JP2001526788A - 組織形態形成および活性を評価するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 組織特異的形態形成を誘導するための方法、ならびに局所的欠損部位で真の機能的組織形態形成を誘導し得る形態形成タンパク質およびそのアナログの効力および薬物動力学を評価するためのアッセイが開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 組織形態形成および活性を評価するための方法 発明の分野 本明細書中に開示される発明は、組織特異的形態形成を誘導するための材料お よび方法、ならびに形態形成化合物の活性を評価するための方法に関する。 発明の背景 真の組織モルフォゲンとして機能し得るタンパク質のクラスが、現在同定され てきている。すなわちこれらのタンパク質は、それら自身で、前駆体細胞の機能 的置換組織への移動、増殖および分化を誘導し得る。このクラスのタンパク質を 本明細書では、「骨形成タンパク質」または「形態形成タンパク質」または「モ ルフォゲン」と呼び、異所的な軟骨内性骨形態形成(endochondral bone morphog enesis)を誘導する能力により同定された骨形態形成タンパク質（BMP）のファミ リーのメンバーを含む。形態形成タンパク質は一般に、増殖因子であるTGF-βス ーパーファミリーのサブグループとして当該分野では分類される(Hogen（1996） Genes&Development 10:1580-1594)。モルフォゲンファミリーのタンパク質のメ ンバーは以下のものが挙げられる：哺乳動物の骨形成タンパク質-1（(OP-1)、BM P-7およびショウジョウバエホモログの60Aとしても公知である）、骨形成タンパ ク質-2（OP-2、BMP-8としても公知である）、骨形成タンパク質-3（OP-3）、BMP -2（BMP-2AまたはCBMP-2A、およびショウジョウバエホモログのDPPとしても公知 である）、BMP-3、BMP-4（BMP-2BまたはCBMP-2Bとしても公知である）、BMP-5、 BMP-6およびそのマウスホモログであるVgr-1、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12 、GDF3（Vgr2としてもまた公知である）、GDF8、GDF9、GDF10、GDF11、GDF12、B MP-13、BMP-14、BMP-15、GDF-5（CDMP-1またはMP52としてもまた公知である）， GDF−6（CDMP-2としてもまた公知である）GDF-7（CDMP-3としてもまた公知であ る）、アフリカツメガエルホモログであるVglおよびNODAL、UNIVIN、SCREW、ADM PおよびNEURAL。 このファミリーのメンバーは、前駆体である「プロ-形態」から、二量体化し 得、そして約97〜106アミノ酸のカルボキシ末端活性ドメインを含む成熟ポリペ プチド鎖を生じることを含むプロセシングを含む共通の構造特性を共有する分泌 ポリペプチド鎖をコードする。全てのメンバーがこのドメインにシステインの保 存されたパターンを共有し、そしてこれらのタンパク質の活性形態は単一のファ ミリーのメンバーのジスルフィド結合型ホモ二量体、または2つの異なるメンバ ーのヘテロ二量体のいずれかであり得る（例えば、Massague（1990）Annu．Rev ．Cell Biol.6:597;Sampathら、（1990）J．Biol．Chem．265:13198を参照のこ と）。米国特許第5,011,691号；同第5,266,683号、Ozkaynakら、（1990）EMBO J ．9:2085-2093、Whartonら、（1991）PNAS 88:9214-9218、（Ozkaynak（1992）J ．Biol．Chem．267:25220-25227および米国特許第5,266,683号）；(Celesteら、 （1991）PNAS 87:9843-9847);(Lyonsら、（1989）PNAS 86:4554-4558)もまた参 照のこと。これらの開示は、これらの骨形成タンパク質のアミノ酸配列およびDN A配列ならびに化学的特性および物理的な特性について記載する。Wozneyら、（1 998）Science 242:1528-1534);BMP 9(WO93/00432、1993年1月7日公開)；DPP（Pa dgettら、（1987）Nature 325:81-84;およびVg-1(Weeks（1987）Cell 51:861-86 7)もまた参照のこと。 これらのタンパク質の形態形成活性により、これらのタンパク質は、適切な、 形態形成的に許容性である環境下において組織形態形成の発生カスケードの開始 および維持が可能になり、幹細胞を刺激して組織特異的様式で増殖、および分化 させ、そして新しい組織形成において最高潮に達する事象の進行を誘導する。こ れらの形態形成活性はまた、タンパク質が、それらの分化経路から逸脱するよう に予め誘導された細胞の「再分化」を刺激することを可能にする。このタンパク 質は、哺乳動物の疾患または損傷した組織の置換において、特に損傷組織が正常 な組織または器官（例えば、気腫に起因する損傷した肺組織；硬変した腎臓また は肝臓組織；心筋症および/またはアテローム血栓症もしくは心臓閉栓症の発作 に起因し得るような損傷した心臓または血管組織；潰瘍の穿孔またはそれらの修 復に起因する損傷した胃組織；物理的損傷、退行性疾患（例えば、アルツハイマ ー疾患もしくは多発性硬化症）、または発作に起因するような損傷した神経組 織；疾患または機械的障害に起因し得るような損傷した象牙質および歯周組織） の機能を妨害する場合に有用である。 このタンパク質は、多くの非軟骨形成組織（象牙質、肝臓、腎臓、神経、うっ 血肺、胃腸管組織など）の修復において有用性を有することが示されている。例 えば、W902/15323（1992年9月17日公開）；WO93/04692（1993年3月18日公開）； WO94/06399（1994年3月31日公開)；WO94/03200（1994年2月17日公開）；WO94/06 449（1993年3月31日公開）；WO94/06420（1994年3月31日公開）を参照のこと。U SSN08/404,113；08/445,467；08/432,883；08/155,343；08/260675；08/445,468 ；08/461,397；08/480,528；08/402,542；08/396,930；08/751,227；（代理人参 照番号CRP 069 CP、1997年3月21日提出）（これらの開示は参考として援用され る）もまた参照のこと。 これらの形態形成タンパク質およびこれらのアナログのインビボ活性および/ または効率を評価するために改良された手段についての組成物および方法に対す るニーズが残されている。異なるモルフォゲンが、所定の組織または器官におい て形態形成をもたらすための特異的活性が異なることが想定される。モルフォゲ ンのアナログ（タンパク質に基づかない候補「小分子」機能的模倣物を含む）が 、インビボで所定のモルフォゲンを機能的に置換する能力について評価される必 要があることもまた想定される。所定の兆候（例えば、閉栓性発作の処置）につ いては、例えば、投与の用量および経路は、個人の全体的な健康状態、年齢およ び状態に依存して変化し得ることがさらに予想される。従って、形態形成タンパ ク質またはそれらのアナログの薬物動力学（異なる治療的適用についての、所定 の個体に対する所定のモルフォゲン、および/またはアナログの投与についての 用量の評価、好ましい投与時間、および好ましい投与経路を含む）を評価するた めのニーズもまた残存する。 従って、モルフォゲンおよび/またはそれらのアナログのインビボ活性を迅速 に評価するための処方物およびその使用方法を提供することが本発明の目的であ る。 本明細書に開示される本発明の利点および特色と共に、これらの目的および他 の目的は、以下の記載事項、図面および請求項より明らかである。 発明の要旨 本発明は、その成熟二量体形態において単独で、または可溶性複合体の一部と して全身的に投与された真の組織モルフォゲン（例えば、OP-1）が、局在化した 、投与部位に対して遠位にある欠損部位で新たな再生を誘導し得るという発見に 基づく。具体的には、全身的に投与されるタンパク質は、新規の機能的置換組織 の処方を誘導するために十分であり、組織（骨格または整形組織、肝臓、膵臓、 肺、心臓、腎臓、子宮、腸管、胃腸の＿組織を含む）での局所的欠損の修復に十 分である。（本明細書で使用される場合、「整形組織(orthopedic)」または「骨 格」または「関節」または「軟骨形成（chondrogenic）」組織は、骨格および骨 格関節組織：骨、軟骨、腱、靱帯、および滑膜組織を包含することが理解される ）。形態形成タンパク質の単回の注入が、所望される生物学的効果を誘導するた めに十分であり、そして提供される間葉前駆体細胞が欠損部位に到達可能である 場合、投与が時間反応性ではないことがさらに発見されてきた。つまり、形態形 成タンパク質は、欠損の作製直後、またはある有意な時間の後（線維性組織形成 の開始の後を含むがこれらに限定されない）に、局所的な許容性の欠損部位を有 する個体に提供され得る。従って、機能的置換組織の組織機能の修復および/ま たは修復もしくは再生を、欠損の作製後の有意な時間後に形態形成タンパク質を 全身的に投与することによって増強する手段が、現在利用可能である。方法およ び処方物が外科的な介入を必要とせずに局所的な欠損の修復に使用され得；新し い置換組織形成の速度および質を、特に自発的治癒を生じる能力が減少した易感 染性個体において増強し得、そして欠損部位での線維形成が始まった後であって も新しい組織形成を誘導するために使用され得る。この発見は、同時継続中の米 国特許出願（代理人参照番号、CRP-124、2054/94（本願と同日に出願））に開示 され、この開示は本明細書で参考として援用される。 本明細書中で開示されるように、局所的組織欠損の修復での所定のモルフォゲ ンおよびモルフォゲンアナログのインビボでの活性を効率的に評価するための方 法がここに提供される。本方法は、モルフォゲンまたはアナログを、場合によっ ては修復を必要とする局所的組織欠損を患う動物に対して全身的に提供する工 程を含む。モルフォゲンまたはアナログは、経口、静脈内または腹腔内を含む任 意の全身的な手段により提供され得る。組織は、修復を必要とする任意の組織で あり得、本明細書中に記載される任意の組織を含むがこれらに限定されない。さ らに、本明細書において提供される方法により、好ましい形成処方物、（もしあ れば、標的試薬、抗生物質、鎮痛薬などのような添加された分子の価値を含む） を容易に評価することが可能になり、そして投与経路賦形剤としての価値を付加 する好ましい結合剤、溶液、および他の成分を評価することが可能になる。 本方法により、任意のモルフォゲン（任意の天然に存在するかまたは生合成の （例えば、遺伝子操作されたその改変体（キメラおよびムテインを含む）を含む を迅速に試験することが可能になる。 本方法により、所定のモルフォゲン、モルフォゲンアナログ、治療の症状およ び/または個体の状態についての最適な投薬ストラテジー、投与経路および/また は投与時間の評価することもまた可能になる。これらのストラテジーは、欠損型 、組織型、モルフォゲンおよび/またはアナログの選択、ならびに個体の状態に 基づいてある程度まで変化することが予測される。例えば、老齢の個体、または 血流の減少を有する固体は、健康である若年個体と比較して異なる投薬ストラテ ジーおよび/または投与経路を必要とし得る。これらの異なる患者群における投 薬ストラテジー試験により、投与のための最適な分子および状態を決定すること が可能になる。 本明細書において提供される方法はまた、1つ以上のインビトロアッセイによ って決定されるように、モルフォゲンを機能的に擬態することにおいて有用性を 有することが決定された、候補のモルフォゲンアナログの効力を評価するための 信頼性のあるインビボ手段を提供する。モルフォゲンまたはモルフォゲンアナロ グの活性を評価するためのインビトロアッセイは、極めて多くの公共的供給源（ WO93/05751（1993年4月1日公開）、およびUSSN08/432883（1995年5月2日出願） 、およびUSSN08/727/,118（1996年10月8日提出）（これらの開示は本明細書にお いて参考として援用される）を含む）において記載される。本方法はまた、もし あれば、何が所定の候補アナログの毒性レベルであり得るかを決定するための、 容易な、そして信頼性のある手段を提供する。 本アッセイは、目的の組織における局所的欠損の生成およびモルフォゲンまた はアナログの全身的な投与を含む。1つの実施態様では、生体適合性の生分解性 マトリックスが皮下部位に移殖され、そしてモルフォゲンまたはアナログは、例 えば、腹腔内または静脈内に全身的に投与される。1つの実施態様では、マトリ ックスは、骨由来のコラーゲンマトリックスであり、活性モルフォゲンまたはア ナログは、コラーゲン移殖部位における新しい軟骨および骨形成を誘導し得、こ れらは移殖後12日目に標準的組織学について評価され得る。別の実施態様では、 許容性の局所的欠損部位は、存在する組織において作製される。 本明細書で意図されるように、「許容性」部位とは、修復を必要とする組織欠 損部位であり、そしてこれに対して前駆体細胞が到達可能である。間葉前駆体細 胞は、代表的には、最初の外傷により誘発される炎症性応答の一部として、少な くとも外傷後6〜24時間後までは欠損部位に利用可能となる。具体的には、これ らの前駆体細胞（幹細胞）は、炎症応答により活性化されたケモカインおよび増 殖因子により部位へ補充される。これらの補充された前駆体細胞は、欠損部位で 凝縮塊を形成し、代表的にはカルスと呼ばれ、そして局所的に利用可能である特 異的な組織誘導性シグナルへ応答して特定の組織型へ分化するために利用可能で ある。このような組織誘導性シグナルの不在下では、これらの前駆体細胞は、代 表的には、ケモカインおよび増殖因予（例えば、PDGF、TGFβ、IL-1など）によ り線維芽細胞へ分化するように誘導される。次いで、最終分化に運命づけられた 線維芽細胞は、線維性「瘢痕(scarring)」組織に特徴的な非特異的細胞外マトリ ックスを生成し得、そしてこれらは経時的に吸収され得る。このような瘢痕は、 例えば、肺、肝臓、腎臓、および心臓組織において生じ得るような硬化性組織ま たは組織梗塞の特徴であり得る。 別の実施態様では、局所的欠損部位は目的の組織（例えば、肺、心臓、膵臓、 肝臓、胃腸管および神経組織）において作製される。本方法および組成物は、骨 格組織のような組織（骨、軟骨、靭帯、腱および滑膜組織を含む）、および肝臓 、腎臓、肺、膵臓、脾臓、子宮、心臓、甲状腺、胃腸管、神経組織、感覚器官な どへの、機能の修復および/または回復のための、好ましい投与プロトコルの評 価において補助することが意図される。 1つの好ましい実施態様においては、アッセイが最適な投与時間を評価するた めに使用され得る。例えば、1つの実施態様において、タンパク質または候補ア ナログが、外傷後の少なくとも6時間に、または外傷後の少なくとも10〜24時間 で提供される。別の実施態様においては、タンパク質またはアナログは、外傷後 の24〜36時間の間、および/または36〜72時間の間、および/または72〜120時間 の間、および/または120〜168時間の間の任意の時間に全身的に提供される。別 の実施態様においては、アッセイは、難治性治癒の条件下での組織修復の促進ま たは誘導のための最適な投与経路、時間および用量を評価するために使用される 。本明細書で使用される場合、「難治性治癒」とは、欠損の性質または個体（老 齢、肥満、喫煙者、糖尿病、ステロイド使用者）の状態に起因して、例えば、欠 損を修正するのに十分な新しい置換組織の自発的形成が生じない任意の欠損をい う。 別の局面において、本発明は、存在する組織または器官においてインビボで損 失または損傷した組織を再生するためのモルフォゲンまたはモルフォゲンアナロ グの能力を評価するための方法を提供する。別の局面においては、本発明は、組 織損傷後、またはこのような損傷の前に、正常な組織機能を維持するモルフォゲ ンまたはアナログの能力を評価するための方法を提供する。本明細書において開 示されるように、修復方法は、塞がっているかまたは開いている損傷の両方の処 置を含む。欠損の例には、組織欠損が含まれるがこれに限定されない。 別の局面において、本発明は、上記に記載の方法の実施するためのキットを提 供する。本明細書において意図されるように、キットの1つの実施態様には、全 身投与のための、コラーゲンマトリックス移殖物およびモルフォゲンおよび/ま たはアナログ処方物が含まれる。別の実施態様においては、キットは形態形成タ ンパク質またはアナログを含み、そして全身投与キャリア（例えば、液体キャリ ア）は同じ容器にパッケージされている。他の実施態様においては、形態形成タ ンパク質またはアナログは、滅菌形態で提供され、そして所定のキャリア（例え ば、同じ容器内の水性緩衝液）で再構成される。 本発明の方法を使用して試験するための例示的な処方物には、静脈内に投与さ れる液体処方物として、タンパク質またはアナログを提供する工程を含む。別の 実施態様においては、タンパク質またはアナログは、腹腔内に液体処方物で提供 される。なお別の実施態様においては、タンパク質またはアナログは、経口投与 のために液体または錠剤または他の非液体形態で提供され、これらは生体適合性 、生分解性、または生体腐食性の微粒子（bioerodible microsphere）、および 他の送達ビヒクルに配置されて、または本明細書に記載されるような別の適切な 結合剤と組み合わされて含む。別の好ましい実施態様は、投与直前に溶かされる 乾燥粉末構成物を有し得る。1つの適切な処方物は、最初に液体キャリア(例えば 、賦形剤を有するかまたは有しない水)中に形態形成タンパク質またはアナログ を分散させ、次いで凍結乾燥することから生じる。1つの試験された処方物にお いては、組成物は酸性緩衝化溶液（例えば、pH4.0〜4.5、例えば、酢酸またはク エン酸緩衝液）と一緒にタンパク質を組み合わせることにより作製される溶液で ある。なおも別の処方物は、生理的緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水 （PBS））で骨形成タンパク質を分散することにより形成される懸濁液である。 本明細書において意図されるように、本発明の方法における評価するために有 用である形態形成タンパク質は、以下を含むがこれらに限定されない、OP-1、OP -2、BMP-2、BMP-4、BMP-5、およびBMP-6。現在好ましい形態形成タンパク質は、 OP-1である。本明細書で使用される場合、用語「モルフォゲン」、「骨形態形成 」、「骨形態形成タンパク質」、「BMP」、「骨形成タンパク質」および「骨形 成因子」は、ヒト骨形成タンパク質1（hOP-1）により代表されるタンパク質のク ラスを包含する。hOP-1についてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番 号1および2にそれぞれ提供される。記載を簡潔にするために、hOP-1は、本明細 書において、代表的な形態形成タンパク質として以下に記載される。しかし、OP -1は、真の組織モルフォゲンのTGF-βのサブクラスの単なる代表であり、そして その記載に制限されることは意図されないことが当業者により理解される。他の 公知の、そして有用なタンパク質は、BMP-2、BMP-3、BMP-3b、BMP-4、BMP-5、BM P-6、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-15、GDF-1、GDF-2 、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、GDF-11、GDF-12、NODA L、UNIVIN、SCREW、ADMP、NEURALおよびそれらの形態形成的に活性なアミノ酸改 変体を含む。1つの好ましい実施態様においては、本発明において有用であるタ ンパク質は、これらのタンパク質の任意の生物学的に活性な種改変体を含み、 保存性アミノ酸配列改変体、縮重ヌクレオチド配列改変体によりコードされるタ ンパク質、および本明細書に記載され、そして本明細書に開示される形態形成タ ンパク質（以下を含むがこれらに限定されない、OP-1：BMP-5、BMP-6、BMP-2、B MP-4またはGDF-5、GDF-6またはGDF-7）をコードするDNA配列とハイブリダイズし 得るDNA配列によりコードされる保存された7個のシステイン骨格を共有する骨形 成的に活性なタンパク質を含む。別の実施態様において、有用なタンパク質は、 7個の保存されたシステインドメインを共有し、そして少なくとも70％のアミノ 酸配列の相同性（同一性）を本明細書中で定義されるC末端の活性ドメインの内 部に共有するタンパク質を含む。別の実施態様においては、有用なタンパク質は 、C末端ドメイン中に60％を超える同一性を共有するタンパク質を含む。なお別 の実施態様においては、有用な骨形成タンパク質は、OPX(配列番号3)および一般 配列7および8（配列番号4および5）または一般配列9および10（配列番号6および 7）を含む本明細書で定義されるある1つの一般配列を有する骨形成的に活性なタ ンパク質として定義され得る。 本明細書において意図されるように、本発明の方法は、モルフォゲンアナログ （例えば、モルフォゲン媒介性生物学的効果を誘導し得る任意の候補化合物）の 形態形成特性の評価について有用である。モルフォゲンアナログは、リガンド- モルフォゲンレセプター結合相互作用におけるモルフォゲン、およびネイティブ な状態下でのリガンド-モルフォゲンレセプター結合により通常は刺激される下 流の効果を誘導することによって形態形成の生物学的効果を誘導し得る機能的模 倣物を置換し得るホモログおよびリガンドのアナログを含む。 本発明のアナログを同定する方法の結果として、本発明は、治療グレードのモ ルフォゲンアナログを同定し、そして生成する手段を提供する。本発明はさらに 候補モルフォゲンアナログの誘導体を同定し、そして生成することを提供し、こ こでは、最初に同定されたアナログの任意の所望されない特性（例えば、インビ ボ毒性、または保存における品質低下の傾向）が軽減される。 なお別の実施態様は、モルフォゲンまたはアナログの適切な用量の決定および /または形態生成の進行において有用なアッセイ方法を意図する。 本発明の任意の処置方法において、「形態形成タンパク質またはアナログの投 与」とは、単独または他の分子との組み合わせのいずれかでタンパク質またはそ のアナログを投与することを言う。例えば、モルフォゲンの成熟形態は、その前 駆体である「プロ」ドメイン（これらはタンパク質の溶解性を増強することが公 知である）と関連して提供され得る。本明細書で使用される場合、形態形成タン パク質の「可溶形態」とは、形態形成タンパク質プロドメインの一部または全て と複合体化した二量体種を意味することが理解される。例えば、形態形成タンパ ク質の可溶性複合体形態の詳細な記載については、WO94/03600（1994年2月18日 公開）および/またはJonesら、（1994）Growth Factors 11:215-225を参照のこ と。タンパク質可溶性を増強することが公知である他の有用な分子は、カゼイン および他のミルクの成分ならびに様々な血清タンパク質を含む。 本発明の前述および他の目的、特性および利点は、本発明の以下の詳細な説明 よりさらに明瞭にされる。 図面の説明 図1A〜1Cは、全身性OP-1により誘導される骨形成活性を示すグラフである。 図２Ａ〜２Ｃは、骨形成活性に対するOP-1投与のタイミングの効果を示すグラ フである。ウシのコラーゲンキャリア（25mg）を筋肉内および皮下部位に移殖し 、そしてコラーゲン移殖後1、3、5、7または9日目にOP-1を尾部静脈を介して投 与した（一回の注射あたり1500ug）。骨形成活性を、OP-1投与後12日目に、組織 学、アルカリホスファターゼおよびカルシウム含有量により決定した。 図３Ａおよび３Ｂは、全身性に投与されたOP-1により誘導された骨形成活性に 対する動物の年齢の効果を示す。ウシのコラーゲンキャリア（25mg）を皮下部位 および筋肉内に移殖した。OP-1を尾部静脈を介して投与した（キャリア移殖の24 時間後、単回注射として2500ug）。骨形成活性を、OP-1移殖後12日目に、アルカ リホスファターゼ活性（図3Ａ）およびカルシウム含有量（図3Ｂ）、および移殖 物に対して行った組織学により決定した。 図4は、ヒトOP-1のｃ-末端の7個のシステイン領域に対する様々なモルフォゲ ンの相同性のパーセントを示す表である。 詳細な説明 形態形成タンパク質およびそのアナログの効力および/または薬物動力学特性 を評価するためのアッセイ方法が、ここで発見された。この方法は、 局所的な許容性の欠損部位を有する動物における形態形成タンパク質またはその アナログを全身的に投与する工程、および欠損部位において機能的置換組織の形 成を誘導するために、アッセイの条件下で投与されるタンパク質またはアナログ の能力を評価する工程を包含する。本方法は、外因性マトリックス物質を含むこ とを必要とせず、または欠損部位にタンパク質またはアナログを直接提供するこ とを必要としない。局所的許容性欠損部位は、動物(例えば、ラット)において筋 肉内または皮下部位でのマトリックス物質を移殖することにより容易に生成され 得る。1つの実施態様において、物質は鉱質を除去され、脱タンパク質化（depro teinated）されたコラーゲンマトリックスである。別の実施態様においては、マ トリックスは、任意の他の生体適合性で、生分解性で、生物学的な不活性な足場 物質であり、好ましくは多孔性でありそして実質的に無細胞である。なお別の実 施態様では、許容性の局所的欠損部位は現存する組織において生成される。例え ば、骨折は骨において誘導され得、そして断裂または軟骨の欠損は軟骨で誘導さ れ得る。同様な機械的または毒物誘導性欠損は、少し例を挙げると、肺、心臓、 肝臓、膵臓、子宮および他の組織において誘導され得る。 欠損はまた、異なる患者群を代表する標準的な良好に特徴付けられた動物モデ ルにおいて、異なる治療状態におけるモルフォゲンまたはアナログの効力および /または薬物動力学を評価するための手段として作製され得る。例示的な患者群 は、以下を含むがこれらに制限されない：若年、老齢、糖尿病、高血圧、肥満、 免疫無防備状態の(immune comprised)動物など。 以下では、本方法において有用である適切な形態形成タンパク質およびアナロ グおよび処方物、本発明の組成物およびアッセイならびにそれらの投与および適 用についての方法の詳細な記載；ならびに多くの非限定的な例は、1）本明細書 に記載される形態形成タンパク質、アナログ、処方物、方法およびアッセイの適 切さを例示し；そして2）異なる組織での効力について、様々な欠損の修復につ いて、および異なる患者群における効力および/または薬物動力学の測定につい て、候補のタンパク質およびアナログ、処方物を試験するためのアッセイの提供 の詳細な記載である。 請求される発明の主題をより明解かつ簡潔に記載するために、以下の定義が、 明細書および添付の請求項の範囲で使用される特定の用語の意味についての指導 を提供することを意図される。 本明細書中に具体化されるように、「正常組織機能を維持している」という表 現は、傷害または優先的もしくは先天的な欠損に起因して損失した組織機能の回 復（regain）または回復（restore）ならびに傷害からの損傷の危険にある組織 を保護することの両方を意味する。組織機能を回復することは、新しい組織の再 生および/または生存する分化した組織の細胞を刺激して老化細胞の場合におけ るようにそれらの表現形の発現を続けることを含み得る。「抑圧された組織機能 」レベルとは、組織傷害または疾患の結果として、欠乏まで減少した組織機能を いう。本明細書で使用される場合、組織または器官「の生存性を増強する」とい う表現は、組織の壊死および/または線維症（特に、免疫応答媒介組織の壊死お よび/または線維症）の結果として減少したかまたは損失した組織または器官の 機能の低減および/または除去からの保護を意味する。「軽減する」とは、所望 されない組織の破壊の低減および/または排除からの保護を意味する。「移殖さ れた」生存組織は、例えば、移殖され、単離された前駆体または幹細胞の場合の ように組織移殖片および細胞移殖物の両方を含み、これは、単独で、または一時 的な足場と結合させて移殖され得る。組織は、自己または同種異型の組織および /または、例えば、人工マトリックスの存在下での肝細胞を培養することにより 生成される合成組織であり得る。「形態形成的に許容性の環境」とは、形態形成 が生じる組織を生じさせ得る環境を意味することが理解される。最後に、「症状 を軽減する補因子」とは、本発明の治療剤と一緒に投与され得る1つ以上の医薬 について言い、そしてこれらは、代表的には組織負傷および/または組織機能損 失に関連する1つ以上の症状を軽減するか、または和らげる。例示的な補因子は 、抗生物質、消毒剤、非ステロイド性抗炎症剤などを含む。 「欠損（defect）」または「欠損部位(defect site)」または「欠損位置(部位 )（defect locus）」とは、本明細書で意図されるように、修復を必要とする 組織または器官での任意の構造的破壊を規定し得る。全身的に投与される形態形 成タンパク質は、間葉前駆体細胞（幹細胞）の補充、増殖および分化の割合を増 強し得る。このような組織欠損の修復は、利用可能または接触可能な間葉前駆体 細胞の存在に依存する。 「修復」とは、哺乳動物において機能の再生および/または欠損を機能的に補 正するために十分である新たな組織の形成を意味することが意図される。しかし 、修復は、完全な治癒のプロセス、または、その欠損前の生理学的/構造的/機能 的（mechanical）状態に欠損を再生させることにおいて100％有効である処置を 意味せず、またはそうである場合もない。 形態形成タンパク質に加えて、様々な全身性因子、ホルモン、酵素、酵素イン ヒビターおよび/または化学誘引物質/送化性因子、治療的組成物、抗生物質、ま たは他の生物活性剤もまた、本発明における使用のための処方物内に含まれ得る 。従って、様々な公知の増殖因子（例えば、EGF、PDGF、IGF、FGF、TGF-α、お よびTGF-β）もまた本明細書に記載される形態形成処方物と組み合わされ、そし て全身的に投与され得る。 「モルフォゲン」、「形態形成タンパク質」、「骨形成タンパク質」、または 「骨形態形成タンパク質」は、一般に、新規の器官特異的組織形成を達成する形 態形成事象の完全なカスケードを誘導し得るタンパク質を意味することが理解さ れる。本明細書中の他の場所に記載されるように、このタンパク質のクラスは、 ヒト骨形成タンパク質（hOP1）によって代表される。本発明の実施において有用 な他の骨形成タンパク質には、OP1、OP2、OP3、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6 、BMP9、DPP、Vgl、Vgr、60Aタンパク質、GDF-1、GDF-3、GDF-5、6、7、BMP10、 BMP11、BMP12、BMP13、BMP15、UNIVIN、NODAL、SCREW、ADMP、NEURALの骨形成的 な活性形態、およびそのアミノ酸配列改変体が含まれる。１つの現在好ましい実 施態様において、骨形成タンパク質には、以下のいずれか１つが含まれる：OP1 、OP2、OP3、BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP9、ならびにそのアミノ酸配列改変体 およびホモログ（そのホモログ種を含む）。ヒトOP-1、BMP2および関連タンパク 質の保存された７つのシステインドメインを規定する、Ｃ末端102〜106アミノ酸 と少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質が特に好まし い。 本発明の特定の好ましい実施態様は、骨形成タンパク質であるOP-1、およびＣ末 端の７つのシステインドメインにおいてOP-1と60％より大きいアミノ酸配列同一 性を共有するタンパク質を含む。特定の他の好ましい実施態様は、生理学的生理 食塩溶液に可溶化される成熟OP-1を含む。本明細書中の他の場所にさらに記載さ れるように、本願の発明を用いる使用に適切なタンパク質は、ReddiおよびSampa thにより記載される当該分野に認識されるバイオアッセイを使用して、日常的な 実験の手段によって同定され得る。有用な形態形成タンパク質の詳細な記載は、 以下に提供される。 一般に、用語「アナログ」は、所定の物質の機能的等価物であり、そしてこの 物質の代用物（治療代用物として含む）であり得ることが理解される。アナログ はまた、構造的等価物であり得る。本明細書中に使用される場合、「モルフォゲ ンアナログ」は、モルフォゲン（例えば、OP-1）によって誘導および/または媒 介される生物学的効果を模倣する物質である。このような模倣特性を有する任意 の物質は、その化学的または生化学的性質に関わりなく、本明細書中のモルフォ ゲンアナログとして使用され得る。本明細書中で考慮されるようなモルフォゲン アナログは、生存システムによって、または化学的もしくは生化学的合成技術を 介して産生される、簡単または複合の物質であり得る。これは、天然に存在する 物質であり得るか、または新規の物質であり得、例えば、合理的な薬物設計の原 理に従って調製される。これは、レセプター相互作用に関連する溶媒に露出され たモルフォゲン表面エピトープに構造的に類似した物質、モルフォゲン応答性細 胞の表面上に提示されるモルフォゲンレセプターを他に刺激する物質、または細 胞膜等価性物質もしくは他に細胞内作用性分子（これは、モルフォゲン応答性細 胞のシグナル伝達機構の細胞内成分と相互作用し、それによってモルフォゲン特 異的生物学的効果を刺激する）であり得る。このような細胞内作用性モルフォゲ ンアナログは、本明細書中で「下流形態形成インデューサー」ともいわれる。本 明細書中で使用されるモルフォゲンアナログは、「模倣物（mimic）」または「 模倣物（mimetic）」として好ましくあり得る。 別の実施態様において、本発明において使用されるモルフォゲンアナログは、 候補化合物、またはモルフォゲンレセプターのアゴニストとして作用する薬剤を 含む。レセプターの「アゴニスト」は、レセプターに結合する化合物、およびこ のような化合物のために、このような結合は、レセプターへのモルフォゲンの結 合に類似した機能的結果を有する化合物を意味する。すなわち、レセプターとの 相互作用における化合物は、モルフォゲンと同じか、または実質的に類似した膜 貫通および/または細胞内効果を産生する。従って、モルフォゲンレセプターの アゴニストはレセプターに結合し、そしてこのような結合は、モルフォゲン結合 と同じかまたはこれに類似した機能的結果（例えば、形態形成の誘導）を有する 。アゴニストの活性または潜在力は、天然のモルフォゲンのものよりも低くあり 得（この場合、アゴニストは「部分的アゴニスト」といわれる）、または天然の リガンドのものと等しいかもしくはこれよりも高くあり得る（この場合、アゴニ ストは「完全アゴニスト」といわれる）。従って、例えば、モルフォゲンレセプ ターへの結合および活性化におけるモルフォゲンの活性を模倣し得る小ペプチド または他の分子が、モルフォゲン等価物として使用され得る。好ましくはアゴニ ストは完全なアゴニストであるが、部分的なモルフォゲンレセプターアゴニスト もまた有利に使用され得る。このようなアゴニストを同定する方法は、本明細書 中で開示されており、そしてこれは、モルフォゲン媒介性応答（例えば、後腎間 葉分化の誘導、軟骨内の骨形成の誘導など）を誘導する化合物のアッセイを包含 する。このようなアゴニストは、モルフォゲン「模倣物（mimic）」、「模倣物 （mimetic）」、または「アナログ」ともいわれ得る。 また、例示的な目的であって、これに限定されないが、本発明において有用な 別の型のモルフォゲンアナログは、米国特許第5,132,405号、同第5,091,513号、 および同第5,258,498号に示される（これらの教示は、本明細書中に参考として 援用される）ような、生合成抗体結合部位（BABS）技術の原理の賢明な適用を用 いて調製され得る。BABSアナログ構築物は、抗体から調製され得、好ましくはモ ルフォゲン細胞表面レセプターに特異的に結合するハイブリドーマ細胞によって 産生される。あるいは、BABS分析は、モルフォゲン生物学的活性をブロックする 抗体の抗原結合部位と特異的に反応性である抗イディオタイプ抗体から調製され 得る。Vukicevicら（1994）Biochem．Biophys．Res．Comm．198:693-700は、OP- 1特異的モノクローナル抗体の調製を教示する。当業者は、このような抗体が、 本発明のBABSアナログが調製され得る抗イディオタイプの抗体の日常的な調製に おいて免疫原として使用され得ることを理解する。 再度、本明細書中に例示の目的で示されるがこれに限定されない、構造的に異 なるクラスのモルフォゲンアナログは、Tuerkら(1990)Science 249:505-510，Fa mulokら(1992)Angew．Chem．Intl．Ed．Engl．31:979-988、およびBockら(1992) Nature 355:564-556（各教示は本明細書中に参考として援用される）に示される ような直接的な分子進化の原理の適用によって調製され得る。この直接的な分子 進化プロセスは、核酸分子（代表的には、タンパク質のような選択されたリガン ドに高い親和性で結合するRNA）の単離を含む。このような核酸分子は、当該分 野で「アプタマー」といわれる。所望のアプタマーは、最初に核酸分子のランダ ムプールに存在し、そしてリガンド結合核酸のPCRに基づく増幅の代わりに、い くつかのラウンドのリガンド親和性に基づくクロマトグラフィーを行うことによ って単離される。Bockら（1992）上記は、動物におけるインビボ使用に適切な、 血液凝固促進因子、トロンビンを特異的に阻害するアプタマーの調製を示した。 本明細書中で考慮されるように、このようなアプタマーは、モルフォゲン由来で あり得る。 なお別の構造的に異なるクラスのモルフォゲンアナログは、ランダムペプチド ライブラリー（scottら(1990)Science 249:386-390）または有機もしくは無機の 化合物の組み合わせ合成されたランダムライブラリー（Needelsら(1993)Proc．N atl．Acad．Sci．USA 90:10700-10704;Ohlmeyerら(1993)Proc．Natl．Acad．Sci .USA 90:10922-10926）の適切なメンバーを選択することによって調製され得る 。当業者は、上記および他の関連技術が、生物学的に産生されるのスクリーニン グ物質の長期確立された原理とあわせて、モルフォゲンアナログ活性についてス クリーニングするための広いアレイの候補物質を提供することを理解する。当業 者によって理解されるように、このようなライブラリースクリーニングの産物は 、モルフォゲンレセプター結合のためのリガンドとして、OP-1または別のモルフ ォゲンを模倣し得る。あるいは、産物は、１つ以上の細胞内相互作用を介してモ ルフォゲン特異的生物学的効果を誘導し得る。従って、天然の供給源または一般 的に操作されたOP-1または他のモルフォゲンアナログ、モルフォゲンレセプター ア ナログまたは生物学的機能的模倣物は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖質 、脂質、アミノ酸、核酸、糖、脂肪酸、ステロイド、または上記の化合物のいず れか１つの誘導体を含み得る。これは、真核生物細胞または原核生物細胞の代謝 の中間体もしくは最終産物であり得る。あるいは、アナログは、生物学的な応答 性変更因子または毒素であり得る。最終的に、アナログは、内因性モルフォゲン の発現を誘導するのにコンピテントな（誘導し得る）分子であり得る。 本明細書中で使用される「結合剤」は、本明細書中に規定されるような形態形 成タンパク質とともに混合される場合、インビトロでタンパク質の生物学的活性 を実質的に破壊することなく、処方物の所望の生物学的特性を増強させる、任意 の生物学的に適合可能な物質を意味する。結合剤は、経口投与が所望される場合 、有用性を有することが意図される。とりわけ好ましい結合剤の他の特性は、デ バイスに以下を与える能力である：柔軟性、成形のしやすさ、および/または適 応性に優れる。さらに、特定の好ましい実施態様において、結合剤は、低い割合 で存在する場合、上記の特徴および利点を達成し得る。 本明細書中で有用であることが意図されるこれらの結合剤には、当該分野にお いて理解される懸濁剤、粘性剤、および乳化剤が含まれるが、これらに限定され ない。特に、当該分野において理解される薬剤、例えば、セルロースガム誘導体 、アルギン酸ナトリウム、および粉ゼラチンが使用され得る。より詳細には、セ ルロース誘導体剤（例えば、アルキルセルロース）が好ましく、これには、少し 列挙すると、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキ シエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチル セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびヒドロキシアルキ ルセルロースが含まれる。現在、カルボキシメチルセルロース（そのナトリウム 塩を含む）が最も好ましい。他の有用な結合剤には、デキストラン、マンニトー ル、白色パラフィン、ゴマ油、およびその混合物が含まれるが、これらに限定さ れない。本明細書中上記の技術に関して、当業者は、単に日常的な経験および従 来の技術を使用して、上記に同定された結合剤の適切な等価物を同定し得る。 本明細書中で使用される「湿潤剤」または「キャリア」は、骨形成タンパク質 のインビボ生物学的活性で妨害されない場合、任意の生物学的に適合性の水性溶 液を意味する。現在好ましい湿潤剤またはキャリア剤には、個体に液体形態で投 与され得るように、溶液中でタンパク質を可溶性化またはそうでなければ懸濁さ せ得る水性溶液が含まれる。現在好ましいキャリアには、生理学的生理食塩水、 リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）、酢酸緩衝化溶液（pH4.5）などが含まれるが、 これらに限定されない。等価物は、日常的な実験および従来の技術を超える技術 を使用することなく当業者によって同定され得る。 例示的な組織： いくつかの例示的な組織、ならびに本明細書中に記載される方法および組成物 によって処置可能な、ならびにこの開示によって可能な、ならびにこの開示によ って可能な評価可能なアッセイにおいて有用な、種々の欠損の病因論を以下に列 挙する。援用は、いかなる場合も制限されることが意図されないことが、当業者 によって理解される。本明細書中に援用される組織に加えて、他の組織（膵臓、 子宮、卵巣、胃腸管、結腸、小腸、皮膚、および歯周組織を含むが、これらに限 定されない）が、本明細書中に記載される方法および組成物によって処置され得 る。 心臓組織： 成人の哺乳動物心筋は、非常に制限された増殖力および再生力を有する。結果 として、例えば、心筋梗塞、うっ血性心不全、身体的外傷（例えば、自動車事故 ）、または感染に起因する心筋の損傷または喪失が、代表的に永続的およびしば しば進行的な心機能の喪失を生じる。 本発明の方法および組成物から利益を受け得る被検体には、心筋の喪失または 損傷の危険性にあるか、またはこれに苦しむ個体が含まれる。このような被検体 には、既に心筋梗塞、心臓への身体的外傷（例えば、自動車事故）に罹患してい る被検体、または既にうっ血性心不全に罹患している被検体、ならびに心筋梗塞 またはうっ血性心不全に罹患していることが合理的に予期される被検体のような 、心筋組織の欠失で既に苦しんでいる被検体が含まれる。 方法および組成物は、新規かつ機能的な哺乳動物心筋を生じるために、喪失ま たは損傷した哺乳動物心筋の部位での前駆体幹細胞の増殖および/または分化の プロセスを誘導し、それによって、全体的または部分的に喪失または損傷を回復 または再生させる。処置はまた、慢性的に悪化した哺乳動物心筋（例えば、うっ 血性心不全または慢性筋障害に起因する）を修正するために使用され得る。１つ の実施態様において、既に１つ以上の心筋梗塞に罹患している被検体は、瘢痕組 織を除去するための手術を受け得、そしてモルフォゲンまたはアナログが全身的 に投与され、心臓組織形態形成を誘導し得る。 神経組織： 心臓組織のように、哺乳動物の神経組織は、制限された増殖力および再生力を 有する。モルフォゲンまたはアナログは、神経経路に対する損傷において、また はこのような損傷を見越して、神経経路を維持するために充分な時間および濃度 で、創傷経路の修復またはそれに対するさらなる障害の阻害を含み、本発明の方 法および組成物において使用され得る。 特に、モルフォゲンおよびアナログは、神経自体におけるギャップを埋める離 れた距離にわたって、または神経とシナプス後細胞との間での、横断したもしく は損傷した神経線維（神経）修復再生のニューロンプロセス（特に軸策）を含む 損傷した経路を修復するために使用され得る。特に、本明細書中に記載のモルフ ォゲンおよびアナログは、保護的な髄鞘の脈管形成および再形成を含む、完全な 軸策神経再生を刺激し得る。これらはまた、中枢神経系における（例えば、損傷 もしくは剥離した網膜、または視神経の他の損傷の修復における）機能的な置換 神経経路を形成し得る。 モルフォゲンまたはアナログはまた、死の危険性にあるニューロン細胞の生存 を増強し、それによって神経経路に対する損傷を予防、制限、または阻害するに 有用である。非有糸分裂性ニューロンは、神経障害またはニューロンもしくはグ リア細胞の他の細胞性機能障害（細胞死を含む）、続いて細胞またはその周辺組 織の化学的もしくは機械的外傷の結果として、死の危険性にある。化学的外傷は 、鉛、エタノール、アンモニア、ホルムアルデヒド、および多くの他の有機溶媒 、ならびにタバコの煙および麻酔剤における毒素を含む、公知の毒性剤から生じ 得 る。グルタミン酸のような興奮性のアミノ酸もまた、神経細胞死の病因において 役割を果たし得る（Freeseら(1990)Brain Res．521:254-264を参照のこと）。ニ ューロン細胞死はまた、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、およびパーキ ンソン病、筋萎縮外側硬化、および多発性硬化症を含む多数の神経変性疾患にお ける重要な起因因子であると考えられる。これらの神経障害は、肝臓の脳障害、 感染性脳障害、毒性脳障害、自己免疫脳障害、栄養上の脳障害または虚血性脳障 害を生じる代謝性であり得る。さらに、エタノール、および多数の他の毒素もま た、神経変性疾患における重要な起因因子として同定されている。 本明細書中に記載されるモルフォゲンおよびアナログもまた、身体の免疫/炎 症応答に関連する神経経路を緩和する神経保護効果を提供するために有用である 。このような応答は、例えば、虚血または低酸素症に続く、ニューロンもしくは グリア細胞への血流を阻害することによって、または神経もしくは周辺物質への 他の外傷によって、（例えば、自己免疫機能障害、新生物外傷、感染、化学的外 傷または機械的外傷、疾患によって引き起こされる）神経組織に対する外傷に続 く。塞栓性脳卒中におけるように、例えば、低酸素症または虚血性再灌流から生 じる主な損傷、続く神経血液供給の閉塞は、免疫学的に関連することが考えられ ている。さらに、少なくとも多数の主な脳腫瘍に関連する損傷部分もまた、免疫 学的に関連することが明らかである。例えば、脳室内または間接的に、経口投与 によって哺乳動物に全身的にモルフォゲンを提供することが、神経損傷に対する 免疫学的に関連した応答を緩和および/または阻害するために使用され得る。損 傷が、手術または他の進入性の臨床的な処置の間に誘導される場合、モルフォゲ ンまたは薬剤は、危険性にある神経組織への神経保護効果を提供するために損傷 の誘導の前に提供され得る。 さらに別の局面において、本明細書中に記載される本発明は、モルフォゲンお よび分化したニューロンの増殖および維持を支持し得るアナログの有効性および /または薬物動態学を評価するための方法を提供し、これは、表現型を発現する ことを継続させるためにニューロンを誘導する工程を包含する。この活性は、機 能の喪失が、細胞性代謝性機能および細胞の減少または喪失によって引き起こさ れる神経組織障害の処置において使用され得る。なぜなら、老化または鎮静期が 老化細胞において生じ、そしてアルツハイマー病において顕著であることが考え られるからである。非経口または経口投与によって全身的にモルフォゲンを提供 することによって、これらの細胞を刺激して、細胞性代謝性機能障害の効果を有 意に阻害および/または逆にし、それによって危険な状態にある神経経路を維持 する表現型の発現を継続させる。 本発明はまた、モルフォゲン、アナログ、および機械的な力によって引き起こ される中枢神経系に対する外傷障害を処置することにおいて、それらの薬物動態 学の評価に使用され得る。外傷は、哺乳動物の頭、首、または脊柱の任意の位置 またはその付属物との外来の物体の外傷性接触から生じ得るような、傷、切開、 挫傷、刺し傷、圧迫などから選択される組織発作を含み得る。外傷性損傷の他の 形態は、不適切な体液蓄積による哺乳動物CNS組織の収縮または圧迫から生じ得 る（例えば、正常な脳脊髄または硝子体液産生、回転もしくは容量制御、硬膜下 もしくは脳内血腫もしくは浮腫の遮断または機能不全）。同様に、外傷性の収縮 または圧迫は、転移性または原発腫瘍のような、異常な組織の塊の存在から生じ 得る。 肝臓： 身体におけるほとんどの他の器官とは異なって、肝臓は、肝組織障害または細 胞死の後の規定された再生能力を有する。詳細には、肝細胞が胎児および出生後 肝増殖の後、活性に増殖しない場合、正常な静止肝細胞が細胞死または肝組織の 喪失に応答して分化する。しかし、組織損傷が広範および/または慢性である場 合、永久的な組織障害が生じ得、期間の生存および機能的な能力を減少させる。 永久的な肝組織の損傷は、代表的に、広範な壊死および/または線維形成または 廠痕（硬変）によって特徴付けられる。非修復性損傷の別の供給源は、肝臓新生 物および転移性のガンから生じる。 いずれの肝細胞塊が充分に減少するか、またはそれらの機能が充分に障害され た場合、肝不全が起こる。肝不全の病因は、代謝性（例えば、変化したビリルビ ン代謝または脂肪酸貯蔵）、感染性（例えば、ウイルス性肝炎肝臓分裂縮瞳（sc histomiasis）、梅毒、または回虫症によって誘導される）、毒性（例えば、エ タノール、アンモニア、フェノール、および他の環境毒素、脂肪酸、薬物、およ び/またはそれらの代謝物によって誘導される）、自己免疫、虚血、または栄養 性（例えば、アルコール性肝疾患はまた、重篤度、しばしば本質的な凝血因子の 産生の減少に起因する生命を脅かす出血によって特徴付けられる）であり得る。 肝不全はまた、肝臓の脳障害として広く特徴付けられ、そして腎不全黄疸、肺の 合併症に関連付けられる神経学的な機能不全、ならびにホルモンの不均衡に関連 した宿主の障害を誘導し得る。 胃腸管 本発明の方法および組成物は、特に、潰瘍の危険性にある個体での、モルフォ ゲンおよびアナログの、裂創からの胃腸管の管腔裏打ちの保護を評価するために 有用である。詳細には、本明細書中に記載されるモルフォゲンおよびアナログは 、潰瘍性疾患に正常に関連する炎症を阻害して、瘢痕組織形成を阻害して、なら びに潰瘍組織の修復および再生を誘導して、上皮細胞の増殖を制限する効力につ いて評価され得る。 １つの局面において、本発明は、完全なGI路管腔ライニングを維持するに充分 な、最適な治療的有効量のモルフォゲンタンパク質またはアナログを評価するた めの組成物および方法を特徴とし、これは、全てもしくは一部のGI路管腔ライニ ングに対する、またはこのような障害の予測における、障害における哺乳動物へ の全身投与の工程、および潰瘍組織の修復を評価する工程、および/またはそれ に対する損傷の阻害を包含する。 本発明の１つの好ましい実施態様において、アッセイのために作成された潰瘍 、および/または本発明に従って処置可能な潰瘍には、局所的な回腸炎を引き起 こす回腸において見られるもの、潰瘍性結腸炎、局所的腸炎（クローン病）、直 腸炎および他の形態の炎症性腸疾患（IBD）、胃、小腸、十二指腸、および食道 に見られる胃潰瘍；および口腔に見られる潰瘍を引き起こす結腸において見られ るもの、を含む。本明細書中に記載される組成物および方法は、化学治療または 放射線治療によって引き起こされる粘膜障害の処置において特に有用である。 肺： 種々の肺の病気は、気道炎症（慢性気管支炎、肺気腫、突発性線維症および喘 息を含む）によって特徴付けられる。別の型の肺関連炎症障害は、一般化された 広く広がった急性炎症性応答（例えば、成人呼吸困難症候群）によって特徴付け られる炎症疾患である。炎症性応答に関連した別の機能不全は、高酸素症（例え ば、致死的な高濃度のO₂（95〜100％0₂）の延長した暴露）によって引き起こさ れる障害に対する応答においてモニターされるものである。同様に、以下に記載 されるような組織への血流の減少（および、従って、組織への酸素の減少または 欠如）もまた、炎症性応答を刺激する主な組織障害を誘導し得る。 本発明のアッセイは、これらおよび他の肺組織障害の供給源に起因する、回復 肺組織機能および/または組織喪失における、モルフォゲンおよびアナログの効 果ならびに/または薬物動態学を評価し得る。 本発明の処方物および方法の作製および使用のための手段、ならびにそれらの 性質および有用性に関連する他の物質局面（本発明の請求の範囲を作製および使 用する方法を含む）は、現在、本発明の調製に意図される最高の形態を構成する 以下からさらに理解される。本発明は、このような例示的な研究またはこれらの 実施例における特定の詳細に限定されないことが理解される。 Ｉ．タンパク質考察 Ａ．骨形態形成タンパク質の生化学的、構造的、および機能的性質 その成熟の天然形態において、天然に由来する形態形成タンパク質は、SDS-PA GEによって決定されるように約30〜36kDaの見かけの分子量を代表的に有するグ リコシル化ダイマーである。還元される場合、30kDaタンパク質は、約16kDaおよ び18kDaの見かけの分子量を有する２つのグリコシル化ペプチドサブユニットに なる。還元状態において、タンパク質は検出可能な骨形成活性を有さない。非グ リコシル化タンパク質（これはまた、骨形成活性を有する）は、約27kDaの見か けの分子量を有する。還元されると、27kDaタンパク質は、約14kDa〜16kDaの分 子量を有する２つの非グリコシル化ポリペプチド鎖になる。代表的には、天然に 存在する骨形成タンパク質は、前駆体として翻訳され、これは代表的には約30残 基よりも小さいＮ末端シグナルペプチド配列、続いて、切断されて成熟Ｃ末端ド メインを産生する「プロ」ドメインを有する。シグナルペプチドは、Von HeiJne (1986)Nucleic Acids Research 14:4683-4691の方法を使用して所定の配列にお いて推定され得る切断部位で、迅速に、翻訳に基づいて切断される。プロドメイ ンは、代表的には、完全なプロセスされた成熟Ｃ末端ドメインよりも約３倍大き い。 １対のポリペプチド鎖を含むモルフォゲンは、折りたたまれると、得られた二 量体のタンパク質に充分な構造を適用し、モルフォゲンに特異的なレセプターを 提示する細胞および組織における形態形成応答を惹起する。すなわち、モルフォ ゲンは、一般的に、形態形成的に許容性の環境（前駆体細胞の増殖刺激；前駆体 細胞の分化の刺激；分化細胞の増殖の刺激；および分化細胞の増殖および維持の 支持）において、全ての以下の生物学的機能を誘導する。「前駆体」細胞は、ゲ ノムレパートリーおよび形態形成が誘導される許容される（許容性の）環境の特 異的な組織に依存して、１つ以上の特異的型の分化細胞に分化する能力のある中 立細胞である。モルフォゲンはさらに、表現型および/または組織機能の老化ま たは静止関連喪失の開始を遅延または移動させ得る。モルフォゲンはなおさらに 、分化細胞の表現型の発現（代謝および/またはその機能（例えば、分泌）的特 性の発現を含む）を刺激し得る。さらに、モルフォゲンは、適切な環境条件下で 、関連細胞の再分化を誘導し得る。上記のように、少なくとも象牙質、心臓、肺 、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、卵巣、膵臓、神経、膵臓、または胃腸管組織の増 殖および/または分化を誘導するならびに/またはこれらの組織の任意の増殖、維 持および/または機能的特性を支持するモルフォゲンは、本明細書中で特に目的 である。 本明細書中で有用な形態形成タンパク質には、任意の既知の天然に存在するネ イティブなタンパク質（天然に存在するもしくは生合成により生成した、対立遺 伝子の、系統発生の対応物および他のその変異体（例えば「ムテイン」あるいは 「変異体タンパク質」を含む））ならびに、一般的な形態形成ファミリーのタン パク質の新しい、生物学的に活性なメンバーが含まれる。 特に有用な配列には、DPP(Drosophilaより)、Vgl(Xenopusより)、Vgr-1 (マウスより)のＣ末端の96あるいは102アミノ酸配列、OP1およびOP2タンパク質 、タンパク質（米国特許第5,011,691号およびOppermannらを参照のこと）ならび に、BMP2、BMP3、BMP4(WO88/00205、米国特許第5,013,649号およびWO91/18098) 、BMP5およびBMP6(WO90/11366、PCT/US90/01630を参照のこと)、BMP8およびBMP9 といわれるタンパク質を含む配列が含まれる。本発明の実施において有用な他の タンパク質にはOP1、OP2、OP3、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP9、GDF-5、 GDF-6、GDF-7、DPP、Vgl，Vgr、60Aタンパク質の活性形態、GDF-1、GDF-3、GDF- 5、GDF-6、GDF-7、BMPIO、BMP11、BMP13、BMP15、UNIVIN、NODAL、SCREW、ADMP またはNURALおよびそのアミノ酸配列変異体が含まれる。１つの現在好ましい実 施様態において、形態形成タンパク質には次のうちいずれか一つが含まれる:OP1 、OP2、OP3、BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP9、およびそれらのアミノ酸配列変異 体およびホモログ、これらの配列ならびに（その種ホモログを含む）を含む。 化学的および物理学的特性を開示する刊行物には以下が含まれる:OP-1およびO P-2:米国特許5,011,691，米国特許5,266,683、Ozkaynakら(1990)EMBO J.9:2085- 2093;OP-3:WO94/10203(PCT US93/10520);BMP2、BMP3、BMP4:WO88/00205,Wozney ら(1988)Science 242:1528-1534);BMP5およびBMP6:Celesteら(1991)PNAS 87:984 3-9847;Vgr-1:Lyonsら(1989)PNAS 86:4554-4558;DPP:Padgettら(1987)Nature 32 5:81-84;Vg-1:Weeks(1987)Cell 51:861-867;BMP-9:WO95/33830(PCT/US95/07084) ;BMP10:WO94/26893(PCT/US94/05290);BMP-11:WO94/26892(PCT/US94/05288);BMP1 2:WO95/16035(PCT/US94/14030);BMP-13:WO95/16035(PCT/US94/14030);GDF-1:WO9 2/00382(PCT/US91/04096)およびLeeら(1991)PNAS 88:4250-4254;GDF-8:WO94/216 81(PCT/US94/03019);GDF-9:WO94/15966(PCT/US94/00685);GDF-10:WO95/10539(PC T/US94/11440);GDF-11:WO96/01845(PCT/US95/08543);BMP-15：WO96/36710(PCT/U S96/06540);MP121:WO96/01316(PCT/EP95/02552);GDF-5(CDMP-1,MP52):WO94/1594 9(PCT/US94/00657)およびWO96/14335(PCT/US94/12814)およびWO93/16099(PCT/EP 93/00350)およびStormら(1994)、Nature 368:639-643;GDF-6(CDMP-2,BMP13):WO9 5/01801(PCT/US94/07762)およびWO96/14335およびWO95/10635(PCT/US94/14030); GDF-7(CDMP-3,BMP12):WO95/10802(PCT/US94/07799)およびWO95/10635(PCT/US94/ 14030);BMP-3b:Takaoら(1996)、Biochem．Bjophys．Res．Comm.219:656-6 62;GDF-3:WO94/15965;60A:Blasterら(1993)、Cell 73:687-702およびGenBank登 録番号L12032。他の実施様態において、有用なタンパク質には生物学的に活性な 生合成構築物（新規の生合成タンパク質および二つもしくはそれ以上の既知の骨 原生タンパク質からの配列を使用して設計されたキメラのタンパク質を含む）が 含まれる。米国特許第5,011,691号に開示した生合成構築物(例えば、COP-1、COP -3、COP4、COP-5、COP-7およびCOP-16)もまた参照のこと、およびこの開示は本 明細書中に参考として援用される。 ある好ましい実施様態において、本明細書中で有用な形態形成タンパク質には 、そのアミノ酸配列が前述の天然に存在するタンパク質から選択された参照形態 形成タンパク質と少なくとも70％のアミノ酸配列相同生あるいは「類似性」およ び好ましくは80％の相同性あるいは類似性を共有する配列を含むタンパク質が含 まれる。好ましくは参照タンパク質はヒトOP-1である、そしてその参照配列は形 態形成的に活性形態のヒトOP-1中に存在するＣ-末端７システインドメイン、（ 配列番号２の残基330〜431である。他の既知の形質形成タンパク質もまた参照配 列として使用し得ることが認められる。１つの実施様態において、参照アミノ酸 配列と機能的に等価と考えられる候補アミノ酸配列は、Alignプログラム(DNAsta r，Inc.)のようなコンピュータープログラムにより都合よく実行される、Needle manら(1970)J.Mol.Biol.48:443-453の方法を使用して整列化され得る。候補配列 中の内部のギャップとアミノ酸挿入は、定義された関連性（候補と参照配列との 間で、あるレベルのアミノ酸配列の相同性あるいは同一性として習慣的に表され る。）を計算する目的で無視される。 「アミノ酸配列相同性」は本明細書中において、アミノ酸配列の同一性および 類似性をともに含むと理解される。相同な配列は同一のおよび／または類似のア ミノ酸残基を共有するが、ここで類似の残基は整列化した参照配列中の対応アミ ノ酸残基の保存的置換もしくは「許容される点変異」である。従って、参照配列 と70％のアミノ酸相同性を共有する候補ポリペプチド配列は、任意の70％の整列 化した残基は参照配列中の対応残基と同一であるか、あるいはこれの保存的置換 のいずれか一つである。ある特に好ましい形態形成ポリペプチド鎖は、ヒトOP-1 の好ましい参照配列のＣ末端７システインドメインと少なくとも60％のアミノ酸 配 列同一性、なおより好ましくは、少なくともそれとの65％アミノ酸配列同一性を 共有する。 有意なアミノ酸変化は、形態形成活性を保持する、参照配列から作られ得る。 例えば、GDF-1タンパク質配列が本明細書中に記載されるhOP-1配列とただ約50％ のアミノ酸同一性のみを共有する場合、GDF-1配列はhOP-1配列と70％以上のアミ ノ酸配列相同性を共有するが、ここで「相同性」は上記に定義したとおりである 。さらにGDF-1は、OP-1(配列番号２)の残基372および373に対応する２つの残基 間で、４つのアミノ酸挿入(Gly-Gly-Pro-Pro)を含む。同様にBMP-3は、hOP-1(配 列番号２)の残基385および386に対応する２つの残基間に挿入された「外」残基 、バリンを有する。また、BMP-2およびBMP-4は、ともに、OP-1(配列番号２)の残 基389に対応する「欠損(missing)」アミノ酸残基である。参照配列からのこれら の「逸脱(deviation)」はどれも生物学的活性を妨害しないようである。 当該者に理解されるように、相同性配列なあるいは機能的に等価な配列には、 保存的システイン骨格内（これらのシステインの直線配列を変化させるアミノ酸 挿入あるいは欠損を含む。）システイン残基の機能的に等価な配列が含まれるが 、しかしこの配列は、生物学的活性に必要であり得るような鎖内あるいは鎖間の ジスルフィド結合を形成する能力を含む二量体タンパク質の折り畳み構造中にお いて、それらの関係を本質的に損なわない。例えば、天然に存在するモルフォゲ ンは、（１つの残基BMP2の）少なくとも１つの内部欠損もしくは（４つの残基GD F-1の）挿入が存在するが、生物学的な活性を抑制しないと記述されている。機 能的に等価な配列は、さらに１つあるいはそれ以上のアミノ酸残基が、参照配列 の対応残基この相異が組織の形態形成活性を破壊しない場合、例えばヒトOP-1の Ｃ末端７システインドメイン（本明細書中で保存的７システイン骨格とも言及さ れる）と異なる部位を含む。 本明細書に使用されるように、「保存的置換」は、対応する参照残基（例えば 、類似のサイズ、形、電荷、化学的性質（共有結合性結合もしくは水素結合を形 成する能力を含む）などを有するもの）と物理的にあるいは機能的に類似した残 基である。特に好ましい保存的置換は、Dayhoffら(1978)、5 Atlas of Protein Sequence and Structure ,補意3,第22章(354-352頁),Natl.Biomed.Res.Found.,Wa sh ington,D.C.20007において許容される点変異について規定される基準を満たすも のである。保存的置換の例には、１つのアミノ酸から類似の性質を有する他のア ミノ酸への置換が含まれ、例えば、以下のグループ内での置換が周知である：（ ａ）バリン、グリシン；（ｂ）グリシン、アラニン；（ｃ）バリン、イソロイシ ン、ロイシン；（ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸；（ｅ）アスパラギン、グ ルタミン；（ｆ）セリン、スレオニン；（ｇ）リシン、アルギニン、メチオニン ；および（ｈ）フェニルアラニン、チロシン。用語「保存的変異体(variant)」 あるいは「保存的変異(Variation)」はまた、得られた置換したポリペプチド鎖 に対して結合特異性を有する抗体もまた、非置換あるいは親ポリペプチド鎖に結 合特異性（例えば、「交差反応」「免疫反応」）を有する場合、所定のポリペプ チド鎖中の非置換の親アミノ酸の代わりに、置換したアミノ酸の使用を含む。 他の好ましい実施様態において、本発明に有用な形態形成タンパク質のファミ リーおよびそのメンバーは、一般的なアミノ酸配列によって規定される。例えば 、以下に開示した一般配列７（配列番号４）および一般配列８（配列番号５）は 、現在までに同定された好ましいタンパク質ファミリーメンバーの間で共有され ている相同性に適応する、（少なくともOP-1、OP-2、OP-3、CBMP-2A、CBMP-2B、 BMP-3、60A，DPP、Vgl、BMP-5、BMP-6、Vgr-1およびGDF-1を含む）。これらのタ ンパク質のアミノ酸配列は、上に要約されるように、本明細書中および／または 当該分野において記述されている。一般配列は、６および７システイン骨格（そ れぞれ一般配列７および８）により規定されたＣ末端ドメイン中のこれらの配列 により共有されるアミノ酸同一性、並びにこの配列内の可変の位置についての代 替的な残基の両方を含む。一般配列は、分子間あるいは分子内ジスルフィド結合 が、折り畳まれた３次構造のタンパク質に影響を及ぼし得るある特定のアミノ酸 を形成および含み得る場合、適切なシステイン骨格を提供する。さらに、一般配 列は、36位（一般配列７）あるいは41位（一般配列８）で付加的なシステインを 許容し、それによりOP-2およびOP-3の生物学的に活性な配列を含む。 ここで各Xaaは、独立して、以下で定義された１つあるいはそれ以上の特異的な アミノ酸のグループから選択される：残基(Res.)は「残基（residue）」の意味 であり、残基2でのXaa=(TyrまたはLys);残基3でのXaa=(ValまたはIle);残基4で のXaa=(Ser、AspまたはGlu);残基6でのXaa=(Arg、Gln、Ser、LysまたはAla);残 基7でのXaa=(AspまたはGlu);残基8でのXaa=(Leu、ValまたはIle);残基11でのXaa =(Gln、Leu、Asp、His、AsnまたはSer);残基12でのXaa=(Asp、Arg、AsnまたはGl u);残基13でのXaa=(TrpまたはSer);残基14でのXaa=(IleまたはVal);残基15でのX aa=(IleまたはVal);残基16でのXaa(AlaまたはSer);残基18でのXaa=(Glu、Gln、L eu、Lys、ProまたはArg);残基19でのXaa=(GlyまたはSer);残基20でのXaa=(Tyrま たはPhe);残基21でのXaa=(Ala、Ser、Asp、Met、His、Gln、LeuまたはGly);残基 23でのXaa=(Tyr、AsnまたはPhe);残基26でのXaa=(Glu、His、Tyr、Asp、Gln、Al aまたはSer);残基28でのXaa=(Glu、Lys、Asp、GlnまたはAla);残基30でのXaa=(A la、Ser、Pro、Gln，IleまたはAsn);残基31でのXaa=(Phe、LeuまたはTyr);残基3 3でのXaa=(Leu、ValまたはMet);残基34でのXaa=(Asn、Asp、Ala、ThrまたはPro) ;残基35でのXaa=(Ser、Asp、Glu、Leu、AlaまたはLys);残基36でのXaa=(Tyr、Cy s、His、SerまたはIle);残基37でのXaa=(Met、Phe、GlyまたはLeu);残基38でのX aa=(Asn、SerまたはLys);残基39でのXaa=(Ala、Ser、GlyまたはPro);残基40での Xaa=(Thr、LeuまたはSer);残基44でのXaa=(Ile、ValまたはThr);残基45でのXaa= (Val、Leu、Metまたはlle);残基46でのXaa=(GlnまたはArg)；残基47でのXaa=(Th r、AlaまたはSer);残基48でのXaa=(LeuまたはIle)；残基49でのXaa=(ValまたはM et);残基50でのXaa=(His、AsnまたはArg);残基51でのXaa=(Phe、Leu、Asn、 Ser、AlaまたはVal);残基52でのXaa=(Ile、Met、Asn、Ala、VaLGlyまたはLeu); 残基53でのXaa=(Asn、Lys、Ala、Glu、GlyまたはPhe);残基54でのXaa=(Pro、Ser またはVal);残基55でのXaa=(Glu、Asp、Asn、Gly、VaLProまたはLys);残基56で のXaa=(Thr、Ala、Val、Lys、Asp、Tyr、Ser、Gly、IleまたはHis);残基57でのX aa=(Val、AlaまたはIle);残基58でのXaa=(ProまたはAsp);残基59でのXaa=(Lys、 LeuまたはGlu);残基60でのXaa=(Pro、ValまたはAla);残基63でのXaa=(Alaまたは Val);残基65でのXaa=(Thr、AlaまたはGlu);残基66でのXaa=(Gln、Lys、Argまた はGlu);残基67でのXaa=(Leu、MetまたはVal);残基68でのXaa=(Asn、Ser、Aspま たはGly);残基69でのXaa=(Ala、ProまたはSer);残基70でのXaa=(Ile、Thr、Val またはLeu);残基71でのXaa=(Ser、AlaまたはPro);残基72でのXaa=(Val Leu、Met またはIle);残基74でのXaa=(TyrまたはPhe);残基75でのXaa=(Phe、Tyr、Leuまた はHis);残基76でのXaa=(Asp、AsnまたはLeu);残基77でのXaa=(Asp、Glu、Asn、A rgまたはSer)；残基78でのXaa=(Ser、Gln、Asn、TyrまたはAsp);残基79でのXaa= (Ser、Asn、Asp、GluまたはLys);残基80でのXaa=(Asn、ThrまたはLys);残基82で のXaa=(Ile、ValまたはAsn);残基84でのXaa=(LysまたはArg);残基85でのXaa=(Ly s、Asn、Gln、His、ArgまたはVal);残基86でのXaa=(Tyr、GluまたはHis);残基87 でのXaa=(Arg、Gln、GluまたはPro);残基88でのXaa=(Asn、Glu、TrpまたはAsp); 残基90でのXaa=(Val、Thr、AlaまたはIle);残基92でのXaa=(Arg、Lys、Val、Asp 、GlnまたはGlu);残基93でのXaa=(Ala、Gly、GluまたはSer);残基95でのXaa=(Gl yまたはAla)および残基97でのXaa=(HisまたはArg)。 一般配列８(配列番号５)は全ての一般配列７を含み、そして加えて、Ｎ末端に 次の５アミノ酸配列（配列番号８）を含む： 従って、残基７で開始し、一般配列８中の各「Xaa」は、一般配列７について規 定された特定のアミノ酸であるが、一般配列７について記述された各残基番号は 、 一般配列８の５つでずれていることが異なる。従って、一般配列７の「残基2で のXaa=(TyrまたはLys)」は、一般配列８において、残基7でのXaaを言及する。一 般配列８中において、残基2でのXaa=(Lys、Arg、AlaまたはGln);残基3でのXaa=( Lys、ArgまたはMet);残基４でのXaa=(His、ArgまたはGln);および残基5でのXaa= (Glu、Ser、His、Gly、Arg、Pro、ThrまたはTyr)である。 他の実施様態において、有用な形態形成タンパク質には、以下のように定義さ れた、一般配列９および10により規定されたものが含まれる。 詳細には、一般的配列９および10は、次のタンパク質構成のアミノ酸配列であ る：ヒトOP-1、ヒトOP-2、ヒトOP-3、ヒトBMP-2、ヒトBMP-3、ヒトBMP-4、ヒトB MP-5、ヒトBMP-6、ヒトBMP-8、ヒトBMP-9、ヒトBMP10、ヒトBMP-11、Drosophila 60A、Xenopus Vg-1、ウニUNIVIN、ヒトCDMP-1(マウスGDF-5)、ヒトCDMP-2(マウ スGDF-6、ヒトBMP-13)、ヒトCDMP-3(マウスGDF-7、ヒトBMP-12)、マウスGDF-3、 ヒトGDF-1、マウスGDF-1、ニワトリDORSALIN、dpp、Drosophila SCREW、マウスN ODAL、マウスGDF-8、ヒトGDF-8、マウスGDF-9、マウスGDF-10、ヒトGDF-11、マ ウスGDF-11、ヒトBMP-15、およびラットBMP3b。一般配列７のように、一般配列 ９はＣ末端６システイン骨格を提供し、そして一般配列８のように、一般配列10 は７システイン骨格を提供する。 ここで、各Xaaは独立して、以下に規定された１つあるいはそれ以上の特異的な アミノ酸配列のグループから選択される。:残基(Res.)は「残基（residue）」を 意味し、残基1でのXaa=(Phe、LeuまたはGlu);残基2でのXaa=(Tyr、Phe、His、Ar g、Thr、Lys、Gln、ValまたはGlu);残基3でのXaa=(Val、Ile、LeuまたはAsp);残 基4でのXaa=(Ser、Asp、Glu、AsnまたはPhe);残基5でのXaa=(PheまたはGlu);残 基6でのXaa=(Arg、Gln、Lys、Ser、Glu、AlaまたはAsn);残基7でのXaa=(Asp、Gl u、Leu、AlaまたはGln);残基8でのXaa=(Leu、Val、Met、IleまたはPhe)；残基9 でのXaa=(Gly、HisまたはLys);残基10でのXaa=(TrpまたはMet);残基11でのXaa=( Gln、Leu、His、Glu、Asn、Asp、SerまたはGly);残基12でのXaa=(Asp、Asn、Ser 、Lys、Arg、GluまたはHls);残基13でのXaa=(TrpまたはSer);残基14でのXaa=(Il eまたはVal);残基15でのXaa=(IleまたはVal);残基16でのXaa=(Ala、Ser、Tyrま たはTrp);残基18でのXaa=(Glu、Lys、Gln、Ｍet、Pro、Leu、Arg、HisまたはLys );残基19でのXaa=(Gly、Glu、Asp、Lys、Ser、Gln、ArgまたはPhe);残基20でのX aa=(TyrまたはPhe);残基21でのXaa=(Ala、Ser、Gly、Met、Gln、His、Glu、Asp 、Leu、Asn、LysまたはThr);残基22でのXaa=(AlaまたはPro);残基23でのXaa=(Ty r、Phe、Asn、AlaまたはArg);残基24でのXaa=(Tyr、His、Glu、PheまたはArg); 残基26でのXaa=(Glu、Asp、Ala、Ser、Tyr、His、Lys、Arg、GlnまたはGly);残 基28でのXaa=(Glu、Asp、Leu、Val、Lys、Gly、Thr、AlaまたはGln);残基30での Xaa=(Ala、Ser、Ile、Asn、Pro、Glu、Asp、Phe、GlnまたはLen);残基31でのXaa =(Phe、Tyr、Leu、Asn、GlyまたはArg);残基32でのXaa=(Pro、Ser、AlaまたはVa l);残基33でのXaa=(Leu、Met、Glu、PheまたはVal);残基34でのXaa=(Asn、Asp、 ThLGly、Ala、Arg、LeuまたはPro);残基35でのXaa=(Ser、Ala、Glu、Asp、Thr、 Leu、Lys、GlnまたはHis);残基36でのXaa=(Tyr、His、Cys、Ile、Arg、Asp、Asn 、Lys、Ser、GluまたはGly);残基37でのXaa=(Met、Leu、Phe、Val、GlyまたはTy r);残基38でのXaa=(Asn、Glu、Thr、Pro、Lys、His、Gly、Met、ValまたはArg); 残基39でのXaa=(Ala、Ser、Gly、ProまたはPhe)；残基40でのXaa=(Thr、Ser、Le u、Pro、HisまたはMet);残基41でのXaa=(Asn、Lys、Val、ThrまたはGln);残基42 でのXaa=(His、TyrまたはLys);残基43でのXaa=(Ala、Thr、LeuまたはTyr); 残基44でのXaa=(Ile、Thr、Val、Phe、Tyr、MetまたはPro);残基45でのXaa=(Val 、Leu、Met、IleまたはHis);残基46でのXaa=(Gln、ArgまたはThr);残基47でのXa a=(Thr、Ser、Ala、AsnまたはHis);残基48でのXaa=(Leu、AsnまたはIle);残基49 でのXaa=(Val、Met、Leu、Proまたはlle);残基50でのXaa=(His、Asn、Arg、Lys 、TyrまたはGln);残基51でのXaa=(Phe、Leu、Ser、Asn、Met、Ala、Arg、Glu、G lyまたはGln);残基52でのXaa=(Ile、Met、Leu、Val、Lys、Gln、AlaまたはTyr); 残基53でのXaa=(Asn、Phe、Lys、Glu、Asp、Ala、Gln、Gly、LeuまたはVal);残 基54でのXaa=(Pro、Asn、Ser、ValまたはAsp);残基55でのXaa=(Glu、Asp、Asn、 Lys、Arg、Ser、Gly、Thr、Gln、ProまたはHis);残基56でのXaa=(Thr、His、Tyr 、Ala、Ile、Lys、Asp、Ser、GlyまたはArg);残基57でのXaa=(Val、Ile、Thr、A la、LeuまたはSer);残基58でのXaa=(Pro、Gly、Ser、AspまたはAla);残基59での Xaa=(Lys、Leu、Pro、Ala、Ser、Glu、ArgまたはGly);残基60でのXaa=(Pro、Ala 、Val、ThrまたはSer);残基61でのXaa=(Cys、ValまたはSer);残基63でのXaa=(Al a、ValまたはThr);残基65でのXaa=(Thr、Ala、Glu、Val、Gly、AspまたはTyr); 残基66でのXaa=(Gln、Lys、Glu、ArgまたはVal);残基67でのXaa=(Leu、Met、Thr またはTyr);残基68でのXaa=(Asn、Ser、Gly、Thr、Asp、Glu、LysまたはVal);残 基69でのXaa=(Ala、Pro、GlyまたはSer);残基70でのXaa=(Ile、Thr、LeuまたはV al);残基71でのXaa=(Ser、Pro、Ala、Thr、AsnまたはGly);残基２でのXaa=(Val 、Ile、LeuまたはMet);残基74でのXaa=(Tyr、Phe、Arg、Thr、TyrまたはMet);残 基75でのXaa=(Phe、Tyr、His、Leu、Ile、Lys、GlnまたはVal);残基76でのXaa=( Asp、Leu、AsnまたはGlu);残基77でのXaa=(Asp、Ser、Arg、Asn、Glu、Ala、Lys 、GlyまたはPro);残基78でのXaa=(Ser、Asn、Asp、Tyr、Ala、Gly、Gln、Met、G lu、AsnまたはLys);残基79でのXaa=(Ser、Asn、Glu、Asp、Val、Lys、Gly、Gln またはArg);残基80でのXaa=(Asn、Lys、Thr、Pro、Val、Ile、Arg、SerまたはGl n);残基81でのXaa=(Val、Ile、ThrまたはAla);残基82でのXaa=(Ile、Asn、Val、 Leu、Tyr、AspまたはAla);残基83でのXaa=(Leu、Tyr、LysまたはIle);残基84で のXaa=(Lys、Arg、Asn、Tyr、Phe、Thr、GluまたはGly);残基85でのXaa=(Lys、A rg、His、Gln、Asn、GluまたはVal);残基86でのXaa=(Tyr、His、GluまたはIle); 残基87でのXaa=(Arg、Glu、Gln、ProまたはLys);残基88でのXaa=(Asn、Asp、Ala 、Glu、GlyまたはLys);残基89でのXaa=(MetまたはAla);残基90でのXaa=(Val、Il e、Ala、Thr、SerまたはLys)；残基91でのXaa=(ValまたはAla);残基92でのXaa=( Arg、Lys、Gln、Asp、Glu、VaLAla、SerまたはThr);残基93でのXaa=(Ala、Ser、 Glu、Gly、ArgまたはThr);残基95でのXaa=(Gly、AlaまたはThr);残基97でのXaa= (His、Arg、Gly、LeuまたはSer)。さらに、rBMP3bおよびmGDF-10の残基53の後に Ileがあり；CDF-1の残基54の後にＴがあり;BMP3の残基54の後にＶがあり；BMP-8 およびD or salinの残基78の後にＧがあり；hGDF-1の残基37の後にPro、Gly、Gl y、Proがある。 一般配列10（配列番号７）は、全ての一般配列９（配列番号６）を含み、さら にそのＮ末端に以下の配列（配列番号９）を含む。 従って、残基６で開始し、一般配列10の各「Xaa」は、一般配列９について規定 された特定のアミノ酸であるが、一般配列９について記述された各残基番号は、 一般配列10の５つでずれていることが異なる。従って、一般配列９の「残基1で のXaa=(Tyr、Phe、His、Arg、Thr、Lys、Gln、ValまたはGlu)」は、一般配列10 の残基6でのXaaを言及する。一般配列10では、残基2でのXaa=(Lys、Arg、Gln、S er、His、Glu、AlaまたはCys);残基3でのXaa=(Lys、Arg、Met、Lys、Thr、Leu、 TyrまたはAla);残基4でのXaa=(His、Gln、Arg、Lys、Thr、Leu、Val、Proまたは Tyr);および残基5でのXaa=(Gln、Thr、His、Arg、Pro、Ser、Ala、Gln、Asn、Ty r、Lys、AspまたはLeu) 上述のとおり、本発明において有用な、ある現在好ましい骨形態形成ポリペプ チド配列は、好ましい参照配列のhOP-1を規定するアミノ酸配列と60％以上の同 一性、好ましくは65％以上の同一性を有する。これらの特に好ましい配列は、OP -1およびOP-2タンパク質（Drosophila 60Aタンパク質を含む）の対立遺伝子およ び系統発生の対応物変異体を含む。従って、ある特に好ましい実施様態において 、 有用なタンパク質には本明細書中で、「OPX」(配列番号３)のように言及される 一般のアミノ酸配列内のポリペプチド鎖の対を含む活性タンパク質が含まれ、こ れは７システイン骨格を規定し、そしてOP-1およびOP-2のいくつかの同定された 変異体間の相同性を提供する。本明細書中に記述したように、所定の位置での各 Xaaは、独立的して、マウスあるいはヒトのOP-1またはOP-2のＣ末配列における 対応位置で生じる残基から選択される。 ここで、残基2でのXaa=(LysまたはArg);残基3でのXaa=(LysまたはArg);残基11で のXaa=(ArgまたはGln);残基16でのXaa=(GlnまたはLeu);残基19でのXaa=(Ileまた はVal);残基23でのXaa=(GluまたはGln);残基26でのXaa=(AlaまたはSer);残基35 でのXaa=(AlaまたはSer);残基39でのXaa=(AsnまたはAsp);残基41でのXaa=(Tyrま たはCys);残基50でのXaa=(ValまたはLeu);残基52でのXaa=(SerまたはThr);残基5 6でのXaa=(PheまたはLeu);残基57でのXaa=(IleまたはMet);残基58でのXaa=(Asn またはLys);残基60でのXaa=(Glu、AspまたはAsn);残基61でのXaa=(Thr、Alaまた はVal);残基65でのXaa=(ProまたはAla);残基71でのXaa=(GlnまたはLys);残基73 でのXaa=(AsnまたはSer);残基75でのXaa=(IleまたはThr);残基80でのXaa=(Pheま たはTyr);残基82でのXaa=(AspまたはSer);残基84でのXaa=(SerまたはAsn);残基8 9でのXaa=(LysまたはArg);残基91でのXaa=(TyrまたはHis);および残基97でのXaa =(ArgまたはLys)。 なお他の好ましい実施様態において、有用な形態形成活性タンパク質は、低、 中程度または高ストリンジェントのハイブリダイゼーション状件下で、参照形態 形成配列（例えば、OP-1、OP-2、BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、60A、GDF5、GDF6、G DF7などの保存的７システインドメインを規定するＣ末端配列）をコードするDNA またはRNAにハイブリダイズする核酸によりコードされる配列を含むアミノ酸配 列を有するポリペプチド鎖を持つ。本明細書に使用される場合、高ストリンジェ ントなハイブリダイゼーション条件は、既知の技術40％ホルムアミド、5×SSPE 、5×デンハルト溶液、および0.1%SDS中で37℃での一晩、ならびに0.1×SSPE、0 .1%SDS中50℃での洗浄）に従うハイブリダイゼーションとして規定される。標準 的なストリンジェントな条件は、市販の標準の分子クローニングの教示において 良く特徴付けられる。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual第二版 、Sambrook、FritschおよびManiatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989);DNA Cloning一巻および二巻(D.N.Glover編、1985);Oligonucleotide Synt hesis(M.J.Gait編、1984):Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgi ns編集、1984);およびB.Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning(198 4)。 本明細書中で意図される形態形成タンパク質は、インタクトあるいは短縮型の ゲノムあるいはcDNAから、または原核生物あるいは真核生物の宿主細胞中の合成 DNAから発現し得る。二量体タンパク質は培養培地から単離され得、および／ま たは生物学的に活性な組成物を形成するためにインビトロで再折たたみおよび二 量体化され得る。ヘテロ二量体は、インビトロで、個々の異なるポリペプチド鎖 を組み合せることにより形成され得る。あるいは、ヘテロ二量体は、個々の異な るポリペプチド鎖をコードする核酸を同時発現することにより、単一細胞内で形 成され得る。例えば、いくつかの例示的な組換えヘテロ二量体タンパク質生成プ ロトコールについては、WO93/09229あるいは米国特許第5,411,941号を参照のこ と。現在好ましい宿主細胞には、E.coliを含む原核生物、または、酵母あるいは Saccharomycesあるいは哺乳類細胞（例えば、CHO、COSあるいはBSC細胞）を含む 真核生物が含まれるがこれらに限定されない。当業者は、他の宿主細胞が有利に 使用され得ることを理解する。形態形成活性について生成、使用および試験方法 を含む本発明の実施に有用であるタンパク質の詳細な記述は、米国特許第5,266, 683号、同第5,011,691号、および／または米国特許第5,585,237号を含む多数の 刊行物。（これらの開示は本明細書中に参考として採用される）、ならびに本明 細書中に援用される刊行物（任意の米国特許を含む）（この開示は、本明細書中 に参考として援用される。） 本明細書中上述される二量体タンパク質種は、本明細書において「成熟」形態 形成タンパク質として言及される。これらのタンパク質の可溶性形態はまた、二 量体種を一部あるいは全ての少なくとも1つ、および好ましくは２つの形態形成 タンパク質プロドメインペプチドと複合体化することにより作られ得る。あるい は、形態形成はタンパク質の可溶性複合体形態は、例えば1994年2月18日に公開 されたWO94/03600に記載されたプロトコールを使用して細胞培養培地から単離さ れ得る（以下を参照のこと）。 モルフォゲンの他の可溶性形態は、これらのタンパク質の非切断プロ形態の二 量体、並びに、二量体の片方のサブユニットはタンパク質の非切断のプロ形態で あり、他方のサブユニットがタンパク質の成熟形態（その短縮形態、好ましくは 切断プロドメインペプチドと非共有結合した形態を含む）を含む「ヘミ二量体」 を含む。 公開された出願WO94/03600に記述のように、その教示は本明細書中に参考とし て採用されるが、有用なプロドメインは全長プロ領域、およびその様々な短縮形 態、特にプロドメインポリペプチド内のタンパク質分解性のArg-Xaa-Xaa-Arg切 断部位で切断される短縮形態を含む。例えば、OP1中に可能性のあるプロ配列は 、残基30〜292（全長型）;48〜292;および158〜292、および配列番号２の全てに より規定された配列を含む。可溶性OP1複合体の安定性は、プロ領域が残基48〜2 92短縮形態（ここで残基30〜47は他のモルフォゲンのＮ末端部分と配列相同性を 示し、現在では全てのモルフォゲンの複合体安定性を増強するにあたり特に有用 性を有すると考えられている）のような短縮形態ではなく全長型を含む場合、最 も増強される。従って、現在好ましいプロドメインは、少なくともＮ末端フラグ メント（例えば、天然に存在するモルフォゲンプロドメイン、もしくは天然に存 在するペプチドの特性を増強する溶解性および／または安定性を保持するその生 合成変異体）を含むペプチドを含む。 当業者に理解されるように、プロ領域をコードする有用な配列は、既知のモル フォゲンをコードする遺伝子配列から得られ得る。あるいは、キメラのプロ領域 は、１つ以上の既知のモルフォゲンの配列はから構築され得る。なお他の選択肢 は、１つ以上の既知のプロ領域配列の合成配列変異体を造る方法である。 変性剤なしに実施される単一の３工程クロマトグラフィーのプロトコールを使 用して、可溶性モルフォゲン複合体は、馴化培地から単離され得る。プロトコー ルには、培地（あるいは体液）をアフィニティーカラムでの泳動、続いてイオン 交換およびゲル濾過クロマトグラフィーを含む。以下に記述するアフィニティー カラムはZn-IMACカラムである。別のプロトコールもまた有用性があると想定さ れ、イムノアフィニティーカラム（標準的な製法を使用して作られ、そして、例 えば、所定のモルフォゲンプロドメインに特異的な抗体（例えば、タンパク質Ａ 抱合型のセファロースカラムと複合体化された）を使用する）を含む。イムノア フィニティーカラムを開発するためのプロトコールは当該分野でよく記述されて いる（例えば、Guide to Protein Purification,M.Deutscher編,Academic Press ,San Diego,1990,特にそのVII節およびXI節を参考のこと）。 モルフォゲンは、組換えタンパク質を発現し得る任意の適した宿主細胞おいて 発現され得る。例えば、当該分野で記述されるように、（例えば、国際出願US90 /05903(WO91/05802)を参照のこと）哺乳動物（CHO、チャイニーズハムスター卵 巣）細胞が使用され得る。CHO細胞は0.5%FBSを含む馴化培地が、固定化金属イオ ンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）を使用して最初に精製される。馴 化培地からの可溶性モルフォゲン複合体は、Zn-IMAC樹脂に非常に選択的に結合 し、そして高濃度のイミダゾール（50mMイミダゾール、pH8.0）が結合複合体が 効果的に溶出されることが必要である。Zn-IMAC工程によりフロースルー中に溶 出する夾雑血清タンパク質のバルク、および35mMイミダゾール洗浄画分から可溶 性モルフォゲンを分離する。Zn-IMAC精製可溶性モルフォゲンは、次に、20mM Na PO₄(pH7.0)（50mM NaClを含む）で平衡化したS-セファロースカチオン交換カラ ムに適用される。このS-セファロース工程は続くゲル濾過工程の調製における可 溶性複合体をさらに精製および濃縮するのに貢献する。タンパク質は、TBS中で 平衡化したセファクリルS-200HRカラムに適用された。実質的に同じプロトコー ルを使用して、可溶性モルフォゲンはまた、１つまたはそれ以上の体液（血清、 脳脊髄液、または腹水を含む）から単離され得る。 細胞培養培地から単離された可溶性複合体は、標準タンパク質分子量と比較し て110kDaの見かけの分子量で溶出する。タンパク質の同一性は、Ｎ末端の配列決 定により確認され得る。最終混合物の純度は、還元15%ポリアクリルアミドゲル 中の適切な画分を通過させることにより確認され得る。 培養培地あるいは体液から可溶性タンパク質を精製する代替案として、可溶性 複合体は、精製したプロドメインおよび成熟した二量体種から構成され得る。首 尾良く複合体形成は、ジスルフィド結合に影響を及ぼさずに、これらの分子のこ の折り畳み構造を緩和するのに十分な変性条件下で、成分の結合を必要とするよ うである。好ましくは変性条件は、小胞体の環境を模倣し、その結果、切断プロ ドメインが、緩和した折り畳み条件下で成熟した二量体種に結合する機会を有す る。次いで、溶液中の変性剤の濃度を、好ましくは工程ごとに減少させ、その結 果、プロドメインと二量体との結合を維持する間、二量体およびプロ領域を適切 に再折り畳みさせる。有用な変性剤は、pH4〜10好ましくはpH6〜8の緩衝溶液中 、4〜6M尿素あるいはグアニジン塩酸塩(GuHCl)を含む。次いで、可溶性複合体は 、0.1〜2M未満の尿素あるいはGuHCl、好ましくは1〜2M尿素のGuHClの最終変性剤 濃度を有する溶液中に、制御された透析あるいは希釈により形成され、次いでこ れは好ましくは生理緩衝液中に希釈され得る。タンパク質精製／再生手順および 考案は、当該分野でよく記述されており、そして適切な再生プロトコールを開発 するための詳細は、当業者によって容易に決定され得る。これについての１つの 有用なテキストは、Guide to Protein Purification,M.Deutscher編,Academic P ress,San Diego,1990、特にＶ節である。複合体形成はまた、１つまたはそれ以 上のシャペロンタンパク質の付加により助けられ得る。複合体の安定性もまた、 アルギニンのような正電荷のアミノ酸の存在により増強される。 II．処方と送達の案 一般的な案 本発明の実施に有用な組成物は、日常の方法を使用して処方され得る。要求さ れる全ては、投与当りのモルフォゲンタンパク質の所望の最終濃度の決定である 。有用な処方、方法論は、凍結乾燥タンパク質あるいはアナログの可溶化を含む 。 有用なタンパク質あるいはアナログの可溶化溶液は、エタノール、尿素、生理学 的および／または酸性緩衝液、生理食塩水、ならびにアセトニトリル／トリフル オロ酢酸溶液、などを含む。例えば、米国特許第5,266,683号を参照のこと。所 望される最終濃度のタンパク質またはアナログは、タンパク質あるいはアナログ の特異的活性、ならびに型、容積および／または欠損の解剖学的位置に依存する 。１つの好ましい実施様態において、有用なタンパク質およびアナログは、標準 のラットバイオアッセイにおいて測定される1.0〜2.0ng分子/25mgマトリックス 、あるいは0.5〜1.0ngタンパク質/25mgマトリックスの特異的活性を形成する最 大骨格の半分を有するものである。より低い特異的活性を有するタンパク質もま た、異なる組織モルフォゲンアッセイにおいて特異的活性を有するモルフォゲン として有利に使用され得る。加えて、所望されるタンパク質の最終濃度は、年齢 、性別および／またはレシピエントの全般的な健康に依存し得る。全てのこれら の案は、本発明により可能となったアッセイを用いて評価および最適化され得る 。 有用なモルフォゲンタンパク質あるいはアナログの用量の投与範囲は、0.1〜1 000mg/kg体重を含み、好ましくは1〜100mg/kgの範囲を含むことが意図される。 本明細書中下記に記されるように、タンパク質あるいはアナログは単一のボーラ スとして、あるいは経時的に投与される複数の用量として、全身に投与され得る 。液体投与の有用な濃度は、約0.5〜5000mlの範囲を含む。投与の至適化は、日 常的な実験法を超えない程度に要求され、そしてこれは当業者の技術レベル内で ある。成熟したタンパク質（例えば、OP1、20mg）を21日間継続して正常に生育 しているラットに毎日投与する場合、明白な形態形成タンパク質を誘導性病理学 的障害を生じないことに留意すべきである。さらに、正常な新生マウスに10日間 毎日注射するモルフォゲン（例えば、OP1）の10mgの全身の注射は、いかなる全 体の異常をも起さない。毒性レベルの候補アナログは、治療的に有用な用量を決 定するために本発明によって容易に決定され得る。 タンパク質またはアナログは、全身投与に適切な任意の手段（例えば、i.v.ま たは腹膜内によって非経口的に、または経口的に）によって個体に提供され得る 。液体処方物は、好ましくは水性の、生理学的に受容可能な溶液の一部を構成し 、その結果、所望のタンパク質またはアナログの標的部位への送達に加え、溶液 は、 細胞または被験体の電解質および／または容量バランスに他の点では悪影響を与 えない。適切な、水性媒体は、通常の生理食塩水（例えば、9.85% NaCl、0.15M ，pH7〜7.4）を含むが、これに限定されない。薬剤を含むそのような水溶液は、 例えば、0.1%トリフルオロ酢酸（TFA）または0.1%HCl中のアセトニトリル含有50 %エタノールまたは等価な溶媒中に、凍結乾燥したタンパク質を溶解するか、ま たはタンパク質を分散させることにより作製され得る。例えば、次に、１０容量 のリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）（さらに０．１％〜０．２％のヒト血清アル ブミン（HSA）を含み得る）に、結果として生じる溶液の１容量を添加する。結 果として生じる溶液は、好ましくは、広範にボルテックスをかける。あるいは、 凍結乾燥したタンパク質またはアナログを、酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）ま たはその等価物に溶解し得る。 タンパク質またはアナログが非経口的に（例えば、静脈内に、皮下に、筋肉内 に、眼窩内に、眼に、脳室内に、頭蓋内に、嚢内に、脊椎内に、槽内に、腹腔内 に、頬に、直腸に、膣に、鼻腔内に、またはエアロゾル投与により提供される場 合、タンパク質は好ましくは水溶液の一部を構成する。現在、モルフォゲンの静 脈内投与に好ましいのは、PBSまたは酢酸ナトリウム緩衝液である。タンパク質 またはアナログは、タンパク質またはアナログの単回用量またはボラースの定期 的な注入として投与され得るか、あるいは外部（例えば、i.v.バッグ）または内 部（例えば、生体侵食性移植片、または移植された、モルフォゲン／アナログ産 生細胞のコロニー）のリザーバーから静脈内または腹腔内投与によってより連続 的になされ得る。 非経口的投与に有用な溶液は、薬学分野で周知の任意の方法によって調製され 得、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences(Gennaro，A.編)，Mack Pub .，1990に記載される。 あるいは、本明細書において記載される形態形成タンパク質またはアナログは 、経口的に投与され得る。治療法としてのタンパク質の経口投与は、一般的に行 われない。なぜなら、ほとんどのタンパク質は、血流に吸収され得る前に、哺乳 動物の消化系における消化酵素または酸によって容易に分解されるからである。 しかし、本明細書において記載される形態形成タンパク質は、代表的には、酸安 定 性およびプロテアーゼ耐性である（例えば、米国特許第4,968,590号を参照のこ と）。さらに、少なくとも１つのモルフォゲンであるOP1は、乳腺分泌物、初乳 および５７日目の乳汁において同定されている。さらに、乳腺分泌物から精製さ れたOP1は、形態形成的に活性であり、また血流中で検出される。経口摂取され る乳汁を介する、母性投与は、TGFβスーパーファミリータンパク質の天然の送 達経路であり得る。Letterioら((1994)，Science 264:1936-1938)は、TGFβがマ ウス乳汁に存在すること、および放射性標識化TGFβは、哺乳する子供の胃腸粘 膜によって吸収されることを報告する。標識された経口摂取されたTGFβは、子 供の体細胞（肺、心臓および肝臓を含む）においてインタクトな形態で迅速に出 現する。これらの知見、ならびに以下の実施例に開示される知見は、経口および 非経口投与は、形態形成タンパク質を個体に全身的に投与するために実行可能な 手段であることを示す。さらに、本明細書において記載される特定の形態形成タ ンパク質の成熟形態は、代表的には、あまり可溶性ではないが、乳汁（および乳 腺分泌物および初乳）において見出されるタンパク質の形態は、容易に可溶性で あり、これはおそらく、成熟二量体の種が、インタクト配列のプロドメインの一 部または全部と会合することによるか、および／あるいは１つ以上の乳汁成分と 会合することによる。例えば、WO 93/05751、1993年4月1日公開、および米国特 許出願第08/278,730号を参照のこと。これらの開示を、本明細書において参考と して引用する。従って、本明細書において提供される化合物はまた、インビトロ またはインビボにおいて化合物の可溶性を増強し得る分子と会合し得る。 溶解度を増強し得、そして経口投与に特に有用な別の分子は、カゼインである 。例えば、０．２％カゼインの添加は、成熟な活性形態のOP1の溶解度を８０％ 増加させる。乳汁において見出される他の成物および／または種々の血清タンパ ク質はまた、有用であり得る。 あるいは、または加えて、経口投与された形態形成タンパク質またはアナログ は胃腸系を介して輸送されるのが許容され得る送達ビヒクルの一部として処方さ れ得る。一つの例として、タンパク質は、生物学的に侵食性のマイクロスフェア （特に、そのポリマーが胃腸粘液と管壁細胞との一過的な相互作用を可能にする 十分な接着特性を有し、そして粘膜の吸収性上皮およびパイアー斑のリンパ系組 織を覆う小胞関連上皮を横切り得る）の一部として処方され得る。有用なポリマ ーとして、ポリスチレン、ポリ乳酸および／またはポリグリコリドおよび／また はポリシアノアクリレートポリマーならびにこれらの組み合わせが挙げられるが これらに限定されない。そして、有用なポリマーは、形態形成タンパク質を腸管 の内層を横切り、循環系へ輸送するために使用され得る。マイクロスフェアは以 下およびMathlowitzら(1996)Nature 386:410-414に記載され、また有用であると 考慮される。フマル酸とセバシン酸とのポリ無水物コポリマー「ポリ（FA:SA） 」（例えば、相反転ナノカプセル化によって作製される20:80マイクロスフェア （直径0.1〜10mm）中に処方される）は、光学顕微鏡で測定した場合、両方の膜 を一時間程度の短時間で横切る。さらに他の有用なマイクロスフェアは、ポリ（ フマル酸無水物）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）のポリマーブレンド を含む。 形態形成タンパク質またはアナログは、標準的な相反転プロトコールによって 、容易にマイクロカプセル化され得る。例えば、形態形成タンパク質は、希釈ポ リマー溶液(すなわち、塩化メチレン中に１〜４％(w/v))で添加され、次に溶媒 と非溶媒との比が1:100で、攪拌しない非溶媒浴（石油エーテル）中に迅速に注 がれ、ナノおよびマイクロスフェア（直径0.1〜5.0μm）を自発的に形成させる 。 形態形成タンパク質およびアナログは、当然のことながら、単独でか、または 本明細書において記載される状態の処置に有益であることが公知の他の分子と組 み合わせて、全身的に投与され得る。従って、他の実施態様において、本発明は 、形態形成タンパク質またはアナログが新規の組織形成を促進するか、または増 強する他の薬剤と組み合わせられている薬学的組成物を評価するためのアッセイ を提供する。そのような組成物の各々において、形態形成剤と分裂促進剤との比 率は、文献に開示されるように、そして本発明の方法を使用する簡単な実験を通 じて決定されるように、その活性に基づき調整され得、単回単位投薬量において 、各化合物の治療的有効投薬量を提供する。そのような組成物中の形態形成剤お よび分裂促進剤は、各々、好ましくは、組成物の乾燥重量の少なくとも約１％、 およびより好ましくは５％または１０％より多くを構成する。しかし、組成物は 、上記に記載されるように、そして一般的にRemington's Pharmaceutical Scien ce s(Gennaro，A.編)，Mack Pub.，1990に記載されるように、他の薬学的キャリア および活性薬剤を含む。従って、形態形成剤および分裂促進剤は、各々薬学的組 成物の最終重量の小画分を構成し得る。 形態形成処方物は、移植前に標準的な手順を用いて容易に滅菌され得る。例え ば、タンパク質は、簡便に濾過滅菌（例えば、0.22ミクロンフィルターを使用し て）され得る。あるいは、エチレンオキシドのような化学薬品を使用し得る。キ ャリア物質、湿潤剤および／または結合剤は、化学薬品、熱または電離放射線に 曝露することにより、滅菌され得る。さらに、形態形成処方物は、電離放射線（ 例えば、γ線放射または電子ビーム放射）への曝露によって、10^-6の無菌保証レ ベルまで、最終的に滅菌され得る。有用な用量範囲は、約0.5〜4.0メガラド、好 ましくは2.0〜3.5メガラドの範囲内を含む。例えば、WO 96/40297（1996年12月1 9日公開）を参照のこと。 本発明の実施は、以下の実施例から、なおより十分に理解される。以下の実施 例は、本明細書において説明のためにのみ表され、そしていかなる方法において も、本発明を制限するように解釈されるべきではない。 ＩＶ．バイオアッセイ Ａ．骨形態形成活性のバイオアッセイ：軟骨内骨形成および関連する特性 SampathおよびReddi(Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1983）80:6591-6595)なら びに米国特許第4,968,590号（これらの開示は本明細書において参考として引用 する）に記載される当該分野で認識されている骨誘導のバイオアッセイは、所定 のデバイスまたは処方物の効力を確立するために使用され得る。手短に言えば、 アッセイは、試験サンプルをエーテル麻酔下のレシピエントラットにおける皮下 部位に沈着させる工程からなる。垂直方向の切開（1cm）を、滅菌条件下で胸部 領域にわたる皮膚において作製し、ブラントジセクションによりポケットを調製 する。特定の状況において、約２５mgの試験サンプルを、ポケット内部に深く移 植し、そして切開を金属皮膚クリップで閉鎖する。異所性の部位(heterotropic site）は、同所性部位の使用から生じる可能性のある不明確性なしに、骨誘導の 研究を可能にする。移植片はまた、筋肉内に提供され得、デバイスを接近可能 な前駆細胞のより近くに接触して配置する。代表的な筋肉内移植片は、両脚の骨 格筋中に作製される。 異所性部位で生じる一連の細胞反応は、複雑である。軟骨内骨形成の多段階カ スケードは、以下を含む：フィブリンおよびフィブロネクチンの移植マトリクス への結合、細胞の走化性、線維芽細胞の増殖、軟骨芽細胞への分化、軟骨形成、 血管の侵入、骨形成、リモデリングおよび骨髄分化。 成功した移植片は、制御された進行を、タンパク質に誘導される軟骨内骨発生 の以下を含む段階を通じて示す：（１）１日目の、多形核白血球による一過性浸 潤；（２）２日目および３日目の、間葉細胞の移動および増殖；（３）５日目お よび６日目の、軟骨細胞の出現；（４）７日目の、軟骨マトリクス形成；（５） ８日目の、軟骨の石灰化；（６）９日目および１０日目の、血管の侵入、骨芽細 胞の出現、および新骨の形成；（７）１２日目〜１８日目の、骨芽細胞および骨 リモデリングの出現；ならびに（８）２１日目の、小骨における造血骨髄分化。 組織学的切片化および染色は、移植片の骨形成の程度を決定するために、好ま しい。トルイジンブルーまたはヘマトキシリン(hemotoxylin)／エオシンを用い る染色は、最終的な軟骨内骨の発生を、明らかに実証する。１２日目のバイオア ッセイは、骨誘導活性が試験サンプルと関連するのか否かを決定するのに十分で ある。 さらにアルカリホスファターゼ活性および／または全カルシウム含量は、骨形 成の生化学的マーカーとして使用され得る。アルカリホスファターゼ酵素活性は 、切り出された試験物質のホモジナイゼーション後に、分光光度的に測定され得 る。インビボにおける９〜１０日の活性のピークは、その後ゆっくりと減少する 。組織学的に骨発生を示さないサンプルは、これらのアッセイ条件下でアルカリ ホスファターゼ活性を全く示さないであろう。このアッセイは、試験サンプルが ラットから取り出された後に非常に迅速に骨形成を定量するためおよび推定値を 取得するために有用である。アルカリホスファターゼ活性レベルおよび組織学的 評価によって測定される結果は、「骨形成単位」として表され得る。１骨形成単 位は、１２日目の、最大骨形成活性の半値に必要なタンパク質量を表す。さらに 、用量曲線を、種々の濃度のタンパタ質をアッセイすることにより、精製スキー ムの各 段階でのインビボ骨誘導活性について構築し得る。従って、当業者は、日常的な 実験のみを用いて代表的な用量曲線を構築し得る。 全カルシウム含量を、例えば、冷0.15M NaCl，3mM NaHCO₃，pH9.0中でのホモ ジナイゼーション、および沈殿物の酸可溶性画分のカルシウム含有量の測定後に 、決定し得る。 Ｂ．実施例１ このアッセイは、全身投与された形態形成タンパク質が、局所的欠損部位で骨 形成を誘導する能力について、実証する。局所的で、許容性の部位は、マトリク ス単独（ウシの鉱物質除去、タンパク質除去した骨コラーゲン）をラットの皮下 または筋肉内部位に移植することにより、作製された。皮下部位に単独で移植さ れた場合、骨コラーゲンは、局所的炎症を起こし、そして移動する間葉幹細胞（ 例えば、局所的に与えられた場合に新骨形成を誘導する骨誘導シグナルに対し、 応答し得る前駆細胞）により、迅速に囲まれるようになる。単独のままの場合、 誘導された炎症応答は、時間の経過により消滅し得る、移植部位での線維性組織 形成をもたらす。本実施例において、緩衝液単独、可溶性OP-1、または成熟OP-1 は、形態形成タンパク質が移植位置で新骨形成を誘導する能力を評価するために 、全身的に投与された。 ロング−エバンス（Long-Evans）ラットを、各々４つの骨コラーゲン移植に供 した：上記のように（25mgマトリクス／移植片）、２つを皮下に（胸部の左側、 右側）および２つを筋肉内に（各後脚の筋肉に１つ）。可溶性OP-1（0.5mg、PBS 緩衝液中の成熟等価物）、またはmOP-1（酢酸緩衝液中に0.5mg）を移植後0、8、 24、48および72時間後に尾静脈を介して静脈内（i.v.）に投与した。12日目に動 物を屠殺し、組織学的および生化学的マーカーによって新骨形成を試験した。移 植の日を０日目と考えた。４匹のラットの４つの群の各々を以下の様に試験した ： 群 アッセイ １） なし ２） 緩衝液単独；0、8、24、48および72時間で５回注入（500μl中） ３） sOP-1(500μg)；0、8、24、48および72時間で５回注入（500μl中） ４） mOP-1(500μg)；0、8、24、48および72時間で５回注入（500μl中） 結果 ^*組織学 +++＝＞70％骨および軟骨形成 ++＝＞50％骨および軟骨形成 +/-＝＞20％骨および軟骨形成 -＝＜20％骨および軟骨形成 実施例２ この実施例は、全身的に提供されたタンパク質が全身投与後に局所的欠損部位 に標的化する能力を評価するプロトコールを提供する。 この実施例において、投与されたタンパク質の血清中レベルを、標準的なプロ トコール（ウエスタンブロット、Elisa、および／または放射性ヨウ素化）によ って、注入後、0分、5分および30分で、評価する。 詳細には、mOP-1（500μlの酢酸ナトリウム中に2.5mg成熟）を、コラーゲン移 植の24時間後、尾静脈を介して、i.v.投与する。適切なコントロールは緩衝液の みを含む。OP-1投与の5および30分後に動物を屠殺する。移植片を、８M尿素含有 界面活性剤緩衝液で抽出し、そして移植片中のOP-1の存在をElisaおよびウエス タンブロット分析によって試験する。第2のプロトコールにおいて、ヨウ素化さ れたOP-1を提供し、そして放射性タンパク質を、投与後５分および３０分で、移 植部位で測定する。 全身投与されたOP-1がコラーゲン移植片中で利用可能か否か決定するために、 ヨウ素化OP-1を、コラーゲン移植の24時間後に投与した。次に、移植片を標識化 OP-1の投与後、5、15および60分で収集した。隣接する皮下の筋膜および大腿骨 格組織をコントロールとして収集した。抽出組織のタンパク質のSDS-PAGEオート ラジオグラフィー分析は、ヨウ素化されたOP-1の一部は、５分で収集したコラー ゲン移植片において検出可能であったが、15または60分で収集した移植片では検 出不可能であったことを実証した。コントロールサンプルは、検出可能なレベル の標識化OP-1を、いずれの時間間隔においても含まなかった。以前の薬物動態学 的な研究は、静脈内投与されたOP-1の約0.5％が、1分以内に循環内で利用可能で あり、そして約15〜30分の半減期で循環から除去されることを示した。iv投与の 5分後に検出可能なOP-1の部分は、軟骨内骨の分化の誘発に十分であるようであ る。 試験は、ウシ骨由来の不溶性Ｉ型コラーゲンがラットの尾の腱、ウシアキレス 腱およびＩＶ型コラーゲンを富化したマトリゲル（matrigel）から得られる他の 不溶性コラーゲンより優れていることを示した。ヒドロキシアパタイトはまた、 キャリアとしては、あまり有効ではなかった。コラーゲン移植片を用いない外科 的創傷部位は、骨形成の徴候を示さなかった。このことは、コラーゲン移植片が 全身投与によるOP-1シグナルに応答するための間葉細胞の局所的な補充に必要で ある、ということを示している。 実施例３ この実施例は、全身的に投与された形態形成タンパク質の単回用量が投与部位 から離れた局所的な許容性欠損部位での新規組織形成の誘導に適格である（誘導 にコンピテントである（誘導し得る））こと、および治療的効果は、時間に対し て感受性ではない、ということを実証する。詳細には、24または48または72時間 での単回ボーラスとして投与される形態形成タンパク質は、ラットのバイオアッ セイにおいて、複数回の注入において見られるのと匹敵するレベルで、新骨形成 を誘導する。 これらの研究において、OP-1は、全身的に、単回濃度（実施例１に示すように 、500μl中に500μgを、コラーゲンマトリクス移植後の0、6、24、48および72時 間に5回の注入で与える、または任意の所定の時間で500μgのOP-1の単回投与で 与える）で投与された。コントロール群（注入なしおよび緩衝液注入）は、コラ ーゲン移植部位（s.c.またはi.m.）で骨形成を誘導しなかったが、１２日後に試 験した場合、成熟OP-1を注入した群は、軟骨内骨を誘導した。 ロング−エバンス（６週齢）を、上記に詳述したように、皮下および筋肉内移 植に供した。移植片はウシコラーゲンマトリクス（約25mg）のみからなり、ラッ トの両側の皮下部位、そして両脚の骨格筋に移植された。ラットあたり、４つの 移植がなされ、１群あたり４匹のラットを用いた。コラーゲン移植またはOP-1投 与の日を０日および０時間と考えた。 この実施例は、単回用量が哺乳動物において新骨形成に影響を与える能力、そ して用量は欠損が形成されてから長時間後に投与され得ることを実証する。詳細 には、全身的に投与された形態形成タンパク質は、線維性組織形成のオンセット または開始後に提供される場合でも、有効である。 外傷の７２時間後までに、局所欠損部位の微小環境は、正常化および安定化し た。詳細には、微小血管は修復され、手術または外傷によって誘発された全ての 炎症応答は安定化し、そして線維芽細胞は、今やその部位に存在し、そして細胞 外マトリクス廠痕組織の積層を開始し得る。従って、形態形成タンパク質の不存 在下において、移植後の72時間までに、試験移植片の微小環境は、無防備状態の （compromised）個体（例えば、年齢、疾患（例えば、糖尿病、骨粗鬆症）、手 術または他の治療的手順（例えば、ステロイド）に関連して使用される治療法に よって、新骨仮骨の形成能力が損なわれた個体）の難治性治癒部位の環境を今や 実質的に模倣する。欠損が作製されてから実質的に後の時点で投与される場合、 全身的に投与される形態形成タンパク質が新骨形成を誘導する能力は、難治性治 癒に罹患した患者の処置について、ポジティブな関連を有する。 OP-1（2.5mg/ラット）によって誘導される骨形成は、OP-1がコラーゲン移植の ２４または７２時間後に投与される場合に最大であった。骨形成における約３０ ％の減少が、移植６時間後にOP-1が投与される場合に、観察された。図2はこれ らの結果を示す。各場合において、OP-1は、示された時点で投与され、そして骨 形成は、OP-1投与の12日後に測定された。移植後１２０時間より後の時点では、 OP-1は、骨を誘導しなかった。このことは、コラーゲンは既に線維芽細胞系統に 拘束され得ており、従ってOP-1に対し非応答性であり得ることを示唆する。 実施例４ この実施例は、骨形成が、全身的に投与された形態形成タンパク質の用量に依 存することを実証している。詳細には、このアッセイにおいて、mOP-1（酢酸緩 衝液500μl中に0.05、0.5、2.5mg）および可溶性OP-1（PBS中の0.05、0.5、2.5m gの成熟等価物）を（コラーゲン移植の２４時間後に）尾静脈を介してi.v.投与 した。適切なコントロールは、緩衝液（酢酸ナトリウム）のみを含む。動物をOP -l投与後12日目に屠殺し、そして組織学、アルカリホスファターゼ活性およびカ ルシウム含量によって、新骨形成について試験した。ロング−エバンス（4〜5週 齢）を、上記に詳述のとおり、皮下および筋肉内移植に供した。１ラットにつき 4つの移植、1群につき4匹のラットを用いた。OP-1投与の日を、０日目および０ 時間と考えた。 結果。コントロール群（緩衝液注入）は、コラーゲン移植部位（s.c.またはi. v.）において骨形成を誘導しなかったが、成熟OP-1を注入された群は、１２〜１ ４日後に試験した場合、軟骨内骨を誘導した。複数の注入を受けた群によって示 された骨形成活性は、実施例１において観察されたものと匹敵する。単回投与を 受けた群において観察された骨形成活性の量は、OP-1の投薬と直接的に関連し た；最大の活性は高濃度のOP-1（2.5mg）で観察され、そして実施例１で観察さ れるものに匹敵する骨形成活性を示した。 コラーゲン移植の24時間後でOP-1の単回投与を受けた群において、全てのもの は骨形成を示し、高用量群（2.5mg）は、複数注入を受けた群と匹敵する骨形成 を示し；低濃度（50または500μg）の群はそれぞれ移植片の50または60％の軟骨 内骨形成を示した。複数または単回高用量投与を受けた群由来の全ての移植片は 、互いに匹敵する骨を形成したので、全身投与によって形成される骨の量は、投 薬レジメに依存しない。ラットのバイオアッセイに基づき、単回用量全身投与に よりラットにおいて骨形成をもたらすための現在好ましい用量範囲は、１ラット あたり約0.5〜2.5mgの範囲、または体重1ｋｇあたり１〜50もしくは５〜25mgで ある。個体の処置に好ましい投薬量の決定は日常的な実験によって決定され得る ことが理解される。 関連する実験において、移植後２４時間で投与される単回用量（１ラットあた り2.5mg OP−1）を、3、5、7、9、11、14、21、28および60日に評価し、新骨（ 仮骨）形成の速度および質を決定した。OP-1投与の3、5、7、9、11、14、21およ び28および60日後に動物を屠殺し、そして生化学的アッセイおよび組織学によっ て新骨形成を試験した。データは、1週間までの良好な骨形成、そして骨形成が 局所的に提供されたタンパク質の同一の生物学に従うこと（すなわち、本当の骨 形成を明示する拘束段階を介する保存された進行；間葉前駆細胞の補充、軟骨細 胞の増殖、マトリックス沈着、骨芽細胞の補充および増殖；リモデリング、およ び骨髄形成を含む）を示す。 異なる実験において、局所的な異所性部位で、全身的に投与された形態形成タ ンパク質がコラーゲンキャリアを単独で移植し、新骨形成を開始する潜在能力で ある。各々約25mgのウシ骨由来の不溶性Ｉ型コラーゲンを、６〜８週齢のロング −エバンス雄性ラットの皮下（胸部領域の左側および右側）部位および筋肉内（ 左および右の大腿骨格筋）部位に移植した。１群あたり、4匹のラットが使用さ れた。OP-1（500μl）を、１ラットあたり0.05、0.5、1.25、および2.5mgの濃度 で、尾静脈を介して静脈内に与えた。コラーゲン移植片とともに緩衝液を受けた 群、およびニセの移植片とともに全身性OP-1を受けた群をコントロールとして 使用した。骨形成活性を、組織学、アルカリホスファターゼ活性およびカルシウ ム含有量によって、OP-1投与後１２日目に決定した。 図1は、OP-1投与後12日目に収集した移植片をアルカリホスファターゼ活性、 カルシウム含有量、および組織学的試験によって測定した場合、静脈内に投与さ れたOP-1が、用量依存様式で新骨形成を誘導することを示す。最大の骨形成活性 は、1ラットあたり2.5mgのOP-1の用量が使用された場合に観察された。１ラット あたり0.05mgのOP-1が使用された場合、最大活性の約３０％が観察された。１度 の注入において与えられる2.5mgのOP-1の単回投与（移植後２４時間）は、移植 後0、8、24、48および72時間後に投与される５回の注入が生成した匹敵する骨形 成活性に匹敵する骨形成形成活性を生成した。重要なことに、最大の骨形成をも たらすために全身的に投与されるOP-1量は、局所的に骨を誘導するためにコラー ゲン/OP-1デバイスを使用する場合に骨形成を誘導するために必要な量より約１ ０００倍高い。筋肉内部位のコラーゲン移植片は、皮下部位での移植片よりも良 好に作用するようである。なぜなら、応答する細胞および血管成分は、筋肉内部 位では容易に利用可能であるからである。 実施例５ 以下の実施例は、骨形成の比較測定のためのプロトコルを提供する。ここで、 タンパク質は、任意の全身経路（すなわち、i.v.、腹腔内、または経口投与）に より提供される。OP-1の液体溶液を、以下のとおり、すべての投与経路に使用し た。 静脈内および腹腔内：500μg(成熟等価物)用量を、コラーゲン移植の０、６、 24、48および72時間後に投与した(500μl容量中）。経口投与：可溶性の成熟OP- 1を24時間、１〜２mlに2.5mgの単回用量として投与した。i.v.および経口投与に 関し、mOP-1は、i.v.投与用の酢酸ナトリウム緩衝液、および経口投与用のPBS中 0.1％カゼインで摂取される。OP-1は、0.1％カゼインに完全に可溶である。OP-1 投与の日を０日目とし、移植物を12日目に採取する。次いで、コラーゲン移植物 において骨形成を引き起こした全身OP-1を、アルカリホスファターゼの比活性、 カルシウム含量、および組織学に基づいて評価する。 別の経口投与プロトコル：2.5mgタンパク質(成熟OP-1)を、希釈塩化メチレン に可溶化し、そしてポリマー溶液(すなわち、FA:SA、20:80)に閉じ込め、そして 転相によりカプセル化した。 結果：３つすべての経路が、試験移植物部位で骨形成を引き起こすことが予測 される。この方法論は、好ましい投薬量をアッセイする手段、および所望の投与 経路用の処方物を提供する。 組織化学的および生化学的分析は、全身に投与されたOP-1により、局所のコラ ーゲン移植物において引き起こされた骨形成が、局所のOP-1/コラーゲン移植物 により引き起こされるものと同様な、細胞事象のカスケードを受けることを示す 。 実施例６ 本実施例は、全身に投与された他の形態形成タンパク質の、局所的な骨形成を 引き起こす能力を立証する。上記のプロトコルを使用して、組換えBMP-2、CDMP- 1およびCDMP-2を評価した。アッセイにおいて、OP-1、BMP-2(1.25mgにて)ならび にCDMP-1およびCDMP-2(2.5mgにて)を、コラーゲン移植の24時間後、全身性に投 与した(尾静脈、500μl)。タンパク質投与の日を、０日目として、移植物を12日 目に採取した。 実施例７ 本実施例は、異所性部位のコラーゲン移植物における骨形成に対する、動物の 年齢の効果、および成体ラットにおける治癒を加速または改善する、全身性に投 与された形態形成タンパク質の能力を評価する。代表的には、若齢ラットは、老 齢ラットより早期に治癒する。例えば、毛髪様骨折を若齢ラット(例えば、１ヶ 月齢)に誘導した場合、仮骨形成が１週間までに見られ得、そして完全な治癒が ３週間までに生じる。対照的に、成体ラット(24ヶ月齢)において、形成には２週 間かかり、そして完全な治癒には６〜12週間を必要とする。 １、３、６、12、および24ヶ月齢のLong-EvansまたはFisherラットを、上記の ような皮下および筋肉内移植に供した。移植物は、ウシコラーゲン性マトリクス (約25mg)のみからなる。ラット１匹あたり４つの移植物を製作し、１群あたり４ 匹とした。成熟OP-1を、酢酸緩衝液中500μlあたり500μgで、０、６、24、48、 および72時間めに投与した。OP-1投与の日を０日目とする。動物を、以下の日数 範囲内で選択した時点で評価した：３、５、７、９、11、14、21、28、および60 日目。 結果：全身性に投与した形態形成タンパク質は、コントロールと比較して、よ り老齢のラットにおいて、より早期の仮骨および骨形成を生じた。データは、成 体または骨治癒の能力が減少したかもしくは難治性治癒を経験した任意の個体に おける骨修復を増強するための手段としての全身投与の有用性を示す。このよう な個体は、前駆体細胞を欠いているか、血管分布が乏しいか、誘導シグナルが減 少しているか、などのいずれかのために、骨折を修復する能力が減少しているか または遅延している。 OP-1の効果と、モルフォゲンファミリーの関連するメンバーとの比較により、 12日目の移植物について実施したカルシウム含量および組織学によって測定され るように、OP-1が、全身投与の際に骨形成を誘導することにおいて、BMP-2、CDM P-1(GDF-5)、およびCDMP-2(GDF-6)より強力であることが示される。全身性にOP- 1を与えられた動物における局所的コラーゲン移植物部位での骨形成に対する効 果は、年齢に無関係であった。結果を図3Aおよび3Bに示す。図3Bに示されるよう に、カルシウム含量により決定されるように、骨再造形および鉱化作用の速度が いくらか遅延した。 実施例８ 本実施例は、当該分野において認められたイヌモデルの重大なサイズの尺骨分 節性欠損において骨形成を誘導する、全身性に投与された骨形成タンパク質の能 力を示す。重大なサイズの骨欠損は自然治癒し得ず、そして代表的には再生しな い組織において、新規な組織形成許容位置を誘導する、形態形成タンパク質の能 力を示す。簡潔には、周知の骨修復および再造形特徴のため、認可された犬舎に より供給された成体雄性雑種犬を使用する。動物は好ましくは少なくとも２歳で あり、そして40〜50ポンドの体重であり、均一なサイズおよび体重の動物を選択 して骨幾何学および負荷の変動を限定するよう特別の注意を払った。両側の2.5c m尺骨分節性欠損を、標準的な外科手順を使用して個々のイヌに作製する。すべ ての右側の欠損を無処置のまま残し、すべての左側の欠損には、例えば、１ｇの コラーゲンマトリクスあたり2.5mgのrhOP-1の比で、ウシ骨Ｉ型コラーゲンマト リクスと混合した組換えヒト形態形成タンパク質-1(rhOP-1)を使用して、標準的 な形態形成タンパク質デバイスを与える。成熟または可溶性の形態形成タンパク 質を、0.5mg〜5mg(500〜1,000ml)の用量範囲で投与し、手術後少なくとも24時間 、48時間、もしくは72時間で、単回のボーラスとして、または上記のような５回 の別個の一連の注射として投与する。コントロール群には、形態形成タンパク質 を全身性に投与されない、模擬移植物；および単回の試験欠損を受け、標準的な デバイスもしくは全身性に投与されたタンパク質のいずれかで処置された動物が 含まれる。１週おきにＸ線写真を撮影して治癒の進行を調べそして０〜６の等級 に格付けする。屠殺時、すべての尺骨をひとかたまりに摘出し、そして手による 触診で十分に治癒したものを、ねじれについて機械により試験する。次いで、セ グメントを組織応答、骨構造および再造形、ならびに新骨形成および治癒の質お よび量についての組織学により評価する。全身的に投与された形態形成タンパク 質は、尺骨欠損を修復するに十分な骨形成を誘導することが予測される。 実施例９ 標準的な動物肺線維症モデルが以下に提供され、これは、損傷を受けた肺組織 を修復する、全身的に投与されたモルフォゲンの能力を示すために使用され得る 。本実施例は、本質的に、Hastonら(1996)Cancer Research 56:2596-2601；Wein bachら(1996)Cancer Research 56:5659-5665；Harrisonら(l988)J.Pharmacol.Ex p．Thr．247:1052-1058に記載された方法に従う。 肺線維症は、ブレオマイシン(BLM)(実質的な骨髄毒性を欠く高度に有用な抗腫 瘍剤)により引き起こされる傷害に対する肺の潜在的に致死的な慢性応答である 。この障害の特質は、肺機能を弱める、肺胞壁における細胞外マトリクスタンパ ク質(特に、コラーゲン)の増大した沈着によって特徴付けられる。 アッセイにおいて、肺損傷は、市販の実験用マウスにおいて、BLM注射(代表的 には、100、300、400、または500mg/kg)で誘導される。この薬剤は、腹腔内もし くは皮下注射により、または移植ポンプにより投与され得る。好ましくは、線維 症易発症発現型(例えば、肺線維症に特徴的である組織学的な損傷および増大し た肺OH-プロリン(praline)含量)を有するC₅₇BL/6Jマウス系統が利用される(Jack s on Laboratoryies)。線維症抵抗性表現型系統(例えば、C₃hf/kam)がコントロ ールとして使用され得る。 実施例において、緩衝液単独、成熟モルフォゲン、または可溶性複合体形態が 、以下の１以上のプロトコルにおいて投与される： Ａ．単回ボーラス(0.05、0.5、1.0、または2.5mg/500ml)を、500μl容量でB ＬＭ注射の０、６、12、24、48、または72時間後に投与。 Ｂ．合計0.05、0.5、1.0、または2.5mgまでの複数回注射を、500μl容量で0 、6、24、48、および72時間後に投与。 動物を、8、10、または12週目に、または亢進した呼吸数により示される呼吸 窮迫時に頸椎脱臼により屠殺する。次いで、標準的な方法論を使用する組織学お よびOH-プロリン含量によって肺を評価する。 結果は、形態形成タンパク質の非存在下で、線維症が、適度な用量のBLM(累積 用量、300もしくは400mg/kg)によって誘導されることを示すと予測される。対照 的に、全身性に投与されたモルフォゲンで処置されたマウスは、線維症の線維性 病巣の実質的な減少もしくは皆無が示され、これらのマウスはより高いip接種用 量のBLMに耐性である。 実施例10 心筋は再生し得ないので、心筋梗塞は廠痕により治癒する。このアッセイは、 新たな収縮性組織を再生しそして機能を実質的に回復する、全身性に投与したモ ルフォゲンの能力を示す。このアッセイは、Murryら(1996)J.Clin.Invest 98(11 ):2512-2523のプロトコルに従う。 成体近交ラットの心臓を標準的な凍結−融解方法論により傷害する。具体的に は、液体窒素で予め冷却した１cm直径のアルミニウム棒を、左前心室と直接接触 させて15秒間置く。凍結−融解は、直径約１cmで心筋中に約２mm拡がる、凝固壊 死の円盤状領域を再現可能に引き起こす。モルフォゲンまたは生理食塩水緩衝液 単独を、傷害後ｔ＝０、６、24、48、および72時間に投与する。モルフォゲンは 、 実施例10に記載のとおり、単回のボーラスとして、または複数回の注射により投 与され得る。１週までに、多核化筋管が修復中の組織に明らかである。２週目に 、衛星幹細胞が明らかである。７週までにβ-MHC発現が検出される。 １、２、および７週目に、心筋組織形成が組織学および標準的な生化学的マー カーアッセイ(β-MHC発現の証拠を含む)により評価される。 実施例11 毒素誘導性組織損傷後の再生中の肝臓組織におけるモルフォゲン発現 毒性因子誘導性の損傷した組織後の肝臓組織修復には、肝細胞前駆体細胞の増 殖および分化が含まれる。この組織修復は、胚発生の間に生じる組織形態形成カ スケード(Faustoら(1989)Lab．Investigation 60:4-13)を明らかに模倣する。下 記の実施例に示されるように、全身性に投与されたモルフォゲンは、ガラクトサ ミンまたは四塩化炭素(CCl₄)誘導性肝臓損傷後の肝臓組織再生を増強し得る。実 験を、本質的に、Kuhlmannら(1980)Virchows Arch 387:47-57(この開示を本明細 書中に参考として援用する)に記載のとおり実施する。 ０日目に、ガラクトサミン-HCl 0.75g/kg体重。モルフォゲンを本実験におい て投与し、雄性ラットに、全身性(例えば、以下のプロトコルに従うi.v．：毒素 注射後６、12、24、または48時間後に、500μg緩衝液(酢酸もしくはPBS)中0.5、 1.0、または2.5mgのmOP-1)の単回の腹腔内注射を提供した。動物を、３、５、12 、20日目に屠殺して、組織学によって評価する。 実施例12 モルフォゲン誘導性肝臓再生 本実施例は、部分的な肝切除後の新たな肝臓組織を再生する、全身性に投与し たモルフォゲンの能力を示す。 肝細胞は、組織損失後に補償性の増殖を受ける顕著な能力を有するが、肝臓の 修復特性は胚形態形成とは有意に異なる。具体的には、部分的な肝切除(ここで 、肝臓葉が部分的にもしくは完全に除去される)後、残りのインタクトな葉は、 迅速に増殖し、そして制限された分化を受ける、インタクトな葉の分化した肝細 胞 の能力に起因して重量が二倍になる。しかし、摘出された葉自体は再生しない。 以下の実施例は、部分的な肝切除後の損失肝組織を再生する、モルフォゲンの能 力(摘出した組織葉の再生を含む)を示す。下記のプロトコルは、例えば、Higgin sら(1931)Arch．Pathol．12:136-202およびBraunら(1989)PNAS 86:1558−1562( これらの開示は本明細書中に参考として援用される)により記載される、標準的 な部分的肝切除プロトコルについてのバリエーションである。 成長中のラットまたは老齢ラットを、ケタミンを用いて麻酔する。２つの肝臓 葉(左および右)を切り出す(葉の約1/3)。標準的な外科手順を使用して傷を閉じ る。モルフォゲン(例えば、精製した組換えヒトOP-1、成熟形態)を、全身性に静 脈内(i.e.)またはp．(腹腔内)投与する。OP-1(成熟または可溶)を、手術後12、2 4、48、または72時間に、500μl緩衝液(酢酸またはPBS)中0.5、1.0、または2.5m gのタンパク質で、注射する。プラセボサンプルは、モルフォゲンを含まない注 射緩衝液である。手術後、ラットに通常の食餌を食べさせ、そして水道水を飲ま せる。 12日後、ラットを屠殺し、そして肝臓再生を視覚的に観察する。OP-1を注射し た群は、完全な肝臓組織再生(摘出された葉組織の再編成を含む)を示し、そして 肝臓にいかなる切断の実質的痕跡を示さない。対照的に、PBSのみが注射された コントロール群では、摘出された葉組織は実質的に再生されない。代表的にはこ のサンプルに元の切開が残っている。 本実施例のバリエーションにおいて、手術後の３〜10日の間にわたる一連の注 射として、モルフォゲンを投与する。 実施例13 口腔粘膜炎(mucositis)のモルフォゲン処置 口腔粘膜炎には、例えば、放射線療法または化学療法の結果としての口潰瘍が 含まれる。潰瘍性粘膜炎の経過は、破壊期および治癒期に分けられ得る。口腔上 皮の基底層の細胞は、迅速に分裂するので、化学療法の抗有糸分裂誘発効果およ び毒性効果に感受性である。その結果、萎縮性変化が生じ、次いで潰瘍が続く。 これが破壊期を構成する。潰瘍形成後、治癒期の間に病変がゆっくりと溶解する 。 下記の実施例は、ハムスターモデルにおいて、口腔粘膜を口腔粘膜炎から保護 することにおける、全身性に投与されたモルフォゲンの効力(潰瘍の阻害および 潰瘍組織の再生の増強の両方)を示す。全身投与は、局所的に塗布されたモルフ ォゲンを欠損位置に維持することに関連する問題を消去する。 プロトコルの詳細は、Sonisら(1990)Oral Surg．Oral Med．Oral Phathol 69: 437-443(本開示を本明細書中に参考として援用する)に見出され得る。 簡潔には、ゴールデンシリアンハムスター(６〜８週齢、Charles River Labor atories，Wilmington，MA)を試験群：プラセボ（例えば、生理食塩水）コントロ ール、ならびにモルフォゲン低用量群(100ng)およびモルフォゲン高用量群(１μ g)(それぞれ、群２および群３)に分類する。さらなる群が、モルフォゲン注射の 数(単回ボーラス対複数回投与)を調整し得る。各群は同数の動物を含む。０日目 に始め、５日目まで続けて、モルフォゲンが全身性に(成熟形態)(経口、またはi p、またはi.v．；(尾静脈))投与される。３日目、すべての群で粘膜炎誘導手順 を始める。３日目(60mg/kg)および５日目(40mg/kg)に、５−フルオロウラシルを 腹腔内に注射する。７日目、右頬窩粘膜を、目盛り付き18ゲージ針を用いて表面 で刺激する。無処置動物では、重篤な潰瘍性粘膜炎が、10日目までに少なくとも 80％の動物に誘導される。 12日目、各群２匹の動物を、組織学的研究のために屠殺する。標準的な解剖お よび組織学的手順を用いて、右頬窩粘膜および基礎の結合組織を切り出して、10 ％ホルマリン中で固定する。標本をパラフィンにマウントして、組織学的検査の ために調製する。次いで、切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、そし てハムスターの組織学が専門の３人の口腔病理学者により盲検し、標準的な粘膜 炎パネルに対して、標本に関する知識なしにスコア付けする。萎縮の広がり、細 胞浸潤、結合組織崩壊、潰瘍の程度、および上皮形成を評価する。 組織学に基づいて、投与されたモルフォゲンは、用量依存的に病変形成を有意 に阻害する。対照的に、組織中の黒っぽい領域により示される重大な組織壊死、 および組織の明るい球状領域により示される潰瘍が、無処置の窩に明らかである 。モルフォゲン処置組織は、壊死がなく、そして潰瘍もほとんどないか全くない 、健常な組織を示す。高用量の単回投与は、複数回の注射投与と実質的に同程度 に効果的であると考えられる。 本発明の方法は、危険にある個体が、ガン治療レジメンと同時に予防的にこの タンパク質を摂取することを可能にし、モルフォゲンが、最初の口腔粘膜炎欠損 が生じる時点にその系に存在することを可能にする。 実施例14 十二指腸潰瘍形成のモルフォゲン処置 以下の実施例は、十二指腸潰瘍の処置における、全身性に投与するモルフォゲ ンの効力を立証するためのラットモデルを提供する。プロトコルの詳細な説明は 、Pilanら(1985)Digestive Diseases and Sciences 30:240-246(本開示は、本明 細書中に参考として援用される)に提供される。簡潔には、Sprague-Dawley雌性 ラット(例えば、Charles River Laboratories、150〜200g)に、十二指腸潰瘍発 生因子システアミン-HClを、体重100グラム(gm)あたり25〜28ミリグラム(mg)の 用量にて、同日に３回胃管栄養法により経口的に与える。さらに、コルチソルを 、各ラットに皮下で、体重100gmに対して５mgコルチソルの単回用量にて投与し て、システアミン-HClの投与に起因して死亡率を減少させる。 システアミン-HClの投与３日後、穿通性および足穿孔性十二指腸潰瘍を有するラ ットを、標準的な側腹切開により同定し、そしてコントロール群およびモルフォ ゲン処置群に無作為に分ける。 群１のラット(すべて潰瘍を有する)には、モルフォゲンを与えず、生理食塩水 のみで処置する。群２のラット(これもまたそれぞれが潰瘍を有する)に、体重10 0mgあたり50〜100ngのモルフォゲンを、i.v．(k.l静脈)投与またはi.p.もしくは 経口投与により与える。群３のラット(全てが潰瘍を有する)に、体重100mgあた り200〜500ngのモルフォゲンを与える。処置はまた、実施例10に記載のように、 単回のボーラスまたは一連の複数回の注射であり得る。動物を21日目に屠殺し、 そして潰瘍を測定し組織学的切片を採集する。 モルフォゲン処置動物からの十二指腸切片の組織学は、優勢で密な肉芽組織お よび部分的もしくは完全な上皮再形成を有する治癒した潰瘍を示す。このことは 、モルフォゲンの経口投与が、GI管の潰瘍の治癒を有意に加速し得ることを立証 する。さらに、潰瘍の前もしくは同時のモルフォゲンでの処置もまた、潰瘍形成 を 阻害する。 実施例15 網膜障害のモルフォゲン処置 全身性に投与したモルフォゲンはまた、網膜障害を処置するため、特に、黄斑 変性および円孔の処置に使用され得る。ここで、治癒が促進されそして視力が有 意に改善されると予想される。処置はまた、網膜円孔、涙、および剥離の処置に 使用され得る。これらの障害は、視力の喪失により特徴付けられる。 モルフォゲンで処置される眼は、完全な、手術前および手術後の眼検査を受け る。この眼検査には、視力検査、眼内圧測定、細隙灯生体顕微鏡検査、および双 眼間接検眼鏡検査を含む。外科ストラテジーは、当該分野において公知のように 、正確な硝子体網膜の解剖学に依存する。一般に、すべての硝子体切除は、標準 的な手順を用いて、標準的な３点機器使用で実施する。硝子体切除はモルフォゲ ン投与の前に行う。 硝子体切除後、実施例10に概説したプロトコルまたはそのバリエーションに従 って、モルフォゲンを全身性(ip.、iv)に投与する。１週間目、２週間目、７週 間目に動物を屠殺し、組織学により評価する。全身性に投与されたモルフォゲン は、局所注射によりモルフォゲンを提供する必要を消去し、そして少なくとも局 所的に提供されたタンパク質と同程度に、網膜の再付着および損失網膜組織の再 生を促進すると予期される。さらに、モルフォゲンの全身投与は、線維性血管性 組織の再増殖を阻害し、そして新血管新生を阻害するはずである。 モルフォゲンは、同様に、黄斑円孔を処置するために投与され得る。このよう な処置は、視覚の改善および円孔の縁の厚さが減少することによる治癒を提供す ると期待される。 実施例16 本実施例は、当該分野において認知された動物モデル(イヌ)を使用して、骨軟 骨もしくは軟骨の欠損を治癒する、全身性に投与された骨形成タンパク質の能力 を立証する。具体的には、標準的なイヌ骨軟骨栓子(plug)欠損モデルを用いる研 究を、下記のように実施する。簡潔には、標準的な外科手順および認可された犬 舎から供給された動物を使用して、直径が５mmで肋軟骨下骨に６mm拡がる全層性 欠損を、４匹の成体雑種犬の両側の大腿骨内側顆に作製する。左側欠損に標準的 な骨形成デバイスを与え、そして右側欠損を無処置のままにする。全身性投与ア ッセイを、模擬移植物を含む、適切なコントロールを伴って、上記実施例８にお ける重大な部位欠損についてのように実施する。すなわち、手術の少なくとも24 、48、もしくは72時間後に単回ボーラスとして投与されるまたは複数回の別個の 注射で投与される、有用な投与量の範囲を評価する(0.5mg〜５mg)。 治癒を評価するためのＸ線写真を含むルーチンのプロトコルを使用して、骨軟 骨および軟骨治癒をおおまかで組織学的に評価する。手術後12週目に、バルビツ レートの静脈内過剰投与により各動物を屠殺する。右および左の両方の遠位大腿 骨をひとかたまりに採取し、そして大まかな格付けおよび顕微鏡写真撮影が完了 するまで冷却生理食塩水中に維持する。標本を４％パラホルムアルデヒド固定液 中に置き、同一性を証明する必要なすべてのもので標識し、そして評価するまで ４℃で貯蔵する。 組織学的評価のために、個々の標本を、４％パラホルムアルデヒド溶液に浸漬 することにより固定し、そして標準的な手順を使用して評価する。さらに、ルー チンの手順を使用して、コラーゲン型および組織組成の割合を特徴付けるため、 組織型決定分析を実施する。(マトリクス中のグリコサミノグリカン含量を示す ために)サフラニンＯおよびファストグリーン染色液で染色した非脱石灰化切片( 各標本から１つ)もまた使用し得た。 全身性に投与した骨形成タンパク質で処置した、骨軟骨および/または軟骨の 欠損は、骨および/または軟骨の再生を立証すると予想される。なぜなら、その 症例が、標準的な骨形成デバイスで処置した欠損と比較した場合、適切な軟骨細 胞および軟骨表現型（機能的修復性の関節軟骨形成を含む）を含み得るからであ る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/18 Ａ６１Ｐ 3/10 3/04 5/00 3/10 9/00 5/00 11/00 9/00 13/12 11/00 15/00 13/12 19/10 15/00 25/00 19/10 43/00 １１１ 25/00 Ｃ０７Ｋ 14/475 43/00 １１１ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ０７Ｋ 14/475 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 37/24 (31)優先権主張番号 ６０／０４８，０６３ (32)優先日 平成９年５月30日(1997．5．30) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ，ＵＳ (72)発明者 コーヘン，チャールズ エム. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02193，ウエストン，ハリントン レーン １

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．候補形態形成タンパク質またはそのアナログの形態形成活性を評価するため の方法であって、該方法は、以下の工程： (a) 哺乳動物において局所的な許容性の欠損部位を作製する工程、 (b) 該候補形態形成タンパク質またはアナログを該哺乳動物に全身的に投与す る工程、および (c) 候補タンパク質またはアナログの、該欠損部位で新たな組織形成を誘導す る能力を測定する工程、 を包含する、方法。 ２．前記候補形態形成タンパク質またはアナログが、前記欠損部位に対して遠位 の部位に投与される、請求項１に記載の方法。 ３．哺乳動物に投与するための候補形態形成タンパク質またはそのアナログの最 適投薬量を評価するための方法であって、該方法は、以下の工程： (a) 哺乳動物において局所的な許容性の欠損部位を作製する工程、および (b) 該候補形態形成タンパク質またはアナログを、該哺乳動物に全身的に投与 する工程、および (c) 候補タンパク質またはアナログの、該欠損部位での新たな組織形成を誘導 する能力を測定する工程、 を包含する、方法。 ４．前記タンパク質またはアナログが、前記部位に対して遠位の部位に投与され る、請求項３に記載の方法。 ５．前記欠損部位が、骨格組織、肺組織、心臓組織、肝臓組織、神経組織、膵臓 組織、子宮組織、または甲状腺組織において起こる、請求項１または３に記載の 方法。 ６、前記欠損部位が、腎臓組織において起こる、請求項１または３に記載の方法 。 ７．前記欠損部位が、歯組織または歯周組織において起こる、請求項１または３ に記載の方法。 ８．前記哺乳動物が老齢である、請求項１または３に記載の方法。 ９．前記哺乳動物が、カルス形成を誘導する低減された能力を有する、請求項１ または３に記載の方法。 １０．前記哺乳動物が、骨格端への血流障害を罹患している、請求項１または３ に記載の方法。 １１．前記哺乳動物が、内因性の形態形成シグナルを誘導する低減された能力を 有する、請求項１または３に記載の方法。 １２．形態形成タンパク質またはアナログが、非経口的に投与される、請求項１ または３に記載の方法。 １３．形態形成タンパク質またはアナログが、静脈内に投与される、請求項１２ に記載の方法。 １４．前記形態形成タンパク質が、経口的に投与される、請求項１または３に記 載の方法。 １５．前記形態形成タンパク質またはアナログが、間葉前駆細胞が前記欠損部位 に接触可能な時点で前記哺乳動物に投与される、請求項１に記載の方法。 １６．前記形態形成タンパク質またはアナログが、前記欠損の作製の少なくとも ６時間後に投与される、請求項１、３、または４に記載の方法。 １７．前記形態形成タンパク質またはアナログが、前記欠損が作製された少なく とも２４時間後に投与される、請求項１または４に記載の方法。 １８．前記形態形成タンパク質またはアナログが、前記欠損の作製の少なくとも ７２時間後に投与される、請求項１または４に記載の方法。 １９．前記形態形成タンパク質またはアナログが、前記哺乳動物に、前記欠損部 位で線維症の開始後に投与される、請求項１、３、または４に記載の方法。 ２０．前記形態形成タンパク質またはアナログが、水溶液中において投与される 、請求項１、３、または４に記載の方法。 ２１．前記哺乳動物が、ステロイド剤使用者である、請求項８に記載の方法。 ２２．前記哺乳動物が、老齢であるか、肥満であるか、高血圧であるか、または 骨減少もしくは糖尿病を罹患している、請求項８に記載の方法。 ２３．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、OP3、BMP2；BMP3；BMP4；BMP5；B MP6；BMP9；BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-15、BMP-3b、DPP；Vgl；Vgr；60Aタ ンパク質；GDF-1；GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、GDF-1 1；およびこれらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択 される、請求項１または３に記載の方法。 ２４．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、BMP2；BMP4；BMP5；BMP6；および これらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、請 求項１または３に記載の方法。 ２５．前記形態形成タンパク質が、モルフォゲンであり、該モルフォゲンが、ヒ トOP1の保存された７システインドメインを含むＣ末端の102〜106個のアミノ酸 内で、少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または３ に記載の方法。 ２６．前記形態形成タンパク質が、OP1である、請求項１または３に記載の方法 。 ２７．前記形態形成タンパク質が、生理食塩水溶液中に可溶化された成熟OP1で ある、請求項１または３に記載の方法。 ２８．前記形態形成タンパク質が、OPX（配列番号３）；一般配列６（配列番号 ４）、一般配列７（配列番号５）；一般配列８（配列番号６）；または一般配列 ９（配列番号７）によって規定されるアミノ酸配列を含む、請求項１または３に 記載の方法。 ２９．哺乳動物において非骨格性の欠損部位で新たな組織形成を誘導するための 方法であって、該方法は、該哺乳動物に全身的に形態形成タンパク質を投与する 工程を包含する、方法。 ３０．前記形態形成タンパク質が、前記部位に対して遠位の部位に投与される、 請求項２９に記載の方法。 ３１．哺乳動物において形態形成欠損部位でカルスの形成の質または量を増強す るための方法であって、該方法は、該部位に対して遠位の部位で、形態形成タン パク質を該哺乳動物に全身的に投与する工程を包含する、方法。 ３２．哺乳動物において局所的欠損部位で組織修復の割合を増強するための方法 であって、該方法は、形態形成タンパク質を該部位に対して遠位の部位で該哺乳 動物に全身的に投与する工程を包含する、方法。 ３３．前記欠損が、肺組織、心臓組織、肝臓組織、神経組織、膵臓組織、子宮組 織、または甲状腺組織において起こる、請求項２９、３１、または３２に記載の 方法。 ３４．前記欠損部位が、腎臓組織において起こる、請求項２９、３１、または３ ２に記載の方法。 ３５．前記欠損部位が、歯組織または歯周組織において起こる、請求項２９、３ １、または３２に記載の方法。 ３６．前記哺乳動物が、ヒトである、請求項２９、３１、または３２に記載の方 法。 ３７．前記ヒトが、カルス形成を誘導する低減された能力を有する、請求項３６ に記載の方法。 ３８．前記ヒトが、骨格端への血流障害を罹患している、請求項３６に記載の方 法。 ３９．前記個体が、内因性の形態形成シグナルを誘導する減少された能力を有す る、請求項３６に記載の方法。 ４０．前記形態形成タンパク質が、非経口的に投与される、請求項２９、３１、 または３２に記載の方法。 ４１．前記形態形成タンパク質が、静脈内投与される、請求項４０に記載の方法 。 ４２．前記形態形成タンパク質が、経口投与される、請求項２９、３１、または ３２に記載の方法。 ４３．前記形態形成タンパク質が、前記個体に、間葉前駆細胞が前記欠損部位に 接触可能である時点で投与される、請求項２９に記載の方法。 ４４．前記形態形成タンパク質が、前記欠損の作製の少なくとも６時間後に投与 される、請求項２９、３１、または３２に記載の方法。 ４５．前記形態形成タンパク質が、前記欠損の作製の少なくとも２４時間後に投 与される、請求項２９または３２に記載の方法。 ４６．前記形態形成タンパク質が、前記欠損の作製の少なくとも７２時間後に投 与される、請求項２９または３２に記載の方法。 ４７．前記形態形成タンパク質が、前記哺乳動物に、前記欠損部位で線維症の開 始後に投与される、請求項２９、３１、または３２に記載の方法。 ４８．前記形態形成タンパク質が、水溶液中において投与される、請求項２９、 ３１、または３２に記載の方法。 ４９．前記ヒトが、ステロイド剤使用者である、請求項３６に記載の方法。 ５０．前記ヒトが、老齢であるか、肥満であるか、または骨減少もしくは糖尿病 を罹患している、請求項３６に記載の方法。 ５１．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、OP3、BMP2；BMP3；BMP4；BMP5；B MP6；BMP9；BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-15、BMP-3b、DPP；Vgl；Vgr；60Aタ ンパク質；GDF-1；GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、GDF-1 1；およびこれらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択 される、請求項２９、３１、または３２に記載の方法。 ５２．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、BMP2；BMP4；BMP5；BMP6；および これらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、請 求項２９、３１、または３２に記載の方法。 ５３．前記形態形成タンパク質が、モルフォゲンであり、該モルフオゲンが、ヒ トOP1の保存された７システインドメインを含むＣ末端の102〜106個のアミノ酸 内で、少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２９、３１ 、または３２に記載の方法。 ５４．前記形態形成タンパク質が、OP1である、請求項２９、３１、または３２ に記載の方法。 ５５．前記形態形成タンパク質が、生理食塩水溶液中に可溶化された成熟OP1で ある、請求項２９、３１、または３２に記載の方法。 ５６．前記形態形成タンパク質が、OPX（配列番号３）；一般配列６（配列番号 ４）、一般配列７（配列番号５）；一般配列８（配列番号６）；または一般配列 ９（配列番号７）によって規定されるアミノ酸配列を含む、請求項２９、３１、 または３２に記載の方法。 ５７．哺乳動物への形態形成タンパク質の全身的投与のための組成物であって、 欠損部位での非骨格性の機能的置換組織の形成を誘導するのに十分な量で形態形 成タンパク質を含む、組成物。 ５８．前記組成物が、水溶液中に分散された形態形成タンパク質を含む、請求項 ５７に記載の組成物。 ５９．約４〜８の範囲のｐＨを有する、請求項５７に記載の組成物。 ６０．生理学的緩衝化生理食塩水を含む、請求項５７に記載の組成物。 ６１．前記形態形成タンパク質が、約0.01〜1000mg/kg体重の範囲内の濃度で提 供される、請求項５７に記載の組成物。 ６２．非経口投与のための処方物を包含する、請求項５７に記載の組成物。 ６３．経口投与のために処方された、請求項５７に記載の組成物。 ６４．前記形態形成タンパク質が、生分解性の、生体適合性のミクロスフェア中 に配置されている、請求項５７に記載の組成物。 ６５．形態形成タンパク質を、約0.01g/ml〜10.0g/mlの濃度範囲において含む、 請求項５７に記載の組成物。 ６６．形態形成タンパク質を、約0.1g/ml〜1.0g/mlの濃度範囲において含む、請 求項５７に記載の組成物。 ６７．前記形態形成タンパク質が、水性培地において該タンパク質の可溶性を増 強し得る分子と結合している、請求項５７に記載の組成物。 ６８．前記形態形成タンパク質が、該タンパク質の可溶性複合体形態からなる、 請求項５７に記載の組成物。 ６９．局所的な欠損部位での組織形成の割合を増強し得るとしてさらに特徴付け られる、請求項５７に記載の組成物。 ７０．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、OP3、BMP2；BMP3；BMP4；BMP5；B MP6；BMP9；BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-15、BMP-3b、DPP；Vgl；Vgr；60Aタ ンパク質；GDF-1；GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、GDF-1 1；およびこれらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択 される、請求項５７に記載の組成物。 ７１．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、BMP2；BMP4；BMP5；BMP6；および これらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、請 求項５７に記載の組成物。 ７２．前記形態形成タンパク質が、モルフォゲンであり、該モルフォゲンが、ヒ トOP1の保存された７システインドメインを含むＣ末端の102〜106個のアミノ酸 内で、少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項57に記載の 組成物。 ７３．前記形態形成タンパク質がOP1である、請求項５７に記載の組成物。 ７４．前記形態形成タンパク質が、生理食塩水溶液中に可溶化された成熟OP1で ある、請求項５７に記載の組成物。 ７５．前記形態形成タンパク質が、OPX（配列番号３）；一般配列６（配列番号 ４）、一般配列７（配列番号５）；一般配列８（配列番号６）；または一般配列 ９（配列番号７）によって規定されるアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の 組成物。 ７６．哺乳動物において欠損部位での骨または軟骨の形成を誘導するための方法 であって、該方法は、骨形成タンパク質を全身的に該哺乳動物に投与する工程を 包含する、方法。 ７７．前記骨形成タンパク質が、前記部位に対して遠位の部位に投与される、請 求項７６に記載の方法。 ７８．哺乳動物において骨形成の欠損部位でのカルスの形成の量または質を増強 するための方法であって、該方法は、骨形成タンパク質を該部位に対して遠位の 部位で該哺乳動物に全身的に投与する工程を包含する、方法。 ７９．哺乳動物において局所的欠損部位での骨または軟骨の修復の割合を増強す るための方法であって、該方法は、該部位に対して遠位の部位で該哺乳動物に骨 形成タンパク質を全身的に投与する工程を包含する、方法。 ８０．前記欠損部位が骨折を規定する、請求項７６、７８、または７９に記載の 方法。 ８１．前記欠損部位が、内因性修復が不可能である容量を規定する、請求項７６ 、７８、または７９に記載の方法。 ８２．前記欠損部位が、骨軟骨性の欠損を規定する、請求項７６、７８、または ７９に記載の方法。 ８３．前記哺乳動物がヒトである、請求項７６、７８、または７９に記載の方法 。 ８４．前記ヒトが、カルス形成を誘導する低減された能力を有する、請求項８３ に記載の方法。 ８５．前記ヒトが、骨格端への血流障害を罹患している、請求項８３に記載の方 法。 ８６．前記個体が、内因性の骨誘導性シグナルを誘導する低減された能力を有す る、請求項８３に記載の方法。 ８７．骨形成タンパク質が、非経口的に投与される、請求項７６、７８、または ７９に記載の方法。 ８８．前記骨形成タンパク質が、静脈内投与される、請求項８７に記載の方法。 ８９．前記骨形成タンパク質が、経口投与される、請求項７６、７８、または７ ９に記載の方法。 ９０．前記骨形成タンパク質が、間葉前駆細胞が前記欠損部位に接触可能な時点 で、前記個体に投与される、請求項７６に記載の方法。 ９１．前記骨形成タンパク質が、前記欠損の作製の少なくとも６時間後に投与さ れる、請求項７６、７８、または７９に記載の方法。 ９２．前記骨形成タンパク質が、前記欠損の作製の少なくとも２４時間後に投与 される、請求項７６または７９に記載の方法。 ９３．前記骨形成タンパク質が、前記欠損の作製の少なくとも７２時間後に投与 される、請求項７６または７９に記載の方法。 ９４．前記骨形成タンパク質が、前記欠損部位での線維症の開始後に前記哺乳動 物に投与される、請求項７６、７８、または７９に記載の方法。 ９５．前記骨形成タンパク質が、水溶液中において投与される、請求項７６、７ ８、または７９に記載の方法。 ９６．前記ヒトが、ステロイド剤使用者である、請求項８３に記載の方法。 ９７．前記ヒトが、老齢であるか、肥満であるか、または骨減少もしくは糖尿病 に罹患している、請求項８３に記載の方法。 ９８．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、OP3、BMP2；BMP3；BMP4；BMP5；B MP6；BMP9；BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-15、BMP-3b、DPP；Vgl；Vgr；60Aタ ンパク質；GDF-1；GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、GDF-1 1；およびこれらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択 される、請求項７６、７８、または７９に記載の方法。 ９９．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、BMP2；BMP4；BMP5；BMP6；および これらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、請 求項７６、７８、または７９に記載の方法。 １００．前記形態形成タンパク質が、モルフォゲンであり、該モルフォゲンが、 ヒトOP1の保存された７システインドメインを含むＣ末端の102〜106個のアミノ 酸内で、少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７６、７ ８、または７９に記載の方法。 １０１．前記骨形成タンパク質がOP1である、請求項７６、７８、または７９に 記載の方法。 １０２．前記骨形成タンパク質が、生理食塩水中に可溶化された成熟OP1である 、請求項７６、７８、または７９に記載の方法。 １０３．前記形態形成タンパク質が、OPX（配列番号３）；一般配列６（配列番 号４）、一般配列７（配列番号５）；一般配列８（配列番号６）；または一般配 列９（配列番号７）によって規定されるアミノ酸配列を含む、請求項７６、７８ 、 または７９に記載の方法。 １０４．哺乳動物への骨形成タンパク質の全身的投与のための組成物であって、 骨の欠損部位での骨または軟骨の形成を誘導するのに十分な量で骨形成タンパク 質を含む、組成物。 １０５．前記組成物が、水溶液中に分散された骨形成タンパク質を含む、請求項 １０４に記載の組成物。 １０６．約４〜８の範囲のｐＨを有する、請求項１０４に記載の組成物。 １０７．生理学的緩衝化生理食塩水を含む、請求項１０４に記載の組成物。 １０８．前記骨形成タンパク質が、約0.01〜1000mg/kg体重の範囲内の濃度で提 供される、請求項１０４に記載の組成物。 １０９．非経口投与のための処方物を含む、請求項１０４に記載の組成物。 １１０．経口投与のために処方された、請求項１０４に記載の組成物。 １１１．前記骨形成タンパク質が、生分解性の生体適合性のミクロスフェア中に 分散されている、請求項１０４に記載の組成物。 １１２．約0.01g/ml-10.0g/mlの濃度範囲で骨形成タンパク質を含む、請求項１ ０４に記載の組成物。 １１３．約0.1g/ml〜1.0g/mlの濃度範囲で骨形成タンパク質を含む、請求項１０ ４に記載の組成物。 １１４．前記骨形成タンパク質が、該タンパク質の水性媒体での可溶性を増強し 得る分子と結合している、請求項１０４に記載の組成物。 １１５．前記骨形成タンパク質が、該タンパク質の可溶性複合体形態を含む、請 求項１０４に記載の組成物。 １１６．局所的な骨折部位で骨形成の割合を増強し得るとしてさらに特徴付けら れる、請求項１０４に記載の組成物。 １１７．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、OP3、BMP2；BMP3；BMP4；BMP5 ；BMP6；BMP9；BMP-10、BMP-11，BMP-12、BMP-15、BMP-3b、DPP；Vgl；Vgr；60A タンパク質；GDF-1；GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、GDF -11；およびこれらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選 択される、請求項１０４に記載の組成物。 １１８．前記形態形成タンパク質が、OP1；OP2、BMP2；BMP4：BMP5；BMP6；およ びこれらの形態形成的に活性なアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、 請求項１０４に記載の組成物。 １１９．前記形態形成タンパク質が、モルフォゲンであり、該モルフォゲンが、 ヒトOP1の保存された７システインドメインを含むＣ末端の102〜106個のアミノ 酸内で、少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０４に 記載の組成物。 １２０．前記骨形成タンパク質がOP1である、請求項１０４に記載の組成物。 １２１．前記骨形成タンパク質が、生理食塩水中に可溶化された成熟OP1である 、請求項１０４に記載の組成物。 １２２．前記形態形成タンパク質が、OPX（配列番号３）；一般配列６（配列番 号４）、一般配列７（配列番号５）；一般配列８（配列番号６）；または一般配 列９（配列番号７）によって規定されるアミノ酸配列を含む、請求項１０４に記 載の組成物。