｎ−ＶＬ１−（Ｘ５）ｎ−ＣＨ−（Ｘ６）ｎよって表される構造を含有してもよく、式中、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６はＸ３がＦｃ領域を含有するのであれば、Ｘ６はＦｃ領域を含有しないという条件でＦｃ領域を含んでもよく、ｎは０又は１であってもよい。特定の実施形態では、ＶＬ１とＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい一方で、ＶＬ２とＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成してもよい。特定の実施形態では、結合タンパク質は抗原Ａ及び抗原Ｂの双方を同時に結合することが可能である。
特定の実施形態では、本明細書で開示される結合タンパク質は、本明細書の表８２にて示されるアミノ酸配列から独立して選択されるリンカーＸ１、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５を含む
Figure 2016510319
特定の実施形態では、リンカーＸ１、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５は本明細書の表８２にて示されるアミノ酸配列から独立して選択されるアミノ酸配列から成る。特定の実施形態では、本明細書で開示される結合タンパク質は本明細書の表８３にて示されるリンカーＸ１、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５の組み合わせを含む。
Figure 2016510319
特定の実施形態では、本明細書で開示される結合タンパク質は本明細書の表２１〜２４にて示されるアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖を含む。特定の実施形態では、本明細書で開示される結合タンパク質は本明細書の表２１〜２４にて示されるアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含む。特定の実施形態では、本明細書で開示される結合タンパク質は本明細書の表２１〜２４にて示されるアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖の相補性の対を含む。
特定の実施形態では、重鎖又は軽鎖はさらにＦｃ領域に連結される。Ｆｃ領域は生来の配列のＦｃ領域又は変異体のＦｃ領域であり得る。特定の実施形態では、Ｆｃ領域はヒトのＦｃ領域である。好適なＦｃ領域は本明細書にて開示される。
技量のある熟練者は本明細書で開示される交差多価結合タンパク質を本明細書で開示される一価及び／又は多価の結合タンパク質構成のいずれかに構成設定することができることを理解するであろう。従って、特定の実施形態では、交差多価結合タンパク質は、２つの第１のポリペプチド鎖と２つの第２のポリペプチド鎖とを含み、ポリペプチド鎖の少なくとも１つは可変ドメインに位置する変異を含み、前記変異は特定の抗体と変異体結合ドメインとの間での標的とされる結合を阻害する。
特定の実施形態では、交差多価結合タンパク質は、２つの第１のポリペプチド鎖と２つの第２のポリペプチド鎖とを含み、ポリペプチド鎖のうち２つはそれぞれ、変異を含むＦｃ領域を含み、前記変異は２つのポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を増進する。
Ｃ．一価結合タンパク質
別の態様では、本開示は抗原のようなタンパク質を結合することが可能である一価の結合タンパク質を提供する。さらに詳しくは、結合アームの１つが非機能性にされている抗体のクラスが開示される。特定の実施形態では、本開示の抗体はリガンドを結合することが可能である機能性アームを１つしか持たない。特定の実施形態では、１つの機能性アームが異なるリガンドへの結合のための１以上の結合ドメインを有し得る。リガンドは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、アプタマー、多糖、糖分子、炭水化物、脂質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、合成分子、無機分子、有機分子及びそれらの組み合わせであってもよい。
特定の実施形態では、４つのポリペプチド鎖を含有する結合タンパク質が開示され、その際、４つのポリペプチド鎖のうち少なくとも１つ（たとえば、１又は２）がＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含む。態様の１つでは、ＶＤＨは重鎖可変ドメインであり、Ｘ１は、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、Ｃは重鎖定常ドメインであり、Ｘ２はＦｃ領域であり、ｎは０又は１である。４つのポリペプチド鎖のうちの他の２つ（たとえば、１又は２）の少なくとも一方がＶＤＬ−（Ｘ３）ｎ−Ｃ−（Ｘ４）ｎを含み、その際、ＶＤＬは軽鎖可変ドメインであり、Ｘ３は、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、Ｃは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ４はＦｃ領域を含まず、ｎは０又は１である。別の態様では、４つのポリペプチド鎖のうちの少なくとも１つは可変ドメインに位置する変異を含み、該変異は特定の抗体と変異体結合ドメインとの間での標的とされる結合を阻害する。
特定の実施形態では、式ＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｃ−（Ｘ２）ｎを有する２つのポリペプチド鎖のＦｃ領域はそれぞれ変異を含有してもよく、２つのＦｃ領域における変異は２つのポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を増進する。特定の実施形態では、ノブ・イントゥ・ホール変異をＦｃ領域に導入してＦｃ領域のヘテロ二量体化を達成し得る。Atwell et al. J. Mol. Biol. 1997, 270: 26-35を参照のこと。
特定の実施形態では、４つのポリペプチド鎖のうち１つは表３２にて示されるものから選択されるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質が開示され、その際、４つのポリペプチド鎖のうち２つがＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＤＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域であり、ｎは０又は１である。別の態様では、４つのポリペプチド鎖のうち２つはＶＤＬ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＤＬ２−Ｃ−（Ｘ４）ｎを含み、式中、ＶＤＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ３は、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ４はＦｃ領域を含まず、ｎは０又は１である。特定の実施形態では、ＶＤＬ１とＶＤＨ１のドメインが第１の標的抗原について抗原結合ドメインを形成し、ＶＤＬ２とＶＤＨ２のドメインが第２の標的抗原について第２の抗原結合ドメインを形成する。別の態様では、４つのポリペプチド鎖のうち少なくとも１つが変異を含み、前記変異は第１の可変ドメイン又は第２の可変ドメインに位置し、前記変異は標的抗原と変異体結合ドメインとの間の標的とされる結合を阻害する。変異は第１の重鎖可変ドメイン（ＶＤＨ１）又は第２の重鎖可変ドメイン（ＶＤＨ２）に位置し得る。或いは、変異は第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＤＬ１）又は第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＤＬ２）に位置し得る。説明目的でここでは単一の又は二重の可変ドメインの式を使用するが、本開示の結合タンパク質は１、２（ＤＶＤ）、３（ＴＶＤ）以上の可変ドメインを含有し得る。
別の実施形態では、４つのポリペプチド鎖のうち少なくとも１つが２つの変異を含み、一方の変異は第１の可変ドメイン（たとえば、ＶＤＬ１又はＶＤＨ１）に位置し、他方の変異は第２の可変ドメイン（たとえば、ＶＤＬ２又はＶＤＨ２）又はポリペプチド鎖に位置し、２つの変異は２つの変異体結合ドメインとそのそれぞれの特異的な抗原との間での標的とされる結合を阻害する。
別の実施形態では、ＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎの式を有する２つのポリペプチド鎖のＦｃ領域がそれぞれ変異を含み、２つのＦｃ領域における該変異は２つのポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を増進する。例として、ｃＭｅｔ一価抗体を生成するために、ノブ・イントゥ・ホール変異をＨＣ構築物に導入してＨＣのヘテロ二量体化を達成し得る。Atwell et al. J. Mol. Biol. 1997, 270: 26-35を参照のこと。
別の実施形態では、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質が開示され、その際、第１のポリペプチド鎖はＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−（Ｘ３）ｍ−Ｙ１を含み、ＶＤＨは重鎖可変ドメインであり、Ｘ１はＸ１が、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ２はＣＨ１であり、Ｘ３はリンカーであり、Ｙ１はＣＨ２−ＣＨ３又はＣＨ３又はＣＨ３の一部であり、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１である。第２のポリペプチドはＶＤＬ−（Ｘ４）ｎ−Ｘ５−（Ｘ６）ｍ−Ｙ２を含有してもよく、式中、ＶＤＬは軽鎖可変ドメインであり、Ｘ４はＸ４が、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ５はＣＬ１であり、Ｘ６はリンカーであり、Ｙ２はＣＨ２−ＣＨ３又はＣＨ３又はＣＨ３の一部であり、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１である。態様では、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ変異を含んでもよく、Ｙ１及びＹ２における該変異はＹ１とＹ２の間での相互作用を増進する。例として、ノブ・イントゥ・ホール変異をＨＣ構築物に導入してＨＣのヘテロ二量体化を達成し得る。Atwell et al. J. Mol. Biol. 1997, 270: 26-35を参照のこと。例として及び一実施形態として、結合タンパク質は本明細書の表６９にて示される第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む。
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質も開示され、その際、第１のポリペプチド鎖はＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｘ２−（Ｘ３）ｍ−Ｙ１を含む。態様の１つでは、ＶＤＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、Ｘ１はＸ１が、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、ＶＤＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、Ｘ２はＣＨ１であり、Ｘ３はリンカーであり、Ｙ１はＣＨ２−ＣＨ３又はＣＨ３又はＣＨ３の一部であり、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１である。一実施形態では、第２のポリペプチドはＶＤＬ１−（Ｘ４）ｎ−ＶＤＬ２−Ｘ５−（Ｘ６）ｍ−Ｙ２を含み、式中、ＶＤＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、Ｘ４はＸ４が、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、ＶＤＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｘ５はＣＬ１であり、Ｘ６はリンカーであり、Ｙ２はＣＨ２−ＣＨ３又はＣＨ３又はＣＨ３の一部であり、ｎは０又は１であり、ｍは０又は１である。態様の１つでは、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ変異を含んでもよく、Ｙ１及びＹ２における該変異はＹ１とＹ２の間での相互作用を増進する。そのような変異の例には、Atwell et al. J. Mol. Biol. 1997, 270: 26-35にて記載されたようなノブ・イントゥ・ホール変異が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本明細書の表６９にて示されるように、Ｙ１はＦＣホールであり、Ｙ２はＦＣノブである。別の実施形態では、本明細書の表６９にて示されるように、Ｘ２はＣＨ１であり、Ｘ５はＣＬであり、Ｘ３はＤＫＴＨＴであり、Ｘ６はＧＧＳＧＧである。
特定の実施形態では、宿主細胞にて発現させた組み立てられた免疫グロブリン分子の少なくとも５０％、少なくとも７５％又は少なくとも９０％が所望の一価の結合タンパク質であるので、高い商業的有用性を持つ。従って、「主要生成物」が組み立てられたタンパク質すべての５０％を超える、７５％を超える、又は９０％を超える「一価の結合タンパク質」の「主要生成物」もたらす単一細胞にて一価の結合タンパク質を発現させる方法が提供される。
架橋効果なしで１以上のリガンドに結合するその能力を考えると、本明細書で提供される一価の抗体は標的リガンド（又は抗原）の拮抗剤として使用され得る。
Ｃ．多価の結合タンパク質
別の態様では、本開示は、２以上のタンパク質（たとえば、抗原）を結合することが可能である多価の結合タンパク質を提供する。一般に、そのような結合タンパク質は、特異的に修飾し、幾つかの概念を適合させることによって生成される。これらの概念には、（１）ＣＨ３の「ノブ・イントゥ・ホール」設計を用いてＦｃヘテロ二量体を形成すること、（２）ＣＨ１／ＣＬの交差を用いることによって軽鎖を見逃す対合を減らすこと、及び（３）「還元に次いで酸化」のアプローチを用いてタンパク質産生段階で２つの別々の半Ｉｇ分子を対合することが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの構成の多重特異性及び多価のＩｇＧ様分子（「ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）」とも呼ぶ）が開示される。ベクターの設計、及びベクターを構築する方法、及びタンパク質を発現させ、精製し、性状分析する方法も開示される。
特定の実施形態では、異なるＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子の半分２つと半分のＤＶＤ−Ｉｇ（商標）と半Ｉｇ分子を組み合わせることによってｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物が創られ得る。ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物を４つの独特の構築物から発現させ、重鎖ＣＨ３のノブ・イントゥ・ホール設計を介して一価の多重特異性分子を創り得る。特定の実施形態では、ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物は２つの区別できる軽鎖を含有してもよく、一方のアームのＦｃにて構造的な修飾を利用して各重鎖との軽鎖の適切な対合を確保してもよい。特定の実施形態では、重鎖定常領域のＣＨ１は一方のＦａｂにて軽鎖定常領域のｈＣｋと交換してもよい。特定の実施形態では、軽鎖可変領域全体にｈＣｋを足したものを重鎖可変領域にＣＨ１を足したものと交換してもよい。これらの独特の構造要件を受け入れるｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）構築物ベクターも開示される。
本明細書で記載される方法のいずれか１つによって生成される親抗体から組換えＤＮＡ法を用いて可変ドメインを得ることができる。実施形態では、可変ドメインはＣＤＲを移植した又はヒト化した重鎖又は軽鎖の可変ドメインである。実施形態では、可変ドメインはヒトの重鎖又は軽鎖の可変ドメインである。
特定の実施形態では、第１の可変ドメインと第２の可変ドメインは組換えＤＮＡ法を用いて互いに直接連結される。特定の実施形態では、可変ドメインはリンカー配列を介して連結される。特定の実施形態では、可変ドメインは同一の抗原を結合してもよいし、又は異なる抗原を結合してもよい。本発明のｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）分子は免疫グロブリンの可変ドメイン１つと、受容体のリガンド結合ドメイン、酵素の活性ドメインのような非免疫グロブリンの可変ドメイン１つを含み得る。ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）分子は２以上の非Ｉｇドメインも含有し得る。
リンカー配列の選択は幾つかのＦａｂ分子の結晶構造解析に基づき得る。Ｆａｂ又は抗体の分子構造において可変ドメインとＣＨ１／ＣＬ定常ドメインとの間に天然の柔軟性の連結がある。この天然の連結はＶドメインのＣ末端に由来する４〜６の残基とＣＬ／ＣＨ１ドメインのＮ末端に由来する４〜６の残基が寄与するおよそ１０〜１２のアミノ酸残基を含む。本発明のＤＶＤ−Ｉｇはそれぞれ、ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の軽鎖及び重鎖のリンカーとしての、ＣＬ又はＣＨ１のＮ末端の５〜６アミノ酸残基又は１１〜１２のアミノ酸残基を用いて生成した。ＣＬドメイン又はＣＨ１ドメインのＮ末端残基、特に最初の５〜６アミノ酸残基は強い二次構造なしでループ構造に適合するので、２つの可変ドメインの間で柔軟性のリンカーとして作用することができる。ＣＬドメイン又はＣＨ１ドメインのＮ末端残基は、それらがＩｇ配列の一部であるので、リンカー及び接合部から潜在的に生じ得る免疫原性を大幅にできるだけ抑えるために、可変ドメインの自然な延長である。
リンカー配列には、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの残基のすべてではないＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の長さの配列；たとえば、ＣＬ／ＣＨ１ドメイン最初の５〜１２アミノ酸残基が挙げられ；軽鎖リンカーはＣκ又はＣλに由来することができ；重鎖リンカーはＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、及びＣμを含む任意のアイソタイプのＣＨ１に由来することができる。リンカー配列は、Ｉｇ様分子（たとえば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）；Ｇ／Ｓに基づく配列（たとえば、Ｇ４Ｓ反復）；ヒンジ領域に由来する配列のような他のタンパク質；及び他のタンパク質に由来する天然の配列にも由来し得る。他のリンカー配列も実施例にて開示される。
特定の実施形態では、組換えＤＮＡ法を用いて、定常ドメインを２つの連結された可変ドメインに連結する。実施形態では、連結した重鎖可変ドメインを含む配列を重鎖定常ドメインに連結し、連結した軽鎖可変ドメインを含む配列を軽鎖定常ドメインに連結する。特定の実施形態では、定常ドメインはヒトの重鎖定常ドメイン及びヒトの軽鎖定常ドメインである。実施形態では、重鎖はさらにＦｃ領域に連結される。Ｆｃ領域は生来の配列のＦｃ領域又は変異体のＦｃ領域であり得る。特定の実施形態では、Ｆｃ領域はヒトのＦｃ領域である。別の実施形態では、Ｆｃ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、又はＩｇＤに由来するＦｃ領域を含む。
ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）分子は潜在的に広い応用を有し得る。特定の実施形態では、ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）分子は標的の親和性又は標的抗原の定比性をダイヤルアップ又はダイヤルダウンするのに使用され得る。特定の実施形態では、ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）分子は感染性疾患の治療のための病原体の広く、効率的な阻害に使用され得る。ｐＤＶＤ-Ｉｇ（商標）は異なる病原体に由来する２以上の異なる抗原を結合することが可能であり得る。
特定の実施形態では、結合タンパク質は４つのポリペプチド鎖、すなわち、第１、第２、第３及び第４のポリペプチド鎖を含有し得る。特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−ＣＨ−（Ｘ２）ｎを含有してもよく、式中、ＶＤ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域である。特定の実施形態では、第２のポリペプチド鎖はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−ＣＬ−（Ｘ２）ｎを含有してもよく、式中、ＶＤ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域を含まない。別の態様では、第３のポリペプチド鎖はＶＤ３−（Ｘ３）ｎ−ＶＤ４−ＣＬ−（Ｘ４）ｎを含有してもよく、式中、ＶＤ３は第３の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ４は第４の重鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ４はＦｃ領域である。特定の実施形態では、第４のポリペプチド鎖はＶＤ３−（Ｘ３）ｎ−ＶＤ４−ＣＨ−（Ｘ４）ｎを含有してもよく、式中、ＶＤ３は第３の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ４は第４の軽鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ４はＦｃ領域を含まない。特定の実施形態では、ｎは０又は１であり、第１と第２のポリペプチド鎖におけるＶＤ１ドメインは抗原Ａについての機能的な結合部位を１つ形成し、第１と第２のポリペプチド鎖におけるＶＤ２ドメインは抗原Ｂについての機能的な結合部位を１つ形成し、第３と第４のポリペプチド鎖におけるＶＤ３ドメインは抗原Ｃについての機能的な結合部位を１つ形成し、第３と第４のポリペプチド鎖におけるＶＤ４ドメインは抗原Ｄについての機能的な結合部位を１つ形成する。
特定の実施形態では、抗原Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは同一抗原であってもよいし、又はそれらはそれぞれ異なる抗原であってもよい。別の実施形態では、抗原Ａ及びＢは同一抗原であり、抗原Ｃ及びＤは同一抗原である。
特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖におけるＦｃ領域はそれぞれ変異を含有し、２つのＦｃ領域における該変異は第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を増進する。
ＩＩＩ．操作された多価結合タンパク質
特定の好まれる実施形態では、本明細書で開示される方法及び組成物を用いて作製される多価結合タンパク質は、相当する親参照結合タンパク質に関連して改善された特性（たとえば、親和性又は安定性）を示す。たとえば、操作された結合タンパク質は、表面プラスモン共鳴によって測定されるような約０．１ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数で標的抗原から解離してもよく、又は約１×１０−６Ｍ以下のＩＣ５０で標的抗原の活性を阻害してもよい。或いは、結合タンパク質は、表面プラスモン共鳴によって測定されるような約１×１０−２ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数で標的抗原から解離してもよく、又は約１×１０−７Ｍ以下のＩＣ５０で標的抗原の活性を阻害してもよい。或いは、結合タンパク質は、表面プラスモン共鳴によって測定されるような約１×１０−３ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数で標的から解離してもよく、又は約１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０で標的を阻害してもよい。或いは、結合タンパク質は、表面プラスモン共鳴によって測定されるような約１×１０−４ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数で標的から解離してもよく、又は約１×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０でその活性を阻害してもよい。或いは、結合タンパク質は、表面プラスモン共鳴によって測定されるような約１×１０−５ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数で標的から解離してもよく、又は約１×１０−１０Ｍ以下のＩＣ５０でその活性を阻害してもよい。或いは、結合タンパク質は、表面プラスモン共鳴によって測定されるような約１×１０−５ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数で標的から解離してもよく、又は約１×１０−１１Ｍ以下のＩＣ５０でその活性を阻害してもよい。
特定の実施形態では、操作された結合タンパク質は、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤの定常領域のような重鎖定常領域を含む。好ましくは、重鎖定常領域はＩｇＧ１の重鎖定常領域又はＩｇＧ４の重鎖定常領域である。さらに、結合タンパク質は、軽鎖定常領域、κ軽鎖定常領域又はλ軽鎖定常領域のいずれかを含むことができる。結合タンパク質はκ軽鎖定常領域を含む。或いは、結合タンパク質部分は、たとえば、Ｆａｂ断片又は単鎖Ｆｖ断片であることができる。
特定の実施形態では、操作された結合タンパク質は当該技術で既知の操作されたエフェクター機能を含む（たとえば、Winter, et al. US PAT NOs. 5,648,260; 5624821を参照）。抗体のＦｃ部分は、幾つかの重要なエフェクター機能、たとえば、サイトカインの誘導、ＡＤＣＣ、貪食、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、及び抗体と抗原/抗体複合体の半減期／クリアランス速度に介在する。症例によってはエフェクター機能は治療用結合タンパク質に望ましいが、他の症例では、治療目的によっては不必要又はさらに有害であり得る。特定のヒトＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３はそれぞれＦｃγＲｓ及び補体Ｃ１ｑへの結合を介してＡＤＣＣ及びＣＤＣに介在する。新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）は結合タンパク質の循環半減期を決定する重要な成分である。さらに別の実施形態では、結合タンパク質の定常領域、たとえば、結合タンパク質のＦｃ領域で少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されるので、結合タンパク質のエフェクター機能が変化する。
特定の実施形態では、操作された結合タンパク質は別の機能的分子（たとえば、別のペプチド又はタンパク質）に誘導体化され、又は連結される。たとえば、本発明の結合タンパク質又は結合タンパク質部分を（化学的カップリング、遺伝的融合、一価の会合等によって）１以上の他の分子実体、たとえば、別の結合タンパク質（たとえば、二重特異性結合タンパク質又は二重特異性抗体）、検出可能な剤、細胞傷害剤、医薬剤及び／又は結合タンパク質の別の分子との会合に介在することができるタンパク質又はペプチド（たとえば、ストレプトアビジンのコア領域又はポリヒスチジンタグ）に機能的に連結することによって本発明の標識された結合タンパク質を導出することができる。
本発明の結合タンパク質又は結合タンパク質部分が誘導体化され得る有用な検出剤には蛍光化合物が挙げられる。例となる蛍光検出剤には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、塩化５−ジメチルアミン−１−ナフチレンスルホニル、フィコエリスリン等が挙げられる。結合タンパク質は、たとえば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等のような検出可能な酵素によっても誘導体化され得る。結合タンパク質を検出可能な酵素によって誘導体化する場合、酵素が使用して検出可能な反応生成物を生じる追加の試薬を加えることによってそれが検出される。たとえば、検出剤、西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素及びジアミノベンジジンの添加が着色された反応生成物をもたらし、それが検出可能である。結合タンパク質はビオチンによっても誘導体化され、アビジン又はストレプトアビジンの結合の間接的な測定を介して検出され得る。
他の実施形態では、操作された結合タンパク質はさらに修飾されて、結合タンパク質のＯ−又はＮ−連結グリコシル化部位が変異しているグリコシル化部位の変異体を生成する。当業者は標準的な周知の方法を用いてそのような変異体を生成することができる。生物活性を保持するが、高い又は低い結合活性を有するグリコシル化部位の変異体は本発明の別の目的である。
さらに別の実施形態では、本発明の操作された結合タンパク質又は抗原結合部分のグリコシル化が修飾される。たとえば、非グリコシル化結合タンパク質を作製することができる（たとえば、結合タンパク質はグリコシル化を欠く）。グリコシル化を変化させて、たとえば、結合タンパク質の抗原に対する親和性を高めることができる。そのような糖質修飾は、たとえば、結合タンパク質の配列内で１以上のグリコシル化部位を変化させることによって達成することができる。たとえば、１以上の可変領域のグリコシル化部位の排除を生じ、それによってその部位でのグリコシル化を排除する１以上のアミノ酸置換を行うことができる。そのようなグリコシル化は結合タンパク質の抗原に対する親和性を高める得る。そのようなアプローチは、それぞれその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＰＣＴ公開ＷＯ２００３０１６４６６Ａ２及び米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号に詳細にさらに記載されている。
さらに又は代わりに、本発明の操作された結合タンパク質は、たとえば、低下した量のフコシル残基を有する低フコシル化結合タンパク質又は増加した分岐するＧｌｃＮＡｃ構造を有する結合タンパク質のような、グリコシル化の変化した型でさらに修飾することができる。そのような変化したグリコシル化のパターンは結合タンパク質のＡＤＣＣ能を高めることが明らかにされている。そのような糖質修飾は、たとえば、変化したグリコシル化の機構を伴った宿主細胞にて結合タンパク質を発現させることによって達成することができる。変化したグリコシル化の機構を伴った細胞は当該技術で記載されており、本発明の組換え結合タンパク質を発現させ、それによって変化したグリコシル化を伴う結合タンパク質を産生する宿主細胞で使用することができる。たとえば、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられるShields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, as well as, European Patent No: EP 1,176,195; PCT Publications WO 03/035835; WO 99/54342 80を参照のこと。当該技術で既知の技法を用いて、実行者はヒトのタンパク質のグリコシル化を示す結合タンパク質を生成し得る。たとえば、酵母株で産生されるグリコシル化されたタンパク質（糖タンパク質）が動物細胞、特にヒト細胞のそれと同一であるタンパク質のグリコシル化を示すように、酵母株を遺伝的に操作して天然に存在しないグリコシル化酵素を発現させている（U.S. patent Publication Nos. 20040018590 and 20020137134 and PCT publication WO2005100584 A2）。
ＩＶ．多価結合タンパク質の製造
本発明の操作された結合タンパク質は当該技術で既知の多数の技法のいずれかによって製造され得る。たとえば、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクター−が定法によって宿主細胞にて形質移入される宿主細胞からの発現。用語「形質移入」の種々の形態は外来性のＤＮＡを原核又は真核の宿主細胞に導入するのに一般に使用される多種多様な技法、たとえば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン形質移入等を包含するように意図される。本発明の結合タンパク質を原核又は真核の宿主細胞にて発現させることが可能であるけれども、真核細胞における結合タンパク質の発現が好ましく、哺乳類宿主細胞におけるのが最も好ましいが、そのような真核細胞（特に哺乳類細胞）は原核細胞よりも適正に折り畳まれ、免疫的に活性のある結合タンパク質を組み立て、分泌する可能性が高いからである。
本発明の組換え結合タンパク質を発現させるのに好まれる哺乳類宿主細胞にはチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ細胞）（Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む、R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621にて記載されたようなＤＨＥＲ選択性マーカーを用いた）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が挙げられる。結合タンパク質をコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞に導入する場合、宿主細胞にて結合タンパク質の発現を、又はさらに好ましくは宿主細胞が増殖する培養培地への結合タンパク質の分泌を可能にするのに十分な時間、宿主細胞を培養することによって結合タンパク質が産生される。標準のタンパク質精製法を用いて結合タンパク質を培養培地から回収することができる。
宿主細胞を用いて、たとえば、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子のような機能的な結合タンパク質断片を産生させることができる。上記手順における変化は本発明の範囲内であることが理解されるであろう。たとえば、本発明の結合タンパク質の軽鎖及び／又は重鎖のいずれかの機能的断片をコードするＤＮＡによって宿主細胞に形質移入することが望ましい。組換えＤＮＡ法を用いて、当該抗原の結合に必要ではない軽鎖及び重鎖のいずれか又は双方をコードするＤＮＡの一部又はすべてを取り除き得る。そのような切り詰めＤＮＡ分子から発現される分子も本発明の結合タンパク質によって包含される。加えて、標準の化学架橋法により本発明の結合タンパク質を第２の結合タンパク質に架橋することによって一方の重鎖と一方の軽鎖が本発明の結合タンパク質であり、他方の重鎖と他方の軽鎖が当該抗原以外の抗原に特異的である二官能性の結合タンパク質を産生させ得る。
本発明の結合タンパク質又はその抗原結合部分の組換え発現のための好まれる系では、結合タンパク質の重鎖及び結合タンパク質の軽鎖の双方をコードする組換え発現ベクターが、リン酸カルシウム介在の形質移入によってｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入される。組換え発現ベクターの中で、結合タンパク質の重鎖及び軽鎖の遺伝子はそれぞれ、ＣＭＶエンハンサ／ＡｄＭＬＰプロモータ調節要素に操作可能に連結されて遺伝子の高レベルの転写を推進する。組換え発現ベクターはまた、ＤＨＦＲ遺伝子も運び、それはメソトレキセート選択／増幅を用いてベクターによって形質移入されているＣＨＯ細胞の選択を可能にする。選択された形質転換体宿主細胞を培養して結合タンパク質の重鎖及び軽鎖を発現させ、未処理の結合タンパク質を培養培地から回収する。標準的な分子生物学技法を用いて組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞に形質移入し、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、結合タンパク質を培養培地から回収する。その上さらに本発明は、本発明の組換え結合タンパク質が合成されるまで好適な培養培地にて本発明の宿主細胞を培養することによって本発明の組換え結合タンパク質を合成する方法を提供する。方法はさらに本発明の組換え結合タンパク質を培養培地から単離することを含むことができる。
Ｖ．治療方法
特定の実施形態では、本明細書で提供される結合タンパク質は試験管内及び生体内の双方でその抗原標的の活性を中和することが可能である。従って、そのような結合タンパク質を用いて、たとえば、抗原を含有する細胞培養にて、本明細書で提供される結合タンパク質が交差反応する抗原を有するヒト対象にて又は哺乳類対象にて抗原の活性を阻害することができる。別の実施形態では、抗原活性が有害である疾患又は障害を患う対象にて抗原活性を低下させる方法が提供される。本明細書で提供される結合タンパク質を治療目的でヒト対象に投与することができる。
用語「抗原活性が有害である障害」は、障害を患う対象における抗原の存在が障害の病態生理学に関与する又は障害の悪化に寄与する因子であることが示されている又はそれが疑われる疾患及び他の障害を含むように意図される。従って、抗原活性が有害である障害は、抗原活性の低下が障害の症状及び／又は進行を緩和することが期待される障害である。そのような障害は、たとえば、障害を患う対象の生体液における抗原の濃度の上昇（たとえば、対象の血清、血漿、滑液等における抗原の濃度の上昇）によって証拠付けられ得る。本明細書で提供される結合タンパク質によって治療することができる障害の非限定例には以下及び結合タンパク質を含む医薬組成物に関する節にて議論される障害が挙げられる。
さらに、細胞内送達（内部移行する受容体及び細胞内分子を標的とする）、脳内への送達（脳血管関門を交差するためのトランスフェリン受容体及びＣＮＳ疾患メディエータ）を含む組織特異的な送達（高い局所ＰＫのための組織マーカー及び疾患メディエータを標的とするので高い有効性及び／又は低い毒性）のために本明細書で提供される結合タンパク質を採用することができる。結合タンパク質はキャリアタンパク質としても役立ってその抗原の非中和エピトープを介して特定の位置に抗原を送達し、また抗原の半減期を長くすることもできる。さらに、患者に埋め込まれた医療用具に物理的に連結するように又はこれらの医療用具を標的とするように結合タンパク質を設計することができる（Burke et al. (2006) Advanced Drug Deliv. Rev. 58(3): 437-446; Hildebrand et al. (2006) Surface and Coatings Technol. 200(22-23): 6318-6324; Drug/ device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu (2006) Biomaterials 27(11):2450-2467; Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices, Marques (2005) Biodegradable Systems in Tissue Engineer. Regen. Med. 377-397を参照のこと）。適当な種類の細胞を医療埋没物の部位に向けることは正常な組織機能を治癒させること及び回復させることを促進する。或いは、用具に結合させた又はそれを標的とする受容体抗体融合タンパク質によって用具埋め込みの際に放出されるメディエータ（サイトカインを含むが、これらに限定されない）の阻害も提供される。
本明細書で提供される結合タンパク質分子は、たとえば、結合タンパク質によって認識される標的が有害である種々の疾患を治療するための治療用分子として有用である。そのような結合タンパク質は特定の疾患に関与する１以上の標的を結合し得る。
開示を限定しないで、特定の疾患状態に関するさらなる情報が提供される。
ヒトの自己免疫性及び炎症性の応答
種々のサイトカイン及びケモカインは、たとえば、喘息、アレルギー、アレルギー性肺疾患、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、線維症、嚢胞性線維症（ＣＦ）、線維性肺疾患、特発性肺線維症、肝線維症、ループス、Ｂ型肝炎関連の肝疾患及び肝線維症、敗血症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、炎症性皮膚疾患、乾癬、糖尿病、インスリン依存性糖尿病、炎症性大腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節炎（ＯＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、虚血性心疾患（ＩＨＤ）、セリアック病、接触性過敏症、アルコール性肝疾患、ベーチェット病、アテローム性硬化血管病、眼表面炎症性疾患、又はライム病を含む一般的な自己免疫性及び炎症性の応答に関与している。
本明細書で提供される結合タンパク質は神経性障害を治療するのに使用することができる。実施形態では、本明細書で提供される結合タンパク質又はその抗原結合部分を用いて、神経変性疾患及びニューロン再生及び脊髄損傷を含む状態を治療する。
喘息
アレルギー性喘息は、好酸球増多の存在、杯細胞化生、上皮細胞の変化、気道の過敏症（ＡＨＲ）及びＴｈ２とＴｈ１サイトカインの発現、と同様に血清ＩｇＥレベルの上昇を特徴とする。今日の喘息にはコルチコステロイドが最も重要な抗炎症治療であるが、そのメカニズムは非特異的であり、特に小児患者集団にて安全性の懸念が存在する。従って、さらに特異的で標的化された治療法の開発が必要とされている。
種々のサイトカインは喘息に関連する病理応答を生じることに極めて重要な役割を有することに関係があるとされている。これらのサイトカインに対するｍＡｂの開発と同様にｒＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物は喘息を防ぐこと及び治療することに功を奏する。
炎症とＡＨＲの双方を評価することができるＯＶＡ誘導の喘息マウスモデルのような動物モデルは当該技術で知られており、それを用いて喘息を治療する種々の結合タンパク質分子の能力を測定し得る。喘息を研究する動物モデルはCoffman, et al. (2005) J. Exp. Med. 201(12):1875-1879; Lloyd et al. (2001) Adv. Immunol. 77: 263-295; Boyce et al. (2005) J. Exp. Med. 201(12):1869-1873; and Snibson et al. (2005) J. Brit. Soc. Allergy Clin. Immunol. 35(2):146-52にて開示されている。これらの標的対の日常な安全性評価に加えて、免疫抑制の程度のための特定の試験が必要とされてもよく、最良の標的対を選択するのに役立つ（Luster et al. (1994) Toxicol. 92(1-3):229-43; Descotes et al. (1992) Dev. Biol. Standard. 77:99-102; Hart et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol. 108(2):250-257を参照のこと）。
関節リウマチ
全身性疾患である関節リウマチは、関節の滑膜における慢性の炎症反応を特徴とし、軟骨の変性及び関節近接の骨の糜爛に関連する。多数の炎症促進性のサイトカイン、ケモカイン及び増殖因子が病んだ関節で発現される。最近の研究は、特定のサイトカインがＲＡにおけるＴ細胞の関与に十分な程度に介在することを示している。これらのサイトカインを遮断することの有益な効果も疾患の種々の動物モデルで認められた（概説については、Witowski et al. (2004) Cell. Mol. Life Sci. 61: 567-579を参照のこと）。結合タンパク質分子が関節リウマチを治療するのに有用であるかどうかは、コラーゲン誘導の関節炎モデルのようなＲＡの動物モデルを用いて評価することができる。他の有用なモデルも当該技術で周知である（Brand (2005) Comp. Med. 55(2):114-22を参照）。ヒト及びマウスのオルソログに対する親抗体の交差反応性（たとえば、ヒト及びマウスのＴＮＦ、ヒト及びマウスのＩＬ−１５等に対する反応性）に基づいて、マウスのＣＩＡモデルにおける検証試験を「相当する代理抗体」に由来する結合タンパク質分子と共に実施し得る；手短には、２（以上）のマウスの標的特異的な抗体に基づく結合タンパク質を、ヒト結合タンパク質構築物で使用される親ヒト抗体又は親ヒト化抗体の特徴に可能な限り一致させ得る（たとえば、類似の親和性、類似の中和能、類似の半減期等）。
全身性エリテマトーデス
ＳＬＥの免疫病理的な顕著な特徴は、高グロブリン血症、自己抗体の産生及び免疫複合体の形成をもたらすポリクローナルなＢ細胞の活性化である。有意に高いレベルの特定のサイトカインが全身性エリテマトーデスの患者で検出されている（Morimoto et al. (2001) Autoimmunity, 34(1):19-25; Wong et al. (2008) Clin Immunol. 127(3):385-93）。サイトカインの高い産生は、ＳＬＥ患者と同様にループス様疾患の動物にて示されている。動物モデルはこれらのサイトカインの遮断がループスの兆候を減らし得ることを明らかにしている（概説についてはNalbandian et al. (2009) 157(2): 209-215を参照のこと）。ヒトとマウスのオルソログに対する親抗体の交差反応性（たとえば、ヒトとマウスのＣＤ２０、ヒトとマウスのインターフェロンα等に対する反応性）に基づいて、マウスのループスモデルにおける検証試験を「相当する代理抗体」に由来する結合タンパク質分子と共に実施し得る。手短には、２（以上）のマウスの標的特異的な抗体に基づく結合タンパク質を、ヒト結合タンパク質構築物で使用される親ヒト抗体又は親ヒト化抗体の特徴に可能な限り一致させ得る（たとえば、類似の親和性、類似の中和能、類似の半減期等）。
多発性硬化症
多発性硬化症（ＭＳ）は大部分は未知の病因を伴った複雑なヒト自己免疫型疾患である。神経系全体にわたるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の免疫的な破壊が多発性硬化症の主要な病理である。自己免疫の発生に寄与する免疫的なメカニズムが主要な要因である。特に、抗原の発現、サイトカインと白血球の相互作用、及びＴｈ１細胞やＴｈ２細胞のような他のＴ細胞を調和させ／調節するのに役立つ調節性Ｔ細胞は治療標的の特定にとって重要な領域である。ＭＳでは、特定のサイトカインの高い発現が脳の損傷と血液及び脳脊髄液から単離された単核細胞の双方にて検出されている。これらのサイトカインを産生する細胞が活動性のＭＳ病変に高度に濃縮されるということは、このサイトカインの中和が有益であることの可能性を有する（概説についてはWitowski et al. (2004) Cell. Mol. Life Sci. 61: 567-579を参照のこと）。
ＭＳを治療するための結合タンパク質の有用性を評価する幾つかの動物モデルが当該技術で既知である（Steinman et al. (2005) Trends Immunol. 26(11): 565-71; Lublin et al. (1985) Springer Semin. Immunopathol.8 (3): 197-208; Genain et al. (1997) J. Mol. Med. 75(3):187-97; Tuohy et al. (1999) J. Exp. Med. 189(7):1033-42; Owens et al. (1995) Neurol. Clin. 13(1):51-73; and Hart et al. (2005) J. Immunol. 175(7):4761-8.を参照のこと）。ヒトと動物種オルソログについての親抗体の交差反応性に基づいて、マウスのＥＡＥモデルにおける検証試験を「相当する代理抗体」に由来する結合タンパク質分子と共に実施し得る；手短には、２（以上）のマウスの標的特異的な抗体に基づく結合タンパク質を、ヒト結合タンパク質構築物で使用される親ヒト抗体又は親ヒト化抗体の特徴に可能な限り一致させ得る（たとえば、類似の親和性、類似の中和能、類似の半減期等）。同じ概念が非齧歯類種における動物モデルに適用され、その際、「相当する代理抗体」に由来する結合タンパク質は予想される薬理学及びたぶん安全性試験のために選択される。これらの標的対の日常的な安全性評価に加えて、免疫抑制についての特定の試験が必要とされ得るし、最良の標的対を選択するのに役立ち得る（Luster et al. (1994) Toxicol. 92(1-3): 229-43; Descotes et al. (1992) Devel. Biol. Standard. 77: 99-102; Jones (2000) IDrugs 3(4):442-6を参照のこと）。
敗血症
重篤な炎症反応及び免疫応答は敗血症性ショックの本質的な特徴であり、組織損傷、多臓器不全及び敗血症に誘導される死の病態形成にて中心的な部分を担う。サイトカインは敗血症性ショックのメディエータであることが示されている。これらのサイトカインは組織に対して直接的な毒性効果を有し；それらはホスホリパーゼＡ２を活性化する。これら及び他の効果は、血小板活性化因子の濃度の上昇、酸化窒素シンターゼ活性の促進、好中球による組織浸潤の促進、及び好中球活性の増進をもたらす。特定のサイトカインのレベルと敗血症の臨床的な予後は負に相関することが示されている。これらのサイトカインに対する抗体又はｒＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の中和は敗血症患者の生存率を有意に改善し得る（Flierl et al. (2008) FASEB J. 22: 2198-2205を参照のこと）。
一実施形態は、たとえば、サイトカインのような、敗血症に関与する１以上の標的を結合することが可能であるｒＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物に関する。敗血症を治療するためのそのような結合タンパク質の有効性は当該技術で既知の前臨床動物モデルにて評価することができる（Buras et al. (2005) Nat. Rev. Drug Discov. 4(10):854-65 and Calandra et al. (2000) Nat. Med. 6(2):164-70を参照のこと）。
神経変性疾患
神経変性疾患は、その症例ではそれらが普通加齢依存性である慢性又は急性（たとえば、卒中、外傷性脳傷害、脊髄損傷等）のいずれかである。それらは、ニューロン機能の進行性の喪失（たとえば、ニューロン細胞死、軸索の喪失、神経ジストロフィ、脱髄）、運動性の喪失及び記憶の喪失を特徴とする。これらの慢性的な神経変性疾患は複数の細胞型とメディエータとの間での複雑な相互作用を表す。そのような疾患の治療戦略は限定されており、大部分は非特異的な抗炎症剤（たとえば、コルチコステロイド、ＣＯＸ阻害剤）によって炎症過程を遮断すること、又はニューロンの喪失及び／又はシナプス機能を抑える剤のいずれかに寄与する。これらの治療は疾患の進行を止めることができない。１を超える疾患メディエータを標的とする特定の治療法は、単一の疾患のメカニズムを標的とすることによって認められるものよりも慢性の神経変性疾患にとって一層さらに良好な治療有効性を提供し得る（Deane et al. (2003) Nature Med. 9:907-13; and Masliah et al. (2005) Neuron. 46:857を参照のこと）。
本明細書で提供される結合タンパク質分子はアルツハイマー病のような慢性の神経変性疾患に関与する１以上の標的を結合することができる。結合タンパク質分子の有効性は、アミロイド前駆タンパク質又はＲＡＧＥを過剰発現し、アルツハイマー病様の症状を発症するトランスジェニックマウスのような前臨床動物モデルにて検証することができる。加えて、結合タンパク質分子を構築し、動物モデルにて有効性を調べ、最良の治療用結合タンパク質をヒト患者で治療するために選択することができる。パーキンソン病のような他の神経変性疾患の治療にも結合タンパク質分子を採用することができる。
ニューロンの再生及び脊髄損傷
病理的メカニズムの知識の増加にもかかわらず、脊髄損傷（ＳＣＩ）は未だに破壊的な状態であり、高い医療ニーズを特徴とする医学的適応を表す。ほとんどの脊髄損傷は挫傷又は圧迫の損傷であり、一次損傷には普通、一次損傷を悪化させ、時には１０倍を超える病変領域の有意な肥大を生じる二次損傷メカニズム（炎症性メディエータ、たとえば、サイトカイン及びケモカイン）が続く。特定のサイトカインは二次変性のメディエータであり、それは神経炎症に寄与し、機能的回復を妨害する。
結合タンパク質分子の有効性は、脊髄損傷の前臨床動物モデルにて検証することができる。加えて、結合タンパク質分子を構築し、動物モデルにて有効性を調べ、最良の治療用結合タンパク質をヒト患者で治療するために選択することができる。一般に、抗体は効率的で関連した方式では脳血管関門（ＢＢＢ）を交差しない。しかしながら、特定の神経疾患、たとえば、卒中、外傷性脳損傷、多発性硬化症等では、ＢＢＢは障害され、結合タンパク質及び抗体の脳への高い浸透を可能にする。他の神経状態では、ＢＢＢの漏れが存在しない場合、たとえば、グルコース及びアミノ酸キャリアのようなキャリアが介在する輸送体及びＢＢＢの血管内皮での受容体によって介在されトランスサイトーシスが介在する細胞構造／受容体を含む内在性の輸送系の標的化を採用し得るので、結合タンパク質のＢＢＢ横断の輸送を可能にし得る。そのような輸送を可能にするＢＢＢでの構造には、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、ＬＲＰ及びＲＡＧＥが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、戦略は、低分子量薬、ナノ粒子及び核酸を含む潜在的な薬剤をＣＮＳに輸送するシャトルとしても結合タンパク質の使用を可能にする（Coloma et al. (2000) Pharm Res. 17(3):266-74; Boado et al. (2007) Bioconjug. Chem. 18(2):447-55）。
腫瘍性障害
モノクローナル抗体療法が癌に対する重要な治療法として出現している（von Mehren et al. (2003) Annu. Rev. Med. 54:343-69）。特定のサイトカインは、たぶん血管形成を刺激することによって、又は抗腫瘍免疫及び腫瘍増殖を調節することによって腫瘍増殖を支えることが示唆されている。研究は、一部のサイトカインはＮＫＴ細胞が腫瘍の免疫監視を抑制する新規の免疫調節経路の中心となり得ることを示している（概説については、Kolls et al. (2003) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 28: 9-11, and Terabe et al. (2004) Cancer Immunol Immunother. 53(2):79-85.を参照のこと）。
実施形態では、本明細書で提供される組成物及び方法で治療する又は診断することができる疾患には、乳腺、結腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢及び胆管、小腸、尿路（腎臓、膀胱及び尿路上皮を含む）、女性の生殖路（子宮頚部、子宮及び卵巣並びに絨毛腫及び妊娠性絨毛性疾患を含む）、男性の生殖路（前立腺、精嚢、精巣及び生殖細胞腫を含む）、内分泌腺（甲状腺、副腎及び下垂体を含む）、及び皮膚の癌腫、と同様に血管腫、黒色腫、肉腫（骨及び軟組織から生じるもの並びにカポジ肉腫を含む）、脳、神経、眼及び髄膜の腫瘍（星状細胞腫、膠腫、膠芽腫、網膜芽腫、神経腫、神経芽腫、神経鞘腫、及び髄膜腫を含む）白血病及びリンパ腫（ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫の双方）のような造血系悪性腫瘍から生じる固形腫瘍を含む原発及び転移の癌が挙げられるが、これらに限定されない。
実施形態では、単独で用いた場合又は放射線療法及び／又は他の化学療法剤と併用して用いた場合、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合部分を用いて癌を治療し、又は本明細書で記載される腫瘍からの転移の予防にてそれを使用する。
遺伝子治療
特定の実施形態では、本明細書で記載される結合タンパク質又は本明細書で提供される別の予防剤又は治療剤をコードする核酸配列を投与して遺伝子治療を手段として障害又はその１以上の症状を治療する、予防する、管理する又は改善する。遺伝子治療は対象への発現された又は発現可能な核酸の投与によって実施される治療法を指す。この実施形態では、核酸は、予防効果又は治療効果に介在する、それがコードする本明細書で提供される抗体又は予防剤又は治療剤を生じる。
当該技術で利用可能な遺伝子治療の方法のいずれかは本明細書で提供される方法で使用することができる。遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Goldspiel et al. (1993) Clin. Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu (1991) Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) Science 260:926- 932; Morgan and Anderson (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; and May (1993) TIBTECH 11(5):155-215を参照のこと。使用することができる組換えＤＮＡ技術の当該技術で一般的に知られる方法は、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).にて記載されている。遺伝子治療の種々の方法の詳細な記載は米国特許公開番号ＵＳ２００５００４２６６４にて開示されている。
ＶＩ．医薬組成物
１以上の結合タンパク質を含む医薬組成物は、単独で又は予防剤、治療剤及び／又は薬学上許容可能なキャリアとの併用で提供される。本明細書で提供される結合タンパク質を含む医薬組成物は、障害を診断すること、検出すること又はモニターすること、障害又は１以上のその症状を予防すること、治療すること、管理すること又は改善することにおいて、及び／又は研究において使用するためのものであるが、これらに限定されない。医薬組成物の製剤化は、単独で又は予防剤、治療剤及び／又は薬学上許容可能なキャリアとの併用で当業者に既知である（米国特許公開番号２００９０３１１２５３Ａ１）。
本明細書で提供される予防剤又は治療剤を投与する方法には、非経口投与（たとえば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）、硬膜外麻酔投与、腫瘍内投与、粘膜投与（たとえば、鼻内及び経口経路）及び肺投与（たとえば、吸入器又はネブライザーによって投与される噴霧化化合物）が挙げられるが、これらに限定されない。投与の特定の経路のための医薬組成物の製剤化、及び種々の投与方法に必要とされる材料及び技法は利用可能であり、当業者に既知である（米国特許公開番号２００９０３１１２５３Ａ１）。
投薬計画を調整して最適な所望の応答（たとえば、治療応答又は予防応答）を提供し得る。たとえば、単回ボーラスが投与されてもよいし、幾つかに分割した用量が時間をかけて投与されてもよいし、治療状況の要件にによって指示されるように用量を比例して低下させる又は増加させてもよい。投与の容易さ及び投与量の均一さのために単位剤形で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。用語「単位剤形」は、治療される哺乳類対象のための単位投与量として適する物理的に個別の単位を指し；各単位は、必要とされる医薬キャリアと関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本明細書で提供される単位剤形のための仕様は、（ａ）活性化合物の独特の特徴及び達成される治療効果及び予防効果、並びに（ｂ）個体における感受性の治療のためのそのような活性化合物を構成する当該技術に固有の限定によって及び直接それに応じて指示される。
本明細書で提供される結合タンパク質の治療上又は予防上有効な量の例となる非限定の範囲は０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、たとえば、１〜１０ｍｇ／ｋｇである。投与量の値は緩和される状態の種類及び重症度で変化し得ることが留意されるべきである。特定の対象については、個体のニーズ及び化合物を投与する又は化合物の投与を監督する人の専門的な判断に従って特定の投薬計画を時間をかけて調整してもよく、本明細書で示される投与量範囲は例示のみであり、請求される組成物の範囲又は実行を限定するようには意図されないことがさらに理解されるべきである。
ＶＩＩ．併用療法
本明細書で提供される結合タンパク質は、種々の疾患の治療で有用な１以上の追加の治療剤と共に投与することもでき、該追加の剤は意図した目的について技量のある熟練者によって選択される。たとえば、追加の剤は、本明細書で提供される抗体によって治療される疾患又は状態を治療するのに有用であるとして当該技術で認識される治療剤であることができる。併用には、１を超える追加の剤、たとえば、２又は３の追加の剤も含まれ得る。
併用療法剤には、抗腫瘍剤、放射線療法、たとえば、ＤＮＡアルキル化剤、シスプラチン、カルボプラチン、抗チューブリン剤、パクリタキセル、タキソール、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ゲムザール、アントラサイクリン、アドリアマイシン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、リューコボリン、イリノテカン、受容体チロシンキナーゼ阻害剤（たとえば、エルロチニブ、ゲフィチニブ）、ＣＯＸ−２阻害剤（たとえば、セレコキシブ）、キナーゼ阻害剤及びｓｉＲＮＡのような化学療法が挙げられるが、これらに限定されない。
自己免疫疾患及び炎症性疾患を治療するための併用は、イブプロフェンのような薬剤を含むＮＳＡＩＤＳとも呼ばれる非ステロイド性の抗炎症薬である。他の併用はプレドニゾロンを含むコルチコステロイドであり；ステロイド使用の周知の副作用は、本明細書で提供される結合タンパク質との併用で患者を治療する場合、必要とされるステロイド用量を徐々に減らすことによって減らすことができ、又は排除することさえできる。本明細書で提供される抗体又はその抗体結合部分を併用することができる関節リウマチのための治療剤の非限定例には、以下：サイトカイン抑制性の抗炎症薬（ＣＳＡＩＤ）；ヒトの他のサイトカイン又は増殖因子、たとえば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、インターフェロン、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、及びＰＤＧＦに対する抗体又はその拮抗剤が挙げられる。本明細書で提供される結合タンパク質又はその抗原結合部分は、たとえば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ９０、ＣＴＬＡのような細胞表面分子に対する抗体又はＣＤ１５４（ｇｐ３９又はＣＤ４０Ｌ）を含むそれらのリガンドと併用することができる。
治療剤の併用は自己免疫及びそれに続く炎症性カスケードにおける異なる点で干渉し得る；例には、本明細書で開示される結合タンパク質と、キメラ、ヒト化又はヒトＴＮＦ抗体のようなＴＮＦ拮抗剤、アダリムマブ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２９１３１）、ＣＡ２（ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ）、ＣＤＰ５７１、可溶性のｐ５５又はｐ７５ＴＮＦ受容体、又はその誘導体（ｐ７５ＴＮＦＲ１ｇＧ（ＥｎｂｒｅｌＴＭ）又はｐ５５ＴＮＦＲ１ｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ））、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤；又はＩＬ−１阻害剤（インターロイキン−１変換酵素阻害剤、ＩＬ−１ＲＡ等）が挙げられる。他の併用には本明細書で開示される結合タンパク質とインターロイキン１１が挙げられる。さらに別の併用には、ＩＬ−１２の機能と並行して、依存して又は調和して作用し得る免疫応答の立役者が挙げられ；特に関連するのは、ＩＬ−１８抗体、可溶性ＩＬ−１８受容体、又はＩＬ−１８結合タンパク質を含むＩＬ−１８拮抗剤である。ＩＬ−１２とＩＬ−１８は重複するが異なる機能を有し、双方に対する拮抗剤の併用は最も効果的であり得ることが示されている。さらに別の併用は本明細書で開示される結合タンパク質と非枯渇性抗ＣＤ４阻害剤である。さらに他の併用には、本明細書で開示される結合タンパク質と、抗体、可溶性受容体又は拮抗性リガンドを含む同時刺激経路ＣＤ８０（Ｂ７．１）又はＣＤ８６（Ｂ７．２）が挙げられる。
本明細書で提供される結合タンパク質はまた、たとえば、メソトレキセート、６−ＭＰ、アザチオプリンスルファサラジン、メサラジン、オルサラジンクロロキニン／ハイドロクロロキン、ペンシラミン、アウロチオリンゴ酸（筋肉内及び経口）、アザチオプリン、コキシン、コルチコステロイド（経口、吸入及び局所注射）、β−２アドレナリン受容体アゴニスト（サルブタノール、テルブタリン、サルメテラール）、キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）、クロモグリク酸、ネドクロミル、ケトチフェン、イプラトロピウム、オキシトロピウム、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、たとえば、イブプロフェン、たとえば、プレドニゾロンのようなコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノソシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動薬、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１（たとえば、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８又はＭＡＰキナーゼ阻害剤）のような炎症促進性サイトカインによるシグナル伝達妨害する剤、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤、キナーゼ阻害剤のようなＴ−細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体又はその誘導体（たとえば、可溶性ｐ５５又はｐ７５ＴＮＦ受容体又は誘導体ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（ＥｎｂｒｅｌＴＭ）又はｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ）、抗炎症性サイトカイン（たとえば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３及びＴＧＦβ）、セレコキシブ、葉酸、硫酸ヒドロキシクロロキン、ロフェコキシブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、ネプロキセン、バルデコキシブ、スルファサラジン、メチルプレドニゾロン、メロキシカム、酢酸メチルプレドニゾロン、金チオリンゴ酸ナトリウム、アスピリン、トリアムシノロンアセトアミド、プロポキシフェンナムシル酸／アセトアミノフェン、葉酸塩、ナブメトン、ジクロフェナク、ピロキシカム、エトドラク、ジクロフェナクナトリウム、オキサプロジン、オキシコドンｈｃｌ、酒石酸水素ヒドロコドン／アセトアミノフェン、ジクロフェナクナトリウム／ミソプロストール、フェンタニル、アナキンラ、ヒト組換え、トラマドールｈｃｌ、サルサレート、スリンダク、シアノコバラミン／ｆａ／ピリドキシン、アセトアミノフェン、アレンドロン酸ナトリウム、プレドニゾロン、硫酸モルヒネ、リドカイン塩酸塩、インドメタシン、グルコサミン硫酸塩／コンドロイチン、アミトリプチリンｈｃｌ、スルファジアジン、オキシコドンｈｃｌ／アセトアミノフェン、オロパタジンｈｃｌ、ミソプロストール、ナプロキセンナトリウム、オメプラゾール、サイクロホスファミド、リツキシマブ、ＩＬ−１ ＴＲＡＰ、ＭＲＡ、ＣＴＬＡ４−ＩＧ、ＩＬ−１８ ＢＰ、抗−ＩＬ−１８、抗−ＩＬ１５、ＢＩＲＢ−７９６、ＳＣＩＯ−４６９、ＶＸ−７０２、ＡＭＧ−５４８、ＶＸ−７４０、ロフルミラスト、ＩＣ−４８５、ＣＤＣ−８０１、又はメソプラムのような剤とも併用され得る。併用にはメソトレキセート又はレフルノミドが挙げられ、中程度又は重度の関節リウマチの症例ではシクロスポリンが挙げられる。
一実施形態では、結合タンパク質又はその抗原結合部分は、関節リウマチの治療のための以下の剤：ＫＤＲの小分子阻害剤、Ｔｉｅ−２の小分子阻害剤；メソトレキセート；プレドニゾロン；セレコキシブ；葉酸；硫酸ヒドロキシクロロキン；ロフェコキシブ；エタネルセプト；インフリキシマブ；レフルノミド；ナプロキセン；バルデコキシブ；スルファサラジン；メチルプレドニゾロン；イブプロフェン；メロキシカム；酢酸メチルプレドニゾロン；金チオリンゴ酸ナトリウム；アスピリン；アザチオプリン；トリアムシノロンアセトアミド；プロポキシフェンナムシル酸／アセトアミノフェン；葉酸塩；ナブメトン；ジクロフェナク；ピロキシカム；エトドラク；ジクロフェナクナトリウム；オキサプロジン；オキシコドンｈｃｌ；ヒドロコドン酒石酸水素／アセトアミノフェン；ジクロフェナクナトリウム／ミソプロストール；フェンタニル；アナキンラ、ヒト組換え；トラマドールｈｃｌ；サルサレート；スリンダク；シアノコバラミン／ｆａ／ピリドキシン；アセトアミノフェン；アレンドロン酸ナトリウム；プレドニゾロン；硫酸モルヒネ；リドカイン塩酸塩；インドメタシン；硫酸グルコサミン／コンドロイチン；シクロスポリン；アミトリプチリンｈｃｌ；スルファジアジン；オキシコドンｈｃｌ／アセトアミノフェン；オロパタジンｈｃｌ；ミソプロストール；ナプロキセンナトリウム；オメプラゾール；ミコフェノール酸モフェチル；サイクロホスファミド；リツキシマブ；ＩＬ−１ ＴＲＡＰ；ＭＲＡ；ＣＴＬＡ４−ＩＧ；ＩＬ−１８ ＢＰ；ＩＬ−１２／２３；抗−ＩＬ１８；抗−ＩＬ１５；ＢＩＲＢ−７９６；ＳＣＩＯ−４６９；ＶＸ−７０２；ＡＭＧ−５４８；ＶＸ−７４０；ロフルミラスト；ＩＣ−４８５；ＣＤＣ−８０１；又はメソプラムの１つとの併用で投与される。
本明細書で提供される結合タンパク質を併用することができる炎症性大腸疾患のための治療剤の非限定例には、以下：ブデノシド；表皮増殖因子；コルチコステロイド；シクロスポリン、スルファサラジン；アミノサリチル酸；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；リポキシゲナーゼ阻害剤；メサラミン；オルサラジン；バルサラジン；抗酸化剤；トロンボキサン阻害剤；ＩＬ−１受容体拮抗剤；抗−ＩＬ−１β ｍＡｂ；抗−ＩＬ−６ ｍＡｂ；増殖因子；エラスターゼ阻害剤；ピリジニル−イミダゾール化合物；ヒトの他のサイトカイン又は増殖因子、たとえば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、又はＰＤＧＦに対する抗体又は拮抗剤が挙げられる。本明細書で提供される結合タンパク質又はその抗原結合部分は、たとえば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０のような細胞表面分子に対する抗体又はそのリガンドと併用することができる。本明細書で提供される抗体又はその抗原結合部分は、たとえば、メソトレキセート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、たとえば、イブプロフェン、たとえば、プレドニゾロンのようなコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動薬、たとえば、ＴＮＦα又はＩＬ−１（たとえば．、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８又はＭＡＰキナーゼ阻害剤）のような炎症促進性サイトカインによるシグナル伝達を妨害する剤、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤のようなＴ−細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体又はその誘導体（たとえば、可溶性ｐ５５又はｐ７５ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ）又は抗炎症性サイトカイン（たとえば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３又はＴＧＦβ）又はｂｃｌ−２阻害剤のような剤とも併用され得る。
結合タンパク質を併用することができるクローン病のための治療剤の例には、以下：抗−ＴＮＦ抗体、アダリムマブ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２９１３１；ＨＵＭＩＲＡ）、ＣＡ２（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）、ＣＤＰ５７１、ＴＮＦＲ−Ｉｇ構築物、（ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（ＥＮＢＲＥＬ）又はｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ））阻害剤又はＰＤＥ４阻害剤が挙げられる。本明細書で提供される抗体又はその抗原結合部分は、コルチコステロイド、たとえば、ブデノシド及びデキサメタゾンと併用することができる。本明細書で提供される結合タンパク質又はその抗原結合部分は、スルファサラジン、５−アミノサリチル酸及びオルサラジン、又はたとえば、ＩＬ−１、たとえば、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤又はＩＬ−１ｒａのような炎症促進性サイトカインの合成又は作用を妨害する剤とも併用され得る。本明細書で提供される抗体又はその抗原結合部分は、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、たとえば、チロシンキナーゼ阻害剤又は６−メルカプトプリンと共に使用され得る。本明細書で提供される結合タンパク質又はその抗原結合部分は、ＩＬ−１１と併用することができる。本明細書で提供される結合タンパク質又はその抗原結合部分は、メサラミン、プレドニゾン、アザチオプリン、メルカプトプリン、インフリキシマブ、メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム、ジフェノキシレート／硫酸アトロピン、塩酸ロペラミド、メトトレキサート、オメプラゾール、葉酸塩、シプロフロキサシン／デキストロース−水、酒石酸水素ヒドロコドン／アセトアミノフェン、テトラサイクリン塩酸塩、フルオシノニド、メトロニダゾール、チメロサール／ホウ酸、コレスチラミン／スクロース、シプロフロキサシン塩酸塩、硫酸ヒヨスチアミン、メペリジン塩酸塩、ミダゾラム塩酸塩、オキシコドンｈｃｌ／アセトアミノフェン、プロメタジン塩酸塩、リン酸ナトリウム、スルファメトキサゾール／トリメトプリム、セレコキシブ、ポリカルボフィル、ナプシル酸プロポキシフェン、ハイドロコルチゾン、マルチビタミン、バルサラジン二ナトリウム、リン酸コデイン／アセトアミノフェン、コレセベラムｈｃｌ、シアノコバラミン、葉酸、レボフロキサシン、メチルプレドニゾロン、ナタリズマブ又はインターフェロン−γと併用することができる。
本明細書で提供される結合タンパク質を併用することができる多発性硬化症の治療剤の非限定例には、以下：コルチコステロイド；プレドニゾロン；メチルプレドニゾロン；アザチオプリン；サイクロホスファミド；シクロスポリン；メソトレキセート；４−アミノピリジン；チザニジン；インターフェロン−β１ａ（Ａｖｏｎｅｘ；Ｂｉｏｇｅｎ）；インターフェロン−β１ｂ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ；Ｃｈｉｒｏｎ／Ｂｅｒｌｅｘ）；インターフェロンα−ｎ３）（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｆｕｊｉｍｏｔｏ）、インターフェロン−α（Ａｌｆａ Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ／Ｊ＆Ｊ）、インターフェロンβ１Ａ−ＩＦ（Ｓｅｒｏｎｏ／Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ペグインターフェロンα２ｂ（Ｅｎｚｏｎ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）、コポリマー１（Ｃｏｐ−１； Ｃｏｐａｘｏｎｅ；Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）；高圧酸素；静脈内免疫グロブリン；クラブリビン；ヒトの他のサイトカイン又は増殖因子及びその受容体、たとえば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−２３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、又はＰＤＧＦに対する抗体又はその拮抗剤が挙げられる。本明細書で提供される結合タンパク質は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０のような細胞表面分子に対する抗体又はそのリガンドと併用することができる。本明細書で提供される結合タンパク質は、メソトレキセート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、たとえば、イブプロフェン、たとえば、プレドニゾロンのようなコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動剤、ＴＮＦα又はＩＬ−１（たとえば、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８又はＭＡＰキナーゼ阻害剤）のような炎症促進性サイトカインによるシグナル伝達を妨害する剤、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＡＣＥ阻害剤、キナーゼ阻害剤のようなＴ−細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体又はその誘導体（たとえば、可溶性ｐ５５又はｐ７５ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ）、抗炎症性サイトカイン（たとえば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３又はＴＧＦβ）又はｂｃｌ−２阻害剤とも併用され得る。
本明細書で提供される結合タンパク質を併用することができる多発性硬化症の治療剤の例には、インターフェロン−β、たとえば、ＩＦＮβ１ａ及びＩＦＮβ１ｂ；コパキソン、コルチコステロイド、カスパーゼ阻害剤、たとえば、カスパーゼ−１の阻害剤、ＩＬ−１阻害剤、ＴＮＦ阻害剤、及びＣＤ４０リガンド及びＣＤ８０に対する抗体が挙げられる。
本明細書で提供される結合タンパク質を併用することができる喘息の治療剤の非限定例には、以下：アルブテロール、サルメテロール／フルチカソン、モンテルカストナトリウム、フルチカソンプロピオン酸塩、ブデソニド、プレドニゾン、サルメテロールキシナホ酸塩、レバルブテロールｈｃｌ、アルブテロール硫酸塩／イプラトロピウム、プレドニゾロンリン酸ナトリウム、トリアムシノロンアセトニド、ベクロメタゾンジプロピオン酸塩、臭化イプラトロピウム、アジトロマイシン、ピルブテロール酢酸塩、プレドニゾロン、無水テオフィリン、メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム、クラリトロマイシン、ザフィルルカスト、フォルモテロールフマル酸塩、インフルエンザウイルスワクチン、メチルプレドニゾロン、アモキシリン三水和物、フルニソリド、アレルギー注射、クロモリンナトリウム、フェキソフェナジン塩酸塩、フルニソリド／メントール、アモキシリン／クラブラネート、レボフロキサシン、吸入器支援装置、グアイフェネシン、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、モキシフロキサシンｈｃｌ、ドキシサイクリンヒクレート、グアイフェネシン／ｄ−メトルファン、ｐ−エフェドリン／コッド／クロルフェニール、ガチフロキサシン、セチリジン塩酸塩、モメタゾンフランカルボン酸塩、サルメテロールキシナホ酸塩、ベンゾナテート、セファレキシン、ペ／ヒドロコドン／クロルフェニール、セチリジンｈｃｌ／シュードエフェド、フェニルエフリン／コッド／プロメタジン、コデイン／プロメタジン、セフプロジル、デキサメタゾン、グアイフェネシン／シュードエフェドリン、クロルフェニラミン／ヒドロコドン、ネドクロミルナトリウム、テルブタリン硫酸塩、エピネフリン、メチルプレドニゾロン、メタプロテレノール硫酸塩が挙げられる。
本明細書で提供される結合タンパク質を併用することができるＣＯＰＤの治療剤の非限定例には、以下：アルブテロール硫酸塩／イプラトロピウム、臭化イプラトロピウム、サルメテロール／フルチカソン、アルブテロール、サルメテロールキシナホ酸塩、フルチカソンプロピオン酸塩、プレドニゾン、無水テオフィリン、メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム、モンテルカストナトリウム、ブデノシド、フォルモテロールフマル酸塩、トリアムシノロンアセトニド、レボフロキサシン、グアイフェネシン、アジトロマイシン、ベクロメタゾンジプロピオン酸塩、レバルブテロールｈｃｌ、フルニソリド、セフトリアキソンナトリウム、アモキシシリン三水和物、ガチフロキサシン、ザフィルルカスト、アモキシシリン／クラブラネート、フルニソリド／メントール、クロルフェニラミン／ヒドロコドン、メタプロテレノール硫酸塩、メチルプレドニゾロン、モメタゾンフランカルボン酸塩、ｐ−エフェドリン／コッド／クロルフェニール、ピルブテロール酢酸塩、ｐ−エフェドリン／ロラタジン、テルブタリン硫酸塩、臭化チオトロピウム、（Ｒ、Ｒ）−フォルモテロール、ＴｇＡＡＴ、シロミラスト、ロフルミラストが挙げられる。
本明細書で提供される結合タンパク質を併用することができる乾癬の治療剤の非限定例には、以下：ＫＤＲの小分子阻害剤、Ｔｉｅ−２の小分子阻害剤、カルシポトリエン、クロベタゾールプロピオン酸塩、トリアムシノロンアセトニド、ハロベタゾールプロピオン酸塩、タザロテン、メソトレキセート、フルオシノニド、ベタメタゾンジプロピオン酸増強、フルオシノロンアセトニド、アシトレチン、タールシャンプー、ベタメタゾン吉草酸塩、モメタゾンフランカルボン酸塩、ケトコナゾール、プラモキシン／フルオシノロン、ハイドロコルチゾン吉草酸塩、フルランドレノリド、尿素、ベタメタゾン、クロベタゾールプロピオン酸塩／エモール、フルチカソンプロピオン酸塩、アジトロマイシン、ハイドロコルチゾン、保湿調合、葉酸、デソニド、ピメクロリムス、コールタール、ジフロラソン二酢酸塩、エタネルセプト葉酸塩、乳酸、メトキサレン、ｈｃ／ビスマスサブガル／ｚｎｏｘ／ｒｅｓｏｒ、メチルプレドニゾロン酢酸塩、プレドニゾン、日焼け止め剤、ハルシノニド、サリチル酸、アントラリン、クロコルトロンピバル酸塩、コール抽出物、コールタール／サリチル酸、コールタール／サリチル酸／イオウ、デソキシメタゾン、ジアゼパム、皮膚軟化剤、フルオシノニド／皮膚軟化剤、鉱物油／ヒマシ油／ｎａ ｌａｃｔ、鉱物油／ピーナッツ油、石油／ミリスチン酸イソプロピル、プソラレン、サリチル酸、石鹸／トリブロムサラン、チメロサール／ホウ酸、セレコキシブ、インフリキシマブ、シクロスポリン、アレファセプト、エファリズマブ、タクロリムス、ピメクロリムス、ＰＵＶＡ、ＵＶＢ、スルファサラジンが挙げられる。
本明細書で提供される結合タンパク質を併用することができるＳＬＥ（ループス）の治療剤の非限定例には、以下：ＮＳＡＩＤＳ、たとえば、ジクロフェナク、ナプロキセン、イブプロフェン、ピロキシカム、インドメタシン；ＣＯＸ２阻害剤、たとえば、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ；抗マラリア剤、たとえば、ヒドロキシクロロキン；ステロイド、たとえば、プレドニゾン、プレドニゾロン、ブデノシド、デキサメタゾン；細胞傷害剤、たとえば、アザチオプリン、サイクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、メソトレキセート；ＰＤＥ４の阻害剤又はプリン合成阻害剤、たとえば、セルセプトが挙げられる。本明細書で提供される結合タンパク質は、たとえば、スルファサラジン、５−アミノサリチル酸、オルサラジン、イムラン及びたとえば、ＩＬ−１のような炎症促進性サイトカインの合成、産生又は作用を妨害する剤、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤及びＩＬ−１ｒａのようなカスパーゼ阻害剤のような剤とも併用され得る。本明細書で提供される結合タンパク質は、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、たとえば、チロシンキナーゼ阻害剤；又はＴ細胞の活性化分子を標的とする分子、たとえば、ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧ若しくは抗−Ｂ７ファミリー抗体、抗−ＰＤ−１ファミリー抗体とともにも使用され得る。本明細書で提供される結合タンパク質は、Ｌ−１１又は抗−サイトカイン抗体、たとえば、フォノトリズマブ（抗−ＩＦＮｇ抗体）、又は抗−受容体受容体抗体、たとえば、抗−ＩＬ−６受容体抗体及びＢ−細胞表面分子に対する抗体と併用することができる。本明細書で提供される抗体又はその抗原結合部分は、ＬＪＰ３９４（アベチムス）、Ｂ−細胞を枯渇させる又は不活化する剤、たとえば、リツキシマブ（抗−ＣＤ２０抗体）、リンホスタット−Ｂ（抗−ＢｌｙＳ抗体）、ＴＮＦ拮抗剤、たとえば、抗−ＴＮＦ抗体、アダリムマブ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２９１３１；ＨＵＭＩＲＡ）、ＣＡ２（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）、ＣＤＰ５７１、ＴＮＦＲ−Ｉｇ構築物、（ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（ＥＮＢＲＥＬ）及びｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ （Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ））及びｂｃｌ−２阻害剤とともにも使用され得るが、トランスジェニックマウスにおけるｂｃｌ２の過剰発現はループス様の表現型を生じる原因であることが明らかにされているからである（Marquinaを参照のこと）。本明細書で提供される医薬組成物は「治療上有効な量」の又は「予防上有効な量」の本明細書で提供される結合タンパク質を含み得る。「治療上有効な量」は、所望の治療成績を達成するのに必要な投与量及び時間での有効な量を指す。結合タンパク質の治療上有効な量は、当業者によって決定されてもよく、たとえば、個体の疾患の状態、年齢、性別及び体重、及び個体にて所望の応答を引き出す結合タンパク質の能力に従って変化し得る。治療上有効な量はまた、抗体又は抗体結合部分の毒性効果又は有害効果に治療上有益な効果が上回るものでもある。「予防上有効な量」は、所望の予防成績を達成するのに必要な投与量及び時間での有効な量を指す。通常、予防上の用量は疾患に先立って又は疾患の早期段階で対象にて使用されるので、予防上有効な量は治療上有効な量よりも少ないであろう。
ＶＩＩ．診断
本開示はまた、診断アッセイ法、１以上の結合タンパク質を含有する診断用キット、及び自動化及び／又は半自動化された方式で使用するための方法及びキットの応用を含むが、これらに限定されない診断応用も提供する。提供される方法、キット及び応用は、個体における疾患又は障害の検出、モニタリング及び／又は治療にて採用され得る。これは以下でさらに明らかにされる。
本開示は、本明細書で記載されるような少なくとも１つの結合タンパク質を用いて試験試料における検体又はその断片の存在、量又は濃度を測定する方法も提供する。当該技術で既知のような好適なアッセイを方法にて使用することができる。例には、免疫アッセイ及び／又は質量分光分析を採用する方法が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示によって提供される免疫アッセイには、とりわけ、サンドイッチ免疫アッセイ、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、競合阻害免疫アッセイ、蛍光偏光免疫アッセイ（ＦＰＩＡ）、酵素多重免疫アッセイ法（ＥＭＩＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、及び均質化学発光アッセイが挙げられ得る。
化学発光微粒子免疫アッセイ、特にＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）自動化アナライザ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）を採用するものは免疫アッセイの一例である。
質量分光分析を採用する方法が本開示によって提供され、それには、ＭＡＬＤＩ（マトリクス支援レーザー脱離／イオン化）又はＳＥＬＤＩ（表面増感レーザー脱離／イオン化）が挙げられるが、これらに限定されない。
免疫アッセイ及び質量分光分析を用いて生物試験試料を採取する、取り扱う、処理する及び分析する方法は当業者に周知であり、本開示の実践にて（ＵＳ２００９−０３１１２５３）提供される。
試験試料における検体又はその断片の存在、量又は濃度について試験試料をアッセイするキットも提供される。キットは、検体又はその断片について試験試料をアッセイするための少なくとも１つの成分と、検体又はその断片について試験試料をアッセイするための指示書とを含む。検体又はその断片について試験試料をアッセイするための少なくとも１つの成分には、本明細書で開示されるような結合タンパク質を含む組成物、及び／又は任意で固相に不動化される抗検体結合タンパク質（又はその断片、変異体又はその変異体の断片）を挙げることができる。
任意で、キットは単離された又は精製された検体を含み得る較正器又は対照を含み得る。キットは、免疫アッセイ及び／又は質量分光分析によって検体について試験試料をアッセイするための少なくとも１つの成分を含むことができる。検体、結合タンパク質、及び／又は抗検体結合タンパク質又はそれらの断片を含むキットの成分は、当該技術で既知の検出可能な標識を用いて任意で標識され得る。本開示の実践に提供される創製のための材料及び方法は当業者に既知である（ＵＳ２００９−０３１１２５３Ａ１）。
本明細書で記載されるような免疫アッセイのようなアッセイによって試験試料における検体の存在、量又は濃度を測定する方法と同様にキットは、（固相が微粒子を含むものを含む）たとえば、米国特許第５，０８９，４２４号及び同第５，００６，３０９号に記載されたような、たとえば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）としてＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）から市販されているような種々の自動化された及び半自動化されて方式での使用に適合させることができる。
Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な他のプラットフォームには、他のプラットフォームと同様にＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭｘ（登録商標）（たとえば、米国特許第５，２９４，４０４号、ＰＲＩＳＭ（登録商標）、ＥＩＡ（ビーズ）及びＱｕａｎｔｕｍ（商標）ＩＩを参照）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アッセイ、キット及びキットの成分は、他の構成、たとえば、電気化学又は他の携帯式又はポイントオブケア式のアッセイ方式にて採用することができる。本開示は、たとえば、サンドイッチ免疫アッセイを実施する市販のＡｂｂｏｔｔポイントオブケア（ｉ−ＳＴＡＴ（商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学免疫アッセイ方式に適用することができる。免疫センサー及び単回使用の装置の製造及び操作の方法は、たとえば、米国特許第５，０６３，０８１号、同第７，４１９，８２１号及び同第７，６８２，８３３；及び米国特許公開番号２００４００１８５７７、２００６０１６０１６４及びＵＳ２００９０３１１２５３にて記載されている。
本明細書で記載される方法の他の好適な改変及び適合が明白であり、本明細書で開示される実施形態の範囲から逸脱することなく好適な同等物を用いて為し得ることは当業者に容易に明らかであろう。今や特定の実施形態を詳細に記載して、説明のみの目的で含まれ、限定することは意図されない以下の実施例の参照によって同じことがさらに明瞭に理解されるであろう。
ＶＩＩＩ．例示
さらなる限定として解釈されるべきではない以下の実施例によって本発明がさらに説明される。配列表、図面及び本出願で引用される参考文献、特許及び公開された特許出願のすべてが参照によって明白に本明細書に組み入れられる。
実施例１．ＤＶＤ−Ｆａｂ酵母ディスプレイベクターの構築
多重工程法にてＤＬＬ４／ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｆａｂ（抗−ＤＬＬ４クローンｈ１Ａ１１．１及び−ＶＥＧＦ抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む）を酵母発現ベクターｐＦａｂＢにクローニングした。手短には、ｈ１Ａ１１．１−短−抗ＶＥＧＦの領域をコードするＶＨをＰＣＲによって異なる発現ベクターから増幅し、相同組換えによってｐＦａｂＢに挿入した（ＳｐｅＩ及びＳａｌＩによって線状化した）。ｈ１Ａ１１．１−短−抗ＶＥＧＦの領域をコードするＶｋを同様に２工程重複ＰＣＲを用いて増幅した。第１のＰＣＲ工程は異なる発現ベクターからｈ１Ａ１１．１−短−抗ＶＥＧＦのＶｋ領域を増幅し、第２のＰＣＲ工程はＧＡＳリーダー配列を増幅した。次いで相同組換えによって、ｈ１Ａ１１．１−短−抗ＶＥＧＦのＶＨの正しい配列を含有する、ＢａｍＨＩとＢｓｉＷＩで線状化したｐＦａｂベクターに重複するＰＣＲ産物を挿入した。配列の確認の後、ｐＦａｂＢ−ｈ１Ａ１１．１−ＳＳ−抗ＶＥＧＦベクターで化学的に適格なＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を形質転換した。
細胞の誘導の際、染色を行って表面に発現されたｈ１Ａ１１．１−ＳＳ−ＶＥＧＦ ＤＶＤ−ＦａｂのＤＬＬ４（ヒト及びマウス）及びＶＥＧＦ双方への結合を確認した。酵母の表面における重鎖及び軽鎖の発現は約６０％であると判定された。３７℃で１時間の抗原との細胞のインキュベートの後、１００ｎＭでのｈｕＤＬＬ４及びｍｕＤＬＬ４への結合が認められ、３００ｎＭでのＶＥＧＦ−Ａｌｅｘａ６４７の結合が認められた。
実施例２．外側ドメイン親和性成熟のためのｈ１Ａ１１．１／ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｆａｂベクターの設計及び構築
配列比較は、ＤＬＬ４抗体、ｈ１Ａ１１．１がヒト生殖系列、ＶＨ３−７／ＪＨ４及びＯ２／ＪＫ２と最高の同一性を共有することを示した。ｍＡｂ、ｈ１Ａ１１．１の以前の親和性成熟に基づいて、ＶＨ−ＣＤＲ１及びＶＨ−ＣＤＲ２のみを変異誘発した。ｈ１Ａ１１．１のＶＨ−ＣＤＲ３及びＶＫの配列は不変のままにした。ｈ１Ａ１１．１のＤＬＬ４への親和性を改善するために、生殖系列ＶＨ３−７に対しても高い同一性を共有するＩｇＢＬＡＳＴデータベースにおける他のヒト抗体配列から超変異したＣＤＲ残基を特定した。次いで、親和性成熟法で使用するのに好適なＤＶＤ−ＩｇＦａｂ構成における抗体ライブラリを１つ創るためにこれらの位置で低い縮重を有するプライマーを伴うＰＣＲによる限定変異に、相当するｈ１Ａ１１．１のＣＤＲ残基を供した。ライブラリはＶＨのＣＤＲ１及び２における残基３０、３１、３２、３５、５０、５２、５２ａ、５５、５６、５７及び５８（Ｋａｂａｔ番号付け）にて変異を含有した。ｈ１Ａ１１．１のヒト生殖系列フレームワーク配列に対する同一性をさらに高めるために、ＶＨの７６位（Ｓ／Ｎ）で二成分の縮重をライブラリに導入した（表１）。ｈ１Ａ１１．１／ＶＥＧＦのＶＨを構築するために、ドープしたプライマーを用いて多重工程の重複ＰＣＲを行い、ｈ１Ａ１１．１のＶＨ−ＣＤＲ１及びＶＨ−ＣＤＲ２に変異を導入した。最終的なライブラリは短いリンカーを含有してＤＬＬ４とＶＥＧＦ可変ドメインを分離した（短いリンカーＶＨ配列＝ＡＳＴＫＧＰ；短いリンカーＶＬ配列＝ＴＶＡＡＰ）。ＳｐｅＩとＳａｌＩで以前線状化し、ｈ１Ａ１１．１／ＶＥＧＦのＶｋコーディング配列を含有するｐＦａｂＢに、導出したｈ１Ａ１１．１／ＶＥＧＦのＶＨのＰＣＲ産物を導入した。
実施例３．ｈ１Ａ１１．１／ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｆａｂ酵母ディスプレイライブラリを選別すること
実施例２で記載されたｈ１Ａ１１．１／ＶＥＧＦ ＤＶＤ−ＦａｂライブラリでＥＢＹ１００酵母細胞を形質転換し、ライブラリサイズを１．３×１０９であると決定した。次いで、酵母細胞表面上でそれを提示させ、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、次いで蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってＤＬＬ４細胞外ドメイン及びＶＥＧＦに対して選択した。１０倍の細胞を過剰採取し、１０倍の抗原過剰を用いてＭＡＣＳを２回行った。同様の条件を３回の選別に用いた。選別は、ライブラリ細胞の二重標識、最良のＤＬＬ４発現体と結合体ゲートをかけること及びＤＬＬ４とＶＥＧＦへの同時結合体を採取することによって行った。ＭＡＣＳ選別及びＦＡＣＳ選別のための条件はＭ＝ＭＡＣＳ選別及びＳ＝ＦＡＣＳ選別である表２に記載する。
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改善されたｈ１Ａ１１．１親和性クローンの選択は表２で示される条件下で行い、親和性調節されたｈ１Ａ１１．１クローンのアミノ酸配列はさらなる性状分析のためにＤＶＤ−ＩｇＧの構成に変換し戻すために回収された（表３を参照）。２回目及び３回目の細胞選別を介して合計１１のクローンを特定したが、クローンｈ１Ａ１１．１−Ａ０２−Ｓ３はＣＤＲ２にシステインを有したので１０のクローンのみをＤＶＤ−ＩｇＧの構成に変換した。
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実施例４．ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｆａｂ親和性成熟産物の性状分析
表３で特定し、記載した親和性成熟させたＤＬＬ４／ＶＥＧＦクローンを完全ＤＶＤ−Ｉｇ分子に変換した。クローンの５’及び３’の末端に相補性のプライマーを設計し、ＰＣＲによってクローンを増幅し、相同組換えによって哺乳類発現ベクターｐＨｙｂＥに導入した。細菌コロニーＰＣＲを行ったのち、各構築物のクローン１つを正しいと確認し、増やして、発現のためにＨＥＫ−２９３細胞に形質移入した。タンパク質上清を回収し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって精製した。クローンｈ１Ａ１１．１−Ｅ０６−Ｓ３はＨＥＫ−２９３細胞で非常に不十分に発現したので精製しなかった。精製した物質をＳＥＣ、ＭＳ、安定性アッセイ（表４を参照）及びＢｉａｃｏｒｅ（表５及び表６を参照）によるＤＶＤ−Ｉｇ分子の性状分析に利用した。安定性アッセイは、５℃にて１５ｍＭのヒスチジン緩衝液中の５０ｍｇ／ｍｌのＤＶＤ−Ｉｇで行った。０、８及び２１日目に単量体比率をモニターした。
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実施例５．ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｆａｂリンカーライブラリの設計及び構築
３つの異なる型のリンカー：標準の長／短リンカー、ＧＳリンカー及び剛性リンカー（リンカーのアミノ酸配列については表７及び／又は１１を参照）を用いてＤＬＬ４／ＶＥＧＦリンカーライブラリを構築した。ｈ１Ａ１１．１のＤＬＬ４配列に相補性の５’末端と抗ＶＥＧＦのＶＥＧＦ配列に相補性の３’末端を持つ各ＤＮＡリンカー配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成した。その型及び長さに基づいて６つの異なる群にて等モル量でオリゴヌクレオチドをプールした。以前のＤＬＬ４／ＶＥＧＦ親和性成熟（実施例３を参照）から単離したＤＬＬ４／ＶＥＧＦ Ｍ２Ｓを含有するＤＮＡを鋳型として用いて６つの異なるオリゴヌクレオチド群で別々にＰＣＲ反応を行った。ＶＨ及びＶＬのリンカーライブラリについての反応を別々に行った。各ＰＣＲ産物を精製し、濃縮し、等モル量で混合してＶＨ及びＶＬについてのリンカーライブラリを別々に含有する最終ＰＣＲ産物を生じた。次いでＶＨを含有するＰＣＲ産物とＶＬを含有するＰＣＲ産物を重複ＰＣＲによって１つの産物に組み合わせ、ＳｐｅＩ、ＳａｌＩ、ＢｓｉＷＩ及びＢａｍＨＩで線状化したｐＦａｂＢ発現ベクターに酵母のエレクトロポレーションによって組み換えた。異なる比率のベクターと挿入物を用い（μｇベクター／μｇ挿入物＝４／１２、４／１８及び４／２４）、酵母細胞の導出された集団を先ず別々に増殖させ、次いで各集団が１０倍過剰に試料採取できるような方法で最終的に一緒に合わせた。プールした集団で酵母コロニーのＰＣＲを行い、最終的なライブラリの多様性を決定した。配列分析の後、最終的なＤＬＬ４ Ｍ２Ｓ１を組み換えたリンカーライブラリのサイズは２．３×１０７であると決定され、各リンカーの亜型のリンカー分布は予測された分布に従った（表８を参照）。クローンの約６６％がＶＨ及びＶＬについて異なる型のリンカーの組換えを有する一方で、約３４％は同一型のリンカーの組換えを有することも認められた。
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実施例６．ＤＬＬ４Ｍ２Ｓ１／ＶＥＧＦを組み換えたリンカーライブラリの選別
スカウト実験を行ってライブラリの選別に最適な条件を決定した。好適な選択条件は３ｎＭのｍｕＤＬＬ４及び３００ｎＭのＶＥＧＦであることが見いだされた。ＤＬＬ４Ｍ２Ｓ１／ＶＥＧＦリンカーライブラリを１０倍過剰にし試料採取し、実施例３に記載されたように１０倍過剰の抗原で標識を行った。種々の条件下で異なる標識及び選別を行った（表９を参照）。抗原結合は３７℃で１５分間行った。合計５つの異なる産物を回収した。
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５つの異なる産物の配列分析の際、ライブラリを選別する最良の方法は二重染色を行い、同時結合体を回収する（ＤＬＬ４又はＶＥＧＦの最良の結合体のいずれかに先ずゲートをかけることによって）ことであると結論付けられた。５つのライブラリのための最良の抗原結合条件を決定する別のスカウト実験の後、２回目の選別を行った。室温で５分間、０．３ｎＭのＤＬＬ４及び１００ｎＭのＶＥＧＦの同時結合を行った。１回目で選別された集団２、４及び５（表９を参照）のみを２回目で選別した。標識及び選別の条件を表１０に示す。
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２回目の選別後のライブラリの多様性に基づいて３回目の選別を行う。具体的には、先ず、本明細書で記載された（実施例６を参照）ようにスカウト実験を行い、最適な抗原濃度を決定し、その結果に基づいて３回目の選別を行う。２回目の選別のように（表１０を参照）集団５にゲートをかけて、ＤＬＬ４の親和性とは無関係な、内側ドメイン（この場合、抗ＶＥＧＦ）の親和性改善に最も適合するリンカー対を特定する。２回目の選別のように（表１０を参照）集団２及び４にゲートをかけて、改善されたＤＬＬ４の結合及び多分ＶＥＧＦの結合を伴うＤＬＬ４／ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｉｇ分子を特定する。得られた酵母細胞をＳＤＣＡＡプレートに入れ、各プレートから９６のコロニーを選び取る。産物すべての配列分析を行って各集団の多様性を決定し、どのリンカー対が、内側ドメイン（抗ＶＥＧＦ）の親和性の改善、内側ドメイン（抗ＶＥＧＦ）の親和性を維持し及び／又は改善することによる外側ドメイン（ＤＬＬ４）の親和性の改善について好まれるのかを決定する。
実施例７．ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｆａｂ組換えリンカーライブラリ産物の性状分析
数回の選別を介して特定される最良の成績のＤＬＬ４／ＶＥＧＦ ＤＶＤ−Ｆａｂ組換えリンカーライブラリのクローンをＤＶＤ−Ｉｇ分子に変換し、実施例４に記載されたように性状分析する。
実施例８．内側ドメインの親和性成熟のためのＶＥＧＦ／ＤＬＬ４ ＤＶＤ−Ｆａｂリンカーライブラリの設計及び構築
実施例５におけるような３つの異なる型のリンカー：標準の長／短リンカー、ＧＳリンカー及び剛性リンカー（リンカーのアミノ酸配列については表７及び／又は１１を参照）を用いてＶＥＧＦ／ＤＬＬ４リンカーライブラリを構築した。抗ＶＥＧＦのＶＥＧＦ配列に相補性の５’末端とｈ１Ａ１１．１のＤＬＬ４配列に相補性の３’末端を持つ各ＤＮＡリンカー配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成した。その型及び長さに基づいて６つの異なる群にて等モル量でオリゴヌクレオチドをプールした。ｐＦａｂＢ−抗−ＶＥＧＦ−ＧＳ１４−ｈ１Ａ１１．１親ベクターＤＮＡを鋳型として用いて６つの異なるオリゴヌクレオチド群で別々にＰＣＲ反応を行った。ＶＨ及びＶＬのリンカーライブラリについての反応を別々に行った。各ＰＣＲ産物をゲル精製し、濃縮し、ＶＨ及びＶＬについてのリンカーライブラリを別々に含有する１つの最終ＰＣＲ産物を有するように等モル量で混合した。次いでＶＨを含有するＰＣＲ産物とＶＬを含有するＰＣＲ産物を重複ＰＣＲによって１つの産物に組み合わせ、ＳｐｅＩ、ＳａｌＩ、ＢｓｉＷＩ及びＢａｍＨＩで線状化したｐＦａｂＢ発現ベクターに酵母のエレクトロポレーションによって組み換えた。μｇベクター／μｇ挿入物＝４／１２の比を用い、酵母細胞の導出した集団を増殖させた。集団にて酵母コロニーのＰＣＲを行い、最終ライブラリの多様性を決定した。配列分析の後、最終的なＶＥＧＦ／ＤＬＬ４リンカーライブラリのサイズは３．５×１０７であると判定され、リンカーの型すべてが示された。実施例９にて記載したように数回の選別の後、内側ドメインの親和性成熟のためにこのライブラリをｈ１Ａ１１．１ＶＨライブラリで組み換えた。このｈ１Ａ１１．１ＶＨライブラリは実施例２にて記載したように設計され、ＶＥＧＦ／ＤＬＬ４ライブラリに由来するＤＮＡをＰＣＲの鋳型として使用する。予めＳｐｅＩ及びＳａｌＩで線状化し、ＶＥＧＦ／ｈ１Ａ１１．１Ｖｋリンカーライブラリのコーディング配列を含有するｐＦａｂＢに、導出したＶＥＧＦ／ｈ１Ａ１１．１ＶＨのＰＣＲ産物を導入する。
実施例９．ＶＥＧＦ／ｈ１Ａ１１．１ ＤＶＤ−Ｆａｂ酵母ディスプレイリンカーライブラリ及び内側ドメイン（ｈ１Ａ１１．１）の親和性成熟のための組換えライブラリを選別すること
エレクトロポレーションによってＶＥＧＦ／ｈ１Ａ１１．１ ＤＶＤ−Ｆａｂ酵母ディスプレイリンカーライブラリでＥＢＹ酵母細胞を形質転換し、次いでそれを細胞表面に提示させ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってＤＬＬ４細胞外ドメイン及びＶＥＧＦに対して選択する。実施例３にて示されたものに類似する方法で複数回の選別を行ってライブラリの多様性を減らすであろう。具体的には、選別は、ライブラリ細胞の二重染色、最良のＤＬＬ４発現体と結合体にゲートをかけること、及びＤＬＬ４とＶＥＧＦへの最良の同時結合体を回収することによって行う。次いで、改善されたｈ１Ａ１１．１親和性クローンについての選択を行い、さらなる性状分析のためのＤＶＤ−Ｉｇ構成への変換のために親和性調節したｈ１Ａ１１．１クローンのアミノ酸配列を回収する。
実施例１０．ＶＥＧＦ／ＤＬＬ４ ＤＶＤ−Ｆａｂ親和性成熟産物の性状分析
親和性調節したｈ１Ａ１１．１クローンを完全なＤＶＤ−Ｉｇ分子に変換し、実施例４にて記載したように性状分析した。
実施例１１．ＤＶＤ−Ｆａｂ酵母ライブラリの選別に異なる選択条件を適用する
ＩＬ１７／ＩＬ１α ＤＶＤ−Ｆａｂの合成ライブラリを生成し、エレクトロポレーションで酵母細胞に入れることによってｐＦａｂＢ酵母発現ベクターに組換える。以前生成した複数のＩＬ１７／ＩＬ１α ＤＶＤ−Ｉｇ分子の利用可能なデータに基づいて幾つかのＩＬ１７／ＩＬ１α ＤＶＤ−Ｆａｂを選択する。これらのＤＶＤ−Ｉｇ分子は広範に性状分析されており、既知の結合親和性及び効能、可溶性、安定性及び物理化学的な特性を有する。良好な、許容可能な及び不十分な物理化学的な特性を持つ幾つかのＤＶＤ−Ｉｇ分子を選択する。これらの分子をＰＣＲのＤＮＡ鋳型として用いて合成ライブラリを構築する。増幅された後、それらを等モル量で混合し、その後酵母を形質転換する。ＩＬ１７／ＩＬ１α ＤＶＤ−Ｆａｂライブラリは、選別のための異なる条件（塩濃度、緩衝液ｐＨ、異なる緩衝液、加熱及び考えられる他の方法）を用いて選択される。最良の物理化学的な特性を持つライブラリからのＤＶＤ−Ｉｇ分子の選択を可能にする選択圧を決定する。ＤＶＤ−Ｉｇ分子の親和性成熟の間にこの方法を任意で組み込んで改善された結合親和性を持つ分子だけでなく、改善された物理化学的な特性も持つ分子を選択する。
実施例１２．ＩＬ１β／ＩＬ１７混合及び一致のＤＶＤ−Ｆａｂライブラリの設計及び構築
ＩＬ１βに対する７つの外側ドメインｍＡｂ、ＩＬ１７に対する３つの内側ドメインｍＡｂ及び種々の長さの２種類のリンカー用いてＩＬ１β／ＩＬ１７混合及び一致のライブラリを構築した（表１１を参照）。重複ＰＣＲ戦略を用いてライブラリを構築した（図３を参照）。２群：（１）外側ドメインのｍＡｂ配列にアニーリングし、リンカー型の最短リンカー長さのＤＮＡ配列をコードする逆行プライマー（すなわち、ＶＨ６）及び（２）内側ドメイン配列にアニーリングし、リンカーの全体のＤＮＡ配列をコードする正行プライマーにてオリゴヌクレオチドを設計し、合成した。適当なプライマーを用いて；内側ドメインについては、プライマーのオリゴヌクレオチドすべてを型によってプールした（すなわち、全エルボーＶＨ）。各ｍＡｂのＶＨ及びＶＬを別々にＰＣＲ増幅した。Ｑｉａｇｅｎ ＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて各ＰＣＲ産物をきれいにし、２回目のＰＣＲについて合計１６プールのｍＡｂ系列及びリンカーの型によってグループ分けされた等量にてプールした。たとえば、４つのプールは、ＶＨドメイン：エルボーリンカーを持つ１Ｂ１２系列；ＧＳリンカーを持つ１Ｂ１２系列；エルボーリンカーを持つＥ２６系列；ＧＳリンカーを持つＥ２６系列について創られた。４つの別々のＰＣＲ反応物、たとえば、（1）１Ｂ１２系列＋エルボーリンカー＋Ｂ６系列、（２）１Ｂ１２系列＋エルボーリンカー＋１０Ｆ７Ｍ１１、（３）１Ｂ１２系列＋ＧＳリンカー＋Ｂ６系列、（４）１Ｂ１２系列＋ＧＳリンカー＋１０Ｆ７Ｍ１１にて重鎖及び軽鎖をそれぞれ組み立てた。２回目のＰＣＲ反応物をゲル精製し、等量の重鎖ＰＣＲ、軽鎖ＰＣＲ及びプロモータＰＣＲを３回目のＰＣＲに用いた。３回目のＰＣＲ産物をゲル精製し、濃縮し、次いで線状化したｐＦａｂＢ発現ベクターに酵母エレクトロポレーションによって組み換えた。ｐＦａｂＢ発現ベクターをＳａｌＩ、ＢｓｉＷＩ及びＢａｍＨＩによって線状化し、次いでゲル精製し、濃縮した。希釈プレーティングに基づいてライブラリのサイズを３×１０８メンバーで推定した。ライブラリ酵母細胞を増殖させた後、酵母細胞からライブラリＤＮＡを単離し、大腸菌を形質転換し、コロニーＰＣＲ及び配列決定を行って最終的なライブラリの分布を決定した（表１２を参照）。
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実施例１３．フローサイトメトリーによるＩＬ１β／ＩＬ１７ ＤＶＤ−Ｆａｂライブラリの選択
ライブラリの選別にとって最適な選択条件はスカウト実験から５ｎＭのＩＬ１β及び５ｎＭのＩＬ１７であることが決定された。厳密性を高めることによって複数回の選択を完了した（表１３を参照）。選択すべてについて選別ゲートはＩＬ１β及びＩＬ１７双方への最良な同時結合体を採取するように選択した。各選別回の後、ライブラリＤＮＡを酵母細胞から単離し、それで大腸菌を形質転換し、コロニーＰＣＲ配列決定を行って選別産物を分析した。表１及び表に列記されるのは３回目の産物の配列である。実施例４にて記載されたように性状分析のためにライブラリ産物クローンを完全ＤＶＤ−Ｉｇ構成に変換する。
Figure 2016510319
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実施例１４．酵母ディスプレイのための完全長ＤＶＤ−Ｉｇの構築
ＤＶＤ−Ｆａｂ及び完全長ＤＶＤ−Ｉｇの双方としてＤＬＬ４／ＶＥＧＦ ＤＶＤ（抗ＤＬＬ４抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む）をｐＦａｂＢ酵母発現ベクターにクローニングした。手短には、ＤＶＤのＶＬをコードする領域を増幅し、停止コドンを除く、ｐＦａｂＢベクターとＤＶＤ重鎖（ＶＨ領域又は完全なＶＨ＋Ｆｃのいずれか）の部分に重複ＰＣＲで結合させた。完全長のＤＶＤについては、クローニング目的でｐＦａｂベクターの別の部分も重複ＰＣＲに含めた。ＤＶＤ−Ｆａｂ構築物については、ｐＦａｂＢをＢｓｉＷＩ、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで線状化し;ＤＶＤ−Ｉｇについては、ｐＦａｂＢをＢｓｉＷＩ、ＢａｍＨＩ及びＰａｃＩで線状化し、相同組換えによってＰＣＲ産物を挿入した。配列確認の後、化学的に適格なＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞をＤＶＤ−Ｆａｂ及びＤＶＤ−Ｉｇ酵母ディスプレイベクターで形質転換した。
実施例１５．完全長ＤＶＤ−Ｉｇ酵母細胞のフローサイトメトリー解析
タンパク質発現について酵母細胞を誘導し、その後フローサイトメトリー染色実験を行ってディスプレイ及び抗原結合を検証した。ＤＶＤ−Ｆａｂ又はＤＶＤ−Ｉｇの重鎖のディスプレイをＶ５タグの染色によってモニターし、抗ｈＣＫ試薬の使用によって軽鎖をモニターし、完全長ＤＶＤ−Ｉｇの存在をポリクローナル抗ｈＦｃ試薬によってモニターした。表は、種々の染色試薬を用いて重鎖及び軽鎖のディスプレイを示す細胞のパーセントを列記する。完全長ＤＶＤ−Ｉｇのみが抗ｈＦｃ試薬との反応性を示すことに留意のこと。ＶＥＧＦ（ビオチン化ＶＥＧＦ及びストレプトアビジン−ＰＥを用いて視覚化される）及びＤＬＬ４（Ａｌｅｘａ６４７に抱合されたＤＬＬ４）の双方への同時抗原結合は、ＤＶＤ−Ｆａｂ及びＤＶＤ−Ｉｇ双方について観察された。表は、抗Ｖ５陽性細胞の抗原結合についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
Figure 2016510319
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実施例１７．単鎖二重可変ドメイ分子の生成
ＤＶＤ−Ｉｇに由来するｓｃＤＶＤの設計を図４にて模式的に示す。比較のためにＤＶＤ−Ｉｇ（図４Ｂ）及びｓｃＦｖ（図４Ｃ）の模式図も提示されている。ｓｃＤＶＤタンパク質は、３０、３５、４０又は４５のアミノ酸のＧｌｙ４Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＶＬドメインのアミノ末端に繋がれるＶＨドメインのカルボキシ末端を伴ったその全体にてＤＶＤ−Ｉｇの可変重鎖及び可変軽鎖の双方を含む。ＶＨ１及びＶＨ２は６〜１４のアミノ酸の特定のリンカー配列に接続されて対合する。ＶＬ１及びＶＬ２は６つのアミノ酸の特定のリンカー配列に接続されて対合する。可変領域をコードする配列はＤＶＤ−Ｉｇ発現ベクターからＰＣＲで増幅される。プライマーは、増幅されたＤＮＡが必要な重複配列を有して追加の重複ＰＣＲを行うような方法で設計される。最終的な断片は、ＶＨドメインと、長いＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーと、ＶＬドメインと、酵母の表面でのｓｃＤＶＤの発現をモニターするのに使用されるペプチドタグとを含有する。ＤＨ５αで化学的に適格な細菌を用いて相同組換えによって構築物をｐＹＤ酵母発現ベクターにクローニングする。正しい構築物の存在について細菌コロニーＰＣＲによって形質転換に由来するクローンをスクリーニングする。
ＶＨドメイン又はＶＬドメインを連結することについて幾つかの異なるリンカー配列を評価した（図５を参照）。ＳＬリンカーは、ＩｇＧ１定常領域の最初の６〜１４アミノ酸（ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳ）に相当し、又はＩｇＫ定常領域の最初の６〜１４アミノ酸（ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳ）に相当する。ＧＳリンカーはＧｌｙ４Ｓｅｒの反復を伴う６〜１４アミノ酸に相当する。ＲＬリンカーはプロリンが豊富な６〜１４アミノ酸の配列に相当する。
実施例１８．酵母の表面におけるｓｃＤＶＤの発現
酵母の表面におけるｓｃＤＶＤの発現及び発現をモニターするために選択されたエピトープタグの安定性を評価した。ｓｃＤＶＤエピトープタグに対する抗体を用いたフローサイトメトリー解析によって酵母の表面におけるｓｃＤＶＤの発現をモニターした。酵母の表面におけるｓｃＤＶＤの発現はｓｃＦｖ分子について観察されたのに匹敵し、ｓｃＤＶＤ構築物を発現する酵母細胞の約５０％であることが見いだされた（図６Ａ）。しかしながら、ｓｃＤＶＤの発現がｓｃＦｖに比べて低い平均蛍光強度を示すということは、単一の細胞によって少ない数のｓｃＤＶＤ分子が発現されたことを示唆している。図６Ａ（右の点線のプロット）は、２つの異なる酵母培養物（一方がｓｃＤＶＤを発現し、別のがｓｃＦｖを発現する）を同一チューブで標識する場合のこの差異を示す。双方の構築物は細胞の約５０％で発現される（データは示さず）が、ｓｃＦｖクローンは高い平均蛍光を有する。
長いＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーの長さはｓｃＤＶＤを発現する細胞の能力に大きくは影響しなかった。３０アミノ酸のＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーは発現に否定的な影響を有すると思われる一方で、３５、４０又は４５アミノ酸のＧｌｙ４Ｓｅｒを用いた場合の発現との差異はなかった（図６Ｂ）。
実施例１９．ｓｃＤＶＤは双方の標的を結合するＤＶＤ−Ｉｇの能力を保持する
３つの異なるタグ（ＡｃＶ５、Ｅ又はＳｔｒｅｐＩＩのペプチドタグ）を伴ったｐＹＤベクターを用いて酵母の表面上でｓｃＤＶＤとして２つの異なるＤＶＤ−Ｉｇを発現させた。同じ条件及び濃度のもとでビオチン化抗原と共に各構築物をインキュベートした。それぞれマウス、ヤギ及びウサギで作製したエピトープタグに特異的な抗体を用いてｓｃＤＶＤの発現をモニターした。蛍光色素で標識したロバ抗マウス、抗ヤギ又は抗ウサギ抗体を検出試薬として用いた。平均蛍光を各個々の点線のプロットで示す。ＤＬＬ４／ＶＥＧＦｓｃＤＶＤはＤＬＬ４及び／又はＶＥＧＦの双方を結合するその能力を保持する（図７Ａ）。ｓｃＤＶＤをＤＬＬ４、ＶＥＧＦ又は２つの抗原の混合物と共にインキュベートした場合、結合（平均蛍光強度）に差異はない。同様の知見はＴＮＦ／ＳＯＳＴｓｃＤＶＤについても認められた。このｓｃＤＶＤはＴＮＦ及び／又はスクレロスチンの双方を結合する能力を保持する（図８）。ｓｃＤＶＤをＴＮＦ、ＳＯＳＴ又は２つの抗原の混合物と共にインキュベートした場合、結合（平均蛍光強度）に差異はない。酵母細胞は細胞表面上でｓｃＤＶＤの多数のコピーを発現し、その結果、双方の抗原への同時結合は理論的には、一方の抗原に結合する細胞上の一部のｓｃＤＶＤ分子及び第２の抗原に独立して結合する同じ細胞上の他のｓｃＤＶＤ分子のせいであり得る。しかしながら、ｓｃＤＶＤを一方の抗原、他方の抗原又は双方の抗原の混合物と共にインキュベートした場合、平均蛍光が変化しないということは、ｓｃＤＶＤ分子が双方の抗原を同時に結合していることを示唆している。
実施例２０．酵母の表面におけるその発現をモニターするのに使用されるタグに関係なくｓｃＤＶＤは双方の抗原を結合する。
酵母ディスプレイでは、発現タグは抗体の発現をモニターし、発現のための抗原結合シグナルを基準化するのに使用されるので宿主の発現の偏りによる人為的な結果を排除する。このことは、その標的に向けられた異なる親和性を持つ変異体間の細かな区別を可能にする。酵母の表面におけるその発現をモニターするのに使用されるタグにかかわらず、所与の機能的なＤＶＤ−ＩｇがｓｃＤＶＤとして発現される場合、その同族標識に向けられた結合能を維持するかどうかを判定するために実験を行った。具体的には、３つの異なるタグ（ＡｃＶ５、Ｅ又はＳｔｒｅｐＩＩのペプチドタグ）を用いて酵母の表面上にてｓｃＤＶＤとしてＴＮＦ／ＳＯＳＴ ＤＶＤ−Ｉｇを発現させた。同一の条件及び濃度のもとで３つの構築物を同一のビオチン化抗原（ＴＮＦ及びスクレロスチン）に暴露した。マウス（抗ＡｃＶ５；Ａｂｃａｍ）、ヤギ（抗Ｅ；Ａｂｃａｍ）及びウサギ（抗ＳｔｒｅｐＩＩ；ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）で作製したタグに特異的な抗体を用いてｓｃＤＶＤの発現をモニターした。蛍光色素を標識したロバ抗マウス（ＰｅｒＣＰ）、抗ヤギ（ＰＥ）又は抗ウサギ（ＤｙＬｉｇｈｔ４８８）抗体を検出試薬として用いた（本明細書の表１８〜２０を参照）。ＡＰＣを結合したストレプトアビジン又はＤｙＬｉｇｈｔ３３を結合したニュートラアビジンによって抗原結合をモニターした。フローサイトメトリーによって試料すべてを解析した。図８は、酵母の表面におけるｓｃＤＶＤの発現及び結合をモニターするのに異なるペプチドタグを使用することは実現可能であることを示す。
実施例２１．ＴＮＦ／ＳＯＳＴ ｓｃＤＶＤに由来するライブラリの結合選択は親ｓｃＤＶＤに比べて改善された発現及び結合を明らかにする
酵母の表面にて発現されるｓｃＤＶＤ構成のＤＶＤ−Ｉｇを増強し、親和性成熟させる能力を調べるために異なるライブラリを用いてＴＮＦ／ＳＯＳＴ ＤＶＤ−Ｉｇの親和性成熟を行った。ＳＯＳＴ可変ドメインの異なるＣＤＲにて限定された変異を含有するようにこれらのライブラリを構築した。ＴＮＦ／ＳＯＳＴ ｓｃＤＶＤのタンパク質配列を図９Ａにて示す。これらのライブラリを設計するために、他のヒト抗体配列から超変異したＣＤＲ残基を特定した。次いで、低い縮重（７９％親ヌクレオチド及び２１％他の３つのヌクレオチドすべて）を有して酵母表面ディスプレイに好適なｓｓＤＶＤ構成にて３つの抗体ライブラリを創るプライマーを伴ったＰＣＲによる限定された変異誘発に、相当するＳＯＳＴのＣＤＲ残基を供した。第１のライブラリ（Ｈ１＋Ｈ２）はＳＯＳＴのＶＨドメインのＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２にて変異を含有した。第２のライブラリ（Ｈ３）はＳＯＳＴのＶＨドメインのＨＣＤＲ３にて変異を含有し、第３のライブラリはＳＯＳＴのＶＬドメインのＣＤＲすべてにて変異を含有した。ヒトの生殖系列フレームワークに対するＳＯＳＴ可変ドメインの同一性をさらに高めるために、特定の位置での二元縮重（５０％親５０％生殖系列）をライブラリに導入し、特定の残基は生殖系列だった（図９Ｂを参照）。導入された変化は以下のとおりだった：
Ｈ１＋Ｈ２のライブラリ
・残基の限定された変異誘発：Ｄ３０、Ｄ３１、Ｓ５２、Ｈ５３、Ｇ５４、Ｄ５５、Ｆ５６及びＤ５８
・生殖系列の７残基：Ｇ１６Ｒ、Ｔ２３Ａ、Ｓ７４Ａ、Ｔ７７Ｓ、Ｇ８２ｂＳ、Ｍ８７Ｔ、Ｉ８９Ｌ
Ｈ３ライブラリ
・残基の限定された変異誘発：Ｎ９５、Ｎ９６、Ｒ９７、Ｇ９８、Ｙ９９、Ｇ１００、Ｇ１００ａ、Ｌ１００ｂ
・生殖系列の７残基：Ｇ１６Ｒ、Ｔ２３Ａ、Ｓ７４Ａ、Ｔ７７Ｓ、Ｇ８２ｂＳ、Ｍ８７Ｔ、Ｉ８９Ｌ
・ＳＯＳＴのＶＨとＧ９４Ｋでの生殖系列との間での二元縮重
ＬＣライブラリ
・残基の限定された変異誘発：Ｓ２７、Ｓ３０、Ｔ３２、Ｓ４０、Ｓ９４
・残基Ｎ９５ａにおけるＮＮＫ無作為化：Ｎ９５ａ、Ｇ９５ｂ及Ｓ９５ｃ
・ＳＯＳＴのＶＬとＧ３Ｖでの生殖系列との間での二元縮重
これらのライブラリ（図９Ｂを参照）で別々に形質転換させ、それを酵母細胞上に提示させ、磁気活性化細胞選別、次いで蛍光活性化細胞選別によってビオチン化されたスクレロスチン及びＴＮＦの低濃度に対して選択した。ＳｔｒｅｐＩＩ、ＦＬＡＧ又はＥの１つによって各ライブラリに異なるタグを付けた。本明細書の表１９及び２０に記載される抗体を用いて上述のようにフローサイトメトリーによってｓｃＤＶＤの発現及び抗原結合をモニターした。
２回及び４回の選択の後、スクレロスチンに対する結合は親分子の結合に比べて顕著に改善された。親ＴＮＦ／ＳＯＳＴ ｓｃＤＶＤは３７℃で１時間のインキュベートの後３００ｎＭのスクレロスチンに結合する。親分子を３０ｎＭのスクレロスチンとインキュベートした場合、結合は認められなかった。それに対して、２回の選択の後、Ｈ３ライブラリは３０ｎＭのスクレロスチンへの結合を示し、４回の選択の後、ライブラリ産物を室温で２０分間インキュベートした場合、３０ｎＭのスクレロスチンへの結合が認められる（図９Ｃを参照）。同様の改善はＨ１＋Ｈ２ライブラリ及びＬＣライブラリについても認められた。
いったん、各ライブラリの多様性が約１０３に減らされると、各産物からプラスミドＤＮＡを単離し、ライブラリをＰＣＲによって新しいライブラリ（ｒＨＣ＋ＬＣ）に組み換える。このライブラリで酵母細胞を形質転換してビオチン化スクレロスチンに対して選択される細胞表面上でそれを提示させた。選択の後、親和性の改善は非常によく知られる。指摘されるように親構築物は３７℃で１時間インキュベートした場合、３００ｎＭのスクレロスチンを結合することができる。ｒＨＣ＋ＬＣライブラリ産物は、６回の選択の後、４℃でたった２０秒間インキュベートすると０．１ｎＭのスクレロスチンを結合することができる。親和性の正式な定量は行っていないが、この結果に基づいて１００倍を超える改善が期待される。ｓｃＤＶＤに基づいたライブラリがさらに良好な結合体について選択され、濃縮され得るのは明らかである。
実施例２３．ＴＮＦ／ＳＯＳＴ ｓｃＤＶＤライブラリの結合選択はＶＬドメイン間のＳＬリンカーの濃縮を示す
上記で議論されたように、ＤＶＤ−Ｉｇ抗体の構築及び最適化の間でのリンカーの操作に対する明瞭なニーズがある。内側ＶＤのリガンド結合部位に対する外側可変ドメインの近接性による立体障害は、少なくとも部分的に、内側可変ドメインとして操作する際、ドメインの親和性低下に関与し得る。従って、ＤＶＤ−ＩｇにおけるＶＨ対又はＶＬ対へのリンカーを操作するのにｓｃＤＶＤのアプローチが使用され得るかどうかを判定するために実験を行った。この目的で、１２の異なるリンカー：ＩｇＫ定常領域の最初の６、８、１０及び１２アミノ酸に相当する４つのＳＬリンカー；６、８、１０及び１２アミノ酸のＧｌｙ４Ｓｅｒの反復を持つ４つのＧＳリンカー；及び６、８、１０及び１２アミノ酸に相当する４つのプロリンリッチＲＬリンカー（図１０Ａを参照）を導入することによってＴＮＦ／ＳＯＳＴ ｓｃＤＶＤライブラリを作製した。さらに、ＮＮＫ無作為化によってＳＯＳＴ ＶＬのＬＣＤＲ３の残基Ｓ９４、Ｎ９５ａ、Ｇ９５ｂ及びＳ９５ｃを変異させた。異なる条件下で異なる濃度のスクレロスチンを用いた４回の選択の後、ライブラリ産物は特に最長サイズのＲＬリンカーで濃縮を示した（１２及び１０アミノ酸；３〜７倍の間）。また、ＧＳリンカーは有意に減少した（６〜８倍の間）（図１０Ｂを参照）。このデータはｓｃＤＶＤに基づいた酵母表面ディスプレイがＶＨ対又はＶＬ対に対するリンカーの最適化及び操作を可能にすることを明瞭に実証している。
Figure 2016510319
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実施例２４．定常領域を含む単鎖二重可変ドメインＦａｂ（ｓｃＤＶＤＦａｂ）の生成
ＤＶＤ−Ｉｇに由来するｓｃＤＶＤＦａｂの別の設計を図１３に模式的に示す。比較のために、ＤＶＤ−Ｉｇ（図１３Ｂ）及びｓｃＤＶＤ（図１３Ｃ）の模式図も提示されている。この実施例では、ｓｃＤＶＤＦａｂタンパク質は、重鎖のＣＨ１領域及び軽鎖のκ定常領域（Ｃκ）を伴ったその全体にてＤＶＤ−Ｉｇの可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を含む。図１３Ａに示すように、Ｃκに融合させたＶＬドメインは、Ｃκ領域のカルボキシ末端からＶＨドメインのアミノ末端までの４１、４９、５７又は６５アミノ酸のＧＳ剛性ペプチドリンカーを介してＣＨ１に融合させたＶＨドメインに繋がれる。これらのリンカーは以下でさらに詳細に示される。ＶＬ１及びＶＬ２は、すでに記載され、ＤＶＤ−Ｉｇ及びｓｃＤＶＤで使用される特定のリンカーと接続して対合する。ＶＨ１及びＶＨ２の対も同様である。図１４ＡはｓｃＤＶＤＦａｂ線状配列の模式的説明を含有する。
可変領域をコードする配列をＤＶＤ−Ｉｇ発現ベクターからＰＣＲで増幅した。増幅したＤＮＡが必要な重複配列を有して追加の重複ＰＣＲを行えるような方法でプライマーを設計した。最終的な断片は、図１４Ａで表される線状配列に加えて酵母の表面にてｓｃＤＶＤの発現をモニターするのに使用されるペプチドタグを含有した。化学的に適格な細菌であるＤＨ５αを用いて相同組換えによって構築物をｐＹＤ酵母発現ベクターにクローニングした。正しい構築物の存在について細菌コロニーＰＣＲによって形質転換に由来するクローンをスクリーニングした。
ＧＳ剛性リンカー
異なるＧｌｙ／Ｓｅｒ断片とプロリンリッチ剛性断片の組み合わせによってＧＳ剛性リンカーを作製した。リンカーの配列を以下に示し、ＧＳ剛性リンカーの模式図は図１４Ｂにて見いだされ得る。さらに具体的には、ＧＳ剛性リンカーは以下として構成される：
Ｎ−末端−Ｇ３ＳＧ３−左剛性断片−Ｇ２ＳＧ２−右剛性断片−Ｇ３ＳＧ３−Ｃ−末端
その際、剛性断片は長さ及びアミノ酸組成が変化する。以下の剛性断片が調べられている；
リンカーにおける右剛性断片：
ＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴ １１ ＡＡ （配列番号：）
ＴＰＡＰＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴ １５ ＡＡ （配列番号：）
ＴＰＡＰＬＰＡＰＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴ １９ ＡＡ （配列番号：）
ＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴ ２３ ＡＡ （配列番号：）
リンカーにおける左剛性断片
ＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴ １１ ＡＡ （配列番号：）
ＴＰＬＰＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴ １５ ＡＡ （配列番号：）
ＴＰＬＰＡＰＬＰＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴ １９ ＡＡ （配列番号：）
ＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴ ２３ ＡＡ （配列番号：）
４１アミノ酸のＧＳ剛性リンカー
ＧＧＧＳＧＧＧＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴＧＧＳＧＧＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴＧＧＧＳＧＧＧ （配列番号：）
４９アミノ酸のＧＳ剛性リンカー
ＧＧＧＳＧＧＧＴＰＬＰＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴＧＧＳＧＧＴＰＡＰＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴＧＧＧＳＧＧＧ （配列番号：）
５７アミノ酸のＧＳ剛性リンカー
ＧＧＧＳＧＧＧＴＰＬＰＡＰＬＰＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴＧＧＳＧＧＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴＧＧＧＳＧＧＧ （配列番号：）
６５アミノ酸のＧＳ剛性リンカー
ＧＧＧＳＧＧＧＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴＧＧＳＧＧＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴＧＧＧＳＧＧＧ （配列番号：）
実施例２５．酵母の表面におけるｓｃＤＶＤＦａｂの発現
酵母の表面にてｓｃＤＶＤＦａｂを発現させたところ、選択されたペプチドタグはその発現をモニターするのに好適だった。フローサイトメトリーによって酵母の表面におけるｓｃＤＶＤＦａｂの発現をモニターし、抗体を用いてペプチドタグを検出した。ｐＹＤベクター及び４つの異なるＧＳ剛性リンカーを用いて酵母の表面におけるｓｃＤＶＤＦａｂとしてＤＶＤ−Ｉｇを発現させた。酵母の表面におけるｓｃＤＶＤＦａｂの発現は、構築物を発現する酵母細胞の５０％余りに達するｓｃＦｖ分子で見られるものに匹敵した（図１５）。ＧＳ剛性リンカーはｓｃＤＶＤＦａｂを発現する細胞の能力に影響しなかった。
実施例２６．ｓｃＤＶＤＦａｂは双方の標的を結合するＤＶＤ−Ｉｇの能力を保持した
ｓｃＤＶＤＦａｂとして発現させた機能的なＤＶＤ−Ｉｇは酵母の表面にて２つの抗原に向けられた結合能を維持した。ｐＹＤベクターを用いて酵母の表面上にてＤＶＤ−ＩｇをｓｃＤＶＤＦａｂとして発現させた。酵母培養物のアリコートをビオチン化抗原と共にインキュベートした。精製したタグ特異的な抗体によってｓｃＤＶＤＦａｂの発現をモニターした。蛍光色素を標識した二次抗体を検出試薬として使用した。ＩＬ−１／ＩＬ１７ｓｃＤＶＤＦａｂはＩＬ１Ｂ及び／又はＩＬ１７の双方を結合する能力を保持する（図１６及び図１７）。
実施例２７．双方のタグへの結合は酵母の表面にて発現されたｓｃＤＶＤＦａｂとＤＶＤ−Ｆａｂの構成の間で同等である
ｓｃＤＶＤＦａｂ構築物はそれらを結合するＤＶＤ−Ｆａｂと類似の方法で双方の抗原を結合した。ｐＹＤベクターを用いてＤＶＤ−Ｉｇを酵母の表面にてｓｃＤＶＤＦａｂ及びＤＶＤ−Ｆａｂとして発現させた。酵母培養物のアリコートをビオチン化抗原と共にインキュベートした。精製したタグ特異的な抗体によってｓｃＤＶＤＦａｂ及びＤＶＤ−Ｆａｂの発現をモニターした。蛍光色素を標識した二次抗体を検出試薬として用いた。ｓｃＤＶＤＦａｂ及びＤＶＤ−Ｆａｂは酵母の表面にてＩＬ１Ｂ及びＩＬ１７の双方に対して類似の結合特性結合を有した。ＤＶＤ−Ｆａｂに比べてｓｃＤＶＤＦａｂ平均蛍光で小さな上昇があった（図１６及び図１７）。
実施例２８．交差ＤＶＤ−Ｉｇ構成の設計及び構築
図１８は構成２のＤＶＤ−Ｉｇ分子の構成モデルを示す。この構成における可変ドメインが連結される方法のために、内側結合ドメインは完全に露出され得る。リンカーの異なる長さの効果を評価し、ＶＨ１がＶＬ１との機能的な結合ドメインを形成することができる一方で、ＶＨ２がＶＬ２との機能的な結合ドメインを形成することができることを保証するために、種々のリンカーの長さを調べた。７アミノ酸のリンカーをＶＬ２とＶＬ１の間で用い、５アミノ酸のリンカーをＶＬ１とＣＬの間で用い、１アミノ酸のリンカーをＶＨ１とＶＨ２の間で用い、２アミノ酸のリンカーをＶＨ２とＣＨ１の間で用いる。たとえば、米国特許出願番号ＵＳ２０１２０２５１５４１ Ａ１を参照のこと。
ＤＶＤ１２８６及びＤＶＤ１２８２における可変ドメインを用いて交差ＤＶＤ−Ｉｇ構成２を調べる。種々のクローンの配列を表２１に列記する。「ｖｈ」で終わる配列の名称はＣＨ１−Ｆｃ（又はＣＨ−（Ｘ４）ｎ）に対してＮ末端側に置かれる。「ｖｌ」で終わる配列の名称はＣｋ（又はＣＬ−（Ｘ２）ｎ）に対してＮ末端側に置かれる。同一クローンからの配列を対合させて交差ＤＶＤ−Ｉｇを形成する。
Figure 2016510319
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実施例２９．交差ＤＶＤ−Ｉｇ構成１０の設計及び構築
図１８は構成１０のＤＶＤ−Ｉｇ分子の構成モデルを示す。この構成における可変ドメインが連結される方法のために、内側結合ドメインは完全に露出され得る。リンカーの異なる長さの効果を評価し、ＶＨ１がＶＬ１との機能的な結合ドメインを形成することができる一方で、ＶＨ２がＶＬ２との機能的な結合ドメインを形成することができることを保証するために、種々のリンカーの長さを調べた。ＧＧＧＳＧＧＧＧの配列を有するリンカーをＶＬ２とＶＨ１の間で用い、ＬＧＧＣＧＧＧＳの配列を有するリンカーをＶＨ１とＣＨ１の間で用い、ＧＧＧＳＧＧＧＧの配列を有するリンカーをＶＬ１とＶＨ２の間で用い、ＬＧＧＣＧＧＧＳの配列を有するリンカーをＶＨ２とＣＬの間で用いる。たとえば、米国特許出願番号２００９００６０９１０Ａ１を参照のこと。リンカーの長さ及び配列にて種々の変更を行って選択を最適化し得る。
ＤＶＤ１２８６及びＤＶＤ１２８２における可変ドメインを用いて交差ＤＶＤ−Ｉｇ構成１０を調べる。種々のクローンの配列を表２２に列記する。「ｖｈ」で終わる配列の名称はＣＨ１−Ｆｃ（又はＣＨ−（Ｘ４）ｎ）に対してＮ末端側に置かれる。「ｖｌ」で終わる配列の名称はＣｋ（又はＣＬ−（Ｘ２）ｎ）に対してＮ末端側に置かれる。同一クローンからの配列を対合させて交差ＤＶＤ−Ｉｇを形成する。
Figure 2016510319
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実施例３０．交差ＤＶＤ−Ｉｇ構成１１の設計及び構築
図１８は構成１１のＤＶＤ−Ｉｇ分子の構成モデルを示す。この構成における可変ドメインが連結される方法のために、内側結合ドメインは完全に露出され得る。リンカーの異なる長さの効果を評価し、ＶＨ１がＶＬ１との機能的な結合ドメインを形成することができる一方で、ＶＨ２がＶＬ２との機能的な結合ドメインを形成することができることを保証するために、種々のリンカーの長さを調べた。ＶＨ１とＶＬ１の間のモデル化した考えられる相対的な位置及びＶＨ２とＶＬ２の間の相対的な位置に基づいて、ＶＨ２とＶＬ１の間のリンカーは長さ３〜１２アミノ酸であり、ＶＬ１とＣＨ１の間のリンカーは長さ３〜８アミノ酸であり、ＶＨ１とＶＬ２の間のリンカーは長さ５〜１２アミノ酸であり、ＶＬ２とＣＬの間のリンカーは長さ１〜３アミノ酸である。リンカーの長さ及び配列における種々の変更を行って抗原結合ドメインの形成及び露出を最適化し得る。
ＤＶＤ１２８６及びＤＶＤ１２８２における可変ドメインを用いて交差ＤＶＤ−Ｉｇ構成１１を調べる。種々のクローンの配列を表２３に列記する。「ｖｈ」で終わる配列の名称はＣＨ１−Ｆｃ（又はＣＨ−（Ｘ４）ｎ）に対してＮ末端側に置かれる。「ｖｌ」で終わる配列の名称はＣｋ（又はＣＬ−（Ｘ２）ｎ）に対してＮ末端側に置かれる。同一クローンからの配列を対合させて交差ＤＶＤ−Ｉｇを形成する。
Figure 2016510319
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実施例３１．交差ＤＶＤ−Ｉｇ構成１２の設計及び構築
図１８は構成１２のＤＶＤ−Ｉｇ分子の構成モデルを示す。この構成における可変ドメインが連結される方法のために、内側結合ドメインは完全に露出され得る。リンカーの異なる長さの効果を評価し、ＶＨ１がＶＬ１との機能的な結合ドメインを形成することができる一方で、ＶＨ２がＶＬ２との機能的な結合ドメインを形成することができることを保証するために、種々のリンカーの長さを調べた。ＶＨ１とＶＬ１の間のモデル化した考えられる相対的な位置及びＶＨ２とＶＬ２の間の相対的な位置に基づいて、ＶＨ１とＶＨ２の間のリンカーは長さ１〜５アミノ酸であり、ＶＨ２とＣＬの間のリンカーは長さ１〜３アミノ酸であり、ＶＬ２とＶＬ１の間のリンカーは長さ５〜１５アミノ酸であり、ＶＬ１とＣＨの間のリンカーは長さ３〜８アミノ酸である。リンカーの長さ及び配列における種々の変更を行って抗原結合ドメインの形成及び露出を最適化し得る。
ＤＶＤ１２８６及びＤＶＤ１２８２における可変ドメインを用いて交差ＤＶＤ−Ｉｇ構成１２を調べる。種々のクローンの配列を表２４に列記する。「ｖｈ」で終わる配列の名称はＣＨ１−Ｆｃ（又はＣＨ−（Ｘ４）ｎ）に対してＮ末端側に置かれる。「ｖｌ」で終わる配列の名称はＣｋ（又はＣＬ−（Ｘ２）ｎ）に対してＮ末端側に置かれる。同一クローンからの配列を対合させて交差ＤＶＤ−Ｉｇを形成する。
Figure 2016510319
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実施例３２．２９３細胞における交差ＤＶＤ−Ｉｇ分子の形質移入及び発現並びに交差ＤＶＤ−Ｉｇの性状分析
それぞれ抗原Ａ及び抗原Ｂに特異的な親モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを用いて、３〜４の抗原に結合することが可能である交差ＤＶＤ−Ｉｇ分子をコードする発現ベクターを構築した。相当する軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）の核酸を含有するプラスミドと共にＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞に一時的に同時形質移入することによって参照交差ＤＶＤ−Ｉｇの発現を達成した。フラスコ（2L Corning Cat# 431198）にて０．５Ｌ規模でＣＯ２インキュベータ（８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ、３７℃）で振盪しながらフリースタイル２９３培地（Invitrogen, Carlsbad Calif.）においてＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞を増殖させた。培養物が１×１０６細胞／ｍｌの密度に達すると形質移入複合体で細胞に形質移入した。形質移入複合体は、先ず２５ｍｌのフリースタイル培地にて１５０μｇのＬＣ−プラスミドと１００μｇのＨＣ−プラスミドを一緒に混合し、その後、５００μｌのＰＥＩストック溶液［ストック溶液：１ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ７．０）の線状２５ｋＤａのＰＥＩ、Polysciences Cat# 23966］を添加することによって調製した。形質移入複合体を反転によって混合し、室温で２０分間インキュベートした後、細胞培養物に添加した。形質移入に続いて、ＣＯ２インキュベータ（８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ、３７℃）にて培養物を増殖させ続けた。形質移入の２４時間後、２５ｍｌの１０％トリプトンＮ１溶液（Organo Technie, La Courneuve France Cat# 19553）で培養物を補完した。形質移入の９日後、遠心分離（１６，０００ｇ、１０分間）によって細胞を培養物から取り出し、保持された上清を無菌濾過し（Millipore HV Durapore Stericup, ０．４５μｍ）、精製工程の開始まで４℃に置いた。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂(GE Healthcare)を含有する使い捨ての２ｍｌの充填カラム（Orochem Technologiesによって充填された）を用いて各交差ＤＶＤ−Ｉｇを個々に精製した。カラムをＰＢＳで予め平衡化し、次いで、素通り画分を供給容器に循環し戻しながら、回収した０．５５Ｌの試料を１ｍｌ／分で一晩（１５時間）負荷した。負荷工程に続いて、カラムを２０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、４ｍｌ／分で溶出緩衝液（５０ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．５）を供給し、すでに０．２ｍｌの１．５Ｍトリス、ｐＨ８．２（最終ｐＨをおよそ６．０に橋渡しする）を含有する試験管にて分画を回収することによってタンパク質を溶出した。抗体を含有する分画をクロマト図に基づいてプールし、最終保存緩衝液（１０ｍＭのクエン酸、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ６．０）にて透析した。透析に続いて、０．２２μｍのＳｔｅｒｉｆｌｉｐ(Millipore)を介して試料を濾過し、吸光度（Hewlett Packard 8453、ダイオードアレイ分光光度計）によってタンパク質濃度を決定した。分析用試料でＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（還元及び非還元の双方で）を行い、最終的な純度を評価し、およその大きさの重鎖及び軽鎖のバンドの存在を検証し、遊離の（たとえば、複合体化していない）軽鎖の非存在（非還元試料にて）を確認した。
実施例３３．抗ＩＬ１ｂ／ＩＬ１７交差ＤＶＤ−Ｉｇ分子の抗原結合及びタンパク質発現解析
選択された交差ＤＶＤ−ＩｇクローンのＩＬ１β及びＩＬ１７への結合親和性を表面プラスモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって測定した。ＩＬ１β及びＩＬ１７のその同族受容体への結合を中和する交差ＤＶＤ−Ｉｇクローンの能力も測定し、ＩＣ−５０を決定した。選択された交差ＤＶＤ−Ｉｇクローンそれぞれのタンパク質発現レベル及び産生された単量体比率も測定した。実験の各セットでは、個々のＩＬ１β及びＩＬ１７モノクローナル抗体を基準として使用した。本明細書の表２５に示す結果は、選択された交差ＤＶＤ−Ｉｇクローンの幾つかが個々の基準のＩＬ１β及びＩＬ１７モノクローナル抗体に比べて優れた機能的及び熱動態的な特性を呈することを示す。
実施例３４．抗ＴＮＦ／ＩＬ１７交差ＤＶＤ−Ｉｇ分子の抗原結合及びタンパク質発現解析
Ｂ６１７抗ＩＬ１７抗体及びｈＭＡＫ１９９−ＡＭ１抗ＴＮＦ抗体の可変ドメインを用いて完全長のＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子及び構成２（本明細書で開示されるように）を有する２つの交差ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子を作製した。交差ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子を作製するのに使用したリンカー配列を本明細書の表８２及び８３にて示す。ＤＶＤ−ＩｇクローンのＴＮＦ及びＩＬ１７結合親和性を表面プラスモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって測定した。ＴＮＦ及びＩＬ１７のその同族受容体への結合を中和する交差ＤＶＤ−Ｉｇクローンの能力も測定し、ＩＣ−５０を決定した。選択された交差ＤＶＤ−Ｉｇクローンそれぞれのタンパク質発現レベル及び産生された単量体比率も測定した。実験の各セットでは、個々の親ＴＮＦ及びＩＬ１７モノクローナル抗体を基準として使用した。本明細書の表２６に示す結果は、選択された交差ＤＶＤ−Ｉｇクローンの幾つかが個々の基準のＴＮＦ及びＩＬ１７モノクローナル抗体に比べて優れた機能的及び熱動態的な特性を呈することを示す。特に、交差ＤＶＤ−Ｉｇクローンは双方の親抗体よりもＩＬ１７及びＴＮＦに対して高い親和性及びＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子よりもＩＬ１７に対する高い親和性を示す。
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実施例３５．抗ｃＭｅｔ ＭＢｏｄｙ分子
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／ｃＭｅｔ経路は、増殖、運動性、浸潤及び血管形成を推進することによって癌の進行に関連付けられている（それぞれ参照によって本明細書に組み入れられるNakamura et al. (1989) Nature 342: 440-3; Lokker et al. (1992) EMBO J. 11: 2503-10; Naka et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 20114-9; and Peruzzi et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12:3657-60を参照のこと）。この経路を標的とすることは癌の増殖及び転移を抑制し得る。しかしながら、通常のｃＭｅｔ抗体は、多分これらの抗体が細胞表面にてｃＭｅｔの二量体化を促進するために本質的に作動性である（それぞれ参照によって本明細書に組み入れられるPrat et al. (1998) J. Cell Science 111: 237-247; and Ohashi et al. (2000) Nature Med. 6: 327-331を参照のこと）。
実施例３５．１．抗ｃＭｅｔＩｇの重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の構築物の生成
マウスのハイブリドーマＨＢ−１１８９５（５Ｄ５.１１．６）をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC, Manassas, VA）から購入した。当該技術で既知である方法を用いてＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡ配列をクローニングした。ｃＤＮＡ配列及び翻訳されたアミノ酸配列を表２７及び２８に示す。
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白金ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ (Invitrogen, Carlsbad, CA)によって軽鎖及び重鎖のｃＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物をそれぞれ、ｐＨｙＢＥ−ｈＣｋ及びｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａベクター (Abbott Laboratories)にクローニングした。調製の後、ＡＢＩ ３７３０ＸＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ(Applied Biosystesm, Foster City, CA)を用いるジデオキシ鎖終結法によってプラスミドの配列を確認した。完全長の軽鎖及び重鎖の配列を表２９に示す。
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実施例３５．２．変異の組み合わせを可変ドメインに導入して抗ｃＭｅｔ抗体／抗原の結合を無効にすること
抗ｃＭｅｔ抗体／抗原の結合を無効にするために、アラニン走査法を用いてＨＣのＣＤＲ３領域に変異を導入した。当該技術で周知の方法を用い、部位特異的変異誘発を用いて各特定の位置に変異の組み合わせを導入した。６つのＨＣ変異体のアミノ酸配列を表３０にて示す。
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実施例３５．３．ＶＨ変異を持つ抗ｃＭｅｔ抗体の抗原結合能のＥＬＩＳＡによる特徴づけ
ポリエチレンイミン（Sigma, St. Louis, MO）によるヒト胚性腎臓２９３−６Ｅ細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA）への形質移入のためにＶＨ変異を持つ各ｃＭｅｔのＨＣのプラスミドを共通するｃＭｅｔのＬＣのプラスミドと対合させた。形質移入の６〜７日後、細胞培養培地を回収し、製造元の指示書に従ってプロテインＧカラムクロマトグラフィ（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて抗体を生成した。
ｃＭｅｔ結合ＥＬＩＳＡを行ってｃＭｅｔ抗体の抗原結合特性を特徴づけた。９６穴ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌ／ウェルのＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＧＦｃで４℃にて一晩コーティングした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄した後、ＰＢＳ中５％のミルクで室温にて１時間プレートをブロックした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で別に３回洗浄した後、１００μｌのｃＭｅｔ抗体を各ウェルに加え、その後室温で１時間インキュベートした。ストレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーゼ（KPL, Gaithersburg, MD）とテトラメチルベンジジン（Thermo Scientific, Rockford, IL）によって、結合しているビオチン標識したｃＭｅｔを検出した。２モル／ＬのＨ２ＳＯ４によって反応を止めた後、４５０ｎｍにて最終的な吸光度を取得した。データは、ＡＡ２、ＡＡ３及びＡＡ６のＶＨ変異持つｃＭｅｔ抗体はｃＭｅｔ抗原に結合するその能力をほぼ完全に失うことを示した（表３１及び図１９を参照）。ｃＭｅｔＡＡ６ＩｇのＥＣ５０は表３１には載せられていないが、図１９から判断して、ｃＭｅｔＡＡ６ＩｇのＥＣ５０はＡＡ２及びＡＡ３で得られたものに類似するはずである。用語ＥＣ５０及びＩＣ５０はこの実施例では相互交換可能に使用され、特定された暴露時間の後のベースラインと最大値との間の中間の応答を誘導する抗体の濃度を反映し得る。
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実施例３５．４．抗ｃＭｅｔ ＭＢｏｄｙ分子の分子クローニング
ＭＢｏｄｙ技術は抗体又は抗体様分子の一方の結合アームを不活化する又は取り除くことを目的とする。態様の１つでは、二価で標的抗原に結合する代わりに、ＭＢｏｄｙが一価で抗原に結合する。この概念は通常、２つの結合アームを有し、抗原結合に関与する免疫グロブリン様分子すべてに適用される。そのような分子には、免疫グロブリン、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））タンパク質、三重可変ドメイン免疫グロブリン（ＴＶＤ−Ｉｇ（商標））タンパク質、及び受容体抗体（ＲＡＢ）、（Ｆａｂ）２が挙げられるが、これらに限定されない。
ＭＢｏｄｙ分子は一方のみの抗原結合アームを含有する。この特徴と共に、本明細書で明らかにされるように、抗ｃＭｅｔＭＢｏｄｙ分子は、ｃＭｅｔへの一価の結合がｃＭｅｔの二量体化及び下流のシグナル伝達を誘導しないので拮抗剤として機能し得る。
ｃＭｅｔのＭＢｏｄｙを生成するために、ＨＣ構築物、ｃＭｅｔＡＡ２ ＨＣ、ｃＭｅｔＡＡ３ ＨＣ及びｃＭｅｔＡＡ６ ＨＣにノブ・イントゥ・ホール変異（Atwell et al. J. Mol. Biol. 1997, 270: 26-3）を導入してＨＣのヘテロ二量体化を達成した。合計６のＨＣを生成した。表３２を参照のこと。
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実施例３５．５．２９３細胞における抗ｃＭｅｔＭＢｏｄｙ分子の一時的な発現
ポリエチレンイミン（Sigma, St. Louis, MO）によるヒト胚性腎臓２９３−６Ｅ細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA）への形質移入のために、ＶＨ変異とノブ／ホール変異を持つ各ｃＭｅｔのＨＣのプラスミドをノブ／ホール変異と共通のｃＭｅｔのＬＣを持つ適当なｃＭｅｔのＨＣのプラスミドと対合させた。プラスミドの組み合わせ情報については表３３を参照。形質移入の６〜７日後、細胞培養培地を回収し、製造元の指示書に従ってプロテインＧカラムクロマトグラフィ（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて抗体を生成した。通常の抗体の発現レベルに比べてほとんどのｃＭｅｔＭＢｏｄｙが２９３細胞で十分に発現された（表３４を参照）ということは、これらの抗体が哺乳類細胞で効率的に発現されることを示している。２つのｃＭｅｔＭＢｏｄｙの発現が一桁台の範囲であったが、それは準最適な発現条件によるのかも知れない。
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実施例３５．６．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によるｃＭｅｔＭＢｏｄｙ分子の性状分析
非還元条件及び還元条件双方のもとでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによってｃＭｅｔＭＢｏｄｙ分析した。非還元条件下では、タンパク質試料のそれぞれは１５０ｋＤａで単一バンドを示した。還元条件下では、タンパク質試料のそれぞれは２本のバンドを生じ、一方が重鎖に相当し、他方が軽鎖に相当した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、各ＭＢｏｄｙが単一種として産生され、重鎖と軽鎖が効率的に対合して抗体様分子を形成することを明らかにした。
ＳＥＣを行って上記で掲載したＭＢｏｄｙ分子のサイズを確認した。解析については、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の精製した親ｃＭｅｔＭＢｏｄｙをスーパーデックス２００、３００×１０ｍｍのカラム（GE Healthcare, Piscataway, NJ）にかけた。ＨＰＬＣ機器モデル１０Ａ (Shimadzu, Columbia, MD)をＳＥＣに用いた。タンパク質はすべて２８０ｎｍ及び２１４ｎｍでのＵＶ光を用いて検出した。溶出は０．５ｍｌ／分の流速で定組成だった。
ＳＥＣのデータは、ＶＨ及びノブ・イントゥ・ホールの変異を伴ってｃＭｅｔＭＢｏｄｙ分子は単量体として一般に安定であることを明らかにした（表３５を参照）。必要に応じて、精製を適用して単量体からＭＢｏｄｙ凝集体を分離することができる。精製した単量体は適当な保存条件下で安定である。
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実施例３５．７．ｃＭｅｔＭＢｏｄｙ分子の質量分光分析
ｃＭｅｔＭＢｏｄｙ分子の未処理の分子量を測定するために、２μｌのＭＢｏｄｙ（０．８μｇ／μｌ）をＰｏｒｏｓｈｅｌｌ３００ＳＢ−Ｃ３カラム (１．０×７５ｍｍ，５μｍ， Agilent Technologies Inc., Pala Alto, CA)に注入した。質量分光分析計Ａｇｉｌｅｎｔ６２２４ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳシステム (Agilent Technologies Inc., Pala Alto, CA)に接続したＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ１２００キャピラリーＨＰＬＣでＬＣ／ＭＳ解析を行った。緩衝液Ａは０．１％のギ酸水溶液であり、緩衝液Ｂは０．１％ギ酸のアセトニトリル溶液だった。流速は５０μｌ／分だった。分離勾配は、最初の５分間は５％Ｂを保持し、０．５分で９５％Ｂに高め、次の９．５分間９５％Ｂで保持し、その後０．５分で５％Ｂに変化させ、別の４．５分間５％Ｂで保持した。質量分光分析計は５ボルトのスプレー電圧で操作し、走査範囲は６００〜３２００の質量対電荷の比だった。
タンパク質試料の軽鎖及び重鎖の分子量（ＭＷ）を測定するために、０．２μｌの１ＭのＤＴＴ溶液によって３７℃で３０分間、１０μｌのタンパク質試料（０．８μｇ／μｌ）を還元した。Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ３００ＳＢ−Ｃ３カラム、１．０×７５ｍｍ，５μｍ(Agilent Technologies Inc., Pala Alto, CA)を用いて軽鎖と重鎖を分離した。質量分光分析計Ａｇｉｌｅｎｔ６２２４ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳシステム (Agilent Technologies Inc., Pala Alto, CA)に接続したＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ１２００キャピラリーＨＰＬＣでＬＣ／ＭＳ解析を行った。緩衝液Ａは０．１％のギ酸水溶液であり、緩衝液Ｂは０．１％ギ酸のアセトニトリル溶液だった。流速は５０μｌ／分であり、試料の注入容量は２μｌだった。カラム温度は６０℃に設定した。分離勾配は５％Ｂで開始した。５分で３５％Ｂに上昇させ、次いで１５分で６５％Ｂに上昇させ、１分で９５％Ｂに上昇させ、９５％で４分間保持し、１分で５％Ｂに下降させ、５％Ｂで５分間保持した。質量分光分析計は５ボルトのスプレー電圧で操作し、走査範囲は６００〜３２００の質量対電荷の比だった。
表３６に示すように、軽鎖、重鎖及び完全長のタンパク質を含むｃＭｅｔＭＢｏｄｙ分子の実験的に決定された分子量は予想された値に十分一致する。
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実施例３５．８．ｃＭｅｔＭＢｏｄｙ分子の抗原結合親和性の測定
２５℃にてＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭのＮａＣｌ，３ｍＭのＥＤＴＡ，及び０．００５％界面活性剤Ｐ２０）を用いてＢｉａｃｏｒｅ３０００機器（Biacore AB,Uppsala,Sweden）による表面プラスモン共鳴に基づく測定法によってｒｈｃＭｅｔＥＣＤ（細胞外ドメイン）へのＭＢｏｄｙの結合の動態を測定した。化学物質はすべてＢｉａｃｏｒｅ ＡＢ（Uppsala,Sweden）から入手し、又はさもなければ本明細書で記載されるような異なる供給源から入手した。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で希釈したおよそ５０００ＲＵのヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ断片に特異的なポリクローナル抗体を、製造元の指示書と手順に従って２５ｍｇ／ｍｌで標準のアミンカップリングキットを用いてＣＭ５研究等級のバイオセンサーチップの全域に直接不動化した。バイオセンサー表面上の未反応の部分をエタノールアミンでブロックした。フローセル２及び４における修飾したカルボキシメチルデキストラン表面を反応表面として使用した。フローセル１及び３におけるヤギ抗ヒトＩｇＧを含まない未修飾のカルボキシメチルデキストランを参照表面として使用した。動態アッセイについては、Ｂｉｏｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４.０．１ソフトウエアを用いて１０回の注入すべての会合相及び解離相に１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに由来する速度方程式を適合させた（グローバルフィット解析を用いて）。ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃに特異的な反応表面全域での捕捉のために精製ＭＢｏｄｙ試料をＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水で希釈し、流速５ｍｌ／分で反応マトリクスに注入した。２５ｍｌ／分の連続的な流速のもとで会合及び解離の速度定数ｋｏｎ（Ｍ−１ｓ−１）及びｋｏｆｆ（ｓ−１）を測定した。１．２５〜１０００ｎＭに及ぶ様々な１０の抗原濃度にて動的結合測定を行うことによって速度定数を導き出した。次いでＭＢｏｄｙとｒｈｃＭｅｔＥＣＤの間での反応の平衡解離定数（Ｍ）を以下の式：ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎによる動的速度定数から算出した。ｒｈｃＭｅｔＥＣＤ試料のアリコートも同時にブランク参照及び反応ＣＭ表面に注入して非特異的な結合背景を記録し、差し引いて屈折率の変化及び注入ノイズの大半を排除した。５ｍｌ／分の流速での１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）のその後の２回の２５ｍｌの注入によって表面を再生した。表面に不動化した抗Ｆｃ抗体を完全に再生し、それは１２回にわたってその完全な捕捉能を保持した。捕捉されたＭＢｏｄｙ／ｒｈｃＭｅｔＥＣＤ複合体の見かけの定比性は、以下の式
定比性＝［ｒｈｃＭｅｔＥＣＤの応答（ＲＵ）］／［ＭＢｏｄｙの応答（ＲＵ）］×［ＭＢｏｄｙのＭＷ］／［ｒｈｃＭｅｔＥＣＤのＭＷ］
を用いて飽和する結合条件（定常状態の平衡）のもとで算出された。
Ｂｉａｃｏｒｅの解析は、ＭＢｏｄｙ分子が元々の親ｃＭｅｔｍＡｂと類似するｃＭｅｔに対する結合動態及び親和性を持つことを示した（表３７）。ｒｈｃＭｅｔＥＣＤに対する５つのＭＢｏｄｙ分子の全体的な結合パラメータは類似していたが、ｃＭｅｔＡＡ６ＭＢｏｄｙの親和性は、親ｃＭｅｔｍＡｂ及び他のＭＢｏｄｙよりも半分小さかった。親ｃＭｅｔｍＡｂ及びノブ・イントゥ・ホール変異を持つｃＭｅｔｍＡｂは双方とも二価で単一特異性であり、それぞれ１．５１及び１．５３の定比性でＢｉａｃｏｒｅ上のｃＭｅｔに結合する。これは、１．５〜２．０に及ぶ定比性を生じるＢｉａｃｏｒｅセンスチップ上に抗体が密に不動化される場合、大きな分子量のためにＩｇＧに共通する。ｃＭｅｔＭＢｏｄｙ分子すべてのｃＭｅｔＥＣＤに対する定比性パラメータが０．７７〜１．０３の範囲であったということは、これらのｃＭｅｔＭＢｏｄｙ分子がｃＭｅｔ抗原に対する一価の結合能を持つことを示している。
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実施例３５．９．ＥＬＩＳＡによるｃＭｅｔＭＢｏｄｙ分子の結合解析
実施例３５．３に記載された方法に従ってｃＭｅｔ結合ＥＬＩＳＡを行った。データは、ｃＭｅｔＭＢｏｄｙの抗原結合能がｃＭｅｔｍＡｂのそれに比べて約２倍低いことを示した（表３８及び図２０を参照）。これは、ＭＢｏｄｙの一方のＦａｂアームの結合能の喪失によるのかも知れない。ｃＭｅｔＭＢｏｄｙの最大結合も二価のｃＭｅｔ親ｍＡｂのそれよりも低かった。
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実施例３５．１０．抗ｃＭｅｔＭＢｏｄｙ分子は癌細胞の増殖を阻害した
ＩＭ−９５（カタログ＃１０７５．ＪＣＲＢ，日本）も１０ｍｇ／Ｌのインスリンを伴ったＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳにて維持した。増殖アッセイについては、ＩＭ−９５細胞を５，０００個／ウェルで１８０μＬの増殖培地にて９６穴プレート（Falcon 35-3075. BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ）に入れた。細胞を５％ＣＯ２で３７℃にて一晩インキュベートした。２日目に抗体希釈物を細胞のプレートに加えた（２０μＬ／ウェル）。無処理の対照ウェル（％対照用）及び１０μＭのスタウロスポリンで処理したウェル（１００％殺傷用）を各プレートでインキュベートした。プレートを５％ＣＯ２で３７℃にて５日間インキュベートした。７日目（処理後５日目）に、培地を取り除き、Ｏｐｔｉ−ｍｅｍ培地(Cat. # 31985-070. Invitrogen, Carlsbad, CA)で希釈した１×Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ (G3581. Promega, Madison, WI)をプレートに加え、次いでプレートを３７℃で１時間インキュベートした。Ｍ５ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー (Molecular Probes, Carlsbad, CA)にて４９０ｎｍでＯＤを読み取った。阻害率は、以下の式：１００×（０％対照−処理）／（０％対照−１００％殺傷）を用いて１００％殺傷と無処理の対照に基づいて算出した。
親ｃＭｅｔｍＡｂは１７μｇ／ｍＬでのＥＣ５０を伴ってＩＭ９５細胞の増殖を阻害した。ほとんどのｃＭｅｔＭＢｏｄｙ分子は、部分的には親ｍＡｂとｃＭｅｔＭＢｏｄｙとの間の定比性の差異によってＩＭ９５細胞の増殖の阻害においてやや弱い能力を示した。興味深いことに、ｃＭｅｔＡＡ２ＨＫのＭＢｏｄｙは親ｍＡｂのほぼ同じくらい強く癌細胞の増殖を阻害したということは、生体内での潜在的に優れた有効性を示している。
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実施例３５．１１．ｃＭｅｔＭＢｏｄｙ分子のＦｃＲｎ結合の解析
新生児のＦｃ受容体は小腸及び血管内皮細胞に存在する。新生児のＦｃ受容体は、飲作用によって取り込まれているＩｇＧのＦｃ部分をそれが結合する酸性エンドソームに局在する。次いでＩｇＧはＦｃＲｎを介して細胞表面に放出し戻される。この過程は、単層上皮バリアを横切るＩｇＧ輸送の制御を可能にし、ＩｇＧ分子を異化作用から保護し、ＩｇＧの半減期に影響を及ぼす（参照によって本明細書に組み入れられるBlumberg RS & Lencer WI. Nature Biotechnology, 2005, 23: 1232-1234を参照）。
ＣＨＯ−ＦｃＲｎＧＰＩ細胞（安定なＦｃＲｎ受容体発現体）及びＣＨＯ−ｐＢｕｄ１１細胞（非ＦｃＲｎ発現体）を１×１０５個／ウェルで９６穴プレートに等分して入れた。細胞を１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再浮遊させた。抗ｃＭｅｔＡｂ及び半Ｉｇ結合タンパク質をＦＡＣＳ緩衝液ｐＨ６．４及び７．４にて１００μｇ／ｍＬに希釈した。３０μＬの希釈した抗体又は半Ｉｇ結合タンパク質を各ウェルに加え、氷上で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液による２回の洗浄に続いて、ＦＡＣＳ緩衝液ｐＨ６．４及び７．４で希釈した二次抗体、Ｒ−フィコエリスリン結合のＡｆｉｎｉｐｕｒｅＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）を加えた。混合物を氷上で３０分間インキュベートした。相当するｐＨの１％ＦＢＳ(Invitrogen, Carlsbad, CA)及び２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム(Invitrogen, Carlsbad, CA)を伴った１００μＬのＰＢＳに細胞を再浮遊させた。ＦＡＣＳｃａｎ(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)にて最終的なＦＡＣＳデータを取得した。
親ｃＭｅｔ抗体はＦｃＲｎ受容体に対して強い結合を示した。ノブ・イントゥ・ホール変異の部位はＦｃＲｎの結合部位から離れているので、予想通り、ｃＭｅｔＭＢｏｄｙ分子はすべて最大測定限界までＦｃＲｎ受容体に対する結合能を保持した（表４０を参照）。特定の症例では、高親和性のＦｃＲｎ／ＩｇＧ相互作用が血清にてＩｇＧ及びＦｃに結合した薬剤の半減期を延長するので強いＦｃＲｎ／ＩｇＧ相互作用は治療用組成物で好まれる。改善された薬物動態はモノクローナル抗体の投与回数を減らし、患者のリスク及び不快感を減らす。
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実施例３５．１２．ｃＭｅｔＭＢｏｄｙ分子の薬物動態解析
ｃＭｅｔＭＢｏｄｙの薬物動態特性をＣＤ−１マウスにて測定した。５ｍｇ／ｋｇの試験ＭＢｏｄｙ分子の単回用量をオスのマウスに静脈内投与した。種々の時点で血液試料を採取した。捕捉にビオチン化ｃＭｅｔを、検出にスルホ−ＴＡＧ抗ヒトＩｇκを用いる化学発光ＭＳＤ法においてＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ６０００(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)にて血清試料を分析した。ＸＬｆｉｔ４ソフトウエアを用いて検量線の適合及びデータの評価を行った。理論的な基準濃度に対するＭＳＤ化学発光単位から較正曲線をプロットした。曲線の適合には４パラメータの記号論理学モデルを用いた。次いで較正曲線のための回帰方程式を用いて測定された濃度を逆算した。線形範囲は０．０２７〜２０μｇ／ｍＬであり、定量の下限は０．０２７μｇ／ｍＬだった。ノンコンパートメント解析及び線形台数法によるＰＬＡＳＭＡ ＴｅｍｐｌａｔｅＭａｋｅｒ ｒｅｖ ２．６．１２によって薬物動態パラメータを計算した。親の抗ｃＭｅｔ抗体に比べて、ｃＭｅｔＡＡ２ＨＫ ＭＢｏｄｙ及びｃＭｅｔＡＡ３ＨＫ ＭＢｏｄｙは双方ともさらに長い半減期及びさらに低いクリアランスを有した（表４１）。しかしながら、半減期は親抗体とほぼ同じであったが、ｃＭｅｔＡＡ６ＫＨ ＭＢｏｄｙは０．９２６ｍｌ／ｈｒ／ｋでのやや高いクリアランスを有した。
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実施例３６．抗ＣＤ３ＭＢｏｄｙ分子
ＣＤ３／ＴＣＲのシグナル伝達は、Ｔ細胞の活性化、系列選択、生き残り、抗原特異性、エフェクター機能及びサイトカイン分泌にとって決定的に重要である（Guy D et al. Immunol Rev. 2009, 232: 7-21）。免疫寛容、抗腫瘍及び抗炎症に対して抗体法によってＣＤ３を標的とする多数の取り組みが為されている（Chatenoud L Nat Rev Immunol. 2003, 3: 123-132. Tibben JG et al. J. Natl Cancer Inst. 1993, 85: 1003-1004. Plevy S et al. Gastroenterology 2007, 133: 1414-1422）。しかしながら、種々のサイトカイン、ケモカイン、酸素ラジカル及び補体因子の放出が関与する過度の全身性免疫応答であるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）が抗ＣＤ３治療において頻繁に認められている（Carpenter PA et al. J Immunol. 2000, 165: 6205-6213. Zlabinger GJ et al. J Clin Immunol. 1992, 12: 170-177）。
抗体がエフェクター細胞を活性化し、サイトカインの放出を引き起こすことができる分子メカニズムに関する複数の仮説が提案されている（Bugelski PJ et al. Exp Rev Clin Immunol. 2009, 5: 499-521）。これらの中で、二価の抗体による細胞表面の標的の架橋を介した標的細胞の活性化は独立したグループから生成された証拠によって支持されている（Wilde MI et al. Transplantation 1996, 51: 865-894. Onrust SV et al. Drugs 1999, 58: 79-88. Adams A et al. J Immunol. 2005 174: 542-550）。興味深いことに、一価の標的化するＩｇ様結合分子は試験管内で標的細胞を活性化せず（Pound J et al. International Immunol. 1999, 11: 11-20）、生体内でＣＲＳを誘導しなかった又はＣＲＳの症状を軽減した（Abbs IC et al. Therap. Immunol. 1: 325-331）。
実施例３６．１．抗ＣＤ３のＨＣ及びＬＣの分子クローニング
実施例１に記載されたように、抗ＣＤ３ ＯＫＴ３のＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡ配列（表４２、米国特許出願２０１１／０２６３８２７）をｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１、ｚ，ｎｏｎ−ａベクター及びｐＨｙＢＥ−ｈＣｋにてそれぞれクローニングした。ＶＨ、ＶＬ、及び完全長のＨＣ、ＬＣのアミノ酸配列を表４３及び４４にて示した。
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実施例３６．２．可変ドメインに変異を導入して抗ＣＤ３抗体／抗原の結合を無効にすること
ＣＤ３抗原の結合を無効にするために、アラニン走査法を用いてＨＣのＣＤＲ３領域に変異を導入した。部位特異的変異誘発を用い、当該技術で周知の方法を用いて各特定の位置に変異の組み合わせを導入した。５つのＨＣの変異体のアミノ酸配列を表４５にて示した。
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ＣＤ３のＨＣ及びＬＣの構築物によってＨＥＫ２９３細胞に一時的に形質移入した。前の実施例に記載されたように、発現された抗体をプロテインＡカラムによって精製した。
実施例３６．３．ＶＨ変異を持つ抗ＣＤ３抗体の抗原結合能のＦＡＣＳによる特徴づけ
ＶＨのＣＤＲ３の変異を持つ抗ＣＤ３抗体の抗原結合能をＦＡＣＳアッセイによって評価した。Ａ４３１及びＪｕｒｋａｔ細胞を回収し、１×１０６個／ｍｌにてＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）に再浮遊させた。２×１０５個／ウェルを丸底９６ウェルプレートに加え、試験抗体と共に４度で１時間インキュベートした。洗浄に続いて、５０μｌのＡｌｅｘａ４８８抗ヒトＩｇＧ（１：３００希釈、Jackson Immunoresearch. Cat #: 109-546-098）を加え、４度で３０分間インキュベートした。洗浄の後、細胞を１００μｌのＰＢＳに再浮遊させ、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩによって解析した。５つの異なる変異の組み合わせの間で、０．２７ｎＭでのＥＣ５０を持つ親抗体に比べてＡＡ３は抗原結合能をやや下げた（０．５３でのＥＣ５０）一方で、ＡＡ４及びＡＡ５は大きな影響を示さなかった。ＡＡ１及びＡＡ２の変異は双方とも抗原結合能を有意に下げた。ＡＡ１の曲線は対照抗体のそれと同様に完全に平坦だった。ＦＡＣＳデータはＡＡ１の変異がＣＤ３結合能を完全に無効にすることを示した。従って、ＡＡ１の変異をＣＤ３ＭＢｏｄｙ及びＣＤ３／ＥＧＦＲ ＤＶＤのＭＢｏｄｙの構築のために選択した。
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実施例３６．４．抗ＣＤ３ＭＢｏｄｙのＨＣの構築
実施例１．４にて記載した方法に類似して、抗ＣＤ３−ＡＡ１変異をノブ又はホール変異と組み合わせて抗ＣＤ３ＭＢｏｄｙの生成に使用した。詳細なＨＣの情報を表４７で取り上げた。
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実施例３６．５．２９３細胞における抗ＣＤ３ＭＢｏｄｙ分子の一時的な発現
実施例１．５にて記載したように、各抗ＣＤ３ＭＢｏｄｙ分子の一時的な発現のために３つの異なるＨＣ及びＬＣのプラスミドの組み合わせでＨＥＫ２９３細胞に同時形質移入した（表４８）。
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２９３細胞における双方のＭＢｏｄｙの一時的な発現レベルは高く、ＣＤ３ＡＡ１ＨＫ ＭＢｏｄｙは２１１．７ｍｇ/Ｌであり、ＣＤ３ＡＡ１ＫＨ ＭＢｏｄｙは５４．９ｍｇ/Ｌだった（表４９）。ＳＥＣ解析は９５％を上回って単量体である双方の分子を示した。
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実施例３６．６．抗ＣＤ３ＭＢｏｄｙの薬物動態
ＣＤ−１マウスにてＣＤ３ＭＢｏｄｙの薬物動態特性を測定した。５ｍｇ／ｋｇの試験ＭＢｏｄｙ分子の単回用量をオスのマウスに静脈内で投与した。種々の時点で血液試料を採取した。捕捉には抗ヒトＩｇＧＦｃを、検出にスルホ−ＴＡＧ抗ヒト抗体を用いる化学発光ＭＳＤ法においてＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ６０００(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)にて血清試料を分析した。ＸＬｆｉｔ４ソフトウエアを用いて検量線の適合及びデータの評価を行った。理論的な基準濃度に対するＭＳＤ化学発光単位から較正曲線をプロットした。曲線の適合には４パラメータの記号論理学モデルを用いた。次いで較正曲線のための回帰方程式を用いて測定された濃度を逆算した。線形範囲は０．００５〜２０μｇ／ｍＬであり、定量（ＬＬＯＱ）の下限は０．００５μｇ／ｍＬだった。ノンコンパートメント解析及び線形台数法によるＰＬＡＳＭＡ ＴｅｍｐｌａｔｅＭａｋｅｒ ｒｅｖ ２．６．１２によって薬物動態パラメータを計算した。
ＣＤ−１マウスで調べたＣＤ３ＭＢｏｄｙは双方とも他の通常の抗体のそれに匹敵する妥当な半減期及びクリアランスを有した。興味深いことに、２つのＨＣ間でノブとホールの変異の入れ替えによってＣＨ３の接合領域でのみＣＤ３ＡＡ１ＫＨと異なるＣＤ３ＡＡ１のＭＢｏｄｙは２３１時間の相対的に短い半減期及び０．４２０ｍｌ／ｈｒ／ｋｇの大きなＣＬｐを有した（表５０）。
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実施例３７．抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ ＭＢｏｄｙ分子
癌の免疫療法のための戦略の開発において再指示細胞傷害性のアプローチが注目を集めている（Beun G et al. Immunol Today 1994, 15: 11-15）。二重特異性の抗Ｔ細胞表面標的×抗腫瘍イディオタイプ抗体の開発は再指示細胞傷害性にて研究を大きく推し進めた。発想は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を動員し、活性化して選択された標的癌細胞を認識し、破壊することである。１９８５年には早くも、Ｐｅｒｅｚらが、二重特異性の抗ＣＤ３×抗腫瘍イディオタイプ抗体の複合体は、試験管内にてＣＴＬが腫瘍細胞を殺傷するのを可能にすることを実証した（Perez P et al. Nature 1985, 316: 354-356）。Ｄｅｍａｎｅｔ及びその共同研究者らは、Ｂ細胞リンパ腫の致死的な腹腔内注射を負荷したマウスの８０％までを、再指示細胞傷害性を介した二重特異性の抗ＣＤ３×抗腫瘍イディオタイプ抗体の単回静脈注射による処理によって治癒させることを提示した（Demanet et al. J Immunol. 1991, 147:1091-1097）。最近、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ ＡＧ及びＭｅｄＩｍｍｕｎｅ社によって開発された組換え二重特異性のＴ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９抗体であるＭＴ−１０３による臨床試験はＢ細胞非ホジキンリンパ腫（Bargou R et al. Science 2008, 321: 974-977）及びＢ前駆細胞急性リンパ性白血病（Top MS et al ASH Abstract #174, 2010）にてこの二重特異性分子の有効性を実証した。
表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）のシグナル経路は腫瘍細胞の増殖、局所浸潤、血管形成及び転移において決定的に重要である（Rusch V et al. Clin Cancer Res. 1997, 3: 515-522）。抗ＥＧＦＲは様々な臨床試験で有効であることが実証された（Pirker R et al. Lancet 2009, 373: 1525-1531. Khambata-Ford S et al. J Clin Oncol. 2010, 28: 918-927）。抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲのＭＢｏｄｙは再指示細胞傷害性を介して癌細胞を殺傷し得る。抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲのＭＢｏｄｙを生成するために、アラニン走査変異をＨ２４抗体（Abbott Laboratories）の一方の結合アームに導入し、ノブ・イントゥ・ホール変異をそのＦｃ領域に導入する。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、ＳＥＣ及び質量分光分析によって抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲのＭＢｏｄｙを性状分析してその配列、分子量及び単量体状態を確認する。ＦＡＣＳ解析を適用してこれらのＭＢｏｄｙの抗原結合能を測定する。Ｔ細胞活性化アッセイ又はサイトカイン放出アッセイを適用してこれらのＭＢｏｄｙのアゴニスト活性を測定する。
実施例３７．１．抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ ＤＶＤのＨＣ及びＬＣの分子クローニング
実施例１にて記載したように、抗ＣＤ３／ＥＧＦＲのＨＣ及びＬＣのｃＤＮＡ配列（表２５）をそれぞれ、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１、ｚ、ｎｏｎ−ａベクタい及びｐＨｙＢＥ−ｈＣｋにクローニングした。ＶＨ、ＶＬ及び完全長のＨＣ、ＬＣのアミノ酸配列を表５１及び表５２にてそれぞれ示す。
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実施例３７．２．抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ ＤＶＤ ＭＢｏｄｙのＨＣの構築
実施例１．４にて記載された方法に類似して、抗ＣＤ３ＡＡ１変異をノブ又はホールの変異と組み合わせて抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ ＤＶＤ ＭＢｏｄｙの生成に使用した。詳細なＨＣの情報を表５４で取り上げた。
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実施例３７．３．２９３細胞における抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ ＤＶＤ ＭＢｏｄｙ分子の一時的な発現
実施例１．５にて記載されたように、各抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ ＤＶＤ ＭＢｏｄｙ分子の一時的な発現のために３つの異なるＨＣ及びＬＣのプラスミドの組み合わせでＨＥＫ２９３細胞に同時形質移入した（表５５）。
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２９３細胞における双方のＭＢｏｄｙの発現レベルはＤＶＤ−Ｉｇ分子に匹敵し、ＣＤ３ＡＡ１／ＥＧＦＲ−ＨＫ ＤＶＤ ＭＢｏｄｙは１５．４ｍｇ／Ｌであり、ＣＤ３ＡＡ１／ＥＧＦＲ−ＫＨ ＤＶＤ ＭＢｏｄｙは２６．２ｍｇ／Ｌだった。
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実施例３７．４．抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ ＭＢｏｄｙ分子の抗原結合
実施例２．３にて記載されたように、抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ ＭＢｏｄｙのＣＤ３への結合を性状分析した。親ＤＶＤ−Ｉｇの結合のＥＣ５０が１９４２ｐＭであった一方で、ＣＤ３ＡＡ１／ＥＧＦＲ−ＨＫ ＤＶＤ ＭＢｏｄｙ及びＣＤ３ＡＡ１／ＥＧＦＲ−ＫＨ ＤＶＤ ＭＢｏｄｙのＥＣ５０はそれぞれ１２３１及び１７９７ｐＭで上手く維持された（表５７）
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実施例３６．５．ｒＣＴＬ抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ ＭＢｏｄｙ分子の性状分析
再指示細胞傷害性アッセイをインピーダンスに基づくアッセイ（Zhu, J., et al. 2006. J Immunological Methods 309:25-33）として行った。上記のようにＴ細胞を調製した。ＥＧＦＲを発現している標的細胞をＡＣＥＡ ＲＴ−ＣＥＳ９６穴プレート(ACEA Bio, San Diego)に一晩付着させた。次いでエフェクターＴ細胞（Ｅ）及び標的（Ｔ）を２×１０５及び２×１０４個／ウェルでプレートに入れ、１０：１のＥ：Ｔ比を得た。ＤＶＤ−Ｉｇ及びＭＢｏｄｙＤＶＤ−Ｉｇ分子を適宜希釈して濃度依存性の滴定曲線を得た。ＭＢｏｄｙＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質で処理した試料における標的の細胞指数を対照標的（処理せず）の細胞指数で割って特異的溶解の比率を算出した。データをグラフにした、そしてＰｒｉｓｍ(Graphpad)にてＩＣ５０を算出する。
インピーダンスアッセイの結果は、８７．９ｐＭのＥＣ５０を持つ親抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ ＤＶＤ−Ｉｇに比べて、ＣＤ３ＡＡ１／ＥＧＦＲ−ＨＫ ＤＶＤ ＭＢｏｄｙ及びＣＤ３ＡＡ１／ＥＧＦＲ−ＫＨ ＤＶＤ ＭＢｏｄｙは双方ともそれぞれ７０３．０ｐＭ及び３３６．９ｐＭの相対的に大きいＥＣ５０でｒＣＴＬを維持した（表５８）。
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実施例３７．６．ＣＤ３／ＥＧＦＲ ＭＢｏｄｙ分子のサイトカイン放出活性
ＰＢＳ中１μｇ／ウェルで室温にて９０分間試験抗体を９６穴ポリプロピレンプレートにコーティングした。プレートをすすぎ、ヒトＰＢＭＣを１０５個／ウェルで加えた。培養の４８時間後、上清を回収し、市販のキット（Meso Scale Discovery, Rockville, MD）を用いてサイトカインについてアッセイした。
非特異的なサイトカイン放出（４０６６１ｐｇ／ｍｌ、３人のドナーからの平均数）を強力に刺激した親ＤＶＤ分子に比べて、ＣＤ３ＡＡ１／ＥＧＦＲ ＤＶＤ ＭＢｏｄｙはアッセイにて６８％少ないＩＦＮｇの産生を誘導した（表５９）。
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実施例３７．７．抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ ＭＢｏｄｙ分子の薬物動態
抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ ＤＶＤ ＭＢｏｄｙのＰＫの測定方法は実施例２．４のものと同じである。
１．３９ｍｌ／ｈｒ／ｋｇの相対的に高いＣＬｐを持つ親抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ ＤＶＤ−Ｉｇは２１１時間の半減期を提示した。やや高いＣＬｐと共に、ＣＤ３ＡＡ１／ＥＧＦＲ−ＨＫ ＤＶＤ ＭＢｏｄｙは２１７時間の半減期を有した。しかしながら、ＣＤ３ＡＡ１／ＥＧＦＲ−ＫＨ ＤＶＤ ＭＢｏｄｙは、１．６２ｍＬ／ｈｒ／ｋｇのＣＬｐと共に１４６時間の非常に短い半減期を有した（表６０）。
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実施例３８．抗ＣＤ４０ＭＢｏｄｙ分子
実施例３８．１．抗ＣＤ４０のＨＣ及びＬＣの分子クローニング
実施例１にて記載されたように、抗ＣＤ４０ ２１．４.１のＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡ（表２８、米国特許出願２００５／０６３２８９）をそれぞれｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１、ｚ、ｎｏｎ−ａベクター及びｐＨｙＢＥ−ｈＣｋにクローニングした。ＶＨ、ＶＬ及び完全長のＨＣ、ＬＣのアミノ酸配列を表６１〜６３にて示した。
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実施例３８．２．可変ドメインに変異を導入して抗ＣＤ４０抗体／抗原の結合を無効にすること
抗原結合を無効にするために、抗体構造の分析に基づいてＨＣのＣＤＲ３領域にて特定の変異を設計した。部位特異変異誘発を用い、当該技術で周知の方法を用いて変異の組み合わせを各特定の位置に導入した。５つのＨＣ変異のアミノ酸配列を表６４にて示した。
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実施例３８．３．２９３細胞における抗ＣＤ４０ ＭＢｏｄｙ分子の一時的な発現
ＣＤ４０のＨＣ及びＣＤ４０のＬＣの構築物でＨＥＫ２９３細胞に一時的に形質移入した。前の実施例にて記載されたように、発現された抗体をプロテインＡカラムによって精製した。
実施例３８．４．ＨＣのＣＤＲ３に変異を持つ抗ＣＤ４０抗体の抗原結合能
ＨＣのＣＤＲ３に変異を持つ２１．４.１抗体の結合能をＦＡＣＳによって測定した。先ず、ＣＤ４０を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を０．０１μｇ／ｍｌ〜１０１μｇ／ｍｌの範囲でのｈＩｇＧ１又は試験物質で染色した。ＡＰＣを結合した抗ヒトＦｃ抗体との氷上での３０分間のインキュベートがそれに続いた。次いで細胞を２回洗浄した。Ｂｅｃｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ (Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いて蛍光を測定した。
ＦＡＣＳによってタンパク質の結合を調べた。０．０８４μｇ／ｍｌのＥＣ５０での抗ＣＤ４０抗体ＣＤ４０。ＶＡ、ＬＡ、ＮＡ及びＹＡの変異は結合に部分的にしか影響しなかった。ＬＹＮＶ及びＹＮＶの変異は双方とも結合を有意に減らした（表６５）。抗ＣＤ４０のＭＢｏｄｙ構築物のためにＬＹＮＶの変異を選択した。
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実施例３８．５．ノブ及びホールの変異を持つ抗ＣＤ４０のＨＣの生成
最終的なＣＤ４０ ＭＢｏｄｙの生成のために抗ＣＤ４０ＷＴのＨＣ及びＬＹＮＶのＨＣをノブ又はホール変異と連結した（表６６）
Figure 2016510319
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実施例３８．６．２９３細胞における抗ＣＤ４０ＭＢｏｄｙ分子の一時的な発現
実施例１．５にて記載されたように、各抗ＣＤ４０ＭＢｏｄｙ分子の一時的な発現のために３つの異なるＨＣ及びＬＣのプラスミドの組み合わせでＨＥＫ２９３細胞に同時形質移入した（表６７）。
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２９３細胞における双方のＭＢｏｄｙの一時的な発現レベルは相対的に低く、ＣＤ４０ＬＹＮＶ−ＨＫ ＭＢｏｄｙは６．３ｍｇ／Ｌであり、ＣＤ４０ＬＹＮＶ−ＫＨ ＭＢｏｄｙは５．０ｍｇ／Ｌだった。
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実施例３８．６．抗ＣＤ４０ＭＢｏｄｙの抗原結合
２１．４.１ＭＢｏｄｙの結合能をＦＡＣＳによって測定した。先ず、ＣＤ４０を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞を０．０１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲でのｈＩｇＧ１、２１４１又は２１４１ＭＢｏｄｙで染色した。ＡＰＣを結合した抗ヒトＦｃ抗体との氷上での３０分間のインキュベートがそれに続いた。次いで細胞を２回洗浄し、ＰＢＳ／ＦＢＳに再浮遊させた。Ｂｅｃｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いて蛍光を測定した。
ＦＡＣＳによってタンパク質の結合を調べた。２１４１抗体及び２１４１ＭＢｏｄｙはそれぞれ０．２４及び１．０μｇ／ｍｌのＥＣ５０を持つ匹敵する親和性でＣＤ４０を結合する。
実施例３８．７．抗ＣＤ４０ＭＢｏｄｙ分子のアゴニスト活性
細胞表面に過剰発現させたＣＤ４０によって作動させる操作されたＮＦκＢ−ＳＥＡＰを持つＨＥＫ２９３細胞株によって試験抗体のアゴニスト活性を測定した。０．０１〜１０１．０μｇ／ｍｌの範囲でのｈＩｇＧ１対照、２１４１抗体又は２１４１ＭＢｏｄｙで一晩細胞を刺激した。次いでＮＦκＢ−ＳＥＡＰ活性を検出するために２００μｌのＱｕａｎｔｉブルーを加える。２１４１抗体は０．１２μｇ／ｍｌのＥＣ５０を持つ強いアゴニスト活性を示したのに対して２１４１ＭＢｏｄｙによるアゴニスト活性はほとんど失われていた（１μｇ／ｍｌまでに見られるアゴニスト活性はない）。これは、一価のＣＤ４０結合はＣＤ４０のアゴニスト活性を誘導しないことを示唆した。
実施例３９．ｃＭｅｔを一価で結合することが可能なＦａｂ-ｂｏｄｙの生成
細胞表面受容体ｃＭｅｔは十分に有効な腫瘍学の標的であり（Danilkovitch-Miagkova A et al. J Clin Invest. 2002, 109:863-867. Birchmeier CBW et al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003, 4:915-925. Oyewale A et al. Reviews on Recent Clinical Trials. 2007 2: 143-147. Liu X et al. Expert Opin Invest Drugs 2008.17: 997-1011）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合によって誘導される二量体化の際にそれは活性化される。たぶん抗体の正常な形態の二価特性のために、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって報告された５Ｄ５のようなｃＭｅｔに対して開発された抗体は所望のアンタゴニスト効果よりもむしろアゴニスト効果を生じることが多い（Prat M et al. J Cell Sci. 1998, 111: 237-247. Ohashi K et al. Nature Med. 2000, 6: 327-331）。Ｆａｂ−ｂｏｄｙの一価の結合特性のために、抗ｃＭｅｔＦａｂ-ｂｏｄｙを用いてｃＭｅｔを発現する腫瘍細胞株の増殖を阻害する。
実施例３９．１．抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ−ｂｏｄｙの発現プラスミドのクローニング及び構築
ｈ５Ｄ５と名付けられた親ヒト化ｃＭｅｔ抗体の可変ドメインのアミノ酸配列を文献（ＵＳ２００７／００９２５２０）から抽出した（表６９）。ＬＦｃ鎖と名付けられたシグナルペプチド、ｈ５Ｄ５の軽鎖（ＶＬ＋ＣＬ）、短いリンカー及びＦｃ領域（Ｆｃノブ）を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現ベクターｐＨｙｂＥ（Abbott）にクローニングした。同様に、ＨＦｃ鎖と名付けられたシグナルペプチド、ｈ５Ｄ５の重鎖Ｆａｂ領域（ＶＨ＋ＣＨ１）、短いリンカー及びＦｃ領域（Ｆｃホール）を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現ベクターｐＨｙｂＥにクローニングした。
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実施例３９．２．抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙの発現
ＬＦｃ鎖をコードする発現プラスミドとＨＦｃ鎖をコードする発現プラスミドで同時にＨＥＫ２９３細胞（ヒトの胚性腎臓）に一時的に形質移入することによって抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙを発現させた。手短には、フリースタイル２９３発現培地（Invitrogen）にて０．７５×１０５個／ｍｌでＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞を培養し、５％ＣＯ２及び３７℃にて増殖させた。翌日、形質移入の前に細胞密度を１．２×１０６個／ｍｌに調整した。形質移入のために、１ｍｇのＤＮＡをフラスコにて３５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Invitrogen）で希釈し、１ｍｇ／ｍｌの濃度での２ｍｌのＰＥＩ（Polysciences, cat # 23966）を別のフラスコで３５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭに希釈した。室温で５分間のインキュベート後、ＤＮＡ及びＰＥＩを一緒に混合し、室温で１５分間インキュベートした。次いでＤＮＡ：ＰＥＩの複合体を１Ｌの培養物に加えた。翌日、トリプトンＮ１（cat# 19554, Oraganotechnie）を０．５％の最終濃度で加えた。形質移入の７日後、細胞培養の上清を回収した。
実施例３９．３．抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙの精製
細胞培養の上清を０．２ｍｍのフィルターを介して濾過した。フィルター上清をＨｉＴＲＡＰ ｒプロテインＡ ＦＦカラム(Amersham)にかけた。１００ｍＭのグリシンｐＨ２．７及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含有し、１ＭのトリスｐＨ８．０緩衝液で中和した緩衝液によってタンパク質を溶出した。ＰＢＳに対してタンパク質を透析し、ＳｕｐｅｒｄｅｘＳ２００サイズ排除クロマトグラフィ(Amersham)によってさらに精製した。プロテインＡアフィニティ精製の工程で、穏やかなＡｇ／Ａｂ結合緩衝液及び穏やかなＡｇ／Ａｂ溶出緩衝液（Thermo Scientific, cat# 21012 and 21013）による穏やかな溶出法を用いて最終的な単量体の収率を高めた。
実施例３９．４．参照分子の生成
抗ヒトｃＭｅｔ抗体５Ｄ５及び抗体断片５Ｄ５Ｆａｂをハイブリドーマ細胞株５Ｄ５（ＡＴＣＣ）から産生させた。対照ヒトＩｇＧはＳｉｇｍａ（１４５０６）から購入した。
同一のｃＭｅｔ結合可変ドメインを持つＭｅｔＭＡｂ１と名付けられた一価のｃＭｅｔ抗体（ＵＳ２００７／００９２５２０）をＨＥＫ３９３−６Ｅ細胞で発現させ、抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙと同様に精製した。
実施例３９．５．ＥＬＩＳＡによる抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙの結合解析
実施例３．１にて記載された方法に従ってｃＭｅｔ結合ＥＬＩＳＡを行った。データは、ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙの抗原結合能がｃＭｅｔ一価の結合分子ＭｅｔＭａｂ１及びｃＭｅｔ抗体ＭａｂＸ（Abbott）に匹敵し、二価の抗体５Ｄ５に比べて半分を下回る能力を持つことを示した。
実施例３９．６．抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙの生化学的な性状分析
精製した抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙを非還元条件及び還元条件のもとでＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質は、還元条件下で５０ｋＤａ前後の及び非還元条件下で９８ｋＤａ前後のバンド１本を示した。Ｆａｂ-ｂｏｄｙの２本のポリペプチド鎖の分子量は互いに非常に近いので、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは区別できない。非還元ゲルの結果は２本のポリペプチド鎖が効率的に対合することを示している。
３８．７で記載された方法を用いて非還元条件及び還元条件のもとで抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙにて質量分光分析を行った。抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙ及びそのポリペプチド鎖の実験的に測定された分子質量は、１０１，５１６（０Ｇ０Ｋ、非還元）、５１，０２９（０Ｇ０Ｋ、還元）及び５０，４８８Ｄａ（０Ｇ０Ｋ、還元）だったが、それらはそれぞれｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙ及びＬＦｃ鎖及びＨＦｃ鎖の理論的分子量に一致する。
実施例１．６にて記載された方法によって抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙにてＳＥＣ解析を行った。抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙは９７％単量体で約１００ｋＤａの見かけの分子量を有し、それは理論的分子量に一致する。
実施例３９．７．ホスホ−ｃＭｅｔ（ｐ−ｃＭｅｔ）及び細胞増殖アッセイ
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（HyClone SH30070.03）で補完されたＤＭＥＭ（Gibco-Invitrogen cat. No. 11995）にて腫瘍細胞株（ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ−１８５）を維持した。ＩＭ−９５（ＪＣＲＢ ＃１０７５）も１０ｍｇ／Ｌのインスリンを伴ったＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳで維持した。ＳＮＵ−５（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ−５９７３）及びＳＮＵ−６２０（ＫＣＬＢ ＃００６２０）
は、１０％ＦＢＳで補完されたＲＰＭＩ−１６４０ (Gibco-Invitrogen, cat. No. 11875)にて培養した。
９６穴プレートにて４０，０００個／ウェルでＡ５４９細胞を増殖培地に入れた。２４時間後、細胞を３７℃にて１時間、抗体で予備処理し、次いで３７℃で１０分間、ＨＧＦで刺激した。次いで培地を取り除き、プロテアーゼ阻害剤錠（Roche # 11714900）で補完された１００μＬ／ウェルの細胞溶解緩衝液(Cell Signaling Technology # 9803)によって細胞を溶解した。１００μＬの抗ｃＭｅｔ抗体 (R&D systems, # MAB3581) ２μｇ／ｍＬで)によって４℃で一晩、ウェルを予備コーティングし、その後、室温にて１時間の２００μｇ／ウェルのＰＢＳ１％ＢＳＡ処理によってブロックし、ＰＢＳＴで３回洗浄することによってＥＬＩＳＡ捕捉プレートを生成した。細胞溶解物（８０μｌ／ウェル）を捕捉プレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、（ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡで１：１０００に希釈した）抗ホスホ−チロシン４Ｇ１０−ＨＲＰ抱合体と共に室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、各ウェルに１００μｌのＴＭＢを加え、発色するまで室温でインキュベートした。１００μｌ／ウェルの２Ｎの硫酸の添加によって反応を止め、４５０ｎｍでＯＤを読み取った。細胞を３７℃にて５％ＣＯ２と共に培養した。精製した抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙを非還元条件及び還元条件のもとでＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質は、還元条件下で５０ｋＤａ前後の及び非還元条件下で９８ｋＤａ前後のバンド１本を示した。
５，０００個／ウェルにて１８０μｌの増殖培地で９６穴プレート（Falcon 35-3075）にＩＭ−９５細胞を入れた。細胞を５％ＣＯ２と共に３７℃で一晩インキュベートした。２日目に抗体希釈物を細胞のプレートに加えた（２０μｌ／ウェル）。無処理の対照ウェル（０％対照用）及び１０μＭのスタウロスポリンで処理したウェル（１００％殺傷用）を各プレートでインキュベートした。プレートを５％ＣＯ２と共に３７℃で５日間インキュベートした。７日目（処理後５日目）に、培地を取り除き、Ｏｐｔｉ-ｍｅｍ培地（Invitrogen # 31985-070）で希釈した１×Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ溶液(Promega, G3581)をプレートに加え、次いで３７℃で１時間インキュベートした。Ｍ５ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー (Molecular Probes)にて４９０ｎｍでのＯＤを読み取った。以下の式：１００×（％対照−処理）／（％対照−１００％殺傷）を用いて１００％殺傷及び無処理の対照に基づいてパーセント阻害を算出した。
１０，０００個／ウェルで１８０μｌの無血清培地（ＲＰＭＩ１６４０＋０．１％ＢＳＡ）にてＳＮＵ−５細胞又はＳＮＵ−６２０細胞を９６穴プレートに入れ、５％ＣＯ２と共に３７℃で一晩インキュベートした。３日間の処理と共に細胞をインキュベートし、５日目に４０μｌのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ溶液(Promega, G3581)を各ウェルに加え、次いでプレートを３７℃で１時間インキュベートしたことを除いて、処理及びデータ処理には上記と同様のプロトコールを用いた。
抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙは、Ａ５４９及びＩＭ−９５において抗ｃＭｅｔの一価結合分子、５Ｄ５Ｆａｂ及びＭｅｔＭＡｂ１に匹敵する阻害能を示したが、ｃＭｅｔの二価結合分子、５Ｄ５及びＭａｂＸの半分を下回る能力だった。ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙ及びＭａｂＸのみがＳＮＵ−５細胞の細胞増殖を阻害した。二価抗体５Ｄ５はＳＮＵ−６２０の増殖を刺激した一方で、ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙは刺激しなかった（表７０）。症例によっては、アゴニスト効果なしで種々の癌細胞株を阻害することのような治療組成物ではｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙの独特のアンタゴニスト効果が好まれる。
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実施例３９．８．ＦｃＲｎの結合の解析
ｃＭＥＴに対するヒトＩｇＧ抗体（Abbott）と共に抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙにてＦｃＲｎの結合の解析を行った。抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙはＡｂｂｏｔｔの抗体のそれに匹敵するＦｃＲｎへの結合親和性を有し、ＥＣ５０値がそれぞれ５８．１９ｎＭ及び１６９ｎＭだったということは、そのＦｃＲｎが介在するクリアランスが同等であることを示唆している。
実施例３９．９．薬物動態
ＣＤ−１マウスにて抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙの薬物動態特性を測定した。５ｍｇ／ｋｇの試験Ｆａｂ−ｂｏｄｙ分子の単回用量をオスのマウスに静脈内投与した。種々の時点で血液試料を採取した。捕捉にビオチン化ｃＭｅｔを、検出にスルホ−ＴＡＧ抗ヒトＩｇκを用いる化学発光ＭＳＤ法においてＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ６０００(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)にて血清試料を分析した。ＸＬｆｉｔ４ソフトウエアを用いて検量線の適合及びデータの評価を行った。理論的な基準濃度に対するＭＳＤ化学発光単位から較正曲線をプロットした。曲線の適合には４パラメータの記号論理学モデルを用いた。次いで較正曲線のための回帰方程式を用いて測定された濃度を逆算した。線形範囲は０．００５〜２０μｇ／ｍＬであり、定量の下限（ＬＬＯＱ）は０．００５μｇ／ｍＬだった。ノンコンパートメント解析及び線形台数法によるＰＬＡＳＭＡ ＴｅｍｐｌａｔｅＭａｋｅｒ ｒｅｖ ２．６．１２によって薬物動態パラメータを計算した。抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙは２６６時間の平均半減期及び０．４６ｍｇ／ｈｒ／ｋｇのクリアランス率を有した。
実施例４０．ＣＤ４０を一価で結合することが可能なＦａｂ−ｂｏｄｙの生成
ＣＤ４０は腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの一員である。ＣＤ４０は、樹状細胞、Ｂ細胞及びマクロファージを含む抗原提示細胞の表面にて発現され、液性免疫が介在する応答にはＣＤ４０とそのリガンド、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）との相互作用が必要とされる（Grewal is et al. Ann. Rev. Immunol., 1996, 16: 111-135）。ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０のシグナル伝達は、たとえば、コラーゲン誘導の関節炎、ループス腎炎、急性又は慢性の移植片対宿主病、多発性硬化症及び甲状腺炎のような実験的に誘導される自己免疫疾患に関連すると思われる（Mach F et al. Nature 1998, 394: 200-203. Biancone L. Int J Mol Med. 1999, 3:343-353）。ＣＤ４０は広い範囲の腫瘍細胞にも発現され、ＣＤ４０抗体は癌を治療することに関与している（Turner JG et al. J of Immun 2001, 166: 89-94. 57. Luqman Met al. Blood. 2008, 112:711-720. Beatty GL et al. Science 2011, 331:1612-1616）。抗体の一部は、従来の二価抗体の架橋特性のためにアゴニストである。ＣＤ４０に一価で結合するＦａｂ−ｂｏｄｙを用いてＣＤ４０のシグナル伝達の活性化をできるだけ抑えることによって癌及び自己免疫疾患を治療することができる。
ＣＤ４０抗体可変ドメインのアミノ酸配列は文献（ＷＯ２００５０６３２８９）（表７１）から抽出した。ＬＦｃ鎖と名付けられた、シグナルペプチド（配列番号６０）、抗ＣＤ４０軽鎖（ＶＬ＋ＣＬ）（配列番号７０＋配列番号６２）、短いリンカー（配列番号６３）及びＦｃ領域（Ｆｃノブ、配列番号６４）を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現ベクターｐＨｙｂＥ（Abbott）にクローニングする。同様にＨＦｃ鎖と名付けられた、シグナルペプチド（配列番号６５）、抗ＣＤ４０重鎖Ｆａｂ領域（ＶＨ＋ＣＨ１）（配列番号７１＋配列番号６７）、短いリンカー（配列番号６８）及びＦｃ領域（Ｆｃホール、配列番号６９）を含むポリペプチドをコードする別のＯＲＦを発現ベクターｐＨｙｂＥにクローニングする。抗ＣＤ４０Ｆａｂ−ｂｏｄｙを実施例５における抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ-ｂｏｄｙと同じ方法で発現させ、精製した。
精製した抗ＣＤ４０Ｆａｂ-ｂｏｄｙを非還元条件及び還元条件のもとでＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質は、還元条件下で５０ｋＤａ前後の及び非還元条件下で９８ｋＤａ前後のバンド１本を示した。Ｆａｂ-ｂｏｄｙの２本のポリペプチド鎖の分子量は互いに非常に近いので、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは区別できない。非還元ゲルの結果は２本のポリペプチド鎖が効率的に対合することを示している。
実施例１．７で記載された方法を用いて非還元条件及び還元条件のもとで抗ＣＤ４０Ｆａｂ-ｂｏｄｙにて質量分光分析を行った。抗ＣＤ４０Ｆａｂ-ｂｏｄｙ及びそのポリペプチド鎖の実験的に測定された分子質量は、１０１，２２７（０Ｇ０Ｋ、非還元）、５１，２８９（０Ｇ０Ｋ、還元）及び４９，９４５Ｄａ（０Ｇ０Ｋ、還元）だったが、それらはそれぞれ抗ＣＤ４０Ｆａｂ-ｂｏｄｙ及びＬＦｃ鎖及びＨＦｃ鎖の理論的分子量に一致する。
実施例３９．６にて記載された方法によって抗ＣＤ４０Ｆａｂ-ｂｏｄｙにてＳＥＣ解析を行った。抗ＣＤ４０Ｆａｂ-ｂｏｄｙは９８％単量体で約１００ｋＤａの見かけの分子量を有し、それは理論的分子量に一致する。
実施例４にて記載された抗ＣＤ４０ＭＢｏｄｙと同じ方法で抗ＣＤ４０Ｆａｂ-ｂｏｄｙの抗原結合能及びアゴニスト活性を測定した。親ＣＤ４０抗体及びＦａｂ−ｂｏｄｙは、それぞれ０．２４μｇ／ｍｌ及び０．４７μｇ／ｍｌのＥＣ５０を持って匹敵する親和性でＣＤ４０に結合する。
実施例４．７にて記載されたように細胞表面にて過剰発現されたＣＤ４０によって作動する操作されたＮＦκＢ−ＳＥＡＰを持つＨＥＫ２９３細胞株によって試験抗体のアゴニスト活性を測定した。親ＣＤ４０抗体は０．１２μｇ／ｍｌのＥＣ５０で強いアゴニスト活性を示したのに対して、Ｆａｂ−ｂｏｄｙによるアゴニスト活性は大きく低下し、０．１μｇ／ｍｌまで見られるアゴニスト活性はなかった。
Figure 2016510319
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実施例４１．ＣＤ３及びＨＥＲ２をそれぞれ及び同時に一価で結合することが可能なＦａｂ−ｂｏｄｙの生成
実施例３で述べた理論的根拠に類似して、ＣＤ３とＨＥＲ２を結合するＦａｂ−ｂｏｄｙはＨＥＲ陽性癌細胞を殺傷すること及び腫瘍の治療にて適用される。
ＣＤ３とＨＥＲ２を結合するＤＶＤ−Ｉｇ分子可変ドメインのアミノ酸配列は分子ＤＶＤ０１２（Abbott）から抽出した（表７２）。ＬＦｃ鎖と名付けられた、シグナルペプチド（配列番号６０）、ＤＶＤ−Ｉｇ軽鎖（ＶＬ＋ＣＬ）（配列番号７２＋配列番号６２）、短いリンカー（配列番号６３）及びＦｃ領域（Ｆｃノブ、配列番号６４）を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現ベクターｐＨｙｂＥ（Abbott）にクローニングする。同様にＨＦｃ鎖と名付けられた、シグナルペプチド（配列番号６５）、ＤＶＤ−Ｉｇ重鎖Ｆａｂ領域（ＶＨ＋ＣＨ１）（配列番号７３＋配列番号６７）、短いリンカー（配列番号６８）及びＦｃ領域（Ｆｃホール、配列番号６９）を含むポリペプチドをコードする別のＯＲＦを発現ベクターｐＨｙｂＥにクローニングする。実施例５における抗ｃＭｅｔ−ｈ５Ｄ５Ｆａｂ−ｂｏｄｙと生化学的に同じ方法で、ＣＤ３とＨＥＲ２を一価で結合するＦａｂ−ｂｏｄｙを発現させ、精製する。
精製した抗ＤＶＤ０１２Ｆａｂ-ｂｏｄｙを非還元条件及び還元条件のもとでＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質は、還元条件下で６０ｋＤａ前後の及び非還元条件下で１２０ｋＤａ前後のバンド１本を示した。Ｆａｂ-ｂｏｄｙの２本のポリペプチド鎖の分子量は互いに非常に近いので、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは区別できない。非還元ゲルの結果は２本のポリペプチド鎖が効率的に対合することを示している。
実施例１．７で記載された方法を用いて非還元条件及び還元条件のもとでＤＶＤ０１２Ｆａｂ-ｂｏｄｙにて質量分光分析を行った。の実験的に決定された分子質量。還元条件でのＤＶＤ０１２Ｆａｂ-ｂｏｄｙの質量分光分析は、ＨＦｃ０Ｋ０及びＧ１Ｋ０のグリコシル化状態の理論的分子量に一致する分子量６４，４８５Ｄａ及び６４，６４７Ｄａの一方の鎖と、ＬＦｃが重度にグリコシル化されることを反映し得る６３，８６１Ｄａ及び６４，０２３Ｄａ前後に集まる分子量の第２の鎖とを持つ２本のポリペプチドを明瞭に示した。非還元状態によって分子量１２８，３３８、１２８，５０３及び１２８，６６４Ｄａが得られたが、それはＬＦｃ鎖とＨＦｃ鎖の合計を反映する。
実施例３９．６にて記載された方法によってＤＶＤ０１２Ｆａｂ−ｂｏｄｙでＳＥＣ解析を行った。ＤＶＤ０１２Ｆａｂ−ｂｏｄｙは約１６０ｋＤａの見かけの分子量を有するが、それは１５０ｋＤａより小さい分子量を持つ多数のＦｃ融合タンパク質に共通する。精製したＤＶＤ０１２Ｆａｂ−ｂｏｄｙは９８％を超える単量体を有する。
Figure 2016510319
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ＤＶＤ０１２Ｆａｂ−ｂｏｄｙの抗原結合能をＦＡＣＳアッセイによって評価した。０．５×１０６個のＪｕｒｋａｔ細胞又はＮＣＩ−Ｎ８７細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で洗浄し、５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再浮遊させた。ｍＡｂ又はＦａｂ−ｂｏｄｙを５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液で調製し、細胞と混合し、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏ４８８−Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ， Ｆｃガンマ (Jackson Labs)を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再浮遊させ、４℃で１時間インキュベートし、次いで細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ ｃａｎｔｏ ＩＩ機器(BD Biosciences)で解析した。親ＤＶＤ−Ｉｇ及びＦａｂ−ｂｏｄｙのＣＤ３結合についてのＥＣ５０はそれぞれ８９ｎＭ及び９５ｎＭだった。ＨＥＲ２についてのＥＣ５０はそれぞれ７ｎＭ及び１２ｎＭだった。
ＨＥＲ２発現腫瘍細胞に対するＤＶＤ０１２Ｆａｂ−ｂｏｄｙによる再指示細胞傷害性（ｒＣＴＬ）アッセイを行った。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞（Ｔ）を２×１０４個／ウェルでプレートに播き、ＡＣＥＡ ＲＴ−ＣＥＳ９６穴プレート（ACEA Bio,San Diego）に一晩付着させた。次いでエフェクターＰＢＭＣ細胞（Ｅ）を１×１０６個／ウェルでプレートに播き、５０：１のＥ：Ｔ比を得た。ＤＶＤ−Ｉｇ又はＦａｂ−ｂｏｄｙを適宜希釈して濃度依存性の滴定曲線を得た。ＤＶＤ−Ｉｇで処理した試料における標的の細胞指数を対照標的（処理せず）の細胞指数で割って特定の溶解の比率を算出した。データをグラフにし、Ｐｒｉｓｍ(Graphpad)にてＩＣ５０を算出した。親ＤＶＤ−Ｉｇ及びＦａｂ−ｂｏｄｙは双方とも有効な殺傷を誘導し、そのＥＣ５０はそれぞれ０．５１ｎＭ及び０．２９ｎＭだった。
実施例４２．ＣＤ３とＥＧＦＲをそれぞれ及び同時に一価で結合することが可能なＦａｂ−ｂｏｄｙの生成
上記で述べたように、ＣＤ３とＥＧＦＲを結合するＦａｂ−ｂｏｄｙは癌細胞を殺傷すること及び腫瘍の治療に適用される。
ＣＤ３とＥＧＦＲを結合するＤＶＤ−Ｉｇ分子のアミノ酸配列は分子ＤＢ００１（Abbott）から抽出した（表７３）。ＬＦｃ鎖と名付けられた、シグナルペプチド（配列番号）、ＤＶＤ−Ｉｇ軽鎖（ＶＬ＋ＣＬ）（配列番号７４＋配列番号６２）、短いリンカー（配列番号６３）及びＦｃ領域（Ｆｃノブ、配列番号６４）を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現ベクターｐＨｙｂＥ（Abbott）にクローニングする。同様にＨＦｃ鎖と名付けられた、シグナルペプチド（配列番号６５）、ＤＶＤ−Ｉｇ重鎖Ｆａｂ領域（ＶＨ＋ＣＨ１）（配列番号７５＋配列番号６７）、短いリンカー（配列番号６８）及びＦｃ領域（Ｆｃホール、配列番号６９）を含むポリペプチドをコードする別のＯＲＦを発現ベクターｐＨｙｂＥにクローニングする。本明細書の抗ｃＭｅｔ５Ｄ５Ｆａｂ−ｂｏｄｙと同じ方法で、ＣＤ３とＥＧＦＲに一価で結合するＦａｂ−ｂｏｄｙを発現させ、精製し、生化学的に性状分析した。
Figure 2016510319
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精製したＤＢ００１Ｆａｂ-ｂｏｄｙを非還元条件及び還元条件のもとでＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質は、還元条件下で６０ｋＤａ前後の及び非還元条件下で１２０ｋＤａ前後のバンド１本を示した。Ｆａｂ-ｂｏｄｙの２本のポリペプチド鎖の分子量は互いに非常に近いので、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは区別できない。非還元ゲルの結果は２本のポリペプチド鎖が効率的に対合することを示している。
実施例１．７で記載された方法を用いて非還元条件及び還元条件のもとでＤＢ００１Ｆａｂ-ｂｏｄｙにて質量分光分析を行った。の実験的に決定された分子質量。還元条件でのＤＢ００１Ｆａｂ-ｂｏｄｙの質量分光分析は、ＨＦｃＧ０Ｋ０及びＧ１Ｋ０のグリコシル化状態の理論的分子量に一致する分子量６４，５３０Ｄａ及び６４，６９２Ｄａの一方の鎖と、ＬＦｃＧ０Ｋ０及びＧ１Ｋ０のグリコシル化状態の理論的分子量に一致する６２，８８１Ｄａ及び６３，０４３Ｄａ前後に集まる分子量の第２の鎖とを持つ２本のポリペプチドを明瞭に示した。非還元状態によって分子量１２７，４０５、１２７，５６７及び１２７，７２９Ｄａが得られたが、それはＬＦｃ鎖とＨＦｃ鎖の合計を反映する。
上記で記載されたＤＶＤ０１２Ｆａｂ−ｂｏｄｙと同様に、実施例１．６にて記載された方法によってＤＢ００１Ｆａｂ−ｂｏｄｙでＳＥＣ解析を行った。ＤＢ００１Ｆａｂ−ｂｏｄｙも約１６０ｋＤａの見かけの分子量を有するが、それは１５０ｋＤａより小さい分子量を持つ多数のＦｃ融合タンパク質に共通する。精製されたＤＢ００１Ｆａｂ−ｂｏｄｙは９８％を超える単量体を有する。
ＤＢ００１Ｆａｂ−ｂｏｄｙの抗原結合能をＦＡＣＳアッセイによって評価した。０．５×１０６個のＪｕｒｋａｔ細胞又はＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−７細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で洗浄し、５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再浮遊させた。ｍＡｂ又はＦａｂ−ｂｏｄｙを５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液で調製し、細胞と混合し、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏ４８８−Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ， Ｆｃガンマ (Jackson Labs)を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再浮遊させ、４℃で１時間インキュベートし、次いで細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ ｃａｎｔｏ ＩＩ機器(BD Biosciences)で解析した。親ＤＶＤ−Ｉｇ及びＦａｂ−ｂｏｄｙのＣＤ３結合についてのＥＣ５０はそれぞれ７４ｎＭ及び８０ｎＭだった。ＥＧＦＲについてのＥＣ５０はそれぞれ９ｎＭ及び１５ｎＭだった。
実施例３．５にて記載されたように、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞に対するＤＢ００１Ｆａｂ−ｂｏｄｙによる再指示細胞傷害性（ｒＣＴＬ）アッセイを行った。１．５ｎＭのＥＣ５０を持つ親の抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ ＤＶＤ−Ｉｇ分子ＤＢ０２１に比べて、ＤＢ００１Ｆａｂ−ｂｏｄｙは５．８ｎＭでの相対的に高いＥＣ５０でｒＣＴＬを維持していた。
実施例４３．種々の半Ｉｇ及びその親抗体の構築及び性状分析
図２１は、抗体の種々の構成及び半Ｉｇ結合タンパク質（下列）を設計するのに基礎として使用することができる二価の分子（上列）に基づく免疫グロブリンの模式図を提供する。種々の半Ｉｇ結合タンパク質の構成で示されるように、重鎖抗原結合ドメインを含有するペプチドは軽鎖抗原結合ドメインを含有するペプチドと対合する。半Ｉｇ結合タンパク質の模式図では、半ＤＶＤ結合タンパク質及び半ＴＶＤ結合タンパク質、重鎖及び軽鎖の可変ドメインは単一の抗原結合ドメインを形成する相補性の対として示される。半ＲＡｂ−Ｉｇ結合タンパク質では、定常領域に隣接する可変ドメインが相補性の対として示され、軽鎖抗原結合ドメインを含有するペプチド及び重鎖抗原結合ドメインを含有するペプチドのそれぞれにおける受容体は相互作用せず、独立した結合部位を形成する。これらの半Ｉｇ（半Ｂｏｄｙ又は半ｂｏｄｙとも呼ばれる）は、参照によって本出願に組み入れられる米国特許出願番号＃１３／３３３，５４５にて詳細に記載されている。
米国特許出願番号＃１３／３３３，５４５に従って、抗ｃＭｅｔ１／２Ｉｇ（半Ｉｇ）を生成した。抗ｃＭｅｔ半Ｉｇの図を図２２の左のパネルで示す。ＨＧＦが誘導したｃＭｅｔのリン酸化を上記実施例４にて記載されたように測定した。図２２におけるチャートにて示されるように、抗ｃＭｅｔ半ＩｇはＨＧＦが誘導するｃＭｅｔのリン酸化に対してアンタゴニストとして機能するのに対して通常のｃＭｅｔｍＡｂはＨＧＦが誘導するｃＭｅｔのリン酸化に対してアゴニストとして機能する。
図２１にて示す結合タンパク質は親抗体と比べて劇的に異なる特性を有し得る。たとえば、可変ドメインの配向又は順序及び抗体の価数は双方とも修飾された抗体の機能性を決定するのに重大な役割を担う。図２３は抗ＨＥＲ２抗体であるトラツズマブ及びペルツズマブそれぞれに由来する可変ドメインを有する多数のＤＶＤ−Ｉｇを示す。左のパネルに示すように、ＤＶＤ−Ｉｇの可変ドメインの順を反転することは、ＤＶＤ−Ｉｇの機能性をＨＥＲ２アゴニストからＨＥＲ２アンタゴニストへと変える。抗体の価数もその機能性に影響する。図２３の右のパネルにて示すように、ＤＶＤ−Ｉｇ６８７に基づいて創られた半Ｉｇ（半ＤＶＤ６８７）は親抗体ＤＶＤ−Ｉｇ６８７によって示されるアゴニスト効果を示さない。
実施例４４．価数及び／又は特異性を調整することによって生成される他の抗体構成
図２４は、本明細書で記載される種々の技法によって生成される種々の修飾された抗体構成を示す。これらの技法には、たとえば、点突然変異又は欠失突然変異による結合ドメインの不活化、余分な可変ドメイン又は受容体ドメインの付加による結合ドメインの付加が挙げられる。実施例３５にて記載されたＦｃの操作も使用され得る。
実施例４５．ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の設計及び構築
多価のＩｇを異なるＤＶＤ−Ｉｇ分子の２つの半分、又は半ＤＶＤ−Ｉｇ及び半ＩｇＧ分子と組み合わせて４つの独特の構築物から発現させ、重鎖ＣＨ３のノブ・イントゥ・ホール設計の使用を介して一価の多重特異性分子を創った。ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物は、２つの異なる軽鎖を含有し、一方のアームのＦｃ上で構造修飾を利用して軽鎖とその独自の重鎖との適正な対合を確保する。一例では、重鎖定常領域ＣＨ１が軽鎖定常領域ｈＣｋと交換され；別の例では、重鎖可変領域全体にｈＣｋを足したものが重鎖可変領域にＣＨ１を足したものと交換される。ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物はこれらの独特の構造要件を受け入れるように設計され、ここで記載される。ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物は多数の構成を持つ多重特異性の分子の基盤を記載する。本開示者の目的で、ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物が４つの異なるポリペプチド鎖を含有する場合、それらはポリペプチド１、２、３及び４として標識される。たとえば、図２５を参照のこと。
ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子は２つの異なるＤＶＤ−ＩｇＦａｂアーム、又は半ｍＡｂ１つと半ｍＡｂ１つを組み合わせるように設計される。二重可変ドメインの免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）分子は、２つの異なる親モノクローナル抗体に由来する２つの異なる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が直列で直接、組換えＤＮＡ法を介して連結され、その後に軽鎖定常ドメイン、及び任意でＦｃ領域が続くように設計される。同様に、重鎖は直列に連結された２つの異なる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、それに続く定常ドメインＣＨ１及びＦｃ領域を含む。ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子は一例では、ＣＬ定常領域で交換されるＣＨ１又はＶＬ＋ＣＬで交換されるＶＨ＋ＣＨを組み入れるように設計される。
ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の構築に使用されるアミノ酸配列は以前生成されたクローニングベクターの試料から得た。シグナル配列は、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１、ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３５）Ｖ２（ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ）（配列番号）及びｐＨｙｂＥ−ｈＣｋ Ｖ３ （ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＦＰＧＳＲＣ）（配列番号）に由来した。
ＣＨ２及びＣＨ３のノブ又はホールのアミノ酸配列は野生型のコドン最適化ｈＣｇ１Ｆｃに由来したが、表７４に載せる。
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ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物のベクターは、２９３ ６ｅの形質移入及びタンパク質産生のための構築物設計する場合、各可変ドメインによって置き換えられるスタッファー領域を含有する。ベクターの配列を表７５に示す。
Figure 2016510319
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ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の構築で使用されるリンカーの配列は表７６にて示される。他のリンカー配列が使用されてもよく、それには、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号１３）；ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号１４）；ＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号１５）；ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号１６）；ＳＡＫＴＴＰ（配列番号１７）；ＲＡＤＡＡＰ（配列番号１８）；ＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号１９）；ＲＡＤＡＡＡＡＧＧＰＧＳ（配列番号２０）；ＲＡＤＡＡＡＡ（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２１）；ＳＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号２２）；ＡＤＡＡＰ（配列番号２３）；ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰ（配列番号２４）；ＴＶＡＡＰ（配列番号２５）；ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号２６）；ＱＰＫＡＡＰ（配列番号２７）；ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号２８）；ＡＫＴＴＰＰ（配列番号２９）；ＡＫＴＴＰＰＳＶＴＰＬＡＰ（配列番号３０）；ＡＫＴＴＡＰ（配列番号３１）；ＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号３２）；ＡＳＴＫＧＰ（配列番号３３）；ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号３４），ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３５）；ＧＥＮＫＶＥＹＡＰＡＬＭＡＬＳ（配列番号３６）；ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号３７）；ＧＨＥＡＡＡＶＭＱＶＱＹＰＡＳ（配列番号３８）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号３９）；及びＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号４０）が挙げられる。加えて、内側ドメインを交換するｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物は、以下の配列：ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号４１）；ＡＳＴＶＡＰ（配列番号４２）；ＴＶＡＡＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号４３）；及びＴＶＡＳＴＰ（配列番号４４）を有する、重鎖及び軽鎖のための重鎖及び軽鎖の遷移を軽鎖のための重鎖の遷移に組み合わせるハイブリッド形成した長い又は短いリンカーを利用する。
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リンカー配列の選択は幾つかのＦａｂ分子の結晶構造の解析に基づく。Ｆａｂ又は抗体の分子構造には可変ドメインとＣＨ１／ＣＬ定常ドメインとの間に天然の柔軟な架橋がある。この天然の架橋は、ＶドメインのＣ末端に由来する４〜６の残基及びＣＬ／ＣＨ１ドメインのＮ末端に由来する４〜６の残基が寄与するおよそ１０〜１２のアミノ酸残基を含む。本発明のＤＶＤ−Ｉｇは、それぞれ軽鎖及び重鎖にてＮ末端の５〜６アミノ酸残基又はＣＬ若しくはＣＨ１の１１〜１２アミノ酸残基をリンカーとして用いて生成される。ＣＬ又はＣＨ１のドメインのＮ末端残基、特に最初の５〜６アミノ酸残基は強力な二次構造なしでループ構造を採用するので、２つの可変ドメイン間で柔軟なリンカーとして作用することができる。ＣＬ又はＣＨ１のドメインのＮ末端残基は、それらがＩｇ配列の一部なので可変ドメインの天然の伸長であるので、リンカー及び接合部から生じる可能性がある免疫原性を大幅にできるだけ抑える。
他のリンカー配列には、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの残基すべてではないＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の長さの配列が挙げられる。たとえば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２アミノ酸残基；軽鎖リンカーはＣκ又はＣλに由来することができ；重鎖リンカーは、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、及びＣμを含む任意のアイソタイプのＣＨ１に由来することができる。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（たとえば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）；Ｇ／Ｓに基づく配列（たとえば、Ｇ４Ｓ反復）；ヒンジ領域に由来する配列及び他のタンパク質からの他の天然の配列のような他のタンパク質に由来することもできる。
ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物で可能である複雑性のために及び明瞭性の目的で、ポリペプチド１及び２を「アンカー鎖」と名付ける。アンカー鎖はｈＣｋ（ポリペプチド１）及びＦｃのＣＨ３に存在するノブ変異を持つ重鎖（ポリペプチド２）から成る。ポリペプチド１はポリペプチド２と対合する。「アンカー鎖」及び「多様鎖」の指定は説明のみを目的とし、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
ポリペプチド３及び４を「多様鎖」と名付ける。多様鎖は、交換された断片を伴う重鎖及び軽鎖として定義され、実際、互いにハイブリッドであり、多価分子の１つの軽鎖と１つの重鎖の適切な対合を確保するように設計される。ポリペプチド３はＣＨ３ホール変異及び交換されたＣＨ１領域を持つ重鎖である。
ＣＨ１は、ｈＣｋドメイン又は重鎖可変ドメインの軽鎖定常領域への遷移を受け入れるように設計されたエルボー領域を含有する修飾されたｈＣｋによって置き換えられる。ポリペプチド４は、ＣＨ１Ｆｃドメイン又は重鎖Ｆｃによる軽鎖可変ドメインの遷移を受け入れるように設計されたエルボー領域を持つ修飾されたＣＨ１から成る。
実施例に記載されるように、ポリペプチド２のＣＨ３における変異の種類は、どの変異がポリペプチド３に含有され、ポリペプチド２に対向しなければならないかを決定付ける。たとえば、ポリペプチド２のＣＨ３がノブ変異を含有するのであれば、ポリペプチド３のＣＨ３はホール変異を含有しなければならない。加えて、ポリペプチド３に使用される構築物の種類は、どの種類のポリペプチド４が使用されるかを決定するであろう。たとえば、ポリペプチド３にＰＣｋ２３ｈが選択されるのであれば、そのとき、ポリペプチド４はＰＣＨ１でなければならない。しかしながら、ポリペプチド３が構築物ＰＥＣＫ２３ｈを利用するのであれば、ポリペプチド４はＰＥＣＨ１でなければならない。ＰＥＣＨ１と対合する内側軽鎖可変ドメインの設計は、可変領域と定常領域の間でアルギニンを排除してベクター内にエルボー領域を受け入れる（詳細はエルボー利用の節を参照のこと）。
ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子の構築に使用された適当なベクターの幾つかの組み合わせの例は表７７に載せられる。
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ポリペプチド３と４の間での適正な対合及びポリペプチド１と３及びポリペプチド２と４の間での最少限の誤対合を確保するために、２つの鎖の間での免疫グロブリンの一部の交換を使用する。この目標を達成するための２つの異なった方法が開示される：一方はエルボー領域を使用し、他方の方法はエルボー領域を使用しない。たとえば、Schaefer, et al. 2011を参照のこと。交換を達成する第１の方法は、可変重鎖全体及びＣＨ１ドメインの可変軽鎖及びＣｋドメインによる交換を利用する。これを行うように設計された構築物はエルボー領域を利用せず、ベクターｐＣＫ２３Ｋｎ、ｐＣＫ２３ｈ及びｐＣＨ１を含む。交換を達成する第２の方法は、ＣＨ１ドメインとＣｋドメインのみの交換であり、ベクターｐＥＣＫ２３ｈ、ｐＥＣＫ２３Ｋｎ及びｐＥＣＨ１を含む。これらの構築物の使用は、ＩｇＧにて適正な長さと形状のエルボー領域を受け入れるようにベクター内で設計されたエルボー領域を必要とする。この特に設計されたエルボー領域は、重鎖可変領域の軽鎖定常領域への又は軽鎖可変領域の重鎖定常領域への遷移に必要とされる。ｐＥＣＨ１構築物のみが可変配列領域を設計する際、特定の状況を必要とする。各ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の構成及びバージョンの設計は表７８にて以下で記載される。
Figure 2016510319
実施例４６．ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成１、バージョン１、２及び３
実施例４６．１．ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成１、バージョン１
この実施例で示すｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成１、バージョン１は、ポリペプチド３及び４にてＣＨ１／ＣＬの交換を含有する一価の四重特異性分子である。この分子は抗ＴＮＦ／ＩＬ１７（図２５のＡ、Ｂ）を抗ＩＬ１ａ／ｂ（図２５のＣ、Ｄ）と組み合わせる。可変ドメインの配列は表６に記載されている。構成１、バージョン１は、ＧＳ１０リンカーを伴う抗ＴＮＦ／ＩＬ１７のＶＬ（ポリペプチド１）と、ＧＳ１０リンカーとＣＨ３ノブ変異を伴う抗ＴＮＦ／ＩＬ１７のＶＨ（ポリペプチド２）と、ＧＳリンカーとＳＳリンカー（２サブバージョン）及びＣＨ３ホール変異を持つＥＣｋ交換を伴う抗ＩＬ１ａ／ｂのＶＨ（ポリペプチド３）と、ＧＳリンカーとＳＳリンカー（２サブバージョン）及びＥＣＨ１交換を伴う抗ＩＬ１ａ／ｂのＶＬ（ポリペプチド４）とを含有する。加えて、構成１、バージョン１のｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物は各抗原を標的とするアーム上での交換の影響を検討するように設計される。たとえば、１つの型では、ＴＮＦ／ＩＬ１７はアンカー鎖に置かれ、ＩＬ１ａ／ｂは多様鎖に置かれ、次いで配向が入れ替えられる。その結果、ＴＮＦ／ＩＬ１７が多様アーム上にあり、ＩＬ１ａ／ｂがアンカー鎖上にある。構成１は同時に二価及び２×一価の三重特異性分子であるようにも設計される。
Figure 2016510319
Figure 2016510319
実施例４６．２.ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物構成１、バージョン２
この実施例で示されるｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成１、バージョン２はポリペプチド３及び４にてＶＨ−ＣＨ１／ＶＬ−ＣＬの交換を含有する一価の四重特異性分子である。この分子は、抗ＴＮＦ／ＩＬ１７（図２６のＡ、Ｂ）を抗ＩＬ１ａ／ｂ（図２６のＣ、Ｄ）と組み合わせる。可変ドメインの配列は表６に記載されている。構成１、バージョン２は、ＧＳ１０リンカーを伴う抗ＴＮＦ／ＩＬ１７のＶＬ（ポリペプチド１）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ３ノブ変異を伴う抗ＴＮＦ／ＩＬ１７のＶＨ（ポリペプチド２）と、ＧＳ及びＳＳリンカー（サブバージョン）及びＣＨ３ホール変異によるＣｋの交換を伴う抗ＩＬ１ａ／ｂのＶＬ（ポリペプチド３）と、ＧＳ及びＳＳリンカー（サブバージョン）及びＣＨ１の交換領域を伴う抗ＩＬ１ａ／ｂのＶＨ（ポリペプチド４）とを含有する。構成１の異なるバージョンを持つ同じ配列を含有するこの分子構成の他の２つのバージョンが記載される。加えて、各抗原結合アームに対する交換の影響を検討する２つの種類の構成１、バージョン２が設計される。たとえば、種類の１つでは、ＴＮＦ／ＩＬ１７はアンカー鎖に置かれ、ＩＬ１ａ／ｂは多様鎖に置かれ、次いで配向が入れ替えられる。その結果、ＴＮＦ／ＩＬ１７が多様アーム上にあり、ＩＬ１ａ／ｂがアンカー鎖上にある。
実施例４６．３．ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成１、バージョン３
この実施例で示されるｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成１、バージョン３はポリペプチド３及び４にてＶＨ−ＣＨ１／ＶＬ−ＣＬの交換を含有する一価の四重特異性分子である。この分子は、抗ＴＮＦ／ＩＬ１７（図２７のＡ、Ｂ）を抗ＩＬ１ａ／ｂ（図２７のＣ、Ｄ）と組み合わせる。可変ドメインの配列は表６に記載されている。構成１、バージョン３は、ＧＳ１０リンカーを伴う抗ＴＮＦ／ＩＬ１７のＶＬ（ポリペプチド１）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ３ノブ変異を伴う抗ＴＮＦ／ＩＬ１７のＶＨ（ポリペプチド２）と、ハイブリッドリンカー及びＣＨ３ホール変異によるＣｋの交換を伴うＶＬになる抗ＩＬ１ｂ／ａのＶＨ（ポリペプチド３）と、ハイブリッドリンカー及びＣＨ１の交換を伴うＶＬになる抗ＩＬ１ｂ／ａのＶＨ（ポリペプチド４）とを含有する。加えて、各抗原結合アームに対する交換の影響を検討する２つの種類の構成１、バージョン３が設計される。たとえば、種類の１つでは、ＴＮＦ／ＩＬ１７はアンカー鎖に置かれ、ＩＬ１ｂ／ａは多様鎖に置かれ、次いで配向が入れ替えられる。その結果、ＴＮＦ／ＩＬ１７が多様アーム上にあり、ＩＬ１ｂ／ａがアンカー鎖上にある。
実施例４７．ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成２、バージョン１〜４
実施例４７．１．ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成２、バージョン１
この実施例で示されるｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成２、バージョン１はポリペプチド３及び４にて交換を含有しない一価の三重特異性分子である。この分子は、抗原結合ドメインＡ（図２８）を抗原結合ドメインＢ及びＣ（図２８）と組み合わせる。この構成２バージョン１のｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物は、ＧＳ１０リンカーを伴うＶＬ（ポリペプチド１）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ３ノブ変異を伴うＶＨ（ポリペプチド２）と、ＧＳ１０リンカーを伴い、交換を伴わないＶＨ（ポリペプチド３）と、ＧＳ１０リンカーを伴い、交換を伴わないＶＬ（ポリペプチド４）を含有する。可変ドメインの配列は表７９に示す。
実施例４７．２．ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成２、バージョン２
この実施例で示されるｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成２、バージョン２はポリペプチド３及び４にてＣＨ１／Ｃｋエルボーの交換を含有する一価の三重特異性分子である。この分子は、抗原結合ドメインＡを抗原結合ドメインＢ及びＣと組み合わせる（図２９）。この構成２バージョン２は、ＧＳ１０リンカーを伴うＶＬ（ポリペプチド１）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ３ノブ変異を伴うＶＨ（ポリペプチド２）と、ＧＳ１０リンカー及びエルボー領域とＣｋの交換を伴うＶＨ（ポリペプチド３）と、ＧＳ１０リンカー及びエルボー領域とＣＨ１の交換を伴うＶＬ（ポリペプチド４）とを含有する。可変ドメインの配列は表７９に示す。
実施例４７．３．ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成２、バージョン３
この実施例で示されるｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成２、バージョン３はポリペプチド３及び４にてＶＨ−ＣＨ１／ＶＬ−Ｃｋの交換を含有する一価の三重特異性分子である。この分子は、抗原結合ドメインＡ（図３０）を抗原結合ドメインＢ及びＣ（図３０）と組み合わせる。この構成２バージョン３は、ＧＳ１０リンカーを伴うＶＬ（ポリペプチド１）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ３ノブ変異を伴うＶＨ（ポリペプチド２）と、ＧＳ１０リンカー及びＣｋの交換を伴うＶＬ（ポリペプチド３）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ１の交換を伴うＶＨ（ポリペプチド４）とを含有する。可変ドメインの配列は表７９に示す。
実施例４７．４．ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成２、バージョン４
この実施例で示されるｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成２、バージョン４はポリペプチド３及び４にて内側ドメインのＶＨ−ＣＨ１／ＶＬ−Ｃｋの交換を含有する一価の三重特異性分子である。この分子は、抗原結合ドメインＡ（図３１）を抗原結合ドメインＢ及びＣ（図３１）と組み合わせる。この構成２バージョン４は、ＧＳ１０リンカーを伴うＶＬ（ポリペプチド１）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ３ノブ変異を伴うＶＨ（ポリペプチド２）と、ＶＬへのハイブリッドリンカー及びＣｋの交換を伴うＶＨ（ポリペプチド３）と、ＶＨへのハイブリッドリンカー及びＣＨ１の交換を伴うＶＬ（ポリペプチド４）とを含有する。可変ドメインの配列は表７９に示す。
実施例４８．ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成３、バージョン１〜６
実施例４８．１.ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成３、バージョン１
ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成３、バージョン１は、同時に二価＆一価、二重＆単一特異性の分子、又は一価の三重特異性の分子のいずれかであるように設計される。説明目的で、この実施例では、構成３、バージョン１は、ポリペプチド３及び４にてエルボーによるＣＨ１／ＣＬの交換を含有する一価の三重特異性分子である。この分子は、抗原結合ドメインＡ、Ｂ（図３２）を抗原結合ドメインＣ及びＤ（図３２）と組み合わせる。この構成３バージョン１は、ＧＳ１０リンカーを伴うＶＬ（ポリペプチド１）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ３ノブ変異を伴うＶＨ（ポリペプチド２）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ３ホール変異によるＥＣｋの交換を伴う、ノックアウトされた外側重鎖可変ドメインと重鎖内側ドメインのＶＨ（ポリペプチド３）と、ＧＳ１０リンカー及びＥＣＨ１の交換を伴うＶＬ（ポリペプチド２）とを含有する。加えて、２種類の構成３は各抗原を標的とするアームに対する交換の影響を調べるように設計される。可変ドメインの配列は表７９に示す。
実施例４８．２.ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成３、バージョン２
ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成３、バージョン２は、同時に二価＆一価、二重＆単一特異性の分子、又は一価の三重特異性の分子のいずれかであるように設計される。この実施例では、構成３、バージョン２は、ポリペプチド３及び４にてエルボーによるＣＨ１／ＣＬの交換を含有する一価の三重特異性分子である。この分子は、抗原結合ドメインＡ、Ｂ（図３３）を抗原結合ドメインＣ及びＤ（図３３）と組み合わせる。この構成３バージョン２は、ＧＳ１０リンカーを伴うＶＬ（ポリペプチド１）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ３ノブ変異を伴うＶＨ（ポリペプチド２）と、ＧＳ１０リンカー及びノックアウト内側ドメイン及びＣＨ３ホール変異によるＥＣｋの交換を伴うＶＨ（ポリペプチド３）と、ＧＳ１０リンカー及びＥＣＨ１の交換を伴うＶＬ（ポリペプチド４）とを含有する。加えて、２種類の構成３バージョン２は各抗原を標的とするアームに対する交換の影響を調べるように設計される。可変ドメインの配列は表７９に示す。
実施例４８．３.ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成３、バージョン３
この実施例で示されるｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成３、バージョン３は、ポリペプチド３及び４にてエルボーによるＣＨ１／ＣＬの交換を含有する。この分子は、抗原結合ドメインＡ、Ｂ（図３４）を完全にノックアウトされたアームＣ及びＤ（図３３）と組み合わせる。この実施例では、構成３バージョン３は、ＧＳ１０リンカーを伴うＶＬ（ポリペプチド１）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ３ノブ変異を伴うＶＨ（ポリペプチド２）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ３ホール変異によるＥＣｋの交換を伴うノックアウトされたＶＨ（ポリペプチド３）と、ＧＳ１０リンカー及びＥＣＨ１の交換を伴うＶＬ（ポリペプチド４）とを含有する。加えて、２種類の構成３バージョン３は各抗原を標的とするアームに対する交換の影響を調べるように設計される。可変ドメインの配列は表７９に示す。
実施例４８．４.ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成３、バージョン４
ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成３、バージョン４は、同時に二価＆一価、二重＆単一特異性の分子、又は一価の三重特異性の分子のいずれかであるように設計される。この実施例では、構成３、バージョン４は、ポリペプチド３及び４にてＶＨ−ＣＨ１／ＶＬ−ＣＬの交換を含有する一価の三重特異性分子である。この分子は、抗原結合ドメインＡ、Ｂ（図３５）を抗原結合ドメインＣ及びＤ（図３５）と組み合わせる。この構成３バージョン４は、ＧＳ１０リンカーを伴うＶＬ（ポリペプチド１）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ３ノブ変異を伴うＶＨ（ポリペプチド２）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ３ホール変異によるＣｋの交換を伴う内側ドメインＶＬ（ポリペプチド３）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ１の交換を持つＶＨ内側ドメインを伴うノックアウト外側ドメインＶＨ（ポリペプチド４）を含有する。加えて、２種類の構成３バージョン４は各抗原を標的とするアームに対する交換の影響を検討するように設計される。可変ドメインの配列は表７９に示す。
実施例４８．５.ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成３、バージョン５
ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成３、バージョン５は、同時に二価＆一価、二重＆単一特異性の分子、又は一価の三重特異性の分子のいずれかであるように設計される。この実施例では、構成３、バージョン５は、ポリペプチド３及び４にてＣＨ１／ＶＬ−ＣＬの交換を含有する一価の三重特異性分子である。この分子は、抗原結合ドメインＡ、Ｂ（図３６）を抗原結合ドメインＣ及びＤ（図３６）と組み合わせる。構成３バージョン５は、ＧＳ１０リンカーを伴うＶＬ（ポリペプチド１）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ３ノブ変異を伴うＶＨ（ポリペプチド２）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ３ホール変異によるＣｋの交換を伴うＶＬ（ポリペプチド３）と、ノックアウトされた内側ドメイン及びＧＳ１０リンカー及びＣＨ１の交換を伴うＶＨ（ポリペプチド４）とを含有する。加えて、２種類の構成３バージョン５は各抗原を標的とするアームに対する交換の影響を検討するように設計される。可変ドメインの配列は表７９に示す。
実施例４８．６.ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成３、バージョン６
ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構成３、バージョン６は、ポリペプチド３及び４にてＶＨ−ＣＨ１／ＶＬ−ＣＬの交換を含有する。この分子は、抗原結合ドメインＡ、Ｂ（図３４）を抗原結合ドメインＣ及びＤ（図３７）と組み合わせる。構成３バージョン６は、ＧＳ１０リンカーを伴うＶＬ（ポリペプチド１）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ３ノブ変異を伴うＶＨ（ポリペプチド２）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ３ホールによるＣｋの交換を伴うＶＬ（ポリペプチド３）と、ＧＳ１０リンカー及びＣＨ１の交換を伴う二重ノックアウトＶＨ（ポリペプチド４）とを含有する。加えて、２種類の構成３バージョン６は各抗原を標的とするアームに対する交換の影響を検討するように設計される。可変ドメインの配列は表７９に示す。
実施例４９．標的の定比性及び親和性の調節
ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子は標的の親和性又は定比性をダイヤルアップする又はダイヤルダウンするのに使用され得る。たとえば、図３８に示すように、各標的抗原に特異的な結合ドメインの数は特定の必要性に基づいて調整され得る。その結果、特定の標的抗原に対する結合親和性及びｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物に結合した様々な抗原の定比性も結果的に調節され得る。
実施例５０．様々な病原体に由来する複数の標的分子に特異的な結合分子
本明細書で開示されるｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子及び方法論を用いて様々な病原体に由来する複数の分子を結合することが可能である分子を生成し得る。たとえば、結合分子の一方のアームがＲＳＶの表面上の抗原に結合し得る一方で、結合分子の他方のアームはインフルエンザウイルスの表面上の異なる抗原い結合し得る（図３９）。
実施例５１．ラクダ科動物に基づくドメイン抗体
本明細書で開示されるｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子及び方法論を用いて単一ドメイン抗体（ラクダ科動物に基づくドメイン抗体又はナノボディ）を生成し得る（図４０）。そのようなラクダ抗体は従来の抗体を超える特定の利点を有する。たとえば、ラクダ抗体は低い結合親和性を有しうるので、低いＫｄが望ましい場合に使用され得る。ラクダ科動物に基づくドメイン抗体は軽鎖を必要としないので、製造し易くてもよい。
実施例５２．半分子の分離発現を用いたｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の生成
（１）ＣＨ３の「ノブ・イントゥ・ホール」設計を介したＦｃヘテロ二量体の形成、及び（２）「還元次いで酸化」を用いたタンパク質製造段階での２つの別々の半ＩｇＧ分子の対合を用いてｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子を生成する。
「分離発現」及び「先ず還元、次いで酸化」のアプローチを用いて２つの半分子を別々に発現させ、次いで最終分子にてそれらを再連結する詳細な手順は、参照によって本開示に組み入れられるＵＳ特許出願ＷＯ２０１２／１０６５８７Ａ１及びＷＯ２０１２／１４３５２３Ａ１にて記載されている。ＷＯ２０１２／１０６５８７Ａ１の６５〜６７ページは２つの別々の発現させた半分子をどのようにヘテロ多量体タンパク質に組み立てるかを記載している。
ＣＨ３ドメインにて「ノブ・イントゥ・ホール」設計を伴う通常のＤＶＤ−Ｉｇ分子をこのアプローチに使用する。図４１に示すように、２つの半分子を別々に発現させ、次いで還元し、酸化して最終的な四重特異性分子に組み立てる。
図４２に示すように、このアプローチを用いて三重特異性分子を生成することもできる。ＣＨ３ドメインにて「ノブ・イントゥ・ホール」設計を伴うＤＶＤ−Ｉｇ／通常のＩｇのハイブリッド分子が使用される。
実施例５３．２９３細胞におけるｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の形質移入及び発現並びにｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の性状分析
抗原Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤにそれぞれ特異的な４つの親モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを用いて、３〜４の抗原を結合することが可能なｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子をコードする発現ベクターを構築した。
相当する軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）の核酸を含有するプラスミドでＨＥＫ２９３細胞（ＥＢＮＡ）に一時的に同時形質移入することによって参照ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の発現を達成した。フラスコ（2L Corning Cat# 431198）にて０．５Ｌ規模でＣＯ２インキュベータ（８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ、３７℃）で振盪しながらフリースタイル２９３培地（Invitrogen, Carlsbad Calif.）においてＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞を増殖させた。培養物が１×１０６細胞／ｍｌの密度に達すると形質移入複合体で細胞に形質移入した。形質移入複合体は、先ず２５ｍｌのフリースタイル培地にて１５０μｇのＬＣ−プラスミドと１００μｇのＨＣ−プラスミドを一緒に混合し、その後、５００μｌのＰＥＩストック溶液［ストック溶液：１ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ７．０）の線状２５ｋＤａのＰＥＩ、Polysciences Cat# 23966］を添加することによって調製した。形質移入複合体を反転によって混合し、室温で２０分間インキュベートした後、細胞培養物に添加した。形質移入に続いて、ＣＯ２インキュベータ（８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ、３７℃）にて培養物を増殖させ続けた。形質移入の２４時間後、２５ｍｌの１０％トリプトンＮ１溶液（Organo Technie, La Courneuve France Cat# 19553）で培養物を補完した。形質移入の９日後、遠心分離（１６，０００ｇ、１０分間）によって細胞を培養物から取り出し、保持された上清を無菌濾過し（Millipore HV Durapore Stericup, ０．４５μｍ）、精製工程の開始まで４℃に置いた。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂(GE Healthcare)を含有する使い捨ての２ｍｌの充填カラム（Orochem Technologiesによって充填された）を用いて各各ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物を個々に精製した。カラムをＰＢＳで予め平衡化し、次いで、素通り画分を供給容器に循環し戻しながら、回収した０．５５Ｌの試料を１ｍｌ／分で一晩（１５時間）負荷した。負荷工程に続いて、カラムを２０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、４ｍｌ／分で溶出緩衝液（５０ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．５）を供給し、すでに０．２ｍｌの１．５Ｍトリス、ｐＨ８．２（最終ｐＨをおよそ６．０に橋渡しする）を含有する試験管にて分画を回収することによってタンパク質を溶出した。抗体を含有する分画をクロマト図に基づいてプールし、最終保存緩衝液（１０ｍＭのクエン酸、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ６．０）にて透析した。透析に続いて、０．２２μｍのＳｔｅｒｉｆｌｉｐ(Millipore)を介して試料を濾過し、吸光度（Hewlett Packard 8453、ダイオードアレイ分光光度計）によってタンパク質濃度を決定した。分析用試料でＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（還元及び非還元の双方で）を行い、最終的な純度を評価し、およその大きさの重鎖及び軽鎖のバンドの存在を検証し、有意な量の遊離の（たとえば、複合体化していない）軽鎖（非還元試料にて）及び誤対合したｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の非存在を確認した。
抗Ａ／Ｂ／Ｃ／ＤｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の結合親和性をタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ及びタンパク質Ｄに対するＢｉａｃｏｒｅにて解析する。Ｂｉａｃｏｒｅでの多重結合試験によってｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の多価特性を調べる。一方で、タンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ及びタンパク質Ｄに対するｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の中和能を本明細書で記載されるようにそれぞれバイオアッセイによって評価する。元々の親ｍＡｂの親和性及び能力を最も保持するｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子を本明細書で記載されるような詳細な物理化学的な性状分析のために選択する。
ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の物理化学的な分析及び試験管内安定性の分析及びサイズ排除クロマトグラフィ
ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物を水で２．５μｇ／ｍｌに希釈し、２０ｍｌをＴＳＫゲルＧ３０００ ＳＷＸＬカラム (Tosoh Bioscience, cat# k5539-05k)を用いた島津ＨＰＬＣシステムで解析する。２１１ｍＭの硫酸ナトリウム、９２ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０によって０．３ｍｌ／分の流速にて試料をカラムから溶出する。ＨＰＣＬシステムを操作する条件を以下に列記する：
移動相：２１１ｍＭのＮａ２ＳＯ４、９２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４．７Ｈ２Ｏ，ｐＨ７．０
勾配：定組成
流速：０．３ｍｌ／分
検出器波長：２８０ｎｍ
自動試料採取器の冷却器温度：４℃
カラムオーブンの温度：常温
実行時間：５０分
還元条件及び変性条件双方のもとでドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によってｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物を解析する。還元条件については、１００ｍＭのＤＴＴを伴う２×トリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（Invitrogen, cat# LC2676, lot# 1323208）と試料を１：１で混合し、ＢＭＥ（β−メルカプトエタノール）の存在下で９０℃で１０分間加熱する。変性条件については、試料を試料緩衝液と１：１で混合し、９０℃で１０分間加熱する。還元した試料及び変性させた試料（レーン当たり１０μｇ）を１２％の予め成形したトリス／グリシンゲル（Invitrogen, cat# EC6005box, lot# 6111021）に負荷する。ＳｅｅＢｌｕｅＰｌｕｓ２（Invitrogen, cat#LC5925, lot# 1351542）を分子量マーカーとして使用する。ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋミニセルゲルボックス(Invitrogen, cat# EI0001)にてゲルを作動させ、先ず７５ボルトを印加してゲル中に試料を堆積させ、その後、色素の先頭がゲルの底に達するまで１２５ボルトの電圧を印加することによってタンパク質を分離する。使用される移動緩衝液は、１０×トリスグリシンＳＤＳ緩衝液（ABC, MPS-79-080106)）から調製される１×トリスグリシンＳＤＳ緩衝液である。コロイド状ブルー染色（Invitrogen cat# 46-7015, 46-7016）によって一晩ゲルを染色し、背景が透明になるまでミリＱ水で脱色する。次いで染色したゲルをＥｐｓｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎスキャナー(model 1680, S/N DASX003641)を用いて走査する。
物理化学的な及び薬学的な特性
生物薬剤（抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ又はｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物）による治療上の処置は、高い用量、多くは数ｍｇ／ｋｇの投与を必要とすることが多い（通常大きな分子量の結果として質量基準で効能が低いために）。患者のコンプライアンスの便宜を図り、慢性疾患の治療法及び外来治療に適正に対処するために、治療用ｍＡｂの皮下（ｓ.ｃ.）又は筋肉内（ｉ.ｍ.）の投与が望ましい。たとえば、ｓ.ｃ.投与の最大の望ましい容量は約１．０ｍｌなので、＞１００ｍｇ／ｍｌの濃度が投与当たりの注射の回数を制限するために望ましい。実施形態では、治療用の生物薬剤は単回投与で投与される。しかしながら、そのような製剤の開発は、タンパク質／タンパク質の相互作用（たとえば、免疫原性のリスクを高める可能性がある凝集）によって、及び処理及び送達の間での制約（たとえば、粘性）によって制約される。その結果、臨床上の有効性に必要とされる大きな量及び関連する開発上の制約が、製剤化の可能性及び高用量投薬計画でのｓ.ｃ.投与の完全な実施を制限する。たとえば、安定性、溶解性及び粘度の特徴のような、タンパク質分子及びタンパク質溶液の物理化学的な及び薬学的な特性が最大限重要であることは明らかである。
安定性
「安定な」生物製剤は、その中の生物剤がその物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物活性を保存の際本質的に保持するものである。安定性は選択される温度にて選択される時間で測定することができる。実施形態では、製剤における生物剤は室温（約３０℃）若しくは４０℃で少なくとも１ヵ月安定であり、及び／又は約２〜８℃で少なくとも１年、少なくとも２年安定である。さらに、実施形態では、以後「凍結／融解サイクル」と呼ばれる凍結（たとえば、−７０℃に）及び融解の後、製剤は安定である。別の例では、「安定な」製剤はタンパク質の約１０％未満及び約５％未満が製剤にて凝集体として存在するものである。
種々の温度にて長い時間、試験管内で安定なｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物が望ましい。高い温度、たとえば、４０℃で２〜４週間、試験管内で安定な親Ａｂを迅速にスクリーニングすることによってこれを達成することができ、安定性を評価することができる。２〜８℃での保存の間、タンパク質は少なくとも１２ヵ月、たとえば、少なくとも２４ヵ月安定性を示す。安定性（単量体で無傷の分子の％）は、たとえば、カチオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、と同様に生物活性試験のような種々の技法を用いて評価することができる。共有結合及び構造上の修飾を分析するのに採用され得る分析法のさらに包括的なリストについては、Jones, A. J. S. (1993) Analytical methods for the assessment of protein formulations and delivery systems. In: Cleland, J. L.; Langer, R., editors. Formulation and delivery of peptides and proteins, 1st edition, Washington, ACS, pg. 22-45; and Pearlman, R.; Nguyen, T. H. (1990) Analysis of protein drugs. In: Lee, V. H., editor. Peptide and protein drug delivery, 1st edition, New York, Marcel Dekker, Inc., pg. 247-301.を参照のこと。
不均質性及び凝集体の形成：生物剤の安定性は、凝集体として存在するＧＭＰ抗体物質において処方が約１０％未満を示し得る、実施形態では、約５％未満、別の実施形態では、約２％未満、実施形態では、０．５〜１．５％以下の範囲内を示し得るようであり得る。サイズ排除クロマトグラフィは、タンパク質凝集体の検出にて感度の高い、再現性のある且つ非常に堅固である方法である。
低レベルの凝集体に加えて、生物剤は、実施形態では、化学的に安定でなければならない。化学的な安定性はイオン交換クロマトグラフィ（たとえば、カチオン又はアニオン交換クロマトグラフィ）、疎水性相互作用クロマトグラフィ、又は等電点電気泳動若しくはキャピラリー電気泳動のような他の方法によって測定され得る。たとえば、抗体の化学的な安定性は、２〜８℃での少なくとも１２カ月の保存の後、カチオン交換クロマトグラフィにおける未修飾抗体を表すピークが、保存試験前の抗体溶液に比べて、２０％以下、実施形態では、１０％以下、又は別の実施形態では、５％以下上昇し得るようなものであり得る。
実施形態では、親抗体は構造上の整合性、正しいジスルフィド結合の形成及び正しい折り畳みを提示する。抗体ＤＶＤ−Ｉｇ又はｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の二次構造又は三次構造における変化による化学的な不安定性は抗体の活性に影響を与え得る。たとえば、抗体の活性によって示されるような安定性は、２〜８℃での少なくとも１２カ月の保存の後、抗体の活性が保存試験前の抗体溶液に比べて、５０％以下、実施形態では、３０％以下、又はさらに１０％以下、又は実施形態では、５％又は１％以下低下するようなものであり得る。好適な抗原結合アッセイを用いて抗体の活性を測定することができる。
溶解性
ｍＡｂ、ＤＶＤ−Ｉｇ又はｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の「溶解性」は正しく折り畳まれた単量体のＩｇＧの産生に相関する。従って、ＩｇＧの溶解性はＨＰＬＣによって評価され得る。たとえば、可溶性（単量体）のＩｇＧはＨＰＬＣのクロマト図で単一ピークを生じるのに対して、不溶性（たとえば、多量体及び凝集した）のＩｇＧは複数のピークを生じる。従って、当業者は日常のＨＰＣＬ法を用いてＩｇＧの溶解性の増減を検出することができる。溶解性を分析するのに採用され得る分析法のさらに包括的なリストについては、Jones, A. G. Dep. Chem. Biochem. Eng., Univ. Coll. London, London, UK. Editor(s): Shamlou, P. Ayazi. Process. Solid-Liq. Suspensions (1993), 93-117. Publisher: Butterworth-Heinemann, Oxford, UK and Pearlman, Rodney; Nguyen, Tue H, Advances in Parenteral Sciences (1990), 4 (Pept. Protein Drug Delivery), 247-301を参照のこと。治療用ｍＡｂの溶解性は、適正な投与に必要とされることが多い高濃度に製剤化するのに決定的に重要である。本明細書で概説するように、効率的な抗体の投与に便宜を図るには、たとえば、＞１００ｍｇ／ｍｌの溶解性が必要とされ得る。たとえば、抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ又はｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の溶解性は、研究の早期では約５ｍｇ／ｍｌ以上、実施形態では、高度処理の科学段階で約２５ｍｇ／ｍｌ以上、実施形態では、約１００ｍｇ／ｍｌ以上、又は実施形態では、約１５０ｍｇ／ｍｌ以上であり得る。タンパク質分子の固有の特性、たとえば、安定性、溶解性、粘性のようなタンパク質溶液の物理化学的な特性が重要であることは当業者に明白である。しかしながら、当業者は、添加剤として使用され得る広範な種々の賦形剤が最終的なタンパク質製剤の特徴に有益に影響することを十分に理解するであろう。これらの賦形剤には、（ｉ）液体溶媒、共溶媒（たとえば、エタノールのようなアルコール）；（ｉｉ）緩衝剤（たとえば、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、アミノ酸の緩衝液）；（ｉｉｉ）糖又は糖アルコール（たとえば、スクロース、トレハロース、フルクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、デキストラン）；（ｉｖ）界面活性剤（たとえば、ポリソルベート２０、４０、６０、８０、ポロキサマー）；（ｖ）等張性調節剤（たとえば、ＮａＣｌのような塩、糖、糖アルコール）；及び（ｖｉ）その他（たとえば、保存剤、キレート剤、抗酸化剤、キレート基質（たとえば、ＥＤＴＡ）、生分解性ポリマー、担体分子（たとえば、ＨＳＡ、ＰＥＧ）が挙げられ得る。
粘性は、抗体の製造及び抗体の処理（たとえば、透析濾過／限外濾過）、完全仕上げ加工（ポンプ態様、濾過態様）及び送達態様（注射針通過、最新の用具送達）に関して重要性の高いパラメータである。低い粘性は、さらに高い濃度を有する抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ又はｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の液体溶液を可能にする。これは、同じ用量を少ない体積で投与し得ることを可能にする。少ない注射容量は注射の知覚で少ない疼痛の利点を内在し、溶液は患者にて注射の疼痛を軽減するために必ずしも等張である必要はない。抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ又はｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の溶液の粘度は、１００（１／ｓ）抗体溶液粘度の剪断率が、２００ｍＰａを下回る、実施形態では、１２５ｍＰａを下回る、別の実施形態では、７０ｍＰａを下回る、さらに別の実施形態では、２５ｍＰａ又はさらに１０ｍＰａを下回るようなものであり得る。
ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子を特定し、性状分析するのに使用されたアッセイ
特に言及されない限り、実施例全体を通して以下のアッセイを用いてｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物を特定し、性状分析した。
親抗体及びｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物のその標的抗原に対する結合及び親和性を測定するのに使用したアッセイ
直接結合ＥＬＩＳＡ
所望の標的抗原を結合する抗体をスクリーニングするための酵素結合免疫吸着アッセイを以下のように実施した。４℃にてリン酸緩衝化生理食塩水（10×PBS, Abbott Bioresearch Center, Media Prep# MPS-073, Worcester, Mass）における１００μＬ／ウェルの１０μｇ／ｍｌの所望の標的抗原（R&D Systems, Minneapolis, Minn.）又は所望の標的抗原の細胞外ドメイン／ＦＣ融合タンパク質（R&D Systems, Minneapolis, Minn.）又はモノクローナルマウス抗ポリヒスチジン抗体（R&D Systems # MAB050, Minneapolis, Minn.）によって高結合ＥＬＩＳＡプレート（Corning Costar # 3369, Acton, Mass.）を一晩コーティングした。０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳでプレートを４回洗浄した。室温で１／２時間、３００μｌ／ウェルのブロッキング溶液（脱脂粉乳、種々の小売供給業者、ＰＢＳで２％に希釈）の添加によってプレートをブロックした。ブロックの後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳでプレートを４回洗浄した。
或いは、上述のようにモノクローナルマウス抗ポリヒスチジン抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに１００μ１／ウェルの１０μｇ／ｍｌのヒスチジンタグを付けた所望の標的抗原（R&D Systems, Minneapolis, Minn.）を加え、室温で１時間インキュベートした。０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳでウェルを４回洗浄した。
上述のように調製した所望の標的抗原のプレート又は所望の標的抗原／ＦＣ融合のプレート又は抗ポリヒスチジン抗体／ヒスチジンタグを付けた所望の標的抗原のプレートに、上述のようなブロッキング溶液で希釈した１００μｌの抗体又はｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の調製物を加え、室温で１時間インキュベートした。０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳでウェルを４回洗浄した。
所望の標的抗原のプレート又は抗ポリヒスチジン抗体／ヒスチジンタグを付けた所望の標的抗原のプレートの各ウェルに１００μｌの１０ｎｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ特異的なＨＲＰ結合の抗体（Southern Biotech # 2040-05, Birmingham, Ala.）を加えた。或いは、所望の標的抗原／ＦＣ融合のプレートの各ウェルに１００μｌの１０ｎｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧκ軽鎖特異的なＨＲＰ結合の抗体（Southern Biotech # 2060-05 Birmingham, Ala.）を加え、室温で１時間インキュベートした。０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳでプレートを４回洗浄した。
１００μｌの増強ＴＭＢ溶液（Neogen Corp. #308177, K Blue, Lexington, Ky.）を各ウェルに加え、室温で１０分間インキュベートした。５０μｌの１Ｎの硫酸の添加によって反応を止めた。４５０ｎｍの波長にて分光光度計でプレートを読み取った。
捕捉ＥＬＩＳＡ
抗ヒトＦｃ抗体（ＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌ、Jackson Immunoresearch, West Grove, Pa.）と共にＥＬＩＳＡプレート（Nunc, MaxiSorp, Rochester, N.Y.）を４℃にて一晩インキュベートする。洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）でプレートを３回洗浄し、ブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）にて２５℃で１時間ブロックする。ウェルを３回洗浄し、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳにおける各抗体又はｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の連続希釈物をウェルに加え、２５℃で１時間インキュベートする。ウェルを３回洗浄し、ビオチン化抗原（２ｎＭ）をプレートに加え、２５℃で１時間インキュベートする。ウェルを３回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（KPL #474-3000, Gaithersburg, Md）と共に２５℃で１時間インキュベートする。ウェルを３回洗浄し、ウェル当たり１００μｌのＵＬＴＲＡ−ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ(Pierce, Rockford, Ill.)を加える。発色に続いて、1ＮのＨＣｌで反応を止め、４５０ｎｍでの吸光度を測定する。
Ｂｉａｃｏｒｅ技術を用いた親和性測定
Ｂｉａｃｏｒｅ法
Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ（Biacore, Inc, Piscataway, N.J）は、オン速度定数及びオフ速度定数の動的測定によって抗体又はｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の親和性を測定する。２５℃にて実行ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．００５％
の界面活性剤Ｐ２０）を用いるＢｉａｃｏｒｅＲ１０００又は３０００機器（Biacore（登録商標） AB, Uppsala, Sweden）による表面プラスモン共鳴に基づく測定によって標的抗原（たとえば、精製した組換え標的抗原）への抗体又はｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の結合を測定する。化学物質はすべてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ（Uppsala, Sweden）から得る、又はさもなければ、本文に記載されるような異なる供給源から得る。たとえば、製造元の指示書と手順に従って標準のアミンカップリングキットを用いてＣＭ５研究等級のバイオセンサーチップ全体に２５μｇ／ｍｌで、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で希釈したおよそ５０００ＲＵのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃγ）、断片特異的なポリクローナル抗体（Pierce Biotechnology Inc, Rockford, Ill.）を直接不動化する。バイオセンサー表面上の未反応の部分をエタノールアミンでブロックする。フローセル２及び４における修飾されたカルボキシメチルデキストラン表面を反応表面として使用する。フローセル１及び３におけるヤギ抗マウスＩｇＧを含まない未修飾のカルボキシメチルデキストラン表面を参照表面として使用する。動的な解析については、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４.０．１ソフトウエアを使用しながら、８回の注入すべての会合相及び解離相に、１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに由来する反応速度式を同時に適合させる（グローバルフィット解析を用いて）。ヤギ抗マウスＩｇＧに特異的な反応表面全域での捕捉のために精製した抗体又はｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物をＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水で希釈する。リガンド（２５μｇ／ｍｌ）として捕捉される抗体又はｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物を５μｌ／分の流速で反応マトリクス全体に注入する。２５μｌ／分の連続流速のもとで会合及び解離の速度定数Ｋｏｎ（Ｍ−１ｓ−１）及びＫｏｆｆ（ｓ−１）を測定する。１０〜２００ｎＭの範囲での様々な抗原濃度で動的な結合測定を行うことによって速度定数を導き出す。次いで抗体又はｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物と標的抗原との間の反応の平衡解離定数（Ｍ）を以下の式ＫＤ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎによる動的速度定数から算出する。結合を時間の関数として記録し、動的速度定数を算出する。このアッセイでは、１０６Ｍ−１ｓ−１ほど速いオン速度及び１０−６ｓ−１ほど遅いオフ速度を測定することができる。
ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物の機能的な活性を測定するのに使用されたアッセイ
ＩＬ−１α／βバイオアッセイ及び中和アッセイ
１００μｌの容量でウェル当たり１．５〜２×１０４個でＭＲＣ５細胞をプレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２にて一晩インキュベートした。完全ＭＥＭ培地にて抗体の２０μｇ／ｍｌの作業ストック（４×に濃縮）を調製した。Ｍａｒｓｈ希釈プレートにて完全ＭＥＭで８点の連続希釈（５μｇ／ｍｌ〜０．０００３μｇ／ｍｌ）を行った。６５μｌ／ウェルの各抗体希釈物を４つ組で９６穴Ｖ底プレート（Costar# 3894）に加え、６５μｌの２００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１α若しくはＩＬ−１βの溶液、又はＩＬ−１α若しくはＩＬ−１βの５０ｐｇ／ｍｌ溶液を含有する６５μｌの混合溶液を加えた。対照ウェルには、６５μＬの２００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１α若しくはＩＬ−１β又は５０ｐｇ／ｍＬの混合したＩＬ−１α／β（４×濃縮）＋６５μＬのＭＥＭ培地を入れ、培地対照には１３０μｌの培地を入れた。１時間のインキュベートに続いて、１００μｌのＡｂ／Ａｇ混合物をＭＲＣ細胞に加えた。ウェルの容量はすべて２００μｌに等しかった。プレートの試薬はすべてそのとき１×濃縮だった。１６〜２０時間のインキュベートの後、ウェルの内容物（１５０μｌ）を９６穴丸底プレート（Costar# 3799）に移し、−２０℃に置いた。ヒトＩＬ−８ＥＬＩＳＡキット (R&D Systems, Minneapolis, Minn.)又はＭＳＤ ｈＩＬ−８(chemiluminescence kit)を用いることによってｈＩＬ−８のレベルについて上清を調べた。ＩＬ−１α、ＩＬ−１β又はＩＬ−１α／βのみの対照値に対するパーセント阻害を算出することによって中和能を決定した。
ＩＬ−１７のバイオアッセイ及び中和アッセイ
ヒトＨＳ２７細胞株（ATCC #CRL-1634）はＩＬ−１７に応答してＩＬ−６を分泌する。ＩＬ−１７が誘導するＩＬ−６の分泌は中和する抗ＩＬ−１７抗体によって阻害される（たとえば、J. Immunol. 155:5483-5486, 1995 or Cytokine 9:794-800, 1997を参照のこと）。
アッセイ培地（１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ＃２６１４０）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、ペニシリンＧ（１００Ｕ／５００ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／５００ｍｌ）を伴ったＤＭＥＭ高グルコース培地（Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５））にてＨＳ２７細胞を維持する。アッセイ当日に約８０〜９０％の集密度になるまでＴ１５０フラスコにて細胞を増殖させる。ヒトＩＬ−１７（R&D Systems, #317-IL/CF）をＣａ２＋及びＭｇ２＋を含まない無菌ＰＢＳにて再構成し、凍結保存し、使用のために新しく融解し、アッセイ培地で４０ｎｇ／ｍｌ（４×）に希釈した。別のプレートで抗体の連続希釈を行い（４×濃度）、等量の４０ｎｇ／ｍｌ（４×）のｈｕＩＬ−１７と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。ＨＳ２７細胞（通常５０μｌのアッセイ培地中で約２０，０００個）を９６穴平底組織培養プレート（Costar #3599）の各ウェルに加え、その後、５０μｌの予めインキュベートした抗体＋ＩＬ−１７を添加した。ＩＬ−１７の最終濃度は１０ｎｇ／ｍｌである。細胞を３７℃で約２４時間インキュベートした。次いで培地上清を回収した。製造元の指示書に従って、市販のＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙキット用いて上清にてＩＬ−６の量を測定することによってＩＬ−１７中和のレベルを測定した。ＩＬ−６量の可変傾きの適合に対する抗体の対数を用いてＩＣ５０値を得た（表１３）。
ｈｕＴＮＦαの中和
Ｌ９２９細胞を半集密密度まで増殖させ、０．０５％トリプシン（Gibco #25300）を用いて回収した。細胞をＰＢＳで洗浄し、数え、４μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを含有するアッセイ培地に１×１０６個／ｍｌで再浮遊させた。５０μｌの容量で５×１０４個／ウェルにて９６穴プレート（Costar#3599）に細胞を播いた。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）及び対照ＩｇＧをアッセイ培地で４×濃度に希釈し、１：３の連続希釈を調製した。ｈｕＴＮＦαをアッセイ培地で４００ｐｇ／ｍｌに希釈した。１：２の希釈スキームで抗体試料（２００μｌ）をｈｕＴＮＦα（２００μｌ）に加え、室温で０．５時間インキュベートした。１００ｐｇ／ｍｌのｈｕＴＮＦαと２５ｎＭ〜０．０００１４ｎＭのｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の最終濃度について１００μｌでｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）／ｈｕＴＮＦαの溶液をプレートに入れた細胞に加えた。３７℃、５％ＣＯ２にてプレートを２０時間インキュベートした。生存率を定量するために、ウェルから１００μｌを取り出し、１０μｌのＷＳＴ−１試薬（Roche cat# 11644807001）を加えた。アッセイ条件下でプレートを３．５時間インキュベートし、５００×ｇにて遠心分離し、７５μｌの上清をＥＬＩＳＡプレート（Costar cat#3369）に移した。Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ １９０ ＥＬＩＳＡプレートリーダーにてＯＤ４２０〜６００ｎｍでプレートを読み取った。幾つかのアッセイに由来する平均のＥＣ５０を表１４に含める。
ＦＡＣＳに基づく再指示細胞傷害性（ｒＣＴＬ）アッセイ
負の選択濃縮カラム（R&D Systems, Minneapolis, Minn.; Cat.#HTCC-525）によってヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を以前凍結した単離末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。Ｄ−ＰＢＳ(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)中の１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３(OKT-3, eBioscience, Inc., San Diego, Calif.)及び２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８(CD28.2, eBioscience, Inc., San Diego, Calif.)によってコーティングしたフラスコ（換気キャップ, Corning, Acton, Mass）にてＴ細胞を４日間刺激し、Ｌ−グルタミン、５５ｍＭの１−ＭＥ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０％ＦＢＳを伴った完全ＲＰＭＩ１６４０培地 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)における３０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２(Roche)にて培養した。次いで、アッセイにて使用する前に一晩３０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２にてＴ細胞を休ませた。ＤｏＨＨ２又はＲａｊｉ標的細胞を製造元の指示書に従ってＰＫＨ２６（Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.）で標識した。Ｌ−グルタミンと１０％ＦＢＳ（Hyclone, Logan, Utah）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（フェノールなし, Invitrogen, Carlsbad, Calif）をｒＣＴＬアッセイの全体を通して使用した（Dreier et al. (2002) Int J Cancer 100:690を参照）。
エフェクターＴ細胞（Ｅ）及び標的（Ｔ）をそれぞれ１０５及び１０４個／ウェルの最終細胞濃度にて９６穴プレート（Costar #3799, Acton, Mass.）に入れ、１０：１のＥ：Ｔの比を得た。ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）分子を希釈して濃度依存性の滴定曲線を得た。一晩のインキュベートの後、細胞をペレットにし、Ｄ−ＰＢＳで１回洗浄した後、Ｄ−ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ（Invitrogen, Carlsbad, Calif）、０．１％のアジ化ナトリウム及び０．５ｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含有するＦＡＣＳ緩衝液に再浮遊させた。ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩマシーン (Becton Dickinson, San Jose, Calif.)でＦＡＣＳデータを集め、Ｆｌｏｗｊｏ(Treestar)にて解析した。標的全体（対照、無処理）のパーセントで割ったｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物で処理した試料における生存標的のパーセントを算出して特異的溶解のパーセントを決定した。ＩＣ５０はＰｒｉｓｍ(Graphpad)にて算出した。
結果
それぞれＩＬ−１ａ，ＩＬ−１ｂ、ＴＮＦ及びＩＬ−１７に特異的な可変ドメインを含む８種のｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）構築物を本明細書の表８０にて示すように設計した。ＨＥＫ２９３細胞の２５０ｍｌの培養物にて各ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）クローンの完全長の構築物が発現され、分泌されたｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）の総収率を測定した。この分析の結果（本明細書の表８０にて示す）は、４〜１０ｍｇの各ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）クローンが発現されたことを示している。質量分光分析を支配することによってｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）１、２及び４について発現されたタンパク質をさらに特徴付けた。この分析の結果（本明細書の表８１にて示す）は、ＨＥＫ２９３細胞で発現させた場合、予想された質量の約０〜１０Ｄａの範囲内で各ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）クローンの個々の軽鎖及び重鎖が産生されることを示している。
上記で記載したように、表面プラスモン共鳴によって、ＩＬ−１ａ，ＩＬ−１ｂ、ＴＮＦ及びＩＬ−１７に同時に結合するｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）クローンの能力を測定した。具体的には、ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）クローン４をサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって精製し、ｈｕＩｇＧＦＣ（１００００ＲＵ）でコーティングした表面プラスモン共鳴センサーに捕捉させた。１μｇ／ｍｌのｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）クローン４が捕捉された（１０μｌ＠５μｌ／分）。２５μｌの各抗原（５００ｎＭ）を１０μｌ／分で順次注入し、不動化されたｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）クローン４への結合の量を測定した。この分析の結果（本明細書の表４３にて示す）は、ｐＤＶＤ−Ｉｇ（商標）クローン４がおよそ１：１：１：１の定比性でＩＬ−１ａ，ＩＬ−１ｂ、ＴＮＦ及びＩＬ−１７に同時に結合することができることを示している。
Figure 2016510319
Figure 2016510319
参照による組み入れ
本出願の全体を通して引用され得る引用文献（参考文献、特許、特許出願、及びウェブサイトを含む）すべての内容は、その中で引用された参照のように目的に応じてその全体が参照によって明白に本明細書に組み入れられる。本開示は、特に指示されない限り、当該技術で周知である免疫学、分子生物学及び細胞生物学の従来技法を採用するであろう。
本開示はまた参照によって分子生物学及び薬剤送達の分野で周知の技法を完全な形で組み入れる。これらの技法には、以下の出版物で記載された技法が挙げられるが、これらに限定されない：
Atwell et al. J. Mol. Biol. 1997, 270: 26-35;
Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993);
Ausubel, F.M. et al. eds., Short Protocols In Molecular Biology (4th Ed. 1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471-32938-X);
Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984);
Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999);
Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984);
Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981;
Harlow et al. , Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988);
Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991);
Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242;
Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).
Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990);
Lu and Weiner eds., Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis (2001) BioTechniques Press. Westborough, MA. 298 pp. (ISBN 1-881299-21-X).
Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974);
Old, R.W. & S.B. Primrose, Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering (3d Ed. 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology; V.2:409 pp. (ISBN 0-632-01318-4).
Sambrook, J. et al. eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1-3. (ISBN 0-87969-309-6).
Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978
Winnacker, E.L. From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology (1987) VCH Publishers, NY (translated by Horst Ibelgaufts). 634 pp. (ISBN 0-89573-614-4)

Claims (40)

  1. 一般式ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｘ２−ＶＬ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＬ２を有する単鎖多価の結合タンパク質であって、式中、ＶＨ１は第１の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ２は第２の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ２はリンカーであり、ＶＬ１は第１の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ２は第２の抗体軽鎖可変ドメインであり、ｎは０又は１であり、ＶＨ１とＶＬ１及びＶＨ２とＶＬ２がそれぞれ組合わされて２つの機能的な抗原結合部位を形成する、結合タンパク質。
  2. 一般式ＣＨ１−（Ｘ０）ｎ−ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｘ２−ＣＬ１−Ｘ４−ＶＬ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＬ２を有する単鎖多価の結合タンパク質であって、式中、ＣＨ１は重鎖定常ドメインであり、Ｘ０は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ１は第１の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ２は第２の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ２はリンカーであり、ＣＬ１は軽鎖定常ドメインであり、Ｘ４は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ１は第１の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ２は第２の抗体軽鎖可変ドメインであり、ｎは０又は１であり、ＶＨ１とＶＬ１及びＶＨ２とＶＬ２がそれぞれ組合わされて２つの機能的な抗原結合部位を形成する、結合タンパク質。
  3. 一般式（ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｘ２−ＶＨ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＨ２を有する単鎖多価の結合タンパク質であって、式中、ＶＬ１は第１の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ２は第２の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ２はリンカーであり、ＶＨ１は第１の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ２は第２の抗体重鎖可変ドメインであり、ｎは０又は１であり、ＶＨ１とＶＬ１及びＶＨ２とＶＬ２がそれぞれ組合わされて２つの機能的な抗原結合部位を形成する、結合タンパク質。
  4. 一般式ＣＬ１−（Ｘ０）ｎ−ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｘ２−ＣＨ１−Ｘ４−ＶＨ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＨ２を有する単鎖多価の結合タンパク質であって、式中、ＣＨ１は重鎖定常ドメインであり、Ｘ０は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ１は第１の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＨ２は第２の抗体重鎖可変ドメインであり、Ｘ２はリンカーであり、ＣＬ１は軽鎖定常ドメインであり、Ｘ４は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ１は第１の抗体軽鎖可変ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、ＶＬ２は第２の抗体軽鎖可変ドメインであり、ｎは０又は１であり、ＶＨ１とＶＬ１及びＶＨ２とＶＬ２がそれぞれ組合わされて２つの機能的な抗原結合部位を形成する、結合タンパク質。
  5. 単鎖二重可変ドメインの免疫グロブリン分子（ｓｃＤＶＤ）である、請求項１又は３に記載の結合タンパク質。
  6. 単鎖二重可変ドメインのＦａｂ免疫グロブリン分子（ｓｃＤＶＤＦａｂ）である、請求項２又は４に記載の結合タンパク質。
  7. 前記ＣＬ１ドメインがκ（ｈｃκｏｒ ｃκ）定常ドメインである、請求項２又は４に記載の結合タンパク質。
  8. 前記ＣＬ１ドメインがλ（ｈｃλｏｒ ｃλ）定常ドメインである、請求項２又は４に記載の結合タンパク質。
  9. Ｘ２が、（Ｇ４Ｓ）ｎ［ｎ＝１〜１０］である、請求項１から８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
  10. Ｘ２が、一般式Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄを有するアミノ酸配列を含み、その際、Ａ及びＣは柔軟性のアミノ酸リンカー領域であり、Ｃ及びＤは剛性のアミノ酸リンカー領域である、請求項１から９のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
  11. ＡがＧＧＧＳＧＧＧであり；ＢがＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴ、ＴＰＡＰＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴ、ＴＰＡＰＬＰＡＰＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴ又はＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴであり；ＣがＧＧＳＧＧであり；且つＤがＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴ、ＴＰＬＰＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴ、ＴＰＬＰＡＰＬＰＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴ又はＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＬＰＴＰＬＰＡＰＬＰＡＰＴである、請求項１０に記載の結合タンパク質。
  12. Ｘ２が図１４Ｂにて示すアミノ酸配列を含む結合タンパク質。
  13. Ｘ１が図５にて示すアミノ酸配列から選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載のライブラリ。
  14. Ｘ３が図５にて示すアミノ酸配列から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載のライブラリ。
  15. 第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、
    前記第１のポリペプチド鎖がＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−（Ｘ２）ｎ−ＣＬ−（Ｘ３）ｎを含み、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３は、Ｘ６がＦｃ領域でなければＦｃ領域であり、
    前記第２のポリペプチド鎖がＶＨ２−（Ｘ４）ｎ−ＶＨ１−（Ｘ５）ｎ−ＣＨ−（Ｘ６）ｎを含み、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６は、Ｘ３がＦｃ領域でなければＦｃ領域であり、
    ｎは０又は１であり、前記ＶＬ１と前記ＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的結合部位を１つ形成し、前記ＶＬ２と前記ＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的結合部位を１つ形成する、
    結合タンパク質。
  16. 第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、
    前記第１のポリペプチド鎖がＶＨ２−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ１−（Ｘ２）ｎ−ＣＬ−（Ｘ３）ｎを含み、ＶＨ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３は、Ｘ６がＦｃ領域でなければＦｃ領域であり、
    前記第２のポリペプチド鎖がＶＬ１−（Ｘ４）ｎ−ＶＬ２−（Ｘ５）ｎ−ＣＨ−（Ｘ６）ｎを含み、ＶＬ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６は、Ｘ３がＦｃ領域でなければＦｃ領域であり、
    ｎは０又は１であり、前記ＶＬ１と前記ＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的結合部位を１つ形成し、前記ＶＬ２と前記ＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的結合部位を１つ形成する、
    結合タンパク質。
  17. 第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、
    前記第１のポリペプチド鎖がＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−（Ｘ２）ｎ−ＣＬ−（Ｘ３）ｎを含み、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３は、Ｘ６がＦｃ領域でなければＦｃ領域であり、
    前記第２のポリペプチド鎖がＶＬ２−（Ｘ４）ｎ−ＶＨ１−（Ｘ５）ｎ−ＣＨ−（Ｘ６）ｎを含み、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６は、Ｘ３がＦｃ領域でなければＦｃ領域であり、
    ｎは０又は１であり、前記ＶＬ１と前記ＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的結合部位を１つ形成し、前記ＶＬ２と前記ＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的結合部位を１つ形成する、
    結合タンパク質。
  18. 第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、
    前記第１のポリペプチド鎖がＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−（Ｘ２）ｎ−ＣＬ−（Ｘ３）ｎを含み、ＶＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１及びＸ２は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ３は、Ｘ６がＦｃ領域でなければＦｃ領域であり、
    前記第２のポリペプチド鎖がＶＨ２−（Ｘ４）ｎ−ＶＬ１−（Ｘ５）ｎ−ＣＨ−（Ｘ６）ｎを含み、ＶＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ４及びＸ５は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ６は、Ｘ３がＦｃ領域でなければＦｃ領域であり、
    ｎは０又は１であり、前記ＶＬ１と前記ＶＨ１のドメインは抗原Ａに対する機能的結合部位を１つ形成し、前記ＶＬ２と前記ＶＨ２のドメインは抗原Ｂに対する機能的結合部位を１つ形成する、
    結合タンパク質。
  19. Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５が表８２にて示すアミノ酸配列から独立して選択される、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
  20. Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５が表８３に示すアミノ酸リンカー配列の組み合わせを含む、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
  21. ２本の第１のポリペプチド鎖と２本の第２のポリペプチド鎖を含み、ポリペプチド鎖のうち２本がＦｃ領域を含む、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
  22. ポリペプチド鎖のうち少なくとも１つが変異を含み、前記変異が可変領域に位置し、前記変異が特定の抗原と前記変異体結合ドメインとの間の標的とされる結合を阻害する、請求項２１に記載の結合タンパク質。
  23. Ｆｃ領域を有する２本のポリペプチド鎖のＦｃ領域が変異を含み、２つのＦｃ領域の前記変異が前記２本のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を増進する、請求項２１に記載の結合タンパク質。
  24. ４本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、
    前記４本のポリペプチド鎖のうち２本がＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、
    ＶＤＨは重鎖可変ドメインであり、
    Ｘ１は、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、
    Ｃは重鎖定常ドメインであり、
    Ｘ２はＦｃ領域であり
    ｎは０又は１であり；
    且つ
    前記４本のポリペプチド鎖のうち２本がＶＤＬ−（Ｘ３）ｎ−Ｃ−（Ｘ４）ｎ
    を含み、
    ＶＤＬは軽鎖可変ドメインであり、
    Ｘ３は、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、
    Ｃは軽鎖定常ドメインであり、
    Ｘ４はＦｃ領域を含まず、
    ｎは０又は１であり；
    前記４本のポリペプチド鎖のうち少なくとも１つが変異を含み、前記変異が可変領域に位置し、前記変異が特定の抗原と変異体結合ドメインとの間の標的とされる結合を阻害する、
    結合タンパク質。
  25. ＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｃ−（Ｘ２）ｎの式を有する２本のポリペプチド鎖のＦｃ領域がそれぞれ変異を含み、前記２つのＦｃ領域の前記変異が前記２本のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を増進する、請求項２４に記載の結合タンパク質。
  26. ４本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、
    前記４本のポリペプチド鎖のうち２本がＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、
    ＶＤＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり、
    ＶＤＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり、
    Ｃは重鎖定常ドメインであり、
    Ｘ１は、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、
    Ｘ２はＦｃ領域であり
    ｎは０又は１であり；
    且つ
    前記４本のポリペプチド鎖のうち２本がＶＤＬ１−（Ｘ３）ｎ−ＶＤＬ２−Ｃ−（Ｘ４）ｎを含み、
    ＶＤＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、
    ＶＤＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、
    Ｃは軽鎖定常ドメインであり、
    Ｘ３は、ＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり、
    Ｘ４はＦｃ領域を含まず、
    ｎは０又は１であり；
    前記４本のポリペプチド鎖のうち少なくとも１つが変異を含み、前記変異は前記第１の可変ドメイン又は前記第２の可変ドメインに位置し、前記変異は特定の抗原と変異体結合ドメインとの間の標的とされる結合を阻害する、
    結合タンパク質。
  27. 変異が第１の重鎖可変ドメイン又は第２の重鎖可変ドメインに位置する、請求項２６に記載の結合タンパク質。
  28. 変異が第１の軽鎖可変ドメイン又は第２の軽鎖可変ドメインに位置する、請求項２６に記載の結合タンパク質。
  29. ４本のポリペプチド鎖のうち少なくとも１つが２つの変異を含み、一方の変異が第１の可変ドメインに位置し、他方の変異が第２の可変ドメインに位置し、前記２つの変異が２つの変異体結合ドメインとそのそれぞれの特異的な抗原との間の標的とされる結合を阻害する、請求項２６に記載の結合タンパク質。
  30. ＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎの式を有する２本のポリペプチド鎖のＦｃ領域がそれぞれ変異を含み、前記２つのＦｃ領域の前記変異が前記２本のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を増進する、請求項２６に記載の結合タンパク質。
  31. 第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、前記第１のポリペプチド鎖がＶＤＨ−（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−（Ｘ３）ｍ−Ｙ１を含み、
    ＶＤＨは重鎖可変ドメインであり；
    Ｘ１は、Ｘ１がＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり；
    Ｘ２はＣＨ１であり；
    Ｘ３はリンカーであり；
    Ｙ１はＣＨ２−ＣＨ３又はＣＨ３又はＣＨ３の一部であり；
    ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり；
    且つ
    前記第２のポリペプチド鎖がＶＤＬ−（Ｘ４）ｎ−Ｘ５−（Ｘ６）ｍ−Ｙ２を含み、
    ＶＤＬは軽鎖可変ドメインであり；
    Ｘ４は、Ｘ４がＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり；
    Ｘ５はＣＬ１であり；
    Ｘ６はリンカーであり；
    Ｙ２はＣＨ２−ＣＨ３又はＣＨ３又はＣＨ３の一部であり；
    ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり；
    Ｙ１及びＹ２はそれぞれ変異を含み、Ｙ１及びＹ２における前記変異がＹ１とＹ２の間の相互作用を増進する、
    結合タンパク質。
  32. 第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、前記第１のポリペプチド鎖がＶＤＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤＨ２−Ｘ２−（Ｘ３）ｍ−Ｙ１を含み、
    ＶＤＨ１は第１の重鎖可変ドメインであり；
    Ｘ１は、Ｘ１がＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり；
    ＶＤＨ２は第２の重鎖可変ドメインであり；
    Ｘ２はＣＨ１であり；
    Ｘ３はリンカーであり；
    Ｙ１はＣＨ２−ＣＨ３又はＣＨ３又はＣＨ３の一部であり；
    ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり；
    且つ
    前記第２のポリペプチド鎖がＶＤＬ１−（Ｘ４）ｎ−ＶＤＬ２−Ｘ５−（Ｘ６）ｍ−Ｙ２を含み、
    ＶＤＬ１は第１の軽鎖可変ドメインであり；
    Ｘ４は、Ｘ４がＣＨ１ではないことを条件とするリンカーであり；
    ＶＤＬ２は第２の軽鎖可変ドメインであり；
    Ｘ５はＣＬ１であり；
    Ｘ６はリンカーであり；
    Ｙ２はＣＨ２−ＣＨ３又はＣＨ３又はＣＨ３の一部であり；
    ｎは０又は１であり、ｍは０又は１であり；
    Ｙ１及びＹ２はそれぞれ変異を含み、Ｙ１及びＹ２における前記変異がＹ１とＹ２の間の相互作用を増進する、
    結合タンパク質。
  33. 第１と、第２と、第３と第４のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、
    前記第１のポリペプチド鎖がＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−ＣＨ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の重鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域であり；
    前記第２のポリペプチド鎖がＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−ＣＬ−（Ｘ２）ｎを含み、ＶＤ１は第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ１は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ２はＦｃ領域を含まず；
    前記第３のポリペプチド鎖がＶＤ３−（Ｘ３）ｎ−ＶＤ４−ＣＬ−（Ｘ４）ｎを含み、ＶＤ３は第３の重鎖可変ドメインであり、ＶＤ４は第４の重鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ４はＦｃ領域であり；
    前記第４のポリペプチド鎖がＶＤ３−（Ｘ３）ｎ−ＶＤ４−ＣＨ−（Ｘ４）ｎを含み、ＶＤ３は第３の軽鎖可変ドメインであり、ＶＤ４は第４の軽鎖可変ドメインであり、ＣＨは重鎖定常ドメインであり、Ｘ３は、定常ドメインではないことを条件とするリンカーであり、Ｘ４はＦｃを含まず；
    ｎは０又は１であり、
    前記第１と第２のポリペプチド鎖における前記ＶＤ１ドメインは抗原Ａに対する機能的な結合部位を１つ形成し、前記第１と第２のポリペプチド鎖における前記ＶＤ２ドメインは抗原Ｂに対する機能的な結合部位を１つ形成し、前記第３と第４のポリペプチド鎖における前記ＶＤ３ドメインは抗原Ｃに対する機能的な結合部位を１つ形成し、前記第３と第４のポリペプチド鎖における前記ＶＤ４ドメインは抗原Ｄに対する機能的な結合部位を１つ形成する、
    結合タンパク質。
  34. 第１と第３のポリペプチド鎖のＦｃ領域がそれぞれ変異を含み、前記２つのＦｃ領域の前記変異が前記第１と第３のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を増進する、請求項３３に記載の結合タンパク質。
  35. 請求項１から３４のいずれか一項に記載の結合タンパク質と、薬学上許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物。
  36. 抗原活性が有害である障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、有効量の請求項１から３４のいずれか一項に記載の結合タンパク質を投与することを含む、方法。
  37. 請求項１から３４のいずれか一項に記載の結合タンパク質又はそのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド。
  38. 請求項１から３４のいずれか一項に記載の結合タンパク質又はそのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  39. 請求項１から３４のいずれか一項に記載の結合タンパク質を発現する宿主細胞。
  40. 結合タンパク質を製造する方法であって、結合タンパク質が発現されるような条件下で請求項３９に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
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