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JP2013253079A - BIOLOGICALLY ACTIVE Fc FUSION PROTEIN OF HUMAN URINARY TRYPSIN INHIBITOR, AND PREPARATION METHOD AND APPLICATION THEREOF - Google Patents

BIOLOGICALLY ACTIVE Fc FUSION PROTEIN OF HUMAN URINARY TRYPSIN INHIBITOR, AND PREPARATION METHOD AND APPLICATION THEREOF Download PDF

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JP2013253079A
JP2013253079A JP2013102039A JP2013102039A JP2013253079A JP 2013253079 A JP2013253079 A JP 2013253079A JP 2013102039 A JP2013102039 A JP 2013102039A JP 2013102039 A JP2013102039 A JP 2013102039A JP 2013253079 A JP2013253079 A JP 2013253079A
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huti
fusion protein
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Qiang Li
李強
Naichao Sun
孫乃超
Ruoyun Zhou
周若芸
Dongdong Wu
武棟棟
Ruixian Liu
劉瑞賢
Yihui Jin
金宜慧
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XUHUA (SHANGHAI) BIOLOGICAL RESEARCH & DEVELOPMENT CENTER CO Ltd
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XUHUA (SHANGHAI) BIOLOGICAL RESEARCH & DEVELOPMENT CENTER CO Ltd
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a recombinant Fc fusion protein of a human urinary trypsin inhibitor, the protein having biological activity similar with that of the human urinary trypsin inhibitor (hUTI).SOLUTION: There is provided: a recombinant hUTI-L-Fc fusion protein, comprising hUTI, about 20 or less flexible peptide linkers, and human IgG Fc or its variant (vFc); and a preparation method of the fusion protein with high expression level. The Fc variant of IgG is preferably insoluble and shows side effects mediated by minimum unwanted Fc. The recombinant hUTI-L-Fc fusion protein has sufficient biological activity and/or an extended or elongated half-life period in serum. Thus improved pharmacokinetics and/or pharmacodynamics are/is provided, thereby using different or smaller dosage amount and/or achieving better or different therapeutic efficacy.

Description

背景
ウリナスタチンまたはビクニンとも呼ばれるヒト尿中トリプシンインヒビター(ヒトUTIまたはhUTI)は、2つのKunitz型プロテアーゼインヒビタードメインを含むグリコシル化タンパク質である。ヒトUTIはヒト尿中および血中に見られ、分子量は約40キロダルトン(kD)である。ヒトUTIは、トリプシン、α−キモトリプシン、プラスミン、カテプシンGおよび白血球エラスターゼを含むセリンプロテアーゼの活性に対する阻害効果などの、多くの生理的作用を有することが知られている。ヒトUTIは、また、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、インターロイキン−1(IL−1)およびインターロイキン−6(IL−6)などの炎症誘発性サイトカインの放出をダウンレギュレーションすることで免疫調節効果を示す(例えば、Park, et al. J. Korean Med. Sci., 25: 128-34, 2010; Sato et al. Jpn. J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 48: 428-34, 2000; Park et al. Korean J. Anesthesiol., 58:334-337, 2010参照)。さらに、hUTIは、PDGF−Dの活性二量体(PDGF−DD)/PDGF−bbRにより媒介されるシグナル伝達を中和することによって悪性中皮腫細胞の遊走を抑制し、そして、癌細胞の増殖を阻害しそしてCXCL4およびMMP−9の発現をダウンレギュレーションすることによって乳癌異種移植ヌードマウスモデルにおける乳腺腫瘍を有意に減少させ(例えば、Yaguchi et al. Cancer Lett 288: 214-218, 2010; Sun et al. J. Int. Med. Res. 38: 967-976, 2010参照)、このことは癌療法におけるhUTIの可能性ある役割を示唆する。
Background Human urinary trypsin inhibitor (human UTI or hUTI), also called urinastatin or bikunin, is a glycosylated protein that contains two Kunitz-type protease inhibitor domains. Human UTI is found in human urine and blood and has a molecular weight of about 40 kilodaltons (kD). Human UTI is known to have many physiological actions, such as an inhibitory effect on the activity of serine proteases including trypsin, α-chymotrypsin, plasmin, cathepsin G and leukocyte elastase. Human UTI also immunizes by down-regulating the release of pro-inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin-1 (IL-1) and interleukin-6 (IL-6). Show regulatory effects (eg Park, et al. J. Korean Med. Sci., 25: 128-34, 2010; Sato et al. Jpn. J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 48: 428-34, 2000 Park et al. Korean J. Anesthesiol., 58: 334-337, 2010). Furthermore, hUTI inhibits malignant mesothelioma cell migration by neutralizing PDGF-D active dimer (PDGF-DD) / PDGF-bbR mediated signaling and Significantly reduced mammary tumors in breast cancer xenograft nude mouse models by inhibiting proliferation and down-regulating CXCL4 and MMP-9 expression (eg, Yaguchi et al. Cancer Lett 288: 214-218, 2010; Sun et al. J. Int. Med. Res. 38: 967-976, 2010), suggesting a possible role of hUTI in cancer therapy.

さらに、hUTIは、種々の組織上でのトリプシンのタンパク質分解作用を抑制するように作用し、そして局所的な抗炎症作用を奏功することが示されている。リスクの高い患者における全身麻酔の症例において使用する場合、hUTIの静脈内注入は、多くの臓器に対する灌流を改善し、そして炎症応答を減少させることができる。それ故、hUTIは、急性膵炎、全身性炎症反応症候群、循環機能不全、播種性血管内凝固(DIC)および多臓器不全を含む、急性炎症性疾患に対して適応される(例えば、Jong In Han, Korean J. Anesthesiol., 58: 325-327, 2010参照)。   Furthermore, hUTI has been shown to act to suppress the proteolytic action of trypsin on various tissues and to exert local anti-inflammatory effects. When used in cases of general anesthesia in high-risk patients, intravenous infusion of hUTI can improve perfusion to many organs and reduce the inflammatory response. Therefore, hUTI is indicated for acute inflammatory diseases including acute pancreatitis, systemic inflammatory response syndrome, circulatory dysfunction, disseminated intravascular coagulation (DIC) and multiple organ failure (eg, Jong In Han , Korean J. Anesthesiol., 58: 325-327, 2010).

動物モデルの研究においては、hUTIは、エンドトキシン誘発性ショック並びに肝虚血再灌流障害に対して防御作用を有することが報告されている(例えば、Inoue et al. Expert Opin. Investig. Drugs, 19:513-20, 2010; Wu et al. Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., 8:53-58, 2009参照)。臨床研究においては、hUTIとチモシンα−1との組合せ使用により、重度の敗血症患者の生存率が増加した(例えば、Li et al. J. Intensive Care Med., 24:47-53, 2009参照)。別の臨床研究においては、hUTIは、SARSウイルスによって誘発された急性肺損傷(ALI)または急性呼吸促迫症候群(ARDS)を処置するのに効果的であることが示された(例えば、US Patent No. 7,470,666参照)。   In animal model studies, hUTI has been reported to have protective effects against endotoxin-induced shock as well as hepatic ischemia-reperfusion injury (eg, Inoue et al. Expert Opin. Investig. Drugs, 19: 513-20, 2010; Wu et al. Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., 8: 53-58, 2009). In clinical studies, the combined use of hUTI and thymosin alpha-1 increased the survival of patients with severe sepsis (see, eg, Li et al. J. Intensive Care Med., 24: 47-53, 2009) . In another clinical study, hUTI has been shown to be effective in treating acute lung injury (ALI) or acute respiratory distress syndrome (ARDS) induced by SARS virus (eg, US Patent No. 7,470,666).

ヒトの尿から精製されたhUTIに対する商標名である「Miraclid」は、1985年に日本の持田製薬によって初めて市販された。「Miraclid」は、急性膵炎およびショックによって引き起こされる急性循環不全の処置に対する薬物として臨床効力を実証した。他の類似した製品が、Techpool Biopharma、中国(「注射用ウリナスタチン」)、Han Lim Pharmaceutical、韓国(ウリスチン(Ulistin))、Kolon Pharmaceutical、韓国(ウスタチン(Ustatin))およびYu Young Pharmaceutical、韓国(スタチン(Statin))によって製造されている。日本および中国においては、hUTIは、急性膵炎、播種性血管内凝固(DIC)およびショック、例えば出血性ショック、敗血症ショック、外傷性ショックおよび熱傷ショックの処置のための薬物として広く使用されている。   The trade name “miraclide” for hUTI purified from human urine was first marketed in 1985 by Mochida Pharmaceutical, Japan. “Miracrid” has demonstrated clinical efficacy as a drug for the treatment of acute pancreatitis and acute circulatory failure caused by shock. Other similar products are Techpool Biopharma, China (“Urinastatin for Injection”), Han Lim Pharmaceutical, Korea (Ulistin), Kolon Pharmaceutical, Korea (Ustatin) and Yu Young Pharmaceutical, Korea (statin ( Statin)). In Japan and China, hUTI is widely used as a drug for the treatment of acute pancreatitis, disseminated intravascular coagulation (DIC) and shocks such as hemorrhagic shock, septic shock, traumatic shock and burn shock.

市場におけるhUTIの製薬等級の製品は、ヒトの尿から精製される。この出発物質の供給は予測不可能であり得、そしてヒト病原体による可能性ある汚染は危険である。組換えDNA技術の使用により、rhUTIが酵母において産生され、そして精製された物質は、in vitroにおいてトリプシン阻害活性を有することが示された。酵母における組換えhUTIタンパク質の発現は、55mg/Lという低いレベルであると報告されている(例えば、Jian-qiu Wang et al, Protein Expr. Purif.,60:127-31, 2008; USPatent No. 5,407,915参照)。さらに、酵母細胞において産生された組換えタンパク質は、異なる翻訳後修飾を受ける傾向があり、これによりin vivoにおける潜在的に減少した効力および/または治療タンパク質に対する免疫応答をトリガーするなどの望ましくない副作用がもたらされる。従って、酵母に由来するrhUTIタンパク質は、生物学的治療薬のための良好な候補ではないだろう(Brooks SA, Mol. Biotechnol., 28:241-55, 2004)。   HUTI pharmaceutical grade products on the market are purified from human urine. This supply of starting material can be unpredictable and possible contamination by human pathogens is dangerous. Through the use of recombinant DNA technology, rhUTI was produced in yeast and the purified material was shown to have trypsin inhibitory activity in vitro. Recombinant hUTI protein expression in yeast has been reported to be as low as 55 mg / L (see, eg, Jian-qiu Wang et al, Protein Expr. Purif., 60: 127-31, 2008; US Patent No. 5,407,915). In addition, recombinant proteins produced in yeast cells tend to undergo different post-translational modifications, thereby undesired side effects such as triggering potentially reduced potency and / or immune responses to therapeutic proteins in vivo. Is brought about. Therefore, rhUTI protein derived from yeast may not be a good candidate for biological therapeutics (Brooks SA, Mol. Biotechnol., 28: 241-55, 2004).

複雑な翻訳後修飾を行なえるということが、大半の生物学的治療薬が哺乳動物の細胞培養液において製造される主な理由である。実際に、アルブミン(Recombumin(登録商標)、Novozymes Biopharmaによって製造)および速効型インスリンアナログ(Humalog(登録商標)、Eli Lillyによって製造)などのほんのわずかなバイオ医薬品タンパク質が簡単な修飾を受けるので、それらを酵母を使用して製造することができる。一般に、哺乳動物細胞において産生された組換えタンパク質は十分に折り畳まれそして適切にグリコシル化されている。しかしながら、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞におけるrhUTIの発現は、細胞培養液中において広範なタンパク質凝集物を生じることが報告され、結果として活性の低下につながる。タンパク質凝集物は、非天然のジスルフィド結合を通して共有結合的に架橋していることが示された(例えば、Seefeldt MB et al. Protein Sci., 13:2639-50, 2004参照)。   The ability to make complex post-translational modifications is a major reason that most biotherapeutic agents are produced in mammalian cell cultures. In fact, only a few biopharmaceutical proteins such as albumin (Recombumin®, manufactured by Novozymes Biopharma) and fast-acting insulin analogues (Humalog®, manufactured by Eli Lilly) are subject to simple modifications Can be produced using yeast. In general, recombinant proteins produced in mammalian cells are fully folded and appropriately glycosylated. However, rhUTI expression in Chinese hamster ovary (CHO) cells has been reported to produce extensive protein aggregates in cell culture, resulting in reduced activity. Protein aggregates have been shown to be covalently crosslinked through non-natural disulfide bonds (see, eg, Seefeldt MB et al. Protein Sci., 13: 2639-50, 2004).

健康な志願者においては、注射から0から3時間後までの間の静注(i.v.)hUTIの血漿中半減期は約33分間であり、注射されたhUTIの約90%の消失を占める。その後の4時間の間に、よりゆっくりとした第2相が観察され、半減期は約2時間であった。注射から7時間後、遊離hUTIの僅か1%しか血漿中に留まらなかった(例えば、Jonsson-Berling et al. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 51:549-57, 1991参照)。ラットにおける臓器組織分布研究は、腎臓がhUTIの分解および排泄のための主要な部位であることを示した。さらに、免疫組織化学的技術を使用した、正常および悪性のヒト組織におけるhUTIの分布および局在は、腎臓の近位尿細管におけるhUTIを見出した(例えば、Yoshida et al. Cancer, 64:860-9, 1989参照)。   In healthy volunteers, the plasma half-life of intravenous (iv) hUTI between 0 and 3 hours after injection is about 33 minutes, indicating about 90% loss of injected hUTI. Occupy. During the subsequent 4 hours, a slower second phase was observed with a half-life of about 2 hours. Seven hours after injection, only 1% of free hUTI remained in the plasma (see, eg, Jonsson-Berling et al. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 51: 549-57, 1991). Organ tissue distribution studies in rats have shown that the kidney is the primary site for hUTI degradation and excretion. Furthermore, the distribution and localization of hUTI in normal and malignant human tissues using immunohistochemical techniques found hUTI in the proximal tubule of the kidney (see, eg, Yoshida et al. Cancer, 64: 860- 9, 1989).

hUTIのクリアランスに関与する詳細な機序は依然として不明であるが、腎臓が、hUTI異化の主要な部位であるようである。循環中のhUTIの半減期を延長するために、hUTIの分子量を増加させることにより、腎臓を通しての排出を減速させることができる。このようなアプローチは長時間作用型医薬品の設計においてとられており、例えばEPOに余分なN−グリコシル化部位を付加(Aranesp(登録商標)、Amgenによって製造)、またはG−CSFにPEG分子を付加(Neulasta(登録商標)、Amgenによって製造)などがある。hUTIのC末端にヒトIgG Fcまたはその変異体を付加することによって、得られたUTI−Fc分子はより大きな分子量を有するだけでなく、血漿中のヒトIgG Fcに関するより長い半減期を示すだろう。   Although the detailed mechanism involved in hUTI clearance remains unclear, the kidney appears to be a major site of hUTI catabolism. In order to prolong the half-life of hUTI in the circulation, the excretion through the kidney can be slowed by increasing the molecular weight of hUTI. Such an approach has been taken in the design of long acting drugs, for example adding extra N-glycosylation sites to EPO (Aranesp®, manufactured by Amgen) or adding PEG molecules to G-CSF. Addition (Neulasta®, manufactured by Amgen) and the like. By adding human IgG Fc or a variant thereof to the C-terminus of hUTI, the resulting UTI-Fc molecule will not only have a higher molecular weight, but will also exhibit a longer half-life for human IgG Fc in plasma .

IgGクラスの免疫グロブリンは、ヒト血液中において最も豊富なタンパク質の1つである。その循環半減期は21日間もの長さに達し得る。融合タンパク質は、IgGのFc領域を、別のタンパク質のドメイン(例えば種々のサイトカインおよび可溶性レセプター)と組み合わせると報告されている(例えば、Capon et al., Nature, 337:525-531, 1989; Chamow et al., Trends Biotechnol.,14:52-60, 1996); U.S. Pat. Nos. 5,116,964および5,541,087参照)。融合タンパク質の原型は、IgG Fcのヒンジ領域におけるシステイン残基を通して連結されたホモダイマータンパク質であり、その結果として、CH1ドメインおよび軽鎖を含まないIgG分子に類似した分子が得られる。構造的相同性に因り、Fc融合タンパク質は、in vivoにおいて、類似のアイソタイプを有するヒトIgGと同等な薬物動態プロファイルを示す。このアプローチは、いくつかの治療的に重要なサイトカイン、例えばEPO、G−CSF、および可溶性レセプター、例えばTNF−RcおよびIL−5−Rcに適用されている(例えば、US Patent Nos., 5,349,053および7,232,668参照)。それ故、本発明において開示または記載したようなヒトIgG(IgG1、IgG2、IgG4)タンパク質のFc部分に連結されたhUTIを含む融合タンパク質を製造することによって、hUTIの循環半減期を延ばすもしくは改変するおよび/またはその生物学的活性を増加/改変することが望ましい。また、異なるおよび/またはより望ましい臨床特性および/または薬学的特性を示す、hUTIに代わるこのような製品を生産することが望ましくそして本発明の一部である。   The IgG class of immunoglobulins is one of the most abundant proteins in human blood. Its circulating half-life can reach as long as 21 days. Fusion proteins have been reported to combine the Fc region of IgG with other protein domains (eg, various cytokines and soluble receptors) (eg, Capon et al., Nature, 337: 525-531, 1989; Chamow et al., Trends Biotechnol., 14: 52-60, 1996); US Pat. Nos. 5,116,964 and 5,541,087). The prototype of the fusion protein is a homodimeric protein linked through a cysteine residue in the hinge region of IgG Fc, resulting in a molecule similar to an IgG molecule that does not contain a CH1 domain and light chain. Due to structural homology, Fc fusion proteins exhibit a pharmacokinetic profile equivalent to human IgG with similar isotypes in vivo. This approach has been applied to several therapeutically important cytokines such as EPO, G-CSF, and soluble receptors such as TNF-Rc and IL-5-Rc (see, eg, US Patent Nos., 5,349,053 and 7,232,668). Therefore, prolonging or altering the hUTI circulating half-life by producing a fusion protein comprising hUTI linked to the Fc portion of a human IgG (IgG1, IgG2, IgG4) protein as disclosed or described in the present invention It may be desirable to increase / modify and / or its biological activity. It is also desirable and part of the present invention to produce such an alternative to hUTI that exhibits different and / or more desirable clinical and / or pharmaceutical properties.

さらに、大半の報告されているFc融合タンパク質分子において、ヒンジ領域が、Fc領域とアミノ末端のサイトカインまたは可溶性レセプターとの間のスペーサーとして作用し、よって分子のこれらの2つの部分が別々に機能することを可能とする(例えば、Ashkenazi et al., Current Opinion in Immunology,9:195-200, 1997参照)。それ故、このようなスペーサーとして作用する適切なリンカーを有することが望ましくそして本発明の一部であり、これにより両方のUTIドメインが、セリンプロテアーゼと独立して相互作用することができる。   Furthermore, in most reported Fc fusion protein molecules, the hinge region acts as a spacer between the Fc region and the amino-terminal cytokine or soluble receptor, so that these two parts of the molecule function separately (See, for example, Ashkenazi et al., Current Opinion in Immunology, 9: 195-200, 1997). It is therefore desirable to have a suitable linker that acts as such a spacer and is part of the present invention so that both UTI domains can interact independently with a serine protease.

ヒト免疫グロブリンのFc領域は、病原体の排除のための免疫防御において重要な役割を果たす。IgGのエフェクター機能は、2つの主要な機序を通してFc領域によって媒介される:(1)細胞表面Fcレセプター(FcγRs)への結合により、食作用による病原体の摂取または抗体依存性細胞傷害(ADCC)経路を介したキラー細胞による溶解が起こり得るか、あるいは(2)第1補体成分C1のC1q部分への結合により、補体依存性細胞傷害(CDC)経路が開始され、病原体の溶解が起こる。4つのヒトIgGアイソタイプの中で、IgG1およびIgG3が、FcγRへの結合において効果的である。FcγRへのIgG4の結合親和性は、IgG1またはIgG3よりも約1ケタ低く、一方、FcγRへのIgG2の結合は検出未満である。ヒトIgG1およびIgG3は、また、C1qへの結合および補体カスケードの活性化においても効果的である。ヒトIgG2は補体と弱くしか結合せず、そしてIgG4は、補体カスケードを活性化する能力が極めて不十分であるようである(例えば、Jefferis et al., Immunol. Rev., 163:59-76, 1998参照)。治療使用においては、hUTI−L−Fcが種々のプロテアーゼに結合する場合、融合タンパク質のFc領域が、細胞表面に結合したプロテアーゼを有する細胞の溶解または除去を引き起こすエフェクター機能を媒介するかまたはしないかは決定的または重要ではないだろう。従って、ここで開示した本発明から、hUTI−FcのFc領域は、天然IgG Fcまたは非溶解性のFc変異体であり得ることが明らかである。上で考察したように、天然IgG Fcは、種々のレベルのエフェクター機能を媒介する。これに対し、非溶解性のFcは、エフェクター機能をトリガーするためのFcγRsおよびC1qへの結合に関して不活性である。非溶解性Fcを得るためには、天然Fc領域の特定のアミノ酸を、エフェクター機能の減弱化のために突然変異させなければならない。   The Fc region of human immunoglobulin plays an important role in immune defense for the elimination of pathogens. The effector functions of IgG are mediated by the Fc region through two major mechanisms: (1) phagocytosis of pathogen uptake or antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) by binding to cell surface Fc receptors (FcγRs) Lysis by killer cells can occur via the pathway, or (2) binding of the first complement component C1 to the C1q moiety initiates the complement dependent cytotoxicity (CDC) pathway and pathogen lysis occurs . Of the four human IgG isotypes, IgG1 and IgG3 are effective in binding to FcγR. The binding affinity of IgG4 to FcγR is about an order of magnitude lower than IgG1 or IgG3, while IgG2 binding to FcγR is less than detection. Human IgG1 and IgG3 are also effective in binding to C1q and activating the complement cascade. Human IgG2 binds only weakly to complement, and IgG4 appears to be very poorly capable of activating the complement cascade (eg Jefferis et al., Immunol. Rev., 163: 59- 76, 1998). In therapeutic use, if hUTI-L-Fc binds to various proteases, whether the Fc region of the fusion protein mediates or does not mediate an effector function that causes lysis or removal of cells with protease bound to the cell surface Will not be definitive or important. Thus, it is clear from the invention disclosed herein that the FUT region of hUTI-Fc can be a native IgG Fc or an insoluble Fc variant. As discussed above, native IgG Fc mediates various levels of effector function. In contrast, non-soluble Fc is inactive with respect to binding to FcγRs and C1q to trigger effector function. In order to obtain non-soluble Fc, certain amino acids in the native Fc region must be mutated to attenuate effector function.

ヒトおよびマウスのIgGアイソタイプのアミノ酸配列を比較することによって、CH2ドメインのN末端近くのFc部分が、IgG FcのFcγRsへの結合において役割を果たすことに関与している。234位から237位のモチーフの重要性が、遺伝子工学された抗体を使用して実証された(例えば、Duncan et al., Nature, 332:563-564, 1988参照)。アミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, United States Department of Health and Human Services, 1991)に記載のEUインデックスに従う。4つのヒトIgGアイソタイプの中で、IgG1およびIgG3がFcγRsに最も良く結合し、そしてLeu234−Leu−Gly−Gly237の配列を共有する(IgG3は図1に示されていない)。より低い親和性でFcγRsに結合するIgG4においては、この配列は1つのアミノ酸置換、すなわち234位のLeuに対してPheを含む。FcγRsに結合しないIgG2においては、2つの置換と1つの欠失があり、Val234−Ala−Gly237となる(図1)。FcγRへのFcの結合を最小限にし、従ってADCC活性を最小限にするために、IgG4におけるLeu235をAlaによって置換した(例えば、Hutchins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11980-11984, 1995参照)。IgG1は、このモチーフにおいて、IgG2からの配列であるPro233−Val−Ala235を用いてGlu233−Leu−Leu235を置換することによって改変された。この置換により、マウスにおいてターゲット細胞を枯渇させるFcγRにより媒介される能力を欠失したIgG1変異体が得られた(例えば、Isaacs et al., J. Immunol., 161:3862-3869, 1998参照)。   By comparing the amino acid sequences of the human and mouse IgG isotypes, the Fc portion near the N-terminus of the CH2 domain is involved in playing a role in the binding of IgG Fc to FcγRs. The importance of the motifs at positions 234 to 237 has been demonstrated using genetically engineered antibodies (see, eg, Duncan et al., Nature, 332: 563-564, 1988). The numbering of amino acid residues follows the EU index described in Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, United States Department of Health and Human Services, 1991). Of the four human IgG isotypes, IgG1 and IgG3 bind best to FcγRs and share the sequence of Leu234-Leu-Gly-Gly237 (IgG3 is not shown in FIG. 1). In IgG4, which binds FcγRs with lower affinity, this sequence contains a single amino acid substitution, namely Phe for Leu at position 234. In IgG2, which does not bind to FcγRs, there are two substitutions and one deletion, resulting in Val234-Ala-Gly237 (FIG. 1). In order to minimize Fc binding to FcγR and thus minimize ADCC activity, Leu235 in IgG4 was replaced by Ala (eg, Hutchins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11980-11984, 1995). IgG1 was modified in this motif by replacing Glu233-Leu-Leu235 with Pro233-Val-Ala235, a sequence from IgG2. This substitution resulted in an IgG1 mutant that lacked the ability mediated by FcγR to deplete target cells in mice (see, eg, Isaacs et al., J. Immunol., 161: 3862-3869, 1998). .

FcγRおよびC1qへの両方の結合に重要であると思われる第2の部分は、ヒトIgGのCH2ドメインのカルボキシ末端近くに位置している(例えば、Duncan et al., Nature,332:738-740, 1988参照)。4つのヒトIgGアイソタイプの中で、この部分内で置換を示すのはただ2つのアミノ酸残基のみである:IgG4におけるSer330およびSer331は、IgG1、IgG2およびIgG3に存在するAla330およびPro331に置き換わっている(図1)。Ser330の存在は、FcγRまたはC1qへの結合に影響を及ぼさない。IgG1におけるPro331をSerによって置換すると、IgG1がC1qに結合する能力は実質的に消失し、一方、Ser331をProによって置換すると、IgG4の補体結合活性は部分的に回復した(例えば、Tao et al., J. Exp. Med.,178:661-667, 1993; Xu et al., J. Biol. Chem., 269:3469-3474, 1994参照)。   A second portion that appears to be important for binding to both FcγR and C1q is located near the carboxy terminus of the CH2 domain of human IgG (see, eg, Duncan et al., Nature, 332: 738-740). , 1988). Of the four human IgG isotypes, only two amino acid residues show substitution within this part: Ser330 and Ser331 in IgG4 are replaced by Ala330 and Pro331 present in IgG1, IgG2 and IgG3 (FIG. 1). The presence of Ser330 does not affect binding to FcγR or C1q. Replacing Pro331 in IgG1 with Ser substantially abolished the ability of IgG1 to bind to C1q, while replacing Ser331 with Pro partially restored the complement binding activity of IgG4 (eg, Tao et al. , J. Exp. Med., 178: 661-667, 1993; Xu et al., J. Biol. Chem., 269: 3469-3474, 1994).

本発明者らは、天然ヒトIgG Fcの他に、少なくとも3つの他のFc変異体(vFc)を、本発明のhUTI−Fc融合タンパク質の産生のために設計および/または使用することができることを発見した(図1)。ヒトIgG2 FcはFcγRに結合しないが、弱い補体活性を示す。Pro331Ser突然変異を有するFcγ2変異体は、天然Fcγ2よりも低い補体活性を有するはずであるが、依然としてFcγRへは結合しない。IgG4 Fcは補体カスケードの活性化において不十分であり、そしてFcγRへの結合親和性は、最も活性なアイソタイプであるIgG1よりも約1ケタ低い。Ser228ProおよびLeu235Ala突然変異を有するFcγ4変異体は、天然Fcγ4と比較して最小のエフェクター機能を示すはずである。Leu234Val、Leu235AlaおよびPro331Ser突然変異を有するFcγ1変異体もまた、天然Fcγ1よりもはるかに低いエフェクター機能を示す。本発明者らは、また、これらのFc変異体、並びにヒトIgG(IgG1、IgG2、IgG4)からの天然Fcは全て、hUTI−Fc融合タンパク質の調製に適していることを発見する。循環半減期を損なうことなく、または望ましくないコンフォメーション変化を全く引き起こすことなく、非溶解性Fcまたは天然Fcの調製のために他の置換を導入し得ることも可能である。   In addition to the native human IgG Fc, the inventors have noted that at least three other Fc variants (vFc) can be designed and / or used for the production of the hUTI-Fc fusion proteins of the invention. I found it (Figure 1). Human IgG2 Fc does not bind to FcγR, but exhibits weak complement activity. Fcγ2 variants with the Pro331Ser mutation should have lower complement activity than native Fcγ2, but still do not bind to FcγR. IgG4 Fc is deficient in activation of the complement cascade, and its binding affinity to FcγR is about one order of magnitude less than IgG1, the most active isotype. Fcγ4 variants with Ser228Pro and Leu235Ala mutations should show minimal effector function compared to native Fcγ4. Fcγ1 mutants with Leu234Val, Leu235Ala and Pro331Ser mutations also show much lower effector function than native Fcγ1. We also find that these Fc variants, as well as native Fc from human IgG (IgG1, IgG2, IgG4) are all suitable for the preparation of hUTI-Fc fusion proteins. It is also possible to introduce other substitutions for the preparation of non-soluble Fc or native Fc without compromising the circulation half-life or causing any undesirable conformational changes.

本発明において、hUTIの組換え融合タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株から誘導された細胞株によって産生される。rhUTI−Fc融合タンパク質は、類似の宿主細胞を使用してrhUTIの細胞培養液中に存在すると報告されたタンパク質凝集物を含むことなく、細胞培養液から容易に精製される(例えば、Seefeldt MB et al. Protein Sci., 13:2639-50, 2004参照)。in vitroにおける生物学的活性に関してhUTIと比較した場合、hUTIとFc部分との間に適切なペプチドリンカーを有するhUTI融合タンパク質(hUTI−L−Fc)は、モル基準でhUTIと同等な活性を保持する。これらの分子のFc部分は、長時間の血清中半減期を示すことが知られているので、この長時間作用型の医薬品の投与頻度計画を減少させることができ、より良好に管理することができ、そして/またはより望ましい血清中レベルが維持される。   In the present invention, a hUTI recombinant fusion protein is produced by a cell line derived from a Chinese hamster ovary (CHO) cell line. rhUTI-Fc fusion proteins are readily purified from cell cultures using similar host cells without the inclusion of protein aggregates reported to be present in rhUTI cell cultures (see, eg, Seefeldt MB et al. al. Protein Sci., 13: 2639-50, 2004). hUTI fusion protein (hUTI-L-Fc) with an appropriate peptide linker between hUTI and Fc portion retains activity equivalent to hUTI on a molar basis when compared to hUTI for biological activity in vitro To do. The Fc portion of these molecules is known to exhibit a long serum half-life, which can reduce the frequency of administration of this long-acting drug and can be better managed. And / or more desirable serum levels are maintained.

本発明には多くの利点があり、これは、以下に開示および考察したように、特に当業者には明らかであろう。哺乳動物細胞培養液におけるrhUTIと比較して、rhUTI−L−Fcのより簡単な精製プロトコールおよびより高い産生収率は、製造コストを実質的に低下させることができる。血清中におけるhUTI−L−Fc融合タンパク質の異なるおよび/または高い活性並びに異なるおよび/または延長された存在は、異なるまたは低い投与量、並びに異なるまたはより低頻度の注射をもたらし得る。血清中の薬物濃度の変動がより少ないことは、また、改善された安全性および耐容性を意味する。それ故、非溶解性Fc変異体または天然Fcを含むhUTI−L−Fc融合タンパク質は、急性膵炎、播種性血管内凝固(DIC)およびショックに関連した種々の容態の管理に有意に貢献する。   The present invention has many advantages, which will be particularly apparent to those skilled in the art, as disclosed and discussed below. Compared to rhUTI in mammalian cell culture, a simpler purification protocol and higher production yield of rhUTI-L-Fc can substantially reduce manufacturing costs. Different and / or higher activity and different and / or prolonged presence of hUTI-L-Fc fusion proteins in serum can result in different or lower doses, as well as different or less frequent injections. Less variation in serum drug concentration also means improved safety and tolerability. Therefore, hUTI-L-Fc fusion proteins comprising non-soluble Fc variants or native Fc contribute significantly to the management of various conditions associated with acute pancreatitis, disseminated intravascular coagulation (DIC) and shock.

発明の要約
本発明の1つの局面は、hUTI−L−Fc融合タンパク質に関する。このhUTI−L−Fc融合タンパク質は、hUTI、ペプチドリンカー(Lによって示す)およびヒト天然FcまたはIgG Fc変異体(両方共にFcによって示す)を含む。長さが約20以下、より好ましくは約2〜20アミノ酸の可動性ペプチドリンカーを使用することが好ましく、そして前記可動性ペプチドリンカーは、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択された2つ以上のアミノ酸を含む。IgG Fc変異体は非溶解性であり、そして天然IgG Fcと比較してアミノ酸の突然変異を含む。
Summary of the Invention One aspect of the present invention relates to hUTI-L-Fc fusion proteins. This hUTI-L-Fc fusion protein comprises hUTI, a peptide linker (indicated by L) and a human natural Fc or IgG Fc variant (both indicated by Fc). It is preferred to use a mobile peptide linker having a length of about 20 or less, more preferably about 2-20 amino acids, and the mobile peptide linker is selected from the group consisting of glycine, serine, alanine and threonine. Contains one or more amino acids. IgG Fc variants are non-soluble and contain amino acid mutations compared to native IgG Fc.

本発明の別の態様は、ヒトIg Fcが、ヒトIgG1、IgG2およびIgG4などのヒトIgGのヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含むことである。好ましくは、CH2ドメインは、228位、234位、235位および331位(EUナンバリングシステムによって定義)においてアミノ酸の突然変異を含む。これらのアミノ酸の突然変異は、Fcのエフェクター機能を減弱するように作用すると考えられる。   Another aspect of the invention is that the human Ig Fc comprises the hinge, CH2 and CH3 domains of human IgG, such as human IgG1, IgG2 and IgG4. Preferably, the CH2 domain comprises amino acid mutations at positions 228, 234, 235 and 331 (defined by the EU numbering system). These amino acid mutations are thought to act to attenuate the effector function of Fc.

本発明のさらに別の態様において、CHOに由来する細胞株などの哺乳動物細胞株からこのような組換え融合タンパク質を製造または産生するための方法を開示する。トランスフェクションされた細胞株を、組換え融合タンパク質が24時間の期間中に100万個の細胞あたり50μg、好ましくは100μgを超える量でその増殖培地に発現および分泌される条件下で増殖させる。これらのrhUTI−L−Fc融合タンパク質は、rhUTIと比べて、モル基準で、in vitroにおける高い生物学的活性、および望ましくない副作用を伴うことなく延長された血清中半減期によって特徴付けられそしてこれを示し、これにより改善された薬物動態および薬力学がもたらされ、従って、類似の効力を達成するためにより少ない投与量およびより少ない注射回数が必要となる。   In yet another aspect of the invention, methods for producing or producing such recombinant fusion proteins from mammalian cell lines, such as cell lines derived from CHO, are disclosed. The transfected cell line is grown under conditions where the recombinant fusion protein is expressed and secreted into the growth medium in an amount of 50 μg per million cells, preferably over 100 μg, over a 24 hour period. These rhUTI-L-Fc fusion proteins are characterized by a high biological activity in vitro and an extended serum half-life without undesirable side effects, on a molar basis, compared to rhUTI. This results in improved pharmacokinetics and pharmacodynamics, thus requiring lower doses and fewer injections to achieve similar efficacy.

本発明のさらなる態様は、hUTI、可動性ペプチドリンカーおよびヒトIgG Fc(変異体形および天然形からなる群より選択される)を含む組換え融合タンパク質を製造するための方法を提供し、前記方法は、(a)CHOに由来する細胞株を生成する工程;(b)組換え融合タンパク質が、24時間の期間中に100万(10)個の細胞あたり50μg、好ましくは100μgを超える量でその増殖培地に発現および分泌される条件下で細胞株を増殖させる工程;そして(c)工程b)からの発現タンパク質を精製する工程を含み、組換え融合タンパク質は、モル基準で、hUTIと類似した、同じくらい高い、またはより高い生物学的活性によって特徴付けられそしてこれを示す。この場合、好ましくは、約20個以下、しかし好ましくは2個より少なくはなく、より好ましくは20から2個であるアミノ酸を含む可動性ペプチドリンカーが、hUTIとヒトIgG Fc(変異形および天然形からなる群より選択される)との間に存在し;そして可動性ペプチドリンカーは、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択された2つ以上のアミノ酸を含み;そしてヒトIgG Fc(天然形または変異形のいずれか)は、ヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む。Fcの変異形は、Pro331Ser突然変異を含むヒトIgG2、Ser228ProおよびLeu235Ala突然変異を含むヒトIgG4、並びにLeu234Val、Leu235AlaおよびPro331Ser突然変異を含むヒトIgG1からなる群より選択される。 A further aspect of the invention provides a method for producing a recombinant fusion protein comprising hUTI, a mobile peptide linker and a human IgG Fc (selected from the group consisting of variant and native forms), said method comprising: (A) generating a cell line derived from CHO; (b) the recombinant fusion protein in an amount of 50 μg per million (10 6 ) cells, preferably greater than 100 μg, over a 24 hour period. Growing the cell line under conditions expressed and secreted into the growth medium; and (c) purifying the expressed protein from step b), wherein the recombinant fusion protein is similar to hUTI on a molar basis. Characterized by and indicating as much higher or higher biological activity. In this case, preferably a mobile peptide linker comprising no more than about 20, but preferably no less than 2, more preferably 20 to 2, amino acids is a hUTI and human IgG Fc (mutated and native forms). And the mobile peptide linker comprises two or more amino acids selected from the group consisting of glycine, serine, alanine and threonine; and human IgG Fc (naturally occurring) Either form or variant) comprises a hinge domain, a CH2 domain and a CH3 domain. The variant of Fc is selected from the group consisting of human IgG2, including the Pro331Ser mutation, human IgG4, including the Ser228Pro and Leu235Ala mutations, and human IgG1, including the Leu234Val, Leu235Ala, and Pro331Ser mutations.

図1は、ヒトIgG1、IgG2、IgG4およびその変異体のヒンジ領域およびCH2領域のアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸228位、234〜237位および330〜331位という3つの部分を比較する。変異体のアミノ酸の突然変異を太字のイタリック体で示す。アミノ酸残基についてはEUナンバリングシステムを使用する。FIG. 1 shows the amino acid sequence alignment of the hinge and CH2 regions of human IgG1, IgG2, IgG4 and variants thereof. The three parts of amino acids 228, 234-237 and 330-331 are compared. Mutant amino acid mutations are shown in bold italics. The EU numbering system is used for amino acid residues. 図2は、hUTI−L−vFcγ2のヌクレオチド配列(配列番号1)および推定アミノ酸配列(配列番号2)を示す。アミノ酸残基1〜19のペプチドは、hUTIのリーダーペプチドである。成熟タンパク質は、hUTI(アミノ酸残基20〜162)、ペプチドリンカー(アミノ酸残基163〜178)およびFcγ2変異体(アミノ酸残基179〜401)を含む。FIG. 2 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of hUTI-L-vFcγ2. The peptide of amino acid residues 1-19 is a hUTI leader peptide. The mature protein includes hUTI (amino acid residues 20-162), peptide linker (amino acid residues 163-178) and Fcγ2 variant (amino acid residues 179-401). 図3は、hUTI-L−vFcγ4のヌクレオチド配列(配列番号3)および推定アミノ酸配列(配列番号4)を示す。アミノ酸残基1〜19のペプチドはhUTIのリーダーペプチドである。成熟タンパク質はhUTI(アミノ酸残基20〜162)、ペプチドリンカー(アミノ酸残基163〜178)およびFcγ4変異体(アミノ酸残基179〜407)を含む。FIG. 3 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of hUTI-L-vFcγ4. The peptide of amino acid residues 1-19 is a hUTI leader peptide. The mature protein includes hUTI (amino acid residues 20-162), peptide linker (amino acid residues 163-178) and Fcγ4 variant (amino acid residues 179-407). 図4は、hUTI−L−vFcγ1のヌクレオチド配列(配列番号5)および推定アミノ酸配列(配列番号6)を示す。アミノ酸残基1〜19のペプチドはhUTIのリーダーペプチドである。成熟タンパク質はhUTI(アミノ酸残基20〜162)、ペプチドリンカー(アミノ酸残基163〜178)およびFcγ1変異体(アミノ酸残基179〜405)を含む。FIG. 4 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 5) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of hUTI-L-vFcγ1. The peptide of amino acid residues 1-19 is a hUTI leader peptide. The mature protein includes hUTI (amino acid residues 20-162), peptide linker (amino acid residues 163-178) and Fcγ1 variant (amino acid residues 179-405). 図5は、発現プラスミドPCDNA3−hUTI−L−vFcγの図解を示す。プラスミドは、示されているように、9,063bps長であり、hCMVプロモーター−エンハンサー、融合タンパク質遺伝子、DHFRおよびネオマイシン選択遺伝子などを含む。FIG. 5 shows a diagram of the expression plasmid PCDNA3-hUTI-L-vFcγ. The plasmid, as indicated, is 9,063 bp long and contains the hCMV promoter-enhancer, fusion protein gene, DHFR, neomycin selection gene, and the like. 図6は、hUTI−L−vFcγ2融合タンパク質を分泌している組換え細胞株を使用した、振とうフラスコ中の細胞増殖および累積タンパク質濃度を示す。最終タンパク質濃度は、15日目に3g/Lに近づいた。FIG. 6 shows cell growth and cumulative protein concentration in shake flasks using a recombinant cell line secreting hUTI-L-vFcγ2 fusion protein. The final protein concentration approached 3 g / L on day 15. 図7は、トリプシン阻害剤としてヒトの尿から精製されたhUTI(Techpool)またはCHO細胞上清からのrhUTI−L−vFcγ2融合タンパク質を使用した、in vitroにおける生物学的アッセイを示す。hUTIのIC50は81.5±6.0nMであり、そしてrhUTI−L−vFcγ2のIC50は70.9±1.5nMである。FIG. 7 shows an in vitro biological assay using hUTI (Techpool) purified from human urine as a trypsin inhibitor or rhUTI-L-vFcγ2 fusion protein from CHO cell supernatant. The IC50 for hUTI is 81.5 ± 6.0 nM and the IC50 for rhUTI-L-vFcγ2 is 70.9 ± 1.5 nM. 図8は、セルレインにより誘発されたマウス急性膵炎モデルにおける、rhUTI−L−vFcおよびhUTIの生物学的活性を示す。対照(グループA)と比較して、hUTIは、1mg/kgの投与量で、血清中アミラーゼレベルの増加に対して全く効果を示さなかった(グループB)。40mg/kg(または1μmol/kg)というはるかに高い投与量においては、hUTIは血清中アミラーゼの増加に対して8%の阻害効果を示した(グループC)。3mg/kg(または0.027μmol/kg)においては、hUTI−L−vFcは、血清中アミラーゼの増加に対して26%の阻害効果を示した(p<0.005、グループD)。30mg/kgにおいては、阻害は53%とはるかに高くあり続けた(p<0.001、グループE)。グループDにおけるrhUTI−L−vFcの投与量は、グループCにおけるhUTIより30倍少なかったが、血清中アミラーゼレベルに対する阻害効果は有意により良好であった。FIG. 8 shows the biological activity of rhUTI-L-vFc and hUTI in a mouse acute pancreatitis model induced by cerulein. Compared to the control (Group A), hUTI had no effect on increasing serum amylase levels at the 1 mg / kg dose (Group B). At a much higher dose of 40 mg / kg (or 1 μmol / kg) hUTI showed an 8% inhibitory effect on serum amylase increase (Group C). At 3 mg / kg (or 0.027 μmol / kg), hUTI-L-vFc showed a 26% inhibitory effect on serum amylase increase (p <0.005, group D). At 30 mg / kg, inhibition continued to be much higher at 53% (p <0.001, group E). The dose of rhUTI-L-vFc in group D was 30 times less than that in group C, but the inhibitory effect on serum amylase levels was significantly better. 図9は、10%還元SDS−PAGE上でのヒトの尿から精製されたhUTI(Techpool)および精製されたrhUTI−L−vFcγ2融合タンパク質を示す。FIG. 9 shows hUTI (Techpool) purified from human urine and purified rhUTI-L-vFcγ2 fusion protein on 10% reduced SDS-PAGE.

発明の詳細な説明
本発明は、hUTI、ペプチドリンカー(L)およびヒトIgG Fc(天然形または変異体形のいずれか)を含む、ヒト尿中トリプシンインヒビター(hUTI)−L−Fc融合タンパク質に関する。この融合タンパク質において、可動性ペプチドリンカーは約20以下のアミノ酸長を含み;そしてFcは、天然ヒトIgG FcおよびFc変異体(vFc)から選択される。2から約20アミノ酸長の可動性ペプチドリンカー(L)を使用することがより好ましく、そして可動性ペプチドリンカーは、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択された2つ以上のアミノ酸からなるまたは含む。IgG Fc変異体は非溶解性であり、そして天然IgG Fcと比較してアミノ酸の突然変異を含む。
Detailed Description of the Invention The present invention relates to a human urinary trypsin inhibitor (hUTI) -L-Fc fusion protein comprising hUTI, a peptide linker (L) and a human IgG Fc (either native or variant). In this fusion protein, the flexible peptide linker comprises about 20 amino acids or less; and the Fc is selected from natural human IgG Fc and Fc variants (vFc). More preferably, a mobile peptide linker (L) 2 to about 20 amino acids in length is used, and the mobile peptide linker consists of two or more amino acids selected from the group consisting of glycine, serine, alanine and threonine. Or include. IgG Fc variants are non-soluble and contain amino acid mutations compared to native IgG Fc.

本発明には多くの利点がある。血清中におけるhUTI−L−Fc融合タンパク質の高い活性および/または延長した存在は、より少ない投与量並びにより低頻度の注射をもたらし得る。血清中の薬物濃度の変動がより少ないことは、また、改善された安全性および耐容性を意味する。それ故、非溶解性Fc変異体または天然Fcを含むhUTI−L−Fc融合タンパク質は、急性膵炎、播種性血管内凝固(DIC)およびショックに関連した種々の容態の管理に有意に貢献する。   The present invention has many advantages. High activity and / or prolonged presence of hUTI-L-Fc fusion protein in serum can result in lower doses and less frequent injections. Less variation in serum drug concentration also means improved safety and tolerability. Therefore, hUTI-L-Fc fusion proteins comprising non-soluble Fc variants or native Fc contribute significantly to the management of various conditions associated with acute pancreatitis, disseminated intravascular coagulation (DIC) and shock.

本発明者らは、天然ヒトIgG Fcの他に、少なくとも3つのFc変異体(vFc)を、hUTI−L−Fc融合タンパク質の産生のために使用し、hUTI−L−Fc融合タンパク質に取り込み、および/またはhUTI−L−Fc融合タンパク質の産生へと別様に設計することができることを見い出した(図1)。ヒトIgG2 FcはFcγRには結合しないが、弱い補体活性を示す。Pro331Ser突然変異を有するFcγ2変異体は、天然Fcγ2よりも弱い補体活性を有するはずであるが、依然としてFcγRには結合しない。IgG4 Fcは補体カスケードを活性化するのには不十分であり、そしてFcγRへのその結合親和性は、最も活性のあるアイソタイプであるIgG1よりも約1ケタ低い。Ser228ProおよびLeu235Ala突然変異を有するFcγ4変異体は、天然Fcγ4と比較して最小のエフェクター機能を示すはずである。Leu234Val、Leu235AlaおよびPro331Ser突然変異を有するFcγ1変異体もまた、天然Fcγ1よりもはるかに低いエフェクター機能を示す。本発明者らは、これらのFc変異体、並びにヒトIgG(IgG1、IgG2、IgG4)からの天然Fcは全て、UTI融合タンパク質の調製に適していることを発見する。循環半減期を損なうことなく、または望ましくないコンフォメーション変化を全く引き起こすことなく、非溶解性Fcまたは天然Fcの調製のために他の置換を導入し得ることも可能である。   In addition to native human IgG Fc, we used at least three Fc variants (vFc) for the production of hUTI-L-Fc fusion proteins and incorporated into hUTI-L-Fc fusion proteins, We have found that and / or can be engineered to produce hUTI-L-Fc fusion proteins (FIG. 1). Human IgG2 Fc does not bind to FcγR, but exhibits weak complement activity. Fcγ2 variants with the Pro331Ser mutation should have weaker complement activity than native Fcγ2, but still do not bind to FcγR. IgG4 Fc is insufficient to activate the complement cascade, and its binding affinity to FcγR is about one digit lower than IgG1, the most active isotype. Fcγ4 variants with Ser228Pro and Leu235Ala mutations should show minimal effector function compared to native Fcγ4. Fcγ1 mutants with Leu234Val, Leu235Ala and Pro331Ser mutations also show much lower effector function than native Fcγ1. We find that these Fc variants, as well as native Fc from human IgG (IgG1, IgG2, IgG4) are all suitable for the preparation of UTI fusion proteins. It is also possible to introduce other substitutions for the preparation of non-soluble Fc or native Fc without compromising the circulation half-life or causing any undesirable conformational changes.

本発明により、hUTIとヒトIgG Fcとの間に存在する付加されたペプチドリンカーは、hUTI−L−Fc分子のin vitroにおける生物学的活性に2つの方法で貢献することが発見される:(1)hUTI上のプロテアーゼ結合部位からFc領域を離しておく、および/または(2)一方のUTIドメインを、他方のUTIドメインから遠ざける。このようにして、両方のUTIドメインがプロテアーゼと独立的に相互作用し得ることが可能である。本発明では、長さが約20以下のアミノ酸の可動性ペプチドリンカー(L)が好ましい。より好ましくは、ペプチドリンカー(L)は少なくとも2アミノ酸長を有するべきである。さらに、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択された2つ以上のアミノ酸を含むペプチドリンカーを使用することがさらにより好ましい。   In accordance with the present invention, it has been discovered that the added peptide linker that exists between hUTI and human IgG Fc contributes to the in vitro biological activity of hUTI-L-Fc molecules in two ways: ( 1) Keep the Fc region away from the protease binding site on hUTI and / or (2) keep one UTI domain away from the other UTI domain. In this way, it is possible that both UTI domains can interact independently with the protease. In the present invention, a mobile peptide linker (L) having an amino acid length of about 20 or less is preferred. More preferably, the peptide linker (L) should have a length of at least 2 amino acids. It is even more preferred to use a peptide linker comprising two or more amino acids selected from the group consisting of glycine, serine, alanine and threonine.

また本発明によると、hUTIの組換え融合タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株から誘導された細胞株によって産生された。マウス急性膵炎疾病モデルにおけるin vivoでの生物学的活性に関してhUTIと比較した場合、組換えhUTI−L−Fcは、モル基準で、hUTIよりもはるかにより効果的であるようであった。ラットにおいては、組換えhUTI−L−Fcの半減期はhUTIよりもはるかに長いことが観察された。この長時間作用型の医薬品を製造することによって、投与頻度を減少させるおよび/または投与頻度を管理する選択肢を提供することが可能となり得、そして高い血清中レベルを維持し得る。   Also according to the present invention, the hUTI recombinant fusion protein was produced by a cell line derived from a Chinese hamster ovary (CHO) cell line. Recombinant hUTI-L-Fc appeared to be much more effective than hUTI on a molar basis when compared to hUTI for in vivo biological activity in a mouse acute pancreatitis disease model. In rats, the half-life of recombinant hUTI-L-Fc was observed to be much longer than hUTI. By producing this long acting pharmaceutical, it may be possible to provide options to reduce dosing frequency and / or manage dosing frequency and maintain high serum levels.

本発明のために、上で考察したCHO由来細胞株などの哺乳動物細胞株から本明細書において開示した組換え融合タンパク質を製造または産生するための方法を開示する。トランスフェクションされた細胞株を、組換え融合タンパク質が24時間の期間中に100万個の細胞あたり50μgを超える量で、好ましくは100μgを超える量でその増殖培地に発現および分泌される条件下で増殖させる。これらのrhUTI−L−Fc融合タンパク質は、hUTIと比べて、モル基準で、in vitroにおける良好なおよび/または高い生物学的活性、並びに多くの望ましくない副作用を伴うことなく延ばされた血清中半減期によって特徴付けられそしてこれを示し、これにより改善された薬物動態および薬力学がもたらされる。従って、類似の効力を達成するためにより少ない投与量およびより少ない注射回数が必要となる。または代替的にもしくは組み合わせて、異なる投与計画および/または異なる注射管理の方法が可能となり得る。   For the present invention, a method is disclosed for producing or producing the recombinant fusion proteins disclosed herein from mammalian cell lines, such as the CHO derived cell lines discussed above. The transfected cell line is subjected to conditions under which the recombinant fusion protein is expressed and secreted into its growth medium in an amount greater than 50 μg per million cells, preferably greater than 100 μg, over a 24 hour period. Proliferate. These rhUTI-L-Fc fusion proteins are compared to hUTI in serum on a molar basis with good and / or high biological activity in vitro and without many undesirable side effects. Characterized by and exhibiting a half-life, which results in improved pharmacokinetics and pharmacodynamics. Thus, smaller doses and fewer injection times are required to achieve similar efficacy. Alternatively or in combination, different dosing schedules and / or different methods of injection management may be possible.

本発明のさらなる態様は、hUTI、可動性ペプチドリンカーおよびヒトIgG Fc(変異体形および天然形を含む)を含む組換え融合タンパク質を製造するための方法を提供し、前記方法は、(a)CHOに由来する細胞株を生成する工程;(b)組換え融合タンパク質が、24時間の期間中に100万(10)個の細胞あたり50μg、好ましくは100μgを超える量でその増殖培地に発現および分泌される条件下で細胞株を増殖させる工程;そして(c)工程b)からの発現タンパク質を精製する工程を含み、組換え融合タンパク質は、モル基準で、hUTIと同じくらい高い生物学的活性によって特徴付けられそしてこれを示す。この場合、好ましくは、約20個以下であるが、しかし2個より少なくはないアミノ酸を含む可動性ペプチドリンカーが、rhUTIとヒトIgG Fc(変異体形および天然形を含む)との間に存在し;そして可動性ペプチドリンカーは、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択された2つ以上のアミノ酸を含み;そして、ヒトIgG Fc(天然形または変異体形のいずれか)は、ヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む。Fcの変異体形は、Pro331Ser突然変異を含むヒトIgG2、Ser228ProおよびLeu235Ala突然変異を含むヒトIgG4、およびLeu234Val、Leu235AlaおよびPro331Ser突然変異を含むヒトIgG1からなる群より選択される。 A further aspect of the invention provides a method for producing a recombinant fusion protein comprising hUTI, a mobile peptide linker and a human IgG Fc (including mutant and native forms), said method comprising (a) CHO (B) recombinant recombinant protein is expressed in its growth medium in an amount of 50 μg per million (10 6 ) cells, preferably greater than 100 μg, over a 24 hour period; Growing the cell line under secreted conditions; and (c) purifying the expressed protein from step b), wherein the recombinant fusion protein has a biological activity as high as hUTI on a molar basis. And is characterized by this. In this case, preferably a mobile peptide linker comprising no more than about 20 but no less than 2 amino acids is present between rhUTI and human IgG Fc (including mutant and native forms). And the mobile peptide linker comprises two or more amino acids selected from the group consisting of glycine, serine, alanine and threonine; and human IgG Fc (either native or variant) comprises a hinge domain, Includes CH2 and CH3 domains. The variant form of Fc is selected from the group consisting of human IgG2, including the Pro331Ser mutation, human IgG4, including the Ser228Pro and Leu235Ala mutations, and human IgG1, including the Leu234Val, Leu235Ala, and Pro331Ser mutations.

実施例1.hUTI−L−vFcγ2融合タンパク質をコードする遺伝子の調製
ヒトUTIのリーダーペプチドおよび成熟タンパク質をコードする遺伝子を新規に合成した。得られた約500bp長のDNAフラグメントを、pUC57などのホールディングベクター(holding vector)のEcoRV制限酵素部位に挿入することにより、phUTIプラスミドを得た。hUTI遺伝子の配列はDNAシークエンスによって確認された。
Example 1. Preparation of Gene Encoding hUTI-L-vFcγ2 Fusion Protein A gene encoding a human UTI leader peptide and a mature protein was newly synthesized. The obtained DNA fragment of about 500 bp was inserted into the EcoRV restriction enzyme site of a holding vector such as pUC57 to obtain a phUTI plasmid. The sequence of the hUTI gene was confirmed by DNA sequencing.

リンカーペプチドおよびヒトIgG2のFc変異体領域(Pro331Ser突然変異を含むFcγ2)をコードする遺伝子を新規に合成した。得られたFcγ2のDNAフラグメントは、リンカーペプチド、並びに、Fcγ2 Pro331Ser変異体(vFcγ2)(Fcγ2の331位のProをSerを用いて置換した)を含むIgG2のヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインの配列を含んだ。リンカーペプチドは、16アミノ酸のGly−Serペプチドリンカーをコードする配列を含んだ。得られた約700bp長のDNAフラグメントをpUC19などのホールディングベクターのBamHIおよびEcoRI部位に挿入することによりpL−vFcγ2プラスミドを得た。遺伝子の配列はDNAシークエンスによって確認された。   A gene encoding a linker peptide and an Fc variant region of human IgG2 (Fcγ2 containing Pro331Ser mutation) was synthesized. The obtained Fcγ2 DNA fragment is a sequence of an IgG2 hinge domain, a CH2 domain, and a CH3 domain containing a linker peptide and an Fcγ2 Pro331Ser mutant (vFcγ2) (Pro at position 331 of Fcγ2 was replaced with Ser) Included. The linker peptide contained a sequence encoding a 16 amino acid Gly-Ser peptide linker. The obtained DNA fragment of about 700 bp was inserted into BamHI and EcoRI sites of a holding vector such as pUC19 to obtain a pL-vFcγ2 plasmid. The sequence of the gene was confirmed by DNA sequencing.

hUTI−L−vFcγ2融合遺伝子を調製するために、hUTIフラグメントをSpeIおよびBamHIを用いてphUTIプラスミドから切り出し、そしてアガロースゲル電気泳動によって精製した。その後、精製されたフラグメントを、pL−vFcγ2プラスミド中のペプチドリンカーの5’末端に挿入することにより、phUTI−L−vFcγ2プラスミドを得た。融合遺伝子は、hUTI、Gly−SerペプチドリンカーおよびFcγ2変異体遺伝子を含む。   To prepare the hUTI-L-vFcγ2 fusion gene, the hUTI fragment was excised from the phUTI plasmid using SpeI and BamHI and purified by agarose gel electrophoresis. The purified fragment was then inserted into the 5 'end of the peptide linker in the pL-vFcγ2 plasmid to obtain the phUTI-L-vFcγ2 plasmid. The fusion gene includes hUTI, Gly-Ser peptide linker and Fcγ2 mutant gene.

hUTIとFc部分との間の(およびその両方に化学的に結合した)ペプチドリンカー、好ましくは可動性リンカーの存在は、hUTIドメインの可動性を増加させ、そしてその生物学的活性を増強する。本発明では、約20以下のアミノ酸長のペプチドリンカーが好ましい。1つのアミノ酸も本発明の範囲内にあるが、約20から約2のアミノ酸長の可動性ペプチドリンカーを有することが好ましい。グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択された2つ以上のアミノ酸を含むペプチドリンカーを好ましくは使用することができる。ペプチドリンカーの例は、GlyGlyGlyGlySerなどのGly−Serペプチド構築ブロックを含む。図2は、hUTI、16アミノ酸ペプチドリンカー(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)およびFcγ2 Pro331Ser変異体をコードする配列を含む融合遺伝子と、その対応するアミノ酸配列を示す。図3は、hUTI−L−vFcγ4(Ser228ProおよびLeu235Ala突然変異を有するFcγ4)についての融合遺伝子および対応するアミノ酸配列を示す。図4は、hUTI−L−vFcγ1(Leu234Val、Leu235AlaおよびPro331Ser突然変異を有するFcγ1)についての融合遺伝子および対応するアミノ酸配列を示す。   The presence of a peptide linker, preferably a mobile linker, between (and chemically bound to) the hUTI and Fc moieties increases the mobility of the hUTI domain and enhances its biological activity. In the present invention, a peptide linker having an amino acid length of about 20 or less is preferred. One amino acid is also within the scope of the invention, but preferably has a mobile peptide linker of about 20 to about 2 amino acids in length. Peptide linkers comprising two or more amino acids selected from the group consisting of glycine, serine, alanine and threonine can preferably be used. Examples of peptide linkers include Gly-Ser peptide building blocks such as GlyGlyGlyGlySer. FIG. 2 shows a fusion gene comprising a sequence encoding hUTI, a 16 amino acid peptide linker (GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer) and Fcγ2 Pro331Ser variant, and its corresponding amino acid sequence. FIG. 3 shows the fusion gene and corresponding amino acid sequence for hUTI-L-vFcγ4 (Fcγ4 with Ser228Pro and Leu235Ala mutations). FIG. 4 shows the fusion gene and corresponding amino acid sequence for hUTI-L-vFcγ1 (Fcγ1 with Leu234Val, Leu235Ala and Pro331Ser mutations).

実施例2.hUTI−Fcのための発現ベクターの構築
その後、hUTI−L−vFcγ融合タンパク質をコードする完全遺伝子を、pcDNA3(Invitrogen)などの哺乳動物発現ベクターのHindIIIおよびEcoRI部位に挿入した。図5に示したように、最終発現ベクタープラスミドpCDNA3−hUTI−L−vFcγは、哺乳動物細胞における高レベルの発現に必要とされるサイトメガロウイルス初期遺伝子プロモーター−エンハンサーを含む。前記プラスミドは、また、細菌におけるアンピシリン耐性、および哺乳動物細胞におけるG418耐性を付与するための選択マーカーを含む。さらに、この発現ベクターは、宿主細胞にDHFR遺伝子発現が欠損している場合に、メトトレキサート(MTX)の存在下でhUTI−L−vFcγ融合遺伝子およびDHFR遺伝子の同時増幅を可能とするジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子を含む(例えば、U.S. Pat. No. 4,399,216参照)。
Example 2 Construction of an expression vector for hUTI-Fc The complete gene encoding the hUTI-L-vFcγ fusion protein was then inserted into the HindIII and EcoRI sites of mammalian expression vectors such as pcDNA3 (Invitrogen). As shown in FIG. 5, the final expression vector plasmid pCDNA3-hUTI-L-vFcγ contains a cytomegalovirus early gene promoter-enhancer that is required for high level expression in mammalian cells. The plasmid also contains a selectable marker for conferring ampicillin resistance in bacteria and G418 resistance in mammalian cells. Furthermore, this expression vector is a dihydrofolate reductase that allows simultaneous amplification of the hUTI-L-vFcγ fusion gene and the DHFR gene in the presence of methotrexate (MTX) when the host cell is deficient in DHFR gene expression. DHFR) gene (see, for example, US Pat. No. 4,399,216).

実施例3.トランスフェクションされた細胞株における融合タンパク質の発現
pCDNA3−hUTI−L−vFcγ発現ベクタープラスミドを使用して哺乳動物宿主細胞株をトランスフェクションすることにより、融合タンパク質の発現を達成した。安定した高いレベルの発現のために好ましい宿主細胞株は、DHFR酵素を欠損したCHO細胞である(例えば、U.S. Pat. No. 4,818,679参照)。好ましいトランスフェクション法は電気穿孔法である。リン酸カルシウム共沈降法、リポフェクタミン2000を含む他の方法も使用することができる。電気穿孔法のために、PvuIを用いて鎖状化した20μgのプラスミドDNAを、電場250Vおよび静電容量960μFdに設定されたGene Pulserエレクトロポレーター(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)を使用してキュベット中の2〜5×10個の細胞に加えた。トランスフェクションから2日後、培地を、0.8mg/mlのG418を含む増殖培地と交換した。選択薬に対して耐性のあるトランスフェクション体を、抗ヒトIgG FcELISAを使用して融合タンパク質の分泌について試験した。発現された融合タンパク質の定量も、抗hUTI ELISAによって行なわれた。高レベルのFc融合タンパク質を産生するウェルを、96ウェル組織培養プレート上での限界希釈によってサブクローニングした。
Example 3 Expression of the fusion protein in transfected cell lines Expression of the fusion protein was achieved by transfecting a mammalian host cell line using the pCDNA3-hUTI-L-vFcγ expression vector plasmid. Preferred host cell lines for stable high level expression are CHO cells deficient in DHFR enzyme (see, eg, US Pat. No. 4,818,679). A preferred transfection method is electroporation. Other methods including calcium phosphate coprecipitation, Lipofectamine 2000 can also be used. For electroporation, 20 μg of plasmid DNA chained with PvuI was used with a Gene Pulser electroporator (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.) Set to an electric field of 250 V and a capacitance of 960 μFd. And added to 2-5 × 10 7 cells in the cuvette. Two days after transfection, the medium was replaced with growth medium containing 0.8 mg / ml G418. Transfectants resistant to the selected drug were tested for secretion of the fusion protein using an anti-human IgG Fc ELISA. Quantification of the expressed fusion protein was also performed by anti-hUTI ELISA. Wells producing high levels of Fc fusion protein were subcloned by limiting dilution on 96-well tissue culture plates.

より高いレベルの融合タンパク質の発現を達成するために、MTX薬物によって阻害され得るDHFRの遺伝子を使用することによって同時増幅を行なった。漸増濃度のMTXを含む増殖培地中において、トランスフェクションされた融合タンパク質の遺伝子をDHFR遺伝子と同時増幅させた。1μg/mlまでのMTXを含む培地中で増殖することのできるトランスフェクション体を、再度、限界希釈によってサブクローニングした。サブクローニングされた細胞株を、分泌率を測定することによってさらに分析した。24時間あたり100万個の細胞あたり100μgを超える分泌率レベルを生じたいくつかの細胞株を、無血清増殖培地を使用して懸濁培養に適応させた。1つの細胞株を、15日間かけて振とうフラスコを使用して100ml中で増殖させた。図6は、約3g/Lの融合タンパク質の累積濃度を示す。5から10日目に、最大生存細胞密度は、1mlあたり約600万個の細胞に留まった。これらの条件下で、分泌率は、24時間あたり100万個の細胞あたり約50μgであると計算される。馴化培地を、融合タンパク質の精製のために使用した。   To achieve higher levels of fusion protein expression, co-amplification was performed by using a gene for DHFR that can be inhibited by MTX drugs. In a growth medium containing increasing concentrations of MTX, the gene for the transfected fusion protein was co-amplified with the DHFR gene. Transfectants capable of growing in medium containing up to 1 μg / ml MTX were subcloned again by limiting dilution. Subcloned cell lines were further analyzed by measuring secretion rate. Several cell lines that produced secretion rate levels in excess of 100 μg per million cells per 24 hours were adapted to suspension culture using serum-free growth medium. One cell line was grown in 100 ml using a shake flask for 15 days. FIG. 6 shows the cumulative concentration of fusion protein of about 3 g / L. On days 5 to 10, the maximum viable cell density remained at about 6 million cells per ml. Under these conditions, the secretion rate is calculated to be about 50 μg per million cells per 24 hours. Conditioned medium was used for purification of the fusion protein.

実施例4.融合タンパク質の精製および特徴付け
融合タンパク質を含む馴化培地を、1N NaOHを用いて滴定してpH7〜8とし、そして0.45ミクロンのニトロセルロースフィルターを通してろ過した。ろ液を、リン酸緩衝食塩水(PBS)中で平衡化したProsepAカラムにロードした。融合タンパク質をProsepAに結合させた後、素通り画分を廃棄した。カラムを、280nmにおけるODが0.01未満となるまでPBSを用いて洗浄した。その後、結合した融合タンパク質をpH3.75の0.1Mクエン酸緩衝液を用いて溶出した。0.4容量の1M KHPOを用いて中和した後、精製されたタンパク質を含む画分をプールし、そしてPBSに対して透析した。その後、前記溶液を0.22ミクロンのニトロセルロースフィルターを通してろ過し、そして−70℃で保存した。10%還元SDS−PAGE分析によって示されているように(図9)、精製されたhUTI−L−vFcタンパク質の分子量は、約55kDであると推定された。類似した条件下で、ヒトの尿から精製されたhUTI(Techpool)の分子量は38kDであるようであった。融合タンパク質を、標準としてBSAを使用してBCAタンパク質アッセイによって定量した。
Example 4 Purification and characterization of the fusion protein The conditioned medium containing the fusion protein was titrated with 1N NaOH to pH 7-8 and filtered through a 0.45 micron nitrocellulose filter. The filtrate was loaded onto a ProsepA column equilibrated in phosphate buffered saline (PBS). After the fusion protein was bound to ProsepA, the flow-through fraction was discarded. The column was washed with PBS until the OD at 280 nm was less than 0.01. The bound fusion protein was then eluted with 0.1 M citrate buffer at pH 3.75. After neutralization with 0.4 volume of 1M K 2 HPO 4 , fractions containing purified protein were pooled and dialyzed against PBS. The solution was then filtered through a 0.22 micron nitrocellulose filter and stored at -70 ° C. As shown by 10% reducing SDS-PAGE analysis (FIG. 9), the molecular weight of the purified hUTI-L-vFc protein was estimated to be about 55 kD. Under similar conditions, the molecular weight of hUTI (Techpool) purified from human urine appeared to be 38 kD. The fusion protein was quantified by BCA protein assay using BSA as a standard.

実施例5.in vitroにおける生物学的活性のアッセイ
トランスフェクション体の上清または精製されたタンパク質におけるUTIの生物学的活性を、標準的な手順に従って残留トリプシン活性を決定することによってアッセイした(例えば、Kakade et al Cereal Chem., 46:518-526, 1969参照)。基質としてBAPNA(Nα−ベンゾイル−L−アルギニン4−ニトロアニリド塩酸塩、Sigma-Aldrich)および酵素としてブタトリプシン(Sigma-Aldrich)を使用することによって改変を行なった。20μlの希釈されたhUTIタンパク質、精製されたhUTI−L−vFcγ、またはトランスフェクション体の上清、5μlのトリプシン(2.94g/L CaClを含む1mM HCl中の100mg/ml溶液)を含む反応混合物は、0.2Mトリエタノールアミン緩衝液で125μlの容量に調整された。混合物を振とうしながら37℃で20分間かけてインキュベーションした後、5μlのBAPNA(25mgを最小容量のDMSOに溶解し、そして0.2Mトリエタノールアミン緩衝液を用いて10mg/mlの最終濃度に調整した)を混合物に加え、そして37℃で振とうしながらさらに20分間かけてインキュベーションを続けた。その後、反応を、30μlの30%(v/v)氷酢酸の添加によって終了させた。ブランクおよびトリプシン対照を同時に行なった。405nmにおける吸光度を記録した。図7は、hUTI(Techpool)または精製されたrhUTI−L−vFcγ融合タンパク質の正規化された活性、対、hUTI(Techpool)または精製されたrhUTI−L−vFcγ融合タンパク質のモル(nM)濃度での濃度を示す。これらの条件下で、IC50は、hUTIについては81.5±6.0nMであり、そして精製されたrhUTI−L−vFcγ2融合タンパク質については70.9±1.5nMであると推定された。
Example 5 FIG. In vitro biological activity assay The biological activity of UTI in the supernatant of the transfectants or purified protein was assayed by determining the residual trypsin activity according to standard procedures (eg Kakade et al Cereal Chem., 46: 518-526, 1969). As substrates BAPNA (N α - benzoyl -L- arginine 4-nitroanilide hydrochloride, Sigma-Aldrich) was performed modified by the use of porcine trypsin (Sigma-Aldrich) and as an enzyme. Reactions containing 20 μl of diluted hUTI protein, purified hUTI-L-vFcγ, or supernatant of the transfectant, 5 μl trypsin (100 mg / ml solution in 1 mM HCl containing 2.94 g / L CaCl 2 ) The mixture was adjusted to a volume of 125 μl with 0.2 M triethanolamine buffer. After incubating the mixture for 20 minutes at 37 ° C. with shaking, 5 μl of BAPNA (25 mg dissolved in a minimum volume of DMSO and brought to a final concentration of 10 mg / ml using 0.2 M triethanolamine buffer. Adjusted) was added to the mixture and the incubation continued for another 20 minutes with shaking at 37 ° C. The reaction was then terminated by the addition of 30 μl 30% (v / v) glacial acetic acid. Blank and trypsin controls were performed simultaneously. Absorbance at 405 nm was recorded. FIG. 7 shows the normalized activity of hUTI (Techpool) or purified rhUTI-L-vFcγ fusion protein versus the molar (nM) concentration of hUTI (Techpool) or purified rhUTI-L-vFcγ fusion protein. The concentration of is shown. Under these conditions, the IC50 was estimated to be 81.5 ± 6.0 nM for hUTI and 70.9 ± 1.5 nM for the purified rhUTI-L-vFcγ2 fusion protein.

実施例6.マウス疾病モデルにおけるin vivoでの生物学的活性
精製されたrhUTI−L−vFcタンパク質のin vivoでの生物学的活性を、セルレインを用いて誘発された広く受け入れられている急性膵炎マウスモデルを使用して試験した。セルレインを用いての注射から24時間後に、マウスは、急性膵炎の生化学的、組織学的、および免疫組織化学的証拠を発達させる。血清中のアミラーゼ、リパーゼ、TNF−αおよびIL−1βなどの生化学的マーカーが上昇した。免疫組織化学的染色法を使用して、白血球接着分子、血管内皮増殖因子およびアポトーシス関連タンパク質のレベルが、これらのマウスにおいて増大することが判明した(例えば、Ding et al, Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., 9:645-650, 2010; Galuppo et al, Br J. Pharmacol.,162:1186-1201, 2011参照)。本発明者らの実験においては、血清中アミラーゼ活性を、急性膵炎の重度の指標として追跡した。
Example 6 In vivo biological activity in mouse disease models In vivo biological activity of purified rhUTI-L-vFc protein is used in a widely accepted acute pancreatitis mouse model induced with cerulein And tested. Twenty-four hours after injection with cerulein, the mice develop biochemical, histological, and immunohistochemical evidence of acute pancreatitis. Serum biochemical markers such as amylase, lipase, TNF-α and IL-1β were elevated. Using immunohistochemical staining methods, it was found that levels of leukocyte adhesion molecules, vascular endothelial growth factor and apoptosis-related proteins were increased in these mice (eg, Ding et al, Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int ., 9: 645-650, 2010; Galuppo et al, Br J. Pharmacol., 162: 1186-1201, 2011). In our experiments, serum amylase activity was followed as an indicator of the severity of acute pancreatitis.

30匹の8週令の雄C57BL/6マウス(20〜22g)(SLAC Laboratory, Shanghai)を、1群あたり6匹の5つの群に無作為に分けた。マウスを15時間かけて断食させた後、各群に、1時間間隔で6回、50μg/kgのセルレインを腹腔内注射した。上のようなセルレイン注射を受けたマウスにおいては、アミラーゼ濃度は最後の注射後に急速に増加し、3時間後にピークに達した。その後、レベルはゆっくりと減少し、そして24時間後に基線に戻った。この観察は、最後のセルレインの注射から1時間後が、hUTIまたはrhUTI−L−vFcによる処置の効力を評価する最善の時であることを示した。   Thirty 8-week-old male C57BL / 6 mice (20-22 g) (SLAC Laboratory, Shanghai) were randomly divided into 5 groups of 6 per group. After the mice were fasted for 15 hours, each group was injected intraperitoneally with 50 μg / kg of celluline 6 times at 1 hour intervals. In mice receiving serulein injection as above, amylase concentration increased rapidly after the last injection and peaked after 3 hours. Thereafter, the level slowly decreased and returned to baseline after 24 hours. This observation indicated that 1 hour after the last cellulin injection was the best time to assess the efficacy of treatment with hUTI or rhUTI-L-vFc.

セルレインの初回および5回目のそれぞれの注射後、マウスに、その尾静脈を通して、ヒトの尿から精製されたhUTI(Techpool)またはrhUTI−L−vFcを注射した。図8に示したように、B群およびC群のマウスを、それぞれ、1mg/kgおよび40mg/kgのhUTIを用いて処置し;D群およびE群のマウスを、それぞれ、3mg/kgおよび30mg/kgのrhUTI−L−vFcを用いて処置した。A群のマウスは、等容量の食塩水を受けた対照として作用した。セルレインの最後の注射後、200μlの血液試料を、マウスからその眼窩を通して種々の時点で回収した。試料を10分間かけて6000rpmで遠心分離し、そして血清を、アッセイを実施するまで−70℃で保存した。アッセイを製造業者の指示に従って日立7060自動化学分析装置(Hitachi 7060 Automatic Chemistry Analyzer)で実施した。アミラーゼの濃度を、1リットルあたりの国際単位で表現した。   Following the first and fifth injections of cerulein, mice were injected through their tail vein with hUTI (Techpool) or rhUTI-L-vFc purified from human urine. As shown in FIG. 8, mice in groups B and C are treated with 1 mg / kg and 40 mg / kg hUTI, respectively; mice in groups D and E are treated with 3 mg / kg and 30 mg, respectively. Treated with / kg rhUTI-L-vFc. Group A mice served as controls that received an equal volume of saline. After the last injection of cerulein, 200 μl blood samples were collected from mice through their orbits at various time points. Samples were centrifuged at 6000 rpm for 10 minutes and serum was stored at -70 ° C until the assay was performed. The assay was performed on a Hitachi 7060 Automatic Chemistry Analyzer according to the manufacturer's instructions. Amylase concentration was expressed in international units per liter.

対照(A群)と比較して、hUTIは、1mg/kgの投与量においては、血清中アミラーゼ濃度の増加に対して全く効果を示さなかった(B群)。40mg/kgというはるかに高い投与量においては、hUTIは、血清中アミラーゼの増加に対して8%の阻害効果を示した(C群)。しかしながら、hUTI−L−vFcを用いての処置は、対照(A群)と比較して血清中アミラーゼ濃度を有意に減少させた。hUTI−L−vFcは、3mg/kgにおいて、血清中アミラーゼの増加に対して26%の阻害効果を示した(p<0.005)。30mg/kgにおいては、阻害は、53%とはるかにより効果的であるようであった(p<0.001)。単量体rhUTI−L−vFcおよびhUTIの推定分子量をそれぞれ55kDおよび38kDとして使用することによってモル濃度をさらに計算した(図9)。それ故、40mg/kgまたは1μmol/kgのhUTIは8%の阻害効果を有し、一方、3mg/kgまたは0.027μmol/kgのrhUTI−L−vFcは、血清中アミラーゼ濃度の増加に対して26%の阻害効果を有した。モル基準で、rhUTI−L−vFcの投与量は、hUTIよりも30倍少なく、しかしながら血清中アミラーゼに対する阻害ははるかにより効果的であった。これらの結果は、rhUTI−L−vFcが、これらのマウスにおける急性膵炎を処置する上でhUTIよりもより効果的であることを確認した。   Compared to the control (Group A), hUTI had no effect on increasing serum amylase concentration at the 1 mg / kg dose (Group B). At a much higher dose of 40 mg / kg, hUTI showed an 8% inhibitory effect on the increase in serum amylase (Group C). However, treatment with hUTI-L-vFc significantly reduced serum amylase levels compared to controls (Group A). hUTI-L-vFc showed 26% inhibitory effect on serum amylase increase at 3 mg / kg (p <0.005). At 30 mg / kg, inhibition appeared to be much more effective at 53% (p <0.001). Molar concentrations were further calculated by using the estimated molecular weights of monomeric rhUTI-L-vFc and hUTI as 55 kD and 38 kD, respectively (FIG. 9). Therefore, 40 mg / kg or 1 μmol / kg hUTI has an 8% inhibitory effect, while 3 mg / kg or 0.027 μmol / kg rhUTI-L-vFc is against increasing serum amylase concentration. It had an inhibitory effect of 26%. On a molar basis, the dosage of rhUTI-L-vFc was 30 times less than hUTI, however, inhibition against serum amylase was much more effective. These results confirmed that rhUTI-L-vFc is more effective than hUTI in treating acute pancreatitis in these mice.

実施例7.ラットにおける血清中半減期
SDラット(SLAC Laboratory, Shanghai)に、尾静脈を通して、精製されたhUTI−L−vFcの1回投与量(2mg/kg)を注射した。種々の時間間隔で血液試料を回収し、そして6000rpmで10分間かけて遠心分離にかけた。アッセイを実施するまで血漿上清を−70℃で保存した。血清中濃度を、ELISAによって、ポリクローナルヤギ抗ヒトIgG Fc抗体およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識マウス抗hUTI抗体を使用して試験した。hUTI−L−vFcの半減期は910分間と推定され、これに対してhUTIについては182分間であった。それ故、hUTI−L−vFcの半減期は、ラットにおいて、hUTIと比較して有意に延長されている。
Example 7 Serum half-life in rats SD rats (SLAC Laboratory, Shanghai) were injected with a single dose (2 mg / kg) of purified hUTI-L-vFc through the tail vein. Blood samples were collected at various time intervals and centrifuged at 6000 rpm for 10 minutes. Plasma supernatant was stored at -70 ° C until the assay was performed. Serum concentrations were tested by ELISA using polyclonal goat anti-human IgG Fc antibody and horseradish peroxidase labeled mouse anti-hUTI antibody. The half-life of hUTI-L-vFc was estimated to be 910 minutes, compared to 182 minutes for hUTI. Therefore, the half-life of hUTI-L-vFc is significantly prolonged in rats compared to hUTI.

Claims (13)

ヒト尿中トリプシンインヒビター(hUTI)、ペプチドリンカー(L)およびヒトIgG Fcを含むhUTI−L−Fc融合タンパク質であって、前記可動性ペプチドリンカーは、長さが約20以下のアミノ酸を含み;そしてヒトIgG Fcは、天然IgG FcおよびFc変異体(vFc)からなる群より選択される、前記hUTI−L−Fc融合タンパク質。   A hUTI-L-Fc fusion protein comprising human urinary trypsin inhibitor (hUTI), peptide linker (L) and human IgG Fc, wherein the mobile peptide linker comprises about 20 amino acids or less in length; and The hUTI-L-Fc fusion protein, wherein the human IgG Fc is selected from the group consisting of native IgG Fc and Fc variants (vFc). IgG Fc変異体が非溶解性であり、そして天然IgG Fcと比較してアミノ酸の突然変異を含む、請求項1の融合タンパク質。   2. The fusion protein of claim 1, wherein the IgG Fc variant is non-soluble and contains amino acid mutations compared to native IgG Fc. ヒトIgG Fcが、ヒトIgG1、ヒトIgG2およびヒトIgG4からなる群より選択されたヒトIgGのヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、そしてCH2ドメインが、228位、234位、235位および331位においてアミノ酸の突然変異を含む、請求項2の融合タンパク質。   The human IgG Fc comprises a human IgG hinge domain, CH2 domain and CH3 domain selected from the group consisting of human IgG1, human IgG2 and human IgG4, and the CH2 domain is at positions 228, 234, 235 and 331 The fusion protein of claim 2 comprising an amino acid mutation in IgG Fc変異体が、非溶解性であり;ヒトIg Fcが、ヒトIgG1、ヒトIgG2およびヒトIgG4からなる群より選択されたヒトIgGのヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み;そしてCH2ドメインが228位、234位、235位および331位においてアミノ酸の突然変異を含む、請求項1の融合タンパク質。   The IgG Fc variant is non-soluble; the human Ig Fc comprises a human IgG hinge domain, CH2 domain and CH3 domain selected from the group consisting of human IgG1, human IgG2 and human IgG4; and the CH2 domain The fusion protein of claim 1 comprising amino acid mutations at positions 228, 234, 235 and 331. 前記可動性ペプチドリンカーが、hUTIとヒトIgG Fcとの間に存在し、そして前記可動性ペプチドリンカーが、長さが2〜20のアミノ酸を含む、請求項1の融合タンパク質。   The fusion protein of claim 1, wherein the mobile peptide linker is present between hUTI and human IgG Fc, and the mobile peptide linker comprises 2 to 20 amino acids in length. 前記可動性ペプチドリンカーが、hUTIとヒトIgG Fcとの間に存在し、そして前記可動性ペプチドリンカーが、長さが2〜20のアミノ酸を含み、そして前記アミノ酸が、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択される、請求項1の融合タンパク質。   The mobile peptide linker is present between hUTI and human IgG Fc, and the mobile peptide linker comprises 2-20 amino acids in length, and the amino acids are glycine, serine, alanine and threonine The fusion protein of claim 1 selected from the group consisting of: ヒト尿中トリプシンインヒビター(hUTI)、ペプチドリンカー(L)およびヒトIgG Fcを含むhUTI−L−Fc融合タンパク質であって、前記可動性ペプチドリンカーは、hUTIとヒトIgG Fcとの間に存在し、そして長さが2〜20のアミノ酸を含み、そしてグリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択され;Fcは、天然IgG Fcと、非溶解性で天然IgG Fcと比較してアミノ酸の突然変異を含む変異体(vFc)からなる群より選択され;ヒトIg Fcは、ヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み;そしてヒトIgG Fcは、Pro331Ser突然変異を含むヒトIgG2、Ser228ProおよびLeu235Ala突然変異を含むヒトIgG4、並びにLeu234Val、Leu235AlaおよびPro331Ser突然変異を含むヒトIgG1からなる群より選択される、前記hUTI−L−Fc融合タンパク質。   A hUTI-L-Fc fusion protein comprising human urinary trypsin inhibitor (hUTI), peptide linker (L) and human IgG Fc, wherein the mobile peptide linker is present between hUTI and human IgG Fc; And comprising 2 to 20 amino acids in length and selected from the group consisting of glycine, serine, alanine and threonine; Fc is a native IgG Fc and a non-soluble, amino acid mutation compared to native IgG Fc A human Ig Fc comprises a hinge domain, a CH2 domain and a CH3 domain; and a human IgG Fc comprises a human IgG2, Ser228Pro and Leu235Ala mutation comprising a Pro331Ser mutation. Human IgG4 containing, as well as Le 234Val, is selected from the group consisting of human IgG1 comprising Leu235Ala and Pro331Ser mutation, the hUTI-L-Fc fusion protein. hUTI、可動性ペプチドリンカー、並びにヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含むヒトIgG Fcを含む組換え融合タンパク質を製造するための方法であって、前記方法は、(a)CHOに由来する細胞株を生成する工程;(b)組換え融合タンパク質が、24時間の期間中に100万(10)個の細胞あたり50μgを超える量でその増殖培地中に発現および分泌される条件下で細胞株を増殖させる工程;そして(c)工程b)からの発現タンパク質を精製する工程を含む、前記方法。 A method for producing a recombinant fusion protein comprising hUTI, a mobile peptide linker, and a human IgG Fc comprising a hinge domain, a CH2 domain and a CH3 domain, comprising: (a) a cell line derived from CHO (B) a cell line under conditions where the recombinant fusion protein is expressed and secreted in its growth medium in an amount greater than 50 μg per million (10 6 ) cells over a 24 hour period And c) purifying the expressed protein from step b). 細胞株が、工程(b)において、組換え融合タンパク質が24時間の期間中に100万(10)個の細胞あたり50μgを超える量でその増殖培地中に発現および分泌される条件下で増殖する、請求項8の方法。 The cell line is grown under conditions such that in step (b) the recombinant fusion protein is expressed and secreted in its growth medium in an amount greater than 50 μg per million (10 6 ) cells over a 24 hour period. The method of claim 8. ヒトIgG Fcが、天然Fcと、Pro331Ser突然変異を含むヒトIgG2、Ser228ProおよびLeu235Ala突然変異を含むヒトIgG4、並びにLeu234Val、Leu235AlaおよびPro331Ser突然変異を含むヒトIgG1からなる群より選択された非溶解性の変異体Fcからなる群より選択される、請求項9の方法。   Human IgG Fc is a non-soluble human Fc selected from the group consisting of human IgG2, including the Pro331Ser mutation, human IgG4 including the Ser228Pro and Leu235Ala mutations, and human IgG1 including the Leu234Val, Leu235Ala and Pro331Ser mutations 10. The method of claim 9, wherein the method is selected from the group consisting of variant Fc. ヒトIgG Fcが、天然Fcと、Pro331Ser突然変異を含むヒトIgG2、Ser228ProおよびLeu235Ala突然変異を含むヒトIgG4、並びにLeu234Val、Leu235AlaおよびPro331Ser突然変異を含むヒトIgG1からなる群より選択された変異体Fcからなる群より選択される、請求項8の方法。   A human IgG Fc from a native Fc and a variant Fc selected from the group consisting of human IgG2, including the Pro331Ser mutation, human IgG4 including the Ser228Pro and Leu235Ala mutations, and human IgG1 including the Leu234Val, Leu235Ala and Pro331Ser mutations 9. The method of claim 8, wherein the method is selected from the group consisting of: 前記可動性ペプチドリンカーが、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択された2〜20個のアミノ酸を含む、請求項8の方法。   9. The method of claim 8, wherein the mobile peptide linker comprises 2 to 20 amino acids selected from the group consisting of glycine, serine, alanine and threonine. 細胞株が、組換え融合タンパク質が、24時間の期間中に100万(10)個の細胞あたり50μgを超える量でその増殖培地中に発現および分泌される条件下で増殖し;そして、前記組換え融合タンパク質は、モル基準でhUTIに類似した生物活性によって特徴付けられそしてこれを示し;可動性ペプチドリンカーは、hUTIとIgG Fcとの間に存在し;ヒトIgG Fcは、天然Fcと、Pro331Ser突然変異を含むヒトIgG2、Ser228ProおよびLeu235Ala突然変異を含むヒトIgG4、並びにLeu234Val、Leu235AlaおよびPro331Ser突然変異を含むヒトIgG1からなる群より選択された変異体Fcからなる群より選択され;そして前記可動性ペプチドリンカーは、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択された2〜20個のアミノ酸を含む、請求項8の方法。 A cell line is grown under conditions in which the recombinant fusion protein is expressed and secreted in its growth medium in an amount greater than 50 μg per million (10 6 ) cells during a 24 hour period; and The recombinant fusion protein is characterized by and exhibits biological activity similar to hUTI on a molar basis; a mobile peptide linker is present between hUTI and IgG Fc; human IgG Fc is native Fc, Selected from the group consisting of a human IgG2, including the Pro331Ser mutation, a human IgG4 including the Ser228Pro and Leu235Ala mutations, and a variant Fc selected from the group consisting of human IgG1 including the Leu234Val, Leu235Ala and Pro331Ser mutations; and said mobile Sex peptide linkers 9. The method of claim 8, comprising 2-20 amino acids selected from the group consisting of syn, serine, alanine and threonine.
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