JP2003508054A

JP2003508054A - チャンネル形成性タンパク質の製造方法

Info

Publication number: JP2003508054A
Application number: JP2001520873A
Authority: JP
Inventors: ニーデルバイス，ミヒャエル; ボッスマン，シュテファン
Original assignee: ニーデルバイス，ミヒャエル; ボッスマン，シュテファン
Priority date: 1999-08-31
Filing date: 2000-08-28
Publication date: 2003-03-04
Also published as: AU7901300A; CA2381139A1; DE10082576D2; WO2001016327A2; EP1208207A2; WO2001016327A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、グラム陽性細菌で見出されるチャンネル形成性タンパク質の製造方法であって、チャンネル形成性タンパク質が以下の：ａ）異種過剰発現、またはｂ）ミコバクテリアからの精製により得られ、抽出温度が50℃より高い方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、チャンネル形成性タンパク質の製造方法、チャンネル形成性タンパ
ク質、このようなタンパク質をコードする遺伝子、ならびにｍｓｐＡ、ｍｓｐＣ
またはｍｓｐＤ遺伝子、プラスミドベクター、そして過剰発現系に関する。

【０００２】本発明は概して、ナノ構造の製造の技術分野に関する。今日まで、最良の特性
化ナノ構造は、カーボンナノチャンネルである（Yakobson, B.I. and Smalley,
R.E. Fullerene nanotubes:C_1,000,000 and beyond.「Am Sci」85, 324, 1997）
。カーボンナノチャンネルの電子特性は、それらの構造的詳細により制御し得る
ということが示された。カーボンナノチャンネルは、ＣＶＤ(化学気相蒸着)法（
Fan, S., Chapline, M.G., Franklin, N.R., Tombler, T.W., Cassell, A.M. an
d Dai, H. Self-oriented regular arrays of carbon nanotubes and their fie
ld emission properties.「Science」283、512-4、1999）の異なる変法を用いて
合成され、これはしたがって非常に経費がかかる。

【０００３】 Johnson, S.A.、Ollivier, P.J.及びMallouk, T.E.『Ordered mesoporous pol
ymers of tuneable pore size from colloidal silica templates.』、「Scienc
e」 283、963-965(1999)から、鋳型に基づいて有機ナノチャンネルを作製するた
めの技術が報告されている。この方法を用いて、5〜35ｎｍの直径を有するナノ
チャンネルを生成させ得る。

【０００４】ミコバクテリアはグラム陽性細菌の亜群に属するが、この亜群はミコール酸を
含有し、それらの例としては、コリネバクテリウム属、ノカルジア属、ロドコッ
カス属、ゴルドナ属、ツカムレラ属、ジエチア属が挙げられる。 Trias, J.及びBenz, R. 『Permeability of the cell wall of Mycobacterium
smegmatis.』「Mol Microbiol」、14、283-290(1994)は、ミコバクテリアのミ
コール酸層中のポーリンと呼ばれるチャンネル形成性タンパク質を記載する。こ
れらのポーリンの生化学的または分子遺伝学的データは、未だ発表されていない
。

【０００５】 Lichtinger, T.、Burkovski, A.、Niederweis, M.、Kramer, R.及びBenz, R.
『Biochemical and biophysical characterization of the cell wall porin of
Corynebacterium glutamicum: the channel is formed by a low molecular ma
ss polypeptide.』、「Biochemistry」37、15024-32(1998)により、コリネバク
テリアからポーリンを調製するための方法が既知である。この技法は、相対的に
非効率的である。

【０００６】 Mukhopadhyay, S.、Basu, D.及びChakrabarti, P. 『Characterization of a
porin from Mycobacterium smegmatis.』、「J Bacteriol」179、6205-6207(199
7)は、1％ツビッタージェントを含有する緩衝液を用いた室温で1時間のインキュ
ベーションによるミコバクテリウム・スメグマティス（M. smegmatis）からのポ
ーリンの抽出を記載する。収量は乏しく、ポーリンには多数のその他のタンパク
質が夾雑していた。

【０００７】 Harth, G.他『High-level heterologous expression and secretion in rapid
ly growing nonpathogenic mycobacterium of four major Mycobacterium tuber
culosis extracellular proteins considered to be leading vaccine candidat
es and drug tatgets.』、「Infection and Immunity」65、2321-2328(1997)か
ら、大腸菌におけるミコバクテリア特異的タンパク質の強い発現は可能であると
は思われないことが知られている。

【０００８】 Senaratne, R.H.他『Expression of a Gene for a Porin-Like Protein of th
e OmoA Family from Mycobacterium tuberculosis H37Rv.』、「J Bacteriol」1
80、3541-3547(1998)は、大腸菌におけるミコバクテリウム・ツベルクロシス（M
ycobacterium tuberculosis）H37Rvからのポーリン様タンパク質のための遺伝子
の発現を記載する。遺伝子の発現は、明らかに発現タンパク質が大腸菌に対して
有毒であるために、細菌の増殖の不連続性を生じる。大腸菌からの極少量のタン
パク質は、細胞の死の直前に単離し得た。

【０００９】チャンネル形成性タンパク質の製造方法改良を提供することが、本発明の一目
的である。この目的は、請求項１、２６、２７、２８、３０、３２、３６、３７、３８、
４０および４１の特徴により解決される。さらに適切な実施態様は、請求項２〜
２５、２９、３１、３３、３４、３５、３９ならびに任意に３７および３８の特
徴に由来する。

【００１０】本発明によれば、グラム陽性細菌中に見出されるチャンネル形成性タンパク質
の製造方法であって、チャンネル形成性タンパク質が以下の：ａ）異種過剰発現、またはｂ）ミコバクテリアからの精製により得られ、抽出温度が50℃より高い方法が提供される。

【００１１】チャンネル形成性タンパク質とは、水充填チャンネルまたは水充填チャンネル
様構造を形成し得るタンパク質を意味する。このようなタンパク質は、天然に、
特に細菌の細胞壁中に生じる。それらは、直径3ｎｍまたはそれ以上でさえある
チャンネル様構造を形成し得る。チャンネル様構造またはチャンネルは、多数の
亜構造、特に4または8の亜構造から作り得る。

【００１２】本発明のこの構造は、従来の手法と比較してより効率的であり、クロマトグラ
フィー的精製の広範囲の自動化の可能性を提供し、収量の激烈な増大を可能にす
る。グラム陽性細菌は、少なくとも1つのミコール酸を含有する細菌であり得る。
一実施態様では、本細菌はミコバクテリア、好ましくはミコバクテリウム・スメ
グマティス（Mycobacterium smegmatis）である。

【００１３】チャンネル形成性タンパク質は、ポーリンであり得る。好ましいのは、有機溶
液中で化学的に安定であるか、および／または80℃まで、さらに好ましくは100
℃までの温度に熱安定性であるポーリンである。安定であるとは、当該タンパク
質のチャンネル様構造が無傷のままで、本質的にタンパク質の変性が生じないこ
とを意味する。

【００１４】好ましいのは、ポーリンＭｓｐＡ、ＭｓｐＣ、ＭｓｐＤ、これらのポーリンの
断片、これらのポーリンと相同のタンパク質またはこれらのポーリンから得られ
る配列のタンパク質である。ＭｓｐＡは配列３のアミノ酸28〜211に対応し(下記
参照)、ＭｓｐＣは配列７に対応し、そしてＭｓｐＤは配列９に対応する。前記
のポーリンまたはそれらの断片の相同タンパク質は、前記のポーリンまたはそれ
らの断片と類似の構造を示す。アミノ酸の少なくとも20％は、これらのポーリン
または断片のアミノ酸と同一または相同である。タンパク質中のアミノ酸は、そ
れがタンパク質の機能または構造に影響を及ぼすことなく、他のアミノ酸と置換
され得る場合には、別のアミノ酸と相同である。ポーリンの構造から推測された
タンパク質は、その配列と比較して単一のまたは数個のアミノ酸を失い得るし、
あるいは他のアミノ酸またはアミノ酸類似体を含有する。

【００１５】前記のタンパク質は、それらの意外に高い化学的および熱安定性のために、ナ
ノ構造の生成に特に適している。異種過剰発現が大腸菌で、またはミコバクテリアで実施される場合には、良好
な収量が得られる。過剰発現に関しては、チャンネル形成性タンパク質、好まし
くはポーリンをコードする遺伝子を用いる必要がある。過剰発現のためには、配
列１によるｍｓｐＡ遺伝子(下記参照)、配列６によるｍｓｐＣ遺伝子または配列
８によるｍｓｐＤ遺伝子を用いるのが好ましい。配列番号１、６または８から得
られる突然変異体遺伝子が過剰発現のために用いられ、それにより突然変異は本
質的に、化学的および熱安定性、ならびにチャンネル様構造がＭｓｐＡ、Ｍｓｐ
ＣまたはＭｓｐＤのものと本質的に対応するようなものである。突然変異は、ｍ
ｓｐＡ、ｍｓｐＣまたはｍｓｐＤ遺伝子のコドン使用法が大腸菌における高発現
遺伝子の使用法に適応されるようなものである。これらのコドンは、Nakamura,
T.他『Two types of linkage between codon usage and gene-expression level
s.』、「FEBS Lett.」289、123-125(1991)から既知である。

【００１６】突然変体ｍｓｐＡ、ｍｓｐＣまたはｍｓｐＤ遺伝子は、突然変異が本質的に、
Ｇ＋Ｃ含量を66％未満に低減される場合には、過剰発現のために用い得る。コド
ン使用法の適応は、大腸菌におけるＭｓｐＡ、ＭｓｐＣおよびＭｓｐＤの過剰発
現を劇的に改良する。チャンネル形成性タンパク質ＭｓｐＡの収量は、前記のネイティブタンパク質
の製造方法と比較して、大腸菌における過剰発現を介して因子10〜20によりさら
に増大し得る。

【００１７】過剰発現のために配列４によるｓｙｎｍｓｐＡ遺伝子を用いることは有用であ
る。配列４によるｓｙｎｍｓｐＡ遺伝子が挿入される大腸菌のための過剰発現ベ
クターがこの目的のために用い得る。適切なベクターは、Hanning, G.及びMakri
des, S.C. による「Trends in Biotechnology」1998、Vol. 16、第54頁に記載さ
れている(この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる)。

【００１８】非イオン性または双性イオン性洗剤を用いることにより、グラム陽性細菌の細
胞壁からチャンネル形成性タンパク質を収穫することも有益に見出された。洗剤
は、以下の群から選択し得る：イソトリデシルポリ(エチレングリコールエーテ
ル)_n、アルキルグルコシド、特にオクチルグルコシド、アルキルマルトシド、特
にドデシルマルトシド、アルキルチオグルコシド、特にオクチルチオグルコシド
、オクチル−ポリエチレンオキシドおよびラウリルジメチルアミノキシド。リン
酸塩緩衝液（100mMのＮａ₂ＨＰＯ₄／ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ6.5、150mMのＮａＣｌ
）中の2倍以上の臨界ミセル濃度(ＣＭＣ)が、好ましくは用いられる。双性イオ
ン性および非イオン性洗剤は、ミコバクテリウム・スメグマティス（M. smegmat
is）の細胞壁からのチャンネル形成性タンパク質ＭｓｐＡを非常に有効に溶解し
、良好な収量を生じる。

【００１９】抽出温度は80〜110℃、好ましくは90〜100℃であり、および／または抽出時間
は5〜120分、好ましくは25〜35分であるというのが有用であるとさらに示されて
いる。特に好ましいのは、50 mMＮａＣｌまたはＮａ−リン酸塩より高いイオン
強度を有する緩衝液の使用である。特に100℃での抽出ならびに高イオン強度を有する緩衝液、または双性イオン
性および非イオン性洗剤の使用の実施は、ミコバクテリウム・スメグマティスか
らのポーリンの抽出方法を改良する。有機溶媒または室温でのそれらの抽出を用
いたこれらのタンパク質の精製のための従来の手法と比較して、それは以下の利
点を提供する：ａａ)有機溶媒の使用を必要としないｂｂ)他のタンパク質の最小限の夾雑ｃｃ)効率的抽出。

【００２０】 50〜110℃の範囲の温度でジメチルスルホキシド中に溶解し、その後、溶液を
室温に冷却して、ＭｓｐＡ沈殿物を濾過することにより、ＭｓｐＡを精製するこ
とも可能である。好ましくは、チャンネル形成性タンパク質は、精製のために、特にアセトンを
用いて、沈殿される。この手法は、他の非沈殿タンパク質に関してＭｓｐＡのさ
らなる濃縮を生じる。イオン交換クロマトグラフィー法、特に陰イオン交換クロ
マトグラフィー法を用いてタンパク質を精製することも有益である。さらなる精
製は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて成し遂げ得る。

【００２１】異種過剰発現により産生されるチャンネル形成性タンパク質の再生は、タンパ
ク質の局所濃度を増大することにより成し遂げ得る。増大は、電気泳動的濃厚化
により、特にＤＣ電流により、沈降により、または適切な表面（特に膜）での吸
着により成し遂げ得る。有用なのは、50Ｖで30分間のＤＣ電流である。本発明の別の局面は、本発明の方法により産生されるグラム陽性細菌からのチ
ャンネル形成性タンパク質である。

【００２２】グラム陽性細菌は、ミコール酸を含有する細菌であり、それによりミコバクテ
リア、好ましくはミコバクテリウム・スメグマティスを用いるのが有益である。チャンネル形成性タンパク質が有機溶媒に対して化学的安定であるポーリンで
あることは特に有益である。ポーリンは、80℃までの、好ましくは100℃までの
温度で本質的に安定である。この熱安定性は、ＭｓｐＡ、ＭｓｐＣ、ＭｓｐＤ、
これらのポーリンの断片、これらの断片のうちの１つと相同なポーリン、あるい
はポーリンの配列（ＭｓｐＡ、ＭｓｐＣ、ＭｓｐＤ）またはそれらの断片から得
られるポーリンにより示される。化学的および熱安定性、ならびにこのようにし
て得られたタンパク質のチャンネル形成性構造は、概して、ＭｓｐＡ、ＭｓｐＣ
、ＭｓｐＤタンパク質の安定性に対応する。ここでは言及されていないさらに別
のタンパク質が非常によく似た特性を保有し、したがって本発明の範囲に包含さ
れるということは、さらにあり得る。

【００２３】本発明のチャンネル形成性タンパク質は、以下の利点を有する：ａａａ）チャンネル形成性タンパク質がミコバクテリウム・スメグマティス（
M. smegmatis）の細胞壁中に見出される場合、それらを、変性を伴わずに有機溶
媒(例えば、ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ)中に溶解し得る。チャンネル形成性特性は、
有機溶媒中でも残存する。

【００２４】ｂｂｂ）それらは、変性を伴わずにアセトンを用いて沈降させ得る。ｃｃｃ）それらは、変性を伴わずに、洗剤中での煮沸中(例えば、3％ＳＤＳ中
で10分間)でも生き残る。化学的および熱変性に対する本発明のタンパク質のこの極安定性は、技術的適
用可能なナノ構造を生成するために、それらを用いるのを可能にする。

【００２５】本発明によれば、本発明のチャンネル形成性タンパク質をコードする遺伝子を
さらに特許請求する。これは、配列１によるｍｓｐＡ遺伝子、配列６によるｍｓ
ｐＣ遺伝子または配列８によるｍｓｐＤ遺伝子であり得る。付加的物質として、突然変異化ｍｓｐＡ遺伝子、ｍｓｐＣ遺伝子またはｍｓｐ
Ｄ遺伝子が提供され、この場合、前記の遺伝子のコドン使用法は、大腸菌中の高
発現遺伝子のコドン使用法と実際的に同一である。突然変異は、Ｇ＋Ｃ含量が66
％未満に低減されるようなものであり得る。突然変異化遺伝子はさらに、発現タ
ンパク質の化学的および熱安定性、ならびにチャンネル様構造がＭｓｐＡ、Ｍｓ
ｐＣまたはＭｓｐＤのものと本質的に同様であるように、配列１、６または８の
うちの1つから得られる。本明細書に言及されていないさらに別の突然変異を、
当業者は考えることができる。本発明のチャンネル用タンパク質の形成をもたら
す遺伝子、例えば突然変異化ｍｓｐＡ遺伝子は、本明細書に添付された、特許請
求の範囲に含まれるが、この場合、突然変異化遺伝子は、配列４によるｓｙｎｍ
ｓｐＡ遺伝子(下記参照)である。

【００２６】本発明のさらに別の目的は、プラスミドベクターｐＭＮ５０１、および大腸菌
が前記のプラスミドベクターを含有する過剰発現系である。本発明の以下の実施例を、図面を参照しながら説明する。全てのゲル電気泳動実験において、40mMのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメ
タン、ｐＨ7.0、3％ドデシル硫酸ナトリウム、8％グリセロール,0.1％セルバブ
ルーＧを含有する試料緩衝液中に30分間室温で、タンパク質をインキュベートし
、次にゲル電気泳動によりそれらのサイズによって分離した。

【００２７】図1ａ〜ｃは、異なる温度でミコバクテリウム・スメグマティス（M. smegmati
s）から抽出されたタンパク質を示す。図1ａは、クーマシーブルーで染色した10％変性ポリアクリルアミドゲルを示
す。レーンＭ：分子量マーカー（200、116.3、97.4、66.3、55.4、36.5、31、21
.5および14.4 kDa）。レーン1〜８：30、40、50、60、70、80、90および100℃
で得られた各々12μｌの抽出物。

【００２８】図1ｂは、ＰＶＤＦ膜上にブロットした8％変性ポリアクリルアミドゲルのイム
ノブロット分析を示す。ＭｓｐＡ抗血清および化学発光反応を用いて、タンパク
質を可視化した(ＥＣＬ検出系、AmershamPharmasia, Vienna, Austria)。レーン
Ｍ：分子量マーカー（97.4、68、46、31、20.1、14.4 kDa）。レーン1〜３：30
、40または50℃で得られた2 μｌの抽出物；レーン４〜８：60、70、80、90ま
たは100℃で得られた1 μｌの抽出物；（９）１ｎｇのＭｓｐＡ。

【００２９】図１ｃは、銀で染色した変性8％ポリアクリルアミドゲルを示す。レーンＭ：
分子量マーカー（200、116.3、97.4、66.3、55.4、36.5、31、21.5、14.4、6 k
Da）。レーン1および2：それぞれ30および40℃で得られた15μｌの抽出物；レー
ン３：50℃で得られた15μｌの抽出物；レーン４〜８：60、70、80、90または10
0℃で得られた4μｌの抽出物；（９） 270ｎｇの精製ＭｓｐＡ。

【００３０】図２は、クーマシーブルーで染色した変性10％ポリアクリルアミドゲルを示す
。レーンＭ：分子量マーカー（200、116.3、97.4、66.3、55.4、36.5、31、21.5
、14.4、6 kDa）；レーン1：ＰＯＰ０５緩衝液（100mMのＮａ₂ＨＰＯ₄／ＮａＨ ₂ ＰＯ₄、ｐＨ6.5、0.1mMのＥＤＴＡ、150mMのＮａＣｌ、0.5％オクチルポリエチ
レンオキシド(ＯＰＯＥ)）を用いて得られたミコバクテリウム・スメグマティス
（M. smegmatis）からの抽出物の40μｇのタンパク質；レーン2：アセトンで沈
降後の抽出物の40μｇのタンパク質；レーン3：陰イオン交換クロマトグラフィ
ーおよびＭｓｐＡを含有した分画のプール後の4μｇのタンパク質；レーン4：ア
セトンで沈降後のプール化ＭｓｐＡ分画の4μｇのタンパク質；レーン5：サイズ
排除クロマトグラフィーおよびＭｓｐＡを含有した分画のプール後の4μｇのタ
ンパク質。ｍｓｐＡ遺伝子の、ｍｓｐＡ遺伝子＋プロモーターの、そして推定信
号配列を有するＭｓｐＡタンパク質の配列は、配列プロトコール中の配列1〜3と
して示される。

【００３１】図３は、大腸菌からのチャンネル形成性タンパク質ＭｓｐＡの精製を示す。10
％変性ポリアクリルアミドゲル中でそれらのサイズによって、タンパク質を分離
した。ゲルをクーマシーブルーで染色した。レーン1：ＩＰＴＧによる誘導前の
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)／ｐＭＮ５０１からの溶解物。レーン２：ＩＰＴＧによ
る誘導後の大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)／ｐＭＮ５０１からの溶解物。レーン３：分
子量マーカー（200、116.3、97.4、66.3、55.4、36.5、31、21.5、14.4、6 kDa
）。ゲル上に載せる前に、37℃で30分間、試料をインキュベートした。

【００３２】図４は、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)の過剰発現のためのベクターｐＭＮ５０１の
構築を模式的に示す。略語の意味を以下に示す：ｌａｃＩ：ラクトースリプレッサーをコードする遺伝子。ｎｐｔＩ：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子。この
遺伝子はカナマイシンに対する耐性を付与する。Ｏｒｉ：複製の起点。ＲＢＳ：リボソーム結合部位。

【００３３】図５は、モノマーＭｓｐＡの再生のための装置を模式的に示す。5cmの長さの
ポリエチレン製の使い捨てピペット先端を、その下方端で2mm短くした。この先
端に、ＴＡＥ緩衝液中の1.7％アガロースを充填した。鉛筆(ブランド：Eberhard
Faber、3Ｈ)の芯鉛を5cmに短くした。蓋なしのポリプロピレン製の管に、5μｇ
の変性ＭｓｐＡを含有する溶液60μｌを充填した。ピペット先端および芯鉛を溶
液中に入れて、それぞれ陰極および陽極として接続した。

【００３４】図６は、変性ＭｓｐＡの再生を示す。Schagger(Schagger, H. and von Jagow,
G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis fo
r Anal Biochem 166, 368-79(1987))により記載されたように、10％変性ポリア
クリルアミドゲル中で、タンパク質を分離した。ゲルを銀で染色した。レーンＭ
：分子量マーカー（116、97、66、55、36.5、31、21.5、14.4 kDa）。レーン1
：800ｎｇの変性ＭｓｐＡ。レーン2：再生反応後の800ｎｇのＭｓｐＡ。ゲル上
に載せる前に、37℃で30分間、試料をインキュベートした。

【００３５】図７ａ〜７ｃは、ミコバクテリウム・スメグマティス（M. smegmatis）からの
チャンネル形成性タンパク質ＭｓｐＡの修飾の電子顕微鏡写真を示す。試料の調
製は、以下のように実施した：ＭｓｐＡの1ｍｌの溶液(ｃ(ＭｓｐＡ)=17.2ｘ10^-9 mol/L、100mMのＮａ₂ＨＰ
Ｏ₄／ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ6.5、150mMのＮａＣｌ、0.10 g/LのＳＤＳ)を、24.5℃
で水浴中で、超音波により分散させた。液体およびＨＯＰＧ(炭素)表面(1.0 mm² )間の距離は、5.0 cmであった。分散液体小滴をＨＯＰＧ表面と20分間接触させ
た。

【００３６】図７ａは、単離チャンネル形成性タンパク質を示す。図７ｂは、直径12ｎｍの
大型孔を示すリボン様構造を明示する。図７ｃは、リボン様構造中の２種類のチ
ャンネルを示す：即ち、約2.4ｎｍの小直径を有するチャンネルと、約9〜10ｎｍ
の大型直径を有するチャンネルである。

【００３７】実施例１：異なる温度でのミコバクテリウム・スメグマティス（M. smegmatis
）からのＭｓｐＡの抽出 10ミリグラムのミコバクテリウム・スメグマティス（M. smegmatis）のｍｃ²
１５５細胞(湿重量)をＰＢＳ（100mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ7.0、150mMのＮ
ａＣｌ、0.1mMのＥＤＴＡ）で洗浄し、150μｌのＰＧ０５緩衝液（0.5％イソト
リデシルポリエチレングリコールエーテル、100mMのＮａ₂ＨＰＯ₄／ＮａＨ₂ＰＯ ₄ 、0．1mMのＥＤＴＡ、150mMのＮａＣｌ、ｐＨ6.5）中に再懸濁した。再懸濁細
胞を、30、40、50、60、70、80、90または100℃で30分間インキュベートした。
試料を氷上で10分間冷却し、4℃で10分間遠心分離した。蒸発により、上清の容
積を120μｌから10μｌに減少させた。図１ａ〜ｃに示したように、ゲル電気泳
動によりそれらのサイズによってタンパク質を分離した。抽出物中の総タンパク
質と比較したＭｓｐＡの分画は、50℃より高い温度では有意に増大する。それら
の温度では、その他のタンパク質は少量のみ抽出される。

【００３８】実施例２：ミコバクテリウム・スメグマティス（M. smegmatis）からのＭｓｐ
Ａの精製 10グラムのミコバクテリウム・スメグマティス（M. smegmatis）細胞をＰＢＳ
で洗浄し、35 mLのＰＯＰ０５中に再懸濁し、水浴中で30分間撹拌しながら沸騰
させた。細胞懸濁液を氷上で10分間冷却し、27000ｇで4℃で15分間遠心分離した
。42 mLの上清を静かに等容積の氷冷アセトンと混合した。この混合物を氷上に1
時間保持し、8000ｇで4℃で15分間遠心分離した。沈降タンパク質を10mLの25mM
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２-エタンスルホン酸(ＨＥＰ
ＥＳ)、ｐＨ７．５、10mMのＮａＣｌ、0.5％ＯＰＯＥ(ＡＯＰ０５)中に溶解し、
1.7 mLの容積を有する陰イオン交換カラム「ＰＯＲＯＳ２０ＨＱ」（Persepti
ve Biosystems, Cambridge, USA）上に載せた。14 mLのＡＯＰ０５でカラムを洗
浄後、結合タンパク質を100％ＡＯＰ０５から100％ＢＯＰ０５(25 mMＨＥＰＥＳ
、ｐＨ7.5、2ＭのＮａＣｌ、0.5％ＯＰＯＥ)までの勾配で34 mLに亘って溶離し
た。1 mLの90分画を収集し、ゲル電気泳動により分析した。最高量のＭｓｐＡを
有する4つの分画をプールし、前記と同様にアセトンで沈殿させた。ペレットを6
00μｌのＡＯＰ０５中に溶解し、氷上でインキュベートして、4℃で5分間遠心分
離して、不溶性物質を除去した。タンパク質溶液を24 mLの容積を有するゲル濾
過カラム「スーパーデックスＧ２００」（Pharmacia, Freiburg, Germany）上に
投入した。タンパク質を48 mLのＡＯＰ０５で0.2 mL／分の速度で溶離した。1 m
Lの50分画を収集し、銀で染色した変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分析し
た。見かけ上純粋なＭｓｐＡを含有する分画をプールした。精製段階を図２に示
す。収量は700μｇであった。この試料プローブ1μｇは、銀染色変性ポリアクリ
ルアミドゲル中で他のタンパク質のいかなる夾雑も示さなかった(データは示さ
れていない)。したがって、ＭｓｐＡは、見かけ上均質に精製した。

【００３９】実施例3：大腸菌からのチャンネル形成性タンパク質ＭｓｐＡの精製戦略ＭｓｐＡの収量をさらに増大するためには、大腸菌中でのｍｓｐＡ遺伝子の過
剰発現が示唆される。ｍｓｐＡ遺伝子は、ミコバクテリウム・スメグマティス（
M. smegmatis）からのチャンネル形成性ＭｓｐＡをコードする。ｍｓｐＡ遺伝子
の過剰発現のために、Ｔ7発現系を選択する。ＰＣＲにより、プラスミドｐＰＯ
Ｒ６からｍｓｐＡ遺伝子を増幅した。高発現化遺伝子においてはめったに生じな
いネイティブｍｓｐＡ配列の全コドンを交換した。全突然変異を、配列プロトコ
ールの配列４に列挙する(下記参照)。Stemmer(Stemmer, W.P., Cameri, A., Ha,
K.D., Brennan, T.M. and Heyneker, H.L. Single-step assembly of a gene a
nd entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene
164, 49-53(1995))により記載されたようにオリゴヌクレオチドのアセンブリー
によりこの遺伝子を合成し、ｓｙｎｍｓｐＡと名づけた。ｓｙｎｍｓｐＡ遺伝子
は、ベクターｐＭＮ５００中でｍｓｐＡ遺伝子を置換するが、その使用が大腸菌
中のＭｓｐＡの量を検出可能にしてベクターｐＭＮ５０１に提供することはなか
った(図４)。ベクターｐＭＮ５０１は、ＩＰＴＧによる誘導後に、大腸菌ＢＬ２
１(ＤＥ３)中でのＭｓｐＡモノマー(20 kDa)の強い発現を起こした。このタンパ
ク質は組換え体ＭｓｐＡ(ｒＭｓｐＡ)と呼ばれ、配列プロトコールの配列５を保
有する(下記参照)。

【００４０】実施例４：大腸菌からのチャンネル形成性タンパク質ＭｓｐＡの精製手法 30μｇ／mLのカナマイシンを含有する1リットルのＬＢ培地にｍｉｔ大腸菌Ｂ
Ｌ２１(ＤＥ３)／ｐＭＭ５０１を接種し、培養を37℃で0.6のＯＤ₆₀₀に増殖させ
た。次に、細胞を1 mMのＩＰＴＧで誘導して、培養が2.2のＯＤ₆₀₀に達するまで
、37℃でさらに6時間インキュベートした。遠心分離により細胞を収穫し、40 mL
のＡ−緩衝液(25 mMのＨｅｐｅｓ、ｐＨ7.5、10 mMのＮａＣｌ)中に再懸濁し、
水中で10分間煮沸することにより溶解した。細胞溶解物を氷上に10分間保持し、
細胞屑および不溶性タンパク質を10000ｇで10分間の遠心分離により沈殿させた
。陰イオン交換クロマトグラフィー(ＰＯＲＯＳＨＱ２０、Perseptive Biosys
tems, Cambridge, USA)、ならびに10 mM〜2 M塩化ナトリウムの線状勾配を用い
て上清を分別した。モノマーＭｓｐＡは、350 mMのＮａＣｌで溶離する。Ｍｓｐ
Ａを含有する分画をプールした。サイズ排除クロマトグラフィー（スーパーデッ
クスＧ２００、Pharmacia, Freiburg, Germany）を用いて、大分子量を有するタ
ンパク質からＭｓｐＡを精製する。収量は10 mgＭｓｐＡで、純度は95％を超え
る(データは示されていない)。

【００４１】実施例5：チャンネル形成性タンパク質ＭｓｐＡの電気化学的アセンブリー大腸菌中でのＭｓｐＡの過剰発現は、ＭｓｐＡを良好な収量で容易に産生させ
る。しかしながら、精製タンパク質の大分画は不活性である。その活性形態への
ＭｓｐＡの再生は、以下のプロトコールを用いて成し遂げ得る：再生は、この目的のために特に設計された装置中で起こり得る(図５)。50Ｖの
電圧を30分間適用することにより、前記の装置中で5μｇのモノマーＭｓｐＡを
用いて、再生反応を実施する。次に適用電圧の符号を5秒間逆にして、鉛の表面
に吸着されたポーリンを除去する。再生反応後に変性ポリアクリルアミドゲルで
ポーリンを分析する（図６）。このゲルは、タンパク質の大分画がオリゴマーに
組み立てられることを示す。この集合ＭｓｐＡは、高チャンネル形成性活性を有
することが脂質二層実験において再構築することにより実証される。この実験は
、モノマーＭｓｐＡの再生が小ＤＣ電圧を用いて可能であることを実証する。こ
の再生反応は非常に容易に実施され、そして大腸菌の過剰発現による機能性Ｍｓ
ｐＡの精製の重要な構成成分である。

【００４２】配列リスト：１．ｍｓｐＡ遺伝子(翻訳済) ２．ｍｓｐＡ遺伝子＋プロモーター(翻訳済) ３．推定信号配列を有するＭｓｐＡタンパク質４．ｓｙｎｍｓｐＡ遺伝子(翻訳済) ５．ｒＭｓｐＡタンパク質６．ｍｓｐＣ遺伝子７．ＭｓｐＣタンパク質８．ｍｓｐＤ遺伝子９．ＭｓｐＤタンパク質

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１ａ】ゲル電気泳動により示した場合のミコバクテリウム・スメグマティス（M. sme
gmatis）からのＭｓｐＡの温度依存性抽出。

【図１ｂ】ゲル電気泳動により示した場合のミコバクテリウム・スメグマティス（M. sme
gmatis）からのＭｓｐＡの温度依存性抽出。

【図１ｃ】ゲル電気泳動により示した場合のミコバクテリウム・スメグマティス（M. sme
gmatis）からのＭｓｐＡの温度依存性抽出。

【図２】ゲル電気泳動により示した場合のミコバクテリウム・スメグマティス（M. sme
gmatis）からのＭｓｐＡの精製。

【図３】ゲル電気泳動により示した場合の大腸菌からのＭｓｐＡの精製。

【図４】プラスミドベクターｐＭＮ501の構築。

【図５】モノマーＭｓｐＡを再生するための装置を示す略図である。

【図６】ゲル電気泳動により示した場合の再生ＭｓｐＡ。

【図７ａ】電子顕微鏡により示した場合のチャンネル形成性タンパク質ＭｓｐＡの修飾。

【図７ｂ】電子顕微鏡により示した場合のチャンネル形成性タンパク質ＭｓｐＡの修飾。

【図７ｃ】電子顕微鏡により示した場合のチャンネル形成性タンパク質ＭｓｐＡの修飾。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA03 CA02 EA04 GA25 HA01 4B064 AG01 CA02 CC24 CE07 CE11 CE15 DA16 4H045 AA10 AA20 CA11 EA34 EA45 FA74 GA05 GA10 GA22 GA23 GA30

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グラム陽性細菌に見出されるチャンネル形成性タンパク質の
製造方法であって、チャンネル形成性タンパク質が以下の：ａ）異種過剰発現、またはｂ）ミコバクテリアからの精製により得られ、抽出温度が50℃より高い方法。
【請求項２】グラム陽性細菌が少なくとも１つのミコール酸を含有するも
のである請求項１記載の方法。
【請求項３】細菌がミコバクテリア、好ましくはミコバクテリウム・スメ
グマティス（Mycobacterium smegmatis）である請求項１〜２のいずれかに記載
の方法。
【請求項４】チャンネル形成性タンパク質がポーリンである請求項１〜３
のいずれかに記載の方法。
【請求項５】ポーリンが有機溶媒に対して本質的に化学的に安定である請
求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】ポーリンが80℃、好ましくは100℃までの温度に本質的に熱
安定性である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】ポーリンがポーリンＭｓｐＡ、ＭｓｐＣ、ＭｓｐＤ、これら
のポーリンのうちの１つの断片、これらのポーリンのうちの１つからの相同タン
パク質またはこれらのポーリンのうちの１つの配列から得られるタンパク質であ
る請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】異種過剰発現が大腸菌またはミコバクテリアにおいて実現さ
れる請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】チャンネル形成性タンパク質、好ましくはポーリンをコード
する遺伝子が過剰発現のために用いられる請求項１〜８のいずれかに記載の方法
。
【請求項１０】配列１に記載のｍｓｐＡ遺伝子、配列６に記載のｍｓｐＣ
遺伝子または配列８に記載のｍｓｐＤ遺伝子が過剰発現のために用いられる請求
項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】配列番号１、６または８から得られる突然変異体遺伝子が
過剰発現のために用いられ、突然変異は本質的に、化学的および熱安定性、なら
びにチャンネル様構造がＭｓｐＡ、ＭｓｐＣまたはＭｓｐＤのものと本質的に対
応するようなものである請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】突然変異が本質的に、ｍｓｐＡ、ｍｓｐＣまたはｍｓｐＤ
遺伝子のコドン使用法が大腸菌における高発現遺伝子の使用法に適応されるもの
である請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】ｍｓｐＡ、ｍｓｐＣまたはｍｓｐＤ遺伝子が過剰発現のた
めに用いられ、突然変異が本質的に、Ｇ＋Ｃ含量が66％未満に低減されるもので
ある請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】配列４に記載のｓｙｎｍｓｐＡ遺伝子が過剰発現のために
用いられる請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】配列４に記載のｓｙｎｍｓｐＡ遺伝子を含有する大腸菌に
おける過剰発現のための適切なベクターが用いられる請求項１〜１４のいずれか
に記載の方法。
【請求項１６】非イオン性または双性イオン性洗剤を用いてグラム陽性細
菌からの細胞壁からチャンネル形成性タンパク質が製造される請求項１〜１５の
いずれかに記載の方法。
【請求項１７】用いられる洗剤が以下に列挙したもの：イソトリデシルポ
リ(エチレングリコールエーテル)_n、アルキルグルコシド、特にオクチルグルコ
シド、アルキルマルトシド、特にドデシルマルトシド、アルキルチオグルコシド
、特にオクチルチオグルコシド、オクチル−ポリエチレンオキシドおよびラウリ
ルジメチルアミノキシドから得られる請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】抽出温度が80〜110℃、好ましくは90〜100℃である請求項
１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】抽出時間が5〜120分、特に25〜35分である請求項１〜１８
のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】 50 mMＮａＣｌまたはＮａ−リン酸塩より高いイオン強度
を有する緩衝液が用いられる請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】チャンネル形成性タンパク質が沈殿により、特にアセトン
を用いて精製される請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】チャンネル形成性タンパク質がイオン交換クロマトグラフ
ィーにより、特に陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製される請求項１〜
２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】チャンネル形成性タンパク質がサイズ排除クロマトグラフ
ィーを用いて精製される請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】局所濃度を上げることによる異種過剰発現により産生され
るチャンネル形成性タンパク質が再生される請求項１〜２３のいずれかに記載の
方法。
【請求項２５】局所濃度の上昇が、電気泳動的濃厚化により、特にＤＣ電
流により、沈降により、または適切な表面での、特に膜での吸着により実現され
る請求項２４記載の方法。
【請求項２６】請求項１〜２５のいずれかに記載の方法により産生される
グラム陽性細菌からのチャンネル形成性タンパク質。
【請求項２７】チャンネル形成性タンパク質が有機溶媒に対して本質的に
化学的に安定であるポーリンであるグラム陽性細菌からのチャンネル形成性タン
パク質。
【請求項２８】チャンネル形成性タンパク質が80℃までの温度で本質的に
安定であるポーリンであるグラム陽性細菌からのチャンネル形成性タンパク質。
【請求項２９】チャンネル形成性タンパク質が100℃までの温度で本質的
に安定であるポーリンである請求項２８記載のチャンネル形成性タンパク質。
【請求項３０】チャンネル形成性タンパク質がポーリンＭｓｐＡ、Ｍｓｐ
Ｃ、ＭｓｐＤ、これらのポーリンのうちの１つの断片、これらのポーリンまたは
それらの断片と相同なタンパク質、あるいはこれらのポーリンから得られるタン
パク質であるグラム陽性細菌からのチャンネル形成性タンパク質。
【請求項３１】化学的および熱安定性、ならびに推定タンパク質のチャン
ネル様構造が本質的にタンパク質ＭｓｐＡ、ＭｓｐＣまたはＭｓｐＤのものであ
る請求項３０記載のチャンネル形成性タンパク質。
【請求項３２】請求項２６〜３１のいずれかに記載のチャンネル形成性タ
ンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３３】遺伝子が配列１に記載のｍｓｐＡ遺伝子である請求項３２
記載の遺伝子。
【請求項３４】遺伝子が配列６に記載のｍｓｐＣ遺伝子である請求項３２
記載の遺伝子。
【請求項３５】遺伝子が配列８に記載のｍｓｐＤ遺伝子である請求項３２
記載の遺伝子。
【請求項３６】突然変異が本質的に、ｍｓｐＡ、ｍｓｐＣまたはｍｓｐＤ
遺伝子のコドン使用法が大腸菌中の高発現遺伝子のものに適応されるようなもの
である突然変異化ｍｓｐＡ、ｍｓｐＣまたはｍｓｐＤ遺伝子。
【請求項３７】特に請求項３６に記載の突然変異化ｍｓｐＡ遺伝子、ｍｓ
ｐＣ遺伝子またはｍｓｐＤ遺伝子であって、突然変異が本質的に66％未満へのＧ
＋Ｃ含量低減から成る遺伝子。
【請求項３８】配列１、６または８のうちの1つから得られる特に請求項
３６または３７記載の突然変異化ｍｓｐＡ、ｍｓｐＣまたはｍｓｐＤ遺伝子であ
って、突然変異が、タンパク質の化学的および熱安定性、ならびにチャンネル様
構造が全ての実際目的に関してＭｓｐＡ、ＭｓｐＣまたはＭｓｐＤのものである
ような遺伝子。
【請求項３９】突然変異化遺伝子が配列４によるｓｙｎｍｓｐＡ遺伝子で
ある請求項３６〜３８記載の突然変異化ｍｓｐＡ遺伝子。
【請求項４０】プラスミドベクターｐＭＮ５０１。
【請求項４１】大腸菌がプラスミドベクターｐＭＮ５０１を含有する過剰
発現系。