JP2002525061A

JP2002525061A - 除草標的遺伝子としてのアラビドプシスからのウラシルパーミアーゼ

Info

Publication number: JP2002525061A
Application number: JP2000570336A
Authority: JP
Inventors: ツバイレバイン，ジョシュア; ルイス，シャロンリーポッター; ジョセフバドツィスツェウスキ，グレゴリー; ラッセルウォード，エリック; バーナスコニ，ポール
Original assignee: シンジェンタパーティシペーションズアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1998-09-15
Filing date: 1999-09-13
Publication date: 2002-08-13
Also published as: AU6082399A; WO2000015809A2; EP1114168A2; CA2340332A1; WO2000015809A3; CN1318106A

Abstract

(57)【要約】本発明は、実生の生長のために必須のタンパク質をコードするアラビドプシスから単離された遺伝子に関する。本発明は、正常な生長及び発達の不可欠性に基づいて、新しい除草剤を発見するためにこのタンパク質を用いる方法も含む。本発明は、潜在的な除草剤であるインヒビターを同定するためのスクリーニングアッセイに用いることもできる。本発明は、除草剤耐性植物、植物組織、植物種子、及び植物細胞の開発にも適用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、実生生長のために必須のタンパク質をコードするアラビトプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）から単離された遺伝子に関する。本発明は、正常な生
長及び発達のための遺伝子の本質に基づき、除草標的としてタンパク質を用いる
方法も含む。本発明は、潜在的な除草剤であるインヒビターを同定するためのス
クリーニングアッセイとしても役立つ。本発明は、除草剤耐性植物、植物組織、
植物種子、及び植物細胞の開発にも適用できる。

【０００２】作物の土地において不要な雑草を抑制するための除草剤の使用はほとんど一般
的な習慣になっている。除草剤市場は毎年、１５０億ドルを超える。この大規模
な使用にかかわらず、雑草の抑制は、農業家のための大きなかつコスト的な問題
であり続けている。除草剤の有効な使用は、健全な管理を必要とする。例えば、適用の時間及び方
法並びに雑草の発達の段階が除草剤で優れた雑草抑制を得るために重大である。
種々の雑草種が除草剤に対して耐性であるので、有効な新しい除草剤の生産は次
第に重要になっている。新規の除草剤は現在、組換えＤＮＡ技術を行う高スルー
プットスクリーンを用いて発見することができる。植物の生長及び発達に必須で
あることが見い出されている代謝性酵素は、標準的な分子生物学技術を介して組
換え生産することができ、酵素活性の新規インヒビターのためのスクリーンにお
いて除草剤標的として利用することができる。このようなスクリーンを介して発
見された新規インヒビターは、次に、不要な植物を抑制するために除草剤として
用いることができる。

【０００３】より大きな効力、より広い雑草範囲、及びより迅速な土中での分解を示す除草
剤は、不幸なことに、より大きな作物毒性も有する。この問題に適用される１つ
の解決法は、除草剤に対して耐性又は寛容性である作物を開発することである。
除草剤に対して耐性である作物ハイブリッド又は品種は、作物への損傷の付随す
る危険性なく雑草を殺すための除草剤の使用を許容する。耐性の開発は、その作
物の除草剤への感受性によりその使用が以前に妨げられ又は（例えば発芽前の使
用に）限定された場合に作物への除草剤の適用を許容し得る。例えば、Anderson
らの米国特許第４，７６１，３７３号は、種々のイミダゾリノン又はスルホンア
ミド除草剤に対して耐性の植物に関する。その耐性は、変化したアセトヒドロキ
シ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）酵素によって与えられる。Goodman らの米国特許第
４，９７５，３７４号は、ＧＳを阻害することが知られている除草剤、例えばホ
スフィノトリシン及びメチオニンスルホキシミンによる阻害に対して耐性の変異
体グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）をコードする遺伝子を含む植物細胞及び植物
に関する。Bedbrookらの米国特許第５，０１３，６５９号は、植物をスルホニル
ウレア除草剤による阻害に対して耐性にする変異体アセトラクテートシンターゼ
を発現する植物に関する。Somersらの米国特許第５，１６２，６０２号は、シク
ロヘキサンジオン及びアリールオキシフェノキシプロパン酸除草剤による阻害に
対して耐性の植物を開示する。その耐性は、変化したアセチル補酵素Ａカルボキ
シラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）により与えられる。

【０００４】上述の進歩にもかかわらず、不要な又は有害な植物の成長（例えば雑草）の持
続的かつ断続中の問題があり続けている。更に、その人工は増加し続けるので、
食料不足は増加するであろう。それゆえ、新しく、有効で、かつ経済的な除草剤
を見い出すまだ満たされていない必要性が長い間、感じられている。定義明瞭さのため、本明細書に用いる特定の用語を定義し、以下に示す：キメラは、ＤＮＡ配列、例えばベクター又は遺伝子が組換えＤＮＡ技術により
一緒に融合された別々の起源の１超のＤＮＡ配列から構成され、天然には生じな
いＤＮＡ配列を作り出すことをいうのに用いる。

【０００５】補因子（コファクター）：酵素触媒反応において要求される有機分子又は金属
イオンのような天然の反応物。補因子は、例えばＮＡＤ（Ｐ）、リボフラビン（
ＦＡＤ及びＦＮＮを含む）、葉酸、モリブドプテリン、チアミン、ビオチン、リ
ポ酸、パントテン酸及び補酵素Ａ、Ｓ−アデノシルメチオニン、ピリドキサール
ホスフェート、ユビキノン、メナキノンである。任意に、補因子は再生し、再使
用することができる。

【０００６】ＤＮＡシャッフリング：ＤＮＡシャッフリングは、突然変異又は再配置を、好
ましくはランダムに、ＤＮＡ分子に導入し、又は２又はそれ超のＤＮＡ分子の間
のＤＮＡ配列の交換を好ましくはランダムに行う方法である。ＤＮＡシャッフリ
ングから生ずるＤＮＡ分子は、少くとも１のテンプレートＤＮＡ分子由来の非天
然ＤＮＡであるシャッフル化ＤＮＡである。そのシャッフル化ＤＮＡは、テンプ
レートＤＮＡによりコードされる酵素に対して改変された酵素をコードし、好ま
しくはテンプレートＤＮＡによってコードされる酵素に対して変化した生物活性
を有する。

【０００７】酵素活性は、基質の産物への変換を触媒する酵素の能力を意味する。酵素のた
めの基質は、その酵素の天然の基質を含むが、酵素により産物又は産物のアナロ
グにも変換され得る天然の基質のアナログも含む。酵素の活性は、例えば、特定
の期間後にその反応中の産物の量を測定することにより、又は特定の期間後にそ
の反応混合物中に残っている基質の量を決定することにより測定される。酵素の
活性は、特定の期間後に反応混合物中に残っている反応の未使用の補因子の量を
測定することにより、又は特定期間後に、反応混合物中の使用された補因子の量
を測定することによっても測定される。酵素の活性は特定の期間後に反応混合物
中に残っている自由エネルギーのドナー又はエネルギーの豊富な分子（例えばＡ
ＴＰ、ホスホエノールピルベート、アセチルホスフェート又はホスホクレアチン
）の量を測定することにより、又は特定の期間後に反応混合物中の使用された自
由エネルギーのドナー又はエネルギーの豊富な分子（例えばＡＤＰ、ピルベート
、アセテート又はクレアチン）の量を測定することによっても測定される。

【０００８】発現は、植物中の内在性遺伝子又はトランスジーンの転写及び／又は翻訳をい
う。アンチセンス構成物の場合、例えば、発現は、アンチセンスＤＮＡのみの転
写をいうこともある。遺伝子は、コーディング配列及び関連する調節配列をいい、そのコーディング
配列は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲ
ＮＡ又はアンチセンスＲＮＡに転写される。調節配列の例はプロモーター配列、
５’及び３’非翻訳配列である。存在し得る更なる要素は例えばイントロンであ
る。

【０００９】問題の遺伝子は、植物に移した時に、その植物に、要求される特徴、例えば抗
生物質耐性、ウイルス耐性、昆虫耐性、病気耐性、もしくは他の有害生物に対す
る耐性、除草剤耐性、改良された栄養価、工業過程における改良された能力又は
変化した再生能力を与えるいずれかの遺伝子をいう。“問題の遺伝子”は、植物
における商業的に価値のある酵素又は代謝物の生産のための植物に移されるもの
であってもよい。

【００１０】除草剤：植物、植物細胞、植物の種子、又は植物組織を殺し又はその生長を抑
制するために用いる化学物質。異種ＤＮＡ配列：天然ＤＮＡ配列の非天然多重コピーを含む、導入された宿主
細胞に天然には関連しないＤＮＡ配列。同種ＤＮＡ配列：導入された宿主細胞に天然で関連しているＤＮＡ配列。

【００１１】同一性：動力学的プログラミングアルゴリズムに基づくコンピュータープログ
ラムを用いて配列同一性の割合（％）が決定される。本発明の範囲内で好ましい
コンピュータープログラムには、タンパク質かＤＮＡかにかかわらず、利用でき
る配列データベースの全てを検査するようデザインされたＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉ
ｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）サーチプログ
ラムがある。このサーチツールのＶｅｒｓｉｏｎＢＬＡＳＴ２．０（Ｇａｐ
ｐｅｄＢＬＡＳＴ）は、インターネット（現在、http://www.ncbi.nlm.nih.go
v/BLAST/）で公共に利用できる。それは、グローバルアラインメントと反対に、
ローカルを探す発見的（ｈｅｕｒｉｓｔｉｃ）アルゴリズムを用い、それゆえ、
隔離した領域のみを共有する配列の中での関係を検出することができる。ＢＬＡ
ＳＴサーチにおいて割り当てられるスコアは十分に規定された統計学に基づく。

【００１２】インヒビター：生合成酵素、レセプター、シグナル伝達タンパク質、構造遺伝
子産物、又は植物の生長もしくは生存に本質的である輸送タンパク質のようなタ
ンパク質の酵素活性を不活性化する化学物質、本発明の文脈において、インヒビ
ターは、植物から４７８８の酵素活性を不活性化する化学物質である。アイソジェニック：トランスジーンの存在又は欠如により異なり得ることを除
いて遺伝子的に同一である植物。

【００１３】単離：本発明の文脈において、単離されたＤＮＡ分子又は単離された酵素は、
ヒトの手によりそのネイティブ環境から離れて存在し、それゆえ自然の産物でな
いＤＮＡ分子又は酵素である。単離されたＤＮＡ分子又は酵素は、精製された形
態で存在しても、例えばトランスジェニック宿主細胞のような非天然環境に存在
してもよい。

【００１４】マーカー遺伝子：選択可能な又はスクリーニング可能な形質をコードする遺伝
子。成熟タンパク質：クロロプラストのような、細胞オルガネラに通常、標的にさ
れ、それから一時的なペプチドが除去されるタンパク質。最小プロモーター：上流活性化の欠如下で不活性であるか又はかなり減少した
プロモーター活性を有するプロモーター要素、特にＴＡＴＡ因子。好適な転写因
子の存在下で、最小プロモーターは転写を許容するよう機能する。

【００１５】改変酵素活性：天然の酵素活性を阻害するインヒビターに対して耐性である植
物で天然であるもの（即ちヒトによるこのような活性の直接的又は間接的操作の
ない天然の酵素活性）と異なる酵素活性。作用可能に結合／連結：調節ＤＮＡ配列は、その調節ＤＮＡ配列がコーディン
グＤＮＡ配列の発現に影響を与えるように２つの配列が位置するなら、ＲＮＡ又
はタンパク質をコードするＤＮＡ配列と“作用可能に結合”又は“連結”してい
る。

【００１６】植物は、いずれかの植物、特に種子植物をいう。植物細胞：プロトプラスト及び細胞壁を含む、植物の構造的及び生理学的単位
。植物細胞は単離された単細胞もしくは培養細胞の形態であっても、又は例えば
植物組織もしくは植物器官のような高度に組織化したユニットの一部としてであ
ってもよい。

【００１７】植物材料は、葉、茎、根、花又は花の部分、果実、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢
、卵細胞、接合子、胚、種子、挿木、細胞もしくは組織培養物、又は植物のいず
れか他の部分又は産物をいう。プレタンパク質：クロロプラストのような細胞オルガネラに標的にされ、なお
その形質ペプチドを含むタンパク質。

【００１８】組換えＤＮＡ分子：組換えＤＮＡ技術を用いて一緒に連結されたＤＮＡ配列の
組合せ。組換えＤＮＡ技術：例えばSambrookら（1989, Cold Spring Harbor, NY : Col
d Spring Harbor Laboratory Press）に記載されるような、ＤＮＡを一緒に連結
するために用いる手順。

【００１９】選択マーカー：植物細胞内での発現が細胞に選択的利点を与える遺伝子。選択
マーカー遺伝子で形質転換した細胞が有する選択的利点は、非形質転換細胞の生
長と比べて、抗生物質又は除草剤のような負の選択剤の存在下で生長する能力の
ためであり得る。非形質転換細胞と比べた形質転換細胞が有する選択的利点は、
栄養素、成長因子又はエネルギー源として添加された化合物を利用する増強され
た又は新規な能力のためでもあり得る。選択マーカー遺伝子は、植物細胞内での
発現が細胞に、負の及び正の選択的利点を与える遺伝子及び遺伝子の組合せをも
いう。

【００２０】有意な増加：測定技術に固有の誤差の限度より大きい酵素活性の増加、好まし
くはインヒビターの存在下で野生型酵素の活性より約２倍又はそれ超の増加、よ
り好ましくは約５倍又はそれ超の増加、そして最も好ましくは約１０倍又はそれ
超の増加。有意な減少は、酵素反応の産物の量が測定技術に固有の誤差の限度より大きい
こと、好ましくはインヒビターの欠如下で野生型酵素の活性の約２倍又はそれ超
の減少、より好ましくは約５倍又はそれ超の減少、そして最も好ましくは約１０
倍又はそれ超の減少を意味する。

【００２１】その最も広い意味で、ヌクレオチド配列に関して本明細書で用いる用語“実質的に類似 ”は、対応する配列が引用ヌクレオチド配列によりコードされるポリペ
プチドと実質的に同じ構造及び機能を有するポリペプチドをコードする、引用ヌ
クレオチド配列に対応するヌクレオチド配列、例えば、ポリペプチド機能に影響
を与えないアミノ酸の変化のみがおこる場合を意味する。所望により、実質的に
類似するヌクレオチド配列は引用ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプ
チドをコードする。用語“実質的に類似”は、特に、特定の細胞において発現を
最適化するよう配列が改変されているヌクレオチド配列を含むことを意図する。
実質的に類似するヌクレオチド配列と引用ヌクレオチド配列の間の同一性の割合
は、必要に応じて、少くとも６５％、より好ましくは少くとも７５％、好ましく
は少くとも８５％、より好ましくは少くとも９０％、更により好ましくは少くと
も９５％、なお更により好ましくは少くとも９９％である。配列比較は、Ｓｍｉ
ｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ配列アラインメントアルゴリズムを用いて行う（例えば
Waterman, M.S, Introduction to Computational Biology : Maps, Sequence an
d genomes, Chapman & Hall. London ; 1995, ISBN 0-412-99391-0 又はhttp://
www-hto.usc.edu/software/seqaln/index-html）。ｌｏｃａｌＳプログラムバ
ージョン１．１６は、次のパラメータで用いる：match : 1, mismatch penalty
: 0.33, open-gap penalty : 2, extended-gap penalty : 2。引用ヌクレオチド
配列に“実質的に類似”するヌクレオチド配列は、引用ヌクレオチド配列に、５
０℃で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗って５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ₄ 、１mM ＥＤＴＡ中で、より好ましくは５
０℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗って、５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ₄ 、１mM ＥＤＴＡ中で、より好ましくは
、５０℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗って５０℃で７％ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ₄ 、１mM ＥＤＴＡ中で、好ましく
は５０℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗って、５０℃で７％ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ₄ 、１mM ＥＤＴＡ中で、より好
ましくは６５℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗って、５０℃で７％ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ₄ 、１mM ＥＤＴＡ中でハ
イブリダイズする。

【００２２】タンパク質に関して本明細書で用いる場合の用語“実質的に類似”は、そのタ
ンパク質が引用タンパク質と実質的に同じ構造及び機能を有する、引用タンパク
質に対応するタンパク質、例えばポリペプチド機能に影響を与えたいアミノ酸配
列の変化のみがおこる場合を意味する。タンパク質又はアミノ酸配列のために用
いる場合、実質的に類似する及び引用タンパク質又はアミノ酸配列の間の同一性
の割合は、好ましくは少くとも６５％、より好ましくは少くとも７５％、好まし
くは少くとも８５％、より好ましくは少くとも９０％、更により好ましくは少く
とも９５％、なお更により好ましくは少くとも９９％である。

【００２３】基質：基質は、酵素がその酵素が天然でその機能を行う生化学的経路において
認識し、産物に変換する分子であるか、又は酵素により認識され、天然の反応に
類似する酵素反応において酵素により産物に変換される分子の改変型である。耐性：ネイティブの改変していない植物の正常な生長及び機能を抑制するため
に十分な量でインヒビター又は除草剤に露出した時に正常な生長又は機能を続け
る能力。

【００２４】形質転換：異種ＤＮＡを細胞、組織、又は植物に導入するための方法。形質転
換細胞、組織、又は植物は、形質転換法の最終生成物ばかりでなく、そのトラン
スジェニック子孫も包含すると理解される。トランスジェニック：問題のＤＮＡ配列に作用可能に連結した好適なプロモー
ターを好ましくは含む組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換されたもの。

【００２５】配列表の配列の簡単な記載配列番号：１アラビドプシス４７８８遺伝子のゲノムＤＮＡ配列。配列番号：２アラビドプシス４７８８遺伝子のｃＤＮＡ配列。配列番号：３アラビドプシス４７８８タンパク質のアミノ酸配列。配列番号：４オリゴヌクレオチドＳＬＰ３４６ｆｏｒ。

【００２６】本発明の目的は、新規除草剤を同定するための有効かつ有益な方法を供するこ
とである。本発明の特徴は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけ
る推定上のパーミアーゼ遺伝子の同定である。本発明の別の特徴は、推定上のパ
ーミアーゼ遺伝子が実生の生長及び発達のために必須であるという発見である。
本発明の利点は、新しい除草剤の機能の態様を含む新しく発見された必須遺伝子
により、当業者が新規除草剤を容易かつ迅速に同定するのを可能にすることであ
る。

【００２７】本発明の１つの目的は、除草活性を有する阻害化合物のためのアッセイ開発の
ための植物における必須遺伝子を供することである。遺伝子学の結果は、推定上
のパーミアーゼ遺伝子がアラビドプシスにおいて変異されている場合、得られる
表現型はホモ接合状態で致死的な実生である。これは、変異した遺伝子によりコ
ードされる遺伝子産物についての重大な役割を示唆する。

【００２８】Ｔ−ＤＮＡ挿入変異誘発を用いて、本発明の発明者らは、その活性がアラビド
プシス実生において必須であることを証明した。これは、植物においてタンパク
質の機能を阻害する化学物質が植物に有害な効果を有するようであり、潜在的に
優れた除草候補であることを意味する。それゆえ、本発明は、そのインヒビター
を同定するために後述の遺伝子配列によりコードされる精製されたタンパク質を
用いる方法を供する。次にそれは、不要な植物の生長を抑制するために除草剤と
して、例えば作物が生長する土地、特に農業的に重要な作物、例えばトウモロコ
シ及び他の穀物、例えばコムギ、オート、ライムギ、ソルガム、コメ、オオムギ
、アワ、ターフ及び飼料の草等、並びにワタ、サトウキビ、シュガービート、ア
ブラナ、及びダイズが生長する土地において用いることができる。

【００２９】本発明は、４７８８遺伝子と呼ぶアラビドプシス由来の新規ヌクレオチド配列
を開示する。そのゲノムクローンのヌクレオチド配列を配列番号：１に示し、対
応するｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を配列番号：２に示し、そしてアラ
ビドプシス４７８８タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３に示す。本発明は
、配列番号：１及び配列番号：２に記載の配列に実質的に類似するヌクレオチド
配列も含む。本発明は、配列番号：１及び配列番号：２に記載の配列に実質的に
類似したヌクレオチド配列であって植物ヌクレオチド配列であるものも包含する
。配列番号：１及び配列番号：２に記載の配列に実質的に類似するヌクレオチド
配列であってアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）ヌクレオチド配列であるものが好ましい。

【００３０】更に、配列番号：１及び配列番号：２に記載の配列に実質的に類似するヌクレ
オチド配列であって、そのコードされるタンパク質がパーミアーゼ活性を有する
ものも包含される。配列番号：１及び配列番号：２に記載の配列に実質的に類似
するヌクレオチド配列であって、そのコードされるタンパク質がプリン又はピリ
ミジンパーミアーゼ活性を有するものがより好ましい。配列番号：１及び配列番
号：２に記載の配列に実質的に類似するヌクレオチド配列であって、そのコード
されるタンパク質がウラシルパーミアーゼ活性を有するものが特に好ましい。更
に配列番号：１又は配列番号：２に実質的に類似するヌクレオチド配列によりコ
ードされるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列が包含される。配列番号：１又は配
列番号：２によりコードされるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列も包含される。

【００３１】本発明は、そのアミノ酸配列が配列番号：３に記載のアミノ酸配列に実質的に
類似するタンパク質も包含する。配列番号：３を含むアミノ酸配列及びそれに実質的に類似するアミノ酸配列も
包含する。配列番号：３を含むアミノ酸配列及び配列番号：３であるアミノ酸配
列が好ましい。

【００３２】配列番号：１又は配列番号：２に実質的に類似するヌクレオチド配列によりコ
ードされるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列であって、そのタンパク質がパーミ
アーゼ活性を有するものを包含する。配列番号：１又は配列番号：２に実質的に
類似するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列
であって、そのタンパク質がプリン又はピリミジンパーミアーゼ活性を有するも
のがより好ましい。配列番号：１又は配列番号：２に実質的に類似するヌクレオ
チド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列であって、そのタ
ンパク質がウラシルパーミアーゼ活性を有するものが特に好ましい。

【００３３】配列番号：１又は配列番号：２によりコードされるアミノ酸配列の少くとも２
０の連続するアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を更に包含する。配列番号：３のアミノ酸配列の少くとも２０の連続するアミノ酸残基を含むア
ミノ酸配列を更に包含する。更なる実施形態は配列番号：１又は配列番号：２に実質的に類似するヌクレオ
チド配列に作用可能に結合したプロモーターを含むキメラ遺伝子である。

【００３４】更に、配列番号：１又は配列番号：２に実質的に類似するヌクレオチド配列に
作用可能に結合したプロモーターを含むキメラ遺伝子を含む組換えベクターであ
って宿主細胞に安定に形質転換され得るものを包含する。更に、配列番号：１又は配列番号：２に実質的に類似するヌクレオチド配列に
作用可能に結合したプロモーターを含むキメラ遺伝子を含むベクターを含む宿主
細胞であってそのベクターが宿主細胞に安定に形質転換することができ、そのヌ
クレオチド配列が前記細胞内で発現可能であるものを包含する。

【００３５】本発明による好ましい宿主細胞は真核生物細胞、より好ましくは、昆虫細胞、
イースト細胞、及び植物細胞からなる群から選択される宿主細胞である。更に好
ましい宿主細胞は原核生物細胞であり、細菌細胞がより好ましい。配列番号：１又は配列番号：２に実質的に類似するヌクレオチド配列に作用可
能に連結したプロモーターを含むキメラ遺伝子を含むベクターを含む植物であっ
て、そのベクターが植物細胞に安定に形質転換することができる植物も含み；ま
たその植物の子孫及び種子も含み、その種子は任意に処理され（例えばプライシ
ングされ又はコーティングされ）及び／又はパッケージングされ、例えば使用の
ための説明書と共にバッグ又は他の容器に入れられる。パーミアーゼ活性のイン
ヒビターに対して耐性である本発明による植物がより好ましく；その植物のため
の子孫及び種子も含み、その種子は、任意に、処理され（例えばプライシングさ
れ又はコーティングされ）及び／又はパッケージングされ、例えば使用のための
説明書と共にバッグ又は他の容器に入れられる。

【００３６】本発明の更なる実施形態は、変化したパーミアーゼ活性を有する遺伝子産物を
コードするヌクレオチド配列を生産するための方法であって、ａ）配列番号：１又は配列番号：２に実質的に類似するヌクレオチド配列をシ
ャッフリング（混合）し、ｂ)得られたシャッフル化ヌクレオチド配列を発現させ、そしてｃ）改変していないヌクレオチド配列の遺伝子産物のパーミアーゼ活性と比べ
て変化したパーミアーゼ活性について選択することを含む方法である。

【００３７】好ましいのは、ヌクレオチド配列が配列番号：１又は配列番号：２である本発
明による方法である。より好ましいのは、前記パーミアーゼ活性がプリン又はピ
リミジンパーミアーゼ活性である本発明による方法である。特に好ましいのは、
前記パーミアーゼ活性がウラシルパーミアーゼ活性である本発明による方法であ
る。

【００３８】更に本発明に含まれるのは、変化したパーミアーゼ活性を有する遺伝子産物を
コードするヌクレオチド配列を生産するための方法であって、ａ）配列番号：１又は配列番号：２に実質的に類似するヌクレオチド配列をシ
ャッフリングし、ｂ）得られたシャッフリングされたヌクレオチド配列を発現させ、そしてｃ）改変していないヌクレオチド配列の遺伝子産物のパーミアーゼ活性と比べ
て変化したパーミアーゼ活性について選択することを含む方法によって得ることができるシャッフリングされたＤＮＡ分子である。

【００３９】本発明の更なる実施形態は、本発明による方法により生産されるシャッフリン
グされたＤＮＡ分子である。また、本発明に含まれるのは、本発明による方法により得られるシャッフリン
グされたＤＮＡ分子であって、パーミアーゼ活性のインヒビターに対して増加し
た耐性を有する遺伝子産物をコードするものである。

【００４０】本発明の更なる実施形態は、本発明による方法により生産されたシャッフリン
グされたＤＮＡ分子に作用可能に連結したプロモーターを含むキメラ遺伝子であ
る。本発明の更なる実施形態は、本発明による方法により生産されたシャッフリン
グされたＤＮＡ分子に作用可能に連結したプロモーターを含むキメラ遺伝子を含
む組換えベクターであって、そのベクターが宿主細胞に安定に形質転換され得る
ものである。

【００４１】更に含まれるのは、前記方法により生産されるシャッフリングされたＤＮＡ分
子に作用可能に連結したプロモーターを含むキメラ遺伝子を含む特許請求の範囲
に記載のベクターを含む宿主細胞であって、そのベクターが宿主細胞に安定に形
質転換することができ、そのヌクレオチド配列が前記細胞内で発現可能であるも
のである。好ましいのは、真核生物細胞である本発明による宿主細胞であり、よ
り好ましくは前記細胞は、昆虫細胞、イースト細胞、及び植物細胞からなる群か
ら選択されるものである。

【００４２】また好ましいのは、原核生物細胞である本発明による宿主細胞であり、より好
ましくは、細菌細胞である本発明による宿主細胞である。更なる実質形態は、本発明による方法により生産されたシャッフル化ＤＮＡ分
子に作用可能に結合したプロモーターを含むキメラ遺伝子を含む本発明によるベ
クターを含む植物細胞であって、そのベクターが植物細胞に安定に形質転換する
ことができ、そのヌクレオチド配列が前記細胞内で発現可能である植物であり；
その植物のための子孫及び種子も含み、その種子は、任意に処理され（例えばプ
ライシングされ又はコーティングされ及び／又はパッケージングされ、例えば使
用のための説明書と共にバッグ又は他の容器に入れられる。

【００４３】更なる実質形態は、パーミアーゼ活性のインヒビターに対して耐性である本発
明による植物であり；またその植物のための子孫及び種子も含み、その種子は任
意に処理され（例えばプライシングされ又はコーティングされ）、及び／又はパ
ッケージングされ、例えば使用のための説明書と共にバッグ又は他の容器に入れ
られる。

【００４４】更なる実施形態は、除草活性を有する化合物を同定する方法であって、ａ）配列番号：１又は配列番号：２に実質的に類似するヌクレオチド配列によ
りコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質、及びそのタンパク質に結合する
能力についてテストすべき化合物を、結合に資する条件下で組み合わせ、ｂ）前記タンパク質に結合することができるステップ（ａ）で同定された化合
物を選択し、ｃ）ステップ（ｂ）で同定された化合物を除草活性についてテストすべき植物
に適用し、そしてｄ）除草活性を有する化合物を選択することを含む方法である。

【００４５】更に含まれるのは、本発明による方法により同定することができる除草活性を
有する化合物である。更に含まれるのは除草活性を有するパーミアーゼ活性のインヒビターを同定す
る方法であって、ａ）パーミアーゼ及び該パーミアーゼの活性を阻害する能力についてテストす
べき化合物を、その阻害に資する条件下で組み合わせ、ｂ）前記パーミアーゼ活性を阻害することができるステップ（ａ）で同定され
た化合物を選択し、ｃ）ステップ（ｂ）で同定された化合物を除草活性についてテストすべき植物
に適用し、そしてｄ）除草活性を有する化合物を選択することを含む方法である。

【００４６】本発明により含まれるのは、前記パーミアーゼがプリン又はピリミジンパーミ
アーゼである、より好ましくは前記パーミアーゼがウラシルパーミアーゼである
本発明による方法である。本発明の更なる実施形態は、本発明による方法により同定することができる除
草活性を有する化合物である。

【００４７】更なる実施形態は、パーミアーゼ活性のインヒビターを同定する方法であって
、ａ）配列番号：１もしくは配列番号：２又はそれに実質的に類似するヌクレオ
チド配列を、パーミアーゼ欠損宿主細胞、例えば大腸菌ｕｒａＡに、前記配列が
機能的に発現可能であるように導入し；ｂ）前記ヌクレオチド配列を含む宿主細胞を最小阻害濃度の５−フルオロウラ
シルと、及び前記パーミアーゼの活性を阻害する能力についてテストすべき化合
物と、その阻害に資する条件下で組み合わせ；ｃ）ステップ（ｂ）の条件下で宿主細胞生長を測定し；そしてｄ）ステップ（ｃ）で宿主細胞生長を阻害する前記化合物を選択することを含む方法である。

【００４８】更に含まれるのは、本発明による方法により同定可能な除草活性を有する化合
物である。更に含まれるのは、植物の生長を抑制するための方法であって、前記植物に、
配列番号：１又は配列番号：２に実質的に類似するヌクレオチド配列によりコー
ドされるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列の活性を阻害する化合物を、前記植物
の生長を抑制するのに十分な量で適用することを含む方法である。

【００４９】更に含まれるのは、除草活性を有する化合物を同定する方法であって、ａ）請求項１０のタンパク質及びそのタンパク質に結合する能力についてテス
トすべき化合物を、結合に資する条件下で組み合わせ、ｂ）そのタンパク質に結合することができるステップ（ａ）で同定された化合
物を選択し、ｃ）ステップ（ｂ）で同定された化合物を除草活性についてテストすべき植物
に適用し、そしてｄ）除草活性を有する化合物を選択することを含む方法、及び本発明による方法により同定することができる除草活性を有す
る化合物である。

【００５０】更に含まれるのは、本発明による植物又は種子からなる群から選択されるパー
ミアーゼのンヒビターに対して耐性である除草剤耐性植物又は種子に、除草活性
を有する本発明による化合物を、除草剤耐性植物又は種子の生長を有意に抑制す
ることなく不要な植物の生長を阻害する量で適用することを含む方法である。本発明は、正常な生長及び発達のための遺伝子の本質性に基づき、除草剤標的
として４７８８遺伝子産物を用いる方法も含む。更に、本発明は、潜在的な除草
剤であるインヒビターを同定するためにスクリーニングアッセイに用いることが
できる。

【００５１】別の好ましい実施形態において、本発明は、植物において４７８８活性を阻害
する能力を有する化学物質を同定するための方法であって、ａ）４７８８活性を
有する酵素をコードする非ネイティブヌクレオチド配列を含み、酵素的に活性な
４７８８遺伝子産物を過剰発現することができる好ましくは安定に形質転換され
たトランスジェニック植物、植物組織、植物種子又は植物細胞を得て；ｂ）その
トランスジェニック植物、植物細胞、組織もしくは部分に、又はアイソジェニッ
ク非形質転換植物、植物細胞、組織又は部分に化学物質を適用し；ｃ）化学物質
の適用後のトランスジェニック及び非形質転換植物、植物細胞、組織の生長又は
生存性を決定し；ｄ）化学物質の適用後にトランスジェニック及び非形質転換植
物、植物細胞、組織を比較し；そしてｅ）アイソジェニックトランスジェニック
植物、植物細胞、組織又は部分の生存性又は生長を有意に抑制することなく、非
トランスジェニック植物、植物細胞、組織の生存性又は生長を抑制する化学物質
を選択するステップを好ましくは含む方法を記述する。好ましい実施形態におい
て、４７８８活性を有する酵素は植物、好ましくはアラビドプシス・タリアナ由
来のヌクレオチド配列によりコードされ、必要に応じて、配列番号：１又は配列
番号：２に記載のヌクレオチド配列と同一又は実質的に類似する。別の実施形態
において、４７８８活性を有する酵素は、配列番号：３のアミノ酸配列をコード
し得るヌクレオチド配列によりコードされる。更に別の実施形態において、４７
８８活性を有する酵素は、配列番号：３に記載のアミノ酸配列と同一又は実質的
に類似のアミノ酸配列を有する。

【００５２】本発明は、更なる実施形態において、改変された４７８８活性を有し、それゆ
え天然の４７８８活性に対して通常に阻害するレベルでの除草剤による阻害に対
して耐性である植物、植物組織、及び植物細胞であり；その植物の子孫及び種子
も含み、ここで種子は任意に処理され（例えばプライシング又はコーティングさ
れ）及び／又はパッケージングされ、例えば使用のための説明書と共にバッグ又
は他の容器に入れられる。本発明に包含される除草剤耐性植物は、さもなければ
除草剤を通常、阻害するための潜在的な標的になるであろうもの、特に農業的に
重要な上述の作物を含む。この実施形態によれば、植物、植物組織、植物種子、
又は植物細胞は、野生型の未修飾の４７８８遺伝子産物の活性を通常、阻害する
であろう濃度での除草剤による阻害に対して耐性である改変４７８８遺伝子をコ
ードするヌクレオチドコーディング配列に作用可能に結合した植物において機能
する好適なプロモーターを含む組換えＤＮＡ分子で形質転換され、好ましくは安
定に形質転換される。改変された４７８８活性は、野生型４７８８遺伝子の多重
コピーを植物に供することにより、又は野生型より強力なプロモーターの制御下
での野生型４７８８遺伝子の過剰発現により野生型除草剤感受性４７８８タンパ
ク質の発現を増加させることによっても植物に与えることができる。次に、これ
により形成されたトランスジェニック植物、植物組織、植物種子、又は植物細胞
は、慣用的な選択技術により選択され、それにより除草剤耐性系が単離され、キ
ャラクタライズされ、そして開発される。あるいは、除草剤耐性系を作り出すた
めにランダム又は部位特異的変異誘発を用いることができる。

【００５３】それゆえ、本発明は、４７８８活性を有する酵素をコードする植物から単離さ
れたヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子で形質転換された植物、植物細胞、又は
植物組織を供し；またその植物のための子孫及び種子を含み、その種子は、任意
に処理され（例えばプライシングされ又はコーティングされ）及び／又はパッケ
ージングされ、例えば使用のための説明書と共にバッグ又は他の容器内に入れら
れる。ここで、前記酵素は４７８８活性を有し、前記ＤＮＡ分子は、天然の４７
８８活性を通常、阻害する量で、除草剤に対する耐性を、植物、植物細胞、植物
種子、又は植物組織に与える。この実施形態の一例によれば、４７８８活性を有
する酵素は、配列番号：１又は配列番号：２に示すヌクレオチド配列と同一又は
実質的に類似するヌクレオチド配列によりコードされるか、又は配列番号：３に
記載のアミノ酸配列と同一又は実質的に類似のアミノ酸配列を有する。

【００５４】本発明は、植物において天然の４７８８活性を阻害する化学物質を植物に適用
するステップを含む植物の生長を抑制するための方法も供する。関連する態様に
おいて、本発明は、定植した作物種子の作物又は植物を含む土地における不要な
植物の生長を選択的に抑制するための方法であって、（ａ）天然の４７８８活性
を阻害する除草剤に対して耐性である植物又は植物種子である除草剤耐性作物又
は作物種子を任意に定植し；そしてその土地における作物又は作物種子及び不要
な植物に、除草剤を、天然の４７８８活性を阻害する量で適用することを含み、
ここでその除草剤が作物の生長を有意に抑制することなく雑草の生長を抑制する
方法に関する。

【００５５】本発明の他の目的及び利点は、以下の本発明の記載及び非限定的例の研究から
、当業者に明らかになるであろう。Ｉ．Ｔ−ＤＮＡ挿入変異誘発により証明されるアラビドプシスにおける４７８
８遺伝子の不可欠性以下の例に示されるように、新規遺伝子構造の同定及び正常な植物生長及び発
達のための４７８８遺伝子の不可欠性は、最初に、Ｔ−ＤＮＡ挿入変異誘発を用
いてアラビドプシスにおいて証明されている。植物において４７８８機能の不可
欠性を確立し、この必須活性をコードする遺伝子を同定することにより、本発明
者らは新しい除草剤開発のための重要かつ需要のあるツールを供する。

【００５６】実生致死変異について分離したアラビドプシス挿入変異体系を、必須タンパク
質の同定における最初のステップとして同定する。ゲノム内にＴ−ＤＮＡ挿入を
含む単一Ｔ１植物から収集したＴ２種子で始めて、ホモ接合実生致死実生から分
離したこれらの系を同定する。これらの系は、種子を、殺真菌剤ベノミル及びマ
キシムを含む最小植物生長培地に入れ、室温で光の中で７〜１４日間後に生存不
可能な実生についてスクリーニングすることにより見い出される。生存不能な表
現型は、変化した色又は変化した形態を含む。これらの表現型は、プレート上に
直接、又は実生の移植後に土において観察される。

【００５７】系が実生致死を分離するものとして同定される場合、Ｔ−ＤＮＡ内の耐性マー
カーがその致死性と共に同じ分離されるか否かを決定する（Errampaltiら（1991
) The Plant Cell, 3 : 149-157)。同時分離分析を、種子を選択剤を含む培地に
入れ、そしてその剤に対する耐性又はセンシティビティーについて実生をスコア
リングすることにより行う。用いる選択剤の例はヒグロマイシン又はホスフィノ
トリシンである。約３５の耐性実生を土に移植し、それらの子孫を実生致死の分
離について検査する。Ｔ−ＤＮＡ挿入が必須遺伝子を破壊する場合、各々の植物
に耐性表現型及び実生致死表現型の同時分離がある。それゆえ、このような場合
、全ての耐性植物は次の世代で実生致死を分離し；この結果は、耐性植物の各々
が両方の表現型を引きおこすＤＮＡについてヘテロ接合であることを示す。

【００５８】Ｔ−ＤＮＡ耐性マーカー及び実生致死表現型の同時分離を示すこれらの系につ
いて、各々の挿入の分子の性質のキャラクタリゼーションにおける最初のステッ
プとしてサザン分析を行う。サザン分析は、ヘテロ接合体から単離したゲノムＤ
ＮＡと共に、Ｔ−ＤＮＡベクターＤＮＡとハイブリダイズすることができるプロ
ーブを用いて行う。しばしば、所定の植物におけるＴ−ＤＮＡ挿入は、単一ゲノ
ム座に挿入されたＴ−ＤＮＡの多重コピーを含むことが示される。サザン分析の
結果を用いて、Ｔ−ＤＮＡ挿入の一方又は両方の側に隣接するアラビドプシスゲ
ノムＤＮＡを分子的にクローン化するために、プラスミドレスキューを行うため
に好適な制限酵素が選択される。この方法で得られたプラスミドは、それらの消
化パターンに基づいてプラスミドをクラスに分類するために制限酵素消化によっ
て分析される。各々のクラスのプラスミドクローンのために、ＤＮＡ配列が決定
される。得られた配列は、非Ｔ−ＤＮＡベクター配列の存在について分析される
。このような配列が見い出される場合、それらは、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２
プログラムを用いて、ＤＮＡ及びタンパク質データベースを調査するために用い
られる（Altschulら（1990), J. Mol. Biol. 215 : 403-410 ; Altschul ら（19
97) Nucleic Acid Res 25 : 3389-3402 ）。各々の遺伝子についての更なるゲノ
ム及びｃＤＮＡ配列は、標準的分子生物学手順によって同定される。

【００５９】 II．アラビドプシス４７８８遺伝子の配列アラビドプシス４７８８遺伝子は、タグ化実生致死系＃４７８８からＴ−ＤＮ
Ａボーダーに隣接するＤＮＡを単離することにより配列決定される。Ｔ−ＤＮＡ
ボーダーに隣接するアラビトプシスＤＮＡは、アラビドプシスの配列決定された
ＢＡＣの内部領域（ＢＡＣＴ９Ｊ２２、染色体２）と同一である。このＢＡ
Ｃクローンは、１１５，８５１bpの配列を含み、その極めて小さな部分は４７８
８遺伝子を含む、ゲノム領域に対応する。ＢＡＣ情報にかかわらず、本発明者ら
は、最初に、全体の遺伝子配列を明確に確立し、その４７８８遺伝子産物が正常
な生長及び発達のために必須であることを最初に証明し、その４７８８遺伝子産
物の機能を定義する。本発明は、アラビドプシス４７８８遺伝子のヌクレオチド
配列及びアラビドプシス４７８８タンパク質のアミノ酸配列を開示する。そのゲ
ノムクローンに対応するヌクレオチド配列を配列番号：１に示し、対応するクロ
ーンを配列番号：２に示し、そしてその成熟タンパク質をコードするアミノ酸配
列を配列番号：３に示す。本発明は、植物由来の単離されたアミノ酸配列であっ
て、そのアミノ酸配列が配列番号：１又は配列番号：２に示すヌクレオチド配列
によりコードされるアミノ酸配列と同一又は実質的に類似し、そのアミノ酸配列
が４７８８活性を有するアミノ酸配列も包含する。デフオルトセッティングでＢ
ＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２プログラムを用いて、４７８８遺伝子の配列はウラシ
ルパーミアーゼとの類似性を示す。

【００６０】４７８８遺伝子は、アラビドプシスにおける遺伝子ファミリーのメンバーでも
ある。この遺伝子ファミリーは、少くとも６のメンバーからなる（Genbank Acc.
#s:AC002505 (2739376), BAC T9J22;AC004481 (3337350), BAC F13P17;AC001229
(2190545), BAC F5I14;AB009053 (n/a), clone MQB2 (13^th ORF);U83501 (1791
307)；及びAA712474 (EST clone 194H6T7)並びにAA605567 (EST clone 205J16XP
））。

【００６１】 III ．４７８８の組換え生産及びその使用宿主生物における４７８８の組換え生産のため、４７８８タンパク質をコード
するヌクレオチド配列を、選択された宿主のためにデザインした発現カセットに
挿入し、それが組換え生産される宿主に導入する。選択された宿主のために適し
た特定の調節配列、例えばプロモーター、シグナル配列、５’及び３’非翻訳配
列、並びにエンハンサーは当業者の範囲内である。正確な読み枠内で作用可能に
結合した個々の因子を含む得られた分子は、宿主細胞に形質転換することのでき
るベクターに挿入することができる。タンパク質の組換え生産のための好適な発
現ベクター及び方法は、宿主細胞、例えば大腸菌、イースト、及び昆虫細胞（例
えば、Luckow及びSummers, Bio/Technol. 6 : 47 (1988))、並びにバキュロウイ
ルス発現ベクター、例えばオートグラフィカ・カリホルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多核体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）のゲ
ノム由来のものについて公知である。好ましいバキュロウイルス／昆虫系は、直
鎖オートグラファ・カリホルニカバキュロウイルスＤＮＡ（Pharmigen, San Die
go, CA）の存在下でソドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ）をトランスフェクトするのに用いるｐ
ＡｃＨＬＴ（Pharmingen, San Diego, CA ）である。得られたウイルスは、Ｈｉ
ｇｈＦｉｖｅＴｒｉｃｏｐｌｕｓｉａｎｉ細胞（Invitrogen, La Jolla,
CA）に感染させるのに用いられる。

【００６２】好ましい実施形態において、４７８８活性を有するタンパク質をコードするヌ
クレオチド配列は、真核生物、例えば哺乳動物、ハエ又はイーストから得られる
が、好ましくは植物から得られる。更に好ましい実施形態において、ヌクレオチ
ド配列は配列番号：１もしくは配列番号：２に示すヌクレオチド配列と同一もし
くは実質的に類似であるか、又はそのアミノ酸が配列番号：３に示すアミノ酸配
列と同じもしくは実質的に類似である４７８８活性を有するタンパク質をコード
する。配列番号：２に示すヌクレオチド配列は、そのアミノ酸配列が配列番号：
３に示されるアラビドプシス４７８８タンパク質をコードする、別々の好ましい
実施形態において、ヌクレオチド配列は、原核生物、好ましくは細菌から得られ
、例えば大腸菌中のｕｒａＡ遺伝子（Andersenら（1995) J. Bacteriol. 177 :
2008-2013)である。組換え生産された４７８８は単離され、種々の標準的技術を
用いて精製される。用いることができる実際の技術は、用いる宿主細胞、タンパ
ク質が分泌のためにデザインされているか否か、及び当業者に知られた他の同様
の因子に依存して種々であろう（例えばAusubel, F.ら、“Current Protocols i
n Molecular Biology”, pub by John Wiley & Sons, Inc. (1994) のchapter 1
6を参照のこと）。

【００６３】４７８８タンパク質をキャラクタライズするためのアッセイ組換え生産された４７８８タンパク質は、種々の目的のために役立つ。例えば
、それらは、その標的が４７８８を阻害するか否かを決定するよう同定されてい
ない周知の除草化学物質をスクリーニングするために試験管内アッセイで用いる
ことができる。このような試験管内アッセイは、このような酵素活性を阻害し、
それゆえ新規除草剤候補である化学物質を同定するためにより一般的なスクリー
ンとして用いることもできる。あるいは、組換え生産された４７８８タンパク質
は、これらの分子の複合構造を解明するため並びに新規阻害性除草剤及び酵素の
除草剤耐性型を合理的にデザインするために周知のインヒビターとのそれらの関
連性を更にキャラクタライズするために用いることができる。微生物源を含むい
ずれかのソースからの配列番号：１又は配列番号：２に実質的に類似するヌクレ
オチド配列及び配列番号：３に実質的に類似するタンパク質は、本明細書に例示
されるアッセイに用いることができる。必要に応じて、このようなヌクレオチド
配列及びタンパク質は、植物から得られる。より好ましくは、それらは双子葉植
物から得られる。あるいは、これらのヌクレオチド配列及びタンパク質は、非ト
ウモロコシ源、あるいは非単子葉植物源から得られる。

【００６４】パーミアーゼ活性のためのアッセイ４７８８遺伝子産物は、パーミアーゼ、より詳しくはトウモロコシＬｐｅｌタ
ンパク質に類似するウラシルパーミアーゼ（Schultesら（1996) The Plant Cell
, 8 : 463-475)として機能すると思われる。トウモロコシの葉パーミアーゼ１遺
伝子産物は細菌及び真菌からのプリン及びピリミジンパーミアーゼと類似性を有
することが知られており、ｌｐｅｌ内の変異はクロロプラストの発達に悪影響を
与えることが知られている。それゆえ、ｌｐｅｌコード化タンパク質は潜在的な
除草剤標的であり、それは、更に、アラビドプシス４７８８遺伝子産物の不可欠
性の本明細書での証明により支持される。対応する活性を欠如する細菌宿主中の
植物タンパク質の発現に基づいて新規アッセイを開発することができる（Anders
enら（1995) J. Bacteriol. 177 : 2008-2013)。

【００６５】植物によりコードされた活性の正常な機能に影響を与える化合物についてスク
リーニングするために簡単なアッセイを開発することができる。このような化合
物は、生体内除草剤活性についてテストすることができる試験管内テード化合物
を約束する。１つのアッセイは、４７８８遺伝子を有し、それを機能的に発現す
る大腸菌ｕｒａＡを、最小培地中で、最小阻害濃度の５−フルオロウラシルの存
在下で増殖させることからなる。これは、自動化高スループットスクリーニング
のための９６ウェル形態で行われる。４７８８タンパク質の機能をブロックする
のに有効である化合物は、細胞が５−ＦＵを摂取する能力を阻害し、細菌増殖が
おこる。この増殖は、簡単な比濁法によって測定される。

【００６６】対応する細菌変異体における植物遺伝子に基づく他のアッセイが記載されてい
る。しかしながら、新規除草剤標的であることに加えて、このアッセイの特定の
利点は、ウラシルパーミアーゼは細胞表面上で発現されるので、その機能を阻害
するのに有効である化合物がそれらの活性のために細胞に浸透する必要がないこ
とである。これは、植物において有効であろう化合物を見い出すためのモデルと
して細菌システムを用いる主な問題であり得る。なぜなら多くの潜在的な除草剤
が細菌による化合物の乏しい摂取のため細菌への活性を欠如することが知られて
いるからである。

【００６７】試験管内インヒビターアッセイ：未知の機能のタンパク質と相互作用する小分
子リガンドの発見タンパク質が潜在的な除草標的として同定されたら、次のステップは、そのタ
ンパク質と相互作用するか否かを決定するために多数の化学物質をスクリーニン
グすることを許容するアッセイを開発することである。周知の機能のタンパク質
のためのアッセイを開発することは簡単であるが、未知の機能のタンパク質での
アッセイを開発するのはより難しい。

【００６８】この問題に対応するために、タンパク質の生物学的機能を知ることなくタンパ
ク質とリガンドとの間の相互作用を検出することができる新しい技術を検査する
。蛍光補正分光法、表面増強レーザー脱着／イオン化法、及びｂｉａｃｏｒｅ技
術を含む３つの方法の短い記載を供する。より多くのこれらの方法が発見されて
おり、いくつかは、この開示の範囲内で自動化大規模スクリーニングに受け入れ
られ得る。

【００６９】蛍光補正分光法（ＦＣＳ）理論は、１９７２年に開発されたが、ＦＣＳを行う
技術が利用できるようになったのは近年になってからである（Madge ら（1972).
Phys. Rev. Lett., 29 : 705-708 ; Maiti ら（1997) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 94 : 11753-11757）。ＦＣＳは、小さなサンプル容量内の蛍光分子の平均
拡散率を測定する。そのサンプルサイズは、１０³ 蛍光分子程度の低さであり得
、サンプル容量は単一細菌の細胞質程度の小ささである。その拡散率は、分子の
質量の関数であり、質量が増加すると減少する。それゆえ、ＦＣＳは、質量の変
化、それゆえ結合による分子の拡散率を測定することによりタンパク質−リガン
ド相互作用分析に適用することができる。

【００７０】表面増強レーザー脱着／イオン化（ＳＥＬＤＩ）は、Hutchens and Yibにより
１９８０年代後期に発明された（Hutchens and Yib (1993) Rapid Commun. Mass
Spectrom. 7 : 576-580）。飛行時間質量分析（ＴＯＦ）と組み合わせる場合、
ＳＥＬＤＩは、チップ上に保持された分子を迅速に分析する手段を供する。それ
は、そのチップ上の標的タンパク質に共有結合することによりリガンド−タンパ
ク質相互作用分析に適用することができ、このタンパク質により保持された小分
子をＭＳにより分析することができる（Worrall ら（1998) Anal. Biochem. 70
: 750-756 ）。

【００７１】Ｂｉａｃｏｒｅは、層上に固定されたタンパク質へのリガンドの結合による表
面層における屈折率の変化に依存する。このシステムにおいて、小さなリガンド
の収集は、固定化タンパク質と共に２〜５μＬセルに連続的に注入される。結合
は、表面から屈折するレーザー光を記録することにより、表面プラスチン共鳴（
ＳＰＲ）によって検出される。一般に、表面層での質量濃度の所定の変化につい
ての屈折率変化は、実際に、全てのタンパク質及びペプチドについて同じであり
、単一の方法でいずれのタンパク質のための適用可能である（Liedbergら（1983
) Sensors Actuators. 4 : 299-304 ; Malmquist (1993) Nature, 361 : 186-18
7)。

【００７２】 IV．生体内インヒビターアッセイ一実施形態において、推測される除草剤、例えば試験管内スクリーニングによ
り同定されるものは、種々の濃度で植物に適用される。その推測される除草剤は
、好ましくは、植物に噴霧される。推測される除草剤の適用の後、その植物への
効果、例えば死又は生長の抑制が記録される。

【００７３】別の実施形態において、４７８８活性のインヒビターのための生体内スクリー
ニングアッセイは、４７８８活性を有するヌクレオチド配列を過剰発現すること
ができるトランスジェニック植物、植物組織、植物種子又は植物細胞を用いる。
ここで、４７８８遺伝子産物は、トランスジェニック植物、植物組織、植物種子
又は植物細胞において酵素的に活性である。ヌクレオチド配列は、好ましくは、
真核生物、例えばイーストから得られるが、好ましくは、植物から得られる。更
に好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号：１もしくは配列
番号：２に示すヌクレオチド配列と同一又は実質的に類似するか、又は４７８８
活性を有する酵素をコードする。そのアミノ酸配列は、配列番号：３に示すアミ
ノ酸配列と同一又は実質的に類似する。別の好ましい実施形態において、ヌクレ
オチド配列は原核生物、好ましくは細菌、例えば大腸菌のｕｒａＡ遺伝子から得
られる。

【００７４】次に、化学物質が、トランスジェニック植物、植物組織、植物種子又は植物細
胞に、及びアイソジェニック植物、植物組織、植物種子又は植物細胞に適用され
、そしてトランスジェニック及び非形質転換植物、植物組織、植物種子又は植物
細胞の生長又は生存能が、化学物質の適用後に決定され、比較される。非トラン
スジェニック植物の生長を阻害することができるが、トランスジェニック植物の
生長に影響を与えない化合物が、４７８８活性の特定のインヒビターとして選択
される。

【００７５】Ｖ．除草剤耐性植物本発明は、更に、これらの植物において天然の４７８８活性を阻害する除草剤
に対して耐性である植物、植物組織、植物種子、及び植物細胞であって、その耐
性が変化した４７８８活性によって与えられるものに関する。変化した４７８８
活性は、植物に更なる野生型４７８８遺伝子を供することにより、植物において
改変された除草剤耐性４７８８遺伝子を発現させることにより、又はこれらの技
術を組み合わせることにより、野生型除草剤感受性４７８８の発現を増加させる
ことにより本発明による植物に与えることができる。代表的な植物は、それらの
通常、意図した目的のためにこれらの除草剤が適用されるいずれの植物をも含む
。好ましいのは、農業的に重要な作物、例えば綿、ダイズ、アブラナ、シュガー
ビート、トウモロコシ、コメ、コムギ、オオムギ、オート、ライムギ、ソルガム
、穀類（キビ）、ターフ、かいば、４−フブラス等がある。

【００７６】Ａ．野生型４７８８の発現の増加発現の増加を介して４７８８活性の変化を行うと、除草剤により引きおこされ
る生長阻害を克服するのに少くとも十分な植物細胞中の４７８８のレベルが生ず
る。発現した酵素のレベルは、一般に、ネイティブで発現する量の少くとも２倍
、好ましくは少くとも５倍、そしてより好ましくは少くとも１０倍である。発現
の増加は、野生型４７８８遺伝子の多重コピー；遺伝子内のコーディング配列の
多重発生又は植物細胞内での内在性遺伝子の非コーディング調節配列中の突然変
異のためであり得る。このような変化した遺伝子活性を有する植物は、当業界で
知られた方法（例えば米国特許第５，１６２，６０２号及び米国特許第４，７６
１，３７３号及びそれらの引用文献を参照のこと）により植物における直接的選
択によって得ることができる。これらの植物は、当業界で知られた遺伝子操作技
術によって得ることもできる。除草剤感受性４７８８遺伝子の発現の増加した植
物４７８８タンパク質をコードする相同又は非相同構造遺伝子に作用可能に結合
した植物細胞内で関連する構造遺伝子の発現を駆動することができるプロモータ
ーを含む細胞を組換え又はキメラＤＮＡ分子で形質転換することによって達成す
ることもできる。好ましくは、形質転換は安定であり、それにより遺伝性のトラ
ンスジェニック特質を供する。

【００７７】Ｂ．改変除草剤耐性４７８８タンパク質の発現この実施形態によれば、植物、植物組織、植物種子、又は植物細胞は、４７８
８の除草耐性をコードするコーディング配列に作用可能に結合した植物中で機能
的である好適なプロモーターを含む組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換される。
その酵素の除草剤耐性型は、その酵素の非修飾の天然型を阻害する除草剤に対す
る耐性を与える少くとも１のアミノ酸置換、付加又は欠失を有する。次にこれに
より形成されたトランスジェニック植物、植物組織、植物種子、又は植物細胞は
、慣用的な選択技術によって選択され、それにより除草剤耐性系が単離され、キ
ャラクタライズされ、そして開発される。以下に４７８８の除草剤耐性型をコー
ドする遺伝子を得るための方法を記載する：１つの一般的なストラテジーは、微生物での直接的又は間接的変異誘発に関す
る。例えば、遺伝子操作できる微生物、例えば大腸菌又はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅは、変異誘発原、例えばＵＶ光又はエチルもしくはメチルメタンスルホネー
トでの生体内ランダム変異誘発にかけることができる。変異誘発手順は、例えば
、Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laborato
ry, Cold Spring Harbor, NY (1972) ; Davis et al., Advanced Bacterial Gen
etics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980) ; Sh
erman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, NY (1983) ; 及び米国特許第４，９７５，３７４号に記載
される。変異誘発のために選択された微生物は通常のインヒビター感受性４７８
８遺伝子を含み、この遺伝子により与えられる活性に依存する。その変異誘発し
た細胞は、非改変遺伝子を阻害する濃度でインヒビターの存在下で成長させる。
インヒビターの存在下で非変異誘発微生物よりよく成長する（即ちインヒビター
に対する耐性を示す）変異誘発した微生物のコロニーは、更なる分析のために選
択される。これらのコロニーからの４７８８遺伝子は、クローニングにより又は
ＰＣＲ増幅により単離され、それらの配列が解明される。次に、変化した遺伝子
産物をコードする配列がそれらのインヒビター耐性を与える能力を確認するため
に微生物にもどしてクローン化される。

【００７８】植物４７８８遺伝子の変異体除草剤耐性対立遺伝子を得る方法は、植物により
なる直接的選択に関する。例えば、アラビドプシス、ダイズ、又はトウモロコシ
のような植物の生長インヒビターへの変異誘発した４７８８遺伝子の効果は、増
加する濃度のインヒビターを含む単純最小塩培地でのプレートでの当業界で認め
られた方法により滅菌された種子をプレーティングすることにより決定される。
このような濃度は、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０
．３、１、３、１０、３０、１１０、３００、１０００及び３０００パーツ・パ
ーミリオン(ppm）の範囲である。有意な生長阻害を再現可能に検出することがで
きる最も少い投与量が後の実験のために用いられる。最も低い投与量の決定は当
業界で慣用的である。

【００７９】植物材料の変異誘発は、選択された集団において耐性対立遺伝子が発生する頻
度を増加させるために利用される。変異誘発された種子材料は、化学もしくは物
理的変異誘発もしくは種子、又は化学もしくは物理的変異誘発もしくは花粉を含
む種々のソースから得られ（Neuffer In Maize for Biological Research Sheri
dan, ed. Univ. Press. Grand Forks, ND., pp.61-64 (1982)）、それは次に、
植物を受精させるために用いられ、得られたＭ₁ 変異体種子が収集される。アラ
ビドプシスを例にとると、化学物質、例えばエチルメタンスルホネートで、又は
物理的剤、例えばガンマ線もしくは高速中性子で変異誘発された種子から生長し
た植物の子孫種子であるＭ₂ 種子（Lehle Seeds, Tucson, AZ)は、耐性について
選択するために好適な濃度のインヒビターを含む最小塩培地上で１０，０００種
子／プレート（１０cm直径１までの密度でプレートされる。成長を続け、プレー
ティング後７〜２１日間、緑色であり続ける実生は土に移植され、成熟して種子
をつけるまで生長させる。これらの種子の子孫は、除草剤に対する耐性について
テストされる。その耐性特質が優性であるなら、その種子が３：１／耐性：感受
性に分離する植物は、Ｍ₂ 世代で耐性についてヘテロ接合であると推定される。
全て耐性種子を生ずる植物は、Ｍ₂ 世代で耐性についてホモ接合であると推測定
される。このような完全な種子での突然変異誘発及びそれらのＭ₂ 子孫種子のス
クリーニングは、他の種、例えばダイズで行うこともできる（例えば米国特許第
５，０８４，０８２号を参照のこと）。あるいは、除草剤耐性についてスクリー
ニングするべき変異体種子は、化学又は物理的手段により変異誘発された花粉で
の受精の結果として得られる。

【００８０】除草剤耐性の遺伝子ベースか４７８８遺伝子であるという確認は、以下の例の
ように確認される。最初に、インヒビターに対して耐性を示す植物からの４７８
８遺伝子の対立遺伝子は、配列番号：２に示すアラビドプシスｃＤＮＡコーディ
ング配列に基づく、又はより好ましくは耐性対立遺伝子を生成するために用いら
れる植物からの変化していない４７８８遺伝子配列に基づくプライマーでのＰＣ
Ｒを用いて単離される。コーディング配列内の変異の存在を決定するために対立
遺伝子をスクリーニングした後、その対立遺伝子は、推定上の耐性を与える対立
遺伝子が形質転換されている植物にインヒビターに対する耐性を与える能力につ
いてテストされる。これらの植物は、アラビドプシス植物又はその生長が４７８
８インヒビターに対して感受性であるいずれかの他の植物であり得る。第２に、
その挿入された４７８８遺伝子は、周知の制限フラグメント長多形性（ＲＦＬＰ
ｓ）に対してマッピングされる（例えば、Chang et al. Proc. Natl. Acad, Sci
, USA 85 : 6856-6860 (1988) ; Nam et al., Plant Cell 1 : 699-705 (1989),
cleaved amplified polymorphic sequences (CAPS) (Konieczny and Ausubel (
1993) The Plant Journal, 4 (2) : 403-410) 、又はSSLPs (Bell and Ecker (1
994) Genomics, 19 : 137-144 を参照のこと）。４７８８インヒビター耐性特性
は、同じマーカーを用いて独立してマッピングされる。耐性が４７８８遺伝子の
変異による場合、耐性特性は４７８８遺伝子の位置と区別できない位置にマッピ
ングされる。

【００８１】４７８８遺伝子の除草剤耐性対立遺伝子を得る別の方法は、植物細胞培養にお
ける選択による。植物組織の外植片、例えば胚、葉ディスク等又は問題の植物の
活性に生長するカルス又は懸濁培養物は、研究室環境に用いるために適した阻害
性除草剤又はアナログインヒビターの増加濃度の存在下での培地で生長させる。
種々の程度の生長が異なる培養で記録される。特定の培養において、通常の阻害
濃度のインヒビターの存在下でさえ生長し続ける迅速生長変異体コロニーが生ず
る。このような迅速に生長する変異体が発生する頻度は、その組織又は細胞をイ
ンヒビターに露出する前に化学的又は物理的変異誘発原での処理により増加させ
ることができる。４７８８遺伝子の推定上の耐性を与える対立遺伝子は先のパラ
グラフに記載されるように単離され、テストされる。除草剤耐性を与えるとして
同定されたこれらの対立遺伝子は、次に、最適な発現のために操作し、植物に形
質転換することができる。あるいは、植物は、これらの対立遺伝子を含む組織又
は細胞培養物から再生することができる。

【００８２】なお別の方法は、細菌又はイースト中の野生型除草剤感受性植物４７８８遺伝
子の変異誘発、次の阻害濃度のインヒビターを含む培地上での微生物の培養及び
次のインヒビターの存在下で生長するこれらのコロニーの選択に関する。より詳
しくは、植物ｃＤＮＡ、例えば４７８８をコードするアラビドプシスｃＤＮＡは
、さもなければ選択された遺伝子の活性を欠如する微生物にクローン化される。
その形質転換された微生物は、次に、当業界で知られたいくつかの化学的又は酵
素的方法のいずれか、例えばナトリウムビスルファイト（Shortle et al., Meth
ods Enzymol. 100 : 457-468 (1983) ; メトキシルアミン（Kadonaga et al., N
ucleic Acids Res. 13 : 1733-1745 (1985) ; オリゴヌクレオチド誘導飽和変異
誘発（Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 : 710-714 (1986)
；又は種々のポリメラーゼミスインコーポレーションストラテジー（例えばShor
tle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 : 1588-1592 (1982) ; Shiraish
i et al., Gene 64 : 313-319 (1988)；及びLeung et al., Technique 1 : 11-1
5 (1989)を参照のこと）により、生体内変異誘発又は試験管内変異誘発にかけら
れる。通常の阻害濃度のインヒビターの存在下で生長するコロニーは、反後のリ
ストリーキングにより採取精製される。それらのプラスミドは、それらを４７８
８遺伝子活性を欠如する微生物に再形質転換することによりインヒビターに耐性
を与える能力について精製され、テストされる。このテストを通過するプラスミ
ドからのｃＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列を次に決定する。

【００８３】除草剤耐性４７８８タンパク質は、ＤＮＡシャッフリングとも呼ぶ試験管内組
換えに関する方法を用いても得られる。ＤＮＡシャッフリングにより、変異、好
ましくはランダム変異は４７８８遺伝子に導入される。ＤＮＡシャッフリングは
４７８８遺伝子内の配列の組換え及び再配置を、又は２もしくはそれ超の異なる
４７８８遺伝子の間の配列の組換え及び交換を導く。これらの方法は、何百万の
変異した４７８８遺伝子の生産を許容する。変異した遺伝子又はシャッフリング
した遺伝子は、要求される特性、例えば除草剤に対する改良された耐性について
及び異なるクラスのインヒビター化学物質に対する広範囲の耐性を供する変異に
ついてスクリーニングされる。このようなスクリーニングは、当業者の範囲内で
ある。

【００８４】好ましい実施形態において、変異誘発した４７８８遺伝子は、少くとも１のテ
ンプレート４７８８遺伝子から形成され、ここでそのテンプレート４７８８遺伝
子は、要求される大きさの二本鎖ランダムフラグメントに開裂されており、そし
て二本鎖ランダムフラグメントの得られた集団に１又は複数の一本又は二本鎖オ
リゴヌクレオチドを加え、ここで前記オリゴヌクレオチドは、同定の領域及び二
本鎖ランダムフラグメントに対して異種の領域を含み；得られた二本鎖ランダム
フラグメント及びオリゴヌクレオチドの混合物を一本鎖のフラグメントに変性し
；得られた一本鎖フラグメントの集団を、ポリメラーゼと、同一の前記領域で前
記一本鎖フラグメントのアニーリングを生じ、前記一本鎖フラグメントの対を形
成する条件下でインキュベートし、ここで前記同一の領域は一対の一方のメンバ
ーが他方の複製をプライミングするのに十分であり、それにより変異誘発された
二本鎖ポリヌクレオチドを形成し；そして少くとも２回の更なるサイクル、第２
及び第３のステップをくり返し、ここで更なるサイクルの第２のステップにおけ
る得られた混合物は先のサイクルの第３のステップからの変異誘発された二本鎖
ポリヌクレオチドを含み、そして更なるサイクルが、更に変異誘発された二本鎖
ポリヌクレオチドを形成し、ここで変異誘発されたポリヌクレオチドは、天然の
４７８８活性を阻害する除草剤に対して増強された活性を有することを含む。好
ましい実施形態において、二本鎖ランダムフラグメントの集団における単一種の
二本鎖ランダムフラグメントの濃度は、全ＤＮＡの１重量％未満である。更に好
ましい実施形態において、テンプレート二本鎖ポリヌクレオチドは、少くとも約
１００種のポリヌクレオチドを含む。別の好ましい実施形態において二本鎖ラン
ダムフラグメントの大きさは約５bp〜５kbである。更に好ましい実施形態におい
て、その方法の第４のステップは、少くとも１０サイクル、第２及び第３のステ
ップをくり返すことを含む。このような方法は、例えば、Stemmer et al. (1994
) Nature 370 : 389-391、米国特許５，６０５，７９３及びCrameri et al. (19
98) Nature 391 : 288-291, Cherry et al. (1999) Nature Biotechnology, 17
: 379-384、並びにＷＯ９７／２００７８に記載される。これらの引用文献は
引用により本明細書に組み込まれる。

【００８５】別の好ましい実施形態において、２又はそれ超の異なる４７８８遺伝子のいず
れの組み合わせも、例えばZhaoら（1988）Nature Biotechnology 16 : 258-261
に記載されるようにスタガード(staggered）エクステンションプロセス（ＳｔＥ
Ｐ）により試験管内で変異誘発される。２又はそれ超の４７８８遺伝子がＰＣＲ
反応のエクステンションサイクルでのＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして用
いられ、好ましくはポリメラーゼの至適重合温度により低い温度で行われる。例
えば、至適温度約７２℃で熱安定性ポリメラーゼを用いる場合、エクステンショ
ン反応のための温度は７２℃未満、より好ましくは６５℃未満、好ましくは６０
℃未満、より好ましくはエクステンション反応のための温度は５５℃である。更
に、ＰＣＲサイクルのエクステンション反応の持続時間は、必要に応じて、当業
界で通常、行われるより短く、より好ましくは３０秒未満、好ましくは１５秒未
満、より好ましくはエクステンション反応の持続時間は５秒である。短いＤＮＡ
フラグメントのみが各々のエクステンション反応で重合し、変性及びアニーリン
グの各々のサイクルの後、出発ＤＮＡ分子間のエクステンション産物のテンプレ
ートスイッチを許容し、それによりエクステンション反応の中で多様性を作り出
す。ＰＣＲ反応の最適な数は、変異誘発すべき４７８８コーディング領域の長さ
に依存するが、必要に応じて４０サイクル超、より好ましくは６０サイクル超、
好ましくは８０サイクル超が用いられる。４７８８遺伝子の各々の組合せのため
の最適なエクステンション条件及びＰＣＲサイクルの最適な数は、当業界で公知
の手順を用いて記載されるように決定される。ＰＣＲ反応のための他のパラメー
タは、当業界で一般に用いられるのと本質的に同じである。増幅反応のためのプ
ライマーは、好ましくは、４７８８遺伝子のコーディング配列の外側に位置した
ＤＮＡ配列に、例えば４７８８遺伝子を含むベクターのＤＮＡ配列にアニーリン
グするようデザインされ、それによりＰＣＲ反応に用いる異なる４７８８遺伝子
が、好ましくは別個のベクター含まれる。プライマーは、必要に応じて４７８８
コーディング配列から５００bp未満離れて位置し、好ましくは４７８８コーディ
ング配列から２００bp未満、より好ましくは４７８８コーディング配列から７２
０bp未満離れる。好ましくは、４７８８コーディング配列は、制限部位で囲われ
、ＰＣＲ反応の間に増幅されるＤＮＡ配列内に含まれ、それにより増幅された産
物の好適なベクターへのクローニングを容易にする。

【００８６】別の好ましい実施形態において、付着末端を有する４７８８遺伝子のフラグメ
ントはＷＯ９８／０５７６５に記載されるように生産される。粘着末端は、４７
８８遺伝子の一部に対応する第１のオリゴヌクレオチドをその遺伝子内に存在し
ない第２のオリゴヌクレオチド又は第１のオリゴヌクレオチドに対応する遺伝子
の部分に隣接しない遺伝子の一部に対応する第２のオリゴヌクレオチドに連結さ
せることによって生産される。ここで、第２のオリゴヌクレオチドは少くとも１
のリボヌクレオチドを含む。二本鎖ＤＮＡは、テンプレートとして第１のオリゴ
ヌクレオチド及びプライマーとして第２のオリゴヌクレオチドを用いて生産され
る。リボヌクレオチドは開裂され、除去される。リボヌクレオチドの５’に位置
したヌクレオチドも除去されて、粘着末端を有する二本鎖フラグメントを生ずる
。このようなフラグメントは連結によりランダムに再アセンブルして遺伝子配列
の新規組合せが得られる。

【００８７】除草剤耐性タンパク質は標的遺伝子のイン・シトウ改変に関する方法を用いて
も得られる。生体内で遺伝子を標的にし、それを変異させる技術は、自己相補キ
メラオリゴヌクレオチドに基づいて用いることができる。このアプローチは、部
位特異的及び遺伝性の様式で内在性遺伝子の改変のために開発されている（Beet
ham ら（1999) Proc. Natl. Acad. Sci. 96 : 8774-8778 : 米国特許第５，７５
６，３２５号、米国特許第５，８７１，９８４号、米国特許第５，７３１，１８
１号）。これらの引用文献は引用により本明細書に組み込まれる。更に、植物細
胞においてその場で遺伝子を変異させ又は改変することを含む農業学的に要求さ
れる特質を示す植物を生産するための方法が記載される（ＷＯ９８／５４３３０
）。この引用文献は、引用により本明細書に組み込まれる。このような改変は、
相同的組換えのような定方向突然変異誘発を介して作ることができ、得られた除
草剤耐性表現型に基づいて選択される（例えば、Pazkowski ら、EMBO J. 7 : 40
21-4026 (1988) 及び米国特許第５，４８７，９９２号、特にコラム１８〜１９
及び実施例１８を参照のこと）。これらの引用文献は引用により本明細書に組み
込まれる。

【００８８】いずれの４７８８遺伝子も又は４７８８遺伝子の組合せも、本発明の文脈にお
ける試験管内組換えのために用いられ、例えば、植物、例えばアラビドプシス・
タリアナ由来の４７８８遺伝子、例えば配列番号：１もしくは配列番号：２に示
す４７８８遺伝子、細菌、例えばバチルス・カルドリチクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ）（Ghim及びNeuhard (1994) J. Bacteriol. 176 :
3698-3707) もしくは大腸菌（Andersenら（1995) J. Bacteriol. 177 : 2008-2
013)からの４７８８遺伝子、Ｚｅａｍａｙｓからの４７８８遺伝子（Schultes
ら（1996) The Plant Cell, 8 : 463-475)である。これら全ては引用により本明
細書に組み込まれる。全体の４７８８遺伝子又はその部分が本発明に用いられる
。上述の方法により得られた変異した４７８８遺伝子のライブラリーは好適な発
現ベクターいクローン化され、得られたベクターは、好適な宿主、例えばＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓのような藻類、イースト又は細菌に形質転換される。好適
な宿主は、好ましくは、さもなければ４７８８遺伝子活性を欠如する宿主、例え
ば大腸菌ｕｒａＡ変異体（Andersenら（1995) J. Bacteriol. 177 : 2008-2013)
である。変異した４７８８遺伝子のライブラリーを含むベクター形質転換した宿
主細胞は、阻害濃度のインヒビターを含む培地上で培養され、そのインヒビター
の存在下で生長するコロニーが選択される。通常の阻害濃度のインヒビターの存
在下で生長するコロニーが採取され、くり返しのリストリーキングによって精製
される。それらのプラスミドが精製され、このテストを通過するプラスミドから
のｃＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列が次に選択される。

【００８９】インヒビターに対して耐性である改変４７８８遺伝子を同定するためのアッセ
イは、以下の改良を加えて４７８８活性のインヒビターを同定するためのアッセ
イと同様に行うことができる（インヒビターアッセイ、上述）：最初に、変異体
４７８８をインヒビターアッセイの野生型４７８８について反応混合物の１つに
おいて置換した。第２に、宿主型酵素のインヒビターは両方の反応混合物中に存
在する。第３に、変異した活性（インヒビター及び変異した酵素の存在下での活
性）及び非変異活性（インヒビター及び野生型酵素の存在下での活性）を、酵素
活性の有意な増加が非変異活性と比べた時に変異活性で観察される。変異活性は
、好適な基質及びインヒビターの存在下での変異酵素の活性のいずれかの基準で
ある。非変異活性は、好適な基質及びインヒビターの存在下での野生型酵素の活
性のいずれかの基準である。有意な増加は、測定技術に固有の誤差の限界より大
きい酵素活性の増加として定義され、好ましくはインヒビターの存在下での野生
型酵素の活性の少くとも２倍又はそれ超の増加、より好ましくは少くとも５倍又
はそれ超の増加、最も好ましくは少くとも１０倍又はそれ超の増加である。

【００９０】除草剤耐性植物を作り出すために用いることに加えて除草剤耐性４７８８をコ
ードする遺伝子は、植物細胞形質転換法における選択マーカーとして用いること
ができる。例えば、トランスジーンで形質転換した植物、植物組織、植物種子、
又は植物細胞は、植物が発現することができる変化した４７８８をコードする遺
伝子で形質転換することもできる。その形質転換された細胞は、改変遺伝子を発
現しない植物細胞の生存性を阻害するのに十分な量で酵素のインヒビターを含む
培地に移される。ここで、形質転換された細胞のみが生存するであろう。その方
法は改変４７８８コーディング遺伝子で形質転換され得るいずれの植物細胞にも
適用することができ、問題のいずれのトランスジーンでも用いることができる。
トランスジーン及び改変遺伝子の発現は、植物細胞中で機能的な同じプロモータ
ーにより、又は別個のプロモーターにより駆動させることができる。

【００９１】 VI．植物形質転換技術４７８８遺伝子の野生型又は除草剤耐性型は、慣用的な組換えＤＮＡ技術を用
いて植物又は細菌細胞に組込むことができる。一般に、これは当業界で周知の標
準的クローニング手順を用いて、ＤＮＡ分子が異種である（即ち通常、存在しな
い）発現システムに４７８８をコードするＤＮＡ分子を挿入することに関する。
そのベクターは、ベクターを含む宿主細胞中の挿入されたタンパク質コーディン
グ配列の転写及び翻訳のための必要な要素を含む。当業界で知られた多数のベク
ターシステム、例えばプラスミド、バクテリファージウイルス及び他の改変ウイ
ルスを用いることができる。発現システムの構成物は、発現を増加させるよう改
変することもできる。例えば、トランケートされた配列、ヌクレオチド置換又は
他の改変を用いることができる。当業界で知られた発現システムを用いて好適な
条件下で本質的にいずれの作物細胞でも形質転換することができる。４７８８遺
伝子の野生型又は除草剤耐性型を含むトランスジーンは、好ましくは安定に形質
転換され、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。別の好ましい実施形態において、
４７８８遺伝子の野生型又は除草剤耐性型を含むトランスジーンは自己複製ベク
ター上に位置する。自己複製ベクターの例はウイルス、特にジェミニウイルスで
ある。形質転換された細胞は、４７８８遺伝子の選択された形態がトランスジェ
ニック植物に除草剤耐性を与えるように、全体の植物に再生させることができる
。

【００９２】Ａ．植物発現カセットの作製のための要求トランスジェニック植物において発現を意図した遺伝子配列は、最初に、植物
内で発現可能な好適なプロモーターの後方の発現カセット内でアセンブルされる
。発現カセットは、トランスジーンの発現のために必要とされ又は選択されるい
ずれかの更なる配列も含み得る。このような配列には、これらに限らないが、転
写ターミネーター、発現を増強するための外部配列、例えばイントロン、必須配
列、及び特定のオルガネラ及び細胞成分への遺伝子産物のターゲッティングを意
図した配列がある。これらの発現カセットは、次に、上述の植物形質転換ベクタ
ーに容易に移すことができる。以下に典型的な発現カセットの種々の成分を記載
する。

【００９３】１．プロモーター発現カセットに用いるプロモーターの選択は、トランスジェニック植物中のト
ランスジーンの空間的及び時間的発現パターンを決定するであろう。選択された
プロモーターは、特定の細胞型（例えば葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞）又
は特定の組織もしくは器官（例えば根、葉又は花）においてトランスジーンを発
現するであろうし、その選択は、遺伝子産物の蓄積の要求される位置を反映する
であろう。あるいは、選択されたプロモーターは、種々の誘導条件下で遺伝子の
発現を駆動することができる。プロモーターは、それらの強度において、即ち転
写を促進する能力において多様である。利用する宿主細胞系に依存して、当業界
で知られたいくつかの好適なプロモーターのうちのいずれか１つを用いることが
できる。例えば、構成的発現のために、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、コメアク
チンプロモーター、又はユビキチンプロモーターを用いることができる。調節可
能な発現のために、タバコ又はアラビトプシスからの化学的に誘導可能なＰＲ−
１プロモーターを用いることができる（例えば米国特許第５，６８９，０４４号
を参照のこと）。

【００９４】２．転写ターミネーター発現カセットに用いるために種々の転写ターミネーターが利用できる。これら
は、トランスジーンを超える転写の終了及びその正確なポリアデニル化の原因で
ある。好適な転写ターミネーターは、植物において機能することが知られている
ものであり、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーター、ノパリン
シンターゼターミネーター及びエンドウｒｂｃＳＥ９ターミネーターを含む。
これらは、単子葉植物及び双子葉植物の両方で用いることができる。

【００９５】３．発現の増強又は調節のための配列多数の配列が転写ユニット内で遺伝子発現を増加させることが見い出されてお
り、これらの配列は、トランスジェニック植物においてそれらの発現を増加させ
るために本発明の遺伝子と合わせて用いることができる。例えば、種々のイント
ロン配列、例えばトウモロコシＡｄｈｌ遺伝子のイントロンは特に単子葉植物に
おいて発現を増強することが示されている。更に、ウイルス由来のいくつかの非
翻訳リーダー配列も発現を増強することが知られており、これらは双子葉植物細
胞において特に有効である。

【００９６】４．コーディング配列最適化選択された遺伝子のコーディング配列は、問題の作物種において至適発現のた
めのコーディング配列を変化させることにより遺伝子操作することができる。特
定の作物種において至適発現を達成するためにコーディング配列を改変するため
の方法は公知である（例えばPerlakら、Proc. Natl Acad. Sci. USA 88 : 3324
(1991)；及びKozielら、Bio/technol. 11 : 194 (1993)を参照のこと）。

【００９７】５．細胞内の遺伝子産物のターゲッティング遺伝子産物をターゲッティングするための種々のメカニズムが植物において存
在することが知られており、これらのメカニズムの機能性を制御する配列はいく
らか詳細にキャラクタライズされている。例えば、遺伝子産物のクロロプラスト
へのターゲッティングは、成熟タンパク質を作り出すためにクロロプラストイン
ポートの間に開裂される種々のタンパク質のアミノ末端で見い出されるシグナル
配列により制御される（例えば、Comai ら、J. Biol. Chem. 263 : 15104-15109
(1988))。他の遺伝子産物は他のオルガネラ、例えばミトコンドリア及びペルオ
キシソームに局在化する（例えばUnger ら、Plant Molec. Biol. 13 : 411-418
(1989)) 。これらの産物をコードするｃＤＮＡをこれらのオルガネラに対する異
種遺伝子産物のターゲッティングを行うようにも操作することができる。更に、
遺伝子産物の他の細胞構成物へのターゲッティングを引きおこす配列もキャラク
タライズされている。アミノ末端配列は、ＥＲ、アポプラスト及びアリューロン
細胞からの細胞外分泌へのターゲッティングの原因である（Koehler & Ho, Plan
t Cell 2：769-783（1990)。更に、カルボキシ末端配列と合わせたアミノ末端配
列は、遺伝子産物の液胞のターゲッティングの原因である（Shinshi ら、Plant
Molec. Biol. 14 : 357-368 (1990)）。上述の好適なターゲッティング配列の問
題のトランスジーン配列への融合により、トランスジーン産物をいずれかのオル
ガネラ又は細胞構成物に指示することが可能である。

【００９８】Ｂ．植物形質転換ベクターの作製植物形質転換のために利用できる多数の形質転換ベクターが植物形質転換技術
の当業者に知られており、本発明に関係する遺伝子は、いずれのこのようなベク
ターと合わせても用いることができる。ベクターの選択は、好ましい形質転換技
術及び形質転換のための標的種に依存するであろう。特定の標的種のために、異
なる抗生物質又は除草剤選択マーカーが与えられ得る。形質転換に慣用的に用い
られる選択マーカーには、カナマイシン及び関連抗生物質に対する耐性を与えるｍｐｔII 遺伝子（Messing & Vierra. Gene 19 : 259-268 (1982) ; Bevan et al
., Nature 304 : 184-187 (1983))、除草剤ホスフィノトリシンに耐性を与える
ｂａｒ遺伝子（White et al., Nucl. Acids Res 18 : 1062 (1990), Spencer et
al., Theor. Appl. Genet 79 : 625-631 (1990))、抗生物質ヒグロマイシンに
対する耐性を与えるｈｐｈ遺伝子（Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4 : 2929-2931）、及びメトトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ遺伝子（
Bourouis et al., EMBO J. 2 (7) : 1099-1104 (1983))、及びグリホセートに対
する耐性を与えるＥＰＳＰＳ遺伝子（米国特許４，９４０，９３５及び５，１８
８，６４２）がある。

【００９９】１．アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換のために適
したベクターアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いる形質転換のために多くのベクターが利用できる。
これらは、典型的には、少くとも１のＴ−ＤＮＡボーダー配列を有し、ｐＢＩＮ
１９（Bevan, Nucl. Acids Res (1984))及びｐＸＹＺのようなベクターを含む。
アグロバクテリウム形質転換のために適した典型的なベクターには、バイナリー
ベクターｐＣＩＢ２００及びｐＣＩＢ２００１、並びにバイナリーベクターｐＣ
ＩＢ１０及びそのヒグロマイシン選択誘導体がある（例えば米国特許第５，６３
９，９４９号を参照のこと）。

【０１００】２．非アグロバクテリウム形質転換のために適したベクターアグロバクテリウムツメファシエンスを用いない形質転換は、選択された形質
転換ベクターにおけるＴ−ＤＮＡ配列についての要求を回避し、結果としてこれ
らの配列を欠如するベクターは、Ｔ−ＤＮＡ配列を含む上述のもののようなベク
ターに加えて利用することができる。アグロバクテリウムによらない形質転換技
術には、パーティクル・ボンバードメント、プロトプラスト取込み（例えばＰＥ
Ｇ及びエレクトロポレーション）及びマイクロインジェクションを介する形質転
換がある。ベクターの選択は形質転換される種についての好ましい選択に大きく
依存する。非アグロバクテリウム形質転換のために適した典型的なベクターには
、ｐＣＩＢ３０６４、ｐＳＯＧ１９、及びｐＳＯＧ３５がある（例えば米国特許
第５，６３９，９４９号を参照のこと）。

【０１０１】Ｃ．形質転換技術問題のコーディング配列を発現システムにクローン化した後、それは、植物細
胞に形質転換される。植物の形質転換及び再生のための方法は、当業界で公知で
ある。例えば、Ｔｉプラスミドベクターは、外来ＤＮＡのデリバリー、並びに直
接的ＤＮＡ取込み、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェク
ション、及びマイクロプロジェクティルのために利用されている。更に、アグロ
バクテリウム属からの細菌は、植物細胞を形質転換するために利用することがで
きる。

【０１０２】双子葉植物のための形質転換技術は当業界で公知であり、アグロバクテリウム
ベースの技術及びアグロバクテリウムを要求しない技術を含む。非アグロバクテ
リウム技術は、プロトプラスト又は細胞による直接的な外来性遺伝子材料の取込
みに関する。これはＰＥＧもしくはエレクトロポレーション媒介取込み、パーテ
ィクルボンバードメント媒介デリバリー、又はマイクロインジェクションによっ
て行うことができる。各々の場合、形質転換された細胞は当業界で周知の標準的
技術を用いて完全な植物に再生される。ほとんどの単子葉植物種の形転換は現在
、ルーチン化している。好ましい技術には、ＰＥＧ又はエレクトロポレーション
を用いるプロトプラストへの直接的遺伝子転移、カルス組織へのパーティクルボ
ンバードメント、並びにアグロバクウテリウム媒介形質転換がある。

【０１０３】 VII ．育種本発明の野生型又は変化型は、裸子植物、単子葉植物、及び双子葉植物のもの
を含む、広範囲の種々の植物細胞に除草剤耐性を与えるために利用することがで
きる。これらの広いクラスにあるいずれの植物細胞にも遺伝子を挿入することが
できるが、作物の細胞、特にコメ、コムギ、オオムギ、ライムギ、コーン、ポテ
ト、ニンジン、サツマイモ、シュガービート、マメ、エンドウ、チユリ、レタス
、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、ア
スパラガス、オニオン、ニンニク、ナス、コショウ、セロリー、ニンジン、カボ
チャ（Ｓｑｕａｓｈ，ｐｕｍｐｋｉｎ）、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、セイ
ヨウナシ、マルメロ、メロン、プラム、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ
、イチゴ、グレープ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、
パパイヤ、マンゴー、バナナ、ダイズ、タバコ、トマト、モロコシ類及びサトウ
キビにおいて特に役立つ。野生型４７８８遺伝子の高レベル発現及び植物におい
て除草剤耐性を与える４７８８遺伝子の除草剤耐性型の発現は、生産及び質のた
めに重要な他の特徴と組み合わせて、育種アプローチ及び当業界で知られた技術
を介して植物系に組み込むことができる。

【０１０４】除草剤耐性４７８８遺伝子対立遺伝子が作物における直接的選択又は作物を再
生することができる植物細胞培養により得られる場合、それは、その対立遺伝子
を遺伝子操作し、それで植物を形質転換する必要なしに除草剤耐性作物を開発す
るための伝統的な育種技術を用いて商用品種にされる。本発明は、以下の詳細な例を引用することにより更に記載されよう。これらの
例は説明の目的のためだけに供され、特に示さない限り、限定することを意図し
ない。

【０１０５】実施例ここで用いる標準的組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当業界で公知で
あり、Sambrook, et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, Cold Spring Harbor, Ny (1989), T.J.Silhavy, M.L.Berman, an
d L.W.Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laborat
ory, Cold Spring Harbor NY (1984), Ausubel, F.M. et al., Current Protoco ls in Molecular Biology , pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley- Interscience (1987), Reiter et al., Methods in Arabidopsis Research, Wor
ld Scientific Press (1992)、及びSchultz et al., Plant Molecular Biology Manual , Kluwer Academic Publishers (1998) に記載される。これらの引用文献
は、アラビドプシスのＴ−ＤＮＡ変異誘発集団からの遺伝子のタグ化及びクロー
ン化における全てのステップ：植物感染及び形質転換；実生変異体の同定のため
のスクリーニング；同時分離分析；及びプラスミドレスキューのために用いられ
る標準的な技術を記載する。

【０１０６】実施例１：タグ化実生−アラビドジプシスのＴ−ＤＮＡ変異誘発集団からの致
死系＃４７８８の配列分析Ｔ−ＤＮＡ変異誘発から生ずるＴ−ＤＮＡ挿入の一方又は両方の側に隣接する
アラビドプシスゲノムＤＮＡを分子クローン化するためにプラスミドレスキュー
技術を用いる。この様式で得られたプラスミドは、それらの消化パターンに基づ
くクラスにプラスミドを分離するために制限酵素消化によって分析される。各々
のクラスのプラスミドクローンのために、ＤＮＡ配列を決定する得られた配列は
、非Ｔ−ＤＮＡベクター配列の存在について分析する。プラスミドレスキュープ
ロトコルから回収したプラスミドをｓｌｐ３４６プライマーを用いて配列決定す
る。プライマーｓｌｐ３４６は左のＴ−ＤＮＡボーダーにすぐ隣接したフランキ
ング配列に情報を与える。プラスミドレスキューは、４７８８変異についてのヘ
テロ接合体からのゲノムＤＮＡのＰＣＲによって実証される。このＰＣＲ実験は
、予測されるフランキング配列内に固定されたプライマー及び（Ｔ−ＤＮＡ挿入
物中に固定された）ｓｌｐ３４６プライマーを用いる。プラスミドレスキューク
ローンの配列に基づいて予想されるサイズのＰＣＲ産物を見い出すことで妥当な
レスキューを確認する。

【０１０７】上述のクローンから得られた配列を、ヌクレオチド配列データベースに対する
ＮＣＢＩＷＷＷｂｌａｓｔｎサーチに用いる（Altschulら（1990) J. Mol. Bi
ol. 215 : 403-410 : Altschulら（1997) Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402)
。そのサーチ結果は、回収された配列がアラビドプシス染色体II ＢＡＣＴ９Ｊ
２２（Genbank Acc. AC002505 (2739376))からのゲノムＤＮＡと同一であること
を示す。挿入がおこっているゲノムＤＮＡの領域を、推定上のパーミアーゼをコ
ードするとして注釈する（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃２７３９３７６）。次にプライ
マーを予想されるｍＲＮＡの５’及び３’端に対してデザインし、テンプレート
としてアラビドプシスｃＤＮＡライブラリーからのＤＮＡを用いてＰＣＲを行う
。得られたＰＣＲ産物はＴＡ連結化及びクローン化（Original TA Cloning Kit,
Invitrogen)、そして配列決定する。そのｃＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋに注釈
で予測される配列と同じであり、これにより推定上のオープンリーディングフレ
ーム注釈（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）を最初に確認する。

【０１０８】実施例２：大腸菌によりなる組換え４７８８タンパク質の発現ｃＤＮＡクローンに対応する推定上の成熟タンパク質のコーディング領域を上
述の発現ベクターにサブクローン化し、製造元の条件を用いて大腸菌に形質転換
する。特定の例には、プラスミド、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene
, La Jolla, CA), ｐＦＬＡＧ (International Biotechndogies, Inc., New Hav
en, CT)、及びｐＴｒｃＨｉｓ（Invitrogen, La Jolla, CA）がある。

【０１０９】実施例３：ＤＮＡシャッフリングによる４７８８遺伝子の試験管内組換え４７８８タンパク質をコードするＡ．タリアナ４７８８遺伝子をＰＣＲにより
増幅する。得られたＤＮＡフラグメントを本質的に記載される（Stemmer ら（19
94) PNAS 91 : 10747-10751）ようなＤＮａｓｅＩ処理により消化し、その反応
混合物からＰＣＲプライマーを除去する。プライマーなしでＰＣＲ反応を行い、
次にプライマーと共にＰＣＲ反応を行う。両方とも記載（Stemmer ら1994) PNAS
91 : 10747-10751)されている。得られたＤＮＡフラグメントをｐＴＲＣ９９ａ
（Pharmacia, Cat no : 27-5067-01）にクローン化し、Biorad Gene Pulser及び
製造元の条件を用いるエレクトロポレーションにより大腸菌ｕｒａＡ株（Anders
enら（1995) Journal of Bacteriol. 177 (8) : 2008-2013）に形質転換する。
その形質転換した細菌を阻害濃度のインヒビターを含む培地上で増殖させ、イン
ビターの存在下で増殖するコロニーを選択する。通常の阻害濃度のインヒビター
の存在下で増殖するコロニーを採取し、くり返しのリストリーキングによって精
製する、それらのプラスミドを精製し、次にこのテストを通過するプラスミドか
らのｃＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列を決定する。同様の反応で、タンパク質をコー
ドするＡ．タリアナ４７８８遺伝子を含む、ＰＣＲ増幅化ＤＮＡフラグメント及
び大腸菌ｕｒａＡ遺伝子を含むＰＣＲ増幅化ＤＮＡフラグメントを試験管内で組
み換えて、インヒビターに対する改良された耐性を有する得られた変異体を上述
のように回収する。

【０１１０】実施例４：スタガード（Ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）エクステンション法による４７
８８遺伝子の試験管内組換え４７８８タンパク質をコードするＡ．タリアナ４７８８遺伝子及び大腸菌ｕｒ
ａＡ遺伝子を、各々ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのポリリンカーにクローン
化する。“逆プライマー”及び“Ｍ１３−２０プライマー”（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅＣａｔａｌｏｇ）を用いて、本質的に記載される（Zhaoら（1998) Nature
Biotechnology 16 : 258-261 ）ようにＰＣＲ反応を行う。増幅されたＰＣＲフ
ラグメントを好適な制限酵素で消化し、ｐＴＲＣ９９ａにクローン化し、変異し
た４７８８遺伝子を実施例３に記載されるようにスクリーニングする。

【０１１１】実施例５：試験管内結合アッセイ組換え４７８８タンパク質を、例えば実施例２に従って得る。そのタンパク質
をリガンド結合アッセイのために適したチップ上に固定する。そのチップ上に固
定されたタンパク質を当業界で公知の方法に従って溶液中のサンプル化合物に露
出する。サンプル化合物をその固定されたタンパク質と接触させて、タンパク質
−リガンド相互作用を検出することができる測定を行う。このような測定の例は
、上述のＳＥＬＤＩ、ｂｉａｃｏｒｅ及びＦＬＣである。タンパク質に結合する
ことが見い出された化合物は、この様式で直ちに発見され、例えば以下の実施例
６に従って、更なるキャラクタリゼーションにかけられる。

【０１１２】実施例６：ウラシルパーミアーゼ活性のためのアッセイ４７８８活性の通常の機能性に影響を与える化合物についてスクリーニングす
るため簡単なアッセイを開発する。このような化合物は生体内除草活性について
テストすることができる試験管内リード化合物を約束する。そのアッセイは、４
７８８遺伝子を有し、それを機能的に発現する大腸菌ｕｒａＡを、最小培地中で
、最小阻害濃度の５−フルオロウラシルの存在下で生長させることからなる。こ
れは、自動化高スループットスクリーニングのための９６ウェル形態で行われる
。４７８８タンパク質の機能をブロックするために有効である化合物は細胞が５
−ＦＵを摂取する能力を阻害し、細菌の増殖がおこる。この増殖は、簡単な比濁
測定手段によって測定される。より詳しくは、本発明は、パーミアーゼ活性のイ
ンヒビターを同定する方法であって、ａ）配列番号：１もしくは配列番号：２、又はそれに実質的に類似するヌクレ
オチド配列を、パーミアーゼ欠損宿主細胞、例えば大腸菌ｕｒａＡに、前記配列
が機能的に発現可能であるように導入し、ｂ）前記ヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、最小阻害濃度の５−フルオロウ
ラシルと、及び前記パーミアーゼの活性を阻害する能力についてテストすべき化
合物と、このような阻害に資する条件下で組み合わせ、ｃ）ステップ（ｂ）の条件下で宿主細胞増殖を測定し；そしてｄ）ステップ（ｃ）で宿主細胞増殖を阻害する化合物を選択し、そして任意に
、ｅ）ステップ（ｄ）で同定された化合物を除草活性についてテストすべき植物
に適用し、そしてｆ）ステップ（ｅ）において除草活性を有する化合物を選択することを含む方法に関する。

【０１１３】上述の実施形態は説明のためである。本発明の開示は、本発明の多くのバリエ
ーションを当業者に与えるであろう。全てのこのような明らかな予測できるバリ
エーションは添付の請求の範囲に含まれることを意図する。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｈ０１１ 9/00 1/25 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 1/25 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91）Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者バドツィスツェウスキ，グレゴリージョセフアメリカ合衆国，ノースカロライナ 27705，ダーハム，エングルウッドアベニュ 2016 (72)発明者ウォード，エリックラッセルアメリカ合衆国，ノースカロライナ 27707，ダーハム，ベントレードライブ 3761 (72)発明者バーナスコニ，ポールアメリカ合衆国，ノースカロライナ 27514，チャペルヒル，ウィンドホバードライブ 102 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB03 CD14 4B024 AA07 AA08 BA07 CA04 DA01 DA02 DA05 DA12 EA01 EA02 EA04 FA02 GA11 HA11 4B050 CC01 CC03 DD13 LL10 4B063 QA01 QA08 QQ05 QQ21 QR01 QR57 QR59 QR74 QR80 QS05 QS36 QX01 4B065 AA01X AA72X AA88X AA88Y AA90X AB01 BA01 CA27 CA47 CA53 4H011 AB04 BB19 DH11

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１又は配列番号：２に実質的に類似したヌクレオ
チド配列。
【請求項２】配列番号：３と実質的に類似したアミノ酸配列をコードする
請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】前記ヌクレオチド配列が植物ヌクレオチド配列である請求項
１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】前記タンパク質がパーミアーゼ活性を有する請求項１に記載
のヌクレオチド配列。
【請求項５】前記タンパク質がプリン又はピリミジンパーミアーゼ活性を
有する請求項４に記載のヌクレオチド配列。
【請求項６】配列番号：１又は配列番号：２に実質的に類似したヌクレオ
チド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列。
【請求項７】配列番号：３に実質的に類似したアミノ酸配列を含むアミノ
酸。
【請求項８】前記タンパク質がパーミアーゼ活性を有する請求項６に記載
のアミノ酸配列。
【請求項９】前記タンパク質がプリン又はピリミジンパーミアーゼ活性を
有する請求項８に記載のアミノ酸配列。
【請求項１０】配列番号：１又は配列番号：２によりコードされるアミノ
酸配列の少くとも２０の連続アミノ酸残基を含むアミノ酸配列。
【請求項１１】配列番号：３のアミノ酸配列の少くとも２０の連続アミノ
酸残基を含むアミノ酸配列。
【請求項１２】請求項１〜５のいずれか一に記載のヌクレオチド配列に作
用可能に結合したプロモーターを含むキメラ遺伝子。
【請求項１３】請求項１２に記載のキメラ遺伝子を含む組換えベクターで
あって、該ベクターが宿主細胞に安定に形質転換することができる組換えベクタ
ー。
【請求項１４】請求項１３に記載のベクターを含む宿主細胞であって、前
記ヌクレオチド配列が前記細胞内で発現できる宿主細胞。
【請求項１５】前記宿主細胞が真核生物細胞である請求項１４に記載の宿
主細胞。
【請求項１６】前記宿主細胞が、昆虫細胞、イースト細胞、及び植物細胞
からなる群から選択される請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】前記宿主細胞が原核生物細胞である請求項１５に記載の宿
主細胞。
【請求項１８】請求項１６に記載の植物細胞を含む植物又は種子。
【請求項１９】前記植物がパーミアーゼ活性のインヒビターに対して耐性
である請求項１８に記載の植物。
【請求項２０】変化したパーミアーゼ活性を有する遺伝子産物をコードす
るヌクレオチド配列を作るための方法であって、ａ）請求項１に記載のヌクレオチド配列をシャッフリングし、ｂ）得られたシャッフリングしたヌクレオチド配列を発現させ、そしてｃ）改変していないヌクレオチド配列の遺伝子産物のパーミアーゼ活性と比べ
て変化したパーミアーゼ活性について選択することを含む方法。
【請求項２１】前記ヌクレオチド配列が配列番号：１又は配列番号：２で
ある請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】前記パーミアーゼ活性がプリン又はピリミジンパーミアー
ゼ活性である請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】請求項２０に記載の方法により得ることができるシャッフ
リングされたＤＮＡ分子。
【請求項２４】前記シャッフリングしたＤＮＡ分子が、パーミアーゼ活性
のインヒビターに対する耐性が増加した遺伝子産物をコードする請求項２０に記
載の方法により得ることができるシャッフリングされたＤＮＡ分子。
【請求項２５】請求項２３〜２４のいずれか一に記載のヌクレオチド配列
に作用可能に結合したプロモーターを含むキメラ遺伝子。
【請求項２６】請求項２５に記載のキメラ遺伝子を含む組換えベクターで
あって、該ベクターが宿主細胞に安定に形質転換することができる組換えベクタ
ー。
【請求項２７】請求項２６に記載のベクターを含む宿主細胞であって、前
記ヌクレオチド配列が前記細胞内で発現できる宿主細胞。
【請求項２８】前記宿主細胞が真核生物細胞である請求項２７に記載の宿
主細胞。
【請求項２９】前記宿主細胞が、昆虫細胞、イースト細胞、及び植物細胞
からなる群から選択される請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項３０】前記宿主細胞が原核生物細胞である請求項２７に記載の宿
主細胞。
【請求項３１】請求項２９に記載の植物細胞を含む植物又は種子。
【請求項３２】前記植物がパーミアーゼ活性のインヒビターに対して耐性
である請求項３１に記載の植物。
【請求項３３】除草活性を有する化合物を同定する方法であって、ａ）請求項６に記載のタンパク質及び該タンパク質に結合する能力についてテ
ストすべき化合物を、結合に資する条件下で組み合わせ、ｂ）前記タンパク質に結合することができるステップ（ａ）で同定された化合
物を選択し、ｃ）ステップ（ｂ）で同定された化合物を、除草活性についてテストすべき植
物に適用し、そしてｄ）除草活性を有する化合物を選択することを含む方法。
【請求項３４】請求項３３に記載の方法により同定することができる除草
活性を有する化合物。
【請求項３５】除草活性を有するパーミアーゼ活性のインヒビターを同定
する方法であって、ａ）パーミアーゼ及び該パーミアーゼの活性を阻害する能力についてテストす
べき化合物を、その阻害に資する条件下で組み合わせ、ｂ）前記パーミアーゼ活性を阻害することができるステップ（ａ）で同定され
た化合物を選択し、ｃ）ステップ（ｂ）で同定された化合物を、除草活性についてテストすべき植
物に適用し、そしてｄ）除草活性を有する化合物を選択することを含む方法。
【請求項３６】前記パーミアーゼがプリン又はピリミジンパーミアーゼで
ある請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】請求項３５に記載の方法により同定することができる除草
活性を有する化合物。
【請求項３８】パーミアーゼ活性のインヒビターを同定する方法であって
、ａ）配列番号：１もしくは配列番号：２、又はそれらに実質的に類似したヌク
レオチド配列を、パーミアーゼ欠損宿主細胞、例えば大腸菌ｕｒａＡに、前記配
列が機能的に発現可能であるように導入し；ｂ）前記ヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、最小阻害濃度の５−フルオロウ
ラシルと、及び前記パーミアーゼの活性を阻害する能力についてテストすべき化
合物と、その阻害に資する条件下で組み合わせ；ｃ）ステップ（ｂ）の条件下で宿主細胞増殖を測定し；そしてｄ）ステップ（ｃ）において宿主細胞増殖を阻害する化合物を選択することを含む方法。
【請求項３９】請求項３８に記載の方法により同定することができる除草
活性を有する化合物。
【請求項４０】植物の生長を抑制するための方法であって、該植物に、請
求項６に記載のアミノ酸配列の活性を阻害する化合物を、前記植物の生長を抑制
するのに十分な量で適用することを含む方法。
【請求項４１】前記化合物が請求項３７に記載の化合物及び請求項３９に
記載の化合物からなる群から選択される請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】作物を改良する方法であって、請求項１９に記載の植物又
は種子及び請求項３２に記載の植物又は種子からなる群から選択される除草剤耐
性植物又は種子に、請求項３４に記載の化合物、請求項３７に記載の化合物及び
請求項３９に記載の化合物からなる群から選択される除草活性を有する化合物を
、除草剤耐性植物又は種子の生長を有意に抑制することなく不要な植物の生長を
阻害する量で適用することを含む方法。