JP2001503982A - 肥満（ｏｂ）蛋白の効果を転調させる化合物の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ｏｂ−蛋白の効果を模倣、促進または抑制する化合物の検出方法であって、（ａ）ｏｂ−蛋白の生理学的効果を模倣する化合物については、受容体遺伝子に結合した、ｏｂ−蛋白により活性化されるシグナルトランスデューサーおよび転写アクチベーター（ＳＴＡＴ）ＤＮＡ応答エレメントに対する化合物の影響を評価すること；あるいは（ｂ）ｏｂ−蛋白の生理学的効果を促進または抑制する化合物については、受容体遺伝子に結合した、ｏｂ−蛋白により活性化されるＳＴＡＴ ＤＮＡ応答エレメントに対するｏｂ−蛋白により提供される応答に対する化合物の影響を評価することを含み、応答エレメントおよび受容体はｏｂ−蛋白応答細胞系において発現され、該細胞系は、視床下部由来の細胞系、褐色細胞腫由来の細胞系、造血系由来の細胞系、膵臓由来の細胞系、肝臓由来の細胞系、前脂肪細胞由来の細胞系、骨格筋由来の細胞系、卵巣由来の細胞系からなるリストから選択されるか、あるいはｏｂ−蛋白により活性化されるＳＴＡＴ ＤＮＡ応答エレメントに対するｏｂ−蛋白による刺激を媒介しうるポリペプチドでトランスフェクションされおり、適当なＳＴＡＴ蛋白を含んでいる細胞系（遺伝子操作による細胞系）において応答エレメントおよび受容体が発現されるものである方法。

Description

【発明の詳細な説明】 肥満（ＯＢ）蛋白の効果を転調させる化合物の検出方法 本発明は、新規方法に関し、より詳細にはｏｂ−蛋白の効果を模倣、促進また は抑制する化合物の検出方法に関する。 ｏｂ−蛋白（またはレプチン（leptin））は、体重およびエネルギーバランス を調節するために脂肪組織から他の器官へのシグナルとして作用する分泌蛋白で ある（Zhang et al.，Nature，1994，372，425）。造血および生殖機能における ｏｂ−蛋白のさらなる役割りが示唆されている(Cioffi et al.，Nature Medicin e，1996，2(5)，585)。アップ−アップ−ダウン−ダウントポロジー（up-up-dow n-down topology）の束を形成するα−ヘリックスを含むコアを含む蛋白分子は サイトカインおよび増殖因子のファミリーを構成している。このファミリーの蛋 白は、遺伝子転写を生じさせるキナーゼカスケードを活性化することが知られて いる膜受容体のホモ−およびヘテロ−オリゴマー化を引き起こす。オリゴマー化 により活性化されるファミリーの受容体は２つの広いクラスに分類される。例え ば、それらは細胞内ドメイン中に内在性チロシンキナーゼ活性を有している上皮 増殖因子受容体（A．Ullrich & J．Schlessinger，Cell，1990，61，203-212） ならびにこの活性を欠くが、結合蛋白チロシンキナーゼを介して応答を媒介する ＩＬ−４およびエチスロポイエチン受容体である(J．N．Ihle et al.，TIBS，19 94，19，222-227)。両方の受容体サブタイプはサイトカインにより活性化される が、４−ヘリックスバンドル（4-helix bundle）蛋白は内在性でないチロシンキ ナーゼサブタイプのみを活性化する。一般的には、内在性でない蛋白チロシンキ ナーゼ受容体は、ヤーヌスキナーゼ（Janus kinase）（ＪＡＫ）ならびにそれら の結合シグナルトランスデューサーおよび転写（ＳＴＡＴ）蛋白のアクチベータ ーを含む経路を介して作用する。活性化によりＳＴＡＴ蛋白はＤＮＡ応答エレメ ントに結合し、そのことにより遺伝子転写が制御される。一般的配列ＴＴ（Ｎ）_n ＡＡで示されるＤＮＡ調節エレメントを含むオリゴヌクレオチド配列が、ＳＴ ＡＴ応答 エレメントとして同定されている（Seidel et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．US A.，1995，92，3041）。これらのエレメントは、サイトカインのごときシグナリ ング分子に応答してＳＴＡＴ蛋白に結合する。 同時係属英国出願第９５０９１６４．１号において、我々は、ｏｂ−蛋白が４ ヘリックスバンドル３次構造により特徴づけられるという我々の知見を記載して いる。今回我々は、ｏｂ−蛋白が、ＪＡＫ−ＳＴＡＴキナーゼカスケードを活性 化する膜結合受容体と相互作用すると考えて、ｏｂ−蛋白の効果を模倣、促進ま たは抑制する化合物の検出のためのアッセイ系の基礎を形成する。かかるアッセ イは、体重、エネルギーバランス、造血、生殖およびｏｂ−蛋白により転調させ られる他の疾病の治療用化合物の選択において有用である。とくに、該アッセイ は、肥満、拒食症、悪液質および糖尿病に関連した疾病の治療のための化合物の 選択に有用である。 同時係属国際出願ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２２９１はＪＡＫ−ＳＴＡＴ法を用い る新規検出方法に関する。今回我々は、この方法を用いる特に有利な検出方法を 見出した。 したがって、本発明は、ｏｂ−蛋白の効果を模倣、促進または抑制する化合物 の検出方法に関し、該方法は、 （ａ）ｏｂ−蛋白の生理学的効果を模倣する化合物については、受容体遺伝子 に結合した、ｏｂ−蛋白により活性化されるシグナルトランスデューサーおよび 転写アクチベーター（ＳＴＡＴ）ＤＮＡ応答エレメントに対する化合物の影響を 評価すること；あるいは （ｂ）ｏｂ−蛋白の生理学的効果を促進または抑制する化合物については、受 容体遺伝子に結合した、ｏｂ−蛋白により活性化されるＳＴＡＴ ＤＮＡ応答エ レメントに対するｏｂ−蛋白により提供される応答に対する化合物の影響を評価 すること を含み、該方法において、応答エレメントおよび受容体はｏｂ−蛋白応答細胞系 において発現され、該細胞系は、視床下部由来の細胞系、褐色細胞腫由来の細胞 系、造血系由来の細胞系、膵臓由来の細胞系、肝臓由来の細胞系、前脂肪細胞由 来の細胞系、骨格筋由来の細胞系、卵巣由来の細胞系からなるリストから選択さ れるか、あるいはｏｂ−蛋白により活性化されるＳＴＡＴ ＤＮＡ応答エレメン トに対するｏｂ−蛋白による刺激を媒介しうるポリペプチドでトランスフェクシ ョンされおり、適当なＳＴＡＴ蛋白を含んでいる細胞系（遺伝子操作による細胞 系）において応答エレメントおよび受容体が発現される。 適当な細胞系は視床下部由来の細胞系である。 適当な細胞系は褐色細胞腫由来の細胞系である。 適当な細胞系は造血系由来の細胞系である。 適当な細胞系は膵臓由来の細胞系である。 適当な細胞系は肝臓由来の細胞系である。 適当な細胞系は前脂肪細胞由来の細胞系である。 適当な細胞系は骨格筋由来の細胞系である。 適当な細胞系は卵巣由来の細胞系である。 適当には、ｏｂ−蛋白により活性化されるＳＴＡＴ ＤＮＡ応答エレメントに 対するｏｂ−蛋白による刺激を媒介しうるポリペプチドでトランスフェクション されおり、適当なＳＴＡＴ蛋白を含んでいる細胞系（遺伝子操作による細胞系） において応答エレメントおよび受容体が発現される。 視床下部由来の細胞系の例は、Cellular and Molecular Neurology，1995，15 (1)，43においてW．C．Wetse1により記載されたニューロンＧＴ１−７細胞系で ある。褐色細胞腫由来の細胞の例は、副腎褐色細胞腫ラットＰＣ１２細胞(L．A ．Greene and A．S．Tischler，Proc．Natl．Acad．Sci．USA．1976，73(7)，24 24)である。 造血系由来の細胞系の例は、ヒト赤白血病由来のＨＥＬ ９２．１．７（ＡＴ ＣＣ ＴＩＢ １８０）細胞系（P．Martin，Science 1982，216(4551)，1223） である。 造血系由来の細胞系のさらなる例は、ヒト慢性骨髄性白血病由来のＫ５６２（ ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）細胞系（Proc．Soc．Exp．Biol．Med．1981，166，5 46およびBlood，1975，45，321）である。 膵臓由来の細胞系の例は、ベータＴＣ−３細胞系(T．J．Kieffer et al.，Bio chem． and Biophys．Res．Comm.，1996，224，552)である。 膵臓由来のさらなる例は、ＲＩＮ５ｍＦ細胞であり、最近、レプチンに応答す ることが報告された（Md Shahidul Islam et al.，Biochem．Biophys．Res．Com m，1997，238，851-855）。 前脂肪細胞由来の細胞系の例は、３０Ａ５細胞系(Y．Bai et al.，J．Biol．C hem.，1996，271(24)，13939)である。 前脂肪細胞由来の細胞系のさらなる例は、分化した３Ｔ３−Ｌ１および３Ｔ３ −Ｆ４４２Ａ細胞系を包含し、両方とも市販されている。 肝臓由来の細胞系の例は、ＨｅｐＧ２細胞系（B．Cohen et al.，Science，19 96，274，1185-1188およびY．Wang et al.，J．Biol．Chem，1997，272,16216-1 6223）またはＨ３５細胞系（Y．Wang et al.，J．Biol．Chem，1997，272，1621 6-16223）である。 肝臓由来の細胞系のさらなる例は、ＷＲＬ６８およびチェンジ肝(Change live r)細胞であり、両方とも市販されている。 骨格筋由来の細胞系の例は、マウス筋管Ｃ２ Ｃ１２細胞系(Nature，1997，27 0，725)である。 卵巣由来の細胞系の例は、ＳＫ−ＯＶ−３細胞系（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ７７） (Human Tumor Cells In Vitro p155-159，J．Fogh（ed）Plenum Press，New Yor k，1975中のＦ．Fogh and Trempeによる記載；およびJ．Fogh and Trempe J．Na tl．Cancer Inst Bethesda，1977，587：209-214)である。 ｏｂ−蛋白により活性化されるＳＴＡＴ ＤＮＡ応答エレメントに対するｏｂ −蛋白による刺激を媒介しうる適当なポリペプチドは、ｏｂ−遺伝子受容体の機 能的イソ形態（isoform）、例えば、Tartaglia et al.，Cell，1995，83，1263 において同定されたものである。 適当には、応答エレメントは式ＴＴ（Ｎ）_nＡＡ（式中、Ｎはいずれかのヌク レオチドであり、ｎは４、５または６である）で示されるヌクレオチドである。 好ましい応答エレメントは、受容体と相互作用するｏｂ−蛋白により媒介され る細胞内での事象により選択的に活性化される。ｏｂ−応答性細胞系中にトラン スフェクションされた場合の、ｏｂ−蛋白による一定範囲の応答エレメント−受 容体遺伝子構築物に対する相対的活性化を調べる（他のサイトカインによる活性 化と比較）ことにより、かかる選択的応答エレメントを決定することができる。 好ましい応答エレメントは式ＴＴ（Ｎ）_nＡＡで示されるヌクレオチドであり 、Ｎはいずれかのヌクレオチドであり、ｎは４または５である。 さらに適当な応答エレメントはＴＴＣＣＣＧＧＡＡである。 さらに適当な応答エレメントは、ＳＴＡＴ相互作用に必要とされるｏｂ−蛋白 により調節される遺伝子のプロモーターの領域である。この遺伝子は、アッセイ により選択される化合物の個々の治療用途に左右されるであろう。 適当な受容体遺伝子はホタルのルシフェラーゼまたはクロラムフェニコールア セチルトランスフェラーゼ酵素である。 適当なプロモーターは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼまたはＳＶ ４０プロモーターのごとき最小プロモーターである。 置換結合アッセイを用いて他の応答性細胞系を同定することができる。結合は 機能的な長い形態の受容体に対するものでないかもしれないが、シグナルを細胞 質に伝達する形態である。機能的な長い形態の受容体の同定はＰＣＲまたはノー ザンブロット分析によるものであってもよい（例えば、Human ob-receptor:Tart aglia et al.，Cell，1995，83，1263）。最終的には、種々の濃度のレプチン存 在下における細胞の事象をモニターすることにより応答性細胞を検出する。候補 細胞系を同定またはこれらの細胞の事象をモニターするための効果的な方法は以 下の方法を包含する： １．マイクロフィジオメーター：この方法は、細胞における生化学的変化によ り生じるｐＨの微少な変化を検出するものである。刺激によりｏｂ−蛋白応答性 細胞は生化学的変化を受ける可能性があり、その変化は細胞外酸性度の微少変化 を引き起こす可能性がある。この変化をシリコンマイクロフィジオメーターによ り検出することができる。マイクロフィジオメーターバイオセンサー法はMcConn ell，Science，1992，257，1906により説明されている。 ２．電気泳動度変化アッセイ（ＥＭＳＡ）：ｏｂ−蛋白処理後の細胞からの核 抽出物を、乱雑または特異的なＳＴＡＴ応答エレメントＤＮＡ配列を含む放射性 標識オリゴヌクレオチドと混合する。ｏｂ−蛋白に応答する細胞からの抽出物は 、ＳＴＡＴ応答エレメントに関するオリゴヌクレオチドのゲルシフトを引き起こ す可能性がある。 文献：本"Recombinant DNA"，2nd Edition，Watson et al.，1992，P．158;Lamb et al.，Blood，1994，83，2063。 ３．蛋白リン酸化測定アッセイ：受容体活性化と細胞内蛋白のチロシンリン酸 化による最終応答とのカップリングを、リン酸化チロシンを認識する抗体を用い ることによりアッセイしてもよい。より詳細には、レプチン受容体はＪＡＫ／Ｓ ＴＡＴ経路のチロシンリン酸化を刺激しうるので、この方法は、レプチン応答性 細胞系の検出方法を提供する。チロシンリン酸化について特異的ＪＡＫ／ＳＴＡ Ｔ抗体を併用抗体として用いてレプチン応答性細胞系におけるレプチン活性化を 検出してもよい。蛋白リン酸化の阻害あるいは促進が起こるかもしれない。詳細 には、インスリンにより刺激されるインスリン受容体およびインスリン受容体基 質−１のリン酸化に対するｏｂ−蛋白による阻害が、インスリン受容体を発現し ているラット−１繊維芽細胞において示されている(Kroder et al.，1996，Exp ．Clin．Endocrinol．Diabetes，104，suppl 2，p66)。 ４．置換結合：放射性標識レプチン、例えば［¹²⁵Ｉ］レプチンとともに細胞 をインキュベーションした後、未標識レプチンを添加することにより、レプチン の特異的結合と比較して非特異的結合を調べることができる。非特異的結合に対 する特異的結合の高い割合は、細胞系がレプチン受容体を含んでいる可能性を示 唆する。 ５．選択的抗体を用いることによる、ｏｂ−蛋白の機能的形態、好ましくはそ の機能的な長い形態に関する蛋白の検出。 ６．ノーザン、ＲＴ−ＰＣＲまたは「スロットブロット（slotblot）」分析に よる、ｏｂ−受容体の機能的形態、好ましくはその機能的な長い形態に関するｍ ＲＮＡの検出。 ７．レプチン処理後の増加したｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡの検出。ノーザン、ＲＴ − ＰＣＲまたは「スロットブロット（slot blot）」分析によりｃ−ｆｏｓ ｍＲＮ Ａを検出してもよい。 特定の疾病状態（これに対する化合物が検索される）の制御に関与することが 知られている細胞系が好ましい。 肝臓、脳、または膵臓組織由来の細胞ならびに繊維芽細胞は、肥満および糖尿 病に指向される化合物をアッセイするための細胞として、「ｏｂ−応答性」細胞 は特に好ましい。脳の特定領域は、ｏｂ−蛋白の体重制御およびエネルギーバラ ンス調節効果の標的である。肝臓は、脂質およびグルコースレベルを転調させる 多くの代謝プロセスを制御している。レプチンの効果を媒介するのに必要とされ る、適当な内在性ＪＡＫ、ＳＴＡＴ蛋白および他の細胞内蛋白を含有するこれら の器官の特定領域由来の細胞が好ましい。 適当には、応答エレメント、リポーター、および好ましくはプロモーターを、 ｏｂ−応答性細胞系をトランスフェクションしうるベクター中に含ませる。 ｐＧＬ２−塩基性ルシフェラーゼベクター(Promega)のごとき適当なベクター が市販されている。 ベクターの適当な配置はプロモーター遺伝子およびリポーター遺伝子の上流に ＳＴＡＴ ＤＮＡ応答エレメントが存在するものである。より適当なベクターの 配置は、チミジンキナーゼプロモーターおよびルシフェラーゼリポーター遺伝子 の上流に並んで繰り返されたＳＴＡＴ ＤＮＡ応答エレメント（２〜１０個）が 存在するものである。 例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼまたはＳＶ４０プロモーター のごとき最小プロモーターに連結されたホタルのルシフェラーゼまたはクロラム フェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素遺伝子のようなリポーター遺伝子 を含むようにベクターを構築する。最小プロモーターの上流の適当な制限酵素部 位を用いて、ＳＴＡＴ応答エレメントに関するＤＮＡフラグメントをベクター中 に挿入する。 所望により、慣用的な発現法を用いて、応答エレメント、リポーターおよびプ ロモーターベクター中に挿入する。該方法としては、例えば、最小プロモーター の上流の適当な制限酵素部位を用いて応答エレメントに関するＤＮＡフラグメン トをベクター中に挿入してもよい。 Lamb et al.，Blood，1994，8，2063およびSeidel et al.，Proc．Nat．Acad ．Sci．USA.，1995，92，3041に記載されたようにしてＳＴＡＴ応答エレメント −ルシフェラーゼ酵素受容体系を構築することができる。 例えば、リン酸カルシウム法(Graham and Van Der Eb，Virology，1973，52， 456)のごとき標準的な方法論を用いてＳＴＡＴ応答エレメント−最小プロモータ ー−ルシフェラーゼ受容体構築物でｏｂ−応答性細胞をトランスフェクションす る。トランスフェクション効率の相違を修正するために、β−ガラクトシダーゼ 活性を発現する対照プラスミドとともに細胞を同時トランスフェクションするこ とができる。トランスフェクション期間（１２〜２４時間）後、細胞を種々の濃 度の化合物で処理し、ついで、細胞を集め、溶解する。溶解物をルシフェラーゼ 活性について（適宜β−ガラクトシダーゼ活性について）アッセイする。適当濃 度のｏｂ−蛋白を化合物より先に、または化合物と同時に添加して、ｏｂ−蛋白 のみの場合と比較した場合のルシフェラーゼ応答の促進または抑制を評価し測定 することにより、促進活性またはアンタゴニスト活性をアッセイすることができ る。ルシフェラーゼ酵素活性をアッセイするための標準的方法が存在し、例えば 、Ow et al.，Science，1986，234，856およびde Wet et al.，Mol．Cell Biol. ，1987，7，725に記載の方法ならびにいくつかの市販キットがある。 リポーター構築物および選択可能マーカーで「ｏｂ−応答性」細胞系をトラン スフェクションすることにより、安定な細胞系を得ることができる。Recombinan t DNA，2nd edition，J．D.b Watson et al.，1992，p．216に記載されたように して選択可能マーカーを日常的に使用して安定な細胞系を得る。これらの安定に トランスフェクションされた細胞系を用いて、ｏｂ−蛋白の生理学的効果を模倣 、促進または遮断する化合物についての高処理量アッセイを行うことが可能であ る。 また本発明は、本明細書開示の方法により同定される、ｏｂ−蛋白の生理学的 効果を模倣、促進または抑制する化合物にも関する。 また本発明は、本明細書開示の方法における使用に適合したパーツを含むキッ トにも関する。 本明細書の用語「ｏｂ−蛋白の生理学的効果を模倣する化合物」とは、ｏｂ− 蛋白不存在下においてｏｂ−蛋白受容体を刺激してｏｂ−蛋白と実質的に同じ生 理学的効果を生じさせるように作用しうる化合物、あるいはこの受容体の下流( ポスト受容体（post-receptor）)の応答を活性化しうる化合物をいう。 本明細書の用語「ｏｂ−蛋白の生理学的効果を促進する化合物」とは、ｏｂ− 蛋白の能力および／または最大生理学的効果を高める化合物をいう。 本明細書の用語「ｏｂ−蛋白の生理学的効果を抑制する化合物」とは、ｏｂ− 蛋白の生理学的効果を低下または実質的に遮断する化合物をいう。 機能的形態のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、構成的プロモーター（例 えば、ウイルスプロモーター）または調節可能プロモーターの制御下においてト ランスフェクションして、適宜、アゴニストまたはアンタゴニストの同定用ポリ ペプチドの発現を最適化することができる。別法として、応答エレメントおよび 受容体を細胞系において発現させてもよく、構成的または調節可能プロモーター は、染色体上にコードされているｏｂ−蛋白受容体に関する遺伝子の上流位置に 相同組み換え法により組み込まれる。かかる方法はWaldman，Critical Reviews in Oncology/Hematology，1992，12，49に示されており、個々の例はRiele et a l.，Proceedings of the National Academy of Sciences，1992，89，5128に示 されている。 下記実施例は本発明を説明するが、何ら本発明を限定するものではない。 実施例 一般的手順： 例えばリン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb，Virology，1973，52，4 56）のような標準的方法論を用いて、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼの最 小プロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子リポーター構築物の上流において複 数の並んだコピーとなっているＳＴＡＴ応答エレメントを含むリポータープラス ミドでｏｂ−応答性細胞をトランスフェクションする。トランスフェクション効 率の 相違を修正するために、β−ガラクトシダーゼ活性を発現する対照プラスミドと ともに細胞を同時トランスフェクションすることができる。トランスフェクショ ン期間（１２〜２４時間）後、細胞を種々の濃度の化合物で処理し、ついで、細 胞を集め、溶解する。溶解物をルシフェラーゼ活性について（適宜β−ガラクト シダーゼ活性について）アッセイする。適当濃度のｏｂ−蛋白を化合物より先に 、または化合物と同時に添加して、ｏｂ−蛋白のみの場合と比較した場合のルシ フェラーゼ応答の抑制を評価し測定することにより、アンタゴニスト活性をアッ セイすることができる。ルシフェラーゼ酵素活性をアッセイするための標準的方 法が存在し、例えば、Ow et al.，Science，1986，234，856およびde Wet et al .，Mol.Cell Biol.，1987，7，725に記載の方法ならびにいくつかの市販キット がある。 実施例１ 例えばリン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb，Virology，1973，52，4 56）のような標準的方法論を用いて、単純ヘルペスチミジンキナーゼの最小プロ モーターの上流（−３５から＋１０まで）に４個の並んだＳＴＡＴ応答エレメン トＴＴＣＣＣＧＧＡＡに対応するインサートを含むリポータープラスミドｐＧＬ ２−塩基性ルシフェラーゼベクター(Promega)を用いて、Ｇｔ１−７細胞(W.C.We stel，Cellular and Molecular Neurobiology，1995，15(1)，43)をトランスフ ェクションする。トランスフェクション効率の相違を修正するために、β−ガラ クトシダーゼ活性を発現する対照プラスミドとともに細胞を同時トランスフェク ションすることができる。トランスフェクション期間（１２〜２４時間）後、細 胞を種々の濃度の化合物で処理し、ついで、細胞を集め、溶解する。溶解物をル シフェラーゼ活性について（適宜β−ガラクトシダーゼ活性について）アッセイ する。適当濃度のｏｂ−蛋白を化合物より先に、または化合物と同時に添加して 、ｏｂ−蛋白のみの場合と比較した場合のルシフェラーゼ応答の抑制を評価し測 定することにより、アンタゴニスト活性をアッセイすることができる。ルシフェ ラーゼ酵素活性をアッセイするための標準的方法が存在し、例えば、Ow et al. ，Science，1986，234，856およびde Wet et al.，Mol．Cell Biol.，1987，7， 725に記載の方法 ならびにいくつかの市販キットがある。 実施例２ 例えばリン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb，Virology，1973，52，4 56）のような標準的方法論を用いて、単純ヘルペスチミジンキナーゼの最小プロ モーターの上流（−３５から＋１０まで）に４個の並んだＳＴＡＴ応答エレメン トＴＴＣＣＣＧＧＡＡに対応するインサートを含むリポータープラスミドｐＧＬ ２−塩基性ルシフェラーゼベクター(Promega)を用いて、ラットＰＣ１２細胞（L .A.Greene and A．S．Tischler，Proc．Natl．Acad．Sci．USA．1976，73(7)，2 424）をトランスフェクションする。トランスフェクション効率の相違を修正す るために、β−ガラクトシダーゼ活性を発現する対照プラスミドとともに細胞を 同時トランスフェクションすることができる。トランスフェクション期間（１２ 〜２４時間）後、細胞を種々の濃度の化合物で処理し、ついで、細胞を集め、溶 解する。溶解物をルシフェラーゼ活性について(適宜β−ガラクトシダーゼ活性 について)アッセイする。アンタゴニストおよびルシフェラーゼ酵素活性を上記 のごとくアッセイすることができる。 実施例３ 例えばリン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb，Virology，1973，52，4 56）のような標準的方法論を用いて、単純ヘルペスチミジンキナーゼの最小プロ モーターの上流（−３５から＋１０まで）に４個の並んだＳＴＡＴ応答エレメン トＴＴＣＣＣＧＧＡＡに対応するインサートを含むリポータープラスミドｐＧＬ ２−塩基性ルシフェラーゼベクター(Promega)を用いて、ヒト赤白血病由来のＨ ＥＬ ９２．１．７（ＡＴＣＣ ＴＩＢ １８０）細胞（P．Martin，Science，198 2，216(4551)，1233）をトランスフェクションする。トランスフェクション効率 の相違を修正するために、β−ガラクトシダーゼ活性を発現する対照プラスミド とともに細胞を同時トランスフェクションすることができる。トランスフェクシ ョン期間（１２〜２４時間）後、細胞を種々の濃度の化合物で処理し、ついで、 細胞 を集め、溶解する。溶解物をルシフェラーゼ活性について（適宜β−ガラクトシ ダーゼ活性について）アッセイする。アンタゴニストおよびルシフェラーゼ酵素 活性を上記のごとくアッセイすることができる。 実施例４ 例えばリン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb，Virology，1973，52，4 56）のような標準的方法論を用いて、単純ヘルペスチミジンキナーゼの最小プロ モーターの上流（−３５から＋１０まで）に４個の並んだＳＴＡＴ応答エレメン トＴＴＣＣＣＧＧＡＡに対応するインサートを含むリポータープラスミドｐＧＬ ２−塩基性ルシフェラーゼベクター(Promega)を用いて、ヒト慢性骨髄性白血病 由来のＫ５６２(ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３)細胞(Proc．Soc．Exp．Biol．Med．1 981，166，546およびBlood，1975，45，321)をトランスフェクションする。トラ ンスフェクション効率の相違を修正するために、β−ガラクトシダーゼ活性を発 現する対照プラスミドとともに細胞を同時トランスフェクションすることができ る。トランスフェクション期間（１２〜２４時間）後、細胞を種々の濃度の化合 物で処理し、ついで、細胞を集め、溶解する。溶解物をルシフェラーゼ活性につ いて（適宜β−ガラクトシダーゼ活性について）アッセイする。アンタゴニスト およびルシフェラーゼ酵素活性を上記のごとくアッセイすることができる。 実施例５ 例えばリン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb，Virology，1973，52，4 56）のような標準的方法論を用いて、単純ヘルペスチミジンキナーゼの最小プロ モーターの上流（−３５から＋１０まで）に４個の並んだＳＴＡＴ応答エレメン トＴＴＣＣＣＧＧＡＡに対応するインサートを含むリポータープラスミドｐＧＬ ２−塩基性ルシフェラーゼベクター(Promega)を用いて、インスリノーマベータ ＴＣ−３細胞（T．J．Kieffer et al.，Biochem．and Biophys．Res．Comm.，19 96，224，552）をトランスフェクションする。トランスフェクション効率の相違 を修正するために、β−ガラクトシダーゼ活性を発現する対照プラスミドととも に細 胞を同時トランスフェクションすることができる。トランスフェクション期間（ １２〜２４時間）後、細胞を種々の濃度の化合物で処理し、ついで、細胞を集め 、溶解する。溶解物をルシフェラーゼ活性について（適宜β−ガラクトシダーゼ 活性について）アッセイする。アンタゴニストおよびルシフェラーゼ酵素活性を 上記のごとくアッセイすることができる。 実施例６ 例えばリン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb，Virology，1973，52，4 56）のような標準的方法論を用いて、単純ヘルペスチミジンキナーゼの最小プロ モーターの上流（−３５から＋１０まで）に４個の並んだＳＴＡＴ応答エレメン トＴＴＣＣＣＧＧＡＡに対応するインサートを含むリポータープラスミドｐＧＬ ２−塩基性ルシフェラーゼベクター（Promega）を用いて、前脂肪細胞由来の３ ０Ａ５細胞（Y．Bai et al.，J．Biol．Chem.，1996，271(24)，13939）をトラ ンスフェクションする。トランスフェクション効率の相違を修正するために、β −ガラクトシダーゼ活性を発現する対照プラスミドとともに細胞を同時トランス フェクションすることができる。トランスフェクション期間（１２〜２４時間） 後、細胞を種々の濃度の化合物で処理し、ついで、細胞を集め、溶解する。溶解 物をルシフェラーゼ活性について(適宜β−ガラクトシダーゼ活性について)アッ セイする。アンタゴニストおよびルシフェラーゼ酵素活性を上記のごとくアッセ イすることができる。 実施例７ 例えばリン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb，Virology，1973，52，4 56）のような標準的方法論を用いて、単純ヘルペスチミジンキナーゼの最小プロ モーターの上流（−３５から＋１０まで）に４個の並んだＳＴＡＴ応答エレメン トＴＴＣＣＣＧＧＡＡに対応するインサートを含むリポータープラスミドｐＧＬ ２−塩基性ルシフェラーゼベクター(Promega)を用いて、マウス筋管Ｃ２ Ｃ１２ 細胞（Nature，1977，270，725）をトランスフェクションする。トランスフェク ション効率の相違を修正するために、β−ガラクトシダーゼ活性を発現する対照 プラスミドとともに細胞を同時トランスフェクションすることができる。トラン スフェクション期間（１２〜２４時間）後、細胞を種々の濃度の化合物で処理し 、ついで、細胞を集め、溶解する。溶解物をルシフェラーゼ活性について（適宜 β−ガラクトシダーゼ活性について）アッセイする。アンタゴニストおよびルシ フェラーゼ酵素活性を上記のごとくアッセイすることができる。 実施例８ 例えばリン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb，Virology，1973，52，4 56）のような標準的方法論を用いて、単純ヘルペスチミジンキナーゼの最小プロ モーターの上流（−３５から＋１０まで）に４個の並んだＳＴＡＴ応答エレメン トＴＴＣＣＣＧＧＡＡに対応するインサートを含むリポータープラスミドｐＧＬ ２−塩基性ルシフェラーゼベクター(Promega)を用いて、卵巣ＳＫ−ＯＶ−３細 胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ７７）（Human Tumor Cells In Vitro p155-159，J．Fo gh(ed)Plenum Press，New York，1975中J．Fogh and Trempeによる記載；および J．Fogh and G Trempe，J．Natl．Cancer Inst．Bethesda，1977，587:209-214 ）をトランスフェクションする。トランスフェクション効率の相違を修正するた めに、β−ガラクトシダーゼ活性を発現する対照プラスミドとともに細胞を同時 トランスフェクションすることができる。トランスフェクション期間（１２〜２ ４時間）後、細胞を種々の濃度の化合物で処理し、ついで、細胞を集め、溶解す る。溶解物をルシフェラーゼ活性について（適宜β−ガラクトシダーゼ活性につ いて）アッセイする。アンタゴニストおよびルシフェラーゼ酵素活性を上記のご とくアッセイすることができる。 実施例９ 例えばリン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb，Virology，1973，52，4 56）のような標準的方法論を用いて、単純ヘルペスチミジンキナーゼの最小プロ モーターの上流（−３５から＋１０まで）に４個の並んだＳＴＡＴ応答エレメン ト ＴＴＣＣＣＧＧＡＡに対応するインサートを含むリポータープラスミドｐＧＬ２ −塩基性ルシフェラーゼベクター(Promega)を用いて、機能的形態のレプチン受 容体でトランスフェクションされた肝細胞癌由来の細胞系(Baumann et al.，Pro c．Natl．Acad．Sci.，1996，93，8374-8378)を連鎖トランスフェクションする 。トランスフェクション効率の相違を修正するために、β−ガラクトシダーゼ活 性を発現する対照プラスミドとともに細胞を同時トランスフェクションすること ができる。トランスフェクション期間（１２〜２４時間）後、細胞を種々の濃度 の化合物で処理し、ついで、細胞を集め、溶解する。溶解物をルシフェラーゼ活 性について（適宜β−ガラクトシダーゼ活性について）アッセイする。アンタゴ ニストおよびルシフェラーゼ酵素活性を上記のごとくアッセイすることができる 。 実施例１０ １０％ウシ胎児血清が同時に存在する標準的培地中で、ＷＲＬ６８細胞を集密 になるまで増殖させた。集密状態となった場合、細胞を無血清培地中に最短でも １８時間保持した（血清濃度を低下させても同様の結果が得られる）。ついで、 血清枯渇細胞をレプチンまたは血清（ｃ−ｆｏｓアップレギュレーションについ ての陽性対照）で５分から２時間までの種々の時間処理した。ＲＮＡを細胞から 抽出し、ゲル電気泳動およびノーザンブロッティングを行った。ついで、ブロッ ティングされたＲＮＡをｃ−ｆｏｓ標識プローブで探索してｃ−ｆｏｓの発現を 分析し、ベーターアクチンの発現を分析することによりデータを標準化した。陽 性対照の血清と同様に、レプチン処理はＷＲＬ６８細胞におけるｃ−ｆｏｓ発現 を有意に促進したので（表１参照）、ＳＴＡＴを活性化すると考えられる。それ ゆえ、ＷＲＬ６８細胞は模倣物の同定に適すると考えられる。レプチンに応答し たｃ−ｆｏｓ発現の分析により、他の細胞系も同定可能であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９６２２８４９．９ (32)優先日 平成８年11月１日(1996．11．1) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９６２２８５０．７ (32)優先日 平成８年11月１日(1996．11．1) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９６２２８５１．５ (32)優先日 平成８年11月１日(1996．11．1) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９６２２８６５．５ (32)優先日 平成８年11月１日(1996．11．1) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９６２２８６６．３ (32)優先日 平成８年11月１日(1996．11．1) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９６２２８６７．１ (32)優先日 平成８年11月１日(1996．11．1) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９６２２８６８．９ (32)優先日 平成８年11月１日(1996．11．1) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９６２２８６９．７ (32)優先日 平成８年11月１日(1996．11．1) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９６２２８７０．５ (32)優先日 平成８年11月１日(1996．11．1) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ｏｂ−蛋白の効果を模倣、促進または抑制する化合物の検出方法であって 、 （ａ）ｏｂ−蛋白の生理学的効果を模倣する化合物については、受容体遺伝子 に結合した、ｏｂ−蛋白により活性化されるシグナルトランスデューサーおよび 転写アクチベーター（ＳＴＡＴ）ＤＮＡ応答エレメントに対する化合物の影響を 評価すること；あるいは （ｂ）ｏｂ−蛋白の生理学的効果を促進または抑制する化合物については、受 容体遺伝子に結合した、ｏｂ−蛋白により活性化されるＳＴＡＴ ＤＮＡ応答エ レメントに対するｏｂ−蛋白により提供される応答に対する化合物の影響を評価 すること を含み、応答エレメントおよび受容体はｏｂ−蛋白応答細胞系において発現され 、該細胞系は、視床下部由来の細胞系、褐色細胞腫由来の細胞系、造血系由来の 細胞系、膵臓由来の細胞系、肝臓由来の細胞系、前脂肪細胞由来の細胞系、骨格 筋由来の細胞系、卵巣由来の細胞系からなるリストから選択されるか、あるいは ｏｂ−蛋白により活性化されるＳＴＡＴ ＤＮＡ応答エレメントに対するｏｂ− 蛋白による刺激を媒介しうるポリペプチドでトランスフェクションされおり、適 当なＳＴＡＴ蛋白を含んでいる細胞系（遺伝子操作による細胞系）において応答 エレメントおよび受容体が発現されるものである方法。 ２．視床下部由来の細胞系がニューロンＧＴ１−７細胞系である請求項１記載 の方法。 ３．褐色細胞腫由来の細胞が副腎褐色細胞腫ラットＰＣ１２細胞である請求項 １記載の方法。 ４．造血系由来の細胞系が、ヒト赤白血病由来のＨＥＬ ９２．１．７（ＡＴ ＣＣ ＴＩＢ １８０）細胞系またはヒト慢性骨髄性白血病由来のＫ５６２（Ａ ＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）細胞系であるである請求項１記載の方法。 ５．膵臓由来の細胞系がベータＴＣ−３細胞系またはＲＩＮ５ｍＦ細胞である 請求項１記載の方法。 ６．前脂肪細胞由来の細胞系が３０Ａ５細胞系または分化した３Ｔ３−Ｌ１も しくは３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞系である請求項１記載の方法。 ７．肝臓由来の細胞系がＨｅｐＧ２細胞系またはＷＲＬ６８およびチェンジ肝 細胞系である請求項１記載の方法。 ８．骨格筋由来の細胞系がマウス筋管Ｃ２ Ｃ１２細胞系である請求項１記載 の方法。 ９．卵巣由来の細胞系がＳＫ−ＯＶ−３細胞系（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ７７）で ある請求項１記載の方法。 １０．ｏｂ−蛋白により活性化されるＳＴＡＴ ＤＮＡ応答エレメントを刺激 することのできるポリペプチドがレプチン受容体の機能的イソ形態である請求項 １記載の方法。 １１．応答エレメントがプロモーター遺伝子、好ましくは最小プロモーターに 結合されている請求項１記載の方法。 １２．応答エレメントが式ＴＴ（Ｎ）_nＡＡ（式中、Ｎはいずれかのヌクレオ チドであり、ｎは４、５または６である）で示されるヌクレオチドである請求項 １記載の方法。 １３．応答エレメントがＴＴＣＣＣＧＧＡＡである請求項１２記載の方法。