JP2002537781A

JP2002537781A - 固定化捕捉プローブを有する生化学的精製装置およびその使用

Info

Publication number: JP2002537781A
Application number: JP2000601418A
Authority: JP
Inventors: アダムス，クリストファー，ピー．; ボールズ，ティー．，クリスチャン; ウェア，ローレンス; ダーンダ，ラウル，ケイ．; クロン，ステファン，ジェイ．
Original assignee: モザイクテクノロジーズ
Priority date: 1999-02-26
Filing date: 2000-02-25
Publication date: 2002-11-12
Also published as: WO2000050870A1; DK1157264T3; CA2369083A1; DE60010058T2; ES2221841T3; EP1157264B1; ATE265040T1; AU772213C; DE60010058D1; US20060088867A1; AU3706300A; WO2000050870A9; US20020119480A1; EP1157264A1; AU772213B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、被検試料内に含まれる標的分子を精製および／または濃縮するために使用される、少なくとも１つの精製ユニットを含有する装置に関する。典型的には、標的分子は、被検試料であり、核酸である。これらの精製された核酸は、ヌクレオチド配列分析に供することを含む種々の方法に使用できる。装置の使用方法および装置を含むキットもまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願本出願は１９９９年２月２６日出願のＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒＰ．Ａｄａｍ
ｓ、Ｔ．ＣｈｒｉｓｔｉａｎＢｏｌｅｓ、ＬａｗｒｅｎｃｅＷｅｉｒ、Ｒａ
ｈｕｌＫ．ＤｈａｎｄａおよびＮｅｖｉｎＳｕｍｍｅｒｓによる、標題「固
定捕捉ブローブを含んでなる装置」の米国仮出願番号６０／１２１８３６の利益
を請求し、その教示は全て出展明示により本明細書の一部とする。

【０００２】背景技術分子生物学研究および適用において、例えばＤＮＡシークエンシングにおいて
しばしばＤＮＡを高度に精製する必要がでてくる。ＤＮＡシークエンシングのた
めの現在のプロトコルでは自動分析する前にＤＮＡの実質的な精製が必要である
。典型的には、複製ベクター、例えばＭ１３ファージベクター系、並びにＤＮＡ
ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド、プライマー、塩およびその他の複製成分
を用いる複製プロトコルにＤＮＡを供する。この複製工程中に形成される伸長産
物は、伸長産物そのもののみを含有する比較的精製された調製物を得るためにさ
らに処理する必要がある。ＤＮＡ伸長産物を精製するのにしばしば用いられる方
法論はエタノール沈殿である。エタノール沈殿は伸長産物を含有する調製物から
組み込まれていないヌクレオチドおよび塩を除去するのに比較的有効である。伸
長産物に関して配列分析を実施する前に調製物から任意の鋳型ＤＮＡおよび過剰
なプライマーを除去するのも望ましい。しかしながら、沈殿には時間がかかり、
確実な産物収量を得るためには非常に注意を払う必要がある。

【０００３】関与する時間因子を最小にし、高度に再現性のある結果を保証できる基盤を提
供しうる装置が必要とされる。加えて、マルチプレックス調製（ｍｕｌｔｉｐｌ
ｅｘｅｄｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）シークエンシング反応の産物を分類できる
精製装置を有するのは有利であろう。加えて、マルチプレックス調製シークエン
シング反応の産物を分類できる精製装置を有するのは有利であろう。

【０００４】発明の要旨本発明は被検試料中に含まれる標的分子を精製および／または濃縮するために
用いる、少なくとも一つの精製ユニットを含む装置に関する。典型的には、被検
試料中の標的分子は核酸である。これらの精製された核酸を、ヌクレオチド配列
分析に供するなどの種々の方法に用いることができる。該装置および該装置を含
有するキットを用いる方法もまた提供される。

【０００５】本発明の精製装置は少なくとも一つの精製ユニットを含む。あるいは、該装置
は複数の精製ユニットを含むことができ、例えばマルチユニット装置でありうる
。各々の精製ユニットは標的分子を含んでなる被検試料を受け取る領域、並びに
標的分子が被検試料に存在する場合、これを精製および／または濃縮するための
第２の領域を含む。典型的には、各精製ユニットは三つの構成部分を含み、これ
らは独立あるいは半独立した精製ユニットの領域でもよい。該領域はチャンバー
とも称することができる。典型的には、被検試料を第１領域から第２領域へ、次
いで第３領域へ移動させる。第１領域は標的分子を標的ではない成分、例えば夾
雑タンパク質またはバッファー塩と共に含む被検試料を受け取る。第１領域を収
容部（receptacle）とも称する。被検試料を収容部へ導入する。第２領域を用い
て被検試料に含まれるその他の夾雑分子から標的分子を精製し、および／または
濃縮する。具体的には、この分離領域は、電気泳動媒体内に一つまたはそれ以上
の種またはクラスの固定化捕捉プローブを有する電気泳動マトリックス、例えば
ポリアクリルアミドゲルを含む。該固定化捕捉プローブは標的分子を特異的にハ
イブリダイズする。従って、標的分子は装置の分離領域でマトリックス内に保持
されるが、標的でない、例えばサンプルの夾雑成分は、分離領域を通過する。第
３領域を含む精製ユニットを有する装置では、電気泳動媒体が、装置の第２領域
を通過するいずれかのまたは全ての分子を含有するために用いられる第３領域か
ら収容部を分離する。この第３領域を収集チャンバーと称する。

【０００６】別の態様では、精製装置が複数の精製ユニットを含むことができる。好ましい
態様では、装置がマイクロタイタープレートであり、各精製ユニットがマイクロ
タイターウェルである。

【０００７】精製装置はまた収容部、電気泳動媒体および収集チャンバーを含む精製前ユニ
ットを含むこともできる。電気泳動媒体は収容部を収集チャンバーから分離する
。

【０００８】態様においては、収集チャンバーが出口を含む。好ましい態様では、出口は半
透膜を含む。

【０００９】１個の精製ユニットを含む装置は複数の同一な、または同一に近い、捕捉プロ
ーブを含むことができる。１個の精製ユニットを含む装置は複数の異なる捕捉プ
ローブを含むこともできる。該装置はまた、複数の捕捉ブローブを含むこともで
き、それらは同一かまたは同一に近い部分もあり、異なっている部分もある。

【００１０】複数の精製ユニットを含む装置は複数の同一な、または同一に近い捕捉プロー
ブを含むことができる。複数の精製ユニットを含む装置はまた複数の異なる捕捉
プローブを含むこともできる。該装置はまた複数の捕捉プローブを含むこともで
き、それらは同一に近い部分もあり、異なっている部分もある。

【００１１】別の局面では、本発明は標的核酸分子を含有する被検試料を収容部および標的
核酸分子にハイブリダイズするように選択した少なくとも一つの固定化捕捉プロ
ーブを含む電気泳動媒体を含む精製装置のユニットの収容部に導入し；被検試料
中の標的分子が捕捉プローブにハイブリダイズし、それにより標的分子／捕捉プ
ローブ複合体を形成するのに、かつ被検試料の残りの成分が媒体を通って移動し
て媒体から溶出するのに適した条件下で、被検試料が媒体を通って移動すること
をもたらす電場に電気泳動媒体を供し；および収集チャンバー中に被検試料の残
りを収集する方法に関する。

【００１２】一つの態様では、該方法はさらに電気泳動用媒体を処理して標的分子を放出す
る工程を含む。好ましい態様では、電気泳動用媒体の温度を標的分子／捕捉プロ
ーブ複合体を変成するのに十分な温度まで上昇させるか、電気泳動用媒体内の捕
捉プローブを固定化する化学結合を開裂するか、または電気泳動電場強度を標的
分子／捕捉プローブ複合体を破壊するのに十分なレベルまで上昇させることによ
り、標的分子を電気泳動用媒体から放出できる。一つの態様では、標的分子を収
容部内に放出する。

【００１３】一つの態様では、該方法で用いる装置はさらに、電気泳動用媒体により収容部
から分離されている収集チャンバーを含む。

【００１４】さらなる態様では、該方法はさらに標的分子を増幅する工程を含む。

【００１５】別の態様では、該方法により結果的に標的分子の濃度が上昇しうる。

【００１６】また別の態様では、該方法を複数の精製ユニットを含む精製装置と共に用いる
ことができる。好ましい態様では、複数の標的分子を同時に精製し、例えば、該
方法はマルチプレックス法である。

【００１７】好ましい態様では、標的核酸分子の精製および濃縮を単一の処理工程において
行うことができる。

【００１８】別の態様では、該方法はまた、精製前工程をも含むことができる。さらに別の
態様では、被検試料を精製ユニットの収集チャンバーから得ることができる。

【００１９】別の局面では、本発明は標的核酸を精製する方法のための最適条件を開発する
方法に関する。態様において、標的核酸は疾患の検出において情報を与えてくれ
ることが知られている変異核酸である。態様では、最適化するのに必要な条件は
標的核酸の捕捉および標的核酸の溶出に影響する条件である。

【００２０】別の局面では、本発明は、少なくとも一つの精製ユニットを含む、被検試料か
ら標的核酸を精製するための装置を含む、核酸配列決定に適用するための被検試
料中の標的核酸を調製するためのキットであって、その精製ユニットが収容部お
よび標的核酸をハイブリダイズするために選択した少なくとも一つの固定化捕捉
プローブを含む電気泳動用媒体を含むキットに関する。

【００２１】一つの態様では、該キットの装置はさらに、電気泳動用媒体により収容部から
分離されている収集チャンバーを含む精製ユニットを含む。

【００２２】また別の態様では、該キットは複数の精製ユニットを含む装置を含むことがで
きる。

【００２３】一つの態様では、該キットはさらに、収容部、電気泳動用媒体および収集チャ
ンバーを含む精製前ユニットを含むことができ、ここで電気泳動用媒体は収容部
を収集チャンバーから分離している。

【００２４】一つの態様では、該標的核酸は、ヒト疾患の検出に有用な変異核酸である。好
ましい態様では、ヒト疾患は癌である。

【００２５】本発明の装置により、分子の複合混合物から核酸を迅速で高度に再現性のある
精製が可能になる。

【００２６】発明の詳細な説明本発明は、被検試料中に含まれる標的分子を精製および／または濃縮するため
に用いられる、少なくとも一つの精製ユニットを含む装置に関する。「標的分子
」およびその複数形「（複数の）標的分子」なる用語は、本出願を通じて本質的
に互換的に用いられ、本発明の装置および方法を用いてさらに精製または濃縮で
きる任意の荷電分子を含むことを意図している。

【００２７】好ましくは、標的分子は核酸である。「核酸」なる用語は、デオキシリボ核酸
（以後「ＤＮＡ」）またはリボ核酸（以後「ＲＮＡ」）を含むことを意図してい
る。かかる核酸には、例えばＤＮＡ配列決定法により生じるＤＮＡポリメラーゼ
伸長産物などがある。これらの産物は長さが異なり得、しばしばＤＮＡ配列決定
法の前にさらに精製する必要としうる。精製した標的核酸を、さらなる分析、例
えばヌクレオチド配列分析に供するなどの種々の方法に用いることができる。

【００２８】該標的核酸は、種々の成分を含む被検試料中に含まれ得る。さらに被検試料は
種々の供給源に由来してよい。例えば、被検試料は植物または動物の器官、組織
または細胞のいずれかに由来してよい。被検試料は細胞、組織または器官の培養
系に由来してよい。被検試料はｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーに由来してよ
い。被検試料に用いられるＤＮＡを身体サンプルに見出される有機体、例えば血
液、尿、脳脊髄液、組織材料等から種々の技術、例えばＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ
、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、２８０〜２８１頁（１９
８２）に記載されるような技術により抽出できる。被検試料はまた半精製されて
いてもよく、例えば組織標本からの上澄調製物を被検試料として用いることがで
きる。

【００２９】本発明は被検試料中に含まれる標的分子を精製および濃縮するのに有用な精製
装置を提供する。本発明の装置は独立あるいは半独立した領域を含む、少なくと
も一つの精製ユニットを含む。典型的には、各精製ユニットは本明細書にてチャ
ンバーまたはコンポーネントとも称する少なくとも三つの領域を含む。

【００３０】第１領域は収容部（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）を含む。「収容部」なる用語は、
サンプルを受け取ることができる精製ユニットの領域を含むことを意図している
。

【００３１】第２領域は電気泳動用媒体を含む。「電気泳動用媒体」または「電気泳動媒体
」なる用語は専門用語（ｔｅｔｍｏｆａｒｔ）であり、被検試料中の標的核
酸を精製および／または濃縮するのに適している全ての公知の媒体を含むことを
意図している。該装置の電気泳動用媒体は媒体、例えばＢｏｌｅｓらに付与され
た米国特許第５，９３２，７１１号（その教示は全てそのまま出展明示により本
明細書の一部とする）に記載される電気泳動媒体内で固定されているオリゴヌク
レオチド捕捉プローブを有する、例えばポリアクリルアミドゲルでよい。被検試
料中に含まれる標的分子と特異的に相互作用し、ハイブリダイズするように捕捉
プローブを設計できる。「捕捉プローブ」およびその複数形「（複数の）捕捉プ
ローブ」なる用語は、標的分子、例えば標的核酸分子とハイブリダイズできるプ
ローブを含むことを意図している。

【００３２】第３領域は収集チャンバーを含む。「収集チャンバー」なる用語は、電気泳動
媒体を通って移動した後の被検試料が含まれる領域を含むことを意図している。
このチャンバーは物理的に第２領域と隣接できるか、または第２領域と近位にあ
ることにより第２領域と接続（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）できる。第３領域は第２領
域から分離可能であり、収集チャンバーを空にするか、または充填することがで
き、バッファーを交換することができる。

【００３３】収容部および収集チャンバーは、それらの間でバリアーを形成する電気泳動用
媒体により互いに物理的に分離されている。

【００３４】本発明の精製装置を多くの素材から形成できる。好ましい素材は生物学的分子
、例えばＤＮＡおよびＲＮＡに最も適合する素材である。プラスチック、ステン
レススチール、真ちゅう、セラミック、ガラス、シリカまたはこれらの素材の種
々組み合わせのような素材を用いて精製装置を形成できる。精製装置の実際の幾
何学的な外形はその操作には重大ではなく、特定の形状が特定の適用を有利にで
きる。例えば、ある適用では精製ユニットの環境が装置の種々構成成分を含む領
域において異なるのが好ましいこともある。

【００３５】好ましくは、精製装置を電源と接触して設置し、電圧勾配を確立させて第２領
域に含まれる電気泳動用媒体を通る分子の移動を促進できるようにする。精製の
ための電源を分離して実際の精製装置から隔離でき、または精製装置の設計に組
み込むことができる。装置の重要な特徴は動力源により作られた電圧勾配に結合
、または提供することができる精製装置を有することである。動力源からの電極
または電極のための収容部を精製装置の特徴に組み込むことができる。

【００３６】被検試料を収容部に置くことにより、被検試料を該精製装置に導入することが
できる。標的分子およびその他のサンプル成分が分離電気泳動用媒体を通って移
動できるのに十分な電場、例えば０．１から約１００ないし２００ボルト／ｃｍ
を適用して収容部の荷電分子を電気泳動媒体を通って適当な極に移動させること
ができる。典型的には、標的核酸分子は陰性電荷を有し、従ってアノードへ向か
って移動する。標的分子はその特定の標的分子に特異的な固定化捕捉プローブ、
例えばそれがハイブリダイズする捕捉プローブに接触するまで、媒体を通って移
動し続けることができる。固定化捕捉プローブと標的分子との間でハイブリダイ
ゼーション複合体を形成できる。好ましい捕捉プローブは、電気泳動ゲル、例え
ばポリアクリルアミドゲル内で共重合できる５’アクリルアミド基で修飾したオ
リゴヌクレオチドである。標的分子と捕捉プローブ内に含まれる相補的配列間に
実質的な相補性がある場合、この２分子は結合できる。

【００３７】「実質的な相補性」なる用語は、対応する標的分子にハイブリダイズできる捕
捉プローブの核酸配列を含むことを意図している。かかる配列が標的分子の正確
な核酸配列を反映する必要はない。かかる配列は、特定の条件下で標的分子とハ
イブリダイズする配列の同一性において十分に類似しなければならない。例えば
、配列がそれにハイブリダイズするのに十分な相補性塩基を有する場合、非相補
性塩基、またはさらなるヌクレオチドを配列内に散在させることができる。当業
者はハイブリダイゼーションの特異的条件を経験的に決定できる。

【００３８】例えばストリンジェンシー条件は、非特異的ハイブリダイゼーション反応を有
意に低減するよう選択すべきである。核酸ハイブリダイゼーションのストリンジ
ェンシー条件は、種々参考文献、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ
ｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第
１巻：（補２６）（１９９１）にて説明されており、その教示は参考として本明
細書の一部とする。因子、例えばプローブの長さ、塩基組成、ハイブリダイズす
る配列間のミスマッチパーセント、温度およびイオン強度などは核酸ハイブリッ
ドの安定性に影響する。ストリンジェンシー条件、例えば低度、中程度または高
度なストリンジェンシーを経験的に決定でき、捕捉プローブおよび被検試料中の
標的分子の特徴に一部依存する。

【００３９】ハイブリダイゼーション複合体は標的分子が電気泳動媒体を通ってさらに移動
するのを防御するが、非標的分子の持続的な移動に影響せず、それにより被検試
料中に含まれる標的分子の精製を実現する。非標的分子には、例えばタンパク質
、ペプチド、糖、塩および核酸などが含まれる。

【００４０】被検試料に含まれる非標的分子は電気泳動用媒体を通過し続けることができ、
効果的に標的分子から分離される。サンプル中に含まれる非標的分子はゲルを通
過し、装置の収集チャンバーに含まれる電気泳動バッファーに入る。次いで、収
集チャンバー中のバッファーを新鮮な電気泳動バッファーと交換できる。続いて
標的分子を、引き続き分析するために、捕捉プローブおよび電気泳動用媒体から
溶出できる。

【００４１】「溶出」なる用語は、ハイブリッドの溶解および溶出方向への標的の移動を含
むことを意図する。プローブからの標的の溶解または解離は、バッファー条件を
変化させることにより、例えばｐＨ上昇またはホルムアミドのごとき溶媒の添加
により、または高電圧を適用することにより装置に高温を適用することにより達
成できる。

【００４２】例えば、十分な電圧を適用して標的分子と捕捉プローブとの間で形成されたハ
イブリダイゼーション複合体を変性させ、標的分子を放出することができる。元
来適用されていたのと同一の極性を電場に適用でき、それにより放出した標的分
子が新鮮電気泳動バッファーが含まれる収集チャンバーに移動し続けることがで
きる。また別に、電場を逆にしてサンプルをマイクロタイタープレートのサンプ
ルウェルに引き戻すことができる。今度は精製標的分子を近づけ、さらなる分析
、例えば核酸配列分析に供することができる。また別に、標的分子を増幅反応、
例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーション連鎖反応、核酸配列に
基づく増幅またはその他の同等の方法に導入できる。

【００４３】一つの態様では、装置は単一の精製ユニットを含み、マイクロチューブ、また
はディスポーザブルピペットチップ、例えばギルソンまたはエッペンドルフ型チ
ップの形態である。別の態様では、装置は複数の精製ユニットを含み、マイクロ
タイタープレートの形態である。マイクロタイタープレートは複数のウェル、例
えば９６ウェルを含み、その各々は独立した精製ユニットを形成する。この態様
は複数のサンプルの精製を促進する。装置が９６ウェルマイクロタイタープレー
トを含む場合、９６に分かれた被検試料を導入、例えば装置に負荷できる。９６
以外のウェルを含むマイクロタイタープレートもまた本発明の範囲内である。マ
イクロタイタープレートのウェルは三つの領域を含むことができる。ウェルの第
１領域はサンプルを受け取るための収容部を含む。収容部は約５．０μｌから約
１０００．０μｌまでの容量を収容できるのが好ましいが、より大きなサンプル
を用いることができる。ウェルの上部表面と電気泳動用媒体により形成された表
面境界との間に収容部を配置する。電気泳動用媒体は媒体内に固定化した少なく
とも一つの種類の捕捉プローブ、例えば一つのオリゴヌクレオチド配列を含んで
なる。あるいは、複数の種類の捕捉プローブ、例えば複数のオリゴヌクレオチド
配列を媒体内に固定化できる（例えば、１９９７年８月８日出願のＢｏｌｅｓら
の「固定化プローブを用いる分子の電気泳動分析」ＵＳＳＮ０８／９７１，８４
５（この全内容は参考として本明細書に引用される）を参照のこと）。好ましい
態様では、プローブを電気泳動用ゲル媒体に共有結合させる。第２領域は収容部
の底部表面から収集チャンバーの上部表面までの間に配置し、そのとき第１領域
に隣接する。

【００４４】さらなる態様では、前精製ユニットを本発明の精製ユニットと連結させて用い
ることができる。精製前ユニットの電気泳動用媒体は固定化プローブを含まない
が、むしろユニットが被検試料の最初の非特異的分離を提供するように意図され
ており、被検試料は結果的に部分的に精製されたサンプルになる。被検試料を、
好ましくは電気泳動バッファー中、前精製ユニットの収容部に配置する。電圧勾
配の存在下、サンプルは電気泳動用媒体、例えばゲル負荷領域を急速に移動する
。この分離領域は、ほとんどの分子が同一の電荷を保持するサンプル中で、主に
大きさに基づいて成分を移動させる。典型的には、サンプルをアノードに向かっ
て引き、小型の分子は最も速く分離領域を移動する傾向がある。このように、伸
長産物は、電気泳動用媒体に保持される鋳型よりも速く通過して収集チャンバー
に入る。

【００４５】次いで、前精製ユニットからの収集チャンバーの内容物を、本発明の装置の精
製ユニット中でさらに精製できる。部分的に精製されたサンプルを通常部分的に
精製されたサンプルを収容部に沈殿させることにより、第２領域の上部表面と接
触させて配置する。第３の領域は第２の領域と近接しうる。マイクロタイターウ
ェルのチップを切除するかまたは別の同等の有効な方法により除去できる。ウェ
ルの基底部チップを除去して作った口を半透膜を用いて被覆できる。半透膜は夾
雑サンプル成分に膜を通過させるのに適した分子量カットオフを有しうる。

【００４６】マイクロタイタープレートを動力源と連結してマイクロタイタープレートに含
まれるウェルに電場を適用できる。電場はウェルに関していずれかのジオメトリ
ーを有しうる。好ましくは、電場を適用する場合、電場はウェルの縦軸に沿って
存在し、収容部の荷電分子を第２領域内に含まれる電気泳動媒体を通って縦方向
に移動させうる。一旦サンプルを負荷すると、電場が精製装置に適用され、荷電
分子が電場の影響下移動する。

【００４７】いずれかの電気泳動媒体、すなわち電気泳動に適したマトリックスを本発明の
装置に用いることができる。適当なマトリックスにはアクリルアミドおよびアガ
ロースなどがあり、共に核酸電気泳動に一般的に用いられる。しかしながら、そ
の他の素材を同様に用いてもよい。実例を挙げると、化学的修飾アクリルアミド
、デンプン、デキストランおよびセルロースベースの重合体などがある。さらな
る例としては、修飾アクリルアミドおよびアクリル酸エステル（ポリサイエンシ
ズ・インコーポレーティッド、ポリマー＆モノマーカタログ、１９９６〜１９９
７、ワーリントン、ＰＡを参照のこと）、デンプン（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｊ．，７１：５８５（１９５９）、および製品番号Ｓ５６５１、シグ
マ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ＭＯを参照のこと）、デキストラン
（ポリサイエンシズ・インコーポレーティッド、ポリマー＆モノマーカタログ、
１９９６〜１９９７、ワーリントン、ＰＡを参照のこと）、およびセルロースベ
ースの重合体（Ｑｕｅｓａｄａ、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎ．ＩｎＢｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：８２〜９３（１９９７）を参照のこと）などがある。記
載されたいずれかの重合体を化学的に修飾して捕捉プローブが本発明で使用され
る電気泳動用媒体に特異的に結合するようにできる。とりわけ好ましいマトリッ
クスはアクリルアミドである。

【００４８】種々の捕捉プローブを本発明の装置に用いることができる。典型的には、本発
明の捕捉プローブは標的分子に含まれるヌクレオチド配列の領域に実質的に相補
的なヌクレオチド配列を有する核酸を含んでなり、その結果標的分子は捕捉プロ
ーブにハイブリダイズできる。核酸捕捉プローブの相補性は標的分子を特異的に
結合するのに、従って被検試料中の標的分子の精製を実行するのに十分である必
要があるだけである。本発明の使用に適したプローブには核酸、例えばＲＮＡ、
ＤＮＡ、核酸アナログ、修飾核酸および核酸を別の有機成分、例えばペプチド核
酸と共に含んでなる混合されたクラスのキメラプローブから形成されたものが含
まれる。捕捉ブローブは一本鎖または二本鎖核酸でありうる。好ましくは、捕捉
プローブの長さは少なくとも５ヌクレオチド、より好ましくは５から５０ヌクレ
オチドの長さであるが、長さは数千ヌクレオチドまででありうる。

【００４９】本発明のプローブに有用な核酸には、当該分野で周知の方法により得られる核
酸などがある。これらの核酸には実質的に純粋な核酸、化学合成により、並びに
生物学的および化学的方法の組み合わせにより製造された核酸、および組換え核
酸などがある。ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を用いることができる。

【００５０】「核酸アナログ」なる用語は、修飾された糖基、リン酸塩基または修飾された
塩基を含有する核酸を含むことを意図している。修飾された塩基を有する核酸の
例としては、例えばアセチル化塩基、カルボキシル化塩基、またはメチル化塩基
、例えば４−アセチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、
１−メチルイノシン、ノルバリン、またはアロイソロイシンなどがある。かかる
核酸アナログは当業者に周知である。有用な核酸アナログの一例は標準ＤＮＡ塩
基がＮ−（２−アミノエチル）グリシンユニットの反復からなる修飾ペプチドバ
ックボーンに結合しているペプチド核酸（ＰＮＡ）である（Ｎｉｅｌｓｅｎら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００（１９９１））。ペプチドバック
ボーンは標準ＤＮＡおよびＲＮＡ一本鎖と塩基対形成するのに適当な距離で塩基
を保持することができる。ＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッド二重鎖は相当するＤＮＡ
−ＤＮＡ二重鎖よりも大いに強力であり、恐らくＰＮＡ鎖に負に荷電したホスホ
ジエステル結合がないという事実に依るのであろう。加えて、通常と異なる構造
のためにＰＮＡはヌクレアーゼ分解に対して非常に抵抗性がある。これらの理由
から、ＰＮＡ核酸アナログは固定化プローブアッセイに有用である。類似の設計
ストラテジーを用いて、固定プローブアッセイに有用な特性を有するその他の核
酸アナログを構築できることは当業者には明らかであろう。

【００５１】修飾オリゴヌクレオチドを含有するプローブもまた有用である。例えば、デア
ザグアニンおよびウラシル塩基を含有するオリゴヌクレオチドをグアニンおよび
チミン含有オリゴヌクレオチドの代わりに用いて、ハイブリダイズしたプローブ
の熱安定性を低減することができる。同様に、熱安定性を増したハイブリッドが
望ましい場合、５−メチルシトシンをシトシンに代用することができる（Ｗｅｔ
ｍｕｒ、ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２６：２２７〜２５９（１９
９１））。リボース糖基の修飾、例えば２’−Ｏ−メチル基の添加により固定Ｒ
ＮＡプローブのヌクレアーゼ感受性を低減させることができる（Ｗａｇｎｅｒ、
Ｎａｔｕｒｅ，３７２：３３３〜３３５（１９９４））。ホスホジエステル骨格
から負電荷を除去する修飾によりハイブリッドの熱安定性を増強させることがで
きる（Ｍｏｏｄｙら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１７：４７６９
〜４７８２（１９８９）；Ｉｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１
４７１２〜１４７１７（１９９５））。

【００５２】核酸を結合して固定化プローブを含有する電気泳動用媒体を形成する方法は当
業者に周知である。臭化シアノまたは塩化シアヌール活性化を用いて、核酸、修
飾された核酸および核酸アナログをアガロース、デキストラン、セルロース、お
よびデンプン重合体に結合できる。カルボイミドカップリングを用いてカルボキ
シル基を含有する重合体を、１級アミン基を有する合成捕捉プローブに結合でき
る。グルタルアルデヒドまたは塩化シアヌールを用いて１級アミンを担持する重
合体をアミン含有プローブに結合できる。多くの重合体をチオール含有合成プロ
ーブに結合できるチオール反応性基で修飾することができる。多くのその他の適
当な方法を文献に見出すことができる（検討される場合、Ｗｏｎｇ、Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙｏｆＰｒｏｔｅｉｎＣｏｎｊｕｇａｔｉｏｎａｎｄＣｒｏｓ
ｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ、シー・アール・シー・プレス、ボッカラートン、フロリダ
州（１９９３）を参照されたい）。

【００５３】捕捉プローブを重合可能な化学基に共有結合させる方法もまた開発されている
。適当な重合可能な単量体化合物の混合物と共重合させる場合、高濃度の固定核
酸を含有するマトリックスを製造できる。核酸を重合可能な化学基に共有結合さ
せるための好ましい方法の実例はＢｏｌｅｓら、「核酸含有重合可能複合体」と
標題のついた米国特許第５，９３２，７１１号、およびＲｅｈｍａｎら、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，２７：６４９〜６５５（１９９９）に見出され
、その教示は参考として本明細書に引用する。

【００５４】装置のある態様では、二つまたはそれ以上のマトリックス形成物質の混合物を
含有する混成マトリックス、例えば混成アクリルアミド・アガロースゲルが有用
でありうる。これらのゲルは典型的には約２〜５％アクリルアミドおよび０．５
〜１％アガロースを含有する。これらのゲルでは、アクリルアミドが主要なふる
い分け機能を提供するが、アガロースがなければ、かかる低濃度アクリルアミド
ゲルは取扱いに都合のよい十分な機械的強度を欠く。アガロースの添加によりア
クリルアミドのふるい分け特性を有意に変化させることなく機械的支持を提供す
る。これらの態様では、ゲルのふるい分け機能を付与する成分が溶液相の核酸標
的と最も密接に接触するので、核酸をその成分に結合することができる。また別
に、ゲルマトリックスが結合する強化物質または支持体を提供することができる
（例えば２０００年１月１９日出願のＪｏｎｅｓら、標題「薄層ゲル支持体を用
いる核酸検出方法およびそのための装置」のＵＳＳＮ６０／１７６，８３９を参
照のこと（その教示を参考として本明細書に引用する））。

【００５５】核酸を、それ自体電気泳動用媒体に組み込むことができる粒子に結合すること
ができる。粒子は本質的に肉眼的、顕微鏡的またはコロイド性でありうる（ポリ
サイエンシズ・インコーポレーティッド、ポリマー＆モノマーカタログ、１９９
６〜１９９７、ワーリントン、ＰＡを参照のこと）。Ｃａｎｔｏｒら、米国特許
第５，４８２，８６３号では粒子の懸濁液を含有する電気泳動ゲルを鋳造する方
法について記載している。前記に類似の方法を用いて粒子を核酸に結合し、ゲル
形成化合物と混合し、望ましいマトリックス形態に懸濁液として成形する。

【００５６】図面の検討により本発明の装置および方法の理解が容易になる。ここで図１に
言及すると、本発明の装置の使用方法を説明する。工程１はＤＮＡ標的分子１５
をＤＮＡ鋳型、塩、単量体およびバッファーと共に含んでなる被検試料１０をマ
イクロタイターウェル１００の第１領域１１０に配置する。被検試料を、少なく
とも一つの捕捉プローブ２０を含んでなる第２領域１２０に位置する電気泳動用
媒体と接触させる。工程２では、電場をマイクロタイターウェルの内容物に適用
し、負に荷電した分子を第２領域の電気泳動マトリックスを通って移動させるこ
とができる。ＤＮＡ標的１５は捕捉ブローブ２０により電気泳動マトリックス１
２０に捕捉される。工程３では、第１チャンバー１１０において電気泳動バッフ
ァーを新鮮なバッファーと（好ましくはＤＮＡ分析物サンプルよりも小容量で）
交換する。電流を適用して捕捉プローブおよびＤＮＡ標的により形成された複合
体を変性し、捕捉プローブからＤＮＡ分析物標的１５を放出する。逆の電場を適
用し、ＤＮＡ分析物を精製ユニットの第１領域のサンプル容量に溶出する。工程
４では、精製ユニットの第１領域からのＤＮＡ分析物の除去について説明する。
ＤＮＡ分析物をピペット２００またはその他の手段を用いて除去でき、次いでバ
ッファー中のＤＮＡ分析物サンプルをさらなる分析、例えばＤＮＡ配列決定に備
える。

【００５７】ここで図２に言及すると、配列決定のためのプライマー伸長産物を含んでなる
サンプルを調製する方法を説明する。工程１では、バッファー中でポリメラーゼ
連鎖反応を実施し、サンプル溶液中に伸長産物２２を提供する。サンプル溶液は
伸長産物を含有するのに加えて、ｄｄＮＴＰ２４、ポリメラーゼ酵素２６、塩お
よびその他の成分をも含有する。工程２では、サンプル溶液を、固定化捕捉プロ
ーブ１２０を含有する電気泳動用媒体の上の収容部１１０に配置する。電気泳動
用媒体の底部を収集チャンバー１３０に含まれる電気泳動バッファーと接触させ
る。収容部と収集チャンバー１３０との間で電場を確立する。ｄｄＮＴＰ２４、
ポリメラーゼ酵素２６および被検試料のその他の非標的成分を電気泳動バッファ
ー３０に通し、一方伸長産物２２は捕捉プローブとハイブリダイズして、ゲルマ
トリックス内に捕捉されるハイブリダイゼーション複合体２２２を形成する。電
気泳動バッファーを除去し、変性バッファーを収容部１１０および収集チャンバ
ー１３０の両方に配置する。工程３では、収集チャンバーはそのベース１３５の
口（orifice ）で半透膜１３２を有する。装置を変成条件に暴露し、ハイブリダ
イゼーション複合体２２２から伸長産物２２を放出し、それを収集チャンバー１
３０に入れる。半透膜は過剰のバッファーが除去されるまで伸長産物２２が下部
電極チャンバー１４０に入るのを妨げる。次いで伸長産物をＤＮＡ配列決定の自
動シークエンサーに負荷しうる。

【００５８】図では示していない配列決定用の精製ＤＮＡサンプルを提供するための別の態
様では、ゲル中の捕捉されたＤＮＡ配列を自動シークエンサーのキャピラリーに
直接導入し、前記の溶出および回収工程を排除する。例えば、ハイブリゲル溶液
（４０％アクリルアミド（２９：１アクリルアミド単量体：ビスアクリルアミ
ド）および１０ｘＴＢＥ（９０ｍＭトリスホウ酸ＥＤＴＡバッファー、ｐＨ８．
３；試薬はバイオラッド・ラボラトリーズ・インコーポレーティッド、ヘルクレ
ス、ＣＡより購入）を調製することによりアクリダイト（ａｃｒｙｄｉｔｅ）ビ
ーズを作ることができる。次いでアクリルアミドホスホラミダイト誘導体（モサ
イック・テクノロジーズ・インコーポレーティッド、ボストン、ＭＡから入手可
能なアクリダイト（商標）重合体）から形成した捕捉プローブを加える。１０％
過硫酸アンモニウムおよびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テラメチルエチレンジアミン（
ＴＥＭＥＤ；バイオラッド、ヘルクレス、ＣＡ）を添加することにより重合を開
始する。約１．０μｌから約１０．０μｌの小滴をオイルにピペッティングし、
重合させてビーズ形成を完了させる。望ましい捕捉プローブ配列を有するビーズ
をチップの、または類似の非干渉支持装置のマイクロタイタープレートのウェル
に配置できる。精製および濃縮するサンプルをビーズの上部表面に導入する。次
いでプラチナ電極および動力源を用いて、電気泳動バッファーの存在下で、ビー
ズを通して電圧勾配を確立する。サンプルをビーズ内に電気泳動し、捕捉プロー
ブ配列に相補的な配列を捕捉する。次いで小容量バッファー中のビーズをシーク
エンサーの電極に沈着させる。配列決定に用いる高電圧は標的／捕捉プローブハ
イブリダイゼーション複合体を変性するのに十分であり、ＤＮＡ配列はハイブリ
ゲルビーズを出て、液体を通ってキャピラリーに移動する。

【００５９】ここで図３Ａに言及すると、装置の態様を用いてマルチプレックス反応の産物
を精製する方法を説明する。マルチプレックス反応では、二本鎖オリゴヌクレオ
チドの両方の鎖をフォワードおよびリバースプライマーの両方を用いて同一の容
器で同時に複製する。このように、複数のオリゴヌクレオチドフラグメントを合
成する。複製される二本鎖インサートを有するプラスミドが提供される。フォワ
ードおよびリバースプライマーの各々は各鋳型を複製する。各々は種々の長さの
一連のオリゴヌクレオチドフラグメントを生じる。典型的には、図３Ａで説明す
るように重なり合う配列が作製される。装置の精製ユニットを用いて、フォワー
ドプライマーにより生じたオリゴヌクレオチドフラグメントをリバースプライマ
ーにより生じたオリゴヌクレオチドフラグメントから分離する。フォワード捕捉
プローブ−ゲル−チップ４０をリバース捕捉プローブ−ゲル−チップ５０の上に
積み重ね、電気泳動バッファーを全体に供給する。マルチプレックス反応からの
被検試料をフォワード捕捉プローブ−ゲル−チップ４０の収容部に負荷し、電場
の影響で下、両チップを通って移動させる。図３Ｂおよび３Ｃに示すゲルの写真
により明らかにされているように、その各々の捕捉プローブによりオリゴヌクレ
オチドフラグメントが捕捉される。あるいは、サンプルをプローブ−ゲル−チッ
プの積み重ね（ｓｔａｃｋ）に導入する前に、サンプルを電気泳動にかけ、例え
ば前精製し、ゲル負荷チップを通してマルチプレックス反応から残留する好まし
くない成分を除去する。

【００６０】本発明の装置は、疾患の検出の情報を得られることが知られている変異核酸を
選択的に濃縮するのにとりわけ有用である。加えて、精製標的分子は、フィンガ
ープリンティング、組織類型化、法医学適用、母子および父子鑑定試験、胎児性
別決定、ならびに農業、食品および医薬産業における品質管理における適用が見
出されている。

【００６１】未知サンプル中で見出されるＤＮＡ配列を既知ＤＮＡ配列と比較することによ
り、癌の素因または遺伝病を進展させる可能性に特徴的な変異配列の同定に頼る
診断方法を発展させることができる。例えば癌検出アッセイにおいて、癌を生じ
る新形成組織中、並びに癌の段階、癌の型および癌性である組織に依存するその
他の生物学的サンプル中に癌細胞に特徴的な変異核酸を見出すことができる。

【００６２】具体的には、遺伝子配列における欠失または点変異、例えば塩基変化の特定の
パターンは結腸直腸癌の種々段階の特徴である。便サンプルを用いて、疾患に特
徴的な変異ＤＮＡ配列を区別することにより結腸直腸癌細胞を検出していた。一
例についてはＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎら、米国特許第５，３８０，６４５号、５，
５８０，７２９号および５，９１０，４０７号を参照のこと（その開示は全体と
して参照により本明細書に取り込まれる）。癌組織が転移する場合、変異核酸を
血液およびリンパ節中に見出すことができる。しかしながら、正常な核酸配列の
量に比較して、変異オリゴヌクレオチド配列は非常に少量で存在し、典型的には
全存在の１０％未満の量である。本発明は変異オリゴヌクレオチドを濃縮して疾
患検出のための正確な配列決定を可能にする方法を提供する。

【００６３】本発明の装置を用いる方法は、血液サンプルを入手し、サンプルから核酸、例
えばＤＮＡを単離し、並びに核酸を精製および所望により濃縮することに関する
。これは、標的核酸配列に十分特異的である共有結合捕捉プローブを有し、捕捉
プローブでハイブリダイズできる電気泳動用媒体を含有する装置の収容部に、血
液を抽出することにより得られた核酸被検試料を配置することにより達成できる
。標的核酸が捕捉プローブにハイブリダイズするまで、標的核酸を電気泳動にか
けることができる。核酸をプローブから除去し、所望により増幅して配列決定に
十分な核酸を提供することができる。別法としては、それを直接配列決定できる
。ハイブリダイゼーション複合体から放出した標的核酸配列を収集する場合、少
量のバッファーを用いてサンプルの濃縮を達成できる。

【００６４】標的核酸を精製する方法に最適な条件を開発する方法もまた、本発明の範囲内
である。標的核酸の捕捉および標的核酸の溶出に影響する条件を最適化すると、
標的核酸、とりわけ疾患の検出の情報が得られることが知られている標的変異核
酸を最も効果的に精製できる。

【００６５】記載した方法を実行するのに有用な本発明の装置を含むキットもまた企図され
る。キャピラリー電気泳動用のＤＮＡ配列産物の調製を促進するためのキットは
、ゲル負荷チップの容器およびプローブ−ゲル−チップの容器を含むことができ
る。これはまたチップに適合するように大きさを揃えた電極並びに電気泳動バッ
ファーおよび／または電極に連動する動力源の容器を含むことができる。

【００６６】マルチプレックス（ｍｕｉｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）を促進するキットは、プロー
ブ１−ゲル−チップ（フォワードプライマー配列相補体でよい）の容器、および
プローブ２−ゲル−チップ（リバースプライマー配列相補体でよい）の容器を含
むことができる。さらに、キットはゲル負荷チップ、電極、動力源およびバッフ
ァーまたはこれらの構成成分のいずれもの組み合わせの容器を含むことができる
。

【００６７】癌組織に関連するＤＮＡ配列に特徴的な変異ＤＮＡの検出を促進するキットも
また企図される。かかるキットはプローブ−ゲル−チップの容器を含んでなり得
、ここで電気泳動媒体に固定されているプローブ配列は特定の癌の型に関連する
ことが知られている変異ＤＮＡ配列に相補的である。

【００６８】複数の精製ユニットを有する装置を含むようにいずれものキットを構成するこ
とができる。

【００６９】実施例実施例１Ｍ１３ｍｐ１８配列に相補的な単一のＤＮＡ産物の精製図５はプライマー、塩、ＤＮＡ鋳型、組み込まれていないヌクレオチドおよび
色素ターミネーターを含むＤＮＡシークエンシング反応物からの望ましいオリゴ
ヌクレオチド配列の精製の結果を示すゲルの写真である。第１にシークエンシン
グ反応に用いるＤＮＡをゲル負荷チップにより精製して粗製サンプルを提供し、
次いで捕捉プローブ−ゲル−チップにより粗製サンプルを精製した。レーン１は
精製前に提供されたパターンを示す。レーン２はゲル負荷チップを使用して精製
した後に認められたパターンを提供する。ＤＮＡ鋳型が除去されたのが示される
。レーン３は捕捉プローブ−ゲル−チップを用いて精製した後に認められたパタ
ーンを示す。ＤＮＡ鋳型が存在せず、望ましい配列が局在するのが示される。

【００７０】Ａ．固定化捕捉プローブを有する（プローブ−ゲル−チップ）分離装置および有
さない（ゲル負荷チップ）分離装置の精製プローブ−ゲル−チップ、すなわちＡｃｒｙｄｉｔｅ（登録商標）オリゴヌク
レオチドゲルを含む精製装置の調製を以下のように実施した：４０％アクリルアミド（２９：１アクリルアミド単量体：ビス−アクリルア
ミド）および１０ｘＴＢＥ（９０ｍＭトリスホウ酸−ＥＤＴＡバッファー、ｐＨ
８．３；試薬はバイオラッド・ラボラトリーズ・インコーポレーティッド；ヘル
クレス、ＣＡより購入）の収容溶液からハイブリゲル溶液を調製した。米国特許
第５，６４１，６５８号ならびにＫｅｎｎｅｙ，ＲａｙおよびＢｏｌｅｓ、Ｂｉ
ｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２５：５１６〜５２１（１９９８）の文献（各開示は
全体として参照により本明細書に取り込まれる）に開示されている方法に従って
、オリゴヌクレオチド（オペロン・テクノロジーズ・インコーポレーティッド；
アラメダ、ＣＡから入手）およびアクリルアミドホスホロアミダイト（モザイク
・テクノロジーズ・インコーポレーティッド；ワルトハム、ＭＡから入手可能な
Ａｃｒｙｄｉｔｅ（登録商標）重合体）を用いて捕捉プローブ用のＡｃｒｙｄｉ
ｔｅ（登録商標）オリゴヌクレオチドを合成した。ハイブリゲルは５％アクリル
アミド（２９：１）、１ｘＴＢＥおよび以下の配列：５’−アクリルアミドＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＣＣＴＡＧＧＧ３’（プ
ローブ１）（配列番号：１）を有する１０μＭＡｃｒｙｄｉｔｅ（登録商標）オリゴヌクレオチド捕捉プロ
ーブを含む。この実施例のために選別した捕捉プローブは、ＤＮＡシークエンシ
ング反応の産物である標的分子を提供するベクターＭ１３ｍｐ１８のポリリンカ
ーの一部に相補的である配列を有するが、該捕捉プローブはプライマー配列を全
く含まない。１０％過硫酸アンモニウムおよびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ（Ｔ
ｅｒａ）−メチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ；バイオラッド、ヘルクレス、
ＣＡ）をハイブリゲル溶液に添加すると、重合が急速であった（２分以内）。

【００７１】プローブ−ゲル−チップを調製するために、１０％過硫酸アンモニウム１．０
μｌおよびＴＥＭＥＤ０．５μｌをハイブリゲル溶液２００．０μｌに加えた。
重合ハイブリゲルオリゴヌクレオチド含有溶液１０．０μｌを２００．０μｌチ
ップ（フィッシャー・サイエンティフィック・カンパニー、ピッツバーグ、ＰＡ
）に素早くピペッティングし、重合させた。マルチピペッティング装置（２００
μｌ使い捨てピペットチップおよびマルチピペッティング装置はギルソン、ミッ
ドレートン、ＷＩより入手可能）を用いて一度に８または１２個のプローブ−ゲ
ル−チップを作った。保存用に１ｘＴＢＥ約０．３ｍｌを含むマイクロチューブ
チップにプローブ−ゲル−チップを噴出させた。チップからゲルを押し出さない
ように注意を払わなければならない。次いでプローブ−ゲル−チップを１ｘＴＢ
Ｅ１５０．０μｌで積層した。

【００７２】ゲル負荷チップを用いて鋳型ＤＮＡを除去した。アクリルアミド（２９：１）
のみを含むゲル負荷チップ（すなわちＡｃｒｙｄｉｔｅ（登録商標）捕捉プロー
ブを有さない）を調製した。前記のように、４０％アクリルアミド（２９：１
単量体：ビス）および１０ｘＴＢＥの収容溶液より製造された、５％アクリルア
ミド（２９：１）、１ｘＴＢＥを含有する溶液を用いてゲル負荷チップを調製し
た。１０％過硫酸アンモニウムおよびＴＥＭＥＤを溶液に加え、最終溶液２００
．０μｌを各チップにピペッティングした。ゲル負荷チップも前記のように保存
できる。

【００７３】Ｂ．ＤＮＡ配列産物および捕捉プローブの調製ＰＥアプライドバイオシステムズにより推奨される循環条件を用いて、Ｇｅｎ
ｅＡｍｐ２４００中で−２１Ｍ１３フォワードプライマーを用いて、ＰＥアプラ
イドバイオシステムズＢｉｇＤｙｅプライマーサイクルシークエンシングキット
（ＰＥアプライドバイオシステムズ、ウェレスレイ、ＭＡより入手可能）のプロ
トコルに従って、ＰＥアプライドバイオシステムズシークエンシング産物を調製
した。ベクターＭ１３ｍｐ１８を用いた。既知配列を有するＤＮＡセグメントを
プライマー部位の後に挿入した。伸長産物を調製した。プライマーおよび挿入Ｄ
ＮＡの間の領域に捕捉プローブを作った。フォワードプライマーの伸長産物にハ
イブリダイズできる捕捉プローブを選別した。捕捉プローブは５’末端にＡｃｒ
ｙｄｉｔｅ（登録商標）を用いて合成したオリゴヌクレオチドを含んでなる。

【００７４】別法として、アメルシャム・ファルマシアのＤＹＥｎａｍｉｃＥＴターミネ
ーター・サイクルシークエンシングキットを用いることができる。

【００７５】Ｃ．ＤＮＡ配列伸長産物の捕捉選択した伸長産物（被検試料中の標的）の電気泳動捕捉および分離を以下のよ
うに実施した：プライマー、塩、組み込まれていないヌクレオチド、色素ターミ
ネーター、鋳型ＤＮＡおよび鋳型ＤＮＡから合成した標的ＤＮＡ伸長産物を含有
するシークエンシング反応溶液１０．０μｌ（すなわち一つの反応物の１／２）
を１０ｘフィコール負荷バッファー（３５％フィコール４００、０．１％ブロモ
フェノールブルー、０．１％キシレンシアノール、１００ｍＭＥＤＴＡ）１．
０μｌに加え、サンプル溶液を提供した。約２００μｌの容量の電気泳動バッフ
ァーをゲル負荷チップのゲル表面に積層する一方で、表面の湿りを保持し、電気
的接触を提供するのに十分な、より少量の電気泳動バッファーをプローブ−ゲル
−チップの表面に積層した。サンプル溶液をゲル負荷チップ（すなわちＡｃｒｙ
ｄｉｔｅ（登録商標）捕捉プローブを有さない）内にあるゲル表面に積層し、鋳
型ＤＮＡを除去した。図４Ａに示すように、このチップをプローブ−ゲル−チッ
プ、すなわちハイブリゲル含有チップの上に積み重ねた。小容量の電気泳動バッ
ファーをプローブ−ゲル−チップのゲルの表面に積層し、ゲル負荷チップを電気
泳動バッファーと接触させて配置した。このように、二つのゲル間で液体接続を
形成し、電極および動力源を設置した場合電気的接続が可能になる。

【００７６】ゲル負荷チップのゲル表面にサンプル溶液を負荷した後、両方のチップを１ｘ
ＴＢＥ、電気泳動バッファーを含むマイクロチューブ（１．５ｍｌ）に配置した
。積み重ねたゲルチップの上および下の電気泳動バッファー中にプラチナ電極を
設置し、１００Ｖ電圧を１０分間適用した。上部電極は動力供給の陰性リードに
接続する一方、下部電極を動力供給の陽性電極に接続した。このようにゲル負荷
チップはプローブ−ゲル−チップに導入するための部分的に精製されたサンプル
溶液を提供した。（この時点で、ゲル負荷チップを廃棄できる。）小型のＤＮＡ
フラグメントはバッファーを通り、次いでゲル負荷チップに保持されるＤＮＡ鋳
型および色素よりも速くプローブ−ゲル−チップに入る。

【００７７】プローブ−ゲル−チップゲル表面上に残存する電気泳動バッファーを除去した
。電気泳動バッファーをホルムアミド負荷色素（５：１脱イオン化ホルムアミド
、２５ｍｇ／ｍｌブルーデキストラン、２５ｍＭＥＤＴＡ）４μｌと置換した
。低バッファー保存物を含むマイクロチューブをドライバスに入れることにより
、プローブ−ゲル−チップのゲルの温度を５５℃まで上昇させ、捕捉プローブか
らの標的オリゴヌクレオチド配列の剥離を促進した。（ＶＷＲ）。５％アクリル
酸を含む３０％アクリルアミドゲルを有する清浄な第２のゲル負荷チップをホル
ムアミド負荷色素にまで下げた。プラチナ電極を上のゲル負荷チップに配置した
。電流の方向を逆行させて上向きにハイブリダイゼーション複合体からのオリゴ
ヌクレオチドの放出を誘導した。プローブ−ゲル−チップからホルムアミド負荷
色素へオリゴヌクレオチドを誘導するのに４０Ｖで１分で十分であった。サンプ
ル４．０μｌをピペットにより除去し、配列分析用に保持した。電気泳動の後、
モレキュラー・ダイナミクス・フルオールイメージャー５９５を用いてプローブ
−ゲル−チップのゲルを可視化した。図４Ｂに示す結果はプローブ−ゲル−チッ
プのゲルの上部表面で捕捉を生じていることを表している。

【００７８】Ｄ．ハイブリゲルアッセイによる配列精製の分析垂直ポリアクリルアミド・ミニゲル用ガラスプレート（１０ｘ１０ｃｍ、０．
７５ｍｍ間隔）を組み立て、２０％アクリルアミド（２９：１；Ｂｉｏ−Ｒａｄ
）、１ｘＴＢＥ（９０ｍＭトリスホウ酸バッファー、ｐＨ８．３、２ｍＭＥＤ
ＴＡ）でサンドウィッチの約半分まで充填した。１０％過硫酸アンモニウム水溶
液（ＡＰＳ）およびＴＥＭＥＤを各々ゲル容量の１／１００および１／１０００
で含有することにより重合を開始した。一つの捕捉層を含有するゲル用には、Ａ
ｃｒｙｄｉｔｅ（登録商標）標識オリゴヌクレオチドを最終濃度１０μＭで含有
するゲル溶液（２０％ポリアクリルアミド、１ｘＴＢＥ、１０％ＡＰＳ４μｌ
および１０％ＴＥＭＥＤ４μｌ）６００μｌを重合した。捕捉層の重合の後、
プレートサンドウィッチの残りの空間を５％ゲルで充填した。次いでこの混成ゲ
ルを１ｘＴＢＥを含有するミニゲル装置に組み立て、１００ないし１５０Ｖ、約
４５分間、電気泳動に供した。電気泳動後、モレキュラー・ダイナミクス・フル
オールイメージャー５９５を用いてゲルを可視化した。結果によりハイブリゲル
プローブにより捕捉された配列は鋳型ＤＮＡの相補体であることが確認される。

【００７９】Ｅ．捕捉されたオリゴヌクレオチドの自動シークエンシング前記の方法に従って、本発明の装置により精製したオリゴヌクレオチド配列を
自動シークエンサーで分析し、標準ベクターを用いる反復実験により最初の５０
０ヌクレオチドのシークエンシングの精度が１００％に近いことが示された。読
み取り可能な配列は少なくとも７５０ヌクレオチドまで伸長する。

【００８０】実施例２複数のＤＮＡ配列産物の同時分離この実施例は、本発明の装置および方法がプラスミドで複製されるオリゴヌク
レオチドインサートのシークエンシングに有用であることを示している。図３Ａ
に説明するようにフォワードおよびリバースプライマーの両方を用いる。大きな
インサートを有するプラスミドを一つの反応容器中で二つのプライマーを同時に
用いてシークエンシングした。各々異なる捕捉プローブを含む二つのプローブ−
ゲル−チップを縦列に配置した。プローブ配列は用いたフォワードおよびリバー
スプライマーに基づいて設計した。図５で示される平板ゲルから、被検試料中の
二つのオリゴヌクレオチド標的の精製が、粗製産物と比較して説明される。リバ
ース産物（右）の配列がフォワード配列での夾雑を示さないことに注目されたい
。またＤＮＡ鋳型夾雑物が除去されていることにも注目されたい。

【００８１】Ａ．固定化捕捉プローブを含む分離装置および含まない分離装置の調製ゲル負荷チップを実施例１に記載するように調製した。

【００８２】図３Ａに示すように、一つはフォワードプライマープローブ（プローブ２）が
提供され、他方はリバースプライマープローブ（プローブ３）が提供される以外
は、実施例１に記載するようにプローブ−ゲル−チップを調製した。このように
、一つはアクリダイトオリゴヌクレオチド６２６９−１７ａｃ（配列番号：２）
を有し、他方はアクリダイトオリゴヌクレオチド６２３１−１９ａｃ（配列番号
：３）を有する二つの別個のハイブリゲルチップを作った。ポリリンカーのＸｂ
ａＩ部位に３．８ｋｂインサートを有するプラスミドベクターｐＧＥＭ３Ｚｆ（
−）（プロメガ・バイオテック、ＷＩ）であるプラスミドｐ６９８を用いた。二
つのプローブはポリリンカー内のＸｂａＩ部位のいずれかの側の配列に由来する
。プローブ６２６９−１７ａｃは、リバースプライマーを用いて作った配列産物
に相補的であり、従ってそれを捕捉できる。同様に、プローブ６２３１−１９ａ
ｃはフォワードプライマーからの配列を捕捉できる。６２６９−１７ａｃ５’アクリルアミド−ＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣ
ＴＴ（配列番号：２）６２３１−１９ａｃ５’アクリルアミド−ＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡ
ＡＴＴＣ（配列番号：３）

【００８３】このように、各オリゴヌクレオチドプライマープローブは５’末端でアクリダ
イトを用いて合成され、伸長産物にハイブリダイズできる。各捕捉プローブ配列
は伸長産物配列およびプライマーの両方に相補的である。各捕捉プローブ配列は
プライマー部位およびインサートＤＮＡ間の領域に由来する特定のベクターに特
異的である。

【００８４】Ｂ．複数反応の産物の精製図３Ａで説明するように、プローブ２ゲルチップをプローブ３ゲルチップと縦
列に配置（積み重ね）した。流す電気泳動バッファーをプローブ３ゲルチップの
上部表面に配し、電気的接触を提供し、乾燥を防いだ。マルチプレックスシーク
エンシング反応物からの被検試料をプローブ２ゲルチップおよびプローブ３ゲル
チップの両方を通して電気泳動した。図３Ｂは二つの異なるプローブによる二つ
の別個のチップにおける捕捉を説明している。

【００８５】実施例３温度勾配を用いる捕捉プローブからの標的の溶出以下の方法を用いて捕捉および溶出のための最適温度を決定しうる。

【００８６】ハイブリダイゼーション複合体の安定性は温度に依存する。捕捉プローブを含
まないゲルの層の間でサンドウィッチされたＡｃｒｙｄｉｔｅ（登録商標）捕捉
プローブの層を含む垂直平板ゲルを製造した。上層および下層のゲルはゲル負荷
チップに用いたものであった。捕捉プローブ配列６２４９−１７ａｃ（配列番号
：４）を用いてプローブ−ゲル−チップ用にアクリダイトプローブ層を実施例１
に記載のとおり製造した。この場合のサンプルは６２４９−１７ａｃに相補的な
配列を有する蛍光オリゴヌクレオチドであった。同じサンプルを各ウェルに負荷
した。アルミニウム背板および２個の水浴を用いて全ゲルを温度勾配に供した。
左のゲル温度は２３℃である。温度はゲルを横切って右では５３℃まで上昇した
。低温では標的は捕捉層の上部で効果的に捕捉された。温度が上昇するにつれて
、サンプルが層を通って右に流れるまで標的捕捉は阻害された。遷移温度、すな
わち標的が捕捉されなくなる（ｓｔｏｐｓｃｅａｓｅｓ）温度がＴ_mに関連す
る。この遷移温度以下の温度が捕捉に有用である一方、この遷移温度を越える温
度は溶出に有用である。

【００８７】実施例４配列溶出の温度および捕捉プローブの大きさの依存性シークエンシング産物の捕捉および溶出のための温度条件を決定するために、
図７に示す実験を実施した。この実験は溶出温度が捕捉プローブの大きさにより
影響されることを示している。溶出温度が捕捉プローブの大きさにより影響され
ることが示された。図７に示される５個のパネルは２３℃で始まる五つの異なる
温度での同一の垂直平板ゲルの流れを示し、ここでは５個の異なるプローブを使
用した。各プローブ配列での塩基の数は図７で示すように、１３、１５、１７、
１９および２１ヌクレオチドであった（左から右へ）。各レーンにＭ１３シーク
エンシング反応物（Ｄｙｎａｍｉｃ（登録商標）ＥＴ）を負荷した。１３マーは
２３℃ではうまく捕捉されなかったが、その他は全て捕捉された。３０℃で１５
マーが配列を放出する一方、１７マーは３５℃で放出し始めるなど、５０°まで
には全ての標的配列が放出された。これらの結果はシークエンシング産物の捕捉
および溶出の温度条件を説明している。

【００８８】溶出が４５℃で起こる標準的な方法では、１７マーＡｃｒｙｄｉｔｅ（登録商
標）プローブを捕捉プローブとして選択した。

【００８９】本発明をとりわけその好ましい態様を参考にして示し、記載したが、添付の請
求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく形態および詳細におい
て種々変更をそこに加えることができることは当業者に理解されよう。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はさらなる分析、例えばＤＮＡシークエンシングで使用するための、マイ
クロタイタープレートのウェルである装置の精製ユニットを用いて標的ＤＮＡを
精製する方法を図式的に表す。

【図２】図２はさらなる分析、例えばＤＮＡシークエンシングで使用するための、半透
膜を含む収集チャンバーを含む精製ユニットを有する装置を用いて標的ＤＮＡを
精製する方法を図式的に表す。

【図３】図３Ａは、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびシークエンシ
ングされるオリゴヌクレオチドインサートを有するプラスミドが提供される精製
ユニット内で行われる複数の反応のオリゴヌクレオチド産物の精製方法を図式的
に表す。固定化捕捉プローブ、例えばプローブ・ゲル・チップ装置を含む電気泳
動用媒体を含む積み重ねられた装置（電気泳動用媒体中にフォワード捕捉プロー
ブを有する上部装置および電気泳動用媒体中にリバース捕捉プローブを有する下
部装置を含む）を用いて増幅反応のマルチプレックス産物を精製する。図３Ｂおよび３Ｃは図３Ａに示す方法を用いて達成した精製結果の写真である
。フォワード複製産物をリバース複製産物から分離する。図３Ｄは逆配列を示す。図３Ｅは図３Ａに示す方法において用いられる配列を示す。

【図４】図４Ａは固定化捕捉プローブ、例えばゲル負荷チップ装置を含まない電気泳動
用媒体を、固定化捕捉プローブ、例えばプローブ−ゲル−チップ装置を含む電気
泳動用媒体を含む装置と縦列に並べて用い、ＤＮＡ標的分子、例えばＤＮＡシー
クエンシング反応の産物を精製、および所望により濃縮する装置を用いる方法を
図式的に表す。図４Ｂは電気泳動後、および溶出前の電気泳動用媒体領域中の標的分子の分布
を示す写真である。

【図５】図５は、１）本発明の装置で精製する前、および２）ハイブリダイズして装置
から除去した後に撮影したサンプル成分の分布を示す電気泳動ゲルの写真である
。

【図６】図６は固定化捕捉プローブ、例えばプローブゲル層を含む電気泳動用媒体が、
固定化捕捉プローブ、例えばプローブ負荷層を含まない上部電気泳動用媒体およ
び下部電気泳動用媒体でサンドイッチされている垂直平板電気泳動用媒体の写真
である。該プローブはプローブ・ゲル層中に一様に分布している。２４．７℃か
ら５３．４℃の温度勾配は色素タグを有する標的オリゴヌクレオチドの電気泳動
中に左から右へ提供された。

【図７】図７は、複数のレーンを有する垂直平板電気泳動用媒体の写真である。各レー
ンには、上部から底部へ２３℃から４５℃の温度勾配が提供されている。各レー
ンには異なる大きさの捕捉プローブが提供されている。レーン１の相補性捕捉プ
ローブは１３マー；レーン２は１５マー；レーン３は１７マー；レーン４は１９
マー；およびレーン５は２１マーである。色素タグを有する同一のオリゴヌクレ
オチドは各レーンで電気泳動される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ウェア，ローレンスアメリカ合衆国マサチューセッツ 01748 ホプキントン，グラニットストリート 55 (72)発明者ダーンダ，ラウル，ケイ．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02143 サマヴィル，リンデンアべニューナンバーツー 27 (72)発明者クロン，ステファン，ジェイ．アメリカ合衆国イリノイ 60302 オークパーク，フェアオークスアベニュー 611 Ｆターム(参考） 4B029 AA09 AA23 BB20 CC03 CC08 HA10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）収容部；および（ｂ）標的核酸にハイブリダイズするように選択された少なくとも１種の固定
化捕捉プローブを含有してなる電気泳動用媒体、を含有してなる少なくとも１個の精製ユニットを含有してなる、被検試料由来の
標的核酸分子を精製するための装置。
【請求項２】複数の精製ユニットを含有してなる請求項１記載の装置。
【請求項３】該装置がマイクロタイタープレートであり、各精製ユニット
がマイクロタイターウェルである請求項２記載の装置。
【請求項４】電気泳動用媒体により収容部と分離されている収集チャンバ
ーをさらに含有してなる請求項１記載の装置。
【請求項５】複数の精製ユニットを含有してなる請求項４記載の装置。
【請求項６】該装置はマイクロタイタープレートであり、各精製ユニット
がマイクロタイターウェルである請求項５記載の装置。
【請求項７】（ａ）収容部；（ｂ）電気泳動用媒体；および（ｃ）収集チャンバー、を含有してなり、電気泳動用媒体が収容部と収集チャンバーとを分離する、前精
製ユニットをさらに含有してなる請求項１記載の装置。
【請求項８】収集チャンバーが排出口を含有してなる請求項４記載の装置
。
【請求項９】排出口が半透膜を含有してなる請求項８記載の装置。
【請求項１０】複数の同一の捕捉プローブを含有してなる請求項１記載の
装置。
【請求項１１】複数の異なる捕捉プローブを含有してなる請求項１記載の
装置。
【請求項１２】複数の同一の捕捉プローブを含有してなる請求項２記載の
装置。
【請求項１３】複数の異なる捕捉プローブを含有してなる請求項２記載の
装置。
【請求項１４】複数の同一の捕捉プローブを含有してなる請求項４記載の
装置。
【請求項１５】複数の異なる捕捉プローブを含有してなる請求項４記載の
装置。
【請求項１６】複数の同一の捕捉プローブを含有してなる請求項５記載の
装置。
【請求項１７】複数の異なる捕捉プローブを含有してなる請求項５記載の
装置。
【請求項１８】（ａ）（１）収容部；および（２）標的核酸分子にハイブリダイズするように選択された少なくとも１種の
固定化捕捉プローブを含有する電気泳動用媒体、を含む精製装置のユニットの収容部内に、標的核酸分子を含有する被検試料を導
入する工程；ならびに（ｂ）被検試料中の標的分子が捕捉プローブにハイブリダイズし、それにより標
的分子／捕捉プローブ複合体を形成するのに適し、かつ被検試料の残りの成分が
媒体中を移動し、溶出されるのに適した条件下で電気泳動用媒体を電場に供し、
媒体中での被検試料の移動をもたらす工程、を含む、被検試料由来の標的核酸分子を精製する方法。
【請求項１９】電気泳動用媒体を処理して標的分子を放出させる工程をさ
らに含む請求項１８記載の方法。
【請求項２０】標的分子／捕捉プローブ複合体を変性させるのに充分な温
度に電気泳動用媒体の温度を上昇させる工程、電気泳動用媒体内で捕捉プローブ
を固定化する化学結合を開裂させる工程、および標的分子／捕捉プローブ複合体
を破壊するのに充分なレベルに電気泳動電場強度を上昇させる工程からなる群よ
り選ばれる処理により標的分子を電気泳動用媒体から放出させる請求項１９記載
の方法。
【請求項２１】標的分子を収容部内に放出させる請求項１９記載の方法。
【請求項２２】装置が、電気泳動用媒体により収容部と分離されている収
集チャンバーをさらに含有する請求項１８記載の方法。
【請求項２３】標的分子を増幅する工程をさらに含む請求項１８記載の方
法。
【請求項２４】標的分子の濃度の上昇をもたらす請求項１８記載の方法。
【請求項２５】精製装置が複数のユニットを含む請求項１８記載の方法。
【請求項２６】複数の標的分子が同時に精製される請求項２５記載の方法
。
【請求項２７】収集チャンバーが排出口を含む請求項２２記載の方法。
【請求項２８】排出口が半透膜を含有する請求項２７記載の方法。
【請求項２９】標的核酸分子の精製および濃縮が単一処理工程で起こる請
求項１８記載の方法。
【請求項３０】前精製処理工程をさらに含む請求項１８記載の方法。
【請求項３１】被検試料が精製ユニットの収集チャンバーから得られたも
のである請求項２２記載の方法。
【請求項３２】（ａ）収容部；および（ｂ）予め選択した核酸にハイブリダイズするように選択された少なくとも１
種の固定化捕捉プローブを含有してなる電気泳動用媒体、を含有してなる少なくとも１つの精製ユニットを含んでなる、被検試料由来の標
的核酸を精製するための装置を含有してなる、核酸配列決定適用において使用す
るための被検試料中の標的核酸の調製用キット。
【請求項３３】装置が複数の精製ユニットを含有してなる請求項３２記載
のキット。
【請求項３４】装置が、電気泳動用媒体により収容部と分離されている収
集チャンバーをさらに含有してなる請求項３２記載のキット。
【請求項３５】装置が、電気泳動用媒体により収容部と分離されている収
集チャンバーをさらに含む請求項３３記載のキット。
【請求項３６】（ａ）収容部；（ｂ）電気泳動用媒体；および（ｃ）収集チャンバー、を含有し、電気泳動用媒体が収容部と収集チャンバーとを分離する、前精製ユニ
ットをさらに含んでなる請求項３２記載のキット。
【請求項３７】予め選択した核酸が、ヒト疾患の検出に有用な変異核酸で
ある請求項３２記載のキット。
【請求項３８】疾患が癌である請求項３７記載のキット。