JP2015504060A - アグリコシル化ヒト抗体および融合タンパク質、ならびにその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、改変されたＦｃ領域を含む改変されたアグリコシル化ヒトモノクローナル抗体の有効量を罹患した対象に投与することにより、治療用中和抗体のエフェクター機能を低減する方法であって、Ｆｃ機能アグリコシル化が、治療用抗体媒介細胞活性化、炎症、抗体に対するＣ１ｑ結合、および古典的経路の活性化を引き起こす抗体を防止する方法である。【選択図】なし

Description

本願は、２０１１年１２月２８日出願の米国特許公開公報第６１／５８１，０８０号の主題の利益を主張し、同出願は参照により本明細書中に援用される。

イムノグロブリン（ＩｇＧ）は、大分子であり、２つの重鎖および２つの軽鎖から構成された抗体である。各軽鎖は、定常部（ＬＣ）および可変部（ＬＶ）の２つの部分を有する。各重鎖は、１つの可変部（ＨＶ）および４つの定常部（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を有する。各鎖の各可変部は、定常部と連結されている。各軽鎖は、１つ以上の共有結合である鎖間ジスルフィド結合により重鎖に連結されている。各重鎖および軽鎖はまた、一定間隔の鎖間のジスルフィド架橋をも有する。この可変ドメインは、各抗体に特的な相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＷ）から構成される。この可変ドメインは、抗体の機能および結合を決定する。ＣＤＨは、抗原結合に関与する抗体の主要な結合セグメントである。この定常ドメインは、ＣＨＩ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４から構成され、抗原の結合に関与しない。ＣＨ２およびＣＨ３は、抗体のＦｃ領域を構成する。Ｆｃ領域は、治療用中和抗体に関連して望ましくない可能性のある、特定の生物学的活性を含むいくつかの「エフェクター機能」（以下参照）を与える。このような望ましくないエフェクター機能は、Ｃ１ｑ結合および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を含む。抗体のＦｃ領域、特に、Ｆｃ受容体は、マクロファージなどの免疫エフェクター細胞の表面上のエフェクタードメイン（Ｆｃ．ｇａｍｍａ．Ｒｓ）と結合する。このことにより、標的となる細胞の食作用および溶解を引き起こす。補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）では、この抗体は、相補的カスケードが引き金となり、標的細胞を殺傷し、細胞表面にＭＡＣを形成させる。

免疫−グロブリンは、主として、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つに分類される。ＩｇＧは、さらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４といった４つのアイソタイプにさらに分類される。これらのアイソタイプは、定常ドメイン内に位置する配列により、異なる反応を誘発する。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３アイソタイプは、補体系の活性化およびＣＤＣを引き起こすことが知られている（図１参照）。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタプは、ＡＤＣＣを媒介することが知られている。この４つのＩｇＧアイソタイプは、各アイソタイプの重鎖の組成の点で変動する。治療用の抗体では、ヒトＩｇＧ１が、最も一般的に使用されているアイソタイプである。したがって、治療用抗体のエフェクター機能を修飾する試みでは、ＩｇＧ１アイソタプに焦点があてられている。しかしながら、異なる固有のエフェクター機能特性を備える異なるＩｇＧアイソタイプは、エフェクター機能を低減および／または利用するうえで、多くの場合より有益である。治療用抗体として使用するため、Ｆｃ修飾を伴う、またはＦｃ修飾を伴わないＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のアイソタイプおよびアイソタイプのハイブリッドの用途を開発することが、当該技術分野で必要とされている。本発明は、これらの必要性のいくつかに対処することを目的とする

ハイブリッドアイソタイプ−ＩｇＧ抗体のヒンジ領域は、重鎖のＣＨ１部およびＣＨ２部の間に位置し、特に、タンパク質切断の影響を受けやすい。抗体を、組み換え処理して２つ以上のアイソタイプ由来の部分を含むハイブリッドアイソタイプを形成できる。たとえば、従来技術は、ＣＨ２と融合するＩｇＧ２アイソタイプ抗体の可変部および第１の定常部、ならびにＩｇＧ４アイソタイプ抗体のＣＨ３部を含むハイブリッド抗体を含む（米国特許公開公報第２００７／００４１９７２号）。

Ｆｃ媒介型エフェクター機能−Ｆｃの「エフェクター機能」は、抗体（自然抗体および改変抗体）の主要な機能および目的以外の抗体の生物学的活性である。治療用中和抗体の場合、このエフェクター機能は、標的タンパク質または標的経路の中和以外の抗体の生物学的活性である。抗体のエフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害と、Ｆｃ受容体結合と、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と、食作用と、細胞表面の受容体（たとえばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーションと、Ｆｃ受容体を発現する血小板の活性化の欠損と、Ｂ細胞の活性化とが挙げられる。多くのエフェクター機能は、Ｆｃｇａｍｍａ受容体（Ｆｃ．ｇａｍｍａ．Ｒｓ）に対するＦｃ結合と共に開始する。Ｆｃ．ｇａｍｍａ．ＲＩ（ＣＤ６４）、Ｆｃ．ｇａｍｍａ．ＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃ．ｇａｍｍａ．ＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のＦｃ．ｇａｍｍａ．Ｒの３つのサブクラスが存在する。

本発明は、アイソタイプＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の親抗体由来のＦｃ変異体を含み、Ｆｃ領域中の少なくとも１つのアミノ酸が修飾されている、改変された抗体を目的とする。最も治療効果の高い抗体は、ＩｇＧアイソタイプであり、より活性したエフェクター機能を示す傾向がある。非修飾の野生型アイソタイプＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４でさえも、ＩｇＧ１アイソタイプの抗体よりも低いエフェクター機能活性を示す。抗体のＦｃ領域は、古典的経路活性化および抗体媒介細胞溶解などの、様々な望ましくないエフェクター機能を示す位置である。ＩｇＧ１と他のアイソタイプとの間のエフェクター機能活性の差異は、アイソタイプのＦｃ領域の差異に起因する。本発明の様々な実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１以外のアイソタイプの抗体に由来する。本発明は、ＩｇＧ１以外のアイソタイプである改変されたヒトモノクローナル抗体の有効量を、罹患した対象に投与することにより治療用中和抗体のエフェクター機能を低減する方法であって、このＦｃ領域の修飾は、抗体媒介細胞活性化、Ｃ１ｑ結合、炎症および抗体誘発古典的経路活性化を予防する。本発明は、Ｆｃ領域および／またはＩｇＧ１以外のアイソ来プ由来のＦｃ領域内に変異を有する改変された抗体ならびに抗体ハイブリッドを記載する。ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプ由来の修飾および／または非修飾Ｆｃ領域と結合する１つのアイソタイプに由来し、可変型標的結合領域とハイブリッドする抗体が、本発明に含まれる。本発明の目的は、低減したＦｃ媒介型反応を伴うが、ｉｎ ｖｉｖｏで半減期を伴う治療用中和抗体の使用を可能とすることである。

一部の用途では、抗ガン剤などの治療用抗体の使用等において、特定のエフェクター機能が望まれる。他の使用では、特定のエフェクター機能は望ましくないものである。たとえば、代替的な経路に特異的なタンパク質を標的とする治療用抗体の場合、古典的な補体経路を活性化するエフェクター機能は望ましくない。治療用抗体の望ましくない副作用を最小限または除去するために、本発明は、エフェクター機能を最小限または除去する方法を提供する。

Ｆｃ領域の役割−抗体のＦｃ領域は、抗体のエフェクター機能および血清半減期を媒介する。これらのエフェクター機能は、限定するものではないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、およびＣ１ｑ依存性古典的経路の活性化が挙げられる。Ｆｃ．ｇａｍｍａ．Ｒおよび／またはＣ１ｑに対するＩｇＧの結合は、Ｆｃ領域内に位置する特異的残基またはドメインにより支配される。結合はまた、抗体のヒンジ領域内およびＣＨ２部内に位置する残基に依存する。多くの変異は、Ｆｃ結合に関与する領域を同定するために、幾人かの発明者により作製されてきた。治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＦｃ領域、またはｆｃ融合タンパク質を改変することにより、必要とされる中和治療の薬理作用により適した分子を産生することが可能となる。

ＦｃＲｎ：Ｆｃ受容体の１つの種類として、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）がある。この受容体は、モノクローナル抗体の血清半減期を決定する際において重要である。ＦｃＲｎは、内皮細胞の表面上で発現し、ｐＨに依存する方法でＩｇＧに結合する。この結合は、細胞内小胞内に内部移行する抗体を与える。このことにより、細胞が抗体を血清に戻して再利用することが可能となり、約２３日のＩｇＧ半減期に寄与する。

ＦｃエフェクターおよびＣ１ｑ結合：本抗体のエフェクター機能は、ｉｎ ｖｉｖｏで重要であり、抗癌の治療用抗体の開発に有益であるため探索されてきた。抗癌療法を発展させるために、エフェクター機能を改良する必要があるにも関わらず、慢性的な兆候のための中和抗体の開発において低減したエフェクター機能が必要である。４つすべてのＩｇＧアイソタイプは、Ｆｃ受容体である、Ｆｃ．ｇａｍｍａ．ＲＩ、Ｆｃ．ｇａｍｍａ．ＲＩＩＡおよびＦｃ．ｇａｍｍａ．ＲＩＩＩＡと結合し、活性化させる。Ｆｃ．ｇａｍｍａ．ＲＩＩＢは、抑制性受容体であるため、この受容体に対する抗体結合は、補体反応および細胞反応を活性化しない。Ｆｃ．ｇａｍｍａ．ＲＩは、単量体の形態において、ＩｇＧと結合する高親和性受容体である。Ｆｃ．ｇａｍｍａ．ＲＩＩＡおよびＦｃ．ｇａｍｍａ．ＲＩＩＩＡは、多量体の形態においてＩｇＧのみと結合し、より低い親和性を有する低親和性受容体である。したがって、多量のＩｇＧ受容体は、免疫原性反応を産生する必要がある。

本明細書中の「野生型またはＷＴ」は、対立遺伝子の変異を含み、自然で見いだされるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に修飾したアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。

アグリコシル化−ＩｇＧ抗体のＦｃ領域のアグリコシル化は、抗体のエフェクター機能を妨害することが知られている。Ｆｃ領域のアグリコシル化を、様々な方法で達成することができる。このような方法の１つとして、Ｆｃ領域のＣＨ２部内の位置２９７のアミノ酸（アスパラギン）の変異を介するものがある。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４中のアスパラギン２９７での単一の変換部位があるとされる。このグリコシル化部位に付着する糖鎖は、ＩｇＧのエフェクター機能に重要である。結晶学の研究では、糖（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）鎖が、２つの対向するＣＨ２ドメインの間に架橋を形成することが実証されている。アグリコシル化ＩｇＧは、もはやＦｃｙＲまたはＣ１ｑに結合せず、したがって、ＡＤＣＣおよび古典的経路の活性化の引き金ともならない。

多くの報告から、ＦｃｙＲＩＩＩＡに結合したＩｇＧの修飾が、腫瘍を抑制するための治療用ｍＡｂｓを作製するために重要であることが示されてきた。治療用ｍＡｂｓは、マウスのモデルにおいて、腫瘍の進行を制御し、生存率を上昇させるために活性化したＦｃｙＲが存在することを必要とする。したがって、ヒトＩｇＧ１のグリコシル化プロファイルを修飾する戦略は、抗癌療法に関連して広く探索されてきた。Ｆｃ受容体（ＦｃｙＲｓ）は、細胞免疫反応および体液性免疫反応に関連する。ＩｇＧのＦｃ領域によりこれらの受容体を発現する細胞を刺激することにより、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、古典的経路の活性化、酸化バースト、および炎症性メディエーターの放出を含む劇的な結果がもたらされる。ＩｇＧ１アイソタイプのＦｃ領域中のグリコシル化の除去により、古典的経路の活性化が劇的に低減する。Ｆｃ媒介型のエフェクター機能は、Ｆｃ領域内の選択した点変異を導入することにより低減することができる。本発明に詳細に論述されるように、Ｆｃ媒介型エフェクター機能の低減はまた、別のアイソタイプのＦＣ領域とＩｇＧ１アイソタイプのＦｃ領域を置き換えることにより達成することもできる。

本発明の一実施形態において、改変された抗体は、その部位でのグリコシル化を予防する、位置２９７での変異を含む。位置２９７のアスパラギンは、Ｎ−連結グリコシル化を引き起こさないアミノ酸残基と置換することができる。これらのアミノ酸の一部は、アラニンおよびグルタミン酸と同定することができる。グリコシル化を予防することは、望ましくないエフェクター機能を予防する。

Ｃ１ｑ結合および補体活性化を予防する従来技術方法−Ｃ１ｑは、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓを備えた複合体である、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の第１の補体を形成する。エフェクター機能は、完全長ＩｇＧ固有の特性であり、特定のタンパク質を中和する治療用モノクローナル抗体の観点からダウンレギュレートし、阻害されなければならない。従来技術においては、１）Ｆｃドメイン内に位置し、エフェクター結合相互作用に関与するアミノ酸の変異と、２）Ｆｃ領域の除去およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲートとＦｃ領域の置換と、３）（ハイブリッドアイソタイプを作製する）ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域とＩｇＧ２抗体のＦｃ領域の置換といった、抗体のエフェクター機能を低減する３つの異なる戦略が挙げられる。Ｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイを使用して、アミノ酸に対するＣ１ｑの結合を示した。

Ｎ２９７での点変異を介したアグリコシル化−グリコシル化が、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ−９およびＩＬ−１、ＴＮＦ−αを含む一連の有害なインターロイキンを含む炎症性メディエーターの形成を引き起こす古典的経路の活性化を誘導することが示されてきた。この古典的な補体経路の望ましくない活性化は、位置２９８のアスパラギン（Ｎ）をアラニン（Ａ）またはグルタミン（Ｑ）のいずれかに変異することにより低減できる。アグリコシル化されたＩｇＧ１抗体は、Ｃ１ｑ結合を低減した（表１に示す）。このようなアグリコシル抗体はまた、酵素的および／または化学的脱グリコシル化を利用することにより産生することができる。この宿主細胞は、細菌、哺乳類、ウイルス、または酵母であってもよい。アグリコシル化抗体または抗体誘導体は、アグリコシル抗体を大規模に産生することを促進するため、牛乳中の抗体を発現するトランスジェニック型哺乳類中で産生される。ほぼすべての市販の抗体はＩｇＧ１である。

ＰＥＧ置換を介したアグリコシル化−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲートとＲｃ領域の置換は、エフェクター機能を低減するが、同様に抗体の半減期をも低減させる。したがって、この方法は、慢性的な兆候に用いられる治療用抗体の観点からは理想的ではない。

アイソタイプハイブリッドを介したアグリコシル化−ＩｇＧ２およびＩｇＧ４抗体は、本質的にグリコシル化しているにもかかわらず、補対活性化が低減され、ＦＣ結合が低減した（表１参照）。これらの観察から、これらアイソタイプは、低減したＦｃエフェクター機能および補体依存性細胞傷害を示すアミノ酸配列またはタンパク質モチーフを備えたＦｃ領域を含むことが示唆される。これらのアイソタイプのエフェクター機能をさらに低減するため、アグリコシル化変異を、ＩｇＧ２ｍ４およびＩｇＧ２ｍ３内に導入したように、ＩｇＧ２抗体のＦｃ領域内に誘導した。これらの抗体は、さらにエフェクター機能が低減したことを実証した。位置２３４／２３５／２３７は、Ｆｃ反応を媒介する際に重量であると思われており、それゆえ、Ｖ／Ａ／Ｇ〜Ａ／Ａ／Ａに変異した。３３０／３３１などの他の変異もまた重要であり、多くのグループにより広く研究されていると思われる。

一実施形態において、新規に産生した本発明の抗体は、損傷を受けていないＦｃＲｎ結合を有し、半減期が保持されている。エフェクター機能が低減し、Ｃ１ｑ結合親和性が低減した抗体は、非変異型ＩｇＧ、未処置ＩｇＧと比較してＦｃ受容体Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩに対する結合親和性が低減し、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、およびＣ１ｑ結合が低減した抗体である。本発明は、半減期を保存しながらエフェクター機能を低減する方法であって、改変された抗体はＦｃＲｎと結合するが、Ｃ１ｑと結合しない方法を含む。このような抗体は、半減期が保存されているが、古典的経路は活性化されていない。

示されるように、ＩｇＧのＦｃ領域、特に本発明のＣＨ２領域は、いずれかの免疫賦活性抗体または抗体様タンパク質、ヒト化抗体および治療用抗体を含む融合タンパク質の産生に使用し、かつ補体タンパク質に対するＦｃ受容体の結合の予防または補体タンパク質に対する結合のために使用することができる。当業者により産生および生産される抗体は、限定するものではないが、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、キメラ性またはヒト性抗体、ヒト化またはヒト中和型抗体、二重特異性またはそれらの単鎖抗体が挙げられる。本発明の抗体は、微粒子、微小粒子、またはペグ化した分子が、抗体または抗体フラグメント付着するように、本抗体に付着した追加的な部分を有することができる。

ＩｇＧのグリコシル化を防止するＮ２９７変異−先に公開された技術により、ＩｇＧのエフェクター機能を防止し、それにより、ＩｇＧ１のエフェクター機能を減少させるＮ２９７変異の有効性が記載されている。ＩｇＧ１と比較して、ＩｇＧ２は、図１に示されるように補体経路の活性化、ＡＤＣＣ、およびＦｃエフェクター機能が本質的に減少する。したがって、グリコシル化を除去することにより、補体経路の活性化、ＡＤＣＣの活性化、およびＦｃ受容体の結合をさらに減少させることとなる。したがって、本発明は、Ｉｇ２がエフェクター機能および補体活性化が本質的に低減するように、２９７変異を備えたＩｇＧ２アイソタイプを標的とする。２９７変異を介してグリコシル化を除去することにより、Ｃ１ｑ結合およびエフェクター機能をさらに低減することができる。この変異は、アスパラギン（ａｓｐ）をグリコシル化させないいずれかのアミノ酸を含んでもよい。

ＩｇＧ１のＣＨ２領域内の変異−一連の変異は、ＩｇＧ１のＣＨ２領域内で同定されてきた。公開されている変異は、ＣＨ２領域全体を包有する。ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、およびＦｃ受容体結合が望ましいように減少させるものを選択することは困難である。本発明は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、およびＦｃ受容体（ＦｃＲｎを除外する）結合を低減させる特定のＣＨ１欠損を備えた抗体の産生を請求する。従来の発明は、ＩｇＧ１アイソタイプに対する変異に関与しており、本発明は、ＩｇＧ２アイソタイプに対する変異を使用する。これらの抗体は、大部分のＦｃエフェクター機能が、ＩｇＧのＣｈ２領域内に位置していたことから、ＣＨ２欠損手法を使用して構成できる。また、この欠損は、Ｎ２９７がＣＨ２ドメインの一部であるため、アグリコシル化抗体を産生する。Ｎ２９７は、ＱまたはＡｌａと置き換えられた位置２９７（Ｋａｂａｔナンバリング）のアスパラギンを指す。

４つのＩｇＧｍ４を備えたＩｇＧ２抗体−従来の発明は、ＩｇＧ２ｍ４と呼ばれる４つの変異を備えたグリコシル化ＩｇＧ２抗体をクレームしている。この変異したＩｇＧ２ｍ４の構成は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４配列に基づいていた。天然に見いだされるいくつかのＩｇＧ４由来の配列が、ＩｇＧ２配列に組み込まれた。この変異したＩｇＧ２は、Ｃ１ｑ結合およびＦｃ受容体結合を含むＦｃエフェクター機能を防止すると思われている。メルク（米国特許第７７０００９９号）より、低減したエフェクター機能を有するグリコシル化ＩｇＧ２抗体の使用が記載される。アグリコシル化ＩｇＧ１抗体と同様の変異は、Ｆｃ反応をさらに低減する。このＩｇＧ２ＣＨ１配列は、ＩｇＧＣＨ１配列とは異なる。しかしながら、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を使用し、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４配列由来のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３に連結することが可能である。本発明（原出願）は、ＩｇＧ１抗体の可変部が、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４抗体のより下側の定常部（Ｆｃを含む）と組み合わせた抗体ハイブリッドを与える。ＣＨ２ドメインは、残基２３４、２３５、２３０、２３７、２６８、２９７、３０９、３３０、および３３１の１つ以上において変異を有することができ（または変異を含まない）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４を生成することができる。

通常の特性、結合、およびエフェクター機能の活性と比較した、異なるＩｇＧアイソタイプの特性を示す図である。 抗原に結合した基質に対するＩｇＧ２野生型（ＷＴ）の結合を示す。この抗体と標的抗原の結合は親和性が高い。 抗原に結合した基質に対するアグリコシル化ＩｇＧ２（２９７変異）の結合を示す。このアグリコシル化ＩｇＧ２抗体と標的抗原との結合は親和性が高い。 抗原に結合した基質に対する、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２のアグリコシル化ＩｇＧ２（２９７変異）のハイブリッドの結合を示す。このアグリコシル化ハイブリッド抗体と標的抗原との結合は親和性が高い。 正常なヒト血清中のＩｇＧ２（２９７変異）による代替的経路の阻害を示す。このアグリコシル化ハイブリッド抗体代替的経路に特異的なタンパク質と結合し、このタンパク質を中和する。 正常なヒト血清中の２９７変異を備えたＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッドによる代替経路の阻害を示す。このハイブリッド抗体代替的経路に特異的なタンパク質と結合し、このタンパク質を中和する。 正常なヒト血清中において、２９７変異を備えたＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッドによる古典的経路の阻害または活性化の欠損を示す。このハイブリッド抗体は古典的経路の活性化に影響しない。 正常なヒト血清中の２９７変異を有するＩｇＧ２Ｆｃ領域を備えた抗体による古典的経路の阻害または活性化の欠損を示す。このアグリコシル化ＩｇＧ２抗体は古典的経路に結合し、古典的経路の活性化に影響しない。 正常なヒト血清中で、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド抗体がＣ１ｑと結合しないことを示す。Ｃ１ｑと高い親和性で結合する陽性対照としてアバスチンを使用した。 正常なヒト血清中で、アグリコシル化ＩｇＧ２（２９７変異）抗体がＣ１ｑと結合しないことを示す。ヒト血清をＣ１ｑの供給源として使用した。Ｃ１ｑと高い親和性で結合する陽性対照としてアバスチンを使用した。 グリコシル化ＩｇＧ１抗体が、標的抗原のプロパジンと高い親和性で結合することを示す。 アグリコシル化ＩｇＧ１（２９７変異）標的抗原のプロパジンと高い親和性で結合することを示す。 ＩｇＧ１がＡＰの活性化を阻害することを示す。 アグリコシル化ＩｇＧ１（２９７変異）抗体がＡＰの活性化を阻害することを示す。 アグリコシル化ＩｇＧ１（２９７変異）抗体が、正常なヒト血清中でＣ１ｑと結合しないことを示す。グリコシル化抗体はＣ１ｑと結合する。 アグリコシル化ＩｇＧ１（２９７変異）Ｆｃ．ｇａｍｍａＲＩタンパク質と結合しないことを示す。 アグリコシル化ＩｇＧ１（２９７変異）抗体Ｆｃ．ｇａｍｍａ．ＲＩＩＩタンパク質と結合しないことを示す。

本明細書中に特段の断りのない限り、本文書で使用されるすべての用語は、本発明の当業者により理解されるものと同一の意味を有する。以下の定義は、本発明を描写するために明細書および特許請求の範囲において使用する際に意図する意味を明確にし、定義するために提供される。

「抗体依存性細胞傷害」
（「ＡＤＣＣ」）は、ＦｃｙＲｓを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、結合した抗体を用いて標的細胞を認識し、溶解を引き起こす細胞媒介型反応を指す。

「抗体依存性細胞媒介型食作用」
「ＡＤＣＰ」）は、ＦｃｙＲｓを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、結合した抗体を用いて標的細胞を認識し、食作用を引き起こす細胞媒介型反応を指す。

「アグリコシル化」は、グリコシル化された基に付着していないヒドロキシル基または他の官能基を備えた抗体を指す。また、糖残基を有さない抗体をも指す。

本明細書中で使用されるように、抗体を産生する哺乳類（たとえばマウス、ラット、ウサギ、およびヒトを含む霊長類）のいずれかに由来し、代替経路に特異的なタンパク質に特異的に結合する抗体およびその抗体フラグメントを指す。例示的な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体と、多選択性抗体と、マウス抗体と、キメラ抗体マウス−ヒト抗体、マウス−霊長類抗体、霊長類−ヒト抗体と、抗−イディオタイプ抗体とを含み、未変化の分子またはそのフラグメントのいずれかであってもよい。

「抗体フラグメント」は、完全長抗体由来または完全長抗体に関連するタンパク質を指し、一般に、完全長抗体の抗原結合部または可変部を含む（「抗原結合フラグメント」参照）。本用語「抗体フラグメント」は、一般に、完全長抗体の抗原結合部または可変部を含む完全長抗体由来の一部を指す。他の抗原は、抗体フラグメントから形成される二重特異性抗体、リニア状抗体、単鎖抗体分子および多選択性抗体を含む。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ′）２およびＦｖフラグメント、またはｓｃＦｖフラグメントが挙げられる。

抗体の「抗原結合フラグメント」（または「抗原結合領域」）は、所定の抗原に特異的に結合する特質を保持する１つ以上の未変化の抗体フラグメントを指す。抗体の抗原結合の機能は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む未処置の抗体フラグメントにより行われる。抗体結合断片の例を以下に挙げる。

「Ｆａｂ」フラグメント（ＶｈおよびＶＬを備えた単鎖可変部）
「一価フラグメント」（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨＩドメインからなる抗体フラグメント）
「Ｆ（ａｂ′）２」フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント）
「Ｆｄ」フラグメント（抗体のＶＨおよびＣＨＩドメインからなる）
「Ｆｖ」フラグメント（抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなる）
ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなる単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」）
単離した相補性決定領域（「ＣＤＲ」）

抗原結合フラグメントとしてのＣＤＲはまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、細胞内抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖ内に組み込むことができる。抗体の抗原結合フラグメントは、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づく骨格内に移植することができる。抗原結合フラグメントを、一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む単一鎖分子内に組み込むことにより、相補的軽鎖ポリペプチドと共に、一対の抗原結合領域を形成することができる。

本明細書中で使用されるように、「単一鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。

「補体依存性細胞傷害（「ＣＤＣ」）は、補体計活性化およびＭＡＣ形成の結果として起こる細胞溶解を指す。エフェクター機能としてのＣＤＣは、Ｃ１ｑに結合するＦｃにより引き起こされる。

「キメラ抗体」は、非ヒト種動物の抗体に由来する可変ドメインおよびＣＤＲを含む一方、この抗体分子の残りがヒト抗体由来である、可変ドメインおよびＣＨＲを含む組み換えタンパク質である。このヒトの定常部と抗体の非結合領域の置き換えにより、（元のマウス抗体と比較して）低減したヒトの抗原性を有し、標的化された抗原を認識し結合する特異性を保持するキメラ抗体が可能となる。

「古典的経路」は、活性化のため、抗体−抗原複合体により引き起こされ、Ｃ１Ｑを必要とする補体を指す。古典的経路の増殖は、代替経路の増幅ループを必要とする場合もあり、または必要としない場合もある。

「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗体の鍵となる結合領域である。概して、２つの重鎖および軽鎖の可変部の各可変部領域内に３つのＣＤＲが存在する。ＣＤＲは、特定の結合親和性を作製するため、位置の観点から周辺を組み替えることができる。

「エフェクター機能」は、抗体の未変性のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害と、Ｆｃ受容体結合と、抗体依存性細胞媒介型細胞傷害（ＡＤＣＣ）と、食作用と、細胞表面受容体（たとえばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーションと、Ｆｃ受容体を発現する血小板の活性化の欠損と、Ｂ細胞の活性化とが挙げられる。治療用抗体の副作用を最小限または除去するために、エフェクター機能を最小限または除去することが好ましい場合がある。

本願の文脈において、「望ましくないエフェクター機能」は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、古典的経路の活性化、細胞の活性化、および抗体媒介炎症が挙げられる。

「改変された抗体」は、天然に産生されたものではなく、特定の目的を達成し、特異的な特性を有するために変形させるか、または作成した抗体である。たとえば、エフェクター機能を低減させるために野生型の形態の抗体を計画的に改変した抗体は改変された抗体である。

本明細書中で使用されるように、用語「Ｆｃ領域」は、所定の抗原に対して防御力を提供する抗体の領域を指す。

「抗体の第１部分」は、抗体全体の一部であり、抗体全体よりも小さく、抗体の抗原結合領域を含む部分を指す。「抗体の第２部分」は、抗体全体の一部であり、抗体全体よりも小さく、第１部分に含まれない抗体の一部からなる部分である。

用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃｙＲ」は、ＩｇＧのｆｃ領域に結合する受容体を指す。「ＦｃｙＲＩ」、「ＦｃｙＲＩＩ」、および「ＦｃｙＲＩＩＩ」は、ＦｃｙＲｓのサブクラスである。

本明細書で使用されるように、用語「低減したＦｃエフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域を認識する抗原に対して作用しない抗体機能を指す。低減したＦｃエフェクター機能の例としては、限定するものではないが、抗原に対するＦｃ結合の低減、抗原に対するＦｃ活性化の欠損、正常なＦｃエフェクター機能を抑止し、またはＦｃ領域を有する血小板および他の細胞の活性化を抑止する変異を含むＦｃ領域が挙げられる。

「ヒト抗体」は、フレームワーク、ＣＤＲ、および定常部を含む抗体の全ての成分がヒト由来である抗体である。用語「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体の結合特異性を保持しているが、ヒトにわずかに免疫原性である非ヒト由来の抗体である。キメラ抗体およびヒト化抗体を参照されたい。

本明細書中で使用されるように、用語「免疫原性」は、対象の免疫反応を開始する抗原の特質を指す。

抗体、抗体フラグメント、および／または抗体のＦｃ領域に対する「修飾」は、タンパク質の野生型ポリペプチド配列中の１つ以上のアミノ酸の置換、挿入、または欠損を指す。修飾された抗体、抗体フラグメント、および／またはｆｃ領域は、人工的に修飾が行われた抗体である。

「親抗体」は、改変された抗体または抗体フラグメントの由来となる野生型または非修飾抗体である。

「標的抗原」は、抗体に特異的に結合するタンパク質、糖、脂質、または他の化学化合物を指す。

「治療用中和抗体」は、特異的タンパク質を標的とし、投与される対照に治療効果があると意図／予測されるように開発された任意の抗体を指す。

本明細書では、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ，古典的経路の活性化および抗体を引き金とする炎症などの望ましくないエフェクター機能を低減させることにより特徴付けられる、改変された重鎖を備えた組み換えモノクローナル治療用抗体を記載する。この目的は、望ましくないエフェクター機能が低減した抗体の設計および開発であった、一実施形態において、本発明は、位置Ｎ２９７のアミノ酸を修飾したアグリコシル化ＩｇＧ２アイソタイプ抗体である。これらの抗体は、Ｃ１ｑと結合せず、それゆえ、古典的経路を活性化しない。

文献を参照することにより、
１）ＦＣ領域を全体的に欠損する抗体を産生することと、
２）ＩｇＧ１アイソタイプ抗体のＦｃ領域内の変異を作製することと、
３）ハイブリッドアイソタイプ抗体を作製することであって、ＩｇＧ２アイソタイプ由来のＦａｂ部が、ＩｇＧ４アイソタイプ由来のＦｃ領域に連結する抗体を作製することと
の３つの方法により、エフェクター機能の低減を達成できることが示唆されている（欧州特許出願公開第１６３５８７２ Ａ２号）。

Ｆｃ領域を完全に欠損する抗体（上記方法２）は、血清半減期が短くなる。このような抗体の処置は、慢性的な有効性を得るには、クリニックで頻繁に投与する必要がある。このようなクリニックでの頻繁な投与は、このような投与は、不可能ではないが実現が難しい臨床的な関連が多く存在する。修飾されたＦｃ領域を備えたＩｇＧ１は、低減したエフェクター機能を表すが、ＩｇＧ１アイソタイプは、エフェクター機能を低減する理想的なアイソタイプではない。ハイブリッドＩｇＧ２ｍ４アイソタイプ抗体（上記方法３）は、エフェクター機能のいくつかが低減することを示す。ＩｇＧ２およびＩｇＧ４アイソタイプは非常に類似しており、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４ハイブリッドを開発することは比較的簡単である。本発明のハイブリッド抗体は、さらにエフェクター機能を低減させることを示した。

本発明の一実施形態において、ＩｇＧ２アイソタイプのＦｃ機能を修正して、エフェクター機能が低減したアグリコシル化抗体を産生する。本発明の別の実施形態において、未処置または修飾されたＩｇＧ２またはＩｇＧ３アイソタイプのＦｃ領域をＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧまたはＩｇＧ４アイソタイプ由来の可変部と組み合わせる。本発明は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧまたはＩｇＧ４抗体のＦｃ領域内の変異原性を目的とする部位を介したアグリコシル化抗体を作製し、使用し、ならびに、Ｆｃ領域がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧまたはＩｇＧ４由来であるハイブリッドアイソタイプを産生するために組み換え処置することを目的とする。このような抗体は、抗体依存性細胞媒介型細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、Ｆｃｇａｍｍａ受容体結合、および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が低減した。Ｆｃ領域内のアスパラギン（Ｎ）のアラニンおよび／またはグルタミン酸への変異は、抗体のＣ１Ｑ結合特性を低減する。

本発明は、
１）抗体の第１部分が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来であり、Ｆｃ領域が、野生型ＩｇＧ４またはアグリコシル化ＩｇＧ４アイソタイプ由来であることと、
２）抗体の第１部分が、ＩｇＧ２由来であり、Ｆｃ領域が、アグリコシル化ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来であることと、
３）抗体の第１部分が、ＩｇＧ１由来であり、Ｆｃ領域が、非修飾ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、および 由来であることと、
４）抗体の第１部分が、ＩｇＧ４由来であり、Ｆｃ部が、アグリコシル化し、グリコシル化されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３由来であることと
の構成を備えた非ハイブリット型抗体およびハイブリッド型抗体を包含する。

Ｆｃ領域内の位置２９７での変異を介したＩｇＧ１のアグリコシル化は、従来技術に記載されている。このような抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏでより長い半減期を有することが示されている。また、Ｃ１ｑ結合の低減、Ｆｃ結合の低減、およびエフェクター機能の低減を示す記載もなされている。

用語「Ｆｃ受容体」および「ＦｃｙＲ」は、ＩｇＧのＦｃ領域に結合する受容体を表す。好ましいＦｃｙＲは、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ、およびＦｃｙＲＩＩＩサブクラスである。ＦｃｙＲＩＩ受容体は、ＦｃｙＲＩＩＡ（「活性受容体」）およびＦｃｙＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含む。本発明の単離した非−イムノ−刺激性抗体は、Ｃ１ｑに同時に結合することができない。

特定の実施形態において、本発明は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ領域のアミノ酸配列の実質的な部分を包含する。イムノグロブリンのＦｃ領域は、一般にＣＨ２およびＣＨ３の２つの定常部を含む。本明細書に記載されるように「ＩｇＧ２のＦｃ領域の実質的な部分」は、Ｆｃ領域のアミノ酸配列の８０％〜９０％が、未変性のＩｇＧ２のＦｃ領域のアミノ酸配列であることを意味すると意図される。ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、Ｆｃ結合およびＣ１ｑ結合の低減は、ＩｇＧ２ｆｃ領域の選択されたアミノ酸残基を変異させることにより達成される。ＣＨ２ドメインは、アミノ酸２３１〜アミノ酸３４０に延在する。特定の実施形態において、ＩｇＧ２のＦｃ領域は、アミノ酸残基２９７、２３４、２３５、および３３１でのアミノ酸残基の変異を含む。アグリコシル化ＩｇＧ２の非グリコシル化Ｆｃ領域はまた、Ｎ２９７変異に加えて、アミノ酸残基Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓでの変異も含んでもよい。２９７、２３４、２３５、および３３１の位置での変異を備えた本発明のＩｇＧ２のＦｃ領域を、ＦｃＲｎおよび抗体の他の薬理学的特性に影響を与えることなくＦｃエフェクターおよびＣ１ｑ結合を備えた抗体および／または融合タンパク質を産生するために使用することができる。これら変異の組み合わせはまた、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、およびキメラ抗体またはヒト抗体、ヒト化抗体、中和抗体、二重特異性抗体またはそれらの単鎖抗体内に導入することができる。本発明の抗体は、それら抗体に付着させる追加的な部分を有することができる。

本発明の抗体または抗体様分子は、医薬組成物または薬剤の成分として投与することができる。医薬組成物または薬剤は、一般に、治療剤および様々な他の薬学的に許容可能な成分を含む。

ハイブリッド抗体および融合タンパク質
また、抗体である融合タンパク質は、本発明に提案されるＩｇＧの変更された定常部を使用して作製することができる。この抗体の抗原結合領域はたとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ＳＣＦｖであり、リンカーを用いて、またはリンカーを用いずにＣＨ２−ＣＨ３と融合することができる。当業者に既知の追加的なリンカーもまた使用することができる。ＣＨ２がＣＨ１と置き換えられた融合タンパク質もまた本明細書に記載される。ＣＨ１領域は良性であり、望ましくないＦｃエフェクター機能を引き起こさない。ＣＨ３ドメインのＦｃＲｎ結合領域により、分子の半減期は、元の位置のＣＨ２およびＣＨ３を備えた分子と同様に維持される。欠損したＣＨ１およびＣＨ２領域を備えた抗体もまた、作製され産生された。本発明は、
１）アグリコシル化ＩｇＧ２およびＩｇＧ４抗体であって、２９７の位置での変異の結果としてアグリコシル化が産生される抗体と、
２）アグリコシル化ＩｇＧ２のベースライン値超のエフェクター機能を低減するための、Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓを含むアグリコシル化ＩｇＧ２と、
３）ＣＨ１がＩｇＧ１またはＩｇＧ３由来であり、ＣＨ２およびＣｈ３が、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４由来であり、ＩｇＧ４中の２９７残基がＮ２９７からＡ２９７に変異する、アグリコシル化ＩｇＧ１およびＩｇＧ４ハイブリッドと、
４）ＣＨ２ドメインが、Ｆ（ａｂ）２−ＣＨ１−ＣＨ３であるようにコンストラクトを作製するＣＨ１ドメインと置き換えられる抗体と
を包含する。

４）においては、リンカーは、ＦａｂおよびＣＨ１の間であり、ＣＨ１およびＣＨ２の間に添加される。この最終コンストラクトは、ａ）Ｆｖ−ＣＨｌ−リンカー−ＣＨ１−リンカー−ＣＨ３またはｂ）Ｆｖ−ＣＨｌ−リンカー−ＣＨ２−リンカー−ＣＨ３の構造のうちの１つ（または同様のもの）を有する。ＣＨ１は、活性化していない定常部であり、それゆえ、半減期のより長い伸長したＦａｂを産生するために使用した。このリンカーは、様々な種類、特に（ＧＧＧＧＳ）ｎなどの当業者に既知の種類のものとすることができる。融合タンパク質および／または抗原結合フラグメント、またはいずれかの受容体タンパク質ポリペプチドは、（ＧＧＧＧＳ）ｎなどの当業者に既知のいずれかのリンカーを介してＣＨ２−ＣＨ３上に配置することができる。様々な修飾および組み換えを、Ｆｖ、ＣＨＩ、ＣＨ２、およびＣＨ３の間のリンカーの位置を変動することなどにより、ａ）およびｂ）の構造から作製することができる。リンカーの存在および非存在により、半減期がより長い対象となる分子を作製することができる。Ｆｃ融合は、抗体のＦｃ領域、従ってその望ましいエフェクター機能および薬物動態を、受容体の標的−結合領域、リガンド、またはいくつかの他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインに結合する。Ｆｃ融合と抗体との機能の重複により、本発明はＦｃ融合も包含する。

特にＡＰ中和抗体では、媒介型Ｆｃ反応を最小限にし、Ｃ１ｑ結合が阻害されることが重要である。本明細書の目的は、Ｆｃ領域を完全に除去するための代替物として、ＦｃおよびＣ１ｑ結合が低減した治療用ＡＰ中和抗体を産生することである。多くの報告により、Ｆｃ領域（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）内の単一または複数の点変異は、Ｆｃ受容体およびＣ１ｑに対して抗体の結合を低減することができ、これにより、抗体の血清寿命を損なうことなく望ましくないエフェクター機能を低減することができる。このような修飾を備えた抗体は、ＡＰを標的化するいずれかの治療用抗体の開発に有益であり、このことは、（エフェクター機能を介して）ＣＰを活性化することなくＡＰを中和するように意図するものである。ＩｇＧ２のアグリコシル化は、ＣＰの活性化および他の抗体のＦｃエフェクター機能を防止する目的で記載されてこなかった。この点は、本発明の基軸である。

実施例１
タンパク質のプロパジンを標的とする結合親和性
野生型ＩｇＧ２、アグリコシル化ＩｇＧ２、およびアグリコシル化ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド抗体は、標的タンパク質と高い親和性で結合する。典型的なアッセイでは、ポリスチレンマイクロタイタープレートを、ヒト因子Ｐ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を含むリン酸緩衝食塩水で一晩コーティングした。因子Ｐ溶液を吸引した後、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）を含むＰＢＳで２時間室温でウェルをブロッキングした。因子Ｐのコーティングを行わないウェルをバックグラウンド対照とした。ブロッキング溶液中における研究の下での抗体の様々な濃度の一定分量を、因子Ｐでコーティングしたウェルに添加し、プレートを、１時間静置して、モノクローナル抗体に、基質−結合因子Ｐを結合させた。このプレートをＰＢＳですすぎ、ペルオキシド−コンジュゲート型ヤギ抗ヒトのモノクローナル抗体（検出抗体）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ）をブロッキング溶液で１：２０００に希釈し、添加することによりモノクローナル抗体と結合した因子Ｐを検出し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄した後、１００μｌの３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍｄ．， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ａ５０−６５−００）を添加した。１０分間２５℃で添加した後、ＴＭＢの反応を、１００μｌのリン酸を添加することによりクエンチし、プレートを、マイクロプレートリーダー（たとえば、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ ２５０， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）において４５０ｎｍで読み取った。

ＩｇＧ２野生型、２９７変異を有するＩｇＧ２、および２９７変異を有するＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッドの３種類のＩｇＧ２抗体すべてが、図２、３、および４にそれぞれ示されるように標的タンパク質と高い親和性で結合する。図１１および１２に示されるように、２９７変異を有するグリコシル化ＩｇＧ１およびアグリコシル化ＩｇＧ１は、標的タンパク質プロパジンとの結合の親和性が低い。

実施例２
代替的経路の活性化（ＡＰ）の阻害を示すバイオアッセイ
Ｉｎ ｖｉｖｏ様系において、ＡＰ活性化を阻害する本発明の例示的化合物を評価するために、赤血球溶血アッセイを使用した。ウサギの赤血球（ｒＢＢＣ）を正常なヒト血清（ＮＨＳ）を含むＡＰを可能にするバッファーでインキュベートした。ｒＢＢＣ（「異物」）の存在は、優先的にＡＰの活性化を誘導し、赤血球上のＣ５ｂ−９が析出され、最終的に細胞溶解を引き起こす。この細胞溶解の程度は、７００ｎｍの吸光度での光散乱に基づき検出される。

ウサギの赤血球（ｒＲＢＣ）を１０％のヒト血清（Ｍｇ２＋／ＥＧＴＡを含む）中に導入することは、代替補体カスケードを開始する遺物細胞表面の導入を表す。ＡＰの活性化は、異物の細胞（ｒＲＢＣ）の溶解を引き起こすＭＡＣを形成させる。本発明の選択された抗体は、これらの赤血球の溶解を防止する。この工程を、未変化赤血球細胞により引き起こされる光散乱を検査した後に定量化した。

ウサギの赤血球がＡＰに特異的に活性化し、その結果Ｃ５ｂ−９ （ＭＡＣ）複合体によりｒＲＢＣの溶解を伴うことが良好に示される。（未変化の細胞の溶解により）光散乱の進行が減少したことが、温度−制御型ＥＬＩＳＡプレートリーダー内の時間関数として７００ｎｍで測定した。このデータを記録し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０プレートリーダーおよびＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアで解析した。図６および図７に示されるように、アグリコシル化（２９７変異を有するＩｇＧ１／ＩｇＧ２）は、ＡＰの活性化を阻害する。図１３および１４に示されるように、２９７変異を有するグリコシル化ＩｇＧ１およびアグリコシル化ＩｇＧ２は、同様の効果を備える代替的経路の活性化を阻害する。

実施例３
アグリコシル化抗体は、古典的経路を阻害せず、活性化しない。
公知の文献により、ＩｇＧ２（未変性）が補体経路を活性化することが知られている。図１を参照されたい。ＣＰに関する抗体の効果を試験するために、抗体感作したヒツジの赤血球（ｓＲＢＣ）を、１％の正常なヒト血清を含むＣＰバッファー（Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）中でインキュベートした。これらのｓＲＢＣは、ＣＰを活性化し、このことにより細胞膜の溶解を誘導する。細胞膜の溶解は、細胞による光散乱を徐々に減少させる。本発明の代替的経路に特異的な抗体を、ｓＲＢＣと共に、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋を含むバッファー（「ＣＰバッファー」）を含む１％ＮＨｓ中でインキュベートした際、溶血を開始し、最大溶血と共に終了する期間内では、溶血に全く効果のないことが観察された。このことは、ＩｇＧ２抗体を中和する代替的経路が、ＮＨＳにおけるＣＰの溶血性活性に影響しないことが示唆される。（未変化細胞の溶解による）光散乱を、時間の関数として７００ｎｍで測定した。古典的経路の活性化は、１００％の対照レベルを越えず、このことは、アグリコシド抗体およびアグリコシドハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ２抗体が、古典的経路を活性させないことを示唆する。対照的に、ＩｇＧ１自体は、古典的経路を活性化することが知られている。

実施例４
補体Ｃ１ｑに対する結合親和性
抗体のＣ１ｑ活性は、抗体のエフェクター機能としての古典的補体経路を開始する。Ｃ１ｑの度合いは、抗体の種類により変動し、ＩｇＧ２アイソタイプと比較したＩｇＧ１アイソタイプの方が大きな度合いを有することが見いだされる。また、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、Ｃ１ｑ結合を介して媒介される。したがって、抗体がＣ１ｑとより強く結合すると、ＣＰ活性化およびＣＤＣ活性化がより高くなる。このように、Ｃ１ｑ結合の欠損は、ＣＤＣ活性化の欠損に直接相関する。問題となるすべての抗体の結合を、結合アッセイを使用して評価した。培地結合型９６ウェルプレートを、２μｇ／ｍｌの抗体を含む一晩４℃でＰＢＳによりコーティングした。ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水での各インキュベーションステップおよびインキュベーションを室温で実施した後プレートを洗浄した。コーティングした後、このプレートを、２００μｌ／ウェルのブロッキング溶液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で１時間ブロッキングし、内在性レベルのＣ１ｑを含む様々な濃度の正常なヒト血清で、１時間インキュベートした。インキュベートおよび洗浄の後、結合したＣ１ｑをＨＲＰコンジュゲート型ヤギ抗−ヒトＣ１ｑ抗体（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｙｌｅｒ， ＴＸ）および基質としてＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ）で検出した。この反応を、１００μｌの１ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加することにより停止した。最終的なシグナルを、４５０ｎｍの吸光度により測定した（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ１９０および２５０）。

図１５に示されるように、アバスチンのＦｃドメインは、Ｃ１ｑとの結合を高めるように設計されているため、アバスチンはＣ１ｑと非常に強く結合する。また、ヒュミラは、顕著なＣ１ｑ結合を示す。ヒュミラのＦｃ領域は変化しない。グリコシル化ＩｇＧ１はまた、Ｃ１ｑに結合することを示した。しかしながら、アグリコシル化ＩｇＧ１は、Ｃ１ｑに結合せず、それゆえＣＤＣ活性を示さない。

実施例５
Ｆｃ．Ｇａｍｍａ．ＲＩおよびＦｃ．Ｇａｍｍａ．ＲＩＩＩタンパク質に対する親和性の結合
Ｆｃのエフェクター機能は、細胞の機能および細胞の活性化に重要である、治療用抗体では、これら抗体が細胞の活性型および抗体媒介細胞傷害を引き起こさないことが重要である。ＩｇＧ１アイソタイプは、ＦｃｙＲＩ受容体を高結合親和的に活性化することが知られている。ＦｃｙＲＩＩおよびＲＩＩＩの特定のアイソタイプの結合親和性は、ＲｃＲｉより低い。ＩｇＧ２アイソタイプは、図１に示されるように、概して、これらＦｃｇａｍｍａ受容体に対して低い結合親和性を示す。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２のアグリコシル化アイソフォームを作製することにより、ＡＤＣＣ活性化をさらに低くすることができる。図１６は、アグリコシル化ＩｇＧ１が、試験したＦｃｙＲＩおよびＦｃｙＲＩＩＩに対する結合の欠損を示す。Ｃｏｓｔａｒ製の培地結合型９６ウェルプレートを、Ｆｃ一晩４℃で、ｇａｍｍａペプチドによりコーティングした。ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水での各インキュベーションステップおよびインキュベーションステップを室温で実施した後、このプレートを洗浄した。コーティングした後、このプレートを、２００μｌ／ウェルのブロッキング溶液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で１時間ブロッキングし、抗体を含むブロッキング溶液を多様な濃度で１時間インキュベートした。インキュベートし洗浄した後、結合した抗体を、ＨＲＰコンジュゲート型ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｙｌｅｒ， ＴＸ）おおよび基質としてのＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ）で検出した。この反応を、１００μｌの１ＭのＨ２ＳＯ４を添加することにより停止した。最終的なシグナルを４５０ｎｍでの吸光度により測定した（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ１９０および２５０）。

図１６および１７に示されるようにアグリコシル化抗体は、Ｆｃ受容体に対する結合を示さない。

Claims (73)

1. 抗体媒介細胞活性化、抗体媒介古典的経路活性化および治療用中和抗体に関連する炎症を低減させる方法であって、４つの既知のアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなるアイソタイプの群）のいずれかの１つ以上の抗体に由来する第１部分と、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３からなるアイソタイプの群から選択される１つ以上のヒト抗体由来の第２部分とを有する改変された重鎖の定常部を含む改変された形態の抗体を対象に投与することを含み、
   前記投与される抗体の少なくとも一部が、ＩｇＧ１以外の抗体由来である、
   方法。
2. 前記投与される抗体がアグリコシル化されている、請求項１に記載の方法。
3. 前記アグリコシル化は、位置２９７での、アスパラギン（Ｎ）のアラニン（Ａ）またはグルタミン（Ｑ）の変異によって行われる、請求項２に記載の方法。
4. 前記可変部が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプの抗体由来であり、第１の定常部（ＣＨ１）が、前記第１の定常部由来のものと同一のアイソタイプではないアイソタイプの抗体由来である、請求項１に記載の方法。
5. 前記ＣＨ２およびＣＨ３が、ＩｇＧ４由来ではない、請求項１に記載の方法。
6. 前記抗体がヒト補体系の構成タンパク質に結合する、請求項１に記載の方法。
7. 前記抗体が古典的経路の構成タンパク質に結合する、請求項７に記載の方法。
8. 前記抗体が代替的経路の構成タンパク質に結合する、請求項７に記載の方法。
9. 前記アグリコシル化によるＦｃ改変が、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を低減する、請求項１に記載の方法。
10. 前記抗体がサイトカインまたはサイトカイン受容体に結合する、請求項１に記載の方法。
11. 前記抗体が増殖因子に結合する、請求項１に記載の方法。
12. 前記抗体がケモカインまたはケモカイン受容体に結合する、請求項１に記載の方法。
13. 前記抗体が可溶性タンパク質または分泌タンパク質である、請求項７、８、９、１１、１２、または１３に記載の方法。
14. 前記抗体が細胞表面分子に結合する、請求項７、８、９、１１、１２、または１３に記載の方法。
15. 前記投与される抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる配列の群の１つから選ばれる結合領域を含む、請求項１に記載の方法。
16. 抗体媒介細胞活性化、抗体媒介古典的経路活性化、および治療用中和抗体に関連する炎症を低減する方法であって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体由来の可変部および定常部の第１部分と、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の改変されたＣＨ２およびＣＨ３領域とを含む改変された形態の抗体を対象に投与することを含む、
    方法。
17. 前記投与される抗体がアグリコシル化されている、請求項１６に記載の方法。
18. 前記アグリコシル化が、位置２９７でのアスパラギン（Ｎ）のアラニン（Ａ）またはグルタミン（Ｑ）の変異によって行われる、請求項１６に記載の方法。
19. 前記可変部が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプの抗体由来であり、前記第１の定常部（ＣＨ１）が、前記第１の定常部由来のものと同一のアイソタイプではないアイソタイプの抗体由来である、請求項１６に記載の方法。
20. 前記ＣＨ２またはＣＨ３のいずれかがＩｇＧ２であり、ＣＨ２およびＣＨ３の両方がＩｇＧ２ではない、請求項１６に記載の方法。
21. 前記抗体がヒト補体系の構成タンパク質と結合する、請求項１６に記載の方法。
22. 前記抗体が古典的経路の構成タンパク質と結合する、請求項２１に記載の方法。
23. 前記抗体が代替的経路の構成タンパク質と結合する、請求項２１に記載の方法。
24. 前記アグリコシル化によるＦｃ改変が、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを低減する、請求項１６に記載の方法。
25. 前記抗体がサイトカインまたはサイトカイン受容体と結合する、請求項１６に記載の方法。
26. 前記抗体が増殖因子と結合する、請求項１６に記載の方法。
27. 前記抗体がケモカインまたはケモカイン受容体と結合する、請求項１６に記載の方法。
28. 前記抗体が、可溶性タンパク質または分泌タンパク質と結合する、請求項２１、２２、２３、２５、２６、または２７に記載の方法。
29. 前記抗体が細胞表面分子と結合する、請求項２１、２２、２３、２５、２６、または２７に記載の方法。
30. 抗体媒介細胞活性化、抗体媒介古典的経路活性化、および治療用中和抗体に関連する炎症を低減する方法であって、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２由来の可変部および定常部の第１部分と、１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来のアグリコシル化ＣＨ２およびＣＨ３領域とを含む改変された形態の抗体を投与することを含む、
    方法。
31. 前記投与される抗体のＩｇＧ４部分がアグリコシル化されている、請求項３０に記載の方法。
32. 前記アグリコシル化が、位置２９７でのアスパラギン（Ｎ）のアラニン（Ａ）またはグルタミン（Ｑ）の変異によって行われる、請求項３０に記載の方法。
33. 前記可変部が、抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプ由来とすることができる、請求項３０に記載の方法。
34. 前記可変部が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプ由来であり、第１の定常部（ＣＨ１）が、前記第１の定常部由来のものと同一のアイソタイプではないアイソタイプの抗体由来である、請求項３０に記載の方法。
35. 前記ＣＨ２またはＣＨ３のいずれかがＩｇＧ４であり、ＣＨ２およびＣＨ３の両方がＩｇＧ４ではない、請求項３０に記載の方法。
36. 前記抗体がヒト補体系の構成タンパク質と結合する、請求項３０に記載の方法。
37. 前記抗体が古典的経路の構成タンパク質と結合する、請求項３６に記載の方法。
38. 前記抗体が代替的経路の構成タンパク質と結合する、請求項３６に記載の方法。
39. 前記アグリコシル化によるＦｃ改変が、ＡＤＣＣおよびＣＤＣＣの活性化を低減する、請求項３０に記載の方法。
40. 前記抗体がサイトカインまたはサイトカイン受容体と結合する、請求項３０に記載の方法。
41. 前記抗体が増殖因子と結合する、請求項３０に記載の方法。
42. 前記抗体がケモカインまたはケモカイン受容体と結合する、請求項３０に記載の方法。
43. 前記抗体が可溶性タンパク質または分泌タンパク質と結合する、請求項３６、３７、３８、４０、４１、または４２に記載の方法。
44. 前記抗体が、細胞表面分子と結合する、請求項３６、３７、３８、４０、４１、または４２に記載の方法。
45. 抗体媒介細胞活性化、抗体媒介古典的経路活性化、および治療用中和抗体に関連する炎症を低減する方法であって、アグリコシル化ＩｇＧ２抗体の改変された形態を、その必要のある哺乳類に投与して炎症を防止することを含む、方法。
46. 前記投与したＩｇＧ２抗体が、位置２９７でのアスパラギン（Ｎ）のアラニン（Ａ）またはグルタミン（Ｑ）の変異によってアグリコシル化される、請求項４５に記載の方法。
47. 前記抗体がヒト補体系の構成タンパク質と結合する、請求項４５に記載の方法。
48. 前記抗体が古典的経路の構成タンパク質と結合する、請求項４７に記載の方法。
49. 前記抗体が代替的経路の構成タンパク質と結合する、請求項４７に記載の方法。
50. 前記アグリコシル化によるＦｃ改変が、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性化を低減する、請求項４５に記載の方法。
51. 前記抗体がサイトカインまたはサイトカイン受容体と結合する、請求項４５に記載の方法。
52. 前記抗体が増殖因子と結合する、請求項４５に記載の方法。
53. 前記抗体がケモカインまたはケモカイン受容体と結合する、請求項４５に記載の方法。
54. 前記抗体が可溶性タンパク質または分泌タンパク質と結合する、請求項４７、４８、４９、５１、５２、または５３に記載の方法。
55. 前記抗体が細胞表面分子と結合する、請求項４７、４８、４９、５１、５２、または５３に記載の方法。
56. 抗体媒介細胞活性化、古典的経路活性化、または、特に代替的経路の構成タンパク質を標的化する治療用抗体に関連する炎症事象を低減する方法であって、前記抗体を改変された形態で投与することを含み、前記投与される抗体の第１部分が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４アイソタイプの少なくとも１つの抗体由来であり、第２部分が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される１つ以上のヒト抗体由来である、方法。
57. アグリコシル化が、位置２９７でのアスパラギン（Ｎ）のアラニン（Ａ）またはグルタミン（Ｑ）の変異によって行われる、請求項５６に記載の方法。
58. 前記第２部分が、ＩｇＧ４抗体由来ではない、請求項５６に記載の方法。
59. 前記抗体がヒト補体系の構成タンパク質と結合する、請求項５６に記載の方法。
60. 前記抗体が古典的経路の構成タンパク質と結合する、請求項５６に記載の方法。
61. 前記抗体が代替的経路の構成タンパク質と結合する、請求項５６に記載の方法。
62. 前記アグリコシル化によるＦｃ改変が、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性化を低減する、請求項５６に記載の方法。
63. 前記抗体が、サイトカインまたはサイトカイン受容体と結合する、請求項５６に記載の方法。
64. 前記抗体が増殖因子と結合する、請求項５６に記載の方法。
65. 前記抗体が、ケモカインまたはケモカイン受容体と結合する、請求項５６に記載の方法。
66. 前記抗体が、可溶性タンパク質または分泌タンパク質と結合する、請求項５９、６０、６１、６３、６４、または６５に記載の方法。
67. 前記抗体が細胞表面分子と結合する、請求項５９、６０、６１、６３、６４、または６５に記載の方法。
68. 前記投与される抗体の第１部分が、ＩｇＧ２アイソタイプ由来であり、前記第２部分が、前記Ｆｃ領域でアグリコシル化される、請求項５６に記載の方法。
69. 前記投与される抗体が、Ｆｃ領域でアグリコシル化された、請求項６８に記載の方法。
70. 前記投与される抗体が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる配列群の１つから選ばれる結合領域を含む、請求項１６に記載の方法。
71. 前記投与される抗体が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる配列群の１つから選ばれる結合領域を含む、請求項３０に記載の方法。
72. 前記投与される抗体が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる配列群の１つから選ばれる結合領域を含む、請求項４５に記載の方法。
73. 前記投与される抗体が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる配列群の１つから選ばれる結合領域を含む、請求項５６に記載の方法。

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