JP2002176973A - 哺乳動物胚性幹細胞とその樹立方法並びにその継代培養方法 - Google Patents
哺乳動物胚性幹細胞とその樹立方法並びにその継代培養方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】多能性を有する胚性幹細胞とその樹立方法、並
びにその胚性幹細胞の継代培養方法の提供。 【解決手段】以下の細胞生物学的特徴（１）胚盤胞期胚
由来であること、（２）未分化状態での増殖を続けるこ
と、（３）糖鎖ＳＳＥＡ−１抗原が発現すること、
（４）アルカリフォスファターゼ活性が陽性であるこ
と、（５）転写因子Ｏｃｔ３／４が発現すること、
（６）多分化能を持つこと、の全てを有することを特徴
とする哺乳動物胚性幹細胞と、哺乳動物胚盤胞期胚の内
細胞塊から得られた細胞を牛胎児血清を含有するＭＥＭ
αを培地とし、臍帯より分離した臍帯内皮細胞のフィー
ダー上で培養しコロニーを形成する胚性幹細胞の樹立方
法、並びに継代培養方法。
びにその胚性幹細胞の継代培養方法の提供。 【解決手段】以下の細胞生物学的特徴（１）胚盤胞期胚
由来であること、（２）未分化状態での増殖を続けるこ
と、（３）糖鎖ＳＳＥＡ−１抗原が発現すること、
（４）アルカリフォスファターゼ活性が陽性であるこ
と、（５）転写因子Ｏｃｔ３／４が発現すること、
（６）多分化能を持つこと、の全てを有することを特徴
とする哺乳動物胚性幹細胞と、哺乳動物胚盤胞期胚の内
細胞塊から得られた細胞を牛胎児血清を含有するＭＥＭ
αを培地とし、臍帯より分離した臍帯内皮細胞のフィー
ダー上で培養しコロニーを形成する胚性幹細胞の樹立方
法、並びに継代培養方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は胚性幹細胞とその
樹立方法並びにその胚性幹細胞の継代培養方法に関する
ものである。さらに詳しくは、この発明は胚性幹細胞か
ら臓器へ、臓器から個体へと分化する細胞生物学的、分
子生物学的な制御転換機能解明のための研究材料とし
て、或いは異種間移植用の臓器作出のための医療材料と
して、また胚性幹細胞は、高い頻度で外来遺伝子との相
同組み換えが起こる可能性があるため、有用医薬品のバ
イオリアクターなる組み換えクローン動物を生産するた
めのドナー細胞として有益な胚性幹細胞とその樹立方
法、並びにその胚性幹細胞を継代培養する方法に関する
ものである。
樹立方法並びにその胚性幹細胞の継代培養方法に関する
ものである。さらに詳しくは、この発明は胚性幹細胞か
ら臓器へ、臓器から個体へと分化する細胞生物学的、分
子生物学的な制御転換機能解明のための研究材料とし
て、或いは異種間移植用の臓器作出のための医療材料と
して、また胚性幹細胞は、高い頻度で外来遺伝子との相
同組み換えが起こる可能性があるため、有用医薬品のバ
イオリアクターなる組み換えクローン動物を生産するた
めのドナー細胞として有益な胚性幹細胞とその樹立方
法、並びにその胚性幹細胞を継代培養する方法に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】生物個体への分化能を示す培養細胞とし
てのマウス胚性幹細胞が発見されて以来、この胚性幹細
胞を用いた組織・器官の再生、胚の発生機序の追求、ク
ローン化個体の作出を目指した発生学がクローズアップ
され、次世代の医学及びバイオテクノロジーの目指す方
向性の一つとして期待されている。
てのマウス胚性幹細胞が発見されて以来、この胚性幹細
胞を用いた組織・器官の再生、胚の発生機序の追求、ク
ローン化個体の作出を目指した発生学がクローズアップ
され、次世代の医学及びバイオテクノロジーの目指す方
向性の一つとして期待されている。
【０００３】１９９８年にアメリカの研究者グループが
ヒトにおける胚性幹細胞の樹立を初めて報告して以来
（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＴＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２８２，１１４５−１１４７，１９９８；Ｓｈａ
ｍｂｌｏｔｔ ＭＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９５，１３７２６
−１３７３１，１９９８）、胚性幹細胞がヒトの神経
系、血球系、臓器等の再生医療や遺伝子治療に道を開く
万能細胞として俄然世の脚光を浴びる様になってきた。
しかしながら、マウス以外の動物種では胚性幹細胞（或
いは胚性幹様細胞）を用いた生殖系列キメラの作出は未
だ成功しておらず（ＳｔｉｃｅＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉ
ｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．４８，７１５−７１９，１９９
６；Ｓｔｒｅｌｃｈｅｎｋｏ Ｎ，Ｔｈｅｒｉｏ−ｇｅ
ｎｏｌｏｇｙ，３７，１１１−１２６，１９９６）、体
外で胚性幹細胞の遺伝子操作を行い、形質転換された幹
細胞を介し、組み換え個体の生産が可能なものも今のと
ころマウスに限られている（Ｂｒａｄｌｅｙ Ａ，ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９９，２５５，１９８
４）。
ヒトにおける胚性幹細胞の樹立を初めて報告して以来
（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＴＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２８２，１１４５−１１４７，１９９８；Ｓｈａ
ｍｂｌｏｔｔ ＭＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９５，１３７２６
−１３７３１，１９９８）、胚性幹細胞がヒトの神経
系、血球系、臓器等の再生医療や遺伝子治療に道を開く
万能細胞として俄然世の脚光を浴びる様になってきた。
しかしながら、マウス以外の動物種では胚性幹細胞（或
いは胚性幹様細胞）を用いた生殖系列キメラの作出は未
だ成功しておらず（ＳｔｉｃｅＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉ
ｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．４８，７１５−７１９，１９９
６；Ｓｔｒｅｌｃｈｅｎｋｏ Ｎ，Ｔｈｅｒｉｏ−ｇｅ
ｎｏｌｏｇｙ，３７，１１１−１２６，１９９６）、体
外で胚性幹細胞の遺伝子操作を行い、形質転換された幹
細胞を介し、組み換え個体の生産が可能なものも今のと
ころマウスに限られている（Ｂｒａｄｌｅｙ Ａ，ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９９，２５５，１９８
４）。
【０００４】Ｓｔｒｅｌｃｈｅｎｋｏは前出の論文でウ
シの胚性幹様細胞を樹立し、この細胞をドナー核として
核移植を行い、クローン胚をレシピエント牛に移植した
ところ妊娠５５日で流産したと報告している。しかし、
本発明者が幹細胞の特徴として挙げたアルカリフォスフ
ァターゼの発現は陰性であり、その他の条件もクリアし
ていない様である。またＣａｍｐｂｅｌｌらは、ヒツジ
でｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｉｓｃ由来の培養細胞からの
クローン産仔の作出に成功したが（Ｎａｔｕｒｅ，３８
０，６４−６６，１９９６）、胚性幹細胞の特徴である
アルカリフォスファターゼの発現性や糖鎖ＳＳＥＡ−１
抗体の発現性に関しては記述しておらず、ｅｍｂｒｙｏ
ｎｉｃ ｄｉｓｃ由来の細胞は形態的にも上皮様細胞の
様である。
シの胚性幹様細胞を樹立し、この細胞をドナー核として
核移植を行い、クローン胚をレシピエント牛に移植した
ところ妊娠５５日で流産したと報告している。しかし、
本発明者が幹細胞の特徴として挙げたアルカリフォスフ
ァターゼの発現は陰性であり、その他の条件もクリアし
ていない様である。またＣａｍｐｂｅｌｌらは、ヒツジ
でｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｉｓｃ由来の培養細胞からの
クローン産仔の作出に成功したが（Ｎａｔｕｒｅ，３８
０，６４−６６，１９９６）、胚性幹細胞の特徴である
アルカリフォスファターゼの発現性や糖鎖ＳＳＥＡ−１
抗体の発現性に関しては記述しておらず、ｅｍｂｒｙｏ
ｎｉｃ ｄｉｓｃ由来の細胞は形態的にも上皮様細胞の
様である。
【０００５】Ｓｔｒｅｌｃｈｅｎｋｏ，Ｃａｍｐｂｅｌ
ｌらは胚性幹様細胞の培養を行う為に、胎児繊維芽細胞
株であるマウスＳＴＯかマウス胎児由来の初代繊維芽細
胞を用いている。胚性幹細胞の維持に使われる初代繊維
芽細胞は始原生殖細胞の二次培養以降に使えば細胞株が
得られるが、初代培養に使うと継代出来ないとされてお
り（Ｓｔｅｗａｒｔ，ＣＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂ
ｉｏｌ．１６１，６２６−６２８，１９９４）、ウシや
ヒツジなど家畜種の胚性幹細胞樹立のために、その初代
繊維芽細胞を用いたことが幹細胞の樹立を妨げた可能性
が高いと考えられる。また胚性幹細胞は白血病阻害因子
存在下において未分化状態が維持され、細胞の増殖を促
されることが知られている。しかしながら、白血病阻害
因子を加えてもマウス以外の齧歯類や家畜種胚性幹細胞
の樹立には成功しておらず、未知の増殖因子が存在して
いるのかもしれない。
ｌらは胚性幹様細胞の培養を行う為に、胎児繊維芽細胞
株であるマウスＳＴＯかマウス胎児由来の初代繊維芽細
胞を用いている。胚性幹細胞の維持に使われる初代繊維
芽細胞は始原生殖細胞の二次培養以降に使えば細胞株が
得られるが、初代培養に使うと継代出来ないとされてお
り（Ｓｔｅｗａｒｔ，ＣＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂ
ｉｏｌ．１６１，６２６−６２８，１９９４）、ウシや
ヒツジなど家畜種の胚性幹細胞樹立のために、その初代
繊維芽細胞を用いたことが幹細胞の樹立を妨げた可能性
が高いと考えられる。また胚性幹細胞は白血病阻害因子
存在下において未分化状態が維持され、細胞の増殖を促
されることが知られている。しかしながら、白血病阻害
因子を加えてもマウス以外の齧歯類や家畜種胚性幹細胞
の樹立には成功しておらず、未知の増殖因子が存在して
いるのかもしれない。
【０００６】以上の通り、マウスやヒト以外には胚性幹
細胞の樹立された動物種は確認されておらず、胚性幹細
胞を特定するうえで不可欠な糖鎖ＳＳＥＡ−１が発現す
ることや体外培養系で多分化能を持つこと等が証明され
た報告はない。
細胞の樹立された動物種は確認されておらず、胚性幹細
胞を特定するうえで不可欠な糖鎖ＳＳＥＡ−１が発現す
ることや体外培養系で多分化能を持つこと等が証明され
た報告はない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は以上の様な事
情を勘案してなされたものであり、マウスやヒト以外の
胚性幹細胞を提供することを目的としている。またこの
発明はそれらの細胞を樹立するための方法と、それらの
細胞を継代的に培養するための方法を提供することを目
的としてもいる。
情を勘案してなされたものであり、マウスやヒト以外の
胚性幹細胞を提供することを目的としている。またこの
発明はそれらの細胞を樹立するための方法と、それらの
細胞を継代的に培養するための方法を提供することを目
的としてもいる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この発明はまず、上記の
課題を解決するものとして、以下の細胞生物学的特徴、
（１）胚盤胞期胚由来であること、（２）未分化状態で
の増殖を継続すること、（３）糖鎖ＳＳＥＡ−１抗原が
発現すること、（４）アルカリフォスファターゼ活性が
陽性であること、（５）転写因子Ｏｃｔ３／４が発現す
ること、（６）多分化能を持つこと、の全てを有するこ
とを特徴とする、哺乳動物胚性幹細胞を提供する。
課題を解決するものとして、以下の細胞生物学的特徴、
（１）胚盤胞期胚由来であること、（２）未分化状態で
の増殖を継続すること、（３）糖鎖ＳＳＥＡ−１抗原が
発現すること、（４）アルカリフォスファターゼ活性が
陽性であること、（５）転写因子Ｏｃｔ３／４が発現す
ること、（６）多分化能を持つこと、の全てを有するこ
とを特徴とする、哺乳動物胚性幹細胞を提供する。
【０００９】またこの発明は、哺乳動物胚の内細胞塊か
ら得られた細胞を牛胎児血清を含有するＭＥＭαを培地
とし、臍帯より分離した臍帯内皮細胞のフィーダー上で
培養しコロニーを形成させるか、または、このコロニー
をアルカリフォスファターゼ活性の有無、糖鎖ＳＳＥＡ
−１抗原の発現性、Ｏｃｔ３／４の発現性、多分化能の
有無、未分化状態での増殖性、を指標にスクリーニング
することを特徴とする、胚性幹細胞の樹立方法を提供す
る。
ら得られた細胞を牛胎児血清を含有するＭＥＭαを培地
とし、臍帯より分離した臍帯内皮細胞のフィーダー上で
培養しコロニーを形成させるか、または、このコロニー
をアルカリフォスファターゼ活性の有無、糖鎖ＳＳＥＡ
−１抗原の発現性、Ｏｃｔ３／４の発現性、多分化能の
有無、未分化状態での増殖性、を指標にスクリーニング
することを特徴とする、胚性幹細胞の樹立方法を提供す
る。
【００１０】さらにこの発明は、哺乳動物胚性幹細胞期
胚の内細胞塊から得られた細胞を、牛胎児血清を含有す
るＭＥＭαを培地とし、臍帯より分離した臍帯内皮細胞
のフィーダー上で初代培養してコロニーを形成させ、
０．２５％トリプシン０．１％ＥＤＴＡ溶液によってコ
ロニーの細胞を培地から剥がし、剥がした細胞をＰＢＳ
溶液と共に遠心分離器にかけることで洗浄し、個々の細
胞に分散させた後、上記初代培養に用いた培地で再培養
することを特徴とする、胚性幹細胞の継代培養法を提供
する。
胚の内細胞塊から得られた細胞を、牛胎児血清を含有す
るＭＥＭαを培地とし、臍帯より分離した臍帯内皮細胞
のフィーダー上で初代培養してコロニーを形成させ、
０．２５％トリプシン０．１％ＥＤＴＡ溶液によってコ
ロニーの細胞を培地から剥がし、剥がした細胞をＰＢＳ
溶液と共に遠心分離器にかけることで洗浄し、個々の細
胞に分散させた後、上記初代培養に用いた培地で再培養
することを特徴とする、胚性幹細胞の継代培養法を提供
する。
【００１１】なお、上記の胚性幹細胞の樹立方法、及
び、その継代培養法においては、哺乳動物胚盤胞期胚の
内細胞塊から得られた細胞を、牛胎児血清、上皮細胞成
長因子、白血病阻害因子を含有するＭＥＭαの培地で培
養することを好ましい態様としてもいる。
び、その継代培養法においては、哺乳動物胚盤胞期胚の
内細胞塊から得られた細胞を、牛胎児血清、上皮細胞成
長因子、白血病阻害因子を含有するＭＥＭαの培地で培
養することを好ましい態様としてもいる。
【００１２】
【発明実施の形態】まず、この発明の胚性幹細胞の樹立
方法に関してさらに詳しく説明する。通常、胚性幹細胞
を樹立するためには、マイトマイシン処理をするか、γ
放射線を照射し細胞分裂を停止させたマウスＳＴＯフィ
ーダー細胞が必要である。この発明では臍帯内皮細胞を
フィーダーに用いる。培養培地には牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含有させる。また上
皮細胞成長因子（ＥＧＦ）は胚性幹細胞コロニーの形成
に必須ではないが、胚性幹細胞を株化するのに顕著な効
果があり、細胞の増殖因子として、培養培地に添加する
ことが重要である。臍帯細胞をフィーダーとして用い、
培養培地にＥＧＦを添加することは、胚性幹細胞の増殖
に対し相乗的に働き、細胞株の樹立を可能にする。
方法に関してさらに詳しく説明する。通常、胚性幹細胞
を樹立するためには、マイトマイシン処理をするか、γ
放射線を照射し細胞分裂を停止させたマウスＳＴＯフィ
ーダー細胞が必要である。この発明では臍帯内皮細胞を
フィーダーに用いる。培養培地には牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含有させる。また上
皮細胞成長因子（ＥＧＦ）は胚性幹細胞コロニーの形成
に必須ではないが、胚性幹細胞を株化するのに顕著な効
果があり、細胞の増殖因子として、培養培地に添加する
ことが重要である。臍帯細胞をフィーダーとして用い、
培養培地にＥＧＦを添加することは、胚性幹細胞の増殖
に対し相乗的に働き、細胞株の樹立を可能にする。
【００１３】これらの成分の培地中への添加量は、例え
ばＦＣＳは５〜１０％、ＬＩＦは１０〜５０ｎｇ／ｍ
ｌ、ＥＧＦは１０〜５０ｎｇ／ｍｌ程度とすることが出
来る。培養は５％ＣＯ２条件下で３９℃前後の温度で行
う。以上の通りの培養により、胚性幹細胞のコロニーが
得られる。さらに、これらのコロニーを形成する細胞に
対しては、例えば糖鎖ＳＳＥＡ−１抗原が発現するこ
と、アルカリフォスファターゼが陽性であること、転写
因子Ｏｃｔ３／４が発現すること、多分化能を持つこ
と、を指標としてスクリーニングすることによって、胚
性幹細胞としての機能発現を確認することが出来る。
ばＦＣＳは５〜１０％、ＬＩＦは１０〜５０ｎｇ／ｍ
ｌ、ＥＧＦは１０〜５０ｎｇ／ｍｌ程度とすることが出
来る。培養は５％ＣＯ２条件下で３９℃前後の温度で行
う。以上の通りの培養により、胚性幹細胞のコロニーが
得られる。さらに、これらのコロニーを形成する細胞に
対しては、例えば糖鎖ＳＳＥＡ−１抗原が発現するこ
と、アルカリフォスファターゼが陽性であること、転写
因子Ｏｃｔ３／４が発現すること、多分化能を持つこ
と、を指標としてスクリーニングすることによって、胚
性幹細胞としての機能発現を確認することが出来る。
【００１４】例えばＳＳＥＡ−１抗原の発現性は、細胞
をＳＳＥＡ−１抗体で染色してからフローサイトメトリ
ーで分離することにより確認することが出来る。多分化
能を持つことは、培養系で神経細胞に分化させ、ｇｌｉ
ａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ（ＧＦＡＰ）、Ｎｅｓｔｉｎ抗体マーカーで染色
してその多分化能を確認することが出来る。さらに胚性
幹細胞を除核した体外培養由来の未受精卵に核移植し、
更に体外培養することにより胚盤胞に発達させ、これを
受胚雌の子宮に移植することにより妊娠せしめることで
確認することも可能である。
をＳＳＥＡ−１抗体で染色してからフローサイトメトリ
ーで分離することにより確認することが出来る。多分化
能を持つことは、培養系で神経細胞に分化させ、ｇｌｉ
ａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ（ＧＦＡＰ）、Ｎｅｓｔｉｎ抗体マーカーで染色
してその多分化能を確認することが出来る。さらに胚性
幹細胞を除核した体外培養由来の未受精卵に核移植し、
更に体外培養することにより胚盤胞に発達させ、これを
受胚雌の子宮に移植することにより妊娠せしめることで
確認することも可能である。
【００１５】次に、この発明における胚性幹細胞の継代
培養法に関して説明する。この方法は、上記の樹立方法
によって得た胚性幹細胞のコロニー（初代培養細胞）を
培養器から剥がし、別の培養器において再培養し、増殖
させる方法である。コロニーを剥がす際には、培養器か
ら培養培地を取り除いた後、０．１〜０．２５％程度の
トリプシンＥＤＴＡ液を添加し、約３９℃で６分間程度
処理することにより、フィーダー細胞と共にコロニーを
剥がすことが出来る。これを予め細胞分裂を抑止された
臍帯内皮細胞由来の初代培養に用いたものと同様の培地
（すなわちＦＣＳ、ＬＩＦ、ＥＧＦを含有する培地）で
培養することによって、コロニーをフィーダーに接着さ
せ、再度増殖させることが出来る。継代培養に使用する
細胞以外は、定法に従って液体窒素中で凍結保存も出来
る。
培養法に関して説明する。この方法は、上記の樹立方法
によって得た胚性幹細胞のコロニー（初代培養細胞）を
培養器から剥がし、別の培養器において再培養し、増殖
させる方法である。コロニーを剥がす際には、培養器か
ら培養培地を取り除いた後、０．１〜０．２５％程度の
トリプシンＥＤＴＡ液を添加し、約３９℃で６分間程度
処理することにより、フィーダー細胞と共にコロニーを
剥がすことが出来る。これを予め細胞分裂を抑止された
臍帯内皮細胞由来の初代培養に用いたものと同様の培地
（すなわちＦＣＳ、ＬＩＦ、ＥＧＦを含有する培地）で
培養することによって、コロニーをフィーダーに接着さ
せ、再度増殖させることが出来る。継代培養に使用する
細胞以外は、定法に従って液体窒素中で凍結保存も出来
る。
【００１６】以上の通りこの発明の方法はヒトをはじめ
とする全ての哺乳動物の胚性幹細胞の樹立に適用するこ
とが出来、様々な動物種から胚性幹細胞を樹立するこ
と、並びにそれらの胚性幹細胞を継代的に培養すること
が出来る。そして例えばブタやウシ、ウマの胚性幹細胞
は異種移植用の臓器の作成に利用することが出来たり、
有用医薬品のバイオリアクターとなる組み換えクローン
動物生産に活用出来、再生医学やバイオテクノロジーの
発展に多大な貢献が期待される。
とする全ての哺乳動物の胚性幹細胞の樹立に適用するこ
とが出来、様々な動物種から胚性幹細胞を樹立するこ
と、並びにそれらの胚性幹細胞を継代的に培養すること
が出来る。そして例えばブタやウシ、ウマの胚性幹細胞
は異種移植用の臓器の作成に利用することが出来たり、
有用医薬品のバイオリアクターとなる組み換えクローン
動物生産に活用出来、再生医学やバイオテクノロジーの
発展に多大な貢献が期待される。
【００１７】以下、実施例を示し、この発明の幹細胞樹
立方法をさらに詳細かつ具体的に説明すると共に、この
方法によって得られた胚性幹細胞についても試験結果を
示してその特徴を解説する。しかしながら、この発明は
以下の例によって限定されるものではない。
立方法をさらに詳細かつ具体的に説明すると共に、この
方法によって得られた胚性幹細胞についても試験結果を
示してその特徴を解説する。しかしながら、この発明は
以下の例によって限定されるものではない。
【００１８】
【実施例】実施例１この発明の胚性幹細胞を以下の方法
により取得し、その細胞を生物学的特性を試験した。
により取得し、その細胞を生物学的特性を試験した。
【００１９】（１）臍帯内皮細胞の分離、培養法並びに
フィーダー細胞としての準備に関して記す。ウシ新生子
の臍帯を滅菌した外科用鋏で約１ｃｍ２に切断し、７０
％エタノールを噴霧し、火炎滅菌を行った後、抗生物質
添加ＰＢＳ（−）（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ、Ｃａ、Ｍｇ不
含）で数回洗浄した（ペニシリン２０００単位／ｍｌ；
明治製菓、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ；明治
製菓、ファンギゾン２５μｇ／ｍｌ；ＧＩＢＣＯ ＢＲ
Ｌ）。更に滅菌ペトリ皿上で上記サンプルを１ｍｍ２程
度に細切後、３ｍｌの０．２５％トリプシン０．１％Ｅ
ＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）で１０分間処理した。こ
のサンプルの入ったトリプシン液を５ｍｌのＰＢＳ
（−）で希釈後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）
し、沈殿を５ｍｌのＰＢＳ（−）で懸濁し再度同条件で
遠心分離した。得られた沈殿を１０％のＦＣＳ（ＧＩＢ
ＣＯ ＢＲＬ）と抗生物質を含有したＭＥＭα（ＧＩＢ
ＣＯ ＢＲＬ）３ｍｌの入った培養皿（プライマリア、
ファルコン、６ｃｍ径）に入れ、３８．６℃、５％ＣＯ
２の条件下で培養を行った。培養３〜４日後に細切され
た臍帯サンプルの周囲に内皮細胞がコロニーとなって出
現した。コンフルエントに至る迄更に７〜１０日培養
後、臍帯サンプル塊を除去後、継代培養を行った。培地
は２日に１度新しいものと交換する。継代は細胞をＰＢ
Ｓ（−）で２回洗浄後数分間トリプシンＥＤＴＡ処理を
し、６ｃｍの培養皿に約１／５の濃度で細胞を蒔くこと
で行った。４日後にほぼコンフルエントに達した。２〜
３回継代を繰り返した後、既法に従い凍結保存した。フ
ィーダーとして用いる時には凍結細胞を融解後新たに培
養を始めた。フィーダー細胞の作成手順。ａコンフルエ
ントに近い臍帯内皮細胞に、１０μｇ／ｍｌとなるよう
マイトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を加え、３〜４時間培養
した。ｂ培地を除きＰＢＳ（−）で３回洗浄し、トリプ
シン処理を行い細胞を剥がした後、遠心分離した（１０
００ｒｐｍ、５分間）。細胞を２×１０６／ｍｌの濃度
に懸濁した。ｃ４穴培養皿（Ｎｕｎｃ）に１穴当たり
０．５ｍｌの懸濁液を滴下した。一様なフィーダー細胞
となる、作成後２日以降のものを胚性幹細胞の樹立の為
に使用した。
フィーダー細胞としての準備に関して記す。ウシ新生子
の臍帯を滅菌した外科用鋏で約１ｃｍ２に切断し、７０
％エタノールを噴霧し、火炎滅菌を行った後、抗生物質
添加ＰＢＳ（−）（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ、Ｃａ、Ｍｇ不
含）で数回洗浄した（ペニシリン２０００単位／ｍｌ；
明治製菓、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ；明治
製菓、ファンギゾン２５μｇ／ｍｌ；ＧＩＢＣＯ ＢＲ
Ｌ）。更に滅菌ペトリ皿上で上記サンプルを１ｍｍ２程
度に細切後、３ｍｌの０．２５％トリプシン０．１％Ｅ
ＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）で１０分間処理した。こ
のサンプルの入ったトリプシン液を５ｍｌのＰＢＳ
（−）で希釈後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）
し、沈殿を５ｍｌのＰＢＳ（−）で懸濁し再度同条件で
遠心分離した。得られた沈殿を１０％のＦＣＳ（ＧＩＢ
ＣＯ ＢＲＬ）と抗生物質を含有したＭＥＭα（ＧＩＢ
ＣＯ ＢＲＬ）３ｍｌの入った培養皿（プライマリア、
ファルコン、６ｃｍ径）に入れ、３８．６℃、５％ＣＯ
２の条件下で培養を行った。培養３〜４日後に細切され
た臍帯サンプルの周囲に内皮細胞がコロニーとなって出
現した。コンフルエントに至る迄更に７〜１０日培養
後、臍帯サンプル塊を除去後、継代培養を行った。培地
は２日に１度新しいものと交換する。継代は細胞をＰＢ
Ｓ（−）で２回洗浄後数分間トリプシンＥＤＴＡ処理を
し、６ｃｍの培養皿に約１／５の濃度で細胞を蒔くこと
で行った。４日後にほぼコンフルエントに達した。２〜
３回継代を繰り返した後、既法に従い凍結保存した。フ
ィーダーとして用いる時には凍結細胞を融解後新たに培
養を始めた。フィーダー細胞の作成手順。ａコンフルエ
ントに近い臍帯内皮細胞に、１０μｇ／ｍｌとなるよう
マイトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を加え、３〜４時間培養
した。ｂ培地を除きＰＢＳ（−）で３回洗浄し、トリプ
シン処理を行い細胞を剥がした後、遠心分離した（１０
００ｒｐｍ、５分間）。細胞を２×１０６／ｍｌの濃度
に懸濁した。ｃ４穴培養皿（Ｎｕｎｃ）に１穴当たり
０．５ｍｌの懸濁液を滴下した。一様なフィーダー細胞
となる、作成後２日以降のものを胚性幹細胞の樹立の為
に使用した。
【００２０】（２）胚性幹細胞の樹立並びに培養予め凍
結保存された胚を既法に従い融解した後、試験に供し
た。ラットにおいては交尾確認後４日目の胚盤胞期胚を
ウシ及びウマにおいてはそれぞれ人工或いは自然交配後
７日目の胚盤胞期胚を用いた。全ての胚盤胞から顕微手
術により内細胞塊（ＩＣＭ）部分を切り出し、フィーダ
ー細胞上で培養を行った。２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｓ
ｉｇｍａ）、２０ｎｇ／ｍｌ ＬＩＦ（Ｓｉｇｍａ）を
加えたＭＥＭα（１０％ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプ
トマイシン含有）中で、３８．６℃、５％ＣＯ２条件下
で培養を続けた。培地は２日に１度交換した。フィーダ
ー上のＩＣＭは１〜２日でフィーダーに接着し、増殖を
続けた。培養４〜５日後には周囲に細胞コロニーが発達
してきた。更に培養を続け、コロニーの直径が３０００
〜４０００μｍになった時点でピペットを用いてフィー
ダーより剥がし、トリプシン液でおよそ６〜７分間処理
した後、ガラスピペットを用い細胞を解離した。解離後
はＰＢＳ（−）で希釈後遠心分離を２回行って洗浄した
後、得られた沈殿を上記と同じ培養条件でフィーダー細
胞上に１／３濃度で蒔いた（初代培養）。
結保存された胚を既法に従い融解した後、試験に供し
た。ラットにおいては交尾確認後４日目の胚盤胞期胚を
ウシ及びウマにおいてはそれぞれ人工或いは自然交配後
７日目の胚盤胞期胚を用いた。全ての胚盤胞から顕微手
術により内細胞塊（ＩＣＭ）部分を切り出し、フィーダ
ー細胞上で培養を行った。２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｓ
ｉｇｍａ）、２０ｎｇ／ｍｌ ＬＩＦ（Ｓｉｇｍａ）を
加えたＭＥＭα（１０％ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプ
トマイシン含有）中で、３８．６℃、５％ＣＯ２条件下
で培養を続けた。培地は２日に１度交換した。フィーダ
ー上のＩＣＭは１〜２日でフィーダーに接着し、増殖を
続けた。培養４〜５日後には周囲に細胞コロニーが発達
してきた。更に培養を続け、コロニーの直径が３０００
〜４０００μｍになった時点でピペットを用いてフィー
ダーより剥がし、トリプシン液でおよそ６〜７分間処理
した後、ガラスピペットを用い細胞を解離した。解離後
はＰＢＳ（−）で希釈後遠心分離を２回行って洗浄した
後、得られた沈殿を上記と同じ培養条件でフィーダー細
胞上に１／３濃度で蒔いた（初代培養）。
【００２１】（３）試験方法胚性幹細胞の指標の１つと
なる形態を位相差顕微鏡下で観察し、未分化状態での増
殖を調べた。未分化細胞としての特徴であるアルカリフ
ォスファターゼ活性はｆａｓｔ ｒｅｄ ＴＲ塩（Ｓｉ
ｇｍａ）含有のＮａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ ＭＸ Ｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）で染色することによって検
出した。胚性幹細胞の未分化マーカーＳＳＥＡ−１抗原
の発現は、抗ＳＳＥＡ−１抗体染色によりフローサイト
メトリー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔ
ｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ；ＦＡＣＳ）を用いＳＳ
ＥＡ−１抗体と結合する幹細胞集団の分離を試みた。す
なわちラット胚性幹細胞２×１０５個を抗ラットＩｇＧ
及び抗マウスＳＳＥＡ−１抗体と反応後、ＦＩＴＣ（ｆ
ｌｕｏｒｅｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏ−ｃｙａｎａｔ
ｅ）標識ウサギ抗マウスＩｇＧで二次染色しＦＡＣＳに
て解析した。またウシ胚性幹細胞２×１０５個を抗ウシ
ＩｇＧ及び抗マウスＳＳＥＡ−１抗体と反応後、ＦＩＴ
Ｃ標識ウサギ抗マウスＩｇＧで二次染色しＦＡＣＳにて
解析した。更にウマにおいても胚性幹細胞２×１０５個
を抗ウマＩｇＧ及び抗マウスＳＳＥＡ−１抗体と反応
後、ラット、ウシと同様に二次染色し、ＦＡＣＳにて解
析した。マウスの未分化細胞を同定するのに用いられる
転写因子Ｏｃｔ３／４の検出をＰＣＲ法により行った。
胚性幹細胞の多分化能を調べるため、得られた幹細胞を
神経系細胞へと分化させ、星状膠細胞、神経幹細胞の細
胞マーカー抗体であるＧＦＡＰ、Ｎｅｓｔｉｎ抗体で細
胞免疫化学的にそれらの検出を試みた。すなわち、ウ
マ、ラット胚性幹細胞をＥＧＦ、繊維芽細胞成長因子
（ＦＧＦ）２、ＦＧＦ９含有ＭＥＭα培地で３回継代培
養し、グリア細胞が観察された時点で、マウス抗Ｎｅｓ
ｔｉｎ抗体と反応後アルカリフォスファターゼ共役抗マ
ウスＩｇＧ抗体と二次反応させ、Ｆａｓｔ ｒｅｄで染
色した。また同様にＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ９含有地
で３回継代培養した後、これらサイトカインを除去し、
更に７日間培養した時点で、ウサギ抗ＧＦＡＰ抗体と反
応後、アルカリフォスファターゼ共役抗ウサギＩｇＧ抗
体と二次反応させ、同様に染色した。更にウシ胚性幹細
胞の多分化能を調べるため、幹細胞をドナー核とし、核
移植を実施し、クローン胚を作出した後、受胚雌に移植
した。培地への添加因子であるＥＧＦ、ＬＩＦをそれぞ
れ１種、及び、両方を除いたコントロール培地で、継代
３〜４代のウマ胚性幹細胞の培養を行い、添加因子の細
胞増殖への作用を調べた。又、フィーダー細胞の幹細胞
樹立に対する効果を調べるため、フィーダー細胞無しで
ウシＩＣＭの培養を行い、対照と比較した。
なる形態を位相差顕微鏡下で観察し、未分化状態での増
殖を調べた。未分化細胞としての特徴であるアルカリフ
ォスファターゼ活性はｆａｓｔ ｒｅｄ ＴＲ塩（Ｓｉ
ｇｍａ）含有のＮａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ ＭＸ Ｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）で染色することによって検
出した。胚性幹細胞の未分化マーカーＳＳＥＡ−１抗原
の発現は、抗ＳＳＥＡ−１抗体染色によりフローサイト
メトリー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔ
ｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ；ＦＡＣＳ）を用いＳＳ
ＥＡ−１抗体と結合する幹細胞集団の分離を試みた。す
なわちラット胚性幹細胞２×１０５個を抗ラットＩｇＧ
及び抗マウスＳＳＥＡ−１抗体と反応後、ＦＩＴＣ（ｆ
ｌｕｏｒｅｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏ−ｃｙａｎａｔ
ｅ）標識ウサギ抗マウスＩｇＧで二次染色しＦＡＣＳに
て解析した。またウシ胚性幹細胞２×１０５個を抗ウシ
ＩｇＧ及び抗マウスＳＳＥＡ−１抗体と反応後、ＦＩＴ
Ｃ標識ウサギ抗マウスＩｇＧで二次染色しＦＡＣＳにて
解析した。更にウマにおいても胚性幹細胞２×１０５個
を抗ウマＩｇＧ及び抗マウスＳＳＥＡ−１抗体と反応
後、ラット、ウシと同様に二次染色し、ＦＡＣＳにて解
析した。マウスの未分化細胞を同定するのに用いられる
転写因子Ｏｃｔ３／４の検出をＰＣＲ法により行った。
胚性幹細胞の多分化能を調べるため、得られた幹細胞を
神経系細胞へと分化させ、星状膠細胞、神経幹細胞の細
胞マーカー抗体であるＧＦＡＰ、Ｎｅｓｔｉｎ抗体で細
胞免疫化学的にそれらの検出を試みた。すなわち、ウ
マ、ラット胚性幹細胞をＥＧＦ、繊維芽細胞成長因子
（ＦＧＦ）２、ＦＧＦ９含有ＭＥＭα培地で３回継代培
養し、グリア細胞が観察された時点で、マウス抗Ｎｅｓ
ｔｉｎ抗体と反応後アルカリフォスファターゼ共役抗マ
ウスＩｇＧ抗体と二次反応させ、Ｆａｓｔ ｒｅｄで染
色した。また同様にＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ９含有地
で３回継代培養した後、これらサイトカインを除去し、
更に７日間培養した時点で、ウサギ抗ＧＦＡＰ抗体と反
応後、アルカリフォスファターゼ共役抗ウサギＩｇＧ抗
体と二次反応させ、同様に染色した。更にウシ胚性幹細
胞の多分化能を調べるため、幹細胞をドナー核とし、核
移植を実施し、クローン胚を作出した後、受胚雌に移植
した。培地への添加因子であるＥＧＦ、ＬＩＦをそれぞ
れ１種、及び、両方を除いたコントロール培地で、継代
３〜４代のウマ胚性幹細胞の培養を行い、添加因子の細
胞増殖への作用を調べた。又、フィーダー細胞の幹細胞
樹立に対する効果を調べるため、フィーダー細胞無しで
ウシＩＣＭの培養を行い、対照と比較した。
【００２２】（４）試験結果上記（２）の条件で培養の
結果、図１〜３の位相差顕微鏡写真に示した様にマウス
胚性幹細胞と酷似した細胞同士が密に凝集した胚性幹細
胞コロニーが得られた。初代培養ではコンフルエントに
達するのに７〜１０日間を要した。アルカリフォスファ
ターゼ活性は陽性であった（図４、５、６）。胚性幹細
胞の抗マウスＳＳＥＡ−１抗体陽性細胞の割合は図７、
８、９で示してある。ラットは２４．５％、ウシが１
０．２％、ウマは３８．４％の割合となり、動物種間で
差があることが示唆された。
結果、図１〜３の位相差顕微鏡写真に示した様にマウス
胚性幹細胞と酷似した細胞同士が密に凝集した胚性幹細
胞コロニーが得られた。初代培養ではコンフルエントに
達するのに７〜１０日間を要した。アルカリフォスファ
ターゼ活性は陽性であった（図４、５、６）。胚性幹細
胞の抗マウスＳＳＥＡ−１抗体陽性細胞の割合は図７、
８、９で示してある。ラットは２４．５％、ウシが１
０．２％、ウマは３８．４％の割合となり、動物種間で
差があることが示唆された。
【００２３】
【表１】 表１から明らかなように、全ての動物種の胚性幹細胞で
Ｏｃｔ３／４が陽性であった。
Ｏｃｔ３／４が陽性であった。
【００２４】次に胚性幹細胞の多分化能を示す証拠とし
てウマ胚性幹細胞から星状膠細胞マーカーＧＰＡＰ抗体
陽性細胞（図１０）、及び神経幹細胞マーカーＮｅｓｔ
ｉｎ抗体陽性細胞（図１１）が体外培養系により作出さ
れた。この結果により、ウマ胚性幹細胞が多能性を有す
ることが証明された。ラット胚性幹細胞でも同様の結果
が得られた。
てウマ胚性幹細胞から星状膠細胞マーカーＧＰＡＰ抗体
陽性細胞（図１０）、及び神経幹細胞マーカーＮｅｓｔ
ｉｎ抗体陽性細胞（図１１）が体外培養系により作出さ
れた。この結果により、ウマ胚性幹細胞が多能性を有す
ることが証明された。ラット胚性幹細胞でも同様の結果
が得られた。
【００２５】
【表２】
【００２６】更にウシ胚性幹細胞をドナー核として用い
た核移植胚の妊娠率は表２に示した。このことにより細
胞核の多能性も確認出来た。
た核移植胚の妊娠率は表２に示した。このことにより細
胞核の多能性も確認出来た。
【００２７】以上図１〜１１、表１、２に示したように
本発明で樹立した細胞株は、多分化能を有する胚性幹細
胞としての特徴を完全に示すことが確認出来た。
本発明で樹立した細胞株は、多分化能を有する胚性幹細
胞としての特徴を完全に示すことが確認出来た。
【００２８】図１２に明らかなように、ＥＧＦ、ＬＩＦ
共に除いたコントロールでは、１週間培養を続けてもコ
ンフルエントに達しないのに対し、ＥＧＦ単独で加えた
系では４日で、ＥＧＦ・ＬＩＦを組み合わせると更に３
日で、コンフルエントに達する顕著な増殖効果が認めら
れた。
共に除いたコントロールでは、１週間培養を続けてもコ
ンフルエントに達しないのに対し、ＥＧＦ単独で加えた
系では４日で、ＥＧＦ・ＬＩＦを組み合わせると更に３
日で、コンフルエントに達する顕著な増殖効果が認めら
れた。
【００２９】
【表４】
【００３０】表４に明らかなように、フィーダー細胞の
存在無しではウシ胚性幹細胞の樹立は不可能であった
が、フィーダー細胞を用いることでＩＣＭ９個中５個
（５６％）が幹細胞として樹立され、フィーダー細胞を
使用することが胚性幹細胞樹立には必須であることが示
唆された。
存在無しではウシ胚性幹細胞の樹立は不可能であった
が、フィーダー細胞を用いることでＩＣＭ９個中５個
（５６％）が幹細胞として樹立され、フィーダー細胞を
使用することが胚性幹細胞樹立には必須であることが示
唆された。
【００３１】実施例２実施例１で得た胚性幹細胞を、以
下の方法により継代培養した。フィーダー細胞上でコン
フルエントに達したウシ胚性幹細胞の培養皿から培地を
取り除いた後、０．２５％トリプシン０．１％ＥＤＴＡ
で６〜１０分間処理し、胚性幹細胞とフィーダー細胞と
を溶液中に分散させた。この懸濁液を２回遠心分離し
（１０００ｒｐｍ、５分間）、得られた沈殿を継代培養
に用いたものと同様の組成からなる培地に２×１０５個
／ｍｌ濃度で蒔いたところ、細胞は培養皿上での活発な
分裂、増殖が観察され（図１３）、ほぼ４〜５日でコン
フルエントに達した。
下の方法により継代培養した。フィーダー細胞上でコン
フルエントに達したウシ胚性幹細胞の培養皿から培地を
取り除いた後、０．２５％トリプシン０．１％ＥＤＴＡ
で６〜１０分間処理し、胚性幹細胞とフィーダー細胞と
を溶液中に分散させた。この懸濁液を２回遠心分離し
（１０００ｒｐｍ、５分間）、得られた沈殿を継代培養
に用いたものと同様の組成からなる培地に２×１０５個
／ｍｌ濃度で蒔いたところ、細胞は培養皿上での活発な
分裂、増殖が観察され（図１３）、ほぼ４〜５日でコン
フルエントに達した。
【００３２】
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
って胚性幹細胞とこの細胞を樹立するための方法、並び
にこの胚性幹細胞を継代的に培養する方法が提供され
る。このことにより、幹細胞の再生、分化機構の解明や
異種移植用の臓器の作成、有用医薬品のバイオリアクタ
ーとなる組み換えクローン動物生産に活用することが可
能となり、再生医学やバイオテクノロジーの発展に資す
ることが期待出来る。
って胚性幹細胞とこの細胞を樹立するための方法、並び
にこの胚性幹細胞を継代的に培養する方法が提供され
る。このことにより、幹細胞の再生、分化機構の解明や
異種移植用の臓器の作成、有用医薬品のバイオリアクタ
ーとなる組み換えクローン動物生産に活用することが可
能となり、再生医学やバイオテクノロジーの発展に資す
ることが期待出来る。
【図１】ラット胚性幹細胞コロニー顕微鏡写真２００
倍。
倍。
【図２】ウシ胚性幹細胞コロニー顕微鏡写真２００倍。
【図３】ウマ胚性幹細胞コロニー顕微鏡写真１００倍。
【図４】ラット胚性幹細胞コロニーアルカリフォスファ
ターゼ染色顕微鏡写真２００倍。
ターゼ染色顕微鏡写真２００倍。
【図５】ウシ胚性幹細胞コロニーアルカリフォスファタ
ーゼ染色顕微鏡写真２００倍。
ーゼ染色顕微鏡写真２００倍。
【図６】ウマ胚性幹細胞コロニーアルカリフォスファタ
ーゼ染色顕微鏡写真２００倍。
ーゼ染色顕微鏡写真２００倍。
【図７】抗ＳＳＥＡ−１抗体によるラット胚性幹細胞の
ＦＡＣＳの結果。黒く塗られた領域が陽性細胞の割合。
ＦＡＣＳの結果。黒く塗られた領域が陽性細胞の割合。
【図８】抗ＳＳＥＡ−１抗体によるウシ胚性幹細胞のＦ
ＡＣＳの結果。黒く塗られた領域が陽性細胞の割合。
ＡＣＳの結果。黒く塗られた領域が陽性細胞の割合。
【図９】抗ＳＳＥＡ−１抗体によるウマ胚性幹細胞のＦ
ＡＣＳの結果。黒く塗られた領域が陽性細胞の割合。
ＡＣＳの結果。黒く塗られた領域が陽性細胞の割合。
【図１０】ウマ胚性幹細胞由来ＧＦＡＰ抗体陽性細胞顕
微鏡写真１００倍。
微鏡写真１００倍。
【図１１】ウマ胚性幹細胞由来Ｎｅｓｔｉｎ抗体陽性細
胞顕微鏡写真２００倍。
胞顕微鏡写真２００倍。
【図１２】細胞増殖因子がウマ胚性幹細胞増殖に及ぼす
影響を示したグラフ。
影響を示したグラフ。
【図１３】ウシ胚性幹細胞（継代数５）顕微鏡写真２０
０倍。
０倍。
Claims (9)
- 【請求項１】以下の細胞生物学的特徴（１）胚盤胞期胚
由来であること、（２）未分化状態での増殖を継続する
こと、（３）糖鎖ＳＳＥＡ−１抗原が発現すること、
（４）アルカリフォスファターゼ活性が陽性であるこ
と、（５）転写因子Ｏｃｔ３／４が発現すること、
（６）多分化能を持つこと、の全てを有することを特徴
とする哺乳動物胚性幹細胞。 - 【請求項２】哺乳動物がラット、ウシ及びウマである請
求項１の胚性幹細胞。 - 【請求項３】哺乳動物胚盤胞期胚の内細胞塊から得られ
た細胞を牛胎児血清を含有するＭＥＭαを培地とし、臍
帯より分離した臍帯内皮細胞のフィーダー上で培養しコ
ロニーを形成させることを特徴とする胚性幹細胞の樹立
方法。 - 【請求項４】哺乳動物胚盤胞期胚の内細胞塊から得られ
た細胞を牛胎児血清を含有するＭＥＭαを培地とし、臍
帯より分離した臍帯内皮細胞のフィーダー上で培養しコ
ロニーを形成させ、このコロニーを未分化状態での増殖
能、糖鎖ＳＳＥＡ−１抗原の発現性、アルカリフォスフ
ァターゼ活性の有無、Ｏｃｔ３／４の発現性、多分化能
の有無、を指標にスクリーニングすることを特徴とする
胚性幹細胞の樹立方法。 - 【請求項５】哺乳動物胚盤胞期胚の内細胞塊から得られ
た細胞を牛胎児血清、上皮細胞成長因子、白血病阻害因
子を含有するＭＥＭα培地で培養する請求項３または４
の胚性幹細胞の樹立方法。 - 【請求項６】哺乳動物がラット、ウシ及びウマである請
求項３から５のいずれかの胚性幹細胞の樹立方法。 - 【請求項７】哺乳動物胚盤胞期胚の内細胞塊から得られ
た細胞を牛胎児血清を含有するＭＥＭαを培地とし、臍
帯より分離した臍帯内皮細胞のフィーダー上で初代培養
してコロニーを形成させ、トリプシンＥＤＴＡ溶液によ
ってコロニーの細胞を培地から剥がし、剥がした細胞を
ＰＢＳ溶液と共に遠心分離器にかけることで洗浄し、個
々の細胞に分散させた後、上記初代培養に用いた培地で
再培養することを特徴とする胚性幹細胞の継代培養法。 - 【請求項８】哺乳動物胚盤胞期の内細胞塊から得られた
細胞を牛胎児血清、上皮細胞成長因子、白血病阻害因子
を含有するＭＥＭα培地で初代培養する請求項７の胚性
幹細胞の継代培養方法。 - 【請求項９】哺乳動物がラット、ウシ及びウマである請
求項７か８のいずれかの胚性幹細胞の継代培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000404227A JP2002176973A (ja) | 2000-12-14 | 2000-12-14 | 哺乳動物胚性幹細胞とその樹立方法並びにその継代培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000404227A JP2002176973A (ja) | 2000-12-14 | 2000-12-14 | 哺乳動物胚性幹細胞とその樹立方法並びにその継代培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002176973A true JP2002176973A (ja) | 2002-06-25 |
Family
ID=18868216
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000404227A Pending JP2002176973A (ja) | 2000-12-14 | 2000-12-14 | 哺乳動物胚性幹細胞とその樹立方法並びにその継代培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002176973A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005085427A1 (ja) | 2004-03-04 | 2005-09-15 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | ラット胚性幹細胞 |
| JP2006081542A (ja) * | 2004-08-18 | 2006-03-30 | Institute Of Physical & Chemical Research | クローン哺乳動物の作成方法 |
| GB2424226B (en) * | 2003-12-08 | 2009-03-04 | Cellartis Ab | Methods for clonal derivation of human blastocyst-derived stem cell lines |
| WO2009148622A1 (en) * | 2008-06-06 | 2009-12-10 | Proteonomix, Inc. | Compositions and methods for growing embryonic stem cells |
| US8431395B2 (en) | 2006-08-01 | 2013-04-30 | The University Court Of The University Of Edinburgh | Pluripotent cells from rat and other species |
-
2000
- 2000-12-14 JP JP2000404227A patent/JP2002176973A/ja active Pending
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2005085427A1 (ja) | 2004-03-04 | 2005-09-15 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | ラット胚性幹細胞 |
| JPWO2005085427A1 (ja) * | 2004-03-04 | 2008-01-24 | 大日本住友製薬株式会社 | ラット胚性幹細胞 |
| JP4862119B2 (ja) * | 2004-03-04 | 2012-01-25 | 大日本住友製薬株式会社 | ラット胚性幹細胞 |
| JP2012024088A (ja) * | 2004-03-04 | 2012-02-09 | Dainippon Sumitomo Pharma Co Ltd | ラット胚性幹細胞 |
| US8137966B2 (en) | 2004-03-04 | 2012-03-20 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | Rat embryonic stem cell |
| US8628957B2 (en) | 2004-03-04 | 2014-01-14 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | Rat embryonic stem cell |
| US9700023B2 (en) | 2004-03-04 | 2017-07-11 | Ds Pharma Biomedical Co., Ltd. | Rat embryonic stem cell |
| US10561122B2 (en) | 2004-03-04 | 2020-02-18 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Genetically modified rat derived from rat embryonic stem cell |
| JP2006081542A (ja) * | 2004-08-18 | 2006-03-30 | Institute Of Physical & Chemical Research | クローン哺乳動物の作成方法 |
| US8431395B2 (en) | 2006-08-01 | 2013-04-30 | The University Court Of The University Of Edinburgh | Pluripotent cells from rat and other species |
| WO2009148622A1 (en) * | 2008-06-06 | 2009-12-10 | Proteonomix, Inc. | Compositions and methods for growing embryonic stem cells |
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