JP2001255327A

JP2001255327A - 多孔質支持体と遅延蛍光を用いる物質の検出及び／又は定量法

Info

Publication number: JP2001255327A
Application number: JP2000065861A
Authority: JP
Inventors: Yukio Sudo; 幸夫須藤; Hiroshi Shinoki; 浩篠木; Nobuhiko Ogura; 信彦小倉
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 2000-03-10
Filing date: 2000-03-10
Publication date: 2001-09-21

Abstract

(57)【要約】【課題】ラジオアイソトープ（ＲＩ）を使用しない高
感度のマイクロアレイ法を提供すること。【解決手段】多孔質支持体上に固定した標的物質と、
遅延蛍光を検出できるように標識された試料とを接触さ
せる工程；及び標的物質と相互作用した該試料中の物質
を遅延蛍光により検出及び／又は定量する工程：を含
む、標的物質と相互作用する物質を検出及び／又は定量
する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、標的物質と結合す
る物質を遅延蛍光により検出及び／又は定量する方法に
関する。より詳細には、本発明は、多孔質支持体上に固
定した標的物質に試料を接触させて、標的物質に結合し
た試料を遅延蛍光により検出及び／又は定量する方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解
析するための新しい技術開発が進んでいる。ＤＮＡチッ
プ法は、あらかじめ配列の分かっているＤＮＡを基板上
でマトリックス状に並べておき、未知のＤＮＡ断片とハ
イブリダイズさせて得られるハイブリダイゼーションシ
グナルを解析することにより、ＤＮＡの塩基配列を解析
・決定する方法である。ＤＮＡチップ法を利用すること
により簡便で迅速な塩基配列の解析を行うことが可能で
あり、近年その手法が開発され注目を集めている。しか
しながら、末端ミスマッチ判別が困難なこと、プローブ
配列よりも長いリピート配列の解析が困難なことから、
未知塩基配列決定法としては限界のあることが指摘され
ている。一方、遺伝子発現のモニタリングや、既知塩基
配列における変異の同定、診断分野の応用については急
ピッチの開発が進んでいる。このようなＤＮＡチップを
用いるＤＮＡチップ技術は、ＤＮＡ以外の生体分子にも
適用可能であり、創薬研究、疾病の診断や予防法の開
発、エネルギーや環境問題対策等の研究開発に新しい手
段を提供するものとして期待されている。

【０００３】ＤＮＡチップ技術が具体化してきたのは、
ＤＮＡの塩基配列をオリゴヌクレオチドとのハイブリダ
イゼーションによって決定する方法(SBH:Sequencing by
hybridization)が考案されたことに始まる(Dmanac,R.e
ta1.,Genomics,4, Page114(1989))。SBHは、ゲル電気泳
動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方法では
あったが、実用化には至らなかった。

【０００４】その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発さ
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べる、いわゆるHTS(high-throughput screening)が可能
となった(Fodor,S.P.A.,Science, 251, Page767(1991)
およびSchena, M., Science, 270, Page 467(1995))。

【０００５】しかし、ＤＮＡチップ作製技術を実用化す
るためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを
非多質孔固相担体表面に整列させるためのＤＮＡチップ
の作製技術が必要とされる。このような、ＤＮＡを固定
化する技術については、これまでも数多くの研究がなさ
れてきているが、未だ十分に満足できるものはない。こ
のようなＤＮＡの固定化の不備がデータの信頼性の低
下、感度の低下をもたらしていることが判明してきた。

【０００６】例えば、ガラス支持体等の非多孔質支持体
を用いるＤＮＡマイクロアレイ法が知られている。しか
しながら、非多孔質支持体を用いる場合、ＤＮＡの固定
化の効率が比較的低く、また１スポット当たりのＤＮＡ
固定量も少ないという問題があった。

【０００７】一方、多孔質膜にＤＮＡを固定し、標識Ｄ
ＮＡとのハイブリダイゼーションを行う方法は、Southe
rn Blotting法として知られている。近年は、多孔質膜
上に複数個のＤＮＡをアレイ上に固定し、これと標識し
た検体ＤＮＡを接触させることにより、検体中のｃＤＮ
Ａを測定する方法がマイクロアレイ法として開発されて
きている。マイクロアレイ法では、多孔質膜を使用して
いるため、ＤＮＡの固定化は効率よく行うことができ
る。マクロアレイ法では通常、ラジオアイソトープ（Ｒ
Ｉ）法によって標識と検出が行われる。しかし、ラジオ
アイソトープの取り扱いは繁雑さが伴うという問題があ
り、またスポットの密度（支持体上の１ｃｍ²当たりの
スポット数）が低いという問題もあった。これらの欠点
を回避するために、より簡便な方法として放射性同位元
素を用いることなく、多孔質支持体上に固定されたＤＮ
Ａとハイブリダイズした核酸を蛍光標識により検出する
方法の開発が望まれていた。しかしながら、多孔質膜を
支持体と使用した場合に蛍光標識を使用すると、励起光
の反射によりバックグラウンドが上昇するという問題が
生じ、十分な感度が得られなかった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記した従来
技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。
即ち、本発明が解決しようとする第１の課題は、ラジオ
アイソトープ（ＲＩ）を使用しないマイクロアレイ法を
提供することである。本発明が解決しようとする第２の
課題は、蛍光標識を使用して標的物質と結合する物質を
検出及び／又は定量する方法であってより高感度の方法
を提供することである。本発明が解決しようとする第３
の課題は、ＤＮＡマイクロアレイ技術に応用可能な標的
物質と結合する物質を検出及び／又は定量する方法を提
供することである。本発明の第４の課題は、多孔質支持
体を使用した場合に標識として放射性同位体を用いるこ
となく高感度に標的物質を検出できる方法を提供するこ
とである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は上記課題を解
決するために鋭意検討した結果、種々の濃度のヒト抗体
を多孔質膜上に固定化した後、遅延蛍光物質で標識した
抗ヒト抗体と反応させ、ヒト抗体に結合した標識抗ヒト
抗体を該遅延蛍光により検出したところ、標識として通
常の蛍光物質を使用した場合よりも、検出感度が向上し
ていることを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１０】即ち、本発明によれば、多孔質支持体上に
固定した標的物質と、遅延蛍光を検出できるように標識
された試料とを接触させる工程；及び標的物質と相互作
用した該試料中の物質を遅延蛍光により検出及び／又は
定量する工程：を含む、標的物質と相互作用する物質を
検出及び／又は定量する方法が提供される。

【００１１】好ましくは、多孔質支持体上に固定される
標的物質はＤＮＡであり、標識された試料は標識された
核酸である。好ましくは、多孔質支持体上に固定した標
的物質として、多孔質支持体上に２種類以上のＤＮＡを
固定して得られるＤＮＡアレイを使用する。好ましく
は、ＤＮＡはｃＤＮＡ又はその断片である。

【００１２】好ましくは、遅延蛍光を検出できるように
標識された試料は、遅延蛍光を発する物質で直接標識さ
れた試料、又は遅延蛍光を発する物質と結合できる物質
で標識された試料である。好ましくは、遅延蛍光を発す
る物質は、ランタニドキレート構造を含む物質である。

【００１３】本発明の好ましい態様では、多孔質支持体
上に２種類以上の標的ＤＮＡを固定して得られるＤＮＡ
アレイと、遅延蛍光を検出できるように標識された核酸
とを接触させる工程；及び該ＤＮＡアレイ上に結合した
核酸を遅延蛍光により検出及び／又は定量する工程：を
含む標的ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを検出及
び／又は定量するための方法が提供される。本発明の方
法は、好ましくは、遺伝子の発現、変異及び／又は多型
を解析するために使用される。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施態様及び実施
方法について詳細に説明する。本発明は、多孔質支持体
上に固定した標的物質と、遅延蛍光を検出できるように
標識された試料とを接触させる工程；及び標的物質と相
互作用した該試料中の物質を遅延蛍光により検出及び／
又は定量する工程：を含む、標的物質と相互作用する物
質を検出及び／又は定量する方法に関する。

【００１５】標的物質の種類は、それと相互作用する相
手となる物質（検出される物質）が存在する限り特に制
限されないが、例えば、ＤＮＡ又はＤＮＡ断片、酵素、
抗原、抗体、エピトープまたはタンパク質であり、好ま
しくは核酸であり、より好ましくはＤＮＡであり。特に
好ましくはｃＤＮＡである。遅延蛍光を検出できるよう
に標識された試料は、多孔質支持体上に固定された標的
物質と相互作用することができる物質を含む。本明細書
においておいて「相互作用」とは、蛋白質同士の相互作
用（例えば、抗体と抗原の相互作用など）、核酸同士
（ＤＮＡとＤＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡなど）の相互作用
（核酸ハイブリダイゼーション）などが挙げられる。

【００１６】標的物質として核酸、特にＤＮＡを使用す
る場合、好ましくは１以上の複数種類のＤＮＡが多孔質
支持体に固定される。本発明の好ましい態様では、多数
のＤＮＡを多孔質支持体上に固定したＤＮＡチップが使
用される。ＤＮＡチップを利用した技術としては例えば
以下のようなものが挙げられる。ＤＮＡチップによる塩
基配列解析法の概念を示す特許としては、Hyseq社の米
国特許第5,525,464号、チップ作成技術に関しては米国
特許第5,424,186号(Affymax社)、米国特許第5,556,752
号、米国特許第5,578,832号（以上Affymetrix社）など
が挙げられる。これはフォトリソグラフィーによって基
板状に他種類の配列を有するＤＮＡを合成するものであ
る。Nanogen社（米国特許第5,632,957号）は基板上の微
少電極を荷電させ、ビオチン化したＤＮＡを固定化する
というユニークな方法を開発している。本発明において
も上記特許明細書に記載されたチップ作製技術を使用し
てＤＮＡチップを作製することができる。

【００１７】本発明の一つの実施態様としては、試料中
の遺伝子の解析にある。この場合、1種類以上のＤＮＡ
またはＤＮＡ断片が支持体上に固定化され、ＤＮＡアレ
イを形成することになる。固定化されるＤＮＡまたはＤ
ＮＡ断片は、目的によって二通りに分けることができ
る。遺伝子の発現(ｍＲＮＡの発現レベノレ)を調べるた
めには、cＤＮＡ、cＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌク
レオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌク
レオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的
にはデータベースに登録された配列を基にしてcＤＮＡ
のライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノ
ムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製
する(以下「ＰＣＲ産物」という。)。ＰＣＲ法によって
増幅しないものも好ましく使用することができる。

【００１８】また、遺伝子の変異や多型を調べるには、
標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応
する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用す
ることが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、
4ⁿ(ｎは塩基の長さ)種のオリゴヌクレオチドを合成し、
これを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列
は、既知であることが好ましい。

【００１９】また、このようなＤＮＡまたはＤＮＡ断片
はＤＮＡチップ作製装置(スボツター装置を含む)を用い
てＤＮＡ断片を点着されることが好ましい。点着される
ＤＮＡ断片は、固相担体（多孔質支持体）表面に対し
て、１０〜１０⁵種類/ｃｍ²の範囲にあることが好まし
い。ＤＮＡ断片の量は、1〜10^-15モルの範囲にあり、重
量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点着によ
って、ＤＮＡ断片と親水性ポリマーとの水性液は、固相
担体表面にドットの形状で固定されるが、そのドット間
の距離は、0〜1.5mmの範囲にあることが好ましい。100
〜300μmの範囲にあることが特に好ましい。1つのドッ
トの大きさは、直径が50〜300μmの範囲にあることが好
ましい。点着する量は、100ｐＬ〜1μＬの範囲にあるこ
とが好ましい。1〜100ｎＬの範囲にあることが特に好ま
しい。

【００２０】多孔質支持体としては、例えば、ニトロセ
ルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンフ
ロライド）膜、多孔質ガラス、多孔質セラミックなどが
挙げられる。その他に金属等を平滑支持体上に蒸着する
ことにより、多孔性の支持体を作成することも可能であ
る。このような多孔質支持体の具体例としては、ミリポ
ア社製のイモビロントランスファーメンブラン、アムシ
ャム社製のハイボンド、BioRad社製のTransBlotなどが
市販されている。このような多孔質支持体は、そのまま
使用してもよいし、あるいはガラスやポリエチレンテレ
フタレート（ＰＥＴ）などの固い支持体の上に付着して
使用してもよい。

【００２１】標識核酸は、遺伝子発現を調べる目的で
は、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが
好ましい。標的がゲノムならば、赤血球を除く任意の組
織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く
任意の組織は、末梢血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等
であることが好ましい。標的がｍＲＮＡならば、ｍＲＮ
Ａが発現される組織サンプルから抽出することが好まし
い。ｍＲＮＡは、逆転写反応により標識dNTP(dNTPは、
塩基がアデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)もしく
はチミン(T)であるデオキシリボヌクレオチドを意味す
る。)を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好まし
い。dNTPとしては、化学的な安定性のため、dCTPを用い
ることが好ましい。1回のハイブリダイゼーションに必
要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異なるが、
数μg以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡチップ上
のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、標識核酸
は低分子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞で
は、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを
標識することが好ましい。

【００２２】標識核酸は、遺伝子の変異や多型を調べる
目的では、標識プライマーもしくは標識dNTPを含む反応
系で標的領域のPCRを行って得ることが好ましい。

【００２３】標識方法としては、直接蛍光物質で標識す
る方法、ビオチン／アビジン系、ジゴギシゲニン／抗ジ
ゴキシゲニン抗体系などのような結合を介する方法のい
ずれの方法も用いることができる。蛍光物質としては、
遅延蛍光を発する物質を使用する。

【００２４】遅延蛍光とは、ふつうの蛍光と同じスペク
トルをもつが、寿命が著しく長く１０^-3ｓ以上である発
光を言う。普通の蛍光の寿命は１０^-9ｓから１０^-6ｓで
ある。遅延蛍光にはＥ型、Ｐ型、及び再結合型の３種類
がある。Ｅ型という名称はエオシンなどの色素で見られ
ることに由来する。光照射で生じた準安定な三重項状態
からの熱的励起によって生じる励起一重項状態と基底一
重項状態間の遷移による発光であり、寿命は三重項状態
の寿命と同じである。熱遅延蛍光又はαりん光と呼ばれ
ることもある。Ｐ型の名称はビレンに由来し、多くの芳
香族化合物で見られる。励起三重項状態にある２分子の
相互作用により生じた励起一重項状態からの発光で、気
体、液体、剛性溶媒、結晶など種々の状態及び種々の温
度で観測される。寿命はりん光の約半分で強度はりん光
強度の２乗に比例する。再結合型は光照射によって生じ
た陽イオンと電子（溶媒和などによって補足されてい
る）の再結合による発光である。再結合は一定時間後に
起こるもので遅れた発光となる。寿命は極めて長く１０
０ｓを越えるものもある。

【００２５】本発明では、遅延蛍光を発する物質の種類
は特に限定されないが、好ましくは、ｄＮＴＰに直接標
識して核酸合成反応に使用した場合、鎖中への取り込み
効率に著しい影響を及ぼさない物質である。本発明で好
ましく使用できる遅延蛍光物質は、例えば、特開平６−
９４７２０号公報に記載のランタニドキレート試薬、特
にユーロピウムキレート試薬、並びに特表平１０−５０
５８２０号公報に記載の発光ランタニドキレートなどが
挙げられる。遅延蛍光物質で核酸を標識する方法は当業
者ならば適宜選択することができ、例えば、上記特許文
献（特開平６−９４７２０号公報、及び特表平１０−５
０５８２０号公報）に記載されている方法を使用でき
る。以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明は実施例によって限定されることはない。

【００２６】

【実施例】（１）IgG固定化膜の作成ヒトIgG（Sigma社製）をPBSで１０倍ずつの段階希釈を
行い10^-6mol/Ｌから、10^-12mol/Ｌまでの抗体希釈液を
作成した。この抗体希釈液5μＬを、ニトロセルロース
膜（BioRad社製：TransBlot）に点着、乾燥したのち、
３％のBSA（BovineSerum Albmin）を含有するPBS中で、
室温で３時間放置したのち、PBSで洗浄し、ヒトIgG固定化
膜を作成した。（２）遅延蛍光実験 Eu標識抗ヒトIgG抗体（Amersham社製）をトリス塩酸緩衝
液（pH8.0）で希釈し、0.5μg/mＬの標識抗体液を作成
した。（１）で作製したヒトIgG固定化膜を、この標識
抗体液に浸漬し室温で２時間反応させた後、トリス塩酸
緩衝液（pH8.0）で３回洗浄し、増強試薬液（Amersham
社製）に浸漬後、乾かないようにサランラップ（登録商
標）で包んだ。メンブラン用遅延蛍光測定装置により、
励起光３４０ｎｍ、測定波長６１５ｎｍで、４００μse
cから８００μsecの遅延蛍光を測定した。その結果、１
０^-11mol/Ｌの抗体スポット液まで検出することができ
た。

【００２７】（３）比較実験 Cy5標識抗ヒトIgG抗体（Amersham社製）をトリス塩酸緩衝
液（pH8.0）で希釈し、0.5μg/ｍＬの標識抗体液を作成
した。（１）で作製したヒトIgG固定化膜を、この標識
抗体液に浸漬し室温で２時間反応させた後、トリス緩衝
液（pH8.0）で３回洗浄し、乾かないようにサランラッ
プで包んだ。メンブラン用遅延蛍光測定装置により、励
起光633ｎｍ、測定波長675ｎｍで、蛍光を測定した。そ
の結果、１０^-9mol/Ｌの抗体スポット液まで検出するこ
とができた。

【００２８】上記遅延蛍光実験では１０^-11mol/Ｌの抗
体スポット液まで検出できたのに対して、上記比較実験
では、１０^-9mol/Ｌの抗体スポット液までしか検出でき
なかったことより、遅延蛍光標識を使用する本発明の方
法では、検出感度が向上していることがわかる。

【００２９】

【発明の効果】本発明の検出及び／又は定量方法では、
従来法と比較してより高い検出感度を達成できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 35/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者小倉信彦神奈川県足柄上郡開成町宮台798番地富士写真フイルム株式会社宮台技術開発センター内Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA12 DA13 DA14 FB02 FB07 FB12 FB15 2G058 BA01 CC09 EA11 GA02 4B024 AA11 CA04 CA09 HA12 4B063 QA08 QA17 QA19 QQ42 QR32 QR66 QR82 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】多孔質支持体上に固定した標的物質と、
遅延蛍光を検出できるように標識された試料とを接触さ
せる工程；及び標的物質と相互作用した該試料中の物質
を遅延蛍光により検出及び／又は定量する工程：を含
む、標的物質と相互作用する物質を検出及び／又は定量
する方法。
【請求項２】多孔質支持体上に固定される標的物質が
ＤＮＡであり、標識された試料が標識された核酸である
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】多孔質支持体上に固定した標的物質とし
て、多孔質支持体上に２種類以上のＤＮＡを固定して得
られるＤＮＡアレイを使用することを特徴とする、請求
項１又は２に記載の方法。
【請求項４】ＤＮＡがｃＤＮＡ又はその断片である、
請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】遅延蛍光を検出できるように標識された
試料が、遅延蛍光を発する物質で直接標識された試料、
又は遅延蛍光を発する物質と結合できる物質で標識され
た試料である、請求項１から４の何れか１項に記載の方
法。
【請求項６】遅延蛍光を発する物質が、ランタニドキ
レート構造を含む物質である、請求項１から５の何れか
１項に記載の方法。
【請求項７】多孔質支持体上に２種類以上の標的ＤＮ
Ａを固定して得られるＤＮＡアレイと、遅延蛍光を検出
できるように標識された核酸とを接触させる工程；及び
該ＤＮＡアレイ上に結合した核酸を遅延蛍光により検出
及び／又は定量する工程：を含む標的ＤＮＡと相補的な
配列を有するＤＮＡを検出及び／又は定量するための方
法。
【請求項８】遺伝子の発現、変異及び／又は多型を解
析するために使用する請求項１から７の何れか１項に記
載の方法。