JP2015156851A - Polynucleotide encoding signal peptide, and method for producing protein using it - Google Patents
Polynucleotide encoding signal peptide, and method for producing protein using it Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、シグナルペプチドをコードする新規なポリヌクレオチドおよびそれを用いたタンパク質の製造方法に関する。 The present invention relates to a novel polynucleotide encoding a signal peptide and a method for producing a protein using the same.
タンパク質は細胞内で合成された後、そのまま細胞内に留まるもの、細胞外へと分泌タンパク質として放出されるものが知られている。また大腸菌などを宿主として用いた組換えタンパク質生産では、細胞内膜と外膜の間のペリプラズム領域に前記タンパク質を分泌発現させる方法が知られている（特許文献１）。細胞内からペリプラズム領域へ組換えタンパク質が移送される際には、シグナルペプチドと呼ばれるオリゴペプチドの働きが重要である（特許文献１）。シグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の特徴として、以下の３つがあげられる（特許文献１）。
（ｉ）Ｎ末端領域には、アルギニンやリジンといった塩基性アミノ酸が少なくとも１つ含まれており、当該塩基性アミノ酸の側鎖の正電荷と細胞膜表面の負電荷とのイオン結合によりシグナルペプチドが細胞膜内へと移行する。
（ｉｉ）中心領域では、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンといった疎水性アミノ酸が多く含まれ、細胞膜内への貫通に関与する。
（ｉｉｉ）Ｃ末端領域では、細胞膜貫通後にシグナルペプチダーゼにより切断される特定のアミノ酸が認識部位として存在しており、当該認識部位で切断されることで成熟体タンパク質がペリプラズム領域や細胞外へと放出される。
Proteins that are synthesized in the cell and remain in the cell as they are, or those that are released as secreted proteins to the outside of the cell are known. In recombinant protein production using Escherichia coli or the like as a host, a method of secreting and expressing the protein in the periplasmic region between the inner membrane and outer membrane is known (Patent Document 1). When a recombinant protein is transferred from the cell to the periplasm region, the function of an oligopeptide called a signal peptide is important (Patent Document 1). The characteristics of the amino acid sequence constituting the signal peptide include the following three (Patent Document 1).
(I) The N-terminal region contains at least one basic amino acid such as arginine or lysine, and the signal peptide is bound to the cell membrane by ionic bond between the positive charge on the side chain of the basic amino acid and the negative charge on the cell membrane surface. Move in.
(Ii) The central region contains many hydrophobic amino acids such as alanine, leucine, isoleucine, and valine, and is involved in penetration into the cell membrane.
(Iii) In the C-terminal region, a specific amino acid cleaved by a signal peptidase after passing through the cell membrane exists as a recognition site, and the mature protein is released to the periplasmic region or outside the cell by being cleaved at the recognition site. Is done.
組換えタンパク質を宿主のペリプラズムに分泌発現させるには、前記タンパク質のＮ末端側に、ペリプラズムへの分泌発現を促進させるシグナルペプチドが付加された状態で発現させる必要がある。しかしながら、前記方法を用いた場合、活性型タンパク質としての生産性が低いという問題があった。またシグナルペプチドの改変により生産性を向上させた例も報告（特許文献１から３）されているが、工業的な生産には十分とはいえなかった。
In order to cause a recombinant protein to be secreted and expressed in the host periplasm, it is necessary to express the recombinant protein in a state in which a signal peptide that promotes secretory expression to the periplasm is added to the N-terminal side of the protein. However, when the above method is used, there is a problem that productivity as an active protein is low. In addition, examples of improving the productivity by modifying the signal peptide have been reported (
また近年、シグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドにレアコドン（宿主内で使用頻度の少ないコドン）を導入することで生産性を向上させた例も報告されている（非特許文献１および２）が、これらの例でも工業的な生産には十分とはいえなかった。
In recent years, examples of improving productivity by introducing rare codons (codons that are less frequently used in the host) into oligonucleotides encoding signal peptides have been reported (Non-patent
本発明の目的は、宿主細胞内で発現した組換えタンパク質を効率的にペリプラズム領域へ移行可能なシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドを用いた前記タンパク質の製造方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding a signal peptide capable of efficiently transferring a recombinant protein expressed in a host cell to the periplasmic region, and a method for producing the protein using the polynucleotide. is there.
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、既知のシグナルペプチドの特定位置のアミノ酸をコードするコドンをレアコドンに変換したポリヌクレオチドを前記シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとして用いることで、組換えタンパク質の生産量が向上できることを見出し、本発明の完成に至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have used a polynucleotide obtained by converting a codon encoding an amino acid at a specific position of a known signal peptide to a rare codon as a polynucleotide encoding the signal peptide. Thus, the inventors have found that the production amount of the recombinant protein can be improved, and have completed the present invention.
すなわち本発明は、以下の態様を包含する：
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下の（１）から（３）のコドンのうち、少なくともいずれか１つのコドンをレアコドンに変換した、前記ポリヌクレオチド。
（１）５番目のアミノ酸ロイシンをコードするコドン
（２）６番目のアミノ酸プロリンをコードするコドン
（３）７番目のアミノ酸スレオニンをコードするコドン
（Ｂ）５番目のアミノ酸ロイシンのレアコドンがＣＴＡである、（Ａ）に記載のポリヌクレオチド。
That is, the present invention includes the following embodiments:
(A) a polynucleotide encoding an oligopeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein at least any one of the following codons (1) to (3) is converted to a rare codon, The polynucleotide.
(1) Codon encoding the fifth amino acid leucine (2) Codon encoding the sixth amino acid proline (3) Codon encoding the seventh amino acid threonine (B) The rare codon of the fifth amino acid leucine is CTA The polynucleotide according to (A).
（Ｃ）６番目のアミノ酸プロリンのレアコドンがＣＣＣである、（Ａ）または（Ｂ）に記載のポリヌクレオチド。 (C) The polynucleotide according to (A) or (B), wherein the rare codon of the 6th amino acid proline is CCC.
（Ｄ）７番目のアミノ酸スレオニンのレアコドンがＡＣＡである、（Ａ）から（Ｃ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。 (D) The polynucleotide according to any one of (A) to (C), wherein the rare codon of the seventh amino acid threonine is ACA.
（Ｅ）配列番号４から６のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチド。 (E) A polynucleotide encoding an oligopeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 to 6.
（Ｆ）（Ａ）から（Ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドとタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、前記タンパク質を発現させるためのプラスミド。 (F) A plasmid for expressing the protein, comprising the polynucleotide according to any one of (A) to (E) and a polynucleotide encoding the protein.
（Ｇ）タンパク質がＦｃ結合性タンパク質である、（Ｆ）に記載のプラスミド。 (G) The plasmid according to (F), wherein the protein is an Fc-binding protein.
（Ｈ）（Ｆ）または（Ｇ）に記載のプラスミドを用いて宿主を形質転換して得られる、形質転換体。 (H) A transformant obtained by transforming a host with the plasmid according to (F) or (G).
（Ｉ）宿主が大腸菌である、（Ｈ）に記載の形質転換体。 (I) The transformant according to (H), wherein the host is Escherichia coli.
（Ｊ）（Ｈ）または（Ｉ）に記載の形質転換体を培養することで前記形質転換体からタンパク質を発現させる工程と、前記形質転換体から当該タンパク質を単離する工程とを含む、前記タンパク質の製造方法。 (J) comprising culturing the transformant according to (H) or (I) to express a protein from the transformant, and isolating the protein from the transformant, A method for producing a protein.
以下に、本発明について詳細に説明する。 The present invention is described in detail below.
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる天然型ＰｅｌＢシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１の１番目から２２番目までの領域）のうち、５番目のアミノ酸ロイシンをコードするコドン、６番目のアミノ酸プロリンをコードするコドン、７番目のアミノ酸スレオニンをコードするコドン、のうち少なくともいずれか１つのコドンをレアコドンに変換したポリヌクレオチドである。レアコドンとは宿主の翻訳機構において使用頻度が少ないコドンのことをいい、一例として宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合は、アラニン（Ａｌａ）ではＧＣＴが、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＴ／ＣＣＣが、スレオニン（Ｔｈｒ）ではＡＣＡが、それぞれレアコドンに相当する。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。本発明のポリヌクレオチドの一例として、
（ｉ）前記天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドのうち５番目のアミノ酸ロイシンおよび６番目のアミノ酸プロリンをコードするコドンをレアコドンに変換したポリヌクレオチド
（ｉｉ）前記天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドのうち７番目のアミノ酸スレオニンをコードするコドンをレアコドンに変換したポリヌクレオチド
（ｉｉｉ）前記天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドのうち５番目のアミノ酸ロイシン、６番目のアミノ酸プロリンおよび７番目のアミノ酸スレオニンをコードするコドンをレアコドンに変換したポリヌクレオチド
があげられる。（ｉ）の具体例としては、５番目のアミノ酸ロイシンのレアコドンをＣＴＡとし、６番目のアミノ酸プロリンのレアコドンをＣＣＣとした、配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが、（ｉｉ）の具体例としては、７番目のアミノ酸スレオニンのレアコドンをＡＣＡとした、配列番号５に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが、（ｉｉｉ）の具体例としては、５番目のアミノ酸ロイシンのレアコドンをＣＴＡとし、６番目のアミノ酸プロリンのレアコドンをＣＣＣとし、７番目のアミノ酸スレオニンのレアコドンをＡＣＡとした、配列番号６に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが、それぞれあげられる。
The polynucleotide of the present invention comprises a codon encoding the fifth amino acid leucine in a natural PelB signal peptide (uniprot No. P0C1C1 region from the first to the 22nd region) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, A polynucleotide obtained by converting at least one of a codon encoding the 6th amino acid proline and a codon encoding the 7th amino acid threonine into a rare codon. A rare codon means a codon that is used less frequently in the translation mechanism of the host. For example, when the host is Escherichia coli, GCT is used for alanine (Ala), and AGA / AGG / CGG / is used for arginine (Arg). CGA corresponds to rare codons for isoleucine (Ile), ATA for leucine (Leu), GTA for glycine (Gly), CCT / CCC for proline (Pro), and ACA for threonine (Thr). . Analysis of codon usage frequency can also be performed by using a public database (for example, Codon Usage Database on the website of Kazusa DNA Research Institute). As an example of the polynucleotide of the present invention,
(I) a polynucleotide obtained by converting a codon encoding the fifth amino acid leucine and the sixth amino acid proline of the natural PelB signal peptide into a rare codon; (ii) a seventh amino acid threonine of the natural PelB signal peptide; (Iii) a polynucleotide obtained by converting a codon encoding the fifth amino acid leucine, the sixth amino acid proline and the seventh amino acid threonine into a rare codon can give. As a specific example of (i), a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 wherein the rare codon of the fifth amino acid leucine is CTA and the rare codon of the sixth amino acid proline is CCC, As a specific example, a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 in which the rare codon of the seventh amino acid threonine is ACA, and as a specific example of (iii), the rare codon of the fifth amino acid leucine is CTA. And a polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6, wherein the rare codon of the 6th amino acid proline is CCC and the rare codon of the 7th amino acid threonine is ACA.
本発明のプラスミドは、宿主で発現させるタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＡ）の５’末端側に本発明のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＢ）を付加したポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＣ）を、プラスミドの適切な位置に挿入することで得られる。なお、前記ポリヌクレオチドＡに前記ポリヌクレオチドＢを付加させる際、前記ポリヌクレオチドＡと前記ポリヌクレオチドＢとの間にリンカーとして１から数アミノ酸残基からなる任意のオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入してもよい。またポリヌクレオチドＣを挿入するプラスミドとしては、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、宿主が大腸菌の場合は、ｐＥＴプラスミド、ｐＵＣプラスミド、ｐＴｒｃプラスミド、ｐＣＤＦプラスミド、ｐＢＢＲプラスミドを例示することができる。また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。本発明のプラスミドを用いて宿主を形質転換させるには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。 The plasmid of the present invention comprises a polynucleotide (polynucleotide C) obtained by adding the polynucleotide (polynucleotide B) of the present invention to the 5 ′ end side of a polynucleotide (polynucleotide A) encoding a protein to be expressed in a host. It is obtained by inserting it at an appropriate position. In addition, when adding the polynucleotide B to the polynucleotide A, a polynucleotide encoding an arbitrary oligopeptide consisting of 1 to several amino acid residues is inserted between the polynucleotide A and the polynucleotide B as a linker. May be. The plasmid for inserting polynucleotide C is not particularly limited as long as it is stably present and replicable in the host to be transformed. When the host is E. coli, pET plasmid, pUC plasmid, pTrc plasmid, pCDF plasmid The pBBR plasmid can be exemplified. The appropriate position means a position where the replication function of the expression vector, a desired antibiotic marker, and a region related to transmissibility are not destroyed. In order to transform a host using the plasmid of the present invention, those skilled in the art may carry out the method usually used.
本発明のプラスミドを用いて宿主を形質転換体して得られる形質転換体（以下、単に本発明の形質転換体とする）を用いて製造するタンパク質に特に限定はなく、一例として、インシュリン、インターフェロン、インターロイキン、抗体、エリスロポエチン、成長ホルモンなどのヒト由来タンパク質、およびそれらの受容体タンパク質があげられる。なお、本発明の形質転換体を用いて製造するタンパク質は、完全体であってもよいし、当該タンパク質の機能に重要な部分のみから構成されるタンパク質であってもよいし、さらに当該タンパク質を構成するアミノ酸の一つ以上が欠失および／または挿入および／または置換されていてもよい。以降、本発明の形質転換体を用いて製造可能なタンパク質のうち、Ｆｃ結合性タンパク質について詳細に説明する。 There is no particular limitation on the protein produced using a transformant obtained by transforming a host using the plasmid of the present invention (hereinafter, simply referred to as the transformant of the present invention). Examples of such proteins include insulin and interferon. , Interleukins, antibodies, erythropoietin, human-derived proteins such as growth hormone, and their receptor proteins. The protein produced using the transformant of the present invention may be a complete protein, a protein composed only of a part important for the function of the protein, or the protein. One or more of the constituent amino acids may be deleted and / or inserted and / or substituted. Hereinafter, among the proteins that can be produced using the transformant of the present invention, the Fc-binding protein will be described in detail.
本明細書においてＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの領域）（図１参照）を構成するタンパク質、またはヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの場合、配列番号４６に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでの領域）（図４参照）を構成するタンパク質のことをいう。ただし必ずしもヒトＦｃγＲＩ細胞外領域またはヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域の全領域でなくてもよく、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域またはヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域を構成するタンパク質（ポリペプチド）のうち、少なくとも抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。当該ヒトＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質や、
（ｉｉｉ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
（ｉｖ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。
In the present specification, the Fc binding protein is an extracellular region of human FcγRI (specifically, in the case of natural human FcγRI, a region from the 16th glutamine to the 292nd histidine in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1). ) (See FIG. 1) or the extracellular region of human FcγRIIIa (specifically, in the case of natural human FcγRIIIa, from the 17th glycine to the 208th glutamine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46) (Refer to FIG. 4). However, it does not necessarily have to be the entire region of human FcγRI extracellular region or human FcγRIIIa extracellular region, and at least an antibody (immunoglobulin) among proteins (polypeptides) constituting human FcγRI extracellular region or human FcγRIIIa extracellular region The polypeptide of the area | region which can express the original function couple | bonded with Fc area | region of this should just be included. As an example of the human Fc binding protein,
(I) a protein comprising an amino acid residue from at least the 16th glutamine to the 289th valine in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(Ii) including at least the amino acid residue from the 16th glutamine to the 289th valine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and replacing one or more of the amino acid residues with another amino acid residue Inserted or deleted proteins,
(Iii) a protein comprising an amino acid residue from at least the 17th glycine to the 192nd glutamine in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46;
(Iv) including at least the 17th glycine to the 192nd glutamine amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, and replacing one or more of the amino acid residues with another amino acid residue Inserted or deleted protein,
Can be given.
前記（ｉｉ）の具体例としては、特開２０１１−２０６０４６号公報に開示のＦｃ結合性タンパク質や、配列番号２１に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４２）のうち少なくともいずれか１つの置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（特開２０１４−０２７９１６号）があげられる。
（１）配列番号２１の３７番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（２）配列番号２１の３８番目のプロリンがセリンに置換
（３）配列番号２１の５３番目のロイシンがグルタミンに置換
（４）配列番号２１の６２番目のグルタミン酸がバリンに置換
（５）配列番号２１の６３番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（６）配列番号２１の６６番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（７）配列番号２１の６７番目のセリンがプロリンに置換
（８）配列番号２１の６９番目のアラニンがバリンまたはスレオニンに置換
（９）配列番号２１の７１番目のセリンがスレオニンまたはロイシンに置換
（１０）配列番号２１の７８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１１）配列番号２１の８１番目のイソロイシンがバリンに置換
（１２）配列番号２１の８４番目のセリンがスレオニンに置換
（１３）配列番号２１の８８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号２１の９５番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号２１の１１９番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（１６）配列番号２１の１２７番目のバリンがアラニンに置換
（１７）配列番号２１の１４６番目のアルギニンがリジンに置換
（１８）配列番号２１の１４７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号２１の１５１番目のヒスチジンがチロシンに置換
（２０）配列番号２１の１７８番目のスレオニンがアラニンに置換
（２１）配列番号２１の１９１番目のアルギニンがリジンに置換
（２２）配列番号２１の１９９番目のスレオニンがアラニンに置換
（２３）配列番号２１の２００番目のロイシンがメチオニンに置換
（２４）配列番号２１の２１３番目のスレオニンがアラニンに置換
（２５）配列番号２１の２１６番目のバリンがアラニンに置換
（２６）配列番号２１の２２１番目のロイシンがアルギニンに置換
（２７）配列番号２１の２２９番目のセリンがアスパラギンに置換
（２８）配列番号２１の２３６番目のイソロイシンがリジンに置換
（２９）配列番号２１の２４４番目のチロシンがヒスチジンに置換
（３０）配列番号２１の２５３番目のスレオニンがアラニンに置換
（３１）配列番号２１の２９０番目のアルギニンがグルタミンに置換
（３２）配列番号２１の２９３番目のリジンがアスパラギンに置換
（３３）配列番号２１の２９７番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３４）配列番号２１の３０６番目のプロリンがスレオニンに置換
（３５）配列番号２１の３４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（３６）配列番号２１の４５番目のグルタミンがリジンに置換
（３７）配列番号２１の８２番目のグルタミンがプロリンに置換
（３８）配列番号２１の１７７番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（３９）配列番号２１の２１３番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号２１の２４２番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４１）配列番号２１の２５３番目のスレオニンがセリンに置換
（４２）配列番号２１の２７１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
また前記（ｉｖ）の具体例としては、配列番号４６に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４０）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（特願２０１３−２０２２４５号）があげられる。
（１）配列番号４６の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換
（２）配列番号４６の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換
（３）配列番号４６の２９番目のフェニルアラニンがロイシンまたはセリンに置換
（４）配列番号４６の３０番目のロイシンがグルタミンに置換
（５）配列番号４６の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジンのいずれかに置換
（６）配列番号４６の４６番目のリジンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
（７）配列番号４６の４８番目のグルタミンがヒスチジンまたはロイシンに置換
（８）配列番号４６の５０番目のアラニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号４６の５１番目のチロシンがアスパラギン酸またはヒスチジンに置換
（１０）配列番号４６の５４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（１１）配列番号４６の５６番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（１２）配列番号４６の５９番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３）配列番号４６の６１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号４６の６４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号４６の６５番目のセリンがアルギニンに置換
（１６）配列番号４６の７１番目のアラニンがアスパラギン酸に置換
（１７）配列番号４６の７５番目のフェニルアラニンがロイシン、セリン、チロシンのいずれかに置換
（１８）配列番号４６の７７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号４６の７８番目のアラニンがセリンに置換
（２０）配列番号４６の８２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸またはバリンに置換
（２１）配列番号４６の９０番目のグルタミンがアルギニンに置換
（２２）配列番号４６の９２番目のアスパラギンがセリンに置換
（２３）配列番号４６の９３番目のロイシンがアルギニンまたはメチオニンに置換
（２４）配列番号４６の９５番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２５）配列番号４６の１１０番目のロイシンがグルタミンに置換
（２６）配列番号４６の１１５番目のアルギニンがグルタミンに置換
（２７）配列番号４６の１１６番目のトリプトファンがロイシンに置換
（２８）配列番号４６の１１８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（２９）配列番号４６の１１９番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３０）配列番号４６の１２０番目のグルタミン酸がバリンに置換
（３１）配列番号４６の１２１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（３２）配列番号４６の１５１番目のフェニルアラニンがセリンまたはチロシンに置換
（３３）配列番号４６の１５５番目のセリンがスレオニンに置換
（３４）配列番号４６の１６３番目のスレオニンがセリンに置換
（３５）配列番号４６の１６７番目のセリンがグリシンに置換
（３６）配列番号４６の１６９番目のセリンがグリシンに置換
（３７）配列番号４６の１７１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（３８）配列番号４６の１８０番目のアスパラギンがリジン、セリン、イソロイシンのいずれかに置換
（３９）配列番号４６の１８５番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号４６の１９２番目のグルタミンがリジンに置換
本発明の形質転換体を作製する際に用いる宿主としては、ＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞に代表される動物細胞、バチルス属（ブレビバチルス属細菌やパエニバチルス属細菌のような広義のバチルス属細菌も含む）や大腸菌に代表される細菌、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属に代表される酵母、麹菌に代表される糸状菌等が例示できるが、取扱いの簡便な大腸菌を宿主とするのが好ましい。なお宿主が大腸菌でタンパク質がＦｃ結合性タンパク質の場合は、特開２０１２−０３４５９１号および特開２０１３−０８５５３１号に開示した方法等により本発明の形質転換体を培養することで前記タンパク質を発現させればよい。
Specific examples of the above (ii) include the Fc binding protein disclosed in JP2011-206046 and the following amino acid residues in the 34th to 307th amino acid residues of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 ( Examples thereof include Fc-binding proteins (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2014-027916) in which at least one substitution of 1) to (42) has occurred.
(1) 37th threonine of SEQ ID NO: 21 is replaced with isoleucine (2) 38th proline of SEQ ID NO: 21 is replaced with serine (3) 53rd leucine of SEQ ID NO: 21 is replaced with glutamine (4) SEQ ID NO: The 62nd glutamic acid of 21 is replaced with valine (5) The 63rd valine of SEQ ID NO: 21 is replaced with alanine or glutamic acid (6) The 66th leucine of SEQ ID NO: 21 is replaced with glutamine or proline (7) SEQ ID NO: 21 67 of serine is replaced with proline (8) 69th alanine of SEQ ID NO: 21 is replaced with valine or threonine (9) 71st serine of SEQ ID NO: 21 is replaced with threonine or leucine (10) 78th aspartic acid is replaced by glutamic acid (11) 81st isoleucine of SEQ ID NO: 21 is (12) The 84th serine of SEQ ID NO: 21 is replaced with threonine (13) The 88th phenylalanine of SEQ ID NO: 21 is replaced with tyrosine (14) The 95th glutamic acid of SEQ ID NO: 21 is replaced with aspartic acid ( 15) 119th histidine of SEQ ID NO: 21 replaced with glutamine (16) 127th valine of SEQ ID NO: 21 replaced with alanine (17) 146th arginine of SEQ ID NO: 21 replaced with lysine (18) SEQ ID NO: 21 The aspartic acid at position 147 was replaced with asparagine (19) The histidine at position 151 in SEQ ID NO: 21 was replaced with tyrosine (20) The threonine at position 178 in SEQ ID NO: 21 was replaced with alanine (21) The position 191 of SEQ ID NO: 21 Arginine is replaced with lysine (22) The 199th threonine of SEQ ID NO: 21 is (23) 200th leucine of SEQ ID NO: 21 replaced with methionine (24) 213th threonine of SEQ ID NO: 21 replaced with alanine (25) 216th valine of SEQ ID NO: 21 replaced with alanine (26 ) The 221st leucine of SEQ ID NO: 21 was replaced with arginine (27) The 229th serine of SEQ ID NO: 21 was replaced with asparagine (28) The 236th isoleucine of SEQ ID NO: 21 was replaced with lysine (29) 244th tyrosine is replaced with histidine (30) 253rd threonine of SEQ ID NO: 21 is replaced with alanine (31) 290th arginine of SEQ ID NO: 21 is replaced with glutamine (32) 293rd lysine of SEQ ID NO: 21 is replaced Substitution for asparagine (33) The 297th lysine of SEQ ID NO: 21 was substituted for glutamic acid. Substitution (34) The 306th proline of SEQ ID NO: 21 is replaced with threonine (35) The 34th glutamine of SEQ ID NO: 21 is substituted with arginine (36) The 45th glutamine of SEQ ID NO: 21 is substituted with lysine (37) The 82nd glutamine of No. 21 is replaced with proline (38) The 177th asparagine of SEQ ID NO: 21 is replaced with aspartic acid (39) The 213th threonine of SEQ ID NO: 21 is replaced with serine (40) 242 of SEQ ID NO: 21 The 41st glutamine is replaced with arginine (41) The 253rd threonine of SEQ ID NO: 21 is replaced with serine (42) The 271st glutamic acid of SEQ ID NO: 21 is replaced with aspartic acid, and as a specific example of the above (iv), Contains amino acid residues from
(1) 18th methionine of SEQ ID NO: 46 is replaced with arginine (2) 27th valine of SEQ ID NO: 46 is replaced with glutamic acid (3) 29th phenylalanine of SEQ ID NO: 46 is replaced with leucine or serine (4) The 30th leucine of SEQ ID NO: 46 is replaced with glutamine (5) The 35th tyrosine of SEQ ID NO: 46 is replaced with any of aspartic acid, glycine, lysine, leucine, asparagine, proline, serine, threonine, histidine (6) The 46th lysine of SEQ ID NO: 46 is replaced with isoleucine or threonine (7) The 48th glutamine of SEQ ID NO: 46 is replaced with histidine or leucine (8) The 50th alanine of SEQ ID NO: 46 is replaced with histidine (9) No. 46, 51st tyrosine is aspartic acid or histidine (10) The 54th glutamic acid of SEQ ID NO: 46 is replaced with aspartic acid or glycine (11) The 56th asparagine of SEQ ID NO: 46 is replaced with threonine (12) The 59th glutamine of SEQ ID NO: 46 is replaced with arginine (13) The 61st phenylalanine of SEQ ID NO: 46 is replaced with tyrosine (14) The 64th glutamic acid of SEQ ID NO: 46 is replaced with aspartic acid (15) The 65th serine of SEQ ID NO: 46 is replaced with arginine (16) No. 46, 71st alanine is replaced with aspartic acid (17) 75th phenylalanine of SEQ ID NO: 46 is replaced with either leucine, serine or tyrosine (18) 77th aspartic acid of SEQ ID NO: 46 is replaced with asparagine (19) The 78th alanine of SEQ ID NO: 46 is a serine (20) The 82nd aspartic acid of SEQ ID NO: 46 was replaced with glutamic acid or valine (21) The 90th glutamine of SEQ ID NO: 46 was replaced with arginine (22) The 92nd asparagine of SEQ ID NO: 46 was replaced with serine ( 23) 93th leucine of SEQ ID NO: 46 is replaced with arginine or methionine (24) 95th threonine of SEQ ID NO: 46 is replaced with alanine or serine (25) 110th leucine of SEQ ID NO: 46 is replaced with glutamine (26 ) The 115th arginine of SEQ ID NO: 46 is replaced with glutamine (27) The 116th tryptophan of SEQ ID NO: 46 is replaced with leucine (28) The 118th phenylalanine of SEQ ID NO: 46 is replaced with tyrosine (29) 119th lysine substituted with glutamic acid (30) sequence The 120th glutamic acid of No. 46 is substituted with valine (31) The 121st glutamic acid of SEQ ID No. 46 is substituted with aspartic acid or glycine (32) The 151st phenylalanine of SEQ ID No. 46 is substituted with serine or tyrosine (33) The 155th serine of No. 46 is replaced with threonine (34) The 163rd threonine of SEQ ID NO: 46 is replaced with serine (35) The 167th serine of SEQ ID NO: 46 is replaced with glycine (36) The 169th position of SEQ ID NO: 46 (37) The 171st phenylalanine of SEQ ID NO: 46 is replaced with tyrosine (38) The 180th asparagine of SEQ ID NO: 46 is replaced with either lysine, serine or isoleucine (39) of SEQ ID NO: 46 185th threonine is replaced by serine (40) 46 of the 192st glutamine is replaced with lysine Hosts used in preparing the transformant of the present invention include animal cells typified by COS cells and CHO cells, Bacillus spp. (Brevibacillus spp. And Paenibacillus spp. And bacteria represented by Escherichia coli, yeasts represented by Saccharomyces, Pichia and Schizosaccharomyces, and filamentous fungi represented by Aspergillus. Preferably, Escherichia coli is used as a host. When the host is Escherichia coli and the protein is an Fc-binding protein, the protein is expressed by culturing the transformant of the present invention by the method disclosed in JP2012-034591A and JP2013-085531A. Just do it.
本発明の形質転換体の培養液から、発現したタンパク質を回収するには、発現の形態によって適宜選択すればよい。例えば、発現したタンパク質が宿主細胞のペリプラズムに発現する場合は、培養液を遠心分離して得られる宿主細胞を適切な緩衝液で懸濁し細胞破砕（物理的破砕、薬剤による破砕など）後、遠心分離により破砕残渣を除去することで、発現したタンパク質を含む無細胞抽出液を得ればよく、発現したタンパク質が宿主細胞のペリプラズムから培養上清に漏出する場合は、培養液を遠心分離して得られる培養上清から発現したタンパク質を回収すればよい。なお薬剤により宿主細胞を破砕する際は、例えば、１５０ｍＭ ＮａＣｌと１ｍＭ ＥＤＴＡと６ｍＭ ＭｇＳＯ４と２５０Ｕ／Ｌ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商品名）と０．３ｇ／Ｌ Ｌｙｓｏｚｙｍｅと０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）と０．５％ ＣＴＡＢ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）と５０ｍＭ ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（特開２０１３−２５２０９９号）や、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）等の市販の抽出試薬を用いて破砕するとよい。 What is necessary is just to select suitably according to the form of expression, in order to collect | recover expressed proteins from the culture solution of the transformant of this invention. For example, when the expressed protein is expressed in the periplasm of the host cell, the host cell obtained by centrifuging the culture medium is suspended in an appropriate buffer, disrupted (physical disruption, disruption with drugs, etc.), and then centrifuged. By removing the crushing residue by separation, it is sufficient to obtain a cell-free extract containing the expressed protein. When the expressed protein leaks from the periplasm of the host cell to the culture supernatant, the culture solution is centrifuged. What is necessary is just to collect | recover the protein expressed from the culture supernatant obtained. When disrupting host cells with a drug, for example, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 6 mM MgSO 4 , 250 U / L Benzonase (trade name), 0.3 g / L Lysozyme, and 0.4% Triton X-100 (trade name) ), 0.5% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide) and 50 mM CaCl 2 , 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) (Japanese Patent Laid-Open No. 2013-252099), BugBuster Protein extraction kit (manufactured by Takara Bio Inc.) It is good to crush using commercially available extraction reagents, such as.
回収したタンパク質を含む溶液は、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等により当該タンパク質を精製単離することができる。陽イオン交換クロマトグラフィー用担体は、カルボキシメチル基、スルホプロピル基といった陽イオン交換基を担体に結合したものであり、一例として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０（以上、東ソー社製）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）があげられる。疎水クロマトグラフィー用担体は、エーテル基、フェニル基、ブチル基といった疎水性官能基を担体に結合させたものであり、一例として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｅｔｈｅｒ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｂｕｔｙｌ−６５０（以上、東ソー社製）があげられる。各種クロマトグラフィー用担体を用いて精製を行なう際は、アプライ液の導入量や前記担体のタンパク吸着性能などによって決定した量の担体を、適切なオープンカラム等に充填して行なえばよい。また、クロマトグラフィー用担体は、アプライ液を導入する前に、あらかじめ適切な緩衝液（トリス／トリス塩酸塩緩衝液、グリシン／水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸塩緩衝液等）により平衡化しておく。前述の方法で回収したタンパク質を含む溶液を、平衡化したクロマトグラフィー用担体に導入することで前記タンパク質を担体に吸着させ、平衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液で洗浄する。その後、溶出用緩衝液を用いて吸着した前記タンパク質を溶出させることにより精製された前記タンパク質を含む溶液を得ることができる。 The solution containing the recovered protein can be purified and isolated by cation exchange chromatography, hydrophobic chromatography, or the like. The carrier for cation exchange chromatography is obtained by binding a cation exchange group such as carboxymethyl group or sulfopropyl group to the carrier. As an example, TOYOPEARL CM-650, TOYOPEARL SP-650 (above, manufactured by Tosoh Corporation), CM Sepharose FastFlow (manufactured by GE Healthcare) can be mentioned. The carrier for hydrophobic chromatography is obtained by binding a hydrophobic functional group such as an ether group, a phenyl group or a butyl group to the carrier. Manufactured by Tosoh Corporation). When purification is performed using various chromatographic carriers, an appropriate open column or the like may be filled with the amount of carrier determined by the amount of Apply solution introduced or the protein adsorption performance of the carrier. The chromatographic carrier is equilibrated in advance with an appropriate buffer (Tris / Tris hydrochloride buffer, glycine / sodium hydroxide buffer, phosphate buffer, etc.) before introducing the apply solution. . The protein-containing solution recovered by the above-described method is introduced into an equilibrated chromatographic support so that the protein is adsorbed onto the support and washed with the same buffer as that used for equilibration. Thereafter, a purified solution containing the protein can be obtained by eluting the adsorbed protein using an elution buffer.
本発明のポリヌクレオチドは、天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、５番目のアミノ酸ロイシンをコードするコドン、６番目のアミノ酸プロリンをコードするコドン、７番目のアミノ酸スレオニンをコードするコドン、のうち少なくともいずれか１つのコドンをレアコドンに変換したポリヌクレオチドである。本発明により、天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドを通常のコドンで変換したポリペプチドを用いたときと比較し、組換えタンパク質生産量を大幅に向上させることが可能となり、産業上有用な組換えタンパク質の製造効率を大幅に向上させることができる。 The polynucleotide of the present invention is a polynucleotide encoding a natural PelB signal peptide, a codon encoding the fifth amino acid leucine, a codon encoding the sixth amino acid proline, and a codon encoding the seventh amino acid threonine. A polynucleotide obtained by converting at least one of the codons into a rare codon. According to the present invention, compared to the case where a polypeptide obtained by converting a natural PelB signal peptide with a normal codon is used, it is possible to greatly improve the amount of recombinant protein produced, and to produce an industrially useful recombinant protein. Efficiency can be greatly improved.
以下、タンパク質としてＦｃ結合性タンパク質を用いたときの実施例および比較例を用いて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は前記例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail using Examples and Comparative Examples when Fc-binding proteins are used as proteins, but the present invention is not limited to the above examples.
実施例１ 発現ベクターの作製
以下に示す方法にて天然型ＰｅｌＢシグナルペプチド（アミノ酸配列：ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ、配列番号２）をコードするポリヌクレオチド（通常のコドン使用）をプラスミドｐＴｒｃ９９ａ（ＧＥヘルスケア社製）に挿入することで、発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌを作製した。
（１）配列番号７（５’−ＣＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣ−３’）および配列番号８（５’−ＣＡＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＴＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡＴＴＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを等量混合し、９５℃で５分間加熱後、１５℃になるまで１分間で１℃毎に温度を下げることで、二本鎖オリゴヌクレオチドＰｅｌＢｐ１を調製した。なお、ＰｅｌＢｐ１は使用時まで１５℃で保持した。
（２）（１）で調製したＰｅｌＢｐ１を、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９ａに、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションし、このライゲーション産物を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウム（和光純薬社製）を含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌを抽出した。
（４）（３）で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌのうち、ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ライフテクノロジー社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジー社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号９（５’−ＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧ−３’）または配列番号１０（５’−ＴＣＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかをシークエンス用プライマーとして使用した。
Example 1 Preparation of Expression Vector A polynucleotide (ordinary codon usage) encoding a natural PelB signal peptide (amino acid sequence: MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA, SEQ ID NO: 2) was converted into a plasmid pTrc99a (manufactured by GE Healthcare) by the following method. By inserting, an expression vector pTrcpel was prepared.
(1) SEQ ID NO: 7 (5′-CATGAAATACCTGCTGCCGCACCGCTGTCGCTGTGTCTGCTGCCTCCTCCTGCCCCAGCCGGCGGATGGCGC-3 A double-stranded oligonucleotide PelBp1 was prepared by lowering the temperature every 1 ° C. over 1 minute until reaching 15 ° C. PelBp1 was kept at 15 ° C. until use.
(2) PelBp1 prepared in (1) was ligated to the plasmid pTrc99a previously digested with the restriction enzyme NcoI using DNA Ligation kit (manufactured by Takara Bio Inc.), and E. coli JM109 strain (Takara Bio) was used using this ligation product. The product was transformed.
(3) After culturing the obtained transformant in an LB medium containing 100 μg / mL carbenicillin sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), the expression vector pTrcpel was prepared using QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by Qiagen). Extracted.
(4) Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS read Reaction kit (manufactured by Life Technologies) based on the chain terminator method for the polynucleotide encoding the PelB signal peptide and the surrounding region of the expression vector pTrcpel prepared in (3) The nucleotide sequence was analyzed with a fully automatic DNA sequencer ABI Prism 3700 DNA analyzer (manufactured by Life Technology Co., Ltd.). In the analysis, any one of the oligonucleotides having the sequence described in SEQ ID NO: 9 (5′-TGTGGTATGGCTTGTGCAGG-3 ′) or SEQ ID NO: 10 (5′-TCGGCATGGGGTCAGGGTG-3 ′) was used as a sequencing primer.
解析の結果設計通りであることを確認した。本実施例で合成した天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３に示す。 As a result of analysis, it was confirmed that it was as designed. The sequence of the polynucleotide encoding the natural PelB signal peptide synthesized in this example is shown in SEQ ID NO: 3.
実施例２ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６８）発現ベクターの作製
配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のＣ末端側にシステインタグ（アミノ酸配列：ＣＧ）を付加したポリペプチド（ＦｃＲｍ６８−ＣＧ）をコードするポリヌクレオチドを、実施例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌに挿入し、前記タンパク質発現ベクターを作製した。なおＦｃＲｍ６８は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列中、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃ（特開２０１１−２０６０４６号公報）のうち、
配列番号１１の３７番目のスレオニンがイソロイシンに、
配列番号１１の６３番目のバリンがグルタミン酸に、
配列番号１１の６９番目のアラニンがバリンに、
配列番号１１の７１番目のセリンがロイシンに、
配列番号１１の８４番目のセリンがスレオニンに、
配列番号１１の９５番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に、
配列番号１１の２９２番目のプロリンがリジンに、
配列番号１１の２９３番目のグルタミン酸がリジンに、
配列番号１１の２９７番目のグルタミンがリジンに、
配列番号１１の３０１番目のヒスチジンがリジンに、
配列番号１１の３０４番目のプロリンがリジンに、
それぞれ置換したＦｃ結合性タンパク質である。またＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃのアミノ酸配列は、配列番号１に記載のヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列において１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当し、当該領域において６０箇所置換が生じている（特開２０１１−２０６０４６号公報）。
（１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８をコードするポリヌクレオチドである、配列番号１３に記載の配列からなるポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号１４（５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＣ−３’）および配列番号１５（５’−ＣＣＧＧＡＡＧＣＴＴＡＧＣＣＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、ＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドを得た。
Example 2 Preparation of Fc-binding protein (FcRm68) expression vector Polypeptide (FcRm68-) having a cysteine tag (amino acid sequence: CG) added to the C-terminal side of Fc-binding protein FcRm68 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 A polynucleotide encoding CG) was inserted into the expression vector pTrcpel prepared in Example 1 to prepare the protein expression vector. FcRm68 is an Fc-binding protein FcRm60c (JP-A 2011-206046) consisting of a region from the 34th glutamine to the 307th aspartic acid in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11.
37th threonine of SEQ ID NO: 11 is isoleucine,
The 63rd valine of SEQ ID NO: 11 is glutamic acid,
The 69th alanine of SEQ ID NO: 11 is valine,
71th serine of SEQ ID NO: 11 is leucine,
84th serine of SEQ ID NO: 11 is threonine,
The 95th glutamic acid of SEQ ID NO: 11 is aspartic acid,
The 292nd proline of SEQ ID NO: 11 is lysine,
The 293rd glutamic acid of SEQ ID NO: 11 is lysine,
The 297th glutamine of SEQ ID NO: 11 is lysine,
301st histidine of SEQ ID NO: 11 to lysine,
The 304th proline of SEQ ID NO: 11 is lysine,
Each is a substituted Fc binding protein. The amino acid sequence of the Fc binding protein FcRm60c corresponds to the region from the 16th glutamine to the 289th valine in the amino acid sequence of the human Fc receptor FcγRI described in SEQ ID NO: 1, and 60 substitutions occurred in this region. (JP 2011-206046 A).
(1) A polynucleotide encoding the Fc-binding protein FcRm68 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and using the polynucleotide consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 13 as a template, SEQ ID NO: 14 (5′-CATGCCATGGGACAAGTAGATATCCCCCAAGCTGTGATTAAGCTGCCAACC- PCR was carried out using oligonucleotides having the sequences described in 3 ′) and SEQ ID NO: 15 (5′-CCCGGAAGCTTAGCCGCCAGCTCCGGGTCTCTGTTGTTTTACCCAGTAC-3 ′) as PCR primers. In PCR, after preparing a reaction solution having the composition shown in Table 1, the reaction solution was subjected to a first step at 98 ° C. for 10 seconds, a second step at 50 ° C. for 5 seconds, and a third step at 72 ° C. for 1 minute. The reaction for 1 cycle was repeated 30 times. By purifying the obtained PCR product, a polynucleotide encoding FcRm68-CG was obtained.
（３）得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウム（和光純薬社製）を含むＬＢ培地で培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、ＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧを抽出した。
（４）（３）で作製した発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧのうち、ＦｃＲｍ６８をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、実施例１（４）と同様の方法でヌクレオチド配列を解析した。
(3) The obtained transformant is cultured in an LB medium containing 100 μg / mL of carbenicillin sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and then encoded using FIAR Spin Miniprep kit (manufactured by Qiagen) to encode FcRm68-CG. The expression plasmid pTrcFcRm68-CG containing the polynucleotide to be extracted was extracted.
(4) Among the expression vector pTrcFcRm68-CG produced in (3), the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding FcRm68 and the surrounding region were analyzed in the same manner as in Example 1 (4).
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧにより発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１６に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１７に、それぞれ示す。なお配列番号１６において、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでがＰｅｌＢシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）、２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列（配列番号１２）、２９９番目のシステインから３００番目のグリシンまでがシステインタグのアミノ酸配列である。なお配列番号１６において、ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列（２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までの領域）は、配列番号１に記載のヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。 The amino acid sequence of the polypeptide expressed by the expression vector pTrcFcRm68-CG is shown in SEQ ID NO: 16, and the sequence of the polynucleotide encoding the polypeptide is shown in SEQ ID NO: 17, respectively. In SEQ ID NO: 16, the amino acid sequence of the PelB signal peptide from the first methionine to the 22nd alanine (SEQ ID NO: 2), and the amino acid sequence of the Fc-binding protein FcRm68 from the 25th glutamine to the 298th aspartic acid ( (SEQ ID NO: 12) The amino acid sequence of the cysteine tag is from the 299th cysteine to the 300th glycine. In SEQ ID NO: 16, the amino acid sequence of FcRm68 (region from the 25th glutamine to the 298th aspartic acid) is the 289th position from the 16th glutamine in the amino acid sequence of the human Fc receptor FcγRI described in SEQ ID NO: 1. It corresponds to the area up to valine.
実施例３ コドンを改変したシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６８）をコードするポリヌクレオチドとを含む発現ベクターの作製
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドのうち、５番目のアミノ酸ロイシンおよび６番目のアミノ酸プロリンをコードするコドンをレアコドンＣＴＡ（ロイシン）およびＣＣＣ（プロリン）に変換した、本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列：ＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＣＴＡＣＣＣＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＣ、配列番号４）を実施例２で作製したＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドの５’末端側に付加したポリヌクレオチドＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ１を含む発現ベクターを、以下に示す方法で作製した。
（１）実施例２で作製した発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧを鋳型とし、配列番号１８（５’−ＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＣＴＡＣＣＣＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧ−３’：配列番号４の３番目から３１番目の領域に相当）および配列番号１９（５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＴＧＧＧＴＡＧＣＡＧＧＴＡＴＴＴＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５５℃で１分間の第２ステップ、６８℃で５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を１６サイクル繰り返した。
（２）得られた産物を制限酵素ＤｐｎＩで消化することで鋳型プラスミドを分解し、得られた制限酵素消化産物を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウム（和光純薬社製）を含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ１を含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ１を抽出した。
（４）実施例１（４）と同様の方法でＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ１のヌクレオチド配列を解析し所望の配列であることを確認した。
Example 3 Preparation of Expression Vector Containing Codon-Modified Signal Peptide Polynucleotide and Fc-Binding Protein (FcRm68) Polynucleotide Encoding Natural PelB Signal Peptide Comprising the Amino Acid Sequence of SEQ ID NO: 2 Among them, the polynucleotide of the present invention in which the codons encoding the fifth amino acid leucine and the sixth amino acid proline are converted to rare codons CTA (leucine) and CCC (proline) (nucleotide sequence: ATGAAATACCTGCTCACCCCGCCTGCTGTCCCGTCCGCTCGCCCAGCCGGCGGATGGCCC, Example No. 4) The polynucleotide added to the 5′-terminal side of the polynucleotide encoding FcRm68-CG prepared in 2 The expression vector containing the FcRm68-CG-R1, was produced by the following method.
(1) Using the expression vector pTrcFcRm68-CG prepared in Example 2 as a template, SEQ ID NO: 18 (5′-GAAATACCTGCTACCCACCGCTGCTGCTG-3 ′: corresponding to the third to 31st regions of SEQ ID NO: 4) and SEQ ID NO: 19 (5 '-CAGCAGCAGCCGGTGGGGTAGCAGGGTATTTC-3') as a primer, a reaction solution having the composition shown in Table 1 was prepared, and then the reaction solution was treated at 95 ° C for 30 seconds in the first step, and at 55 ° C for 1 step. A reaction in which the second step for 1 minute and the third step for 5 minutes at 68 ° C. for one cycle were repeated 16 cycles.
(2) The template plasmid was decomposed by digesting the obtained product with the restriction enzyme DpnI, and Escherichia coli W3110 was transformed with the obtained restriction enzyme digestion product.
(3) The obtained transformant is cultured in an LB medium containing 100 μg / mL of carbenicillin sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and using QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by Qiagen), FcRm68-CG-R1 The containing expression vector pTrcFcRm68-CG-R1 was extracted.
(4) The nucleotide sequence of FcRm68-CG-R1 was analyzed by the same method as in Example 1 (4) to confirm that it was the desired sequence.
ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ１のヌクレオチド配列を配列番号２０に、発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ１により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す。 The nucleotide sequence of FcRm68-CG-R1 is shown in SEQ ID NO: 20, and the amino acid sequence of the polypeptide expressed by the expression vector pTrcFcRm68-CG-R1 is shown in SEQ ID NO: 16, respectively.
実施例４ Ｆｃ結合性タンパク質の発現
（１）実施例３で作製した発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ１を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウムを含む２ＹＴ（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ：１６ｇ／Ｌ、酵母エキス：１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム：５ｇ／Ｌ）液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウムを含む２ＹＴ液体培地２０ｍＬに前培養液を６００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）培養開始３時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養後、終濃度０．０５ｍＭとなるようＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
（５）（４）で調製したタンパク質抽出液中のＦｃ結合性タンパク質の濃度を、下記に示すＥＬＩＳＡ法を用いて抗体結合活性を測定し、既知濃度のＦｃ結合性タンパク質における値と比較して測定した。
（５−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌの濃度で固定化し（４℃で１８時間）、固定化終了後、０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社製）および１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
（５−２）洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、調製したＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で１時間）。
（５−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ−ＦｃγＲＩ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。
（５−４）３０℃で１時間反応後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬに希釈したＨｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識のＡｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。
（５−５）３０℃で１時間反応後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、１Ｍのリン酸水溶液５０μＬ／ｗｅｌｌを添加し発色反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
Example 4 Expression of Fc Binding Protein (1) Escherichia coli W3110 strain was transformed with the expression vector pTrcFcRm68-CG-R1 prepared in Example 3, and 2YT containing 100 μg / mL carbenicillin sodium (Tryptone: 16 g / L, yeast extract: 10 g / L, sodium chloride: 5 g / L) was inoculated in a liquid medium and precultured by aerobic shaking culture at 37 ° C. overnight.
(2) 600 μL of the preculture was inoculated into 20 mL of 2YT liquid medium containing 100 μg / mL carbenicillin sodium, and cultured with shaking at 37 ° C. aerobically.
(3) Three hours after the start of the culture, the culture temperature was changed to 20 ° C., and after 30 minutes of shaking culture, IPTG (isopropyl-β-thiogalactopyranoside) was added to a final concentration of 0.05 mM. The culture was aerobically shaken overnight at 20 ° C.
(4) After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, and a protein extract was prepared using BugBuster Protein extraction kit (Takara Bio Inc.).
(5) The concentration of the Fc binding protein in the protein extract prepared in (4) was measured for the antibody binding activity using the ELISA method shown below, and compared with the value in the Fc binding protein at a known concentration. It was measured.
(5-1) A gamma globulin preparation which is a human antibody (manufactured by Chemical and Serum Therapy Research Laboratories) was immobilized in a well of a 96-well microplate at a concentration of 1 μg / well (18 hours at 4 ° C.), and after the immobilization was completed Blocking was performed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.5% (w / v) BSA (Sigma Aldrich) and 150 mM NaCl.
(5-2) Fc-binding protein prepared after washing with washing buffer (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.05% (w / v) Tween 20 and 150 mM NaCl) The solution containing was reacted with immobilized gamma globulin (1 hour at 30 ° C.).
(5-3) After completion of the reaction, 100 μL / well of Anti-FcγRI antibody (manufactured by R & D Systems) diluted with 50 ng / mL was washed with the washing buffer.
(5-4) After reacting at 30 ° C. for 1 hour, Horse radish Peroxidase (HRP) -labeled Anti-mouse-IgG antibody (manufactured by BETHYL) diluted with 50 ng / mL was washed with 100 μL / well. Added.
(5-5) After reacting at 30 ° C. for 1 hour, the plate is washed with the washing buffer, TMB Peroxidase Substrate (manufactured by KPL) is added at 50 μL / well, and 1M phosphoric acid aqueous solution is added at 50 μL / well for color reaction. Stop and measure the absorbance at 450 nm.
ＥＬＩＳＡ法によって濃度既知の精製Ｆｃ結合性タンパク質を用いた検量線から、培養後のＦｃ結合性タンパク質の濃度測定を行なった。また、培養終了時の菌体量として測定した６００ｎｍの吸光度で培養後のＦｃ結合性タンパク質の濃度を除することで、菌体あたりのＦｃ結合性タンパク質の生産性を算出した。結果を図２に示す。 The concentration of Fc-binding protein after culture was measured from a calibration curve using purified Fc-binding protein of known concentration by ELISA. The productivity of Fc-binding protein per cell was calculated by dividing the concentration of Fc-binding protein after culture by the absorbance at 600 nm measured as the amount of cells at the end of the culture. The results are shown in FIG.
比較例１ Ｆｃ結合性タンパク質の発現
実施例２で作製した天然型のＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３）を含むＦｃ結合性タンパク質発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧを用いて、大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換後、実施例４と同様の方法にて培養し、Ｆｃ結合性タンパク質の生産性を算出した。結果を図２に示す。
Comparative Example 1 Expression of Fc-binding protein Using the Fc-binding protein expression vector pTrcFcRm68-CG containing the polynucleotide (SEQ ID NO: 3) encoding the natural PelB signal peptide prepared in Example 2, the Escherichia coli W3110 strain was After transformation, the cells were cultured in the same manner as in Example 4, and the productivity of the Fc binding protein was calculated. The results are shown in FIG.
実施例５
実施例３（１）におけるプライマーを配列番号２２（５’−ＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴ−３’：配列番号５の７番目から３３番目の領域に相当）および配列番号２３（５’−ＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は実施例３と同様な方法で、ＰｅｌＢシグナル配列（配列番号２）の７番目のアミノ酸スレオニンをコードするコドンをレアコドンＡＣＡに変換したポリヌクレオチド（配列番号５）を実施例２で作製したＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドの５’末端側に付加したポリヌクレオチドＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ２を含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ２を作製し、ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ２のヌクレオチド配列を解析した。解析の結果、所望の配列であることを確認した。ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ２のヌクレオチド配列を配列番号２４に、発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ２により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す。
Example 5
The primer in Example 3 (1) is described in SEQ ID NO: 22 (5′-TACCTGCTGCCGACAAGCTGCTGCTGGGT-3 ′: corresponding to the seventh to 33rd region of SEQ ID NO: 5) and SEQ ID NO: 23 (5′-ACCAGCAGCAGCTGTTCGGCAGCCAGGTA-3 ′) A polynucleotide obtained by converting the codon encoding the seventh amino acid threonine of the PelB signal sequence (SEQ ID NO: 2) into a rare codon ACA in the same manner as in Example 3 except that the oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 5 was used. ) Was prepared at the 5′-terminal side of the polynucleotide encoding FcRm68-CG prepared in Example 2, and an expression vector pTrcFcRm68-CG-R2 containing FcRm68-CG-R2 was prepared. The analysis of the nucleotide sequence. As a result of the analysis, it was confirmed that the desired sequence was obtained. The nucleotide sequence of FcRm68-CG-R2 is shown in SEQ ID NO: 24, and the amino acid sequence of the polypeptide expressed by the expression vector pTrcFcRm68-CG-R2 is shown in SEQ ID NO: 16.
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ２を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換後、実施例４と同様の方法にて培養し、Ｆｃ結合性タンパク質生産性を算出した。結果を図２に示す。 Escherichia coli W3110 was transformed with the expression vector pTrcFcRm68-CG-R2, and cultured in the same manner as in Example 4 to calculate Fc-binding protein productivity. The results are shown in FIG.
比較例２
実施例３（１）におけるプライマーを配列番号２５（５’−ＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴ−３’）および配列番号２６（５’−ＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は実施例３と同様な方法で、ＰｅｌＢシグナル配列（配列番号２）の６番目のアミノ酸プロリンおよび７番目のアミノ酸スレオニンをコードするコドンをレアコドンＣＣＣ（プロリン）およびＡＣＡ（スレオニン）に変換したポリヌクレオチドを実施例２で作製したＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドの５’末端側に付加したポリヌクレオチドＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ３を含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ３を作製し、ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ３のヌクレオチド配列を解析した。解析の結果、所望の配列であることを確認した。ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ３のヌクレオチド配列を配列番号２７に、発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ３により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す。
Comparative Example 2
Example 3 except that the primer in Example 3 (1) was an oligonucleotide having the sequence described in SEQ ID NO: 25 (5′-TACCTGCTGCCCCACAGCTGCTGCTTGGT-3 ′) and SEQ ID NO: 26 (5′-ACCAGCAGCAGCTGTGGGCAGCAGGTA-3 ′) A polynucleotide in which the codons encoding the 6th amino acid proline and the 7th amino acid threonine of the PelB signal sequence (SEQ ID NO: 2) were converted to the rare codons CCC (proline) and ACA (threonine) in the same manner as in Example 2. An expression vector pTrcFcRm68-CG-R3 containing the polynucleotide FcRm68-CG-R3 added to the 5′-terminal side of the polynucleotide encoding FcRm68-CG prepared in
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ３を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換後、実施例４と同様の方法にて培養し、Ｆｃ結合性タンパク質生産性を算出した。結果を図２に示す。 Escherichia coli W3110 was transformed with the expression vector pTrcFcRm68-CG-R3, and cultured in the same manner as in Example 4 to calculate Fc-binding protein productivity. The results are shown in FIG.
実施例６
実施例３（１）におけるプライマーを配列番号２８（５’−ＡＡＡＴＡＣＣＴＧＣＴＡＣＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴ−３’：配列番号６の４番目から３３番目の領域に相当）および配列番号２９（５’−ＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＧＴＡＧＣＡＧＧＴＡＴＴＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は実施例３と同様な方法で、ＰｅｌＢシグナル配列（配列番号２）の５番目のアミノ酸ロイシン、６番目のアミノ酸プロリンおよび７番目のアミノ酸スレオニンをコードするコドンをレアコドンＣＴＡ（ロイシン）、ＣＣＣ（プロリン）およびＡＣＡ（スレオニン）に変換したポリヌクレオチド（配列番号６）を実施例２で作製したＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドの５’末端側に付加したポリヌクレオチドＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ４を含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ４を作製し、ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ４のヌクレオチド配列を解析した。解析の結果、所望の配列であることを確認した。ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ４のヌクレオチド配列を配列番号３０に、発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ４により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す。
Example 6
The primer in Example 3 (1) is described in SEQ ID NO: 28 (5′-AAATACCTGCTCACCCACAGCTGCTGCTGGT-3 ′: equivalent to the 4th to 33rd region of SEQ ID NO: 6) and SEQ ID NO: 29 (5′-ACCAGCAGCAGCTGTGGGGTAGCAGGGTTT-3 ′) A codon encoding the fifth amino acid leucine, the sixth amino acid proline and the seventh amino acid threonine of the PelB signal sequence (SEQ ID NO: 2) in the same manner as in Example 3 except that an oligonucleotide having the sequence of Was added to the 5 ′ end of the polynucleotide encoding FcRm68-CG prepared in Example 2 (SEQ ID NO: 6), which was converted to rare codons CTA (leucine), CCC (proline) and ACA (threonine). To prepare an expression vector pTrcFcRm68-CG-R4 comprising a polynucleotide FcRm68-CG-R4, and analyzed the nucleotide sequence of FcRm68-CG-R4. As a result of the analysis, it was confirmed that the desired sequence was obtained. The nucleotide sequence of FcRm68-CG-R4 is shown in SEQ ID NO: 30, and the amino acid sequence of the polypeptide expressed by the expression vector pTrcFcRm68-CG-R4 is shown in SEQ ID NO: 16, respectively.
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ４を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換後、実施例４と同様の方法にて培養し、Ｆｃ結合性タンパク質生産性を算出した。結果を図２に示す。 Escherichia coli W3110 was transformed with the expression vector pTrcFcRm68-CG-R4, and cultured in the same manner as in Example 4 to calculate Fc-binding protein productivity. The results are shown in FIG.
比較例３
実施例３（１）におけるプライマーを配列番号３１（５’−ＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＴＡＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣＴ−３’）および配列番号３２（５’−ＡＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は実施例３と同様な方法で、ＰｅｌＢシグナル配列（配列番号２）の１２番目のアミノ酸ロイシンをコードするコドンをレアコドンＣＴＡに変換したポリヌクレオチドを実施例２で作製したＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドの５’末端側に付加したポリヌクレオチドＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ５を含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ５を作製し、ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ５のヌクレオチド配列を解析した。解析の結果、所望の配列であることを確認した。ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ５のヌクレオチド配列を配列番号３３に、発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ５により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す。
Comparative Example 3
Example 3 except that the primer in Example 3 (1) was an oligonucleotide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 31 (5′-GCTGCTGCTGGCTCACTGCCTCCCTCGCT-3 ′) and SEQ ID NO: 32 (5′-AGCGAGGAGCAGTAGACCAGCAGCAGGC-3 ′) 5 ′ of the polynucleotide encoding FcRm68-CG prepared in Example 2 by converting the codon encoding the 12th amino acid leucine of the PelB signal sequence (SEQ ID NO: 2) into the rare codon CTA in the same manner as described above. An expression vector pTrcFcRm68-CG-R5 containing the polynucleotide FcRm68-CG-R5 added to the terminal side was prepared, and the nucleotide sequence of FcRm68-CG-R5 was analyzed. As a result of the analysis, it was confirmed that the desired sequence was obtained. The nucleotide sequence of FcRm68-CG-R5 is shown in SEQ ID NO: 33, and the amino acid sequence of the polypeptide expressed by the expression vector pTrcFcRm68-CG-R5 is shown in SEQ ID NO: 16, respectively.
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ５を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換後、実施例４と同様の方法にて培養し、Ｆｃ結合性タンパク質生産性を算出した。結果を図２に示す。 Escherichia coli W3110 was transformed with the expression vector pTrcFcRm68-CG-R5, and cultured in the same manner as in Example 4 to calculate Fc-binding protein productivity. The results are shown in FIG.
比較例４
実施例３（１）におけるプライマーを配列番号３４（５’−ＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＴＡＣＴＡＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＣ−３’）および配列番号３５（５’−ＧＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＴＡＧＴＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は実施例３と同様な方法で、ＰｅｌＢシグナル配列（配列番号２）の１２番目のアミノ酸ロイシンおよび１３番目のアミノ酸ロイシンをコードするコドンをレアコドンＣＴＡに変換したポリヌクレオチドを実施例２で作製したＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドの５’末端側に付加したポリヌクレオチドＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ６を含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ６を作製し、ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ６のヌクレオチド配列を解析した。解析の結果、所望の配列であることを確認した。ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ６のヌクレオチド配列を配列番号３６に、発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ６により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す。
Comparative Example 4
Example 3 except that the primer in Example 3 (1) was an oligonucleotide having the sequence described in SEQ ID NO: 34 (5′-GCTGCTGCTGGTTCACTACTACTCTCGCTGCC-3 ′) and SEQ ID NO: 35 (5′-GGCAGCGAGGAGTAGTAGACACCAGCAGCAG-3 ′) In the same manner as described above, the polynucleotide in which the codon encoding the 12th amino acid leucine and the 13th amino acid leucine in the PelB signal sequence (SEQ ID NO: 2) was converted to the rare codon CTA was encoded by FcRm68-CG produced in Example 2. An expression vector pTrcFcRm68-CG-R6 containing the polynucleotide FcRm68-CG-R6 added to the 5 ′ end side of the polynucleotide to be prepared is prepared, and nucleotides of FcRm68-CG-R6 are prepared. The analysis of the column. As a result of the analysis, it was confirmed that the desired sequence was obtained. The nucleotide sequence of FcRm68-CG-R6 is shown in SEQ ID NO: 36, and the amino acid sequence of the polypeptide expressed by the expression vector pTrcFcRm68-CG-R6 is shown in SEQ ID NO: 16, respectively.
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ６を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換後、実施例４と同様の方法にて培養し、Ｆｃ結合性タンパク質生産性を算出した。結果を図２に示す。 Escherichia coli W3110 was transformed with the expression vector pTrcFcRm68-CG-R6, and cultured in the same manner as in Example 4 to calculate Fc-binding protein productivity. The results are shown in FIG.
比較例５
実施例３（１）におけるプライマーを配列番号３７（５’−ＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＧＡ−３’）および配列番号３８（５’−ＴＣＣＣＡＴＧＧＣＣＡＴＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は実施例３と同様な方法で、ＰｅｌＢシグナル配列（配列番号２）の１９番目のアミノ酸プロリンおよび２０番目のアミノ酸アラニンをコードするコドンをレアコドンＣＣＴ（プロリン）およびＧＣＴ（アラニン）に変換したポリヌクレオチドを実施例２で作製したＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドの５’末端側に付加したポリヌクレオチドＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ７を含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ７を作製し、ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ７のヌクレオチド配列を解析した。解析の結果、所望の配列であることを確認した。ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ７のヌクレオチド配列を配列番号３９に、発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ７により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す。
Comparative Example 5
Example 3 except that the primer in Example 3 (1) was an oligonucleotide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 37 (5′-CTCGCTGCCCAGCCTGCTATGCCATGGGA-3 ′) and SEQ ID NO: 38 (5′-TCCCCATGCCATAGCAGGCTGGGCAGCGAG-3 ′) A polynucleotide in which the codons encoding the 19th amino acid proline and 20th amino acid alanine of the PelB signal sequence (SEQ ID NO: 2) were converted to rare codons CCT (proline) and GCT (alanine) in the same manner as in Example 2 An expression vector pTrcFcRm68-CG-R7 containing the polynucleotide FcRm68-CG-R7 added to the 5 ′ end side of the polynucleotide encoding FcRm68-CG prepared in Step The nucleotide sequence of Rm68-CG-R7 were analyzed. As a result of the analysis, it was confirmed that the desired sequence was obtained. The nucleotide sequence of FcRm68-CG-R7 is shown in SEQ ID NO: 39, and the amino acid sequence of the polypeptide expressed by the expression vector pTrcFcRm68-CG-R7 is shown in SEQ ID NO: 16, respectively.
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ７を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換後、実施例４と同様の方法にて培養し、Ｆｃ結合性タンパク質生産性を算出した。結果を図２に示す。 Escherichia coli W3110 was transformed with the expression vector pTrcFcRm68-CG-R7, and cultured in the same manner as in Example 4 to calculate Fc-binding protein productivity. The results are shown in FIG.
比較例６
実施例３（１）におけるプライマーを配列番号４０（５’−ＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＣＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＧＡ−３’）および配列番号４１（５’−ＴＣＣＣＡＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＡＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は実施例３と同様な方法で、ＰｅｌＢシグナル配列（配列番号２）の１９番目のアミノ酸プロリンをコードするコドンをレアコドンＣＣＴに変換したポリヌクレオチドを実施例２で作製したＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドの５’末端側に付加したポリヌクレオチドＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ８を含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ８を作製し、ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ８のヌクレオチド配列を解析した。解析の結果、所望の配列であることを確認した。ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ８のヌクレオチド配列を配列番号４２に、発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ８により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す。
Comparative Example 6
Example 3 except that the primer in Example 3 (1) was an oligonucleotide having the sequence described in SEQ ID NO: 40 (5′-CTCGCTGCCCAGCCTGCGGATGGCCATGGGA-3 ′) and SEQ ID NO: 41 (5′-TCCCCATGCCATCGCAGGCTGGGCAGCGGGAG-3 ′) 5 ′ of the polynucleotide encoding FcRm68-CG prepared in Example 2 by converting the codon encoding the 19th amino acid proline of the PelB signal sequence (SEQ ID NO: 2) into the rare codon CCT in the same manner as described above. An expression vector pTrcFcRm68-CG-R8 containing the polynucleotide FcRm68-CG-R8 added to the terminal side was prepared, and the nucleotide sequence of FcRm68-CG-R8 was analyzed. As a result of the analysis, it was confirmed that the desired sequence was obtained. The nucleotide sequence of FcRm68-CG-R8 is shown in SEQ ID NO: 42, and the amino acid sequence of the polypeptide expressed by the expression vector pTrcFcRm68-CG-R8 is shown in SEQ ID NO: 16.
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ８を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換後、実施例４と同様の方法にて培養し、Ｆｃ結合性タンパク質生産性を算出した。結果を図２に示す。 Escherichia coli W3110 was transformed with the expression vector pTrcFcRm68-CG-R8, and cultured in the same manner as in Example 4 to calculate Fc-binding protein productivity. The results are shown in FIG.
比較例７
実施例３（１）におけるプライマーを配列番号４３（５’−ＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＧＡ−３’）および配列番号４４（５’−ＴＣＣＣＡＴＧＧＣＣＡＴＡＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は実施例３と同様な方法で、ＰｅｌＢシグナル配列（配列番号２）の２０番目のアミノ酸アラニンをコードするコドンをレアコドンＧＣＴに変換したポリヌクレオチドを実施例２で作製したＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドの５’末端側に付加したポリヌクレオチドＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ９を含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ９を作製し、ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ９のヌクレオチド配列を解析した。解析の結果、所望の配列であることを確認した。ＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ９のヌクレオチド配列を配列番号４５に、発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ９により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す。
Comparative Example 7
Example 3 except that the primer in Example 3 (1) was an oligonucleotide having the sequence described in SEQ ID NO: 43 (5′-CTCGCTGCCCAGCCGGCTATGCCATGGGA-3 ′) and SEQ ID NO: 44 (5′-TCCCATGGCCATAGCCGGCTGGGCAGCGAG-3 ′) 5 ′ of the polynucleotide encoding FcRm68-CG prepared in Example 2 by converting the codon encoding the 20th amino acid alanine of the PelB signal sequence (SEQ ID NO: 2) into the rare codon GCT in the same manner as described above. An expression vector pTrcFcRm68-CG-R9 containing the polynucleotide FcRm68-CG-R9 added to the terminal side was prepared, and the nucleotide sequence of FcRm68-CG-R9 was analyzed. As a result of the analysis, it was confirmed that the desired sequence was obtained. The nucleotide sequence of FcRm68-CG-R9 is shown in SEQ ID NO: 45, and the amino acid sequence of the polypeptide expressed by the expression vector pTrcFcRm68-CG-R9 is shown in SEQ ID NO: 16.
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ９を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換後、実施例４と同様の方法にて培養し、Ｆｃ結合性タンパク質生産性を算出した。結果を図２に示す。 Escherichia coli W3110 was transformed with the expression vector pTrcFcRm68-CG-R9, and cultured in the same manner as in Example 4 to calculate Fc-binding protein productivity. The results are shown in FIG.
図２より、組換えタンパク質をペリプラズムに分泌させるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、天然型ＰｅｌＢシグナルペプチド（配列番号２）の５番目のアミノ酸ロイシンおよび６番目のアミノ酸プロリンをコードするコドン、天然型ＰｅｌＢシグナルペプチド（配列番号２）の７番目のアミノ酸スレオニンをコードするコドン、天然型ＰｅｌＢシグナルペプチド（配列番号２）の５番目のアミノ酸ロイシン、６番目のアミノ酸プロリンおよび７番目のアミノ酸スレオニンをコードするコドンを、それぞれレアコドンに変換したポリヌクレオチドを用いることで、天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドの通常のコドン（比較例１）を用いたときや、天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドの他の位置のアミノ酸をコードするコドンをレアコドンに変換したポリヌクレオチド（比較例２から７）を用いたときと比較し、前記組換えタンパク質の生産性が向上していることがわかる。 As shown in FIG. 2, as a polynucleotide encoding a signal peptide that secretes a recombinant protein into the periplasm, a codon encoding the fifth amino acid leucine and the sixth amino acid proline of the natural PelB signal peptide (SEQ ID NO: 2), natural type Codon encoding the seventh amino acid threonine of the PelB signal peptide (SEQ ID NO: 2), encoding the fifth amino acid leucine, the sixth amino acid proline and the seventh amino acid threonine of the natural PelB signal peptide (SEQ ID NO: 2) Codons encoding amino acids at other positions of the natural PelB signal peptide when using normal codons of the natural PelB signal peptide (Comparative Example 1) by using polynucleotides in which codons are converted into rare codons, respectively. Compared to when using the converted polynucleotide (Comparative Example 2 to 7) on rare codons, productivity of the recombinant protein it can be seen that improved.
実施例７ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ５ａ）発現ベクターの作製
実施例３で作製した発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ１中、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの部分を配列番号４７に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドに置換した発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲ５ａ−Ｒ１を以下のように作製した。なおＦｃＲ５ａは、配列番号４６に記載のアミノ酸配列中、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでの領域からなるＦｃ結合性タンパク質のうち、
配列番号４６の２７番目のバリンをグルタミン酸に、
配列番号４６の３５番目のチロシンをアスパラギンに、
配列番号４６の７５番目のフェニルアラニンをロイシンに
配列番号４６の９２番目のアスパラギンをセリンに、
配列番号４６の１２１番目のグルタミン酸をグリシンに、
それぞれ置換したＦｃ結合性タンパク質である（特願２０１３−２０２２４５号）。
（１）配列番号４７に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドである、配列番号４８に記載の配列からなるポリヌクレオチドを発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）に導入することで、発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ５ａ（特願２０１３−２０２２４５号）を得た。
（２）得られた発現ベクターｐＥＴ−ＦｃＲ５ａを、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩにて消化し、ベクター部分を除くことで消化産物を得た。
（３）実施例３で得たｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ−Ｒ１を予め制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩにて消化し、ベクター部分を精製したものと、（２）で作製した消化産物をライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウム（和光純薬社製）を含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、配列番号４に記載の配列からなる本発明のポリヌクレオチドをＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドの５’末端側に付加したポリヌクレオチドＦｃＲ５ａ−Ｒ１を含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲ５ａ−Ｒ１を抽出した。
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲ５ａ−Ｒ１に対し、実施例１（４）と同様な方法でヌクレオチド配列の解析を行なった結果、所望の配列であることを確認した。
Example 7 Preparation of Fc Binding Protein (FcR5a) Expression Vector In the expression vector pTrcFcRm68-CG-R1 prepared in Example 3, the portion of the polynucleotide encoding the Fc binding protein was determined from the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 47. An expression vector pTrcFcR5a-R1 substituted with a polynucleotide encoding the Fc-binding protein FcR5a was prepared as follows. FcR5a is an Fc-binding protein consisting of a region from the 17th glycine to the 192nd glutamine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46,
27th valine of SEQ ID NO: 46 is changed to glutamic acid,
Asparagine of the 35th tyrosine of SEQ ID NO: 46,
The 75th phenylalanine of SEQ ID NO: 46 is leucine and the 92nd asparagine of SEQ ID NO: 46 is serine.
Glycine is the 121st glutamic acid of SEQ ID NO: 46.
Each is a substituted Fc-binding protein (Japanese Patent Application No. 2013-202245).
(1) An expression vector pETmalE (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-206046), which is a polynucleotide encoding the Fc-binding protein FcR5a consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47 The expression vector pET-FcR5a (Japanese Patent Application No. 2013-202245) was obtained.
(2) The obtained expression vector pET-FcR5a was digested with restriction enzymes NcoI and HindIII, and the digested product was obtained by removing the vector portion.
(3) The pTrcFcRm68-CG-R1 obtained in Example 3 was previously digested with restriction enzymes NcoI and HindIII, the vector portion was purified, and the digested product prepared in (2) was ligated and used. E. coli strain W3110 was transformed.
(4) The obtained transformant is cultured in an LB medium containing 100 μg / mL of carbenicillin sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and is described in SEQ ID NO: 4 using QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by Qiagen). An expression vector pTrcFcR5a-R1 containing the polynucleotide FcR5a-R1 obtained by adding the polynucleotide of the present invention comprising the sequence to the 5 ′ end side of the polynucleotide encoding the Fc-binding protein FcR5a was extracted.
As a result of analyzing the nucleotide sequence of the expression vector pTrcFcR5a-R1 in the same manner as in Example 1 (4), it was confirmed to be a desired sequence.
実施例８ Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ５ａ）の発現
実施例７で作製した発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲ５ａ−Ｒ１を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し、得られた形質転換体を実施例４（１）から（３）と同様な方法で培養した後、実施例４（４）と同様な方法でタンパク質抽出液を調製し、実施例４（５）と同様な方法でＦｃ結合性タンパク質の濃度を測定することで、Ｆｃ結合性タンパク質の生産性を算出した（ただし、実施例４（５−３）におけるＡｎｔｉ−ＦｃγＲＩ抗体はＡｎｔｉ−ＦｃγＲＩＩＩ抗体を使用した）。結果を図３に示す。
Example 8 Expression of Fc Binding Protein (FcR5a) The expression vector pTrcFcR5a-R1 prepared in Example 7 was used to transform Escherichia coli W3110, and the resulting transformants were obtained from Examples 4 (1) to (3 ), And a protein extract is prepared by the same method as in Example 4 (4), and the concentration of Fc binding protein is measured by the same method as in Example 4 (5). The Fc-binding protein productivity was calculated (however, the Anti-FcγRIII antibody was used as the Anti-FcγRI antibody in Example 4 (5-3)). The results are shown in FIG.
比較例８ Ｆｃ結合性タンパク質の発現（その３）
実施例２で作製した天然型のＰｅｌＢシグナルペプチドを含むＦｃ結合性タンパク質発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ中、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの部分を配列番号４７に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドに置換した発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲ５ａを、実施例７と同様な方法で作製し、実施例４および８と同様な方法でＦｃ結合性タンパク質の生産性を算出した。結果を図３に示す。
Comparative Example 8 Expression of Fc-binding protein (Part 3)
In the Fc-binding protein expression vector pTrcFcRm68-CG containing the natural PelB signal peptide prepared in Example 2, the portion of the polynucleotide encoding the Fc-binding protein consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47. An expression vector pTrcFcR5a substituted with a polynucleotide encoding the protein FcR5a was prepared in the same manner as in Example 7, and the productivity of the Fc binding protein was calculated in the same manner as in Examples 4 and 8. The results are shown in FIG.
図３より、Ｆｃ結合性タンパク質を置き換えても、図２の結果と同様、組換えタンパク質をペリプラズムに分泌させるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、天然型ＰｅｌＢシグナルペプチド（配列番号２）の５番目のアミノ酸ロイシンおよび６番目のアミノ酸プロリンをコードするコドンを、それぞれレアコドンに変換したポリヌクレオチドを用いることで、天然型ＰｅｌＢシグナルペプチドの通常のコドン（比較例８）を用いたときと比較し、前記組換えタンパク質の生産性が向上していることがわかる。 As shown in FIG. 3, even when the Fc-binding protein is replaced, as in the result of FIG. 2, as the polynucleotide encoding the signal peptide that secretes the recombinant protein into the periplasm, the fifth of the natural PelB signal peptide (SEQ ID NO: 2) By using polynucleotides in which the codons encoding the amino acid leucine and the 6th amino acid proline were converted into rare codons, respectively, compared with the case where the normal codon of the natural PelB signal peptide (Comparative Example 8) was used, It can be seen that the productivity of the recombinant protein is improved.
Claims (10)
（１）５番目のアミノ酸ロイシンをコードするコドン
（２）６番目のアミノ酸プロリンをコードするコドン
（３）７番目のアミノ酸スレオニンをコードするコドン A polynucleotide encoding an oligopeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, wherein at least one of the following codons (1) to (3) is converted to a rare codon: .
(1) Codon encoding the fifth amino acid leucine (2) Codon encoding the sixth amino acid proline (3) Codon encoding the seventh amino acid threonine
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