JP2011505859A - 哺乳類発現ベクター - Google Patents
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Abstract
(a) 目的ポリペプチドを発現させるのに適当な少なくとも1個の発現カセット(POI);
(b) 哺乳類選択可能マーカー遺伝子を含む発現カセット(MSM);
(c) 哺乳類で増幅可能かつ選択可能なマーカー遺伝子を含む発現カセット(MASM);
を含み、発現カセット(POI)がその5'で発現カセット(MASM)と隣接しており、発現カセット(MSM)が発現カセット(POI)の3'に位置し、発現カセット(MASM)、(POI)および(MSM)が同じ5'から3'の方向で並んでいるベクター核酸を提供する。本発明はまた、該ベクターを含む宿主細胞および各々の宿主細胞を用いたポリペプチドの製造法を提供する。
Description
(a) 目的ポリペプチドを発現させるための少なくとも1個の発現カセット(POI);
(b) 哺乳類選択可能マーカー遺伝子を含む発現カセット(MSM);
(c) 哺乳類で増幅可能かつ選択可能なマーカー遺伝子を含む発現カセット(MASM);
を含み、発現カセット(POI)がその5'で発現カセット(MASM)と隣接しており、発現カセット(MSM)が発現カセット(POI)の3'に位置し、発現カセット(MASM)、(POI)および(MSM)が同じ5'から3'の方向で並んでいるベクター核酸が提供される。
(a) 目的ポリペプチドを発現させるための少なくとも1個の発現カセット(POI);
(b) 哺乳類選択可能マーカー遺伝子を含む発現カセット(MSM);
(c) 哺乳類で増幅可能かつ選択可能なマーカー遺伝子を含む発現カセット(MASM);
を含み、発現カセット(MSM)は、発現カセット(POI)の3'に位置しており、発現カセット(MASM)は、発現カセット(MSM)の3'に位置しており、発現カセット(MASM)、(POI)および(MSM)が同じ5'から3'の方向で並んでいる環状ベクター核酸である。
(a) 示された配置で下記の遺伝学的要素を含む、環状もしくは直線状ベクター核酸(ここで、5'から3'の方向は、→で示される):
I. 発現カセット(MASM)のプロモーター(→)
II. 発現カセット(MASM)の哺乳類で増幅可能かつ選択可能なマーカーをコードする遺伝子(→)
III. 所望により、発現カセット(MASM)のイントロン(→)
IV. 発現カセット(MASM)のポリA部位(→)
V. 発現カセット(POI)のプロモーター(→)
VI. 発現カセット(POI)のイントロン(→)
VII. 発現カセット(POI)に挿入される目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(→)
VIII. 発現カセット(POI)のポリA部位(→)
IX. 発現カセット(POI')のプロモーター(→)
X. 発現カセット(POI')のイントロン(→)
XI. 発現カセット(POI')に挿入されるさらなる目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(→)
XII. 発現カセット(POI')のポリA部位(→)
XIII. 発現カセット(MSM)のプロモーター(→)
XIV. 発現カセット(MSM)の哺乳類選択可能マーカーをコードする遺伝子(→)
XV. 発現カセット(MSM)のポリA部位(→)
XVI. PSM発現カセット(→)または(←)
XVII. ベクター核酸が環状である場合の直線化制限酵素部位;
(b) 遺伝学的要素の各々の同じ配置を含む、配列番号1または配列番号16で示されるベクター核酸またはその誘導体
からなる群から選択される。
(a) 目的ポリペプチドを発現させるための少なくとも1個の発現カセット(POI);
(b) 哺乳類選択可能マーカー遺伝子を含む発現カセット(MSM);
(c) 哺乳類で増幅可能かつ選択可能なマーカー遺伝子を含む発現カセット(MASM);
を並べることを含み、発現カセット(POI)がその5'で発現カセット(MASM)と隣接しており、発現カセット(MSM)が発現カセット(POI)の3'に位置し、発現カセット(MASM)、(POI)および(MSM)が同じ5'から3'の方向で並ぶようにする方法がまた提供される。
-該細胞培養培地および/または該宿主細胞から目的ポリペプチドを単離すること; および/または
-単離された目的ポリペプチドを加工すること。
本発明は、非限定的な方法で下記に例示されるが、それは、本発明の好ましい態様を構成する。
次いで、目的ポリペプチドを発現させるための本発明による適当な宿主細胞への導入法および宿主細胞の培養法を例示により示す。
CHO細胞を適当なCHO培地、例えば、ExCell81134 (SAFC Biosciencesから入手)で培養する。細胞を新鮮な培地で週2-3回継代し、試験の間、対数増殖期で維持する。
導入のために、生存率が90%を超える指数増殖期の親CHO細胞を使用する。リポフェクションによる導入を、製造者(Invitrogen)の指示にしたがって、DMRIE-C試薬を用いて行う。細胞量をOptiMEM I培地(Invitrogen)で1x106細胞に調整する。リポフェクションのために、2 μgまたは4 μgの発現ベクターおよび4 μlのDMRIE-C試薬を室温で28分間混合し、37℃で4時間細胞に加える。次いで、細胞を2x105細胞/ml培養培地まで希釈し、37℃で2日間、5% CO2下でインキュベートする。
発現ベクター核酸に位置するネオマイシン選択マーカーにより、G418耐性についての選択が可能となる。形質転換体の選択のために、細胞を0.8 mg/ml G418 (Invitrogen)の存在下で約2週間培養する。導入およびG418選択の2週間後、主にG418耐性細胞からなるプール集団が出現する。次いで、細胞をヌクレオチドの非存在下で約2週間培養する。その後、遺伝子増幅を培養培地への20nM MTXの添加により開始する。培養の3週間後、増幅異種細胞集団が産生される。DHFR (ジヒドロ葉酸レダクターゼ)選択/増幅マーカーにより、培養培地への葉酸類似体メトトレキサート(MTX)の添加によるDHFR遺伝子の増幅およびトランスジーンの増幅が可能となり、結果として、増加した導入プール集団の力価が生じる。危機回復(crisis recovery)後、プール集団は、各々約2週間のより高いMTX濃度を用いた第2および第3の増幅工程を受ける(100nMおよび500nM MTX)。各工程でプール集団回復(pool recovery)後、細胞を凍結する。
クローン細胞株(すなわち、単一細胞由来の細胞株)を得るために、安定的に導入された細胞のプール集団を希釈し、96ウェルプレートに0.3 - 0.5細胞/ウェル(限界希釈)の細胞密度で播種し得る。異なるコロニーを形成する細胞を標準的な方法を用いてスケールアップする。最後に、個々のクローンを組み換えポリペプチド発現について評価し、最も高い方法が培養および解析後に保持される。これらの候補の中から、適当な増殖および生産特性を有する細胞株を組み換えタンパク質の産生のために選択する。生産性は、通常、培養条件を確立し/適合させることにより、すなわち、ペプトンのような添加剤を加えることにより、さらに改良され得る。
本発明の教示によるいくつかのベクター集成物が実施可能である。ベクターの個々の構成要素は、当分野で既知であるので、例えば、基本的な遺伝学的要素の塩基配列決定もしくは増幅および適当なクローニングならびに望まれる方向での発現カセットにより適当なベクター構築することができる。各々のクローニング法は、当分野における技術常識であり、また上記の遺伝学的要素の配列は、先行文献に記載されている。次いで、いくつかのベクター構築体の作製を例示する。しかしながら、各々のベクターを取得するために、いくつかの他の態様および方法が適当であり、容易に利用可能であることが当業者により理解されている。
MCS = マルチクローニングサイト
mAB-HC = モノクローナル抗体重鎖
mAB-LC = モノクローナル抗体軽鎖
イントロン = Grillari et al, 2001, 3. Biotechnol. 87, 59-65を参照のこと
prom/enh = プロモーター/エンハンサー
この設定において、bgh pA部位と組み合わせたmAB遺伝子およびDHFR* (野生型DHFRよりもMTXに対する低い感受性を有する突然変異体)のタンデム配置を試験する。DHFR*カセットをmAB-LCを含む発現カセット(POI)の5'に置き、その結果、すべてのオープンリーディングフレームは、1つの読み枠方向に置かれる。pBW147の構築は、表3に示す。
下記のベクター構築は、市販で入手可能なpCI-neo発現ベクター(Promega Cooperation, USA)に基づく。完全DNA配列は、公に利用可能である(GenBank/EMBL受託番号: U47120)。新たなマルチクローニングサイトをpCIneoに導入する。
pBW147を得るために使用され得る第2のベクター構築体は、pBW139の配置を有する。pBW139は、pBW115から作製され得る。pBW115の構築のために、重鎖遺伝子をpCIneoRKにクローン化する(上記を参照のこと)。すなわち、pCIneoRKをMluIおよびNruI (平滑末端カッター)で消化し、一方で、重鎖PCR断片をAscI (3') (MluIに適合する)で消化し、5'は平滑末端である。得られたプラスミドをpBW115として示す。pBW115をScaIおよびBglIIで消化する。次いで、平滑末端を作製するために、Klenow補充を行う。軽鎖発現カセットをScaIおよびDraIIIを用いてpBW133から切断する。平滑末端を作製するために、T4-DNAポリメラーゼ処理を行う。連結により、pBW139としての配置を有するベクターが得られる(表2を参照のこと)。
pBW147を得るために、pBW133をSpeI、XhoIで消化する。CMVプロモーター部分および重鎖の第1部分を含む断片を単離し、pBW139(それはまた、SpeI、XhoIで切断される)に連結する。得られたベクターにおいて、重鎖カセットは、さらなるATGコドンを妨害することなく見出される。軽鎖をベクターに戻すために、pBW139をSpeIで消化する。LC含有断片をSpeIで開裂したpBW148に挿入する。得られたプラスミドは、pBW146としての配置を有する(表2を参照のこと)。
このベクターについては、mAB遺伝子およびpSV2DHFRからのDHFR遺伝子カセット(MTXに対して高感受性を有するDHFRの野生型版)のタンデム配置を試験する。pSV2DHFR (ATCC#374146)からのDHFR発現カセットをPCRにより増幅する。該断片は、プロモーターおよびpolyポリA部位を含んでいる。上記のとおり、オリゴ(oligos)は、BglII/BamHI制限酵素部位を有している。DHFR発現カセットをpBW146のBglII制限酵素部位に挿入し、pBW154と同じ構造を有するベクター構築体を生じる。pBW154の構造を表3に示し、それは、図1および2に由来し得て、遺伝学的要素の各々全構造/配置を有する一般的なベクター構築体の例を示す。pBW154の配列を配列番号1として示す。軽鎖ポリヌクレオチドを配列番号1中のnで示し(優先権の基礎となる出願ではVで代用する)、重鎖ポリヌクレオチドを配列番号1中のnで示す(優先権の基礎となる出願ではYで代用する)。pBW154の特徴は、表4で要約する。当然にまた、他のベクター構成要素、例えば、異なるプロモーター、異なるエンハンサー、異なるポリA部位および異なるorisのような他の構成要素が使用され得る。さらに、免疫グロブリン分子内の軽鎖および重鎖についての発現カセットを変換することが可能である。しかしながら、示された選択およびベクター構成要素の配置が好ましい。上で概略したとおり、また、他の免疫グロブリン分子の機能性断片が使用され得る。したがって、示された「nnn」は、例示目的のみに使用され、より小さいか、もしくはより大きい免疫グロブリン分子が対応する位置に存在し得るために、任意のサイズの制限を示していない。本発明の好ましい態様によるベクターの一般的な構築を示す図1および2との比較を容易にするために、我々は、図1および2に対応する構成要素の番号を示した。
実験はまた、ベクター中のDHFR遺伝子の方向が重要であることを示している。pBW146(上記参照)においては、EcoRI制限酵素部位が存在する。最終発現ベクター中に存在する単一のカッターとしてEcoRIを有するために、該部位を、EcoRIでpBW146を消化することにより除去し、Klenowを補充し、再ライゲーションする。これにより、pBW158としての配置を有するプラスミドを生じる(データは示していない)。DHFRカセットを、上記したとおり、pBW158に組み込むことができる。両方向(pBW159およびpBW160で示された方向、表2および3を参照のこと)は、自動的に作製されるので、両方を発現レベルに関して試験することができる。我々の結果は、すべてのオープンリーディングフレームが一方の5'から3'の読み枠方向に向いた配置の優れた性能を示す。
懸濁培養での試験のために、細胞を、250 mlの丸底フィルターキャップ培養フラスコに、50 ml ExCell81134培地(SAFC Biosciences)中、1x105 細胞/mlで播種する。試験の間、細胞を、37℃、10% CO2環境下、Kuehner Shaker ISF-4-W/インキュベーター内で、65 rpmで振とうする。専用液の単一供給を、固定された供給スキームにしたがって行い、細胞増殖の4日目に開始される。13日目に1 mlのサンプルを集めて、標準的なHPLCおよびプロテインAカラムを用いて力価を測定する。
プロテインA精製のために、約32.4 mgの抗体を含む約27 mLの無細胞培養上清を0.5x10 cmのMabSelect親和性カラムに充填する。充填後、カラムを十分にすすぎ、洗浄する。次いで、pH 3-4で抗体を溶出する。溶出物を、プロテインAカラムを用いた標準的なHPLCで解析する。約30.5 mgの抗体が得られる。
クローン増殖後に選択されるクローンをそれらの生産性について試験する。
IgG1抗体を発現させる。クローンを、商業的に利用可能な培地Ex-Cell81134 (SAFC Biosciences)で増殖させる。栄養溶液(feed solution)およびペプトンのような添加剤を加える。高い生産率は、本発明によるベクターを用いたときに得ることができる。
IgG1抗体およびIgG4抗体を発現させる。クローンを適当な培養培地で増殖させる。栄養溶液およびペプトンのような添加剤を加える。高い生産率は、本発明によるベクターを用いたときに得ることができる。
大規模なポリペプチドの製造は、例えば、ウェーブ、ガラス、ステンレス製のバイオリアクターで行われ得る。その目的のために細胞を増殖させ、それは、通常、単一の凍結バイアル、例えば、Master Cell Bankからのバイアルから開始される。細胞を融解させ、いくつかの工程を介して増殖させる。異なる規模のバイオリアクターに適当な量の細胞を植菌する。バイオリアクターに栄養溶液および添加剤を加えることにより、細胞密度を増加させることができる。長期間にわたって、細胞を高い生存率で維持する。数μg/lから数g/lの範囲内のリアクター内における生成物力価は、大規模で達成される。親和性、イオン交換、疎水性相互作用またはサイズ排除クロマトグラフィー工程を含み得る標準的なクロマトグラフィー方法により、精製を行うことができる。バイオリアクターのサイズは、最終規模で数千リットルまでであり得る(また、例えば、F. Wurm, Nature Biotechnology Vol. 22, 11, 2004, 1393-1398を参照のこと)。
目的の新規ポリペプチドを挿入するための複数の戦略のうち1つの戦略を下記する(pBW154のような配置を有するベクターを用いた例により説明される)。
軽鎖遺伝子を、ATGコドンの5'にMluI部位および遺伝子の3'にSalI部位を導入したプライマーでPCR増幅できる。PCR産物を、これらの2個の制限酵素によりpBW154に導入する。その結果、軽鎖のみからなる中間ベクターを生じる。
ベクターのATGコドンの5'のNruI部位および遺伝子の3'のXbaI部位を利用するために、平滑末端を導入するプライマーを用いて、重鎖遺伝子をPCR増幅できる。PCR産物を、これらの2個の制限酵素によりpBW154に導入する。その結果、前の軽鎖および新たな重鎖を有する中間ベクターを生じる。
新たなmAB-HCを含む断片を、SalI消化によりHCベクターから切り出す。次いで、該断片を、SalIによりLC中間ベクターに挿入し、最終的な新規LC-HCベクターを生じる。
Claims (26)
- 哺乳類細胞において少なくとも1個の目的ポリペプチドを発現させるのに適当なベクター核酸であって、
(a) 目的ポリペプチドを発現させるのに適当な少なくとも1個の発現カセット(POI);
(b) 哺乳類選択可能マーカー遺伝子を含む発現カセット(MSM);
(c) 哺乳類で増幅可能かつ選択可能なマーカー遺伝子を含む発現カセット(MASM);
を含み、発現カセット(POI)がその5'で発現カセット(MASM)と隣接しており、発現カセット(MSM)が発現カセット(POI)の3'に位置し、発現カセット(MASM)、(POI)および(MSM)が同じ5'から3'の方向で並んでいる、ベクター核酸。 - 発現カセット(POI)が目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載のベクター核酸。
- 環状であり、発現カセット(MSM)が発現カセット(POI)の3'に位置し、発現カセット(MASM)が発現カセット(MSM)の3'に位置する、請求項1または2に記載のベクター核酸。
- ベクターがベクターを直線化するための特定の直線化制限酵素部位を含み、該直線化制限酵素部位が発現カセット(MSM)と(MASM)の間に位置する、請求項3に記載のベクター核酸。
- 該発現カセット(MSM)が酵素学的に機能的なネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含み、該発現カセット(MASM)が酵素学的に機能的なジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)をコードする遺伝子を含む、少なくとも請求項1から4のいずれか1項に記載のベクター核酸。
- ベクターがさらなる目的ポリペプチドを発現させるための少なくとも1個のさらなる発現カセット(POI')を含み、さらなる発現カセット(POI')が発現カセット(POI)と発現カセット(MSM)の間に位置し、発現カセット(POI')が発現カセット(POI)および(MSM)と同じ5'から3'の方向で並んでいる、少なくとも請求項1から5のいずれか1項に記載のベクター核酸。
- 発現カセット(POI)および(POI')の各々において、免疫グロブリン分子の軽鎖もしくは重鎖またはその機能性断片をコードするポリヌクレオチドを含む、免疫グロブリン分子を発現させるための請求項6に記載のベクター核酸であって、発現カセット(POI)および(POI')の各々が該ポリヌクレオチドのうちの1個を含む、ベクター核酸。
- 該発現ベクターカセットがプロモーターおよび/または転写終結部位を含む、少なくとも請求項1から7のいずれか1項に記載のベクター核酸。
- 該発現カセットがエンハンサーおよび/またはイントロンを含む、少なくとも請求項1から8のいずれか1項に記載のベクター核酸。
- 発現カセット(POI)および/または所望により発現カセット(POI')がCMVプロモーター/エンハンサーを含み、および/または発現カセット(MSM)および(MASM)がSV40プロモーター/エンハンサーまたはSV40プロモーターを含む、請求項8または9に記載のベクター核酸。
- 少なくとも発現カセット(POI)がプロモーターと目的ポリペプチドを発現させるためのポリヌクレオチドの開始コドンの間に位置するイントロンを含む、請求項9または10に記載のベクター核酸。
- 発現カセット(MASM)が哺乳類で増幅可能かつ選択可能なマーカー遺伝子の3'に位置するイントロンを含む、少なくとも請求項9から11のいずれか1項に記載のベクター核酸。
- 原核生物選択可能マーカー遺伝子を含む少なくとも1個のさらなる発現カセット(PSM)を含み、該発現カセット(PSM)が発現カセット(MSM)と(MASM)の間に位置する、少なくとも請求項1から12のいずれか1項に記載のベクター核酸。
- 原核生物選択可能マーカー遺伝子が抗生物質耐性を提供し、該抗生物質が、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールからなる群から選択される、請求項13に記載のベクター核酸。
- DHFR遺伝子が、野生型DHFR、野生型DHFRと比較して減少したMTX感受性を有するDHFR変異体および野生型DHFRと比較して高められたMTX感受性を有するDHFR変異体からなる群から選択される、少なくとも請求項5から14のいずれか1項に記載のベクター核酸。
- 少なくとも請求項1から15のいずれか1項に記載のベクター核酸であって、発現ベクターが
(a) 示された配置で下記の遺伝学的要素を含む、環状もしくは直線状ベクター核酸(ここで、5'から3'の方向は、→で示される):
I. 発現カセット(MASM)のプロモーター(→)
II. 発現カセット(MASM)の哺乳類で増幅可能かつ選択可能なマーカーをコードする遺伝子(→)
III. 発現カセット(MASM)のイントロン(→)
IV. 発現カセット(MASM)のポリA部位(→)
V. 発現カセット(POI)のプロモーター(→)
VI. 発現カセット(POI)のイントロン(→)
VII. 発現カセット(POI)に挿入される目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(→)
VIII. 発現カセット(POI)のポリA部位(→)
IX. 発現カセット(POI')のプロモーター(→)
X. 発現カセット(POI')のイントロン(→)
XI. 発現カセット(POI')に挿入されるさらなる目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(→)
XII. 発現カセット(POI')のポリA部位(→)
XIII. 発現カセット(MSM)のプロモーター(→)
XIV. 発現カセット(MSM)の哺乳類選択可能マーカーをコードする遺伝子(→)
XV. 発現カセット(MSM)のポリA部位(→)
XVI. PSM発現カセット(→)または(←)
XVII. ベクター核酸が環状である場合の直線化制限酵素部位;
(b) 遺伝学的要素の同じ配置を含む、配列番号1または配列番号16で示されるベクター核酸またはその誘導体
からなる群から選択される、ベクター核酸。 - 少なくとも請求項1から16のいずれか1項に記載のベクター核酸を作製する方法であって、該方法が、少なくとも下記の遺伝学的要素:
(a) 目的ポリペプチドを発現させるための少なくとも1個の発現カセット(POI);
(b) 哺乳類選択可能マーカー遺伝子を含む発現カセット(MSM);
(c) 哺乳類で増幅可能かつ選択可能なマーカー遺伝子を含む発現カセット(MASM);
を並べることを含み、発現カセット(POI)がその5'で発現カセット(MASM)と隣接しており、発現カセット(MSM)が発現カセット(POI)の3'に位置し、発現カセット(MASM)、(POI)および(MSM)が同じ5'から3'の方向で並ぶようにする、方法。 - 発現カセット(MSM)が発現カセット(POI)の3'に位置し、発現カセット(MASM)が発現カセット(MSM)の3'に位置するように遺伝学的要素を並べることを含む、環状ベクター核酸を作製するための請求項17に記載の方法。
- 少なくとも請求項1から16のいずれか1項に記載のベクター核酸を含む、哺乳類宿主細胞。
- COP、L、C127、Sp2/0、NS-0、NS-1、NIH3T3、PC12、PC12h、BHKおよびCHO、COS1、COS3、COS7、CV1、Vero、HeLa、HEK-293、網膜由来PER-C6、2倍体線維芽細胞由来細胞、骨髄腫細胞ならびにHepG2からなる群から選択される、請求項19に記載の哺乳類宿主細胞。
- 宿主細胞に、少なくとも請求項1から16のいずれか1項に記載のベクター核酸を導入する、請求項19または20に記載の宿主細胞を作製する方法。
- 目的ポリペプチドの発現を可能にする条件下、細胞培養培地中で請求項19に記載の少なくとも1個の宿主細胞を培養することを含む、目的ポリペプチドを製造する方法。
- 該目的ポリペプチドが細胞培養培地中に分泌され、該細胞培養培地から単離される、請求項22に記載の方法。
- 目的ポリペプチドが免疫グロブリン分子またはその機能性断片である、請求項22または23に記載の方法。
- 少なくとも請求項22から24のいずれか1項に記載の方法により取得されるポリペプチド。
- 該ポリペプチドが免疫グロブリン分子またはその機能性断片である、請求項25に記載のポリペプチド。
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