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JP2010193888A - ミオスタチンを阻害する結合剤 - Google Patents

ミオスタチンを阻害する結合剤 Download PDF

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ハン，エイチキュー
Hosung Min
ミン，ホスング
Thomas Charles Boone
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Abstract

【課題】ミオスタチンに結合し、そしてその活性を阻害することが可能なペプチドを含む結合剤を提供する。
【解決手段】結合剤は、ポリマーまたはＦｃドメインなどの少なくとも１つのビヒクルに、直接または間接的に付着した、少なくとも１つのミオスタチン結合ペプチドを含む結合剤。前記結合剤を含有する、筋萎縮障害、並びに糖尿病および肥満を含む他の代謝障害を治療するのに有用な組成物。ミオスタチンを検出、測定ならびに、ミオスタチンに関連する障害を診断する方法。
【選択図】なし

Description

本出願は、その全開示が信頼され、そして本明細書に援用される、米国仮出願第６０／４３５，９２３号、２００２年１２月２０日出願の優先権を請求する。
発明の分野
本発明は、増殖因子に関し、そして特に、増殖因子ミオスタチン、およびミオスタチンに結合し、そしてその活性を阻害する剤に関する。
背景
増殖／分化因子８（ＧＤＦ−８）としても知られるミオスタチンは、骨格筋量制御に関与することが知られるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）ファミリーメンバーである。ＴＧＦ−β−ＧＤＦファミリーのメンバーの大部分は、多くの組織種で非特異的に発現され、そして多様な多指向性作用を発揮する。しかし、ミオスタチンは、主に、発生中の骨格筋組織細胞および成人骨格筋組織細胞で発現され、そして骨格筋増殖を負に制御するのに必須の役割を果たす（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら， Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３８７， ８３−９０（１９９７））。しかし、最近の研究によって、心臓、脂肪および前脂肪組織では、低レベルのミオスタチン発現が測定可能であることが示されている。
ミオスタチン・タンパク質は、進化的に非常に保存されている（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４：１２４５７−１２４６１（１９９７））。ミオスタチンの生物学的に活性であるＣ末端領域は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ニワトリ、および七面鳥配列間で１００パーセントの配列同一性を有する。ミオスタチン機能もまた、種間で保存されているようである。これは、ミオスタチン遺伝子に突然変異を有する動物の表現型から明らかである。ウシの２品種、ベルジャン・ブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ Ｂｌｕｅ）（Ｈａｎｓｅｔ Ｒ．， Ｍｕｓｃｌｅ Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ Ｕｓｅ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｂｅｅｆ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｋｉｎｇ， Ｊ．Ｗ．Ｇ． ＆ Ｍｅｎｉｓｓｉｅｒ， Ｆ．監修（Ｎｉｊｈｏｆｆ， Ｔｈｅ Ｈａｇｕｅ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）ｐｐ．４３７−４４９）およびピエモンテ（Ｐｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅ）（Ｍａｓｏｅｒｏ， Ｇ．
＆ Ｐｏｕｊａｒｄｉｅｕ， Ｂ， Ｍｕｓｃｌｅ Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ Ｕｓｅ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｂｅｅｆ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｋｉｎｇ， Ｊ．Ｗ．Ｇ． ＆ Ｍｅｎｉｓｓｉｅｒ，
Ｆ．監修（Ｎｉｊｈｏｆｆ， Ｔｈｅ Ｈａｇｕｅ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）ｐｐ．４５０−４５９）は、「筋肉倍増（ｄｏｕｂｌｅ ｍｕｓｃｌｉｎｇ）」表現型および筋量増加によって特徴付けられる。これらの品種は、ミオスタチン遺伝子のコード領域に突然変異を含有することが示された（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）上記）。さらに、ミオスタチンをコードする遺伝子（Ｍｓｔｎ）をターゲットとした欠失を含有するマウスは、筋量の劇的な増加を示し、これには相応する脂肪の増加が伴わない。Ｍｓｔｎ−／−マウスの個々の筋肉の重量は、筋線維肥大および過形成の結果、対照動物のもののおよそ１００〜２００パーセントである（Ｚｉｍｍｅｒｓら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６， １４８６（２００２））。
特定の系統のマウスにミオスタチンを投与すると、例えば癌、ＡＩＤＳ、および筋ジストロフィーに関連して見出される筋萎縮障害に似た状態が生じることが示された。ミオスタチンを産生するＣＨＯ細胞として、胸腺欠損ヌードマウスにミオスタチンを投与すると、高い度合いの体重減少を伴う萎縮効果が生じ、脂肪萎縮および重度の低血糖症に加えて
、５０％もの骨格筋量減少が生じた（Ｚｉｍｍｅｒｓら、上記）。
ミオスタチンの減少は、加齢とともに、筋量の保持および脂肪集積の減少を生じるようである。Ｍｓｔｎ−／−成体ノックアウトマウスと比較した際の、Ｍｓｔｎ＋／＋の脂肪量および筋量の比較によって決定されるように、年齢に関連する脂肪組織量の増加および筋量の減少は、ミオスタチンレベルに比例することが示された（ＭｃＦｅｒｒｏｎら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ １０９， ５９５（２００２））。Ｍｓｔｎ−／−マウスは、Ｍｓｔｎ＋／＋マウスと比較して、年齢とともに集積される脂肪の減少を示した。
さらに、ミオスタチンは血液グルコースレベルを維持するのにも役割を果たしうるし、そして特定の糖尿病症例の発展に影響を及ぼしうる。例えば、インスリンが刺激するグルコース取り込みに対する骨格筋耐性が、インスリン非依存性（２型）糖尿病で知られる最初の徴候であることが知られる（Ｃｏｒｒｅｇａｎら， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８：１６８２（１９９１））。現在、ミオスタチンの欠損が、２つのマウスモデル、アグチ致死イエロー（Ａｙ）（Ｙｅｎら， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ８：４７９（１９９４））、およびｏｂｅｓｅ（Ｌｅｐｏｂ／ｏｂ）の肥満および糖尿病表現型を部分的に減弱させることが示されている。Ａｙ／ａ、Ｍｓｔｎ−／−二重突然変異体マウスでは、Ａｙ／ａ、Ｍｓｔｎ＋／＋マウスと比較して、脂肪集積および総体重が劇的に減少した（ＭｃＦｅｒｒｏｎら（２００２）上記）。さらに、Ａｙ／ａ、Ｍｓｔｎ−／−マウスでは、外因性グルコース負荷後、Ａｙ／ａＭｓｔｎ＋／＋マウスよりも血糖グルコースレベルが劇的に低く、ミオスタチンの欠損がグルコース代謝を改善することが示された。同様に、Ｌｅｐｏｂ／ｏｂＭｓｔｎ−／−マウスは、Ｌｅｐｏｂ／ｏｂＭｓｔｎ＋／＋表現型に比較した際、脂肪集積の減少を示した。
したがって、過剰発現動物およびノックアウト動物の表現型から、ミオスタチンが、筋萎縮、糖尿病、肥満および高血糖を生じる障害を含む、いくつかの代謝障害に寄与する役割を果たしうる、考慮すべき証拠がある。
発明の概要
本発明は、ミオスタチンに結合し、そしてその活性を阻害する結合剤に関する。結合剤は、ミオスタチンに結合可能な少なくとも１つのペプチドを含む。ミオスタチン結合ペプチドは、好ましくは、長さ約５〜約５０アミノ酸の間、より好ましくは、長さ約１０〜３０アミノ酸の間、そして最も好ましくは、長さ約１０〜２５アミノ酸の間である。１つの態様において、ミオスタチン結合ペプチドは、アミノ酸配列ＷＭＣＰＰ（配列番号６３３）を含む。別の態様において、ミオスタチン結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｃａ１ａ２ Ｗａ３ ＷＭＣＰＰ（配列番号３５２）を含み、ここでａ１、ａ２およびａ３は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸から選択される。別の態様において、ミオスタチン結合ペプチドは、配列Ｃｂ１ｂ２ Ｗｂ３ ＷＭＣＰＰ（配列番号３５３）、ここでｂ１は、アミノ酸Ｔ、Ｉ、またはＲのいずれか１つから選択され；ｂ２は、Ｒ、Ｓ、Ｑのいずれか１つから選択され；ｂ３は、Ｐ、ＲおよびＱのいずれか１つから選択される、を含み、そしてその長さが１０〜５０アミノ酸の間である、前記ペプチド、およびその生理学的に許容しうる塩である。別の態様において、ミオスタチン結合ペプチドは、式：
ｃ１ｃ２ｃ３ｃ４ｃ５ｃ６ Ｃｃ７ｃ８ Ｗｃ９ ＷＭＣＰＰｃ１０ｃ１１ｃ１２ｃ１３（配列番号３５４）、式中：
ｃ１は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
ｃ２は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｃ３は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｃ４は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
ｃ５は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｃ６は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは塩基性アミノ酸であり；
ｃ７は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸であり；
ｃ８は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸であり；
ｃ９は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸であり；そして
ｃ１０〜ｃ１３は、アミノ酸いずれかである
を含み；そしてその長さが２０〜５０アミノ酸の間である、前記ペプチド、およびその生理学的に許容しうる塩である。
関連する態様において、ミオスタチン結合可能ペプチドは、式：
ｄ１ｄ２ｄ３ｄ４ｄ５ｄ６ Ｃｄ７ｄ８ Ｗｄ９ ＷＭＣＰＰｄ１０ｄ１１ｄ１２ｄ１３（配列番号３５５）、式中
ｄ１は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
ｄ２は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｄ３は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｄ４は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
ｄ５は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｄ６は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは塩基性アミノ酸であり；
ｄ７は、アミノ酸Ｔ、Ｉ、またはＲのいずれか１つから選択され；
ｄ８は、Ｒ、Ｓ、Ｑのいずれか１つから選択され；
ｄ９は、Ｐ、ＲおよびＱのいずれか１つから選択され；そして
ｄ１０〜ｄ１３は、アミノ酸いずれかから選択される
を含み、そしてその長さが２０〜５０アミノ酸の間である、前記ペプチド、およびその生理学的に許容しうる塩である。
結合剤のさらなる態様は、少なくとも１つの以下のペプチド：
（１）配列ＷＹｅ１ｅ２ Ｙｅ３ Ｇ（配列番号３５６）
ここでｅ１は、Ｐ、ＳまたはＹであり、
ｅ２は、ＣまたはＱであり、そして
ｅ３は、ＧまたはＨである、を含み、そしてその長さが７〜５０アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、およびその生理学的に許容しうる塩；
（２）配列ｆ１ ＥＭＬｆ２ ＳＬｆ３ｆ４ ＬＬ（配列番号４５５）、
ここでｆ１は、ＭまたはＩであり、
ｆ２は、アミノ酸いずれかであり、
ｆ３は、ＬまたはＦであり、
ｆ４は、Ｅ、ＱまたはＤである
を含み；そしてその長さが７〜５０アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、およびその生理学的に許容しうる塩；
（３）配列Ｌｇ１ｇ２ ＬＬｇ３ｇ４ Ｌ（配列番号４５６）、ここで
ｇ１は、Ｑ、ＤまたはＥであり、
ｇ２は、Ｓ、Ｑ、ＤまたはＥであり、
ｇ３は、アミノ酸いずれかであり、
ｇ４は、Ｌ、Ｗ、Ｆ、またはＹである、を含み、そしてその長さが８〜５０アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、およびその生理学的に許容しうる塩；
（４）配列ｈ１ｈ２ｈ３ｈ４ｈ５ｈ６ｈ７ｈ８ｈ９（配列番号４５７）、ここで
ｈ１は、ＲまたはＤであり、
ｈ２は、アミノ酸いずれかであり、
ｈ３は、Ａ、Ｔ、ＳまたはＱであり、
ｈ４は、ＬまたはＭであり、
ｈ５は、ＬまたはＳであり、
ｈ６は、アミノ酸いずれかであり、
ｈ７は、ＦまたはＥであり、
ｈ８は、Ｗ、ＦまたはＣであり、
ｈ９は、Ｌ、Ｆ、ＭまたはＫである、を含み、そしてその長さが９〜５０アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、およびその生理学的に許容しうる塩
を含む。
１つの態様において、本発明の結合剤は、ポリマーまたはＦｃドメインなどの少なくとも１つのビヒクルをさらに含み、そして少なくとも１つのリンカー配列をさらに含むことも可能である。この態様において、本発明の結合剤は、少なくとも１つのミオスタチン結合ペプチドが、少なくとも１つのビヒクルに付着するように構築される。単数または複数のペプチドが直接、またはリンカー配列を介して間接的に、ペプチドのＮ末端、Ｃ末端またはアミノ酸側鎖で、ビヒクルに付着される。この態様において、本発明の結合剤は、以下の一般化された構造：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ、またはその多量体；
ここでＦ１はビヒクルであり；そしてＸ１およびＸ２は、各々独立に
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；
および−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４
ここでＰ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり；そして
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、各々リンカーであり；そしてａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆは、各々独立に０または１である、但しａおよびｂの少なくとも１つは１である
から選択される
を有し、そしてその生理学的に許容しうる塩である。
この一般化された構造を有する結合剤の多様な態様において、ペプチドＰ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４は、上に提供される配列を含むペプチドのいずれか１以上から独立に選択されることも可能である。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４は、以下の配列：配列番号６３３、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号４５５、配列番号４５６、または配列番号４５７のいずれかを含む１以上のペプチドから独立に選択される。
さらなる態様において、結合剤は、直接または間接的にＦｃドメインに融合し、それによってペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ）を提供するペプチドを含む。本発明のペプチボディは、ミオスタチンに高い結合アフィニティーを示し、そして細胞に基づくアッセイを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏおよび動物の両方で立証されるように、ミオスタチンの活性を阻害可能である。
本発明はまた、本発明のペプチド、ペプチボディ、並びにペプチドおよびペプチボディ変異体および誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子も提供する。
本発明は、本発明の結合剤を１以上含む、薬学的に許容しうる組成物を提供する。
本発明の結合剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでミオスタチン活性を阻害する。本発明の結合剤は、処置した動物において除脂肪（ｌｅａｎ）筋量を増加させ、そして動物体重の割合としての脂肪量を減少させる。本発明のミオスタチン結合剤は、処置
した動物モデルにおいて筋力を増加させる。
本発明は、被験者に１以上の結合剤の有効投薬量を投与することによって、ヒトを含む動物において、ミオスタチン活性を阻害する方法を提供する。本発明は、１以上の結合剤の有効投薬量を投与することによって、ヒトを含む動物において、除脂肪筋肉量を増加させる方法を提供する。本発明は、被験者に、薬学的に許容しうる組成物中、１以上のミオスタチン結合剤の療法的に有効な投薬量を投与することによって、ミオスタチン関連障害を治療する方法をさらに提供する。本発明は、筋ジストロフィーを含む筋萎縮障害、癌、ＡＩＤＳ、関節リウマチ、腎不全、尿毒症、慢性心不全、年齢に関連するサルコペニア、長期間の絶対安静、脊椎傷害、脳卒中、骨折による筋萎縮を治療する方法を提供する。本発明はまた、肥満、糖尿病、高血糖、および骨減少を含む代謝障害を治療する方法も提供する。
本発明はまた、動物に１以上のミオスタチン結合剤の有効投薬量を投与することによって、食用動物における筋量を増加させる方法も提供する。
本発明は、１以上のミオスタチン結合剤を利用して、試料中のミオスタチンを同定し、そして定量化するアッセイを提供する。このアッセイは、ミオスタチン関連障害または疾患を持つ個体において、ミオスタチンレベルを測定するかまたは監視する診断アッセイであることも可能である。
発明の詳細な説明
本発明は、ミオスタチンに結合可能であり、そしてその活性を阻害可能である、結合剤を提供する。ミオスタチン結合剤は、動物において、ミオスタチンレベルを同定するか、定量化するか、または監視するアッセイに使用可能である。本発明のミオスタチン結合剤はミオスタチン活性を減少させる。本発明のミオスタチン結合剤は、動物において除脂肪筋量を増加させ、体重の割合としての脂肪量を減少させ、そして筋力を増加させる。本発明のミオスタチン結合剤を用いて、被験者に、薬学的に許容しうる組成物中、１以上の結合剤の療法投薬量を投与することによって、筋ジストロフィーなどの筋萎縮障害、癌、ＡＩＤＳ、関節リウマチ、腎不全、尿毒症、慢性心不全、長期間の絶対安静、脊椎傷害、脳卒中、および加齢に関連するサルコペニアによる筋萎縮とともに、糖尿病、肥満、高血糖、および骨減少を含む、他の代謝障害を含む、ミオスタチンが役割を果たす多様な代謝障害を治療することも可能である。
ミオスタチン
ミオスタチンは、ＧＤＦ−８としても知られる増殖因子であり、骨格筋組織の負の制御因子であることが知られる。ミオスタチンは、不活性プレプロタンパク質として合成され、タンパク質分解的切断によって活性化される（Ｚｉｍｍｅｒｓら、上記（２００２））。前駆体タンパク質が切断されて、ＮＨ２末端不活性プロドメイン、および約２５ｋＤａのホモ二量体の形である成熟活性型のおよそ１０９アミノ酸のＣＯＯＨ末端タンパク質が生じる（Ｚｉｍｍｅｒｓら、上記（２００２））。現在、成熟二量体は、プロペプチドに結合した不活性不顕性複合体として血液中で循環すると考えられている（Ｚｉｍｍｅｒｓら、上記（２００２））。
本明細書において、用語「全長ミオスタチン」は、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、上記（１９９７）に記載される全長ヒト・プレプロタンパク質配列とともに、やはりＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）に記載される、アレル変異体および種間相同体を含む、関連全長ポリペプチドを指す。本明細書において、用語「プロドメイン」または「プロペプチド」は、切断されて活性ＣＯＯＨ末端タンパク質を放出する、不活性ＮＨ２末端タンパク質を指す。本明細書において、用語「ミオスタチン」または「成熟ミオスタチン」は、単量体、二量体、多量体型または他の型の、生物学的に活性である成熟ＣＯＯＨ末端ポリペプチドを
指す。「ミオスタチン」または「成熟ミオスタチン」はまた、生物学的に活性な成熟ミオスタチンの断片とともに、アレル変異体、スプライス変異体、並びに融合ペプチドおよびポリペプチドを含む、関連ポリペプチドも指す。成熟ミオスタチンＣＯＯＨ末端タンパク質は、ヒト、マウス、ニワトリ、ブタ、七面鳥、およびラットを含む多くの種間で１００％配列同一性を有すると報告されている（Ｌｅｅら， ＰＮＡＳ ９８， ９３０６（２００１））。ミオスタチンは、どのように調製されたかに応じて、ターゲティング配列などのさらなる末端残基、またはメチオニン残基およびリジン残基、並びに／あるいはタグまたは融合タンパク質配列を含むことも、また含まないことも可能である。
本明細書において、用語「ミオスタチンに結合可能な」または「ミオスタチンに結合アフィニティーを有する」は、以下の実施例に記載するファージＥＬＩＳＡアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）またはＫｉｎＥｘＡＴＭアッセイによって立証されるような、ミオスタチンに結合する結合剤またはペプチドを指す。
本明細書において、用語「ミオスタチン活性を修飾可能」は、ミオスタチンの少なくとも１つの生物学的活性に関するアゴニストまたはアンタゴニストいずれかとしての剤の作用を指す。本明細書において、「アゴニスト」または「模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃ）」活性は、例えば本明細書に援用される国際出願ＷＯ ０１／８３５２５、２００１年５月２日出願に記載されるように、目的のタンパク質と相互作用するタンパク質に匹敵する生物学的活性を有する剤を指す。
本明細書において、用語「ミオスタチン活性を阻害する」または「アンタゴニスト活性を有する」は、例えばｐＭＡＲＥ Ｃ２Ｃ１２細胞に基づくミオスタチン活性アッセイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、または以下に記載するようなｉｎ ｖｉｖｏ動物試験によって立証されるように、ペプチドまたは結合剤が、ミオスタチン活性またはシグナル伝達を減少させるかまたは遮断する能力を指す。
ミオスタチン結合剤の構造
１つの態様において、本発明の結合剤は、ポリマーまたはＦｃドメインなどの少なくとも１つのビヒクルに共有結合した、少なくとも１つのミオスタチン結合ペプチドを含む。ミオスタチン結合ペプチドを少なくとも１つのビヒクルに付着させて、剤の生物学的活性を増加させ、そして／またはｉｎ ｖｉｖｏでの分解を減少させ、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増加させ、ｉｎ ｖｉｖｏでの毒性または免疫原性を減少させることによって、療法剤としての結合剤の有効性を増加させることを意図する。本発明の結合剤は、ペプチドおよびビヒクルを連結するリンカー配列をさらに含むことも可能である。単数または複数のペプチドが直接、またはリンカー配列を介して間接的に、ペプチドのＮ末端、Ｃ末端またはアミノ酸側鎖で、ビヒクルに付着される。この態様において、本発明の結合剤は、以下の構造：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ、またはその多量体；
ここでＦ１はビヒクルであり；そしてＸ１およびＸ２は、各々独立に
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；
および−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４
ここでＰ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり；そして
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、各々リンカーであり；そしてａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆは、各々独立に０または１である、但しａおよびｂの少なくとも１つは１である
から選択される
を有する。
システイニル残基を含有するペプチドはいずれも、別のＣｙｓ含有ペプチドと架橋されることも可能であり、これらのいずれかまたは両方がビヒクルに連結されることも可能である。１より多いＣｙｓ残基を有するペプチドはいずれも、ペプチド内ジスルフィド結合を形成することもまた、可能である。
１つの態様において、ビヒクルは以下に定義するＦｃドメインである。この態様は、「ペプチボディ」と称される。本明細書において、用語「ペプチボディ」は、少なくとも１つのペプチドに付着した抗体Ｆｃドメインを含む分子を指す。ペプチボディの産生は、本明細書に援用されるＰＣＴ公報ＷＯ ００／２４７８２、２０００年５月４日公開に一般的に記載される。典型的なペプチボディは、以下の実施例に記載するように、それぞれ、１コピーおよび２コピーのペプチド（タンデムに付着される）を用いて、１ｘおよび２ｘの立体配置として提供される。
ペプチド
本明細書において、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結される約５〜約９０アミノ酸の分子を指す。本発明のペプチドは、好ましくは、長さ約５〜約５０アミノ酸の間、より好ましくは、長さ約１０〜３０アミノ酸の間、そして最も好ましくは、長さ約１０〜２５アミノ酸の間であり、そしてミオスタチン・タンパク質に結合することが可能である。
本発明のペプチドは、天然存在タンパク質配列の部分を含むことも可能であり、天然存在タンパク質由来のランダム化配列であることも可能であり、または完全にランダム化配列であることも可能である。本発明のペプチドは、化学合成、タンパク質の消化、または組換え技術を含む、当該技術分野に知られる方法いずれかによって生成可能である。ミオスタチンに結合可能なペプチドを生成するには、ファージディスプレイおよびＲＮＡ−ペプチド・スクリーニング、および他のアフィニティースクリーニング技術が特に有用である。
ファージディスプレイ技術は、例えば、各々、本明細書に援用される、Ｓｃｏｔｔら，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４（１９９０）；米国特許第５，２２３，４０９号、１９９３年６月２９日発行；米国特許第５，７３３，７３１号、１９９８年３月３１日発行；米国特許第５，４９８，５３０号、１９９６年３月１２日発行；米国特許第５，４３２，０１８号、１９９５年７月１１日発行；米国特許第５，３３８，６６５号、１９９４年８月１６日発行；米国特許第５，９２２，５４５号、１９９９年７月１３日発行；ＷＯ ９６／４０９８７、１９９６年１２月１９日公開；およびＷＯ ９８／１５８３３、１９９８年４月１６日公開に記載される。ファージライブラリーを用いて、繊維状ファージのコートタンパク質との融合によって、ランダムペプチド配列をディスプレイする。典型的には、ディスプレイされたペプチドは、ターゲット分子に対して特異的にまたは非特異的にアフィニティー溶出される。保持されたファージを、アフィニティー精製および再増殖の連続周期によって濃縮することも可能である。例えば以下に記載するファージＥＬＩＳＡを用い、そして次いで配列決定することによって、さらなる解析のために、最適結合ペプチドを選択する。場合によって、突然変異誘発ライブラリーを生成して、そしてスクリーニングし、最適結合剤の配列をさらに最適化することも可能である（Ｌｏｗｍａｎ， Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ ２６：４０１−２４（１９９７））。
ミオスタチン結合ペプチドを生成する他の方法には、当該技術分野に知られるさらなるアフィニティー選択技術が含まれる。ペプチドライブラリーをｌａｃリプレッサーのカルボキシル末端で融合させて、そして大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）で発現させることも可能で
ある。大腸菌に基づく別の方法は、ペプチドグリカン会合リポタンパク質（ＰＡＬ）との融合によって、細胞の外膜上でのディスプレイを可能にする。本明細書において、これ以降、これらの方法および関連法を、まとめて「大腸菌ディスプレイ」と称する。別の方法において、リボソーム放出前にランダムＲＮＡの翻訳を停止して、会合するＲＮＡがまだ付着したポリペプチドのライブラリーを生じる。本明細書において、これ以降、これらの方法および関連法を、まとめて「リボソーム・ディスプレイ」と称する。他の方法は、ＲＮＡに対するペプチドの化学的連結を使用する。例えば、ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９４：１２２９７−３０３（１９９７）を参照されたい。本明細書において、これ以降、これらの方法および関連法を、まとめて「ＲＮＡ−ペプチド・スクリーニング」と称する。酵母２ハイブリッドスクリーニング法もまた、ミオスタチンに結合する本発明のペプチドを同定するのに使用可能である。さらに、化学的に得られるペプチドライブラリーが開発されてきており、該ライブラリーでは、ペプチドは安定な非生物学的物質、例えばポリエチレン・ロッドまたは溶媒浸透性樹脂上に固定されている。別の化学的に得られるペプチドライブラリーは、フォトリソグラフィーを用いて、ガラススライド上に固定されたペプチドをスキャンする。本明細書において、これ以降、これらの方法および関連法を、まとめて「化学的ペプチド・スクリーニング」と称する。化学的ペプチド・スクリーニングは、Ｄ−アミノ酸および他の類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）とともに、非ペプチド要素の使用を可能にする点で好適でありうる。生物学的方法および化学的方法はどちらも、ＷｅｌｌｓおよびＬｏｗｍａｎ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３：３５５−６２（１９９２）に概説される。
さらに、ミオスタチンに結合可能な選択されたペプチドを、「合理的設計」の使用を通じて、さらに改善することも可能である。このアプローチでは、ペプチド配列に段階的な変化を作成し、そして、ペプチドの結合アフィニティーまたは特異性、あるいはペプチドの何らかの他の特性に対する置換の影響を、適切なアッセイで観察する。この技術の一例は、一度に１つの残基をアラニンで置換する、「アラニン・ウォーク」または「アラニン・スキャン」と称されるものである。２つの残基を置換する場合は、「二重アラニン・ウォーク」と称される。生じたペプチドはアミノ酸置換を含有し、このペプチドを、活性増進または何らかのさらなる好適な特性に関して試験する。
さらに、タンパク質−タンパク質相互作用の構造解析を用いて、より大きいタンパク質の相互作用を模倣するペプチドを示唆することも可能である。こうした解析において、タンパク質の結晶構造は、タンパク質の非常に重要な残基の同一性および相対的な配向を示唆することも可能であり、この結晶構造からペプチドを設計することも可能である。例えば、Ｔａｋａｓａｋｉら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １５：１２６６（１９７７）を参照されたい。これらの方法を用いて、ターゲットとされるタンパク質、およびファージディスプレイまたは他のアフィニティー選択法によって選択されたペプチドの間の相互作用を調べ、それによって、結合アフィニティーおよび該ペプチドが該タンパク質の活性を阻害する能力を増加させる、ペプチドのさらなる修飾を示唆することもまた、可能である。
１つの態様において、本発明のペプチドは、関連ペプチドのファミリーとして生成される。典型的なペプチドは、配列番号１〜１３２に代表される。これらの典型的なペプチドは、選択法を通じて得られたものであり、該選択法では、本明細書に記載するようなファージディスプレイ技術などのアフィニティー選択技術によって、ファージディスプレイ技術により生成された最適結合剤をファージＥＬＩＳＡでさらに解析して、候補ペプチドを得た。しかしながら、本発明のペプチドは、以下に記載するように、化学合成を含むあらゆる公知の方法により製造してもよい。
本発明のペプチドは、「アフィニティー成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」のプロセスによってさらに改善可能である。この方法は、ファージディスプレイまたは他の選択技術を用いて、本発明のペプチドおよびペプチボディのアフィニティーまたは活性を増加させることに関する。例えば、コンセンサス配列に基づいて、「コア」アミノ酸（コンセンサス配列から決定される）が一定に保持されるかまたはその発生頻度が偏向した（ｂｉａｓｅｄ）定方向（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）二次ファージディスプレイ・ライブラリーを生成することも可能である。あるいは、個々のペプチド配列を用いて、偏向定方向ファージディスプレイ・ライブラリーを生成することも可能である。よりストリンジェントな条件下で、こうしたライブラリーをパニングすると、ミオスタチンへの増進した結合、ミオスタチンへの選択的結合、または何らかのさらなる望ましい特性を持つペプチドを生じることも可能である。しかし、次いで、化学的合成または組換え的を含む、いかなる数の既知の方法によって、アフィニティー成熟配列を有するペプチドを生じることも可能である。これらのペプチドを用いて、細胞に基づくアッセイおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて、より高い阻害活性を示す、多様な立体配置のペプチボディなどの結合剤を生成する。
以下の実施例６は、アフィニティー成熟ペプチドを生じるための、上述の「第１周期」ペプチドのアフィニティー成熟を記載する。典型的なアフィニティー成熟ペプチボディを表ＩＶおよびＶに提示する。次いで、これらのペプチドから作成されて生じた１ｘおよび２ｘペプチボディを、結合アフィニティー、ミオスタチン活性を中和する能力、他のＴＮＦβファミリーメンバーと対照的なミオスタチンに対する特異性、並びに以下に記載するようなさらなるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ活性に関して、さらに性質決定した。アフィニティー成熟ペプチドおよびペプチボディは、同じファミリーの第１周期ペプチドと区別するため、ファミリー名の前に接頭辞「ｍ」を付けて称される。
本発明にしたがったさらなるアフィニティー成熟のために選択される、典型的な第１周期ペプチドには、以下のペプチドが含まれた：ＴＮ８−１９ ＱＧＨＣＴＲＷＰＷＭＣＰＰＹ（配列番号３３）、および直鎖ペプチド、直鎖−２ ＭＥＭＬＤＳＬＦＥＬＬＫＤＭＶＰＩＳＫＡ（配列番号１０４）、直鎖−１５ ＨＨＧＷＮＹＬＲＫＧＳＡＰＱＷＦＥＡＷＶ（配列番号１１７）、直鎖−１７ ＲＡＴＬＬＫＤＦＷＱＬＶＥＧＹＧＤＮ（配列番号１１９）、直鎖−２０ ＹＲＥＭＳＭＬＥＧＬＬＤＶＬＥＲＬＱＨＹ（配列番号１２２）、直鎖−２１ ＨＮＳＳＱＭＬＬＳＥＬＩＭＬＶＧＳＭＭＱ（配列番号１２３）、直鎖−２４ ＥＦＦＨＷＬＨＮＨＲＳＥＶＮＨＷＬＤＭＮ（配列番号１２６）。これら各々のアフィニティー成熟ファミリーを以下の表ＩＶおよびＶに提示する。
本発明のペプチドはまた、ミオスタチンに結合可能な選択したペプチドの変異体および誘導体も含む。本明細書において、用語「変異体」は、元来のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が挿入されたか、欠失されたか、または置換され、そしてなおミオスタチンに結合可能なペプチドを指す。挿入変異体および置換変異体は、天然アミノ酸とともに、非天然存在アミノ酸を含有することも可能である。本明細書において、用語「変異体」には、ミオスタチンに結合する能力をなお保持するペプチド断片が含まれる。本明細書において、用語「誘導体」は、挿入変異体、欠失変異体、および置換変異体と何らかの点で別個に、化学的に修飾されたペプチドを指す。本発明のペプチドおよびペプチボディの変異体および誘導体を以下により完全に記載する。
ビヒクル
本明細書において、用語「ビヒクル」は、本発明の１以上のペプチドに付着することも可能な分子を指す。好ましくは、ビヒクルは、本発明の結合剤に少なくとも１つの望ましい特性を与える。ペプチドは、単独では、腎ろ過、細網内皮系における細胞性クリアランス機構、またはタンパク質分解的分解によって、ｉｎ ｖｉｖｏで除去される可能性があ
る。ビヒクルへの付着は、結合剤の分解を減少させ、そして／または半減期を増加させ、毒性を減少させ、免疫原性を減少させ、そして／または結合剤の生物学的活性を増加させることによって、結合剤の療法的価値を改善する。
典型的なビヒクルには、Ｆｃドメイン；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリジン、デキストランなどの直鎖ポリマー；分枝鎖ポリマー（例えばＤｅｎｋｅｎｗａｌｔｅｒらに対する米国特許第４，２８９，８７２号、１９８１年９月１５日発行；Ｔａｍに対する米国特許第５，２２９，４９０号、１９９３年７月２０日発行；ＦｒｅｃｈｅｔらによるＷＯ９３／２１２５９、１９９３年１０月２８日公開を参照されたい）；脂質；コレステロール基（ステロイドなど）；炭水化物またはオリゴ糖；あるいはサルベージ受容体に結合する天然または合成タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドいずれかが含まれる。
１つの態様において、本発明のミオスタチン結合剤は、ペプチド（単数または複数）のＮ末端、Ｃ末端またはアミノ酸残基の１つの側鎖を通じて、少なくとも１つのビヒクル（Ｆ１、Ｆ２）に付着した少なくとも１つのペプチドを有する。多数のビヒクルもまた使用可能であり；例えば各末端にＦｃドメインが、または１つの末端にＦｃドメインが、そしてもう一方の末端もしくは側鎖にＰＥＧ基が付着することも可能である。
Ｆｃドメインは１つの好ましいビヒクルである。本明細書において、用語「Ｆｃドメイン」は、天然ＦｃおよびＦｃ変異体分子、並びに以下に定義するような配列を含む。本明細書において、用語「天然Ｆｃ」は、組換えＤＮＡ技術によって、または損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって産生される、抗体の非抗原結合断片、またはその断片のアミノ酸配列を指す。好ましいＦｃは、完全ヒトＦｃであり、そしてＩｇＧ１およびＩｇＧ２などの免疫グロブリンいずれに由来することも可能である。しかし、部分的にヒトであるか、または非ヒト種に由来するＦｃ分子もまた、本明細書に含まれる。天然Ｆｃ分子は、共有結合（すなわちジスルフィド結合）および非共有結合によって二量体型または三量体型に連結されることも可能な、単量体ポリペプチドで構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）またはサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて、１〜４の範囲である。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９８２）， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １０：４０７１−９を参照されたい）。用語「天然Ｆｃ」は、本明細書において、単量体型、二量体型、および多量体型を指すように用いられる。
本明細書において、用語「Ｆｃ変異体」は、例えばどちらも本明細書に援用されるＷＯ
９７／３４６３１およびＷＯ ９６／３２４７８に記載されるような、サルベージ受容体への結合が維持されるという条件付きの天然Ｆｃ配列の修飾型を指す。Ｆｃ変異体は、例えば、残基を置換するかまたは欠失させるか、残基を挿入するか、あるいは該部位を含有する部分を一部切除する（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ）ことによって、構築可能である。挿入残基または置換残基はまた、ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）またはＤ−アミノ酸などの改変されたアミノ酸であることも可能である。Ｆｃ変異体は、いくつかの理由で望ましい可能性があり、理由のいくつかを以下に記載する。典型的なＦｃ変異体には、以下の分子および配列が含まれる：
１．ジスルフィド結合形成に関与する部位が除去されている。こうした除去によって、本発明の分子を産生するのに用いる宿主細胞に存在する、他のシステイン含有タンパク質との反応が回避可能である。この目的のため、Ｎ末端のシステイン含有セグメントを一部切除することも可能であるし、あるいはシステイン残基を欠失させるか、または他のアミノ酸（例えばアラニル、セリル）で置換することも可能である。システイン残基を除去す
る場合であっても、一本鎖Ｆｃドメインはなお、非共有的に一緒に保持される二量体Ｆｃドメインを形成することも可能である。
２．選択した宿主細胞に、より適合するように、天然Ｆｃが修飾されている。例えば、典型的な天然ＦｃのＮ末端近傍に位置し、プロリン・イミノペプチダーゼなどの大腸菌の消化酵素に認識されうる、ＰＡ配列を除去することも可能である。分子が大腸菌などの細菌細胞で組換え的に発現される場合は特に、Ｎ末端メチオニル残基を付加することも可能である。
３．選択した宿主細胞で発現した際、Ｎ末端が不均一になるのを防止するため、天然ＦｃのＮ末端部分が除去されている。この目的のため、Ｎ末端の最初の２０アミノ酸残基のいずれか、特に１位、２位、３位、４位および５位のものを欠失させることも可能である。
４．１以上のグリコシル化部位が除去されている。典型的にグリコシル化される残基（例えばアスパラギン）は、細胞溶解反応を与えうる。こうした残基を欠失させるか、または非グリコシル化残基（例えばアラニン）で置換することも可能である。
５．補体との相互作用に関与する部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されている。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失させるかまたは置換することも可能である。本発明の分子には、補体補充は好適でない可能性もあり、そしてしたがってこうしたＦｃ変異体を用いて、これを回避することも可能である。
６．サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合に影響を及ぼす部位が除去されている。天然Ｆｃは、特定の白血球と相互作用するための部位を有する可能性があり、こうした部位は、本発明の融合分子には必要ではなく、そしてしたがって、除去可能である。
７．ＡＤＣＣ部位が除去されている。ＡＤＣＣ部位は当該技術分野に知られる。例えばＩｇＧ１におけるＡＤＣＣ部位に関しては、Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９（５）：６３３−９（１９９２）を参照されたい。これらの部位もまた、本発明の融合分子には必要ではなく、そしてしたがって、除去可能である。
８．天然Ｆｃが非ヒト抗体に由来する場合、天然Ｆｃをヒト化することも可能である。典型的には、天然Ｆｃをヒト化するため、非ヒト天然Ｆｃの選択される残基を、ヒト天然Ｆｃに通常見られる残基で置換する。抗体をヒト化する技術は当該技術分野に周知である。
用語「Ｆｃドメイン」には、全抗体を消化するのであれ、または他の手段によって産生するのであれ、単量体型または多量体型の分子が含まれる。本明細書において、用語「多量体」は、ＦｃドメインまたはＦｃドメインを含む分子に適用した際、共有的に、非共有的に、または共有相互作用および非共有相互作用の両方によって会合する２以上のポリペプチド鎖を有する分子を指す。ＩｇＧ分子は、典型的には二量体を形成し；ＩｇＭは五量体；ＩｇＤは二量体；そしてＩｇＡは単量体、二量体、三量体、または四量体を形成する。多量体は、配列を利用して、そしてＦｃの天然Ｉｇ供給源の活性を生じることによって、またはこうした天然Ｆｃを誘導体化することによって、形成可能である。用語「二量体」は、ＦｃドメインまたはＦｃドメインを含む分子に適用した際、共有的にまたは非共有的に会合する２つのポリペプチド鎖を有する分子を指す。
さらに、本発明にしたがった別のビヒクルは、サルベージ受容体に結合可能な非Ｆｃドメイン・タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、または小分子（例えば
ペプチド模倣体化合物）である。例えば、Ｐｒｅｓｔａらに対する米国特許第５，７３９，２７７号、１９９８年４月１４日発行に記載されるようなポリペプチドをビヒクルとして用いることも可能である。また、ＦｃＲｎサルベージ受容体に対する結合に関して、ファージディスプレイによってペプチドを選択することも可能である。こうしたサルベージ受容体結合化合物もまた、「ビヒクル」の意味に含まれ、そして本発明の範囲内である。こうしたビヒクルは、半減期を増加させ（例えばプロテアーゼに認識される配列を回避することによって）そして免疫原性を減少させる（例えば抗体ヒト化において発見されるような、非免疫原性配列を好むことによって）ように選択されるべきである。
さらに、ポリマービヒクルもまた、本発明の結合剤を構築するために使用可能である。ビヒクルとして有用な化学部分を付着させる多様な手段が現在利用可能であり、例えば本明細書に完全に援用される、特許協力条約（「ＰＣＴ」）国際公報第ＷＯ ９６／１１９５３号、表題「Ｎ末端が化学的に修飾されたタンパク質組成物および方法」を参照されたい。このＰＣＴ公報は、とりわけ、タンパク質のＮ末端への水溶性ポリマーの選択的付着を開示する。
好ましいポリマービヒクルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ基は、いかなる好適な分子量のものであることも可能であり、そして直鎖であることもまたは分枝鎖であることも可能である。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、最も好ましくは約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲であろう。ＰＥＧ基は、一般的に、アシル化または還元性アルキル化を介し、ＰＥＧ部分上の反応基（例えばアルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）を通じて、本発明の化合物上の反応基（例えばアルデヒド、アミノ、またはエステル基）に付着されるであろう。合成ペプチドのＰＥＧ化に有用な戦略は、相互に、互いに対して反応性である特別の官能性を各々所持するペプチドおよびＰＥＧ部分を、溶液中でコンジュゲート連結を形成することを通じて合わせることからなる。ペプチドは、当該技術分野に知られるような慣用的固相合成で容易に調製可能である。ペプチドを、特定の部位で、適切な官能基で「プレ活性化」する。前駆体を精製し、そしてＰＥＧ部分と反応させる前に完全に性質決定する。ペプチドとＰＥＧの連結は、通常、水性相で行われ、そして逆相分析用ＨＰＬＣによって、容易に監視可能である。分取用ＨＰＬＣによってＰＥＧ化ペプチドを容易に精製し、そして分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸解析、およびレーザー脱離質量分析によって性質決定することも可能である。
多糖ポリマーが、タンパク質修飾に使用可能な水溶性ポリマーの別の種類である。デキストランは、主に１−６連結によって連結された個々のグルコースサブユニットで構成される、多糖ポリマーである。デキストラン自体は、多くの分子量範囲で入手可能であり、そして約１ｋＤａ〜約７０ｋＤａの分子量で容易に入手可能である。デキストランは、単独で、または別のビヒクル（例えばＦｃ）と組み合わせて、ビヒクルとして、本発明で使用するのに適した水溶性ポリマーである。例えば、ＷＯ ９６／１１９５３およびＷＯ ９６／０５３０９を参照されたい。療法免疫グロブリンまたは診断用免疫グロブリンにコンジュゲート化されたデキストランの使用が報告されている；例えば本明細書に援用される欧州特許公報第０ ３１５ ４５６号を参照されたい。デキストランを本発明にしたがったビヒクルとして用いる場合、約１ｋＤａ〜約２０ｋＤａのデキストランが好ましい。
リンカー
本発明の結合剤は、場合によって、「リンカー」基をさらに含むことも可能である。リンカーは、主に、ペプチドおよびビヒクルの間のスペーサー、または本発明の結合剤の２つのペプチドの間のスペーサーとして働く。１つの態様において、リンカーは、ペプチド結合によってともに連結されたアミノ酸、好ましくはペプチド結合によって連結された１〜２０アミノ酸で構成され、アミノ酸は２０の天然存在アミノ酸から選択される。これら
のアミノ酸の１以上は、当業者に理解されるように、グリコシル化されることも可能である。１つの態様において、１〜２０アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリジンから選択される。好ましくは、リンカーは、大部分、立体的に妨害されない、グリシンおよびアラニンなどのアミノ酸で構成される。したがって、典型的なリンカーは、ポリグリシン（特に（Ｇｌｙ）５、（Ｇｌｙ）８）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、およびポリアラニンである。本明細書において、記号表示「ｇ」はグリシン・ホモペプチドリンカーを指す。表ＩＩに示すような「ｇｎ」は、Ｎ末端の５ｘ ｇｌｙリンカーを指し、一方、「ｇｃ」はＣ末端の５ｘ ｇｌｙリンカーを指す。ＧｌｙおよびＡｌａの組み合わせもまた好ましい。本発明の結合剤を構築するのに有用な１つの典型的なリンカー配列は、以下のとおりである：ｇｓｇｓａｔｇｇｓｇｓｔａｓｓｇｓｇｓａｔｇ（配列番号３０５）。このリンカー配列は、「ｋ」または１ｋ配列と称される。表ＩＩに見られるような記号表示「ｋｃ」は、Ｃ末端のｋリンカーを指し、一方、記号表示「ｋｎ」は、Ｎ末端のｋリンカーを指す。
本発明のリンカーはまた、非ペプチドリンカーであることも可能である。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−、ここでｓ＝２〜２０である、などのアルキルリンカーが使用可能である。これらのアルキルリンカーは、低次アルキル（例えばＣ１〜Ｃ６）、低次アシル、ハロゲン（例えばＣｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどの立体的に妨害しない基いずれかによってさらに置換されることも可能である。典型的な非ペプチドリンカーは、ＰＥＧリンカーであり、そして１００〜５０００ｋＤａ、好ましくは１００〜５００ｋＤａの分子量を有する。ペプチドリンカーを改変して、上と同じ方式で誘導体を形成することも可能である。
典型的な結合剤
本発明の結合剤は、ミオスタチンに結合可能な少なくとも１つのペプチドを含む。１つの態様において、ミオスタチン結合ペプチドは、長さ約５〜約５０アミノ酸の間であり、別の態様において、長さ約１０〜３０アミノ酸の間であり、そして別の態様において、長さ約１０〜２５アミノ酸の間である。１つの態様において、ミオスタチン結合ペプチドは、アミノ酸配列ＷＭＣＰＰ（配列番号６３３）を含む。他の態様において、ミオスタチン結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｃａ１ａ２ Ｗａ３ ＷＭＣＰＰ（配列番号３５２）を含み、ここでａ１、ａ２およびａ３は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸から選択される。別の態様において、ミオスタチン結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｃｂ１ｂ２ Ｗｂ３ ＷＭＣＰＰ（配列番号３５３）、ここでｂ１は、アミノ酸Ｔ、Ｉ、またはＲのいずれか１つから選択され；ｂ２は、Ｒ、Ｓ、Ｑのいずれか１つから選択され；ｂ３は、Ｐ、ＲおよびＱのいずれか１つから選択される、を含み、そしてその長さが１０〜５０アミノ酸の間である、前記ペプチド、およびその生理学的に許容しうる塩である。
別の態様において、ミオスタチン結合ペプチドは、式：
ｃ１ｃ２ｃ３ｃ４ｃ５ｃ６ Ｃｃ７ｃ８ Ｗｃ９ ＷＭＣＰＰｃ１０ｃ１１ｃ１２ｃ１３（配列番号３５４）、式中：
ｃ１は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
ｃ２は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｃ３は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｃ４は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
ｃ５は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｃ６は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは塩基性アミノ酸であり；
ｃ７は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸であり；
ｃ８は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸であり；
ｃ９は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸であり；そして
ｃ１０〜ｃ１３は、アミノ酸いずれかである
を含み；そしてその長さが２０〜５０アミノ酸の間である、前記ペプチド、およびその生理学的に許容しうる塩である。
関連する態様において、ミオスタチン結合可能ペプチドは、式：
ｄ１ｄ２ｄ３ｄ４ｄ５ｄ６ Ｃｄ７ｄ８ Ｗｄ９ ＷＭＣＰＰｄ１０ｄ１１ｄ１２ｄ１３（配列番号３５５）、式中
ｄ１は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
ｄ２は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｄ３は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｄ４は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
ｄ５は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｄ６は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは塩基性アミノ酸であり；
ｄ７は、アミノ酸Ｔ、Ｉ、またはＲのいずれか１つから選択され；
ｄ８は、Ｒ、Ｓ、Ｑのいずれか１つから選択され；
ｄ９は、Ｐ、ＲおよびＱのいずれか１つから選択され；そして
ｄ１０〜ｄ１３は、アミノ酸いずれかから選択される
を含み、そしてその長さが２０〜５０アミノ酸の間である、前記ペプチド、およびその生理学的に許容しうる塩である。
結合剤のさらなる態様は、少なくとも１つの以下のペプチド：
（１）配列ＷＹｅ１ｅ２ Ｙｅ３ Ｇ（配列番号３５６）
ここでｅ１は、Ｐ、ＳまたはＹであり、
ｅ２は、ＣまたはＱであり、そして
ｅ３は、ＧまたはＨである、を含み、その長さが７〜５０アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、およびその生理学的に許容しうる塩；
（２）配列ｆ１ ＥＭＬｆ２ ＳＬｆ３ｆ４ ＬＬ（配列番号４５５）、
ここでｆ１は、ＭまたはＩであり、
ｆ２は、アミノ酸いずれかであり、
ｆ３は、ＬまたはＦであり、
ｆ４は、Ｅ、ＱまたはＤである
を含み；そしてその長さが７〜５０アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、およびその生理学的に許容しうる塩；
（３）配列Ｌｇ１ｇ２ ＬＬｇ３ｇ４ Ｌ（配列番号４５６）、ここで
ｇ１は、Ｑ、ＤまたはＥであり、
ｇ２は、Ｓ、Ｑ、ＤまたはＥであり、
ｇ３は、アミノ酸いずれかであり、
ｇ４は、Ｌ、Ｗ、Ｆ、またはＹである、を含み、そしてその長さが８〜５０アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、およびその生理学的に許容しうる塩；
（４）配列ｈ１ｈ２ｈ３ｈ４ｈ５ｈ６ｈ７ｈ８ｈ９（配列番号４５７）、ここで
ｈ１は、ＲまたはＤであり、
ｈ２は、アミノ酸いずれかであり、
ｈ３は、Ａ、Ｔ、ＳまたはＱであり、
ｈ４は、ＬまたはＭであり、
ｈ５は、ＬまたはＳであり、
ｈ６は、アミノ酸いずれかであり、
ｈ７は、ＦまたはＥであり、
ｈ８は、Ｗ、ＦまたはＣであり、
ｈ９は、Ｌ、Ｆ、ＭまたはＫである、を含み、そしてその長さが９〜５０アミノ酸の間
である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、およびその生理学的に許容しうる塩
を含む。
１つの態様において、本発明の結合剤は、ポリマーまたはＦｃドメインなどの少なくとも１つのビヒクルをさらに含み、そして少なくとも１つのリンカー配列をさらに含むことも可能である。この態様において、本発明の結合剤は、少なくとも１つのミオスタチン結合ペプチドが、少なくとも１つのビヒクルに共有的に付着するように構築される。単数または複数のペプチドが直接、またはリンカー配列を介して間接的に、ペプチドのＮ末端、Ｃ末端またはアミノ酸側鎖で、ビヒクルに付着される。この態様において、本発明の結合剤は、以下の一般化された構造：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ、またはその多量体；
ここでＦ１はビヒクルであり；そしてＸ１およびＸ２は、各々独立に
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；
および−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４；
ここでＰ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり；そして
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、各々リンカーであり；そしてａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆは、各々独立に０または１である、但しａおよびｂの少なくとも１つは１である
から選択される
を有する。
この一般化された構造を有する結合剤の１つの態様において、ペプチドＰ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４は、上に提供する配列を含むペプチドのいずれか１以上から選択可能である。ペプチドＰ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４は、以下の配列：配列番号６３３、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号４５５、配列番号４５６、または配列番号４５７のいずれかを含む１以上のペプチドから選択可能である。
さらなる態様において、上記一般式を有する結合剤のビヒクルは、Ｆｃドメインである。ペプチドは、したがって、直接または間接的にＦｃドメインに融合し、それによってペプチボディを提供する。本発明のペプチボディは、ミオスタチンに高い結合アフィニティーを示し、そして本明細書に提供するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよび動物におけるｉｎ
ｖｉｖｏ試験によって立証されるように、ミオスタチンの活性を阻害可能である。
本発明はまた、本発明のペプチド、ペプチボディ、並びにペプチドおよびペプチボディの変異体および誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子も提供する。典型的なヌクレオチド配列を以下に提供する。
ペプチドおよびペプチボディの変異体および誘導体
本発明の結合剤は、本明細書に記載するペプチドおよびペプチボディの変異体および誘導体もまた包含する。本発明のペプチドおよびペプチボディはどちらも、アミノ酸配列に関して記載することも可能であるため、用語「変異体」および「誘導体」は、ペプチド単独、またはペプチボディの構成要素としてのペプチドに適用して述べることも可能である。本明細書において、用語「ペプチド変異体」は、元来のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が挿入されたか、欠失されたか、または置換され、そしてミオスタチンに結合し、そしてその活性を修飾する能力を保持するペプチドまたはペプチボディを指す。本明細書において、「変異体」の定義には、ペプチドまたはペプチボディの断片が含まれる
。
いかなる既定のペプチドまたはペプチボディも、変異体の１種または２種または３種すべてを含有することも可能であることが理解される。挿入変異体および置換変異体は、天然アミノ酸とともに、非天然存在アミノ酸、または両方を含有することも可能である。
ペプチド変異体およびペプチボディ変異体はまた、リーダー配列またはシグナル配列が除去された、成熟ペプチドおよび成熟ペプチボディも含み、そして生じるタンパク質が、天然であることもまたは非天然であることも可能なさらなるアミノ末端残基を有することも可能である。アミノ酸−１位にさらなるメチオニル残基を持つペプチボディ（Ｍｅｔ−１−ペプチボディ）が意図され、−２位および−１位にさらなるメチオニン残基およびリジン残基を持つペプチボディ（Ｍｅｔ−２−Ｌｙｓ−１−）も意図される。細菌宿主細胞における組換えタンパク質産生の増進には、さらなるＭｅｔ残基、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ残基、Ｌｙｓ残基（または一般的に１以上の塩基性残基）を有する変異体が特に有用である。
本発明のペプチド変異体またはペプチボディ変異体には、特定の発現系の使用から生じるさらなるアミノ酸残基を有するペプチドもまた含まれる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合産物の一部として、所望のポリペプチドを発現する、商業的に入手可能なベクターを使用すると、所望のポリペプチドからＧＳＴ構成要素を切断した後、アミノ酸−１位でさらなるグリシン残基を有する、所望のポリペプチドが提供される。他のベクター系における発現から生じる変異体もまた意図され、アミノ酸配列に、一般的には配列のカルボキシ末端および／またはアミノ末端に、ヒスチジンタグが取り込まれているものが含まれる。
一例において、天然存在または非天然存在アミノ酸いずれかの１以上のアミノ酸残基がペプチド・アミノ酸配列に付加される、挿入変異体が提供される。挿入は、タンパク質のいずれかの末端または両末端に位置することも可能であるし、あるいはペプチボディ・アミノ酸配列の内部領域内に位置することも可能である。いずれかの末端または両末端にさらなる残基を持つ挿入変異体には、例えば、融合タンパク質、およびアミノ酸タグまたは標識を含むタンパク質が含まれることも可能である。挿入変異体には、１以上のアミノ酸残基がペプチド・アミノ酸配列またはその断片に付加されるペプチドが含まれる。
挿入変異体はまた、ペプチドまたはペプチボディのアミノ末端および／またはカルボキシ末端を別のポリペプチド、その断片、または特定のタンパク質配列いずれの部分とも一般的に認識されないアミノ酸に融合させた、融合タンパク質も含む。こうした融合タンパク質の例は、免疫原性ポリペプチド、長い循環半減期を持つタンパク質、例えば免疫グロブリン定常領域、マーカータンパク質、所望のペプチドまたはペプチボディの精製を容易にするタンパク質またはポリペプチド、および多量体タンパク質の形成を促進するポリペプチド配列（二量体形成／安定性に有用なロイシンジッパーモチーフなど）である。
この種の挿入変異体は、一般的に、Ｎ末端またはＣ末端で、第二のポリペプチドのすべてまたは部分に連結された、天然分子のすべてまたは実質的な部分を有する。例えば、融合タンパク質は、典型的には、他の種由来のリーダー配列を使用して、異種宿主におけるタンパク質の組換え体発現を可能にする。別の有用な融合タンパク質には、融合タンパク質の精製を促進する免疫学的活性ドメイン、例えば抗体エピトープの付加が含まれる。融合接合部またはその近傍に切断部位を含むと、精製後の外来（ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ）ポリペプチドの除去が容易になるであろう。他の有用な融合には、酵素由来の活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞性ターゲティングシグナルまたは膜貫通領域などの機能ドメインの連結が含まれる。
本発明で使用可能で、商業的に入手可能な多様な融合タンパク質発現系がある。特に有用な系には、限定されるわけではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、マルトース結合タンパク質系（ＮＥＢ、マサチューセッツ州ビバリー）、ＦＬＡＧ系（ＩＢＩ、コネチカット州ニューヘブン）、および６ｘＨｉｓ系（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州チャツワース）が含まれる。これらの系は、少数のさらなるアミノ酸しか所持しない組換えペプチドおよび／またはペプチボディを産生することが可能であり、ペプチドまたはペプチボディの活性に有意に影響を及ぼす可能性が低い。例えば、ＦＬＡＧ系および６ｘＨｉｓ系はどちらも、短い配列しか付加せず、これら配列はどちらもほとんど抗原性でなく、そして天然コンホメーションへのポリペプチドのフォールディングに不都合に影響を及ぼさないことが知られる。有用であることが意図される別のＮ末端融合は、タンパク質またはペプチドのＮ末端領域でのＭｅｔ−Ｌｙｓジペプチドの融合である。こうした融合は、タンパク質発現または活性の有益な増加を生じうる。
所望のペプチドまたはペプチボディから融合パートナーを切除することが望ましい場合、他の融合系は、ポリペプチドハイブリッドを生じる。１つの態様において、融合パートナーは、プロテアーゼの特異的認識配列を含有するペプチド配列によって、組換えペプチボディに連結される。適切な配列の例は、タバコエッチ病ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼに認識されるもの（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ガイザーズバーグ）または因子Ｘａに認識されるもの（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）である。
本発明はまた、一部切除組織因子（ｔＴＦ）と組み合わせて、本発明のペプチドまたはペプチボディのすべてまたは部分を含む融合ポリペプチドも提供する。ｔＴＦは、米国特許第５，８７７，２８９号；第６，００４，５５５号；第６，１３２，７２９号；第６，１３２，７３０号；第６，１５６，３２１号；および欧州特許第ＥＰ ０９８８０５６号に記載されるように、腫瘍血管凝固剤として作用する、ヒト凝血誘導タンパク質の一部切除型からなる血管ターゲティング剤である。ｔＴＦを抗ミオスタチン・ペプチボディまたはペプチド、あるいはその断片に融合させると、ターゲット細胞、例えば骨格筋細胞、心筋細胞、線維芽細胞、前脂肪細胞、および場合によって脂肪細胞への抗ミオスタチン・アンタゴニストの搬送が促進される。
別の側面において、本発明は、ペプチドまたはペプチボディ中の１以上のアミノ酸残基が除去されている欠失変異体を提供する。欠失は、ペプチボディの一方の末端または両方の末端での、あるいはペプチボディ・アミノ酸配列内の１以上の残基の除去から達成されることも可能である。欠失変異体には、必然的に、ペプチドまたはペプチボディのすべての断片が含まれる。
さらに別の側面において、本発明は、本発明のペプチドおよびペプチボディの置換変異体を提供する。置換変異体には、１以上のアミノ酸残基が除去され、そして１以上の別のアミノ酸と交換されているペプチドおよびペプチボディが含まれ、交換するアミノ酸は、天然存在または非天然存在であることも可能である。置換変異体は、２つの分子が、特定の割合で同一アミノ酸を有する点で、元来のペプチドまたはペプチボディに「類似」であるペプチドまたはペプチボディを生成する。置換変異体は、ペプチドまたはペプチボディ内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、および２０アミノ酸の置換を含み、置換の数は、ペプチドまたはペプチボディのアミノ酸の１０パーセントまでであることも可能である。１つの側面において、置換の性質は保存的であるが、本発明はまた、非保存的置換も含み、そしてまた非慣用的アミノ酸も含む。
関連ペプチドおよびペプチボディの同一性および類似性は、既知の方法によって容易に
計算可能である。こうした方法には、限定されるわけではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．監修， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，
Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，
Ｐａｒｔ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．監修， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ニュージャージー（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．監修， Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９９１）；およびＣａｒｉｌｌｏら， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， ４８：１０７３（１９８８）に記載されるものが含まれる。
２つのペプチドまたはポリペプチド、あるいはポリペプチドおよびペプチドの関連性または同一性パーセントを決定する好ましい方法は、試験する配列間の最大のマッチを与えるように設計される。同一性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定する好ましいコンピュータプログラム法には、限定されるわけではないが、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， １２：３８７（１９８４）；遺伝学コンピュータグループ、ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５：４０３−４１０（１９９０））を含むＧＣＧプログラムパッケージが含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ， Ａｌｔｓｃｈｕｌら ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記（１９９０））から公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、同一性を決定することもまた可能である。
２つのアミノ酸配列を並列するための特定の並列スキームは、２つの配列の短い領域のみのマッチングを生じることも可能であり、そして２つの全長配列間に有意な関係がない場合であっても、この小さい並列領域が非常に高い配列同一性を有する可能性もある。したがって、特定の態様において、選択される並列法は、比較するターゲットポリペプチドの全長の少なくとも１０パーセント、すなわち少なくとも４００アミノ酸の配列を比較する場合は少なくとも４０の隣接アミノ酸、少なくとも３００〜約４００アミノ酸の配列を比較する場合は、３０の隣接アミノ酸、２００〜約３００アミノ酸の配列を比較する場合は、少なくとも２０の隣接アミノ酸、そして約１００〜２００アミノ酸の配列を比較する場合は、少なくとも１０の隣接アミノ酸に渡る並列を生じるであろう。例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（ウィスコンシン大学遺伝学コンピュータグループ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、配列同一性パーセントを決定しようとする２つのポリペプチドを、それぞれのアミノ酸の最適マッチングのために並列する（「マッチ化スパン」はアルゴリズムによって決定されるとおり）。特定の態様において、ギャップ・オープニング・ペナルティ（典型的には平均対角の３倍として計算される；「平均対角」は、用いる比較マトリックスの対角の平均である；「対角」は、特定の比較マトリックスによって、完全なアミノ酸マッチ各々に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップ・オープニング・ペナルティの１／１０倍である）とともに、ＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２などの比較マトリックスを、アルゴリズムと組み合わせて用いる。特定の態様において、標準的比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスに関してはＤａｙｈｏｆｆら， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ５（３）（１９７８）；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスに関してはＨｅｎｉｋｏｆｆら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）を参照されたい）もまたアルゴリズムに用いられる。
例えば、特定の態様において、以下を用いてポリペプチド配列比較のパラメーターを作成することも可能である：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８：４４３−４５３（１９７０）；比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、上記（１９９２）由来のＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップペナルティ：１２；ギャップ長ペナルティ：４；類似性閾値：０、末端ギャップに対するペナルティなし。
特定の態様において、ポリヌクレオチド分子配列（アミノ酸配列と対照的に）比較のパラメーターは、以下を用いて作成可能である：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、上記（１９７０）：比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長ペナルティ：３。
プログラム・マニュアル、ウィスコンシン・パッケージ、バージョン９、１９９７年９月に示されるものを含めて、他の典型的なアルゴリズム、ギャップ・オープニング・ペナルティ、ギャップ伸長ペナルティ、比較マトリックス、類似性閾値などを、使用可能である。行うべき特定の選択は当業者には明らかであり、そしてＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡなどの、行う特定の比較に応じ；そしてさらに、比較が既定の配列対間である（この場合、一般的にはＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが好ましい）か、または１つの配列および大きな配列データベース間である（この場合、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）かに応じるであろう。
２０の慣用的（天然存在）アミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、α，α−二置換アミノ酸などの非天然存在アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の慣用的でないアミノ酸もまた、本発明のペプチドに適した構成要素でありうる。非天然存在アミノ酸の例には、例えば：アミノアジピン酸、ベータ−アラニン、ベータ−アミノプロピオン酸、アミノ酪酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノイソ酪酸、アミノピメリン酸、ジアミノ酪酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アローイソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、ザルコシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン（ｏｒｉｔｈｉｎｅ）、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびアミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。
天然存在残基は、共通の側鎖特性に基づいて、（重複する）種類に分けることも可能である：
１）中性疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ；
２）中性極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
アミノ酸の置換は、保存的であることも可能であり、こうした置換は、元来のペプチドと類似の機能的特性および化学的特性を有するペプチドを生じる。保存的アミノ酸置換は、上記種類の１つのメンバーと、同じ種類の別のメンバーを交換することを伴う。保存的変化は、非慣用的なアミノ酸残基を含むことも可能であり、これは典型的には、生物学的系における合成よりも、化学的ペプチド合成によって取り込まれる。これらには、ペプチド模倣体、およびアミノ酸部分の他の逆転（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）型または反転（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）型が含まれる。
非保存的置換は、これらの種類の１つのメンバーと別の種類のメンバーとの交換を伴うことも可能である。これらの変化は、ペプチドの機能的特性および／または化学的特性に実質的な修飾を生じることも可能である。こうした変化を作成する際、特定の態様にしたがって、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮することも可能である。各アミノ酸には、疎水性および電荷特性に基づいて、ヒドロパシー指数が割り当てられている。これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
相互作用性の生物学的機能をタンパク質に与える際に、ヒドロパシーアミノ酸指数が重要であることが、当該技術分野において理解されている。Ｋｙｔｅら， Ｊ． Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．， １５７：１０５−１３１（１９８２）。類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸を、特定のアミノ酸で置換して、そしてなお類似の生物学的活性が保持されうることが知られる。特定の態様において、ヒドロパシー指数に基づいて変化を作製する際、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。特定の態様において、±１以内であるものが含まれ、そして特定の態様において、±０．５以内であるものが含まれる。
当該技術分野において、親水性に基づいて、同様のアミノ酸の置換を有効に行うことが可能であることもまた、理解されており、本明細書の場合におけるように、それによって生成された生物学的に機能性であるペプチボディまたはペプチドが免疫学的態様における使用を意図される場合には特に当てはまる。特定の態様において、隣接するアミノ酸の親水性によって決定される、タンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性および抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性と相関する。
以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変化を作製する際、特定の態様において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、特定の態様において、±１以内であるものが含まれ、そして特定の態様において、±０．５以内であるものが含まれる。また、親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを同定することも可能である。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」とも称される。
典型的なアミノ酸置換を以下の表１に示す。
アミノ酸置換
Figure 2010193888
当業者は、例えばランダム置換によって本発明のペプチドおよびペプチボディの変異体を産生し、そして本明細書に記載するアッセイを用いて、結合活性に関して、生じたペプチドまたはペプチボディを試験することも可能であろう。
さらに、当業者は、類似のポリペプチドにおいて、活性または構造に重要な残基を同定するため、構造−機能研究または三次元構造解析を再検討することも可能である。こうした比較を考慮して、類似のタンパク質において、活性または構造に重要なアミノ酸残基に対応する、タンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予測することも可能である。当業者は、こうして予測された重要なアミノ酸残基に関して、化学的に類似のアミノ酸置換を選択することも可能である。次いで、本明細書に記載するような活性アッセイを用いて、変異体をスクリーニングすることも可能である。
いくつかの科学的刊行物が二次構造の予測に当てられてきている。Ｍｏｕｌｔ Ｊ．，
Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ７（４）：４２２−４２７（１９９６）；Ｃｈｏｕら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら， Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． Ｒｅｌａｔ． Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕら， Ａｎｎ．
Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４７：２５１−２７６およびＣｈｏｕら， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ．， ２６：３６７−３８４（１９７９）を参照されたい。さらに、二次構造を予測するのを補助するコンピュータプログラムが現在利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％を越える配列同一性または４０％を越える類似性を有する、２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似の構造的トポロジーを有する。近年、タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）が大きくなり、タンパク質構造内でのフォールディングのありうる数を含む、二次構造の予測可能性が増進してきている。Ｈｏｌｍら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， ２７（１）：２４４−２４７（１９９９）を参照されたい。既定のタンパク質には、限定される数のフォールディングしかなく、そして決定的な数の構造が解明されたなら、構造予測は劇的により正確になるであろうことが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら， Ｃｕｒｒ．
Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ７（３）：３６９−３７６（１９９７））。
二次構造を予測するさらなる方法には、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ， Ｄ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ４（１）：１５−１９（１９９６））、「プロフィール解析」（Ｂｏｗｉｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍ．， １８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７））、および「進化連関（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ、上記（１９９９）およびＢｒｅｎｎｅｒ、上記（１９９９）を参照されたい）が含まれる。
特定の態様において、ペプチド変異体またはペプチボディ変異体にはグリコシル化変異体が含まれ、該変異体では、Ｎ連結グリコシル化部位などの１以上のグリコシル化部位がペプチボディに付加されている。Ｎ−連結グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒに特徴付けられ、ここで、Ｘと示されるアミノ酸残基は、プロリン以外のいかなるアミノ酸残基であることも可能である。アミノ酸残基を置換するかまたは付加して、この配列を生成すると、Ｎ連結炭水化物鎖を付加するための潜在的な新規部位が提供される。あるいは、この配列を除去する置換は、存在するＮ連結炭水化物鎖を除去するであろう。やはり提供されるのは、１以上のＮ連結グリコシル化部位（典型的には天然存在のものである）を除去し、そして１以上の新規Ｎ連結部位を生成する、Ｎ連結炭水化物鎖の再配置である。
本発明はまた、本発明のペプチドまたはペプチボディの「誘導体」も提供する。本明細書において、用語「誘導体」は、ミオスタチンへの結合能を保持する、アミノ酸残基への挿入、アミノ酸残基の欠失、または置換以外の、またはこれらに加えた修飾を指す。
好ましくは、誘導体を生じるために本発明のペプチドに行う修飾は、共有性であり、そして例えば、ポリマー、脂質、他の有機部分、および無機部分との化学的結合が含まれる。本発明の誘導体は、ペプチボディの循環半減期を増加させるように調製可能であるし、あるいはペプチボディが、所望の細胞、組織、または臓器をターゲットとする能力を改善するように設計可能である。
本発明は、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号；および第４，１７９，３３７号に記載されるように、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールなどの１以上の水溶性ポリマー付着物を含むように共有的に修飾された誘導体結合剤をさらに含む。当該技術分野に知られる、さらに他の有用なポリマーには、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、
または他の炭水化物に基づくポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド・コポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）およびポリビニルアルコールとともに、これらのポリマーの混合物が含まれる。特に好ましいのは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サブユニットで共有的に修飾されたペプチボディである。水溶性ポリマーを、特定の位、例えばペプチボディのアミノ末端に結合させることも可能であるし、またはポリペプチドの１以上の側鎖にランダムに付着させることも可能である。結合剤、例えばペプチボディ、および特にヒト化抗体の療法能を改善するためのＰＥＧの使用が、Ｇｏｎｚａｌｅｓらに対する米国特許第６，１３３，４２６号、２０００年１０月１７日発行に記載される。
本発明はまた、ミオスタチン結合剤のペプチドおよび／またはビヒクル部分を誘導体化することも意図する。こうした誘導体は、化合物の可溶性、吸収、生物学的半減期等を改善しうる。該部分は、化合物のいかなる望ましくない副作用等も除去するかまたは減弱しうる。典型的な誘導体には、以下のような化合物が含まれる：
１．誘導体またはそのある部分が環状である。例えば、ペプチド部分を修飾して２以上のＣｙｓ残基（例えばリンカー中）を含有させることも可能であり、これをジスルフィド結合形成によって環状化することも可能である。
２．誘導体は分子間で架橋されるかまたは分子間の架橋が可能であるようにされている。例えば、ペプチド部分を修飾して、１つのＣｙｓ残基を含有させ、そしてそれによって、同様の分子との分子間ジスルフィド結合を形成可能にすることも可能である。誘導体を、Ｃ末端を通じて架橋することもまた可能である。
３．１以上のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］連結（結合）が、非ペプチジル連結と交換されている。典型的な非ペプチジル連結は、−ＣＨ２−カルバメート［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホネート、−ＣＨ２−スルホンアミド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ２−二級アミン、およびアルキル化ペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−、ここでＲ６は低次アルキルである］である。
４．Ｎ末端が誘導体化されている。典型的には、Ｎ末端は、アシル化されているかまたは置換アミンへと修飾されていることも可能である。典型的なＮ末端誘導体基には、−ＮＲＲ１（−ＮＨ２以外）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１、スクシンイミド、またはベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）、式中、ＲおよびＲ１は、各々独立に水素または低次アルキルであり、そしてフェニル環は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、クロロ、およびブロモからなる群より選択される１〜３の置換基で置換されていることも可能である、が含まれる。
５．未結合（ｆｒｅｅ）Ｃ末端が誘導体化されている。典型的には、Ｃ末端はエステル化されているかまたはアミド化されている。例えば、当該技術分野に記載される方法を用いて、本発明の化合物のＣ末端に（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）２を付加することも可能である。同様に、当該技術分野に記載される方法を用いて、本発明の化合物のＣ末端に−ＮＨ２を付加する（または−ＮＨ２基で「キャッピング」する）ことも可能である。典型的なＣ末端誘導体基には、例えば−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、式中、Ｒ２は低次アルコキシである、または−ＮＲ３Ｒ４、式中、Ｒ３およびＲ４は、独立に水素またはＣ１〜Ｃ８アルキル（好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキル）である、が含まれる。
６．ジスルフィド結合を別の、好ましくはより安定な架橋部分（例えばアルキレン）と交換する。例えばＢｈａｔｎａｇａｒら， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３９：３８１４−９
（１９９６）、Ａｌｂｅｒｔｓら， Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ Ａｍ Ｐｅｐ Ｓｙｍｐ，
３５７−９（１９９３）を参照されたい。
７．１以上の個々のアミノ酸残基が修飾されている。以下に詳細に記載するように、多様な誘導体化剤が、選択した側鎖または末端残基と特異的に反応することが知られる。
リジニル残基およびアミノ末端残基を、リジニル残基の電荷を逆転させるコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させることも可能である。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化する他の適切な試薬には、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル；ピリドキサル・リン酸；ピリドキサル；クロロ水素化ホウ素；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンを含む、慣用的試薬のいずれか１つまたはいくつかの組み合わせとの反応によって、アルギニル残基を修飾することも可能である。アルギニル残基の誘導体化には、グアニジン官能基のｐＫａが高いため、反応をアルカリ条件で行う必要がある。さらに、これらの試薬は、リジン基とともにアルギニン・イプシロン−アミノ基とも反応しうる。
チロシル残基の特異的修飾は、徹底的に研究されてきており、特に、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって、チロシル残基にスペクトル標識を導入することに興味が持たれている。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成する。
カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応によって、カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）を選択的に修飾することも可能である。さらに、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパルチル残基およびグルタミル残基をアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換することも可能である。
グルタミニル残基およびアスパラギニル残基を脱アミド化して、対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基にすることも可能である。あるいは、穏やかな酸性条件下で、これらの残基を脱アミド化する。これらの残基のいずれの型も本発明の範囲内に属する。
システイニル残基をアミノ酸残基または他の部分と交換して、ジスルフィド結合を除去するか、または逆に架橋を安定化することも可能である。例えばＢｈａｔｎａｇａｒら（上記）を参照されたい。
二官能性剤での誘導体化は、ペプチドまたはその機能する誘導体を、水不溶性支持体マトリックスに、または他の巨大分子ビヒクルに架橋するのに有用である。一般的に用いられる架橋剤には、例えば１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することが可能な光活性化可能中間体を生じる。あるいは、米国特許第３，９６９，２８７号；第３，６９１，０１６号；第４，１９５，１２８号；第４，２４７，６４２号；第４，
２２９，５３７号；および第４，３３０，４４０号に記載される、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性水不溶性マトリックスおよび反応性基質がタンパク質固定に使用される。
炭水化物（オリゴ糖）基を、タンパク質のグリコシル化部位であることが知られる部位に、好適に付着させることも可能である。一般的に、Ｏ連結オリゴ糖は、セリン（Ｓｅｒ）残基またはスレオニン（Ｔｈｒ）残基に付着され、一方、Ｎ連結オリゴ糖は、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、ここでＸはプロリン以外のいかなるアミノ酸であることも可能である、の一部である場合のアスパラギン（Ａｓｎ）残基に付着される。Ｘは、好ましくは、プロリン以外の１９の天然存在アミノ酸の１つである。Ｎ連結およびＯ連結オリゴ糖の構造および各種類に見られる糖残基は異なる。両方に一般的に見られる糖の１種は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸と称される）である。シアル酸は、通常、Ｎ連結およびＯ連結オリゴ糖両方の末端残基であり、そして負電荷のため、グリコシル化化合物に酸性特性を与えることも可能である。こうした部位（単数または複数）は、本発明の化合物のリンカー内に取り込まれることも可能であり、そして好ましくは、ポリペプチド化合物の組換え産生中に、細胞によってグリコシル化される（例えばＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳなどの哺乳動物細胞において）。しかし、当該技術分野に知られる合成法または半合成法によって、こうした部位をさらにグリコシル化することも可能である。
他のありうる修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓ中のイオウ原子の酸化、リジン側鎖、アルギニン側鎖、およびヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化が含まれる［例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， サンフランシスコ）ｐｐ．７９−８６（１９８３）を参照されたい］。
本発明の化合物をＤＮＡレベルで変化させることもまた可能である。化合物部分いずれかのＤＮＡ配列を、選択した宿主細胞とより適合するコドンに変化させることも可能である。好ましい宿主である大腸菌に関して、当該技術分野において、最適化コドンが知られる。コドンを置換して制限部位を除去するか、またはサイレント制限部位を含ませることも可能であり、これは選択した宿主細胞におけるＤＮＡのプロセシングを補助しうる。ビヒクル、リンカーおよびペプチドＤＮＡ配列を修飾して、前述の配列変化のいずれを含ませることも可能である。
構造の安定化または生体分解の減少を提供する非ペプチド類似体を含むさらなる誘導体もまた、意図される。非ペプチド部分によって１以上の残基を交換することによって、選択した阻害ペプチドに基づいて、ペプチド模倣類似体を調製することも可能である。好ましくは、非ペプチド部分は、ペプチドがその天然コンホメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を保持するか、またはミオスタチンを認識し、そしてミオスタチンに結合する能力を保持する、好ましい、例えば生物活性コンホメーションを安定化するのを可能にする。１つの側面において、生じた類似体／模倣体は、ミオスタチンに対する結合アフィニティーの増加を示す。ペプチドから非ペプチド模倣類似体を調製する方法の一例が、Ｎａｃｈｍａｎら， Ｒｅｇｕｌ Ｐｅｐｔ ５７：３５９−３７０（１９９５）に記載される。望ましい場合、例えば、本発明のペプチドのグリコシル化、アミド化、カルボキシル化、またはリン酸化によって、あるいは酸付加塩、アミド、エステル、特にＣ末端エステル、およびＮ−アシル誘導体の生成によって、本発明のペプチドを修飾することも可能である。ペプチボディもまた、他の部分との共有または非共有複合体を形成することによって、ペプチド誘導体を生成するよう修飾可能である。ペプチボディが含むアミノ酸側鎖上の官能基に、あるいはＮまたはＣ末端で、化学部分を連結することによって、共有結合複合体を調製可能である。
特に、限定されるわけではないが、放射標識、蛍光標識、酵素（例えば比色反応または蛍光分析反応を触媒する）、基質、固体マトリックス、またはキャリアー（例えばビオチンまたはアビジン）を含む、レポーター基に、ペプチドをコンジュゲート化可能であることが予測される。したがって、本発明は、ペプチボディ分子を含む分子を提供し、ここで該分子は、好ましくは、放射標識、蛍光標識、酵素、基質、固体マトリックス、およびキャリアーからなる群より選択されるレポーター基をさらに含む。こうした標識は当業者に周知であり、例えばビオチン標識が特に意図される。こうした標識の使用は、当業者に周知であり、そして例えば、米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９９６，３４５号；および第４，２７７，４３７号に記載される。有用であろう他の標識には、限定されるわけではないが、放射能標識、蛍光標識および化学発光標識が含まれる。こうした標識の使用に関する米国特許には、例えば米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；および第３，９９６，３４５号が含まれる。本発明のペプチボディはいずれも、これらの標識のいずれかを１つ、２つ、またはそれより多く含むことも可能である。
ペプチドおよびペプチボディを作成する方法
当該技術分野に知られる非常に多様な技術を用いて、本発明のペプチドを生成することも可能である。例えば、慣用的技術にしたがって、溶液中または固体支持体上で、こうしたペプチドを合成することも可能である。多様な自動化合成装置が商業的に入手可能であり、そして既知のプロトコルにしたがって使用可能である。例えば、各々本明細書に援用される、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（上記）；Ｔａｍら， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， １０５：６４４２（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１−３４７（１９８６）；ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １−２８４；Ｂａｒａｎｙら， Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ， ３０：７０５−７３９（１９８７）；および米国特許第５，４２４，３９８号を参照されたい。
固相ペプチド合成法は、０．１〜１．０ｍＭアミン／ｇポリマーを含有するコポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）を用いる。ペプチド合成のこれらの方法は、アルファ−アミノ基のブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）または９−フルオレニルメチルオキシ−カルボニル（ＦＭＯＣ）保護を用いる。どちらの方法も段階的合成を伴い、ペプチドのＣ末端から出発して、各段階で単一のアミノ酸が付加される（Ｃｏｌｉｇａｎら， Ｃｕｒｒ
Ｐｒｏｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１，
単元９を参照されたい）。化学合成完了に際して、低下した温度で酸処理することによって、合成ペプチドを脱保護してｔ−ＢＯＣまたはＦＭＯＣアミノ酸遮断基を除去し、そしてポリマーから切断する（例えば、液体ＨＦ−１０％アニソールで、０℃で約０．２５〜約１時間）ことを可能にする。試薬を蒸発させた後、１％酢酸溶液を用いて、ポリマーからペプチドを抽出し、次いでこれを凍結乾燥して未精製（ｃｒｕｄｅ）物質を生じる。これは、通常、５％酢酸を溶媒として用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５上でのゲルろ過などの技術によって、精製可能である。カラムの適切な分画を凍結乾燥すると、均質なペプチドまたはペプチド誘導体が得られ、これを次いで、アミノ酸解析、薄層クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、紫外吸光分光法、モル旋光度、可溶性などの標準的技術によって性質決定し、そして固相エドマン分解によって定量化することも可能である。
ファージディスプレイ技術は、上述のような本発明のペプチドを同定するのに特に有効でありうる。簡潔には、ファージライブラリーを調製し（例えばｍｌ １３、ｆｄ、またはラムダファージを用いる）、４〜約８０アミノ酸残基の挿入物をディスプレイする。挿
入物は、例えば完全縮重アレイまたは偏向アレイに相当することも可能である。所望の抗原に結合する挿入物を所持するファージを選択し、そして所望の抗原に結合するファージの再選択を数周期行って、このプロセスを反復する。ＤＮＡ配列決定を行って、発現されたペプチドの配列を同定する。この方式で、望ましい抗原に結合する配列の最小直鎖部分を決定することも可能である。最小直鎖部分の一部または全部を含有する挿入物に加えて、その上流または下流に１以上のさらなる縮重残基を含有する挿入物を含有する偏向ライブラリーを用いて、この方法を反復することも可能である。これらの技術は、本明細書に既に同定した剤より、ミオスタチンにさらにより高い結合アフィニティーを持つ、本発明のペプチドを同定可能である。
ペプチドを調製する方式にかかわらず、標準的組換えＤＮＡ法を用いて、こうしたペプチド各々をコードする核酸分子を生成することも可能である。核酸コードの縮重のため、それとともに特定の宿主細胞におけるコード優先のため、これらがコードするアミノ酸配列を変化させることなく、こうした分子のヌクレオチド配列を適切に操作することも可能である。
本発明はまた、本発明のペプチドおよびペプチボディをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子も提供する。これらの核酸分子には、本発明のペプチドおよびペプチボディとともに、ペプチドおよびペプチボディの変異体および誘導体をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターおよび構築物が含まれる。典型的な核酸分子を以下の実施例に提供する。
組換えＤＮＡ技術はまた、本発明の全長ペプチボディおよび他の巨大ポリペプチド結合剤、またはその断片を調製する好適な方法も提供する。ペプチボディまたは断片をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して、このベクターを次いで、本発明の結合剤を産生するために、宿主細胞に挿入することも可能である。本発明の典型的なペプチボディの調製を以下の実施例２に記載する。
多様な発現ベクター／宿主系を利用して、本発明のペプチドおよびペプチボディを発現することも可能である。これらの系には、限定されるわけではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）でトランスフェクションされたか、または細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは動物細胞系が含まれる。１つの好ましい宿主細胞株は、以下の実施例２に記載するようなペプチボディの発現に用いる、大腸菌株２５９６（ＡＴＣＣ ＃ ２０２１７４）である。組換えタンパク質産生に有用な哺乳動物細胞には、限定されるわけではないが、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７など）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２および２９３細胞が含まれる。
用語「発現ベクター」は、ポリヌクレオチド配列からポリペプチドを発現するためのプラスミド、ファージ、ウイルスまたはベクターを指す。発現ベクターは、（１）遺伝子発現を制御する役割を有する、単数または複数の遺伝子要素、例えばプロモーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、そしてタンパク質に翻訳される結合剤をコードする構造または配列、および（３）適切な転写開始および終結配列のアセンブリを含む、転写単位を含むことも可能である。酵母または真核発現系の使用に意図される構造単位には、好ましくは、翻訳されたタンパク質が宿主細胞によって細胞外分泌されるのを可能にするリーダー配列が含まれる。あるいは、組換えタンパク質がリーダー配列または輸送配
列なしで発現される場合、アミノ末端メチオニル残基を含むことも可能である。この残基が、発現された組換えタンパク質から続いて切断され、または切断されずに、最終ペプチド産物を提供することも可能である。
例えば、商業的に入手可能な発現系、例えばピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を製造者の指示にしたがって用いて、ペプチドおよびペプチボディを組換え的に発現することも可能である。この系はまた、分泌を指示するプレ−プロ−アルファ配列に頼るが、挿入物の転写は、メタノールの誘導に際して、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって駆動される。細菌および哺乳動物細胞上清からペプチドを精製するのに用いる方法を用いて、分泌されたペプチドを酵母増殖培地から精製する。
あるいは、ペプチドおよびペプチボディをコードするｃＤＮＡをバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）にクローニングすることも可能である。製造者の指示（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）にしたがってこのベクターを用いて、ｓＦ９タンパク質不含培地中でスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞を感染させ、そして組換えタンパク質を産生することも可能である。ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、培地から組換えタンパク質を精製し、そして濃縮することも可能である。
あるいは、ペプチドまたはペプチボディを昆虫系で発現させることも可能である。タンパク質発現のための昆虫系は、当業者に周知である。こうした系の１つにおいて、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて、スポドプテラ・フルギペルダ細胞またはトリコプルシア幼生（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅ）において外来遺伝子を発現させる。ペプチドコード配列をウイルスの非必須領域、例えばポリヘドリン遺伝子内にクローニングし、そしてポリヘドリン・プロモーターの制御下に置く。ペプチド挿入に成功すると、ポリヘドリン遺伝子が不活性になり、そしてコートタンパク質コートを欠く組換えウイルスが産生されるであろう。この組換えウイルスを用いて、Ｓ．フルギペルダ細胞またはトリコプルシア幼生を感染させて、その中でペプチドを発現させる（Ｓｍｉｔｈら， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ４６：５８４（１９８３）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ （ＵＳＡ）９１：３２２４−７（１９９４））。
別の例において、ペプチドをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅し、そして適切なベクター、例えばｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングすることも可能である。ｐＧＥＸベクターは、ベクターにコードされるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、およびベクターのクローニング部位に挿入されたＤＮＡ断片にコードされるタンパク質を含む、融合タンパク質を産生するように設計される。例えば適切な切断部位を含むように、ＰＣＲプライマーを生成することも可能である。もっぱら発現を促進するために、融合部分を用いる場合、またはそうでなければ融合部分が目的のペプチドへの付着物として望ましくない場合、組換え融合タンパク質を融合タンパク質のＧＳＴ部分から切断することも可能である。ｐＧＥＸ−３Ｘ／特異的結合剤ペプチド構築物で大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を形質転換し、そして個々の形質転換体を単離してそして増殖させる。個々の形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製し、そして自動化配列決定装置を用いて、部分的に配列決定して、適切な方向で、所望の特異的結合剤をコードする核酸挿入物が存在することを確認可能である。
細菌中で不溶性封入体として産生されることも可能な融合タンパク質を、以下のように精製することも可能である。遠心分離によって宿主細胞を収集し；０．１５Ｍ ＮａＣｌ
、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄し；そして０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）で、室温で１５分間処理する。超音波処理によって溶解物を透明にし、そして１２，０００ｘｇで１０分間遠心分離することによって、細胞破片をペレットにすることも可能である。融合タンパク質を含有するペレットを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、および１０ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁し、５０％グリセロールに重層し、そして６０００ｘｇで３０分間遠心分離することも可能である。Ｍｇ＋＋およびＣａ＋＋を含まない標準的リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）にペレットを再懸濁することも可能である。再懸濁したペレットを、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分画することによって、融合タンパク質をさらに精製することも可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）。ゲルを０．４Ｍ ＫＣｌに浸して、タンパク質を視覚化し、これを切除して、そしてＳＤＳを含まないゲル泳動緩衝液に電気溶出することも可能である。ＧＳＴ／融合タンパク質を、可溶性タンパク質として細菌中で産生する場合、ＧＳＴ精製モジュール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製することも可能である。
融合タンパク質を消化に供して、本発明のペプチドからＧＳＴを切断することも可能である。消化反応物（０．５ｍｌ ＰＢＳ中の２０〜４０ｍｇ融合タンパク質、２０〜３０単位ヒト・トロンビン（４０００Ｕ／ｍｇ、Ｓｉｇｍａ））を室温で１６〜４８時間インキュベーションし、そして変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに装填して、反応産物を分画することも可能である。ゲルを０．４Ｍ ＫＣｌに浸して、タンパク質バンドを視覚化することも可能である。自動化配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４７３Ａ、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いたアミノ酸配列解析によって、ペプチドの期待される分子量に対応するタンパク質バンドの同一性を確認することも可能である。あるいは、ペプチドのＨＰＬＣおよび／または質量分析を行うことによって、同一性を確認することも可能である。
あるいは、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、望ましいプロモーター、および場合によってリーダー配列を含有するプラスミドにクローニングすることも可能である（Ｂｅｔｔｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−４３（１９８８））。自動化配列決定によって、この構築物の配列を確認することも可能である。次いで、細菌のＣａＣｌ２インキュベーションおよび熱ショック処理を使用する標準法を用いて、該プラスミドで大腸菌株ＭＣ１０６１を形質転換することも可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）。カルベニシリンを補充したＬＢ培地中で、形質転換細菌を増殖させ、そして適切な培地中の増殖によって、発現タンパク質産生を誘導することも可能である。存在する場合、リーダー配列は、ペプチドの分泌を達成し、そして分泌中に切断されることも可能である。
組換え体ペプチドおよびペプチボディの発現のための哺乳動物宿主系が当業者に周知である。発現タンパク質をプロセシングするか、またはタンパク質活性を提供するのに有用であろう特定の翻訳後修飾を生じる、特定の能力に関して、宿主細胞株を選択することも可能である。タンパク質のこうした修飾には、限定されるわけではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）およびアシル化が含まれる。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８等の異なる宿主細胞は、こうした翻訳後活性の特定の細胞機構および特徴的な機序を有し、そして導入した外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングが確実になるように選択可能である。
形質転換細胞が長期高収率タンパク質産生に用いられることが好ましい。こうした細胞が、望ましい発現カセットとともに、選択可能マーカーを含有するベクターで形質転換されたら、選択培地に切り替える前に、細胞を強化培地で１〜２日間増殖させることも可能である。選択可能マーカーは、導入された配列を発現するのに成功した細胞の増殖および回収を可能にするように設計される。使用する細胞株に適した組織培養技術を用いて、安定に形質転換された細胞の耐性凝集塊を増殖させることも可能である。
いくつかの選択系を用いて、組換えタンパク質産生のために形質転換された細胞を回収することも可能である。こうした選択系には、限定されるわけではないが、それぞれｔｋ−細胞、ｈｐｇｒｔ−細胞またはａｐｒｔ−細胞中の、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼおよびアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。また、メトトレキセートへの耐性を与えるｄｈｆｒ；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ；アミノ配糖体Ｇ４１８に対する耐性を与え、そしてクロルスルフロンに対する耐性を与えるｎｅｏ；およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏに関する選択の基礎として、代謝拮抗剤耐性を用いることも可能である。有用でありうるさらなる選択可能遺伝子には、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するのを可能にするｔｒｐＢ、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するのを可能にするｈｉｓＤが含まれる。形質転換体同定のための視覚的指標を与えるマーカーには、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、並びにルシフェラーゼおよびその基質、ルシフェリンが含まれる。
結合剤の精製および再フォールディング
いくつかの場合、本発明のペプチドおよび／またはペプチボディなどの結合剤は、生物学的に活性になるために、「再フォールディング」され、そして酸化されて適切な三次構造になり、そしてジスルフィド連結が生成される必要がある可能性もある。当該技術分野に周知のいくつかの方法を用いて、再フォールディングを達成することも可能である。こうした方法には、例えば、カオトロピック剤の存在下で、通常７より高いｐＨに、可溶化したポリペプチド剤を曝露することが含まれる。カオトロープの選択は、封入体可溶化に用いる選択と類似であるが、典型的には、カオトロープは、より低い濃度で用いられる。典型的なカオトロピック剤はグアニジンおよび尿素である。大部分の場合、再フォールディング／酸化溶液はまた、還元剤に加えて特定の比で酸化型を含有して、特定の酸化還元電位を生じ、ジスルフィド・シャフリングを可能にして、システイン架橋の形成を生じる。いくつかの通常用いられるレドックス対には、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトールＤＴＴ／ジチアンＤＴＴ、および２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂＭＥが含まれる。多くの場合、共溶媒（ｃｏ−ｓｏｌｖｅｎｔ）を用いて、再フォールディングの効率を増加させることも可能である。一般的に用いられる共溶媒には、グリセロール、多様な分子量のポリエチレングリコール、およびアルギニンが含まれる。
本発明のペプチドおよびペプチボディを精製することが望ましい可能性もある。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、１つのレベルで、タンパク質性分画および非タンパク質性分画の粗分画（ｃｒｕｄｅ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）を伴う。他のタンパク質からペプチドおよび／またはペプチボディを分離したら、クロマトグラフィー技術および電気泳動技術を用いて、目的のペプチドまたはポリペプチドをさらに精製して、部分的精製または完全精製（または均質になるまでの精製）を達成することも可能である。本発明のペプチボディおよびペプチドの調製物に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、迅速タンパク質液体クロマトグラフィーまたは同等のＨＰＬＣである。
本発明の特定の側面は、精製に関し、そして特定の態様において、本発明のペプチボディまたはペプチドの実質的な精製に関する。用語「精製されたペプチボディまたはペプチド」は、本明細書において、他の構成要素から分離可能な組成物を指すよう意図され、ここでペプチボディまたはペプチドは、天然に得られうる状態に比較して、いずれかの度合いに精製されている。したがって、精製されたペプチドまたはペプチボディはまた、天然に生じうる環境から自由なペプチボディまたはペプチドも指す。
一般的に、「精製された」は、多様な他の構成要素を除去する分画に供された、そしてその発現される生物学的活性を実質的に保持する、ペプチド組成物またはペプチボディ組成物を指すであろう。用語「実質的に精製された」を用いる場合、この意味は、ペプチボディまたはペプチドが組成物の主要な構成要素を形成し、例えば組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはそれより多くを構成する、ペプチド組成物またはペプチボディ組成物を指すであろう。
本開示の観点から、ペプチドまたはペプチボディの精製の度合いを定量化する多様な方法が当業者に知られるであろう。これらには、例えば、活性分画の特異的結合活性を測定するか、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析によって、分画内のペプチドまたはペプチボディの量を評価することが含まれる。ペプチド分画またはペプチボディ分画の純度を評価するのに好ましい方法は、分画の結合活性を計算し、これを最初の抽出物の結合活性に比較して、そしてこうして本明細書において「倍精製数」によって評価される、精製の度合いを計算することである。結合活性の量を表すのに用いられる実際の単位は、もちろん、精製を追跡するために選択された特定のアッセイ技術に応じるであろうし、そしてペプチボディまたはペプチドが検出可能な結合活性を示すかどうかに応じるであろう。
精製に使用するのに適した多様な技術が、当業者に周知であろう。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体（免疫沈降）等を用いた沈殿、または熱変性、その後の遠心分離；アフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテイン−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、イオン交換、ゲルろ過、逆相、ヒドロキシルアパタイトおよびアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー工程；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；並びにこうした技術および他の技術の組み合わせが含まれる。当該技術分野に一般的に知られるように、多様な精製工程を行う順序を変化させることも可能であるし、または特定の工程を省略し、そしてなお、実質的に精製された結合剤の適切な調製法を生じることも可能であると考えられる。
本発明の結合剤が、常に最も精製された状態で提供される一般的な必要条件はない。実際、実質的により精製されていない結合剤産物は、特定の態様において有用性を有するであろうことが意図される。より少ない精製工程を組み合わせて用いることによって、または同じ一般的精製スキームの異なる型を利用することによって、部分的精製を達成することも可能である。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に、低圧クロマトグラフィー系を利用する同じ技術よりも、より大きな「倍」精製を生じるであろう。相対的により低い度合いの精製を示す方法は、ペプチドまたはペプチボディの総回収に、あるいはペプチドまたはペプチボディの結合活性を維持するのに有利である可能性もある。
ペプチドまたはポリペプチドの移動が、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの異なる条件で多様である、ときに有意に多様であることが知られる（Ｃａｐａｌｄｉら， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ， ７６：４２５（１９７７））。したがって、異なる電気泳動条件下で、精製されたまたは部分的に精製された結合剤発現産物の見かけの分子量が多様でありうることが認識されるであろう。
ミオスタチン結合剤の活性
本発明の結合剤を構築した後、ミオスタチンに結合し、そしてミオスタチン活性を阻害するかまたは遮断する能力に関して、該結合剤を試験する。いかなる数のアッセイまたは動物試験を用いて、剤がミオスタチン活性を阻害するかまたは遮断する能力を決定することも可能である。本発明のペプチドおよびペプチボディを性質決定するのに用いられるいくつかのアッセイを、以下の実施例に記載する。１つのアッセイは、Ｃ２Ｃ１２ ｐＭＡ
ＲＥ−ｌｕｃアッセイであり、該アッセイは、ミオスタチン／アクチビン応答要素（ＭＡＲＥ）を含有するルシフェラーゼ・レポーターベクターでトランスフェクションした、ミオスタチン応答性細胞株（Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞）を利用する。一連のペプチボディ希釈物をミオスタチンとプレインキュベーションし、そして次いで細胞をインキュベーション混合物に曝露することによって、典型的なペプチボディをアッセイする。生じたルシフェラーゼ活性を測定し、そして一連のペプチボディ希釈物から滴定曲線を生成する。次いで、ＩＣ５０（ルシフェラーゼ活性によって測定されるようなミオスタチン活性の５０％阻害を達成するペプチボディの濃度）を決定した。以下に記載する第二のアッセイは、ミオスタチン結合剤の動力学パラメーターｋａ（会合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）、およびＫＤ（解離平衡定数）を決定するＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイである。解離平衡定数（ＫＤ、ｎＭで表される）がより低いことは、ミオスタチンに対するペプチボディのアフィニティーがより高いことを示した。さらなるアッセイには、ペプチボディなどの結合剤が中和性である（受容体へのミオスタチンの結合を妨げる）か、または非中和性である（受容体へのミオスタチンの結合を妨げない）かを決定する、遮断アッセイ；本発明の結合剤が、ミオスタチンに選択的に結合して、そして他のＴＧＦβファミリーメンバーに結合しないかどうかを決定する、選択性アッセイ；およびやはりＫＤを決定し、そしていくつかの状況では、より感受性であると見なされる、ＫｉｎＥｘ ＡＴＭアッセイまたは溶液に基づく平衡アッセイが含まれる。これらのアッセイを実施例３に記載する。
図１は、ペプチドのペプチボディ型のＩＣ５０と比較したペプチドのＩＣ５０を示す。これは、ミオスタチン活性を阻害する際に、ペプチボディがペプチド単独よりも、有意により有効であることを立証する。さらに、アフィニティー成熟ペプチボディは、一般的に、親ペプチドおよびペプチボディに比較して、改善されたＩＣ５０およびＫＤ値を示す。いくつかの典型的なアフィニティー成熟ペプチボディのＩＣ５０値を、以下の実施例７の表ＶＩＩに示す。さらに、いくつかの場合、２つのペプチドがタンデムに付着された２ｘ型のペプチボディを作成すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ両方で、ペプチボディの活性が増加する。
ｉｎ ｖｉｖｏ活性を以下の実施例に示す。結合剤の活性には、動物モデルにおいて除脂肪筋量を増加させるとともに、処置した動物モデルの総体重に対して脂肪量を減少させ、そして動物モデルにおいて筋力を増加させる、アナボリック活性が含まれる。
ミオスタチン結合剤の使用
本発明のミオスタチン結合剤は、ミオスタチンに結合し、そしてターゲットとされた細胞内のミオスタチンシグナル伝達を遮断するかまたは阻害する。本発明は、１以上のミオスタチン結合剤の有効投薬量を動物に投与することによって、動物におけるミオスタチンの量または活性を減少させる方法および試薬を提供する。１つの側面において、本発明は、動物においてミオスタチン関連障害を治療する方法および試薬であって、該動物に１以上の結合剤の有効投薬量を投与することを含むものを提供する。これらのミオスタチン関連障害には、限定されるわけではないが、筋萎縮の多様な型とともに、糖尿病および関連障害などの代謝障害、並びに骨粗しょう症などの骨変性疾患が含まれる。
以下の実施例８に示すように、本発明の典型的なペプチボディは、ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスモデルにおける除脂肪筋量を劇的に増加させる。このｉｎ ｖｉｖｏ活性は、同じペプチボディに関する、以下に記載するｉｎ ｖｉｔｒｏ結合活性および阻害活性に相関する。
筋萎縮障害には、デュシェンヌ筋ジストロフィー、進行性筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、デジェリン・ランドゥジー筋ジストロフィー、エルブ筋ジストロフィー、および小児神経軸索筋ジストロフィーなどのジストロフィーが含まれる。例えば、
ｉｎ ｖｉｖｏで、抗体の使用を介してミオスタチンを遮断すると、デュシェンヌ筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルのジストロフィー表現型が改善された（Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃｈら， Ｎａｔｕｒｅ ４２０， ２８（２００２））。本発明のペプチボディは、老齢ｍｄｘマウスモデルに投与した際、体重の割合としての除脂肪筋量を増加させ、そして体重の割合としての脂肪量を減少させる。
さらなる筋萎縮障害は、筋萎縮性側索硬化症、うっ血性閉塞性肺疾患、癌、ＡＩＤＳ、腎不全、および関節リウマチなどの慢性疾患から生じる。例えば、ミオスタチンを全身投与することによって、無胸腺ヌードマウスにおいて、悪液質または筋萎縮および体重減少が誘導された（Ｚｉｍｍｅｒｓら、上記）。別の例において、ミオスタチン免疫応答性タンパク質の血清および筋内濃度は、ＡＩＤＳ関連筋萎縮を示すヒトで増加していることが見出され、そして脂肪不含量に逆に相関した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９５：１４９３８−１４９４３（１９９８））。筋萎縮を生じるさらなる状態は、車椅子での拘束などの身体障害による不動、脳卒中、疾病、脊椎傷害、骨折または外傷による長期間の絶対安静、および微小重力環境（宇宙飛行）での筋萎縮症から生じうる。例えば、血漿ミオスタチン免疫応答性タンパク質は、長期間の絶対安静後に増加することが見出された（Ｚａｃｈｗｉｅｊａら， Ｊ Ｇｒａｖｉｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ６（２）：１１（１９９９））。スペースシャトル飛行中、微小重力環境に曝露されたラットの筋肉は、曝露されていないラットの筋肉と比較して、増加した量のミオスタチンを発現することもまた見出された（Ｌａｌａｎｉら， Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎ １６７（３）：４１７−２８（２０００））。
さらに、筋に対する脂肪の比の年齢に関連する増加、および年齢に関連する筋萎縮症は、ミオスタチンに関連するようである。例えば、平均血清ミオスタチン免疫応答性タンパク質は、若年（１９〜３５歳）、中年（３６〜７５歳）、および老年（７６〜９２歳）の男性および女性群において、年齢とともに増加し、一方、平均筋量および脂肪不含量は、これらの群において、年齢とともに下降した（Ｙａｒａｓｈｅｓｋｉら， Ｊ Ｎｕｔｒ
Ａｇｉｎｇ ６（５）：３４３−８（２００２））。マウスにおいてミオスタチン遺伝子をノックアウトすると、筋形成が増加し、そして脂肪形成が減少し（Ｌｉｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２９１（３）：７０１−６（２００２））、筋量が増加し、そして脂肪集積およびレプチン分泌が減少した成体が生じることもまた示されている。典型的なペプチボディは、以下に示すように、老齢ｍｄｘマウスにおいて、脂肪に対する除脂肪筋量の比を改善する。
さらに、現在、ミオスタチンは、心筋において低レベルで発現され、そして梗塞後に心筋細胞で発現が上方制御されることが示されている（Ｓｈａｒｍａら， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １８０（１）：１−９（１９９９））。したがって、心筋においてミオスタチンレベルが減少すると、梗塞後、心筋の回復が改善される可能性もある。
ミオスタチンはまた、２型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、高血糖、および肥満を含む代謝障害にも影響を及ぼすようである。例えば、ミオスタチンが欠如すると、２つのマウスモデルの肥満および糖尿病表現型が改善されることが示されている（Ｙｅｎら、上記）。以下の実施例において、本発明の阻害剤の投与によって、ミオスタチン活性を減少させると、老齢動物モデルを含む動物において、筋に対する脂肪の比が減少することが立証されている。したがって、本発明の阻害剤を投与することによって、脂肪組成を減少させると、動物において、糖尿病、肥満、および高血糖状態が改善されるであろう。
さらに、ミオスタチンレベルを減少させることによって、筋量を増加させると、骨強度が改善され、そして骨粗しょう症および他の変性骨疾患を減少させることも可能である。例えば、ミオスタチン欠損マウスが、マウス上腕骨のミネラル含量および密度の増加、並
びに筋が付着する領域の、骨梁部および皮質骨両方のミネラル含量の増加とともに筋量の増加を示すことが見出された（Ｈａｍｒｉｃｋら、 Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ ７１（１）：６３−８（２００２））。
本発明はまた、動物にミオスタチン結合剤の有効投薬量を投与することによって、食用動物における筋量を増加させる方法および試薬も提供する。成熟Ｃ末端ミオスタチン・ポリペプチドは、試験したすべての種で同一であるため、ミオスタチン結合剤は、ウシ、ニワトリ、七面鳥、およびブタを含む、農業的に重要な種のいずれにおいても、筋量を増加させ、そして脂肪を減少させるのに有効であると期待されるであろう。
本発明の結合剤を、単独で、または他の療法剤と組み合わせて用いて、療法効果を増進させるか、または潜在的な副作用を減少させることも可能である。本発明の結合剤は、剤の療法価値を改善する、１以上の特性の望ましいが予期されぬ組み合わせを所持する。これらの特性には、活性増加、可溶性増加、分解減少、半減期増加、毒性減少、および免疫原性減少が含まれる。したがって、本発明の結合剤は、広範な治療措置に有用である。さらに、本発明の化合物の親水性および疎水性の特性はよくバランスがとれており、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏおよび特にｉｎ ｖｉｖｏでの使用両方に対して有用性が増進する。具体的には、本発明の化合物は、体における吸収および生物学的利用能を可能にする、水性媒体中の適切な度合いの可溶性を有する一方、化合物が、特定の筋肉塊などの推定上の作用部位へと細胞膜を横断するのを可能にする、脂質中のある度合いの可溶性を有する。
本発明の結合剤は、適切な組成物中、有効投薬量で投与された際、ヒトを含む、「被験者」または動物いずれかを治療するのに有用である。
さらに、本発明のミオスタチン結合剤は、いくつかのアッセイにおいて、ミオスタチンを検出し、そして定量化するのに有用である。これらのアッセイを以下により詳細に記載する。
一般的に、本発明の結合剤は、例えばＡｓａｉ監修， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ中， ３７， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， ニューヨーク（１９９３）に記載されるのと類似の多様なアッセイにおいて、ミオスタチンに結合し、そしてこれを固定する捕捉剤として有用である。ある方式で結合剤を標識するか、またはミオスタチンを検出しそして定量化するのを可能にするように標識された抗結合剤抗体などの第三の分子と反応させることも可能である。例えば、結合剤または第三の分子をビオチンなどの検出可能部分で修飾することも可能であり、これが次いで、酵素標識ストレプトアビジン、または他のタンパク質などの第四の分子に結合されることも可能である（Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３５：２５８９（１９８５）；Ｃｈａｕｂｅｒｔ， Ｍｏｄ
Ｐａｔｈｏｌ １０：５８５（１９９７））。
特定のいずれかのアッセイ中、試薬の組み合わせ各々の後に、インキュベーション工程および／または洗浄工程が必要でありうる。インキュベーション工程は、約５秒間〜数時間で多様である可能性があり、好ましくは約５分間〜約２４時間である。しかし、インキュベーション時間は、アッセイ形式、溶液体積、濃度等に応じるであろう。通常、アッセイは周囲温度で行われるであろうが、ある範囲の温度で行われることも可能である。
非競合結合アッセイ：
結合アッセイは、捕捉されたミオスタチンの量を直接測定する、非競合型であることも可能である。例えば、１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、結合剤を直接固体支持体に結合させて、固定することも可能である。次いで、これらの固定された剤を
、試験試料中に存在するミオスタチンに結合させる。次いで、固定されたミオスタチンを、ミオスタチンに対する標識抗体などの標識剤と結合させ、この標識剤を検出することも可能である。別の好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、ビオチンなどの検出可能部分を含有する、結合剤に特異的な第二の剤を添加し、これにストレプトアビジンなどの第三の標識分子が特異的に結合することも可能である（本明細書に援用される、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第１４章， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
ニューヨーク（１９８８）を参照されたい）。
競合的結合アッセイ：
結合アッセイは競合型であることも可能である。試料中に存在するミオスタチンにより、結合剤から置換されたかまたは競合されたミオスタチンの量を測定することによって、試料中に存在するミオスタチンの量を間接的に測定する。１つの好ましい競合的結合アッセイにおいて、通常、標識された既知の量のミオスタチンを試料に添加し、そして次いで試料を結合剤と接触させる。結合剤に結合する標識ミオスタチンの量は、試料に存在するミオスタチンの濃度に反比例する（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第１４章， ｐｐ．５７９−５８３， 上記に見られるプロトコルにしたがう）。
別の好ましい競合結合アッセイにおいて、結合剤を固体支持体上に固定する。ミオスタチン／結合剤複合体に存在するミオスタチンの量を測定することによって、あるいは複合体化していない、残ったミオスタチンの量を測定することによって、結合剤に結合したミオスタチンの量を測定することも可能である。
他の結合アッセイ
本発明はまた、試料中のミオスタチンの存在を検出するかまたは定量化するウェスタンブロット法も提供する。該技術は、一般的に、分子量に基づいて、ゲル電気泳動によって、試料タンパク質を分離し、そして該タンパク質を、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化ナイロンフィルターなどの適切な固体支持体に移すことを含む。ミオスタチンに結合する結合剤またはその断片と試料をインキュベーションし、そして生じた複合体を検出する。これらの結合剤を直接標識することも可能であるし、あるいは結合剤に特異的に結合する標識抗体を用いて続いて検出することも可能である。
診断アッセイ
本発明の結合剤またはその断片は、ミオスタチン量の増加によって特徴付けられる状態または疾患の診断に有用である可能性もある。高レベルのミオスタチンに関する診断アッセイには、ヒト体液、細胞抽出物または特定の組織抽出物において、ミオスタチンを検出する結合剤および標識を利用した方法が含まれる。例えば、個体において、長期に渡り、ミオスタチンの血清レベルを測定して、例えばＹａｒａｓｈｅｓｋｉら、上記に記載されるような、加齢または不動と関連する筋萎縮の開始を決定することも可能である。ミオスタチンレベルの増加は、年齢が増加する男性群および女性群において、平均筋量および脂肪不含量の減少と相関することが示された（Ｙａｒａｓｈｅｓｋｉら、上記）。本発明の結合剤は、例えば、長期に渡り、既定の個体のミオスタチンレベルの増加または減少を監視するのに有用である可能性もある。こうしたアッセイにおいて、修飾を伴い、または伴わずに、結合剤を用いることも可能である。好ましい診断アッセイにおいて、結合剤は、例えば標識またはレポーター分子を付着させることによって、標識されるであろう。非常に多様な標識およびレポーター分子が知られ、これらのいくつかは、すでに本明細書に記載されている。特に、本発明はヒト疾患の診断に有用である。
ミオスタチンの結合剤を用いてミオスタチン・タンパク質を測定する、多様なプロトコ
ルが、当該技術分野に知られる。例には、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）が含まれる。
診断適用のため、特定の態様において、本発明の結合剤は、典型的には検出可能部分で標識されるであろう。検出可能部分は、直接または間接的に検出可能シグナルを産生可能なものいずれであることも可能である。例えば、検出可能部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉなどの放射性同位体、フルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンなどの蛍光または化学発光化合物；あるいはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはセイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼなどの酵素であることも可能である（Ｂａｙｅｒら， Ｍｅｔｈ Ｅｎｚ， １８４：１３８（１９９０））。
薬剤組成物
本明細書に記載するペプチボディなどのミオスタチン結合剤の薬剤組成物は、本発明の範囲内である。こうした組成物は、本明細書に記載するような、療法的または予防的に有効な量のミオスタチン結合剤、その断片、変異体、または誘導体を、薬学的に許容しうる剤と組み合わせて含む。好ましい態様において、薬剤組成物は、薬学的に許容しうる剤と混合された、ミオスタチンを部分的または完全に阻害するアンタゴニスト結合剤を含む。典型的には、ミオスタチン結合剤は、動物に投与するため、十分に精製されているであろう。
薬剤組成物は、例えば組成物のｐＨ、浸透圧、粘性、透明度、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解速度または放出速度、吸着または浸透を修飾するか、維持するか、または保存する配合物質を含有することも可能である。適切な配合物質には、限定されるわけではないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど）；抗菌剤；酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸など）；充填剤（ｂｕｌｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなど）；増量剤（ｆｉｌｌｅｒ）；単糖；二糖および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン類など）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；着色剤；フレーバー剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））；安定性増進剤（スクロースまたはソルビトール）；等張化増進剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（アルカリ金属ハロゲン化物（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、マンニトールソルビトール）；搬送ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または薬剤佐剤が含まれる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１８版， Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ監修， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０）。
最適薬剤組成物は、例えば、意図される投与経路、搬送形式、および望ましい投薬量に応じて、当業者によって決定されるであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記を参照されたい。こうした組成物は、結合剤の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼしうる。
薬剤組成物中の主なビヒクルまたはキャリアーは、水性または非水性いずれであることも可能である。例えば、適切なビヒクルまたはキャリアーは、注射用水、生理学的食塩水溶液または人工的脳脊髄液であって、場合によって非経口投与用の組成物に一般的な他の物質が補充されているものであることも可能である。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水が、さらなる典型的なビヒクルである。他の典型的な薬剤組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、これらはさらにソルビトールまたはひいては適切な代用物を含むことも可能である。本発明の１つの態様において、結合剤組成物は、凍結乾燥ケークまたは水性溶液の形で、場合による配合剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記）と、望ましい度合いの純度を有する選択した組成物を混合することによって、保存用の結合剤組成物を調製することも可能である。さらに、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて、結合剤産物を凍結乾燥物として配合することも可能である。
薬剤組成物を非経口搬送用に選択することも可能である。あるいは、吸入または経腸搬送のため、例えば経口、耳、眼、直腸、または膣搬送のため、組成物を選択することも可能である。こうした薬学的に許容しうる組成物は、当該技術分野の技術範囲内である。
配合物構成要素は、投与部位に許容されうる濃度で存在する。例えば、緩衝液を用いて、組成物を生理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に、組成物を維持する。
非経口投与が意図される場合、本発明で使用する療法組成物は、発熱物質不含の、非経口的に許容されうる水性溶液の形であることも可能であり、薬学的に許容しうるビヒクル中に所望の結合剤を含む。非経口注射に特に適したビヒクルは、無菌蒸留水であり、この中で結合剤は、適切に保存された無菌等張溶液として配合される。さらに別の調製は、産物の徐放または持続放出を提供し、次いで産物が蓄積注射（ｄｅｐｏｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を介して搬送されうる、注射可能微小球体、生体侵食性粒子、ポリマー性化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームなどの剤と所望の分子の配合を伴うことも可能である。ヒアルロン酸もまた使用可能であり、そしてこれは循環中にある期間の維持を促進する効果を有しうる。望ましい分子を導入する他の適切な手段には移植可能薬剤搬送装置が含まれる。
別の側面において、非経口投与に適した薬剤配合物を、水性溶液、好ましくは生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的緩衝生理食塩水中に配合することも可能である。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘性を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有することも可能である。さらに、活性化合物の懸濁物を、適切な油性注射懸濁物として調製することも可能である。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、あるいはオレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが含まれる。非脂質ポリカチオン性アミノ酸ポリマーもまた、搬送に使用可能である。場合によって、懸濁物はまた、化合物の可溶性を増加させ、そして非常に濃縮された溶液の調製を可能にするのに適した安定化剤または剤を含有することも可能である。別の態様において、薬剤組成物を吸入用に配合することも可能である。例えば、結合剤を、吸入用の乾燥粉末として配合することも可能である。ポリペプチドまたは核酸分子吸入溶液を、エアロゾル搬送のため、噴霧剤とともに配合することもまた可能である。さらに別の態様
において、溶液を噴霧することも可能である。肺投与はＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号にさらに記載され、該出願は、化学的修飾タンパク質の肺搬送を記載する。
特定の配合物を経口投与可能であることもまた意図される。本発明の１つの態様において、この様式で投与される結合剤分子を、錠剤およびカプセルなどの固体投薬型の配合に通例用いられるキャリアーを含み、または含まずに、配合することも可能である。例えば、生物学的利用能が最大になり、そして前全身分解が最小になる胃腸管の時点で、配合物の活性部分が放出されるように、カプセルを設計することも可能である。結合剤分子の吸収を促進するため、さらなる剤を含めることも可能である。希釈剤、フレーバー剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および製剤結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）もまた、使用可能である。
経口投与に適した投薬型で、当該技術分野に周知の薬学的に許容しうるキャリアーを用いて、経口投与のための薬剤組成物を配合することもまた可能である。こうしたキャリアーは、薬剤組成物が、患者に摂取される錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤等として配合されることを可能にする。
活性化合物を固体賦形剤と合わせて、そして生じた顆粒混合物を（場合によって粉砕した後）プロセシングして、錠剤または糖剤コアを得ることによって、経口使用のための薬剤調製物を得ることも可能である。望ましい場合、適切な補助剤を添加することも可能である。適切な賦形剤には、炭水化物またはタンパク質増量剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトールを含む糖；トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、コムギ（ｗｈｅａｔ）、イネ（ｒｉｃｅ）、ジャガイモ（ｐｏｔａｔｏ）、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；並びにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質が含まれる。望ましい場合、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、およびアルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの、崩壊剤または可溶化剤を添加することも可能である。
濃縮糖溶液であって、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物もまた含有可能な前記濃縮糖溶液などの、適切なコーティングと組み合わせて、糖剤コアを用いることも可能である。染料または色素を錠剤または糖剤コーティングに添加して、製品を同定するか、または活性化合物の量、すなわち投薬量を性質決定することも可能である。
経口的に使用可能な薬剤調製物には、ゼラチンで作成された押し込み型カプセルとともに、ゼラチンおよびコーティング、例えばグリセロールまたはソルビトールで作成されたソフト密封カプセルもまた含まれる。押し込み型カプセルは、ラクトースまたはデンプンなどの増量剤または製剤結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および場合によって安定化剤と混合された活性成分を含有することも可能である。ソフトカプセル中、活性化合物を、安定化剤を含み、または含まず、適切な液体、例えば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールに溶解するか、または懸濁することも可能である。
別の薬剤組成物は、錠剤の製造に適した非毒性賦形剤と混合された、有効量の結合剤を含むことも可能である。錠剤を、無菌水、または他の適切なビヒクルに溶解することによって、単位用量型で溶液を調製することも可能である。適切な賦形剤には、限定されるわけではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース
、またはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；あるいはデンプン、ゼラチン、またはアカシアなどの結合剤；あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクなどの潤滑剤が含まれる。
さらなる薬剤組成物が当業者に明らかであり、こうした組成物には、持続搬送または徐放搬送配合物中の結合剤分子を伴う配合物が含まれる。多様な他の持続搬送または徐放搬送手段、例えばリポソームキャリアー、生体侵食性微小粒子または多孔ビーズおよび蓄積注射を配合する技術もまた、当業者に知られる。例えば、薬剤組成物を搬送するための多孔ポリマー微小粒子の徐放を記載する、ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照されたい。持続放出調製物のさらなる例には、成型物品、例えばフィルムまたは微小カプセルの形の半透性ポリマーマトリックスが含まれる。持続放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（ＵＳ ３，７７３，９１９、ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ・エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ， ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ．， １５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒら， Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ．， １２：９８−１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、上記）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８）が含まれることも可能である。持続放出組成物にはまた、当該技術分野に知られるいくつかの方法のいずれによっても調製可能なリポソームが含まれる。例えばＥｐｐｓｔｅｉｎら， ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）， ８２：３６８８（１９８５）；ＥＰ ３６，６７６；ＥＰ ８８，０４６；ＥＰ １４３，９４９を参照されたい。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に用いようとする薬剤組成物は、典型的には無菌でなければならない。これは、無菌ろ過膜を通じたろ過によって達成可能である。組成物を凍結乾燥する場合、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥および再構成前にまたはその後に行うことも可能である。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥型で、または溶液中で保存することも可能である。さらに、非経口組成物は、一般的に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に入れられる。
薬剤組成物を配合したら、溶液、懸濁物、ゲル、エマルジョン、固体、あるいは脱水または凍結乾燥粉末として、無菌バイアル中で保存することも可能である。こうした配合物は、すぐに使える型で、または投与前に再構成を要する型（例えば凍結乾燥型）いずれで保存することも可能である。
特定の態様において、本発明は、単回用量投与単位を生じるキットに関する。該キットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性配合物を有する第二の容器両方を含有することも可能である。本発明の範囲内にやはり含まれるのは、単一チャンバーおよび多チャンバーのあらかじめ充填されたシリンジ（例えば液体シリンジおよびリオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅｓ））を含有するキットである。
療法的に使用すべき薬剤組成物の有効量は、例えば、療法背景および目的に応じるであろう。したがって当業者は、治療に適した投薬レベルが、部分的に、搬送する分子、結合剤分子を用いようとする徴候、投与経路、並びに患者の大きさ（体重、体表面積または臓器の大きさ）および状態（年齢および全身の健康状態）に応じるであろうことを認識するであろう。したがって、臨床家は、投薬量を滴定し、そして投与経路を修正して、最適療法効果を得ることも可能である。典型的な投薬量は、上述の要因に応じて、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで、またはそれより多い範囲であることも可能である。他の態様において、投薬量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または１ｍｇ
／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であることも可能である。
いかなる化合物に関しても、まず、細胞培養アッセイにおいて、あるいはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、またはサルなどの動物モデルにおいて、療法的有効用量を概算することも可能である。動物モデルを用いて、適切な濃度範囲および投与経路を決定することもまた可能である。次いで、こうした情報を用いて、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定することも可能である。
正確な投薬量は、治療を要する被験者に関する要因を考慮して決定されるであろう。投薬量および投与を調整して、十分なレベルの活性化合物を提供するか、または望ましい効果を維持する。考慮に入れることが可能な要因には、疾患状態の重症度、被験者の全身の健康状態、被験者の年齢、体重、および性別、投与時間および投与頻度、薬剤併用（単数または複数）、反応感度、並びに療法への反応が含まれる。特定の配合物の半減期およびクリアランス速度に応じて、長く作用する薬剤組成物を３〜４日ごとに、毎週、または２週に一度、投与することも可能である。
投薬頻度は、用いる配合物中の結合剤分子の薬物動態学パラメーターに応じるであろう。典型的には、望ましい効果を達成する投薬量に達するまで、組成物を投与する。したがって、単回用量として、または長期に渡る多数の用量として（同じまたは異なる濃度／投薬量で）、または連続注入として、組成物を投与することも可能である。適切な投薬量のさらなる改良が日常的に行われる。適切な用量−反応データを使用して、適切な投薬量を確定することも可能である。
薬剤組成物の投与経路は、既知の方法にしたがい、例えば経口投与、注射を通じた、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋内、眼内、動脈内、門脈内、病巣内経路、髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、尿道、膣、または結腸手段、持続放出系によるもの、あるいは移植装置によるものである。望ましい場合、巨丸剤（ｂｏｌｕｓ）注射によって、または注入によって連続して、または移植装置によって組成物を投与することも可能である。
あるいは、またはさらに、所望の分子が吸収されているか、または被包されている、膜、スポンジ、または別の適切な物質の移植を介して、組成物を局所投与することも可能である。移植装置を用いる場合、装置を適切な組織または臓器内に移植することも可能であり、そして望ましい分子の搬送は、分散、持続放出巨丸剤、または連続投与を介したものであることも可能である。
いくつかの場合、ｅｘ ｖｉｖｏ方式で薬剤組成物を用いることが望ましい可能性もある。こうした場合、患者から除去された細胞、組織、または臓器を薬剤組成物に曝露し、その後、細胞、組織および／または臓器を、続いて患者に移植しなおす。
他の場合、本明細書に記載するものなどの方法を用いて、遺伝子操作した特定の細胞を移植して、ポリペプチドを発現させ、そして分泌させることによって、ペプチボディなどの本発明の結合剤を搬送することも可能である。こうした細胞は、動物細胞またはヒト細胞であることも可能であり、そして自己、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）、または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であることも可能である。場合によって、細胞を不死化することも可能である。免疫学的応答の可能性を減少させるため、細胞を被包して、取り巻く組織の浸潤を回避することも可能である。被包物質は、典型的には、生体適合性半透性ポリマー封入物または膜であり、これらはタンパク質産物（単数または複数）の放出を可能にするが、患者免疫系による、または取り巻く組織からの他の有害な因子による、細胞の
破壊を妨げる。
本発明の結合剤を含有する薬剤組成物を被験者に投与して、ミオスタチン関連障害いずれかを治療する。これらには、限定されるわけではないが筋ジストロフィーを含む筋萎縮障害、癌、ＡＩＤＳ、筋萎縮症、関節リウマチ、腎不全／尿毒症、慢性心不全、長期間の絶対安静、脊椎傷害、脳卒中、および加齢に関連するサルコペニアによる筋萎縮が含まれる。さらに、これらの組成物は、肥満、糖尿病、高血糖を治療するため、そして骨密度を増加させるために投与される。
本発明が記載されてきているが、以下の実施例は、例示の目的で提供され、そして限定のためではない。
（実施例１）
ミオスタチン結合ペプチドの同定
３つの繊維状ファージライブラリー、ＴＮ８−ＩＸ（５ｘ１０９独立形質転換体）、ＴＮ１２−Ｉ（１．４ｘ１０９独立形質転換体）、および直鎖（２．３ｘ１０９独立形質転換体）（Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．）を用いて、ミオスタチン結合ファージに関して選択した。ミオスタチンでコーティングした表面上で各ライブラリーをインキュベーションし、そして異なるパニング条件に供した：非特異的溶出、および組換えヒト・アクチビン受容体ＩＩＢ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）を用いた特異的溶出、または以下に記載するようなミオスタチン・プロペプチド溶出。３つのライブラリーすべてに関して、第一の選択周期では、非特異的方式でファージを溶出させ、一方、第二および第三の選択周期では、受容体およびプロミオスタチンを用いた。以下に記載するように選択法を行った。
ミオスタチンの調製
以下のように、大腸菌Ｋ−１２株２５９６（ＡＴＣＣ＃２０２１７４）において、ミオスタチン・タンパク質を組換え的に産生した。公開国際特許出願ＷＯ ００／２４７８２に記載される方法にしたがって、発現ベクターｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ番号６９５７６）および米国特許第４，７１０，４７３号に記載される発現ベクター系に由来するｐＡＭＧ２１発現ベクター（ＡＴＣＣ番号９８１１３）に、ヒト・プロミオスタチン分子をコードするポリヌクレオチドをクローニングした。プロミオスタチンをコードするポリヌクレオチドを哺乳動物発現ベクターから得た。標準的ＰＣＲ法、並びにＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩの制限部位を導入する以下のＰＣＲプライマーを用いて、コード領域を増幅した。
Figure 2010193888
ＰＣＲ産物およびベクターを両酵素で消化し、混合し、そして連結した。連結産物を大腸菌株＃２５９６に形質転換した。封入体の形で組換えタンパク質が発現されているかどうか、顕微鏡で単一コロニーをチェックした。プラスミドを単離し、そして組換え遺伝子のコード領域を通じて配列決定して、遺伝的忠実を確認した。
バッチ法を用いて、３７℃で、１０Ｌ発酵から細菌ペーストを生成した。細胞密度が９．６ ＯＤ６００のときに培養物をＨＳＬで誘導し、そして６時間後に１０４ ＯＤ６００の密度で採取した。ペーストを−８０℃で保存した。プロミオスタチンを発現する大腸
菌ペーストを微小流動装置中で１６，０００ｐｓｉで溶解し、遠心分離して不溶性封入体分画を単離した。ジチオスレイトールを含有する塩酸グアニジン中に封入体を再懸濁し、そして室温で可溶化した。次いで、これを水性緩衝液中で３０倍に希釈した。次いで、再フォールディングされたプロミオスタチンを濃縮し、そして２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に緩衝液交換し、そして陰イオン交換カラムに適用した。増加する塩化ナトリウム勾配で陰イオン交換カラムから溶出させた。プロミオスタチンを含有する分画をプールした。大腸菌で産生されるプロミオスタチンは、最初の２３アミノ酸を欠き、そして残基２４のアスパラギンの前のメチオニンで始まる。成熟ミオスタチンを産生するため、プールしたプロミオスタチンを、プロペプチドおよび成熟ミオスタチンＣ末端の間で酵素的に切断した。次いで、０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルの増加勾配を用いて、生じた混合物をＣ４−ｒｐＨＰＬＣカラムに適用した。成熟ミオスタチンを含有する分画をプールし、そしてｓｐｅｅｄ−ｖａｃ中で乾燥させた。
以下に記載する筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２に基づくアッセイにおいて、大腸菌から産生される組換え成熟ミオスタチンを試験し、そして哺乳動物細胞系で商業的に産生された組換えネズミ・ミオスタチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）に比較した際、完全に活性であることを見出した。大腸菌に産生された成熟ミオスタチンを、以下に記載するファージ−ディスプレイおよびスクリーニングアッセイに用いた。
ミオスタチン・コーティング試験管の調製
０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）１ｍｌ中、ミオスタチン・タンパク質８μｇの濃度で、５ｍｌ ＩｍｍｕｎｏＴＭ試験管（ＮＵＮＣ）上にミオスタチンを固定した。ミオスタチン・コーティングＩｍｍｕｎｏＴＭ試験管を、軌道振盪を伴って、室温で１時間インキュベーションした。次いで、５ｍｌの２％ミルク−ＰＢＳを添加し、そして回転させながら室温で１時間インキュベーションすることによって、ミオスタチン・コーティングＩｍｍｕｎｏＴＭ試験管をブロッキングした。次いで、生じたミオスタチン・コーティングＩｍｍｕｎｏＴＭ試験管をＰＢＳで３回洗浄した後、選択法に供した。陰性選択のため、さらなるＩｍｍｕｎｏＴＭ試験管もまた、調製した（ミオスタチンなし）。ミオスタチン・タンパク質の代わりに、１ｍｌの２％ ＢＳＡ−ＰＢＳでＩｍｍｕｎｏＴＭ試験管をコーティングしたことを除いて、各パニング条件について、５〜１０のＩｍｍｕｎｏＴＭ試験管を上記方法に供した。
陰性選択
各パニング条件について、ＴＮ８−ＩＸおよびＴＮ１２−Ｉライブラリー（ＴＮ８−ＩＸは５ｘ１０１１ｐｆｕ、そしてＴＮ１２−Ｉは１．４ｘ１０１１ｐｆｕ）では約１００のランダムライブラリー同等物、そして直鎖ライブラリー（２．３ｘ１０１０ｐｆｕ）では約１０のランダムライブラリー同等物を、ライブラリーストックからアリコットし、そしてＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で１ｍｌに希釈した。陰性選択用に調製したＩｍｍｕｎｏＴＭ試験管に、希釈したライブラリーストック１ｍｌを添加し、そして軌道振盪を伴い、室温で１０分間インキュベーションした。ファージ上清を抜き取って、そして別の陰性選択工程のため、第二のＩｍｍｕｎｏＴＭ試験管に添加した。この方式で、５〜１０の陰性選択工程を行った。
ミオスタチン結合に関する選択
上記の最後の陰性選択工程後、調製したミオスタチン・コーティングＩｍｍｕｎｏＴＭ試験管にファージ上清を添加した。軌道振盪を伴い、ＩｍｍｕｎｏＴＭ試験管を室温で１時間インキュベーションして、特異的ファージがミオスタチンに結合するのを可能にした。３つのライブラリー（ＴＮ８−ＸＩ、ＴＮ１２−Ｉ、および直鎖ライブラリー）すべてを用いた、選択３周期に関して、上清を廃棄した後、２％ミルク−ＰＢＳで約１５回、ＰＢＳＴで１０回、そしてＰＢＳで２回、ＩｍｍｕｎｏＴＭ試験管を洗浄したが、ＴＮ８−
ＩＸおよびＴＮ１２−Ｉライブラリーの二回目の選択周期に関しては、２％ミルク−ＰＢＳで約１４回、２％ＢＳＡ−ＰＢＳで２回、ＰＢＳＴで１０回、そしてＰＢＳで１回、ＩｍｍｕｎｏＴＭ試験管を洗浄したことが例外であった。
非特異的溶出
最後の洗浄工程後、１００ｍＭトリエチルアミン溶液（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）１ｍｌを添加して、軌道振盪を伴い、１０分間インキュベーションすることによって、結合したファージをＩｍｍｕｎｏＴＭ試験管から溶出させた。次いで、０．５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いて、ファージ含有溶液のｐＨを中和した。
結合したファージの受容体（ヒト・アクチビン受容体）溶出
第２周期および第３周期で、最後の洗浄工程後、１μＭの受容体タンパク質（組換えヒト・アクチビン受容体ＩＩＢ／Ｆｃキメラ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）１ｍｌを添加し、各条件に関して１時間インキュベーションすることによって、結合したファージをＩｍｍｕｎｏＴＭ試験管から溶出させた。
結合したファージのプロペプチド溶出
第２周期および第３周期で、最後の洗浄工程後、１μＭのプロペプチド・タンパク質（上述のように作成）１ｍｌを添加し、各条件に関して１時間インキュベーションすることによって、結合したファージをＩｍｍｕｎｏＴＭ試験管から溶出させた。
ファージ増幅
１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＬＢ培地中、新鮮な大腸菌（ＸＬ−１
Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’）培養物をＯＤ６００＝０．５まで増殖させた。各パニング条件について、この培養物２０ｍｌを氷上で冷却し、そして遠心分離した。細菌ペレットを、１ｍｌのｍｉｎＡ塩溶液に再懸濁した。
異なる溶出法からの各混合物を濃縮細菌試料に添加し、そして３７℃で１５分間インキュベーションした。２ｍｌのＮＺＣＹＭ培地（２ｘＮＺＣＹＭ、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）を各混合物に添加し、そして３７℃で１５分間インキュベーションした。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する大きいＮＺＣＹＭ寒天プレート上に、生じた４ｍｌ溶液を蒔き、そして３７℃で一晩インキュベーションした。
大きいＮＺＣＹＭ寒天プレート上で一晩増殖させた各細菌／ファージ混合物を、３５ｍｌのＬＢ培地中に掻き取り、そしてさらなる３５ｍｌのＬＢ培地で、寒天プレートをさらにリンスした。ＬＢ培地中に生じた細菌／ファージ混合物を遠心分離して、細菌をペレットにして除いた。５０μｌのファージ上清を新鮮な試験管に移し、そして１２．５ｍｌのＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ８０００、３．５Ｍ酢酸アンモニウム）を添加し、そして氷上で２時間インキュベーションして、ファージを沈殿させた。沈殿したファージを遠心分離して落とし、そして６ｍｌのファージ再懸濁緩衝液（２５０ｍｌ ＮａＣｌ、１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。残った細菌を遠心分離して除き、そして１．５ｍｌのＰＥＧ溶液を添加することにより、ファージを２回沈殿させることによって、このファージ溶液をさらに精製した。遠心分離工程後、ファージペレットを４００μｌのＰＢＳに再懸濁した。この溶液を最後の遠心分離に供して、残った細菌破片を除いた。標準的プラーク形成アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｍａｎｉａｔｉｓら， 第３版）によって、生じたファージ調製物を力価決定した。
さらなる周期の選択および増幅
第二の周期において、第一の周期由来の増幅したファージ（１０１１ｐｆｕ）を投入フ
ァージとして用いて、選択工程および増幅工程を行った。次に、第二の周期由来の増幅したファージ（１０１１ｐｆｕ）を投入ファージとして用いて、第三の周期の選択および増幅を行った。第三の周期の溶出工程後、溶出したファージのわずかな割合を上述のプラーク形成アッセイにおけるように蒔いた。個々のプラークを摘み取り、そして各ウェルに１００μｌのＴＥ緩衝液を含有する９６ウェルマイクロタイタープレートに蒔いた。これらのマスタープレートを４℃で一晩インキュベーションして、ファージがＴＥ緩衝液に溶出するのを可能にした。
クローン解析
ファージＥＬＩＳＡ
ファージクローンをファージＥＬＩＳＡに供して、そして次いで配列決定した。以下に論じるように配列をランク付けした。
ファージＥＬＩＳＡを以下のように行った。ＯＤ６００が０．５に達するまで、大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’培養物を増殖させた。この培養物３０μｌを９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルにアリコットした。溶出したファージ１０μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１５分間細菌を感染させた。１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する約１２０μｌのＬＢ培地を各ウェルに添加した。次いで、マイクロタイタープレートを振盪しながら３７℃で一晩インキュベーションした。ミオスタチン・タンパク質（０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中、２μｇ／ｍｌ）で、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐＴＭプレート（ＮＵＮＣ）を、４℃で一晩コーティングした。対照として、別個のＭａｘｉｓｏｒｐＴＭプレートを、ＰＢＳ中で調製した２％ＢＳＡでコーティングした。
翌日、タンパク質でコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｐＴＭプレート中の液体を廃棄し、ＰＢＳで３回洗浄し、そして各ウェルを、２％ミルク溶液３００μｌで、室温で１時間ブロッキングした。ミルク溶液を廃棄し、そしてウェルをＰＢＳ溶液で３回洗浄した。最後の洗浄工程後、約５０μｌのＰＢＳＴ−４％ミルクを、タンパク質・コーティングＭａｘｉｓｏｒｐＴＭプレートの各ウェルに添加した。９６ウェルマイクロタイタープレート中の各ウェルから約５０μｌの一晩培養物を、ミオスタチン・コーティングプレートの対応するウェルとともに、対照２％ＢＳＡコーティング・プレートの対応するウェルに移した。２種のプレート中、１００μｌの混合物を、室温で１時間インキュベーションした。ＭａｘｉｓｏｒｐＴＭプレートから液体を廃棄し、そしてＰＢＳＴで約３回、続いてＰＢＳで２回、ウェルを洗浄した。ＨＲＰコンジュゲート化抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を約１：７，５００に希釈し、そして希釈溶液１００μｌをＭａｘｉｓｏｒｐＴＭプレートの各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベーションした。液体を再び廃棄し、そしてＰＢＳＴで約３回、続いてＰＢＳで２回、ウェルを洗浄した。１００μｌのＬｕｍｉＧｌｏＴＭ化学発光基質（ＫＰＬ）をＭａｘｉｓｏｒｐＴＭプレートの各ウェルに添加し、そして反応が起こるように約５分間インキュベーションした。ＭａｘｉｓｏｒｐＴＭプレートの化学発光単位をプレート読取装置（Ｌａｂ Ｓｙｓｔｅｍ）上で読み取った。
ファージクローンの配列決定
各ファージクローンに関して、ＰＣＲ法によって配列決定テンプレートを調製した。以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、５００ヌクレオチド断片を増幅した：プライマー＃１：５’−ＣＧＧＣＧＣＡＡＣＴＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＡＧＣＴＧ−３’（配列番号２９４）およびプライマー＃２：５’−ＣＡＴＧＴＡＣＣＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＧＴＴＴＣＧＴＣ−３’（配列番号２９５）。各クローンに関して、以下の混合物を調製した。
Figure 2010193888
サーモサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、以下のプログラムを実行した：［９４℃５分間；９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃４５秒間］ｘ３０周期；７２℃７分間；４℃に冷却。製造者のプロトコルにしたがって、ＱＩＡｑｕｉｃｋマルチウェルＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、各反応由来のＰＣＲ産物を清浄にした。１０μｌの各ＰＣＲ反応物を、１μｌの色素（１０ｘＢＢＸＳアガロースゲル装填色素）と混合して、１％アガロースゲル上で泳動することによって、ＰＣＲの清浄化産物をチェックした。次いで、製造者が推奨するプロトコルにしたがって、ＡＢＩ３７７配列決定装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、残った産物を配列決定した。
配列ランク付けおよび解析
ヌクレオチド配列から翻訳したペプチド配列をＥＬＩＳＡデータと相関させた。ミオスタチン・コーティングウェル中で高い化学発光単位を、そして２％ＢＳＡコーティングウェル中で低い化学発光単位を示したクローンを同定した。複数回生じた配列を同定した。これらの基準に基づいて選択した候補配列を、ペプチボディとしてさらなる解析に供した。およそ１２００の個々のクローンを解析した。本発明のペプチボディを生成するため、これらのうち、およそ１３２のペプチドを選択した。これらを以下の表Ｉに示す。配列番号１〜１２９を有するペプチドを用いて、同一名のペプチボディを生成した。表Ｉに示す配列番号１３０〜１４１を有するペプチドは、リンカー配列によって付着された、配列番号１〜１３２のペプチドの２以上を含む。配列番号１３０〜１４１もまた、同一名のペプチボディを生成するのに用いた。
ペプチドのＴＮ−８由来群に関してコンセンサス配列を決定した。これらは以下のとおりである：
Figure 2010193888
上記コンセンサス配列のすべてに関して、各コンセンサス配列の下線の「コア配列」は、常にその位置で生じるアミノ酸である。「Ｘ」は、天然存在または修飾アミノ酸いずれかを指す。コア配列とともに含有される２つのシステインは、ＴＮ８−ＩＸライブラリーにおける固定アミノ酸である。
表Ｉ
Figure 2010193888
Figure 2010193888
Figure 2010193888
Figure 2010193888
（実施例２）
ペプチボディの生成
ペプチド−Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡの構築
ミオスタチンに結合可能なペプチドを、単独でまたは互いに組み合わせて用いて、ペプチドがヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合した、融合タンパク質を構築した。各ペプチボディのＦｃ部分のアミノ酸配列は以下のとおりである（アミノ末端からカルボキシ末端）：
Figure 2010193888
ペプチドをＮ配置で融合させる（ペプチドをＦｃ領域のＮ末端に付着させる）か、Ｃ配置で融合させる（ペプチドをＦｃ領域のＣ末端に付着させる）か、またはＮ、Ｃ配置で付着させた（ペプチドをＦｃ領域のＮ末端およびＣ末端両方に付着させた）。別個のベクターを用いて、Ｎ末端融合体およびＣ末端融合体を発現させた。選択したファージ核酸に、オリゴヌクレオチド対（「オリゴ」）をアニーリングさせ、ペプチドをコードする二本鎖ヌクレオチド配列を生成することによって、各ペプチボディを構築した。これらのポリヌクレオチド分子をＡｐａＬからＸｈｏＩの断片として構築した。この断片を、あらかじめＡｐａＬＩおよびＸｈｏＩで消化した、Ｎ末端配向用のｐＡＭＧ２１−Ｆｃ Ｎ末端ベクターに、またはＣ末端配向用のｐＡＭＧ２１−Ｆｃ−Ｃ末端ベクターに連結した。標準法を用い、エレクトロポレーションによって、生じた連結混合物で、大腸菌株２５９６細胞または４１６７細胞（株２５９６細胞のｈｓｄＲ−変異体）を形質転換した。組換えタンパク質を産生し、そして正しいヌクレオチド配列を有する遺伝子融合体を所持する能力に関して、クローンをスクリーニングした。修飾ペプチド各々に関して、単一のこうしたクローンを選択した。
ｐＡＭＧ２１−２ｘＢｓ−Ｎ（ＺｅｏＲ）Ｆｃと称される別のベクターを用いて、構築物の多くを生成した。このベクターは、ベクター消化をＢｓｍＢＩで行ったことを除いて、上記ベクターと類似である。いくつかの構築物では、ペプチド配列をＦｃの両端で融合させた。これらの場合、ベクターは、ｐＡＭＧ２１−２ｘＢｓ−Ｎ（ＺｅｏＲ）ＦｃおよびｐＡＭＧ２１−２ｘＢｓ−Ｃ−Ｆｃの複合体であった。
ｐＡＭＧ２１の構築
すべて本明細書に援用される、公開国際特許出願ＷＯ ００／２４７８２に記載される方法にしたがって、ｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ番号６９５７６）および米国特許第４，７１０，４７３号に記載される発現ベクター系から、発現プラスミドｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３）を得る。
Ｆｃ Ｎ末端ベクター
テンプレートとしてｐＡＭＧ２１ Ｆｃ＿Ｇｌｙ５＿Ｔｐｏベクターを用いて、Ｆｃ Ｎ末端ベクターを構築した。５’ＰＣＲプライマー（以下）を設計して、ｐＡＭＧ Ｔｐｏ Ｇｌｙ５のＴｐｏペプチド配列を除去し、そしてＡｐａＬＩおよびＸｈｏＩ部位を含有するポリリンカーと交換した。このベクターをテンプレートとして用い、以下の５’プライマーおよび普遍的３’プライマーを用いて、Ｅｘｐａｎｄ ＬｏｎｇポリメラーゼでＰＣＲを行った。
Figure 2010193888
生じたＰＣＲ産物をゲル精製し、そして制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｓｒＧＩで消化した。Ｑｉａｇｅｎ（カリフォルニア州チャツワース）ゲル精製スピンカラムを用いて、プラスミド、および目的のペプチドをコードするポリヌクレオチド両方を、リンカーとともにゲル精製した。次いで、標準的連結法を用いて、プラスミドおよび挿入物を連結し、そして生じた連結混合物で大腸菌細胞（株２５９６）を形質転換した。単一コロニーを選択し、そしてＤＮＡ配列決定を行った。正しいクローンを同定し、そして本明細書に記載する修飾ペプチドのベクター供給源としてこれを用いた。
Ｆｃ Ｃ末端ベクターの構築
テンプレートとしてｐＡＭＧ２１ Ｆｃ＿Ｇｌｙ５＿Ｔｐｏベクターを用いて、Ｆｃ Ｃ末端ベクターを構築した。３’ＰＣＲプライマーを設計して、Ｔｐｏペプチド配列を除去し、そしてＡｐａＬＩおよびＸｈｏＩ部位を含有するポリリンカーと交換した。普遍的５’プライマーおよび３’プライマーを用いて、Ｅｘｐａｎｄ ＬｏｎｇポリメラーゼでＰＣＲを行った。
Figure 2010193888
生じたＰＣＲ産物をゲル精製し、そして制限酵素ＢｓｒＧＩおよびＢａｍＨＩで消化した。Ｑｉａｇｅｎゲル精製スピンカラムを介して、プラスミド、および目的のペプチドをコードするポリヌクレオチド両方を、リンカーとともにゲル精製した。次いで、標準的連結法を用いて、プラスミドおよび挿入物を連結し、そして生じた連結混合物で大腸菌（株２５９６）細胞を形質転換した。株２５９６（ＡＴＣＣ＃２０２１７４）は、ｌｕｘプロモーター、並びに２つのラムダ温度感受性リプレッサー、ｃＩ８５７ｓ７およびｌａｃＩＱリプレッサーを含有するよう修飾された大腸菌Ｋ−１２株である。単一コロニーを選択し、そしてＤＮＡ配列決定を行った。正しいクローンを同定し、そして本明細書に記載する各ペプチボディの供給源としてこれを用いた。
大腸菌における発現
Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス培地（前述のＳａｍｂｒｏｏｋらの参考文献に引用される、ＴａｒｔｏｆおよびＨｏｂｂｓ， “Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ｇｒｏｗｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ａｎｄ ｃｏｓｍｉｄ ｃｌｏｎｅｓ”， Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ Ｆｏｃｕｓ， 第９巻， １２ページ， １９８７を参照されたい）中、３７℃で、大腸菌株２５９６中の各ｐＡＭＧ２１−Ｆｃ融合構築物の培養物を増殖させた。合成自己誘導剤（ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒ）、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ＤＬ−ホモセリン・ラクトンを、１ミリリットルあたり２０ナノグラム（ｎｇ／ｍｌ）の最終濃度になるように、培地に添加した後、ｌｕｘＰＲプロモーターからの遺伝子産物発現の誘導が達成された。培養物を３７℃でさらに６時間インキュベーションした。次いで、封入体の存在に関して、細菌培養物を顕微鏡によって検査し、そして遠心分離によって収集した。誘導した培養物中に、屈折（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ）封入体が観察されたことから、大腸菌の不溶性分画でＦｃ融合体が産生される可能性が最も高いことが示された。１０％β−メルカプトエタノールを含有するＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液に直接再懸濁することによって細胞ペレットを溶解し、そして次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。大部分の場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に、適切な分子量の強いクーマシー染色バンドが観察された。
ペプチボディのフォールディングおよび精製
高圧ホモジナイズ（１５，０００ＰＳＩで３パス）によって、水中（体積あたり１／１０体積）で細胞を破壊し、そして遠心分離（Ｊ−６Ｂ中４０００ＲＰＭで３０分間）によって封入体を採取した。６Ｍグアニジン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０中、１／１０の比で、周囲温度で１時間、封入体を可溶化した。可溶化した混合物を４Ｍ尿素、２０％グリセロール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１６０ｍＭアルギニン、３ｍＭシステイン、１ｍＭシスタミン、ｐＨ８．５に２５倍に希釈した。混合物を低温中で一晩インキュベーションした。次いで、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ
、１．５Ｍ尿素に対して、混合物を透析した。一晩透析した後、透析物のｐＨを酢酸でｐＨ５に調整した。遠心分離によって沈殿物を除去し、そして１０ｍＭ ＮａＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムに、上清を４℃で装填した。装填後、カラムを１０ｍＭ ＮａＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．２で洗浄してベースラインにした。２０カラム体積の、酢酸緩衝液中の５０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配で、カラムを展開した。あるいは、ベースラインまで洗浄した後、５カラム体積の１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０でカラムを洗浄し、そして１５カラム体積の、リン酸緩衝液中の０〜４００ｍＭのＮａＣｌ勾配で、カラムを展開した。カラム分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。二量体ペプチボディを含有する分画をプールした。ゲルろ過によってもまた分画を解析し、凝集物が存在するかどうかを決定した。
表Ｉのペプチドからいくつかのペプチボディを調製した。ペプチドをヒトＩｇＧ１ Ｆｃ分子に付着させて、表ＩＩのペプチボディを形成した。表ＩＩのペプチボディに関して、Ｃ立体配置は、指定のペプチドが、ＦｃのＣ末端に付着したことを示す。Ｎ立体配置は、指定のペプチドが、ＦｃのＮ末端に付着したことを示す。Ｎ、Ｃ立体配置は、１つのペプチドが各Ｆｃ分子のＮ末端に、１つがＣ末端に付着したことを示す。２ｘの指定は、指定の２つのペプチドが、示したリンカーに分離されて、互いにタンデムに付着し、そしてまた、ＦｃのＮ末端またはＣ末端に、あるいはＮ、Ｃ両末端に付着したことを示す。リンカーに分離されてタンデムに付着した２つのペプチドは、例えばミオスタチン−ＴＮ８−２９−１９−８ｇと示され、これは、ＴＮ８−２９ペプチドが、（ｇｌｙ）８リンカーを介して、ＴＮ８−１９ペプチドに付着したことを示す。ペプチド（単数または複数）は、別に明記しない限り、（ｇｌｙ）５リンカー配列を介してＦｃに付着した。いくつかの場合、ペプチド（単数または複数）はｋリンカーを介して付着した。ｋまたは１ｋと示されるリンカーは、ｇｓｇｓａｔｇｇｓｇｓｔａｓｓｇｓｇｓａｔｇ（配列番号３０１）リンカー配列を指し、ｋｃは、ＦｃのＣ末端に付着したリンカーを指し、そしてｋｎはＦｃのＮ末端に付着したリンカーを指す。以下の表ＩＩにおいて、第４列はＦｃを第一のペプチドに連結するリンカー配列を指し、そして第５列は、立体配置ＮまたはＣまたは両方を指す。
Ｆｃ分子は溶液中で二量体化するため、１つのペプチドを有するように構築されたペプチボディは、実際には、ペプチド２コピーおよびＦｃ分子２つを持つ二量体であり、そしてタンデムに２つのペプチドを有する２ｘ型は、実際には、ペプチド４コピーおよびＦｃ分子２つを持つ二量体であろう。
表ＩＩに示すペプチボディは、大腸菌で発現されるため、最初のアミノ酸残基はＭｅｔ（Ｍ）である。したがって、Ｎ立体配置のペプチボディは、例えば、Ｍｅｔ−ペプチド−リンカー−Ｆｃ、またはＭｅｔ−ペプチド−リンカー−ペプチド−リンカー−Ｆｃである。Ｃ立体配置のペプチボディは、例えば、Ｍｅｔ−Ｆｃ−リンカー−ペプチドまたはＭｅｔ−Ｆｃ−リンカー−ペプチド−リンカー−ペプチドである。Ｃ、Ｎ立体配置のペプチボディは、両方の組み合わせ、例えば、Ｍｅｔ−ペプチド−リンカー−Ｆｃ−リンカー−ペプチドである。
典型的なペプチボディをコードするヌクレオチド配列を以下の表ＩＩに提供する。本発明の典型的なペプチボディをコードするポリヌクレオチド配列には、以下のようなＦｃポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が含まれる：
Figure 2010193888
さらに、以下のようなｇｇｇｇｇリンカーをコードするポリヌクレオチドが含まれる：
Figure 2010193888
ペプチボディをコードするポリヌクレオチドにはまた、メチオニンをコードするコドンＡＴＧおよびＴＡＡなどの停止コドンも含まれる。
したがって、表ＩＩの第一のペプチボディの構造は、以下のような、Ｃ立体配置および（ｇｌｙ）５リンカーを持つＴＮ８−Ｃｏｎ１である：Ｍ−Ｆｃ−ＧＧＧＧＧ−ＫＤＫＣＫＭＷＨＷＭＣＫＰＰ（配列番号３０３）。このペプチボディをコードする典型的なポリヌクレオチドは：
Figure 2010193888
であろう。
表ＩＩ
Figure 2010193888
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（実施例３）
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
Ｃ２Ｃ１２細胞に基づくミオスタチン活性アッセイ
本アッセイは、ミオスタチンの受容体への結合を阻害する度合いを測定することによって試験される、阻害剤のミオスタチン中和能を示す。
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１７２２）をｐＭＡＲＥ−ｌｕｃ構築物でトランスフェクションすることによって、ミオスタチン応答性受容体細胞株を生成した。ミオスタチン／アクチビン応答要素（Ｄｅｎｎｌｅｒら， ＥＭＢＯ １７：３０９１−３１００（１９９８））に相当するＣＡＧＡ配列の１２の反復を、ＴＡＴＡボックスの上流で、ｐＬｕｃ−ＭＣＳレポーターベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２１９０８７）にクローニングすることによって、ｐＭＡＲＥ−ｌｕｃ構築物を作成した。筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞は、天然に、その細胞表面上に、ミオスタチン／アクチビン受容体を発現する。ミオスタチンが細胞受容体に結合すると、Ｓｍａｄ経路が活性化され、そしてリン酸化されたＳｍａｄが応答要素に結合し（Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａら， Ｃｅｌｌ ８７：１２１５（１９９６））、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を生じる。次いで、製造者のプロトコルにしたがって、商業的ルシフェラーゼレポーターアッセイキット（カタログ番号Ｅ４５５０、Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を用い、ルシフェラーゼ活性を測定する。ｐＭＡＲＥ−ｌｕｃでトランスフェクションされた安定Ｃ２Ｃ１２細胞株（Ｃ２Ｃ１２／ｐＭＡＲＥクローン＃４４）を用い、以下の方法にしたがって、ミオスタチン活性を測定した。
同数のレポーター細胞（Ｃ２Ｃ１２／ｐＭＡＲＥクローン＃４４）を９６ウェル培養に蒔いた。４ｎＭで固定したミオスタチン濃度で、ペプチボディの２つの希釈を用いて、最初の周期のスクリーニングを行った。組換え成熟ミオスタチンを、それぞれ、４０ｎＭおよび４００ｎＭのペプチボディと、室温で２時間、プレインキュベーションした。レポーター細胞培養物を、ペプチボディを含み、または含まず、ミオスタチンで６時間処理した。処理した培養物において、ルシフェラーゼ活性を測定することによって、ミオスタチン活性を測定した。まず、このアッセイを用いて、レポーターアッセイにおいて、ミオスタチンシグナル伝達活性を阻害したペプチボディ・ヒットを同定した。続いて、ミオスタチン濃度を４ｎＭに固定して、９点の滴定曲線を生成した。レポーター細胞培養物に混合物を添加する前に、ミオスタチンを、以下の９つの濃度のペプチボディ各々と２時間プレイ
ンキュベーションした：０．０４ｍＭ、０．４ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、２μＭおよび４μＭ。いくつかの典型的なペプチボディのＩＣ５０値を表ＩＩＩに提供し、そしてアフィニティー成熟ペプチボディに関しては表ＶＩＩＩに提供する。
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ
センサーチップＣＭ５、およびランニング緩衝液として、０．００５パーセントのＰ２０界面活性剤（Ｂｉａｃｏｒｅ， Ｉｎｃ．）を用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ， Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）装置上で、各候補ミオスタチン・ペプチボディのアフィニティー解析を行った。製造者が示唆するプロトコルにしたがって、アミン・カップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ， Ｉｎｃ．）を用い、一級アミン基を介して、研究等級ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ， Ｉｎｃ．）に、組換え成熟ミオスタチン・タンパク質を固定した。
直接結合アッセイを用いて、ペプチボディをスクリーニングし、そして固定化ミオスタチンに結合する能力の順にランク付けした。２つの濃度（４０および４００ｎＭ）の各候補ミオスタチン結合ペプチボディを、流速５０μｌ／分で３分間、固定化ミオスタチン表面に注入することによって、結合アッセイを行った。３分間解離させた後、表面を再生成した。結合シグナル強度に関して、それとともに解離速度に関して、結合曲線を定性的に比較した。ＢＩＡ評価３．１コンピュータプログラム（Ｂｉａｃｏｒｅ， Ｉｎｃ．）を用いて、ｋａ（会合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）、およびＫＤ（解離平衡定数）を含むペプチボディ結合動力学パラメーターを決定した。解離平衡定数（ｎＭで表す）がより低ければ、ミオスタチンに対するペプチボディのアフィニティーはより高い。ペプチボディＫＤ値の例を表ＩＩＩに示し、そして以下のアフィニティー成熟ペプチボディに関しては、表ＶＩに示す。
ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ表面上の遮断アッセイ
固定化ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）およびミオスタチンを用いて、ペプチボディの存在下および非存在下、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ系で、遮断アッセイを行った。アッセイを用いて、非中和（ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃへのミオスタチン結合を妨げないもの）または中和（ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃへのミオスタチン結合を妨げるもの）として、ペプチボディを分類した。いかなるペプチボディも存在しない、ベースラインのミオスタチン−ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ結合をまず決定した。
初期スクリーニング研究には、ペプチボディを試料緩衝液中、４ｎＭ、４０ｎＭ，および４００ｎＭに希釈し、そして４ｎＭミオスタチン（やはり試料緩衝液中で希釈する）とインキュベーションした。ペプチボディ：リガンド混合物が、室温で平衡に達するのを可能にし（少なくとも５時間）、そして次いで、流速１０μｌ／分で、２０〜３０分間、固定化ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ表面上に注入した。結合反応の増加（ペプチボディを含まない対照の結合を越える）は、ミオスタチンへのペプチボディ結合が非中和性であることを示した。結合反応の減少（対照に比較）は、ミオスタチンへのペプチボディ結合が、ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃへのミオスタチン結合を遮断することを示した。ＩＣ５０値（中和ペプチボディ）またはＥＣ５０値（非中和ペプチボディ）を得るため、完全濃度シリーズの遮断アッセイを用いて、選択したペプチボディをさらに性質決定した。ペプチボディ試料を、２００ｎＭ〜０．０５ｍＭまで試料緩衝液中で連続希釈して、そして４ｍＭミオスタチンと、室温で平衡に達するまで（最小５時間）インキュベーションした後、流速１０μｌ／分で２０〜３０分間、固定化ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ表面上に注入した。試料注入後、結合したリガンドを３分間、受容体から解離させた。ペプチボディ濃度に対して結合シグナルをプロッティングし、４ｎＭミオスタチンの存在下で、各ペプチボディのＩＣ５０値を計
算した。例えば、ペプチボディＴＮ８−１９、Ｌ２およびＬ１７は、細胞に基づくアッセイにおいて、ミオスタチン活性を阻害するが、ＴＮ−８−１９の結合は、ミオスタチン／ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ相互作用を遮断しないことから、ＴＮ−８−１９が、他の２つのペプチボディで観察されるのと異なるエピトープに結合することが示された。
ペプチボディに対するエピトープ・ビンニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）
精製ペプチボディをＢＩＡｃｏｒｅチップ上に固定して、第二のペプチボディを注入する前に、ミオスタチンを捕捉し、そして捕捉されたミオスタチンに結合した二次ペプチボディの量を決定した。別個のエピトープを持つペプチボディのみが、捕捉されたミオスタチンに結合し、したがって類似のまたは別個のエピトープ結合特性を持つペプチボディのビンニングが可能になる。例えば、ペプチボディＴＮ８−１９およびＬ２３が、ミオスタチン上の異なるエピトープに結合することが示された。
選択性アッセイ
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）技術を用いて、これらのアッセイを行って、他のＴＧＦβファミリーメンバーへのペプチボディの結合の選択性を決定した。製造者が示唆するプロトコルにしたがって、ＡｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ、ＴＧＦβＲＩＩ／ＦｃおよびＢＭＰＲ−１Ａ／Ｆｃ（すべてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリスから得られる）を研究等級のセンサーチップに共有的にカップリングした。ＢＩＡｃｏｒｅアッセイは屈折率の変化を検出するため、いかなるペプチボディも存在しない対照表面上の注入で検出された反応に比較した、固定化受容体表面上での注入で検出された反応の間の相違は、それぞれ、受容体へのアクチビンＡ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、およびＢＭＰ４の実際の結合に相当する。ペプチボディおよびＴＧＦβ分子をプレインキュベーションすると、結合反応の変化（増加または減少）は、ＴＧＦβファミリー分子へのペプチボディ結合を示す。本発明のペプチボディはすべて、ミオスタチンに結合するが、アクチビンＡ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、またはＢＭＰ４に結合しない。
ＫｉｎＥｘ Ａ ＴＭ 平衡アッセイ
ＫｉｎＥｘ ＡＴＭ技術（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．）を用いた、溶液に基づく平衡結合アッセイを用いて、ペプチボディ分子へのミオスタチン結合の解離平衡（ＫＤ）を測定した。この溶液に基づくアッセイは、いくつかの例で、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイよりもより感受性であると見なされる。Ｒｅａｃｔｉ−ＧｅｌＴＭ６Ｘを約５０μｇ／ｍｌのミオスタチンで一晩プレコーティングし、そして次いで、ＢＳＡでブロッキングした。３０ｐＭおよび１００ｐＭのペプチボディ試料を、試料緩衝液中、多様な濃度（０．５ｐＭ〜５ｎＭ）のミオスタチンと室温で８時間インキュベーションした後、ミオスタチン・コーティングビーズの間を流動させた。スーパーブロック中の１ｍｇ／ｍｌの蛍光（Ｃｙ５）標識したヤギ抗ヒトＦｃ抗体によって、ビーズに結合したペプチボディの量を定量化した。結合シグナルは、既定のミオスタチン濃度で平衡状態の未結合ペプチボディの濃度に比例する。ＫｉｎＥＸ ＡＴＭソフトウェア（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．）に提供される、二重曲線一部位均質結合モデルを用いた競合曲線の非線形回帰から、ＫＤを得た。
（実施例４）
ミオスタチン阻害剤の比較
３つの典型的な第一周期ペプチボディが結合し（ＫＤ）そして阻害する（ＩＣ５０）能力を、可溶性受容体融合タンパク質ａｃｔＲＩＩＢ／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）で得たＫＤおよびＩＣ５０値と比較した。実施例３に記載するｐＭＡＲＥ−ｌｕｃ細胞に基づくアッセイを用いて、ＩＣ５０値を決定し、そして実施例３に記載するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイを用いて、ＫＤ値を決定した。
表ＩＩＩ
Figure 2010193888
ペプチボディは、受容体／Ｆｃ阻害剤より改善されたＩＣ５０値を有し、そして２つのペプチボディでは、受容体／Ｆｃと匹敵する結合アフィニティーを有する。
（実施例５）
ペプチドおよびペプチボディがミオスタチンを阻害する能力の比較
以下のペプチド配列：ＱＧＨＣＴＲＷＰＷＭＣＰＰＹ（ＴＮ８−１９）（配列番号３３）を用い、上記実施例２に記載する方法にしたがって、対応するペプチボディＴＮ８−１９（ｐｂ）を構築した。上記実施例３に記載するＣ２Ｃ１２に基づくアッセイを用いて、ミオスタチン阻害活性に関して、単独のペプチドおよびペプチボディを両方スクリーニングした。図１から、ペプチボディのＩＣ５０（ミオスタチンを５０％阻害するのに有効な濃度）が、ペプチドのものより有意に低く、そしてしたがって、ペプチボディ立体配置に置くことによって、ペプチドがミオスタチン活性を阻害する能力が、実質的に改善されたことがわかる。
（実施例６）
アフィニティー成熟ペプチドおよびペプチボディの生成
ペプチボディ精製に用いる第一周期ペプチドのいくつかを、アフィニティー成熟用に選択した。選択したペプチドには、以下が含まれた：システイン拘束ＴＮ８−１９、ＱＧＨＣＴＲＷＰＷＭＣＰＰＹ（配列番号３３）、および直鎖ペプチド、直鎖−２ ＭＥＭＬＤＳＬＦＥＬＬＫＤＭＶＰＩＳＫＡ（配列番号１０４）；直鎖−１５ ＨＨＧＷＮＹＬＲＫＧＳＡＰＱＷＦＥＡＷＶ（配列番号１１７）；直鎖−１７ ＲＡＴＬＬＫＤＦＷＱＬＶＥＧＹＧＤＮ（配列番号１１９）；直鎖−２０ ＹＲＥＭＳＭＬＥＧＬＬＤＶＬＥＲＬＱＨＹ（配列番号１２２）、直鎖−２１ ＨＮＳＳＱＭＬＬＳＥＬＩＭＬＶＧＳＭＭＱ（配列番号１２３）、直鎖−２４ ＥＦＦＨＷＬＨＮＨＲＳＥＶＮＨＷＬＤＭＮ（配列番号１２６）。コンセンサス配列に基づいて、「コア」アミノ酸（コンセンサス配列から決定する）を一定に維持するかまたはその発生頻度を偏向させた、定方向二次ファージディスプレイ・ライブラリーを生成した。あるいは、個々のペプチド配列を用いて、偏向定方向ファージディスプレイ・ライブラリーを生成することも可能である。よりストリンジェントな条件下での、こうしたライブラリーのパニングによって、ミオスタチンへの結合が増進した、ミオスタチンへの選択的結合が増進した、またはさらなる何らかの望ましい特性を持つ、ペプチドを生じることも可能である。
ライブラリー用のドーピングしたオリゴの産生
ＤＮＡ合成装置中、コア配列が９１％「ドーピング」された、すなわち各溶液が、相当する塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）９１％、および他の３ヌクレオチド各々３％である、オリゴヌクレオチドを合成した。ＴＮ８−１９ファミリーでは、例えば、二次ファージラ
イブラリーの構築に用いた９１％ドーピングオリゴは、以下のとおりであった：
Figure 2010193888
ここで、「Ｎ」は、４つのヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧの各々が、等しく相当することを示し、Ｋは、ＧおよびＴが等しく相当することを示し、そして小文字は、９１％の示した塩基および３％の他の塩基各々の混合物に相当する。この方式で調製したオリゴヌクレオチドファミリーを上記のようにＰＣＲ増幅し、上述のプロトコルにしたがって、ファージミドベクター、例えば修飾ｐＣＥＳ１プラスミド（Ｄｙａｘ）、または入手可能なファージミドベクターいずれかに連結した。生成した二次ファージライブラリーは、すべて９１％ドーピングされ、そして１〜６．５ｘ１０９の独立形質転換体を有した。上述のように、しかし以下の条件を用いて、ライブラリーをパニングした：
第１周期パニング：
投入ファージ数：１０１２〜１０１３ｃｆｕのファージミド
選択法：Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ試験管選択
陰性選択：２％ＢＳＡでコーティングしたＮｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ試験管を用いて各１０分間２回
パニングコーティング：１ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中の１μｇのミオスタチン・タンパク質でコーティング
結合時間：３時間
洗浄条件：６ｘ２％ミルク−ＰＢＳＴ；６ｘＰＢＳＴ；２ｘＰＢＳ
溶出条件：１００ｍＭ ＴＥＡ溶出
第２周期パニング：
投入ファージ数：１０１１ｃｆｕのファージミド
選択法：Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ試験管選択
陰性選択：２％ＢＳＡでコーティングしたＮｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ試験管を用いて各３０分間２回
パニングコーティング：１ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中の１μｇのミオスタチン・タンパク質でコーティング
結合時間：１時間
洗浄条件：１５ｘ２％ミルク−ＰＢＳＴ、１ｘ２％ミルク−ＰＢＳＴで１時間、１０ｘ２％ＢＳＡ−ＰＢＳＴ、１ｘ２％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１時間、１０ｘＰＢＳＴおよび３ｘＰＢＳ
溶出条件：１００ｍＭ ＴＥＡ溶出
第３周期パニング：
投入ファージ数：１０１０ｃｆｕのファージミド
選択法：Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ試験管選択
陰性選択：２％ＢＳＡでコーティングしたＮｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ試験管を用いて各１０分間６回
パニングコーティング：１ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中の０．１μｇのミオスタチン・タンパク質でコーティング
結合時間：１時間
洗浄条件：１５ｘ２％ミルク−ＰＢＳＴ、１ｘ２％ミルク−ＰＢＳＴで１時間、１０ｘ２％ＢＳＡ−ＰＢＳＴ、１ｘ２％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１時間、１０ｘＰＢＳＴおよび３ｘＰＢＳ
溶出条件：１００ｍＭ ＴＥＡ溶出
二次ライブラリーのパニングによって、ミオスタチンへの結合が増進したペプチドを得た。個々の選択クローンを上述のようなファージＥＬＩＳＡに供し、そして配列決定した。
ペプチドの以下のアフィニティー成熟ＴＮ８−１９ファミリーを以下の表ＩＶに示す。
Figure 2010193888
Figure 2010193888
上に示すアフィニティー成熟ＴＮ−８−１９−１からＣｏｎ２（ｍＴＮ８ ｃｏｎ６配列を除く）由来のコンセンサス配列は：Ｃａ１ａ２ Ｗａ３ ＷＭＣＰＰ（配列番号３５２）である。これらのペプチドはすべて、配列ＷＭＣＰＰ（配列番号６３３）を含む。下線のアミノ酸は、すべての態様に存在するコアアミノ酸に相当し、そしてａ１、ａ２およびａ３は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸から選択される。このコンセンサス配列の１つの態様、Ｃｂ１ｂ２ Ｗｂ３ ＷＭＣＰＰ（配列番号３５３）において、ｂ１は、アミノ酸Ｔ、Ｉ、またはＲのいずれか１つから選択され；ｂ２は、Ｒ、Ｓ、Ｑのいずれか１つから選択され；そしてｂ３は、Ｐ、ＲおよびＱのいずれか１つから選択される。これらのペプチドはすべて、配列ＷＭＣＰＰ（配列番号６３３）を含む。配列番号３５２を含むアフィニティー成熟ＴＮ８配列のより詳細な解析は、以下の式：
ｃ１ｃ２ｃ３ｃ４ｃ５ｃ６ Ｃｃ７ｃ８ Ｗｃ９ ＷＭＣＰＰｃ１０ｃ１１ｃ１２ｃ１３（配列番号３５４）、を提供し、式中：
ｃ１は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
ｃ２は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｃ３は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｃ４は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
ｃ５は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｃ６は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは塩基性アミノ酸であり；
ｃ７は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸であり；
ｃ８は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸であり；
ｃ９は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸であり；そして
ｃ１０〜ｃ１３は、アミノ酸いずれかである。
上記式の１つの態様において、ｂ７は、アミノ酸Ｔ、Ｉ、またはＲのいずれか１つから選択され；ｂ８は、Ｒ、Ｓ、Ｑのいずれか１つから選択され；そしてｂ９は、Ｐ、ＲおよびＱのいずれか１つから選択される。これは以下の配列：
ｄ１ｄ２ｄ３ｄ４ｄ５ｄ６ Ｃｄ７ｄ８ Ｗｄ９ ＷＭＣＰＰｄ１０ｄ１１ｄ１２ｄ１３（配列番号３５５）を提供する。
ｄ１は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
ｄ２は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｄ３は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｄ４は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
ｄ５は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
ｄ６は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは塩基性アミノ酸であり；
ｄ７は、アミノ酸Ｔ、Ｉ、またはＲのいずれか１つから選択され；
ｄ８は、Ｒ、Ｓ、Ｑのいずれか１つから選択され；
ｄ９は、Ｐ、ＲおよびＱのいずれか１つから選択され
そしてｄ１０〜ｄ１３は、アミノ酸いずれかから選択される。
ｍＴＮ８ ｃｏｎ６シリーズのコンセンサス配列は、ＷＹｅ１ｅ２ Ｙｅ３ Ｇ（配列番号３５６）であり、ここでｅ１は、Ｐ、ＳまたはＹであり；ｅ２は、ＣまたはＱであり、そしてｅ３は、ＧまたはＨである。
ＴＮ−１９アフィニティー成熟ファミリーに加えて、直鎖Ｌ−２、Ｌ−１５、Ｌ−１７、Ｌ−２０、Ｌ−２１、およびＬ−２４の第一周期のペプチドから、さらなるアフィニティー成熟ペプチドを産生した。これらのファミリーを以下の表Ｖに示す。
Figure 2010193888
Figure 2010193888
Figure 2010193888
次いで、表ＩＶおよびＶに提供するアフィニティー成熟ペプチドを上述のペプチボディにアセンブリし、そしてｉｎ ｖｉｖｏアッセイを用いてアッセイした。
アフィニティー成熟Ｌ２ペプチドは、ｆ１ ＥＭＬｆ２ ＳＬｆ３ｆ４ ＬＬ（配列番号４５５）のコンセンサス配列を含み、ここでｆ１は、ＭまたはＩであり；ｆ２は、アミノ酸いずれかであり；ｆ３は、ＬまたはＦであり；そしてｆ４は、Ｅ、ＱまたはＤである。
アフィニティー成熟Ｌ１５ペプチドファミリーは、配列Ｌｇ１ｇ２ ＬＬｇ３ｇ４ Ｌ（配列番号４５６）を含み、ここでｇ１は、Ｑ、ＤまたはＥであり、ｇ２は、Ｓ、Ｑ、ＤまたはＥであり、ｇ３は、アミノ酸いずれかであり、ｇ４は、Ｌ、Ｗ、Ｆ、またはＹである。アフィニティー成熟Ｌ１７ファミリーは、配列ｈ１ｈ２ｈ３ｈ４ｈ５ｈ６ｈ７ｈ８ｈ９（配列番号４５７）を含み、ここでｈ１は、ＲまたはＤであり；ｈ２は、アミノ酸いずれかであり；ｈ３は、Ａ、Ｔ、ＳまたはＱであり；ｈ４は、ＬまたはＭであり；ｈ５は、ＬまたはＳであり；ｈ６は、アミノ酸いずれかであり；ｈ７は、ＦまたはＥであり；ｈ８は、Ｗ、ＦまたはＣであり；そしてｈ９は、Ｌ、Ｆ、ＭまたはＫである。コンセンサス配列は、上に示すペプチドのｍＬ２０、ｍＬ２１およびｍＬ２４ファミリーに関して決定することもまた可能である。
上記実施例２に記載するように、ＦｃのＮ末端（Ｎ立体配置）、Ｃ末端（Ｃ立体配置）、またはＮ末端およびＣ末端両方（Ｎ、Ｃ立体配置）で、配列番号２９６を有するヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに付着するリンカーを用いて、上述のようなこれらのアフィニティー成熟ペプチドからペプチボディを構築した。指定するペプチドを、５グリシン（５Ｇ）、８グリシンまたはｋリンカー配列を介して、Ｃ末端またはＮ末端に付着させた。２ｘペプチボディ型では、５ｇｌｙ、８ｇｌｙまたはｋなどのリンカーでペプチドを連結した。
例えばｍＴＮ８−１９−２２のように、アフィニティー成熟ペプチドおよびペプチボディを、小文字の「ｍ」で示す。本発明のペプチボディは、ペプチドがファージミドベクターにスプライシングされる２つのスプライス部位をさらに含有する。これらのスプライス部位の位置は、ＡＱ――ペプチド――ＬＥである。ペプチボディは、一般的に、これらのさらなるアミノ酸を含む（しかし、これらは表に列挙するペプチド配列には含まれない）。いくつかのペプチボディで、ＬＥアミノ酸をペプチド配列から除去した。これらのペプチボディは、−ＬＥと示される。
典型的なペプチボディ、およびこれらをコードする典型的なポリヌクレオチド配列を以下の表ＶＩに示す。この表には、（ペプチド単独と対照的に）ペプチボディ配列、例えば２ｘｍＴＮ８−１９−７（配列番号６１５）およびＬＥ配列が欠失されたペプチボディ（配列番号６１７）の例が含まれる。説明として、２ｘ型のリンカー配列は、タンデムペプチド間のリンカーを指す。これらのペプチボディ配列は、Ｆｃ、リンカー、ＡＱおよびＬＥ配列を含有する。付随するヌクレオチド配列は、存在するならばＡＱ／ＬＥリンカー配列に加えてペプチド配列をコードするが、示すリンカーはコードしない。
表ＶＩ
Figure 2010193888
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（実施例７）
アフィニティー成熟ペプチボディのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング
上述のプロトコルにしたがって、以下の典型的なペプチボディをスクリーニングして、以下のＫＤおよびＩＣ５０値を得た。表ＶＩＩは、ＫｉｎＥｘＡＴＭ溶液に基づくアッセイまたはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイによって決定されるように、親ペプチボディと比較した、選択したアフィニティー成熟ペプチボディのＫＤ値の範囲を示す。これらの値は、親ペプチボディと比較して、ミオスタチンに対するアフィニティー成熟ペプチボディの結合アフィニティーが増加したことを立証する。表ＶＩＩＩは、いくつかのアフィニティー成熟ペプチボディのＩＣ５０値を示す。値の範囲をこの表に示す。
表ＶＩＩ
Figure 2010193888
表ＶＩＩＩ
Figure 2010193888
（実施例８）
典型的なペプチボディのｉｎ ｖｉｖｏアナボリック活性
ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスモデル（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州）を用いて、ヒトＦｃ領域（ｈｕＦｃ）を含む本発明のペプチボディのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を決定した。このモデルは迅速なアナボリック反応で本発明の阻害剤に反応し、これは、乾燥筋量の増加および筋線維タンパク質の増加に関連するが、体内の水含量の集積には関連しない。
一例において、１ｘペプチボディｍＴＮ８−１９−２１のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を以下の実験によって立証した。１０匹の８週齢ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスの群を週２回、または週１回、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの投薬量（皮下注射）で処置した。１０匹の８週齢ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスの対照群には、週２回、１０ｍｇ／ｋｇでｈｕＦｃ（ビヒクル）の（皮下）注射を投与した。１日おきに動物の体重を測定し、そして第０日および第１３日に、ＮＭＲによって除脂肪体重を測定した。次いで、第１４日に動物を屠殺し、そして腓腹筋のサイズを測定した。結果を図２および３に示す。図２は、多様な投薬量でペプチボディを１４日間に渡って投与した際の、対照に比較した、マウスの総体重の増加を示す。図２からわかるように、すべての投薬量は、対照に比較して体重の増加を示し、示した投薬量すべては、第１４日までに、対照より統計的に有意に増加した。図３は、ＮＭＲによって測定されるような、第０日および第１３日の除脂肪体重の変化とともに、第１４日に動物から切開された腓腹筋の重量変化を示す。
別の例において、１ｘｍＴＮ８−１９−３２ペプチボディを、ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスに、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および３０ｍｇ／ｋｇで、週２回（ｂｉｗｅｅｋｌｙ）注射して投与し、ｈｕＦｃ対照（ビヒクル）と比較した。ペプチボディ処置動物は、総体重の増加（未提示）とともに、ＮＭＲ測定によって決定されるように、第０日と比較して、第１３日に、除脂肪体重の増加を示す。除脂肪体重の増加を図４に示す。
別の例において、ｉｎ ｖｉｖｏアナボリック有効性に関して、１ｘアフィニティー成熟ペプチボディを２ｘアフィニティー成熟ペプチボディと比較した。ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕ雄マウス（群あたり１０匹）を、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇの１ｘｍＴＮ８−１９−７および２ｘｍＴＮ８−１９−７の週２回の注射で３５日間処置し、一方、対照群（１０匹）には、ｈｕＦｃ（３ｍｇ／ｋｇ）を週２回注射して投与した。図５に示すように、２ｘペプチボディでの処置は、１ｘペプチボディまたは対照と比較して、剖検時に、より多い体重獲得および除脂肪死体体重を生じた。
（実施例９）
筋力増加
年齢をマッチさせた正常な雄４ヶ月齢Ｃ５７Ｂ／６マウスを、週あたり５ｍｇ／ｋｇの２ｘｍＴＮ８−１９−３３、２ｘｍＴＮ８−１９−７、およびｈｕＦｃビヒクル対照群（１０匹／群）の週２回の皮下注射で、３０日間処置した。さらなる注射をせずに動物を回復させた。回復期第１８日に、握力を測定した。Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ測定装置、モデル１０２７ｄｓｍ（オハイオ州コロンバス）を用いて、握力を測定した。ペプチボディ処置は、握力の有意な増加を生じ、２ｘｍＴＮ８−１９−３３で前処置した動物は、対照処置動物に比較して、握力の１４％の増加を示し、一方、２ｘｍＴＮ８−１９−７は、対照処置動物に比較して、握力の１５％の増加を示した。
（実施例１０）
薬物動態学
ＬＥ配列を含まない代表的なペプチボディを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態学実験を行った。１０ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇの投薬量をＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスに投与して、そして以下のパラメーターを決定した：Ｃｍａｘ（μｇ／ｍｌ）、曲線下面積（ＡＵＣ）（μｇ−時間／ｍｌ）および半減期（時間）。アフィニティー成熟ペプチボディの２ｘ型が１ｘ型よりも有意に長い半減期を有することが見出された。例えば、１ｘアフィニティー成熟ｍＴＮ８−１９−２２は、動物において約５０．２時間の半減期を有し、一方、２ｘｍＴＮ８−１９−２２は、約８５．２時間の半減期を有する。アフィニティー成熟１ｘｍＴＮ８−７は、約６５時間の半減期を有し、一方、２ｘｍＴＮ８−１９−７は、
約１０６時間の半減期を有する。
（実施例１１）
ｍｄｘマウスの処置
本発明のペプチボディは、動物において、除脂肪筋量を増加させることが示され、そして筋萎縮を伴う多様な障害の治療に有用である。筋ジストロフィーは、これらの障害の１つである。デュシェンヌ筋ジストロフィーのマウスモデルは、デュシェンヌｍｄｘマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ、メイン州バーハーバー）である。老齢（１０ヶ月齢）のｍｄｘマウスに、ペプチボディ１ｘｍＴＮ８−１９−３３（ｎ＝８／群）またはビヒクルｈｕＦｃタンパク質（Ｎ＝６／群）を３ヶ月間注射した。投薬スケジュールは、１日おき、１０ｍｇ／ｋｇ、皮下注射によった。ペプチボディ処置は、老齢ｍｄｘマウスの体重を増加させそして維持するのに陽性の影響を有した。図６Ａに示すように、ｈｕ−Ｆｃ処置対照群に比較して、ペプチボディ処置群では、体重の有意な増加が観察された。さらに、図６Ｂに示すように、脂肪量に対する除脂肪体重の比もまた、対照群に比較して、ペプチボディ処置の結果、老齢ｍｄｘマウスで有意に増加し、そして体重のうちの脂肪の割合が、対照群に比較して、ペプチボディ処置マウスで減少することが、ＮＭＲ解析によって明らかになった。
本発明は、本明細書に記載する特定の態様によって範囲を限定されず、こうした態様は、本発明の個々の側面の単一の例示であると意図され、そして機能的に同等な方法および構成要素が発明品である。実際、本明細書に示し、そして記載するものに加えて、本発明の多様な修飾が、前述の説明および付随する図から当業者には明らかであろう。こうした修飾は、付随する請求項の範囲内に属すると意図される。
図１は、本明細書の実施例に記載するＣ２Ｃ１２ ｐＭＡＲＥルシフェラーゼアッセイを用いて、各々のＩＣ５０を決定するため、ＴＮ８−１９ペプチドＱＧＨＣＴＲＷＰＷＭＣＰＰＹ（配列番号３２）およびＴＮ８−１９ペプチボディ（ｐｂ）の濃度（ｘ軸）に対する発現されたルシフェラーゼ活性（ｙ軸）によって測定した際のミオスタチン活性を示す。ペプチボディは、ペプチドと比較して、より低いＩＣ５０値を有する。 図２は、実施例８に記載するように、１４日間に渡って、ｈｕＦｃ対照で処置したマウスに比較して、増加する投薬量の１ｘｍＴＮ８−１９−２１ペプチボディで処置したＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスの総体重増加を示すグラフである。 図３Ａは、図２（実施例８）で処置したマウスの剖検時点での腓腹筋量の増加を示す。図３Ｂは、実施例８に記載する実験のＮＭＲによって決定した第０日の除脂肪量と第１３日のものを比較した際の増加を示す。 図４は、実施例８に記載する実験の第０日および第１３日のＮＭＲによって決定した際の、増加する投薬量の１ｘｍＴＮ８−１９−３２ペプチボディを週２回注射して処置したＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスに関する除脂肪体重の増加を示す。 図５Ａは、実施例８に記載するような、２ｘｍＴＮ８−１９−７および対照動物と比較した、１ｘｍＴＮ８−１９−７を週２回注射して３５日間処置したＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスの体重の増加を示す。図５Ｂは、ビヒクル（ｈｕＦｃ）を投与した動物（対照）と比較した、１ｘおよび２ｘ型を１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ注射した動物の剖検時の除脂肪死体体重の増加を示す。 図６Ａは、１日おきに３ヶ月間、１０ｍｇ／ｋｇのアフィニティー成熟１ｘｍＴＮ８−１９−３３ペプチボディまたはｈｕＦｃビヒクルのいずれかで処置した老齢ｍｄｘマウスの体重に対する除脂肪筋量の増加を示す。図６Ｂは、同じマウスに関して、処置３ヵ月後のＮＭＲによって決定されるような、体重に比較した脂肪量の変化を示す。

Claims (36)

  1. ミオスタチンに結合可能な少なくとも１つのペプチドを含む結合剤であって、該ペプチドがアミノ酸配列ＷＭＣＰＰ（配列番号６３３）を含む、前記結合剤およびその生理学的に許容しうる塩。
  2. ペプチドの長さが５〜５０アミノ酸の間である、請求項１の結合剤。
  3. ミオスタチンに結合可能な少なくとも１つのペプチドを含む結合剤であって、該ペプチドが、アミノ酸配列Ｃａ１ａ２ Ｗａ３ ＷＭＣＰＰ（配列番号３５２）、ここでａ１、ａ２およびａ３は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸から選択される、を含み、そして該ペプチドの長さが１０〜５０アミノ酸の間である、前記結合剤およびその生理学的に許容しうる塩。
  4. ミオスタチンに結合可能な少なくとも１つのペプチドを含む結合剤であって、該ペプチドが、配列Ｃｂ１ｂ２ Ｗｂ３ ＷＭＣＰＰ（配列番号３５３）、ここで
    ｂ１は、アミノ酸Ｔ、Ｉ、またはＲのいずれか１つから選択され；
    ｂ２は、Ｒ、Ｓ、Ｑのいずれか１つから選択され；
    ｂ３は、Ｐ、ＲおよびＱのいずれか１つから選択される
    を含み、そして該ペプチドの長さが１０〜５０アミノ酸の間である、前記結合剤およびその生理学的に許容しうる塩。
  5. ミオスタチンに結合可能な少なくとも１つのペプチドを含む結合剤であって、該ペプチドが、配列ｃ１ｃ２ｃ３ｃ４ｃ５ｃ６ Ｃｃ７ｃ８ Ｗｃ９ ＷＭＣＰＰｃ１０ｃ１１ｃ１２ｃ１３（配列番号３５４）、ここで
    ｃ１は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
    ｃ２は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
    ｃ３は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
    ｃ４は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
    ｃ５は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
    ｃ６は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは塩基性アミノ酸であり；
    ｃ７は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸であり；
    ｃ８は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸であり；
    ｃ９は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸であり；そして
    ｃ１０〜ｃ１３は、アミノ酸いずれかである
    を含み；そして該ペプチドの長さが２０〜５０アミノ酸の間である、前記結合剤およびその生理学的に許容しうる塩。
  6. ミオスタチンに結合可能な少なくとも１つのペプチドを含む結合剤であって、該ペプチドが、配列
    ｄ１ｄ２ｄ３ｄ４ｄ５ｄ６ Ｃｄ７ｄ８ Ｗｄ９ ＷＭＣＰＰｄ１０ｄ１１ｄ１２ｄ１３（配列番号３５５）、ここで
    ｄ１は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
    ｄ２は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
    ｄ３は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
    ｄ４は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
    ｄ５は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
    ｄ６は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは塩基性アミノ酸であり；
    ｄ７は、アミノ酸Ｔ、Ｉ、またはＲのいずれか１つから選択され；
    ｄ８は、Ｒ、Ｓ、Ｑのいずれか１つから選択され；
    ｄ９は、Ｐ、ＲおよびＱのいずれか１つから選択され；そして
    ｄ１０〜ｄ１３は、アミノ酸いずれかから選択される
    を含み；
    そして該ペプチドの長さが２０〜５０アミノ酸の間である、前記結合剤およびその生理学的に許容しうる塩。
  7. ミオスタチンに結合可能な少なくとも１つのペプチドを含む結合剤であって、該ペプチドが、配列ＷＹｅ１ｅ２ Ｙｅ３ Ｇ（配列番号３５６）、
    ここでｅ１は、Ｐ、ＳまたはＹであり、
    ｅ２は、ＣまたはＱであり、そして
    ｅ３は、ＧまたはＨである、を含み、そして該ペプチドの長さが７〜５０アミノ酸である、前記結合剤およびその生理学的に許容しうる塩。
  8. ミオスタチンに結合可能な少なくとも１つのペプチドを含む結合剤であって、該ペプチドが、配列ｆ１ ＥＭＬｆ２ ＳＬｆ３ｆ４ ＬＬ（配列番号４５５）、
    ここでｆ１は、ＭまたはＩであり、
    ｆ２は、アミノ酸いずれかであり、
    ｆ３は、ＬまたはＦであり、
    ｆ４は、Ｅ、ＱまたはＤである
    を含み；
    そして該ペプチドの長さが７〜５０アミノ酸である、前記結合剤およびその生理学的に許容しうる塩。
  9. ミオスタチンに結合可能な少なくとも１つのペプチドを含む結合剤であって、該ペプチドが、配列Ｌｇ１ｇ２ ＬＬｇ３ｇ４ Ｌ（配列番号４５６）、ここで
    ｇ１は、Ｑ、ＤまたはＥであり、
    ｇ２は、Ｓ、Ｑ、ＤまたはＥであり、
    ｇ３は、アミノ酸いずれかであり、
    ｇ４は、Ｌ、Ｗ、Ｆ、またはＹである、を含み、そして該ペプチドの長さが８〜５０アミノ酸の間である、前記結合剤およびその生理学的に許容しうる塩。
  10. ミオスタチンに結合可能な少なくとも１つのペプチドを含む結合剤であって、該ペプチドが、配列ｈ１ｈ２ｈ３ｈ４ｈ５ｈ６ｈ７ｈ８ｈ９（配列番号４５７）、ここで
    ｈ１は、ＲまたはＤであり、
    ｈ２は、アミノ酸いずれかであり、
    ｈ３は、Ａ、Ｔ、ＳまたはＱであり、
    ｈ４は、ＬまたはＭであり、
    ｈ５は、ＬまたはＳであり、
    ｈ６は、アミノ酸いずれかであり、
    ｈ７は、ＦまたはＥであり、
    ｈ８は、Ｗ、ＦまたはＣであり、
    ｈ９は、Ｌ、Ｆ、ＭまたはＫである、を含み、そして該ペプチドの長さが９〜５０アミノ酸の間である、前記結合剤およびその生理学的に許容しうる塩。
  11. 構造：
    （Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ、またはその多量体；
    ここでＦ１はビヒクルであり；そしてＸ１およびＸ２は、各々独立に
    −（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
    −（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
    −（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；
    および−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４；
    ここでＰ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、そして各々独立に、アミノ酸配列ＷＭＣＰＰ（配列番号６３３）を含み；
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、各々リンカーであり；
    そしてａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆは、各々独立に０または１である、但しａおよびｂの少なくとも１つは１である
    から選択される
    を有する結合剤およびその生理学的に許容しうる塩。
  12. １以上のミオスタチン結合ペプチドが、アミノ酸配列Ｃａ１ａ２ Ｗａ３ ＷＭＣＰＰ（配列番号３５２）、ここでａ１、ａ２およびａ３は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸から選択される、を含み、そして該ペプチドの長さが１０〜５０アミノ酸の間である、請求項１１の結合剤およびその生理学的に許容しうる塩。
  13. １以上のミオスタチン結合ペプチドが、各々独立に、アミノ酸配列Ｃｂ１ｂ２ Ｗｂ３ ＷＭＣＰＰ（配列番号３５３）、ここで
    ｂ１は、アミノ酸Ｔ、Ｉ、またはＲのいずれか１つから選択され；
    ｂ２は、Ｒ、Ｓ、Ｑのいずれか１つから選択され；
    ｂ３は、Ｐ、ＲおよびＱのいずれか１つから選択される
    を含み、そして該ペプチドの長さが１０〜５０アミノ酸の間である、請求項１１の結合剤およびその生理学的に許容しうる塩。
  14. １以上のミオスタチン結合ペプチドが、配列ｃ１ｃ２ｃ３ｃ４ｃ５ｃ６ Ｃｃ７ｃ８ Ｗｃ９ ＷＭＣＰＰｃ１０ｃ１１ｃ１２ｃ１３（配列番号３５４）、ここで
    ｃ１は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
    ｃ２は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
    ｃ３は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
    ｃ４は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
    ｃ５は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
    ｃ６は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは塩基性アミノ酸であり；
    ｃ７は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸であり；
    ｃ８は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸であり；
    ｃ９は、中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸であり；そして
    ｃ１０〜ｃ１３は、アミノ酸いずれかである
    を含み；そして該ペプチドの長さが２０〜５０アミノ酸の間である、請求項１１の結合剤およびその生理学的に許容しうる塩。
  15. １以上のミオスタチン結合ペプチドが、各々独立に、配列ｄ１ｄ２ｄ３ｄ４ｄ５ｄ６ Ｃｄ７ｄ８ Ｗｄ９ ＷＭＣＰＰｄ１０ｄ１１ｄ１２ｄ１３（配列番号３５５）、ここで
    ｄ１は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
    ｄ２は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
    ｄ３は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
    ｄ４は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり；
    ｄ５は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは酸性アミノ酸であり；
    ｄ６は、存在しないか、または中性疎水性、中性極性、もしくは塩基性アミノ酸であり；
    ｄ７は、アミノ酸Ｔ、Ｉ、またはＲのいずれか１つから選択され；
    ｄ８は、Ｒ、Ｓ、Ｑのいずれか１つから選択され；
    ｄ９は、Ｐ、ＲおよびＱのいずれか１つから選択され；そして
    ｄ１０〜ｄ１３は、アミノ酸いずれかから選択される
    を含み、そして該ペプチドの長さが２０〜５０アミノ酸の間である、請求項１１の結合剤およびその生理学的に許容しうる塩。
  16. 構造：
    （Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ、またはその多量体；
    ここでＦ１はビヒクルであり；そしてＸ１およびＸ２は、各々独立に
    −（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
    −（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
    −（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；
    および−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４；
    ここでＰ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、そして１以上のＰ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４は、各々独立に：
    （ａ）アミノ酸配列ＷＹｅ１ｅ２ Ｙｅ３ Ｇ（配列番号３５６）、ここでｅ１は、Ｐ、ＳまたはＹであり、ｅ２は、ＣまたはＱであり、そしてｅ３は、ＧまたはＨである、を含むペプチド；
    （ｂ）アミノ酸配列ｆ１ ＥＭＬｆ２ ＳＬｆ３ｆ４ ＬＬ（配列番号４５５）、ここでｆ１は、ＭまたはＩであり、ｆ２は、アミノ酸いずれかであり、ｆ３は、ＬまたはＦであり、そしてｆ４は、Ｅ、ＱまたはＤである、を含むペプチド；
    （ｃ）アミノ酸配列Ｌｇ１ｇ２ ＬＬｇ３ｇ４ Ｌ（配列番号４５６）、ここでｇ１は、Ｑ、ＤまたはＥであり、ｇ２は、Ｓ、Ｑ、ＤまたはＥであり、ｇ３は、アミノ酸いずれかであり、そしてｇ４は、Ｌ、Ｗ、Ｆ、またはＹである、を含むペプチド；および
    （ｄ）アミノ酸配列ｈ１ｈ２ｈ３ｈ４ｈ５ｈ６ｈ７ｈ８ｈ９（配列番号４５７）、ここでｈ１は、ＲまたはＤであり、ｈ２は、アミノ酸いずれかであり、ｈ３は、Ａ、Ｔ、ＳまたはＱであり、ｈ４は、ＬまたはＭであり、ｈ５は、ＬまたはＳであり、ｈ６は、アミノ酸いずれかであり、ｈ７は、ＦまたはＥであり、ｈ８は、Ｗ、ＦまたはＣであり、そしてｈ９は、Ｌ、Ｆ、ＭまたはＫである、を含むペプチド
    からなる群より選択され；
    該ペプチドの長さは９〜５０アミノ酸の間であり；
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、各々リンカーであり；
    そしてａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆは、各々独立に０または１である、但しａおよびｂの少なくとも１つは１である
    から選択される
    を有する結合剤およびその生理学的に許容しうる塩。
  17. 構造：
    （Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ、またはその多量体；
    ここでＦ１はビヒクルであり；そしてＸ１およびＸ２は、各々独立に
    −（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
    −（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
    −（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；
    および−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４；
    ここでＰ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、そして独立に、配列番号３０５〜３５１および配列番号３５７〜４５４から選択され；
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、各々リンカーであり；
    そしてａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆは、各々独立に０または１である、但しａおよびｂの少なくとも１つは１である
    から選択される
    を有する結合剤およびその生理学的に許容しうる塩。
  18. ビヒクルがＦｃドメインである、請求項１１〜１７のいずれか１つの結合剤。
  19. 請求項１８の結合剤をコードするポリヌクレオチド配列。
  20. 請求項１９のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  21. 請求項２０の発現ベクターを含む宿主細胞。
  22. 原核細胞である、請求項２１の宿主細胞。
  23. 真核細胞である、請求項２１の宿主細胞。
  24. 薬学的に許容しうるキャリアーと混合された、請求項１または１１のいずれか１つの結合剤の有効量を含む、薬剤組成物。
  25. ビヒクルがＦｃドメインである、請求項２４の薬剤組成物。
  26. 被験者において、ミオスタチン活性を阻害する方法であって、請求項１、３または１１のいずれか１つの結合剤の有効量を、該被験者に投与することを含む、前記方法。
  27. 被験者において、除脂肪（ｌｅａｎ）筋量を増加させる方法であって、請求項２４の組成物を該被験者に投与することを含む、前記方法。
  28. 被験者が食用動物である、請求項２７の方法。
  29. 被験者において、脂肪に対する除脂肪筋量の比を増加させる方法であって、請求項２４の組成物の療法的有効量を、該被験者に投与することを含む、前記方法。
  30. 被験者において、筋萎縮（ｍｕｓｃｌｅ−ｗａｓｔｉｎｇ）疾患を治療する方法であって、請求項２４の組成物の療法的有効量を、該被験者に投与することを含む、前記方法。
  31. 疾患が、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、うっ血性閉塞性肺疾患、慢性心不全、癌、ＡＩＤＳ、腎不全、尿毒症、関節リウマチ、年齢に関連するサルコペニア、並びに長期間の絶対安静、脊椎傷害、脳卒中、骨折、および加齢による筋萎縮から選択される、請求項３０の方法。
  32. 被験者において、ミオスタチン関連代謝障害を治療する方法であって、請求項２４の組成物の療法的有効量を、該被験者に投与することを含む、前記方法。
  33. 代謝障害が、糖尿病、肥満、高血糖、および骨減少から選択される、請求項３２の方法。
  34. 試料中のミオスタチンを検出する方法であって、請求項１または１１の結合剤と該試料を接触させ、そして結合複合体を検出することを含む、前記方法。
  35. 試料中のミオスタチンを測定する方法であって、請求項１または１１の結合剤と該試料を接触させ、そして結合複合体を測定することを含む、前記方法。
  36. 被験者において、ミオスタチンに関連する障害を診断する方法であって、請求項１または１１の結合剤と、該被験者から採取した試料を接触させ、そして結合複合体を検出することを含む、前記方法。
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