JP2001128675A

JP2001128675A - エンドセリン−３前駆体に対するモノクローナル抗体およびその用途

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Publication number: JP2001128675A
Application number: JP2000277433A
Authority: JP
Inventors: Nobuhiro Suzuki; 伸宏鈴木; Hirokazu Matsumoto; 寛和松本
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-07-24
Filing date: 2000-09-13
Publication date: 2001-05-15
Anticipated expiration: 2018-06-23
Also published as: JP3419746B2

Abstract

(57)【要約】【課題】エンドセリン−３の生理的役割、エンドセリ
ン−３の発現部位、血漿レベル等、基本的な生理的情報
を得る。【解決手段】エンドセリン−３前駆体に結合性を有する
モノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ細胞、および該抗体を用いた競合法ある
いはサンドイッチ法によるエンドセリン−３前駆体であ
る、例えばビッグエンドセリン−３の免疫測定法を提供
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はエンドセリン−３の前駆
体、例えばビッグエンドセリン−３に結合特異性を有す
る点で有用かつ新規な抗体に関する。更に詳しくは、抗
原抗体反応に基づくエンドセリン−３の前駆体、例えば
ビッグエンドセリン−３の測定法の開発、あるいはエン
ドセリン−３が関与する疾患の診断、予後治療に有用な
抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】エンドセリン−１は血管内皮細胞の培養
上清中に見出された２１個のアミノ酸からなるペプチド
であり、極めて強力かつ持続的な血管平滑筋収縮活性な
らびに血圧上昇活性を有する。また、エンドセリン−１
のｃＤＮＡの解析から、その生合成過程の中間体とし
て、アミノ酸約40個からなるビッグエンドセリン−１
（エンドセリン−１前駆体）の存在も想定されている。
これまでにエンドセリン−１およびビッグエンドセリン
−１に対するモノクローナル抗体が作製され、高感度な
酵素免疫測定法が開発されたことによりエンドセリン−
１の生理的役割・病態との関連の解明に向けて幅広い研
究を展開することが可能となった。既に、中和活性能を
有するモノクローナル抗体を特異的アンタゴニストとし
て用いることにより、エンドセリン−１が虚血性疾患と
深い関わりを有することが明らかにされ、さらに該測定
法を用いて血漿エンドセリン−１レベルと病態との関連
について詳細な研究が進められている。一方、染色体Ｄ
ＮＡの解析から、新たにエンドセリン−２およびエンド
セリン−３の配列が見出され、エンドセリンが遺伝子フ
ァミリーを形成していることが明らかにされた。特にエ
ンドセリン−３は、エンドセリン−１、エンドセリン−
２とは、以下の例に示すように２１アミノ酸残基中６残
基（アンダーライン参照）が異なっており、その平滑筋
収縮、血圧上昇活性もエンドセリン−１、エンドセリン
−２と比較してかなり微弱であることが報告されてい
る。エンドセリン−１（ブタ、ヒト。エンドセリン−αと呼
ぶこともあった。）Ｃｙs Ｓｅr Ｃｙs Ｓｅr Ｓｅr Ｌｅu Ｍｅt Ａｓp Ｌｙs Ｇｌu Ｃｙs Ｖａl Ｔｙr Ｐｈe Ｃｙs Ｈｉs Ｌｅu Ａｓp Ｉｌe Ｉｌe Ｔｒp エンドセリン−２（ヒト）Ｃｙs Ｓｅr Ｃｙs Ｓｅr Ｓｅr Ｔｒp Ｌｅu Ａｓp Ｌｙs Ｇｌu Ｃｙs Ｖａl Ｔｙr Ｐｈe Ｃｙs Ｈｉs Ｌｅu Ａｓp Ｉｌe Ｉｌe Ｔｒp エンドセリン−３（ラット、ヒト。γと呼ぶこともあっ
た。）Ｃｙs Ｔｈr Ｃｙs Ｐｈe Ｔｈr Ｔｙr Ｌｙs Ａｓp Ｌｙs Ｇｌu Ｃｙs Ｖａl Ｔｙr Ｔｙr Ｃｙs Ｈｉs Ｌｅu Ａｓp Ｉｌe Ｉｌe Ｔｒp また、エンドセリン−３のｃＤＮＡの解析から、エンド
セリン−３の前駆体構造が明らかにされ（特願平１−２
５３７９７）、エンドセリン−３が下記の配列を有する
ビッグエンドセリン−３を直接の前駆体として合成され
ることが示唆された。Ｃｙs Ｔｈr Ｃｙs Ｐｈe Ｔｈr Ｔｙr Ｌｙs Ａｓp Ｌｙs Ｇｌu Ｃｙs Ｖａl Ｔｙr Ｔｙr Ｃｙs Ｈｉs Ｌｅu Ａｓp Ｉｌe Ｉｌe Ｔｒp Ｉｌe Ａｓn Ｔｈr Ｐｒo Ｇｌu Ｇｌn Ｔｈr Ｖａl Ｐｒo Ｔｙr Ｇｌy Ｌｅu Ｓｅr Ａｓn Ｔｙr Ａｒg Ｇｌy Ｓｅr Ｐｈe Ａｒg Ｘ（Ｘ＝Ｇｌｙ−ＯＨまたはＮＨ₂ ＝Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＯＨ＝Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＯＨ）このように、構造および薬理作用の研究結果は、エンド
セリン−３がエンドセリン−１、−２とは異なるリセプ
ターシステムを形成していることを強く示唆しており、
その生理的役割に深い関心が寄せられている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、エン
ドセリン−３の生理的役割に対する関心が高まっている
にもかかわらず、これまで、エンドセリン−３の発現部
位、血漿レベル等、基本的な生理的情報はほとんで得ら
れていない。この主たる原因として、これまでエンドセ
リン−３あるいはエンドセリン−３前駆体を特異的に認
識するモノクローナル抗体が作製されておらず、さらに
エンドセリン−３あるいはエンドセリン−３前駆体を特
異的かつ高感度に測定する免疫学的測定法が開発されて
いないことが挙げられる。これらの免疫学的手法は、エ
ンドセリン−３の研究、特に代謝経路、分泌機構、リセ
プターシステム、病態との関連等に関する研究を総合的
に行う上で最も有効な手段の一つと考えられ、該手法の
確立が各界から切望されていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、エンドセ
リン−３前駆体である、例えばビッグエンドセリン−３
に結合特異性を有するモノクローナル抗体を作製し、該
抗体を用いてビッグエンドセリン−３を高感度にかつ特
異的に検出し得る免疫測定法を開発した。さらに該抗体
特有の薬理作用、すなわち、該抗体が種々の動物の平滑
筋のエンドセリン−３による収縮を抑制することを見出
した。これらの知見は、該抗体をエンドセリン−３の特
異的アンタゴニストとして使用し得ることを示してお
り、該抗体がエンドセリン−３と因果的に、または症候
的に関連する各種疾患の予防あるいは治療薬となり得る
ことを示している。すなわち、本発明はエンドセリン−
３前駆体に結合性を有するモノクローナル抗体、該モノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、および
該抗体を用いた競合法あるいはサンドイッチ法によるエ
ンドセリン−３前駆体である、例えばビッグエンドセリ
ン−３の免疫測定法に関する。

【０００５】エンドセリン−３のサンドイッチ法におい
ては、１次反応および２次反応に用いられる抗体はそれ
ぞれポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であ
ってもよいが、好ましくはその一方がエンドセリン−３
とは反応するが、エンドセリン−３のＣ端部とは反応し
ない抗エンドセリン−３モノクローナル抗体であって、
他方がエンドセリン−３のＣ端部と反応する抗エンドセ
リン−３ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体が
用いられる。この後者のエンドセリン−３のＣ端部と反
応する抗エンドセリン−３ポリクローナルもしくはモノ
クローナル抗体は、上記のエンドセリン−１，２とのア
ミノ酸配列の比較から判るように、エンドセリン−１ま
たは−２のＣ端部と反応する抗体と同一のものを含み、
これについては特願平１−４６５６０号で言及してい
る。また、ビッグエンドセリン−３のサンドイッチ法に
おいても、好ましくは、１次反応および２次反応に用い
られる抗体の一方が、ビッグエンドセリン−３とは反応
するが、エンドセリン−３とは反応しないモノクローナ
ル抗体であって、他方がエンドセリン−３と反応するモ
ノクローナル抗体が用いられる。さらに、ビッグエンド
セリン−３とは反応するが、エンドセリン−３とは反応
しないモノクローナル抗体において、特に好ましくは、
ビッグエンドセリン−３のＣ端部分の構造に対し、広い
特異性を有する抗体、例えばＣ末端がＡｒｇ−Ｇｌｙの
配列でも、Ａｒｇ−ＮＨ2の配列でも、同程度に反応す
る抗体が用いられる。本発明のポリクローナル抗体の調
製は一般に免疫抗原のエンドセリン−３あるいはビッグ
エンドセリン−３とキャリアー蛋白との複合体をつく
り、このものを動物に接種して免疫を行い、該免疫動物
から目的とする抗体含有物を採取、抗体の分離精製を行
うことによる。

【０００６】本発明のモノクローナル抗体の調製に当っ
ては、上記免疫動物から抗体価の高い個体を選び、最終
免疫２〜５日後に脾臓あるいはリンパ節を採取、それら
に含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させ、安定
的に力価の高い抗体を産生するハイブリドーマを選択
し、モノクローナルなハイブリドーマを得ることによ
る。免疫抗原としては、天然精製標品、合成標品等いず
れも使用でき、先に述べたエンドセリン−３、ビッグエ
ンドセリン−３、およびビッグエンドセリン−３の一部
分が用いられる。また免疫抗原として、エンドセリン−
３の構造を含む化合物、あるいはエンドセリン−３の一
部分の構造を含む化合物が用いられる場合もある。本発
明で用いられる種々のペプチドは、ペプチド合成の公知
の常套手段で製造しうる。固相合成法、液相合成法のい
ずれによってもよい。例えば固相法によりエンドセリン
−３を合成する場合、メリーフィールドの固相ペプチド
合成方法〔ジャーナルオブジアメリカンケミカル
ソサィエティ（J.Am. Chem. Soc.),85,2149(1963)〕を
用いるのが好ましい。不溶性樹脂として当該技術分野で
知られたもののいずれであってもよく、例えばクロロメ
チル化されたスチレン−ジビニルベンゼン共重合体、フ
ェナシルアセティックメチル化されたスチレン−ジビニ
ルベンゼン共重合体のようなポリスチレン型樹脂、ポリ
ジメチルアクリルアミド樹脂のようなポリアミド型樹脂
が挙げられる。Ｃ末端のＮ−保護アミノ酸を不溶性樹脂
に結合させた後、エンドセリン−３のＣ末端側から保護
アミノ酸を常法に従って順次結合し、次いでフッ化水素
で処理した後、ジスルフィド結合を形成させ目的とする
エンドセリン−３を合成することができる。Ｎ−保護ア
ミノ酸としては、α−アミノ基はすべてＢｏｃ基で保護
し、セリンおよびスレオニンの水酸基はＢｚｌ基で、グ
ルタミン酸、アスパラギン酸のω−カルボン酸はＯＢｚ
ｌ基、リジンのε−アミノ基はＣｌ−Ｚ基、システイン
のチオール基はＡcm基、ＭｅＢｚｌ基、チロシンの水酸
基はＢｒ−Ｚ基、ヒスチジンのイミダゾール基およびア
ルギニンのグアニド基はＴｏｓ基、トリプトファンのイ
ンドール基はＣＨＯ基で保護するのが好ましい。液相法
による合成の手段としては、たとえば「ザペプチズ（T
he Peptides）」、第１巻（1966年）、Schroder and Lu
bke 著、Academic Press, New York，U.S.A.あるいは
“ペプチド合成"、泉屋ら著、丸善株式会社（1975年）
に記載された方法、たとえばアジド法、クロライド法、
酸無水物法、混合無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル
法、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダ
ゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ／アディテイブ（例、Ｈ
ＯＮＢ，ＨＯＢｔ，ＨＯＳｕ）法などがあげられる。

【０００７】哺乳動物を免疫するために用いられる免疫
抗原とキャリアー蛋白との蛋白複合体に関し、キャリア
ー蛋白の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比
は、キャリアーにカプリングさせて免疫したハプテンに
対して抗体が効率よく出来れば、どの様なものをどの様
な比率でカプリングさせてもよいが、例えば、牛血清ア
ルブミンや牛サイログロブリン、ヘモシアニン等を重量
比でハプテン１対し 0.1〜20、好ましくは１〜５の割合
でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキ
ャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いること
が出来るが、グルタルアルデビトやカルボジイミド、マ
レイミド活性エステル等が好都合に用いられる。縮合生
成物は温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部
位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される
が、なかでも皮下注射が好ましい。投与に際して抗体産
生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完
全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通
常２〜６週毎に１回ずつ行われる。用いられる温血動物
としては、たとえばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、
マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられ
る。抗体は上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹
水（好ましくは血液）などから採取される。例えば、免
疫原がエンドセリン−３あるいはその部分ペプチドであ
る場合、抗血清中の抗エンドセリン−３抗体価の測定
は、例えば後記の標識化エンドセリン−３と抗血清とを
反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定す
ることによりなされる。抗体の分離精製は免疫グロブリ
ンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電
点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）
による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原抗体結合
物あるいは活性吸着剤により特異抗体のみを採取し、結
合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行わ
れる。このようにして作製された抗体は、ＩｇＧを主た
る成分とし、ＩｇＭ，ＩｇＡ等、他の免疫グロブリンも
含む。

【０００８】一方、上記のポリクローナル抗体の調製法
と同様に免疫された温血動物、たとえばマウスから抗体
価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾
臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生
細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、抗エンドセ
リン−３抗体および抗エンドセリン−３前駆体抗体産生
ハイブリドーマを調製することができる。融合操作は既
知の方法、たとえばケーラーとミルスタインの方法〔ネ
ーチャー（Nature）、256、495 (1975)〕に従い実施で
きる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール(Ｐ
ＥＧ)やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好まし
くはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞としてはたとえば
ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などがあげられるが、
特にＰ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産
生細胞（脾臓細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は
１：１〜20：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ
1000〜ＰＥＧ6000）が10〜80％程度の濃度で添加され、
20〜40℃、好ましくは30〜37℃で１〜10分間インキュベ
ートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。抗
エンドセリン−３抗体産生ハイブリドーマあるいは抗ビ
ッグエンドセリン−３抗体産生ハイブリドーマのスクリ
ーニングには種々の方法が使用できるが、たとえばエン
ドセリン−３、ビッグエンドセリン−３、あるいはビッ
グエンドセリン−３の部分ペプチドを吸着させた固相
(例、マイクロプレート)にハイブリドーマ培養上清を添
加し、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ）で標
識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細
胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用い
られる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した抗
エンドセリン−３モノクローナル抗体を検出するＥＬＩ
ＳＡ(Enzyme-linked immunosorbent assay)法、抗免疫
グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相に
ハイブリドーマ培養上清を添加し、ＨＲＰで標識したエ
ンドセリン−３、ビッグエンドセリン−３、あるいはビ
ッグエンドセリン−３の部分ペプチドを加え、固相に結
合したモノクローナル抗体を検出するＥＩＡ(Enzyme im
munoassay)法などがあげられる。ハイブリドーマの選
別、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン）を添加して、10〜20％牛胎児血清を含む
動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ1640)で行われる。ハイ
ブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体
価の測定と同様にして測定できる。

【０００９】抗エンドセリン−３モノクローナル抗体あ
るいは抗ビッグエンドセリン−３抗体の分離精製は上記
のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリ
ンの分離精製法に従って行われる。エンドセリン−３の
一部領域と反応する抗エンドセリン−３ポリクローナル
抗体は、その一部領域に相当するペプチド（部分ペプチ
ド）をハプテンとして免疫し上記の方法で調製すること
もできるが、エンドセリン−３をハプテンとして用いて
調製された抗エンドセリン−３ポリクローナル抗体か
ら、その一部領域に相当するペプチドを結合したカラム
によるアフィニティクロマトグラフィを用いて調製する
こともできる。また、ビッグエンドセリン−３の一部領
域と反応する抗ビッグエンドセリン−３ポリクローナル
抗体は、その一部領域に相当するペプチドをハプテンと
して免疫し上記の方法で調製することもできるが、ビッ
グエンドセリン−３をハプテンとして用いて調製された
抗ビッグエンドセリン−３ポリクローナル抗体から、そ
の一部領域に相当するペプチドを結合したカラムによる
アフィニティクロマトグラフィを用いて調製することも
できる。また、エンドセリン−３あるいはビッグエンド
セリン−３の一部領域と反応するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマおよび、エンドセリン−３ある
いはビッグエンドセリン−３とは反応するがその一部領
域とは反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマの選別はたとえばその一部領域に相当するペプ
チドとハイブリドーマが産生する抗体との結合性を測定
することにより行うことができる。特にエンドセリン−
３Ｃ端ペプチドＣｙs Ｈｉs Ｌｅu Ａｓp Ｉｌe Ｉｌe
Ｔｒp 以外を認識するモノクローナル体のスクリーニ
ングには、該ペプチドに対する抗体の標識体を用いるサ
ンドイッチ型ＥＩＡを用いるのが好ましい。すなわち、
抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた
固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、エンドセリン
−３を加え、さらにＨＲＰで標識した抗エンドセリン−
３Ｃ端ペプチド抗体を反応させたのち、固相上の酵素
活性を測定するＥＩＡ法である。

【００１０】上記で得られた抗エンドセリン−３および
抗ビッグエンドセリン−３モノクローナル抗体を用い
て、エンドセリン−３の測定ないし組織染色等を行ない
得る。エンドセリン−３およびビッグエンドセリン−３
の測定法には通常、以下に述べる競合法が用いられる
が、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。競
合法においては、本発明で得られた抗エンドセリン−３
あるいは抗ビッグエンドセリン−３抗体と、被検液およ
び標識化エンドセリン−３あるいは標識化ビッグエンド
セリン−３あるいはその部分ペプチドとを競合的に反応
させたのち、抗体に結合した標識剤の割合を測定するこ
とにより、被検液中のエンドセリン−３、ビッグエンド
セリン−３、あるいはビッグエンドセリン−３の部分ペ
プチドを定量する。

【００１１】該エンドセリン−３、ビッグエンドセリン
−３、あるいはビッグエンドセリン−３の部分ペプチド
の標識剤あるいは後記の抗体の標識剤としては、放射性
同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが挙げられ
る。放射性同位元素としては、例えば¹²⁵Ｉ,¹³¹Ｉ,³Ｈ,
¹⁴Ｃなどが、上記酵素としては、安定で比活性の大きな
ものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グ
ルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシ
ダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が、蛍光物質としては、
フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート
などが、発光物質としては、ルミノール、ルミノール誘
導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げら
れる。さらに、抗体あるいはエンドセリン−３、ビッグ
エンドセリン−３、あるいはビッグエンドセリン−３の
部分ペプチドと標識剤との結合にビオチン−アビジン系
を用いることもできる。上記の標識剤の活性の測定に当
っては、例えばエンドセリン−３の測定の場合、抗体に
結合した標識化エンドセリン−３と遊離の標識化エンド
セリン−３とを分離（以後Ｂ／Ｆ分離と略す）する必要
があるが、標識剤として酵素を用いた場合には、このた
めの試薬に不溶化した抗エンドセリン−３抗体に対する
抗体あるいは不溶化したプロテインＡ等の活性吸着剤が
有利に用いられる。例えば、抗ＩｇＧ抗体（抗エンドセ
リン−３抗体に対する抗体に相当）を固相として用い、
これと反応性のある上記抗体を介して標識化エンドセリ
ン−３を固相にある抗ＩｇＧ抗体に結合させ、該固相上
の標識剤を測定することによって行なうことができる。
標識剤として酵素を用いた場合には、不溶化担体上の酵
素活性の測定には通常の比色法あるいは蛍光法が用いら
れる。標識剤にラジオアイソトープ等、非蛋白性物質を
用いた場合には、Ｂ／Ｆ分離に上記の試薬以外にも不溶
化しない抗エンドセリン−３に対する抗体、硫酸ナトリ
ウム、デキストラン炭末、ポリエチレングリコール等の
試薬が用いられる。いずれの方法においても上清中ある
いは沈降物中の標識剤の活性を測定する。上記の不溶化
に当っては、物理的吸着を用いてもよく、また通常蛋白
質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる
化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロ
ース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、
ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成
樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。

【００１２】競合法においては、例えばエンドセリン−
３の測定の場合、抗エンドセリン−３抗体、被検液、標
識化エンドセリン−３、およびＢ／Ｆ分離用試薬は、ど
のような順序に反応させることも可能であり、また全部
あるいは一部を同時に反応させてもよいが、少なくとも
標識化エンドセリン−３は、被検液と抗エンドセリン−
３抗体との反応と同時に、あるいは反応後に遅れて反応
系に加えられることが好ましい。ただし硫酸ナトリウ
ム、デキストラン炭末、ポリエチレングリコール等のＢ
／Ｆ分離試薬は主として反応系の最後に用いられる。

【００１３】一方、サンドイッチ法においては不溶化し
た抗エンドセリン−３あるいはビッグエンドセリン−３
抗体に被検液を接触（反応）させ（１次反応）、さらに
標識化抗エンドセリン−３あるいはビッグエンドセリン
−３抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上
の標識剤の活性を測定することにより被検液中のエンド
セリン−３あるいはビッグエンドセリン−３量を定量す
ることができる。１次反応と２次反応は同時に行なって
もよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤およ
び不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。
２次反応に用いられる抗エンドセリン−３抗体あるい
は抗ビッグエンドセリン−３抗体としては、１次反応に
用いられる抗エンドセリン−３抗体あるいは抗ビッグエ
ンドセリン−３抗体とはエンドセリン−３あるいはビッ
グエンドセリン−３の該抗体と結合する部位が相異なる
抗体が好ましく用いられる。たとえばエンドセリン−３
の測定の場合、１次反応で用いられる抗体がエンドセリ
ン−３のＣ端部との結合能を有する場合、２次反応で
は、好ましくはＣ端部以外（例、Ｎ端部）と結合する抗
エンドセリン−３抗体が用いられ、また１次反応で用い
られる抗体がエンドセリン−３のＮ端部との結合能を有
する場合、２次反応では、好ましくはＮ端部以外（例、
Ｃ端部）と結合する抗エンドセリン−３抗体が用いられ
る。１次反応および２次反応に用いられる抗体はそれぞ
れポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であっ
てもよいが、例えばエンドセリン−３の測定の場合、好
ましくはその一方がエンドセリン−３とは反応するが、
エンドセリン−３のＣ端部とは反応しない抗エンドセリ
ン−３モノクローナル抗体であって、他方がエンドセリ
ン−３のＣ端部と反応する抗エンドセリン−３ポリクロ
ーナルもしくはモノクローナル抗体が用いられる。サン
ドイッチ法によるエンドセリン−３の免疫学的測定法に
おいて特に好ましくは、エンドセリン−３のＣ端ペプチ
ド、すなわちＣys−Ｈis−Ｌeu−Ａsp−Ｉle−Ｉle−Ｔ
rpと反応する抗エンドセリン−３ポリクローナル抗体お
よび、エンドセリン−３とは反応するが、上記エンドセ
リン−３のＣ端ペプチドとは反応しない抗エンドセリン
−３モノクローナル抗体が用いられる。サンドイッチ法
による免疫測定法においては、固相用抗体および標識用
抗体いずれもいかなるクラス、サブクラスのものでもよ
く、また、抗体活性が保持されているなら、それらから
Ｆｃ’あるいはＦｃ領域を除去したＦ(ａｂ’)₂画分、
Ｆａｂ’画分あるいはＦａｂ画分でもよい。サンドイッ
チ法による免疫測定法において、モノクローナル抗体を
用いる場合、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられ
る抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を
向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用い
てもよい。また、本発明で得られた抗体を用いる免疫測
定法は、エンドセリン−３が関与する疾患の診断および
予後管理に使用し得る。

【００１４】被検試料としては、血漿、血清、尿、脳脊
髄液、腹水、胸水、羊水等の体液や、痰、便などが使用
し得る。これらの試料は、そのまま、あるいは各種緩衝
液で希釈あるいは抽出後濃縮し、イムノアッセイの試料
とし得る。試料の希釈あるいは抽出に用いられる溶媒と
してはどのような緩衝液あるいは有機溶媒を用いてもよ
いが、好ましくはイムノアッセイ用緩衝液、水、生理食
塩水、酢酸緩衝液、アセトン、クロロホルム−メタノー
ルあるいは、界面活性剤を含むこれらの溶液が用いられ
る。また、濃縮は、試料を直接減圧下、あるいは常圧、
窒素気流下濃縮してもよいし、また試料をイオン交換あ
るいは逆相クロマトグラフィー用担体あるいは抗エンド
セリン−３抗体結合担体に添加したのち、適当な溶出条
件で溶出後、減圧下あるいは常圧、窒素気流下濃縮して
も良い。濃縮用担体として特に好ましくは、逆相クロマ
トグラフィー用担体のＣ２，Ｃ８あるいはＣ18カートリ
ッジが用いられる。濃縮物はイムノアッセイ用緩衝液に
溶解後、イムノアッセイの試料とする。さらに、本発明
で得られた抗エンドセリン−３および抗ビッグエンドセ
リン−３抗体はエンドセリン−３およびビッグエンドセ
リン−３の免疫組織染色法等にも用いる事ができる。そ
の方法は、例えば標識化抗エンドセリン−３あるいは標
識化ビッグエンドセリン−３抗体を用いる直接法、抗エ
ンドセリン−３抗体あるいはビッグエンドセリン−３抗
体および該抗体に対する抗体の標識化されたものを用い
る間接法等に準ずることができる。

【００１５】また、さらに本発明で得られた抗エンドセ
リン−３抗体のうちエンドセリン−３の血管収縮能を中
和し得る抗体は、エンドセリン−３の特異的アンタゴニ
ストとして使用し得る。抗エンドセリン−３抗体の中か
らエンドセリン−３の作用を特異的に抑制する抗体をス
クリーニングする方法としては、エンドセリン−３の薬
理作用を検出するいかなる方法を用いることも可能であ
り、例えば、エンドセリン−３のブタ、ラット、ウサ
ギ、モルモット、イヌ、ヒト等、各種血管平滑筋収縮活
性を指標とする生体外の測定系、あるいはエンドセリン
−３の上記動物の血圧上昇活性または血圧下降活性を指
標とする生体の測定系が挙げられる。得られたエンドセ
リン−３の作用を特異的に抑制する抗体はＩｇＧ，Ｉｇ
Ａ，ＩｇＭいかなるクラスのものでもよく、またそれら
からＦｃ′あるいはＦｃ領域を除去したＦａｂ′あるい
はＦａｂ画分あるいはその重合体でもよい。また、エン
ドセリン−３の作用を特異的に抑制及し得るモノクロー
ナル抗体の可変遺伝子部と、ヒトイムノグロブリン定常
遺伝子部とを融合させ、組み換え体として発現させたキ
メラ抗体を用いることもできる。

【００１６】

【実施例】以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれに限定されるべきものではな
い。後述の実施例で用いられているマウスモノクローナ
ル抗体ＡＥＴ−３０ａを産生するハイブリドーマ細胞Ａ
ＥＴ−３０は財団法人発酵研究所(IFO)に受託番号ＩＦ
Ｏ５０１９３として平成１年７月７日から寄託されて
いる。また、該ハイブリドーマは通商産業省工業技術院
微生物工業研究所(FRI)に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−２５
２３としてブダペスト条約に基き平成１年７月２０日か
ら寄託され、ＦＲＩに保管されている。後述の実施例で
用いられているマウスモノクローナル抗体ｂＥＴ−３１
ａを産生するハイブリドーマ細胞ｂＥＴ−３１は財団法
人発酵研究所(IFO)に受託番号ＩＦＯ５０２４７とし
て平成２年５月２４日から寄託されている。また、該ハ
イブリドーマは通商産業省工業技術院微生物工業研究所
(FRI)に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−２９４９としてブダ
ペスト条約に基き平成２年６月１２日から寄託され、Ｆ
ＲＩに保管されている。後述の実施例で用いられている
マウスモノクローナル抗体ｂＥＴ−２３ａを産生するハ
イブリドーマ細胞ｂＥＴ−２３は財団法人発酵研究所(I
FO)に受託番号ＩＦＯ５０２４６として平成２年５月
２４日から寄託されている。また、該ハイブリドーマは
通商産業省工業技術院微生物工業研究所(FRI)に受託番
号ＦＥＲＭＢＰ−２９４８としてブダペスト条約に基
き平成２年６月１２日から寄託され、ＦＲＩに保管され
ている。

【００１７】Ｉ．酵素標識化抗エンドセリン−３Ｃ端
ペプタイド抗体の作製Ｉ−１．ペプタイドの合成 i）H-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-OH （エンドセリン
−３のＣ端部）の合成 Boc-Ile-Trp-OBzl：H-Trp-OBzl-pTsOH 84gをＤＭＦ100
ｍlに溶解し、ＴＥＡ25ｍlで中和ののち Boc-Ile-OH・1/
2 H₂O 48.9ｇ,HONB 40.12ｇ、ＤＣＣ 46.20gより調製の
Boc-Ile-ONB を加え一晩撹拌した。溶媒を減圧留去
し、残留物にジエチルエーテル 400ｍlと酢酸エチル20
ｍlを加え溶解し、0.5Ｎ−ＨＣl，５％−ＮａＨＣＯ_３
水で洗い、水洗ののち無水ＭｇＳＯ_４で乾燥した。溶
媒を留去し、残留物に石油エーテルを加え結晶をろ取し
た。収量 83.1g（90.9％）〔α〕_D ¹⁸−19.7°（ｃ＝0.99 MeOH）元素分析：Ｃ₂₉Ｈ₃₇Ｎ₃Ｏ₅として計算値：Ｃ，68.62 ;Ｈ，7.35 ;Ｎ，8.28 実測値：Ｃ，68.69 ;Ｈ，7.35 ;Ｎ，8.16 Boc-Ile-Ile-Trp-OBzl：Boc-Ile-Trp-OBzl 53.3ｇをジ
オキサン120ｍlに溶解し、氷冷下に7.1Ｎ−ＨＣl−ジオ
キサン 160ｍlを加え、90分間撹拌した。溶媒を減圧留
去し、残留物にジエチルエーテルを加え、析出物をろ取
した。これをアセトニトリル150ｍlとＤＭＦ250ｍlの混
合溶媒に溶解し、氷冷下、ＴＥＡ14.6ｍlで中和し析出
するＴＥＡ・ＨＣlをろ去した。ろ液にBoc-Ile-ONB 45.
33ｇを加え一晩撹拌した。溶媒を留去し残留物をCHCl
₃1リットルに溶解し、0.5Ｎ−ＨＣl，５％−ＮａＨＣ
Ｏ_３，水で洗い、無水ＭｇＳＯ_４で乾燥した。溶媒を減
圧留去し、残留物にジエチルエーテルを加え析出物を結
晶としてろ取したのちアセトニトリルとジエチルエーテ
ルで洗い乾燥した。収量 54.95ｇ（84.3％）〔α〕_D ¹⁸−12.0°（ｃ＝0.98, CHCl₃）元素分析：Ｃ₃₅Ｈ₄₈Ｎ₄Ｏ₆としての計算値：Ｃ，67.72；Ｈ，7.79；Ｎ，9.03 実測値：Ｃ，67.72；Ｈ，7.91；Ｎ，8.87 Boc-Asp-(OBzl)-Ile-Ile-Trp-OBzl：Boc-Ile-Ile-Trp-O
Bzl 49.7 ｇを氷冷下に10％−１，２−エタンジチオー
ル含有ＴＦＡ250ｍlに溶解し、室温下に15分間放置し
た。溶媒を留去し、残留物に４Ｎ−ＨＣl−ジオキサン2
0ｍlを加えよくかきまぜたのち、ジエチルエーテルを加
え、析出物をろ取した。これをＤＭＦ 250ｍlに溶解
し、氷冷下にＴＥＡ11.1ｍlで中和したのち、析出する
ＴＥＡ・ＨＣlをろ去した。ろ液にBoc-Asp-(OBzl)-OH 3
1.0ｇ,HONB 20.6ｇ,ＤＣＣ 23.8ｇより調製のBoc-Asp-
(OBzl)-ONB を加え一晩攪拌した。溶媒を減圧留去し、
残留物に酢酸エチル 800ｍlを加え溶解し、10％クエン
酸水、５％−ＮａＨＣＯ_３、水で洗い、無水ＭｇＳＯ_４
で乾燥した。溶媒を減圧留去し、残留物にジエチルエー
テルを加え析出物を結晶としてろ取し、アセトニトリル
から再結晶した。収量 54.0ｇ（81.7％）〔α〕_D ¹⁸−13.7°（ｃ＝1.04, CHCl₃) 元素分析：Ｃ₄₆Ｈ₅₉Ｎ₅Ｏ₉としての計算値：Ｃ，66.89；Ｈ，7.20；Ｎ，8.48 実測値：Ｃ，66.69；Ｈ，7.23；Ｎ，8.31 Boc-Leu-Asp(OBzl)-Ile-Ile-Trp-OBzl：Boc-Asp(OBzl)-
Ile-Ile-Trp-OBzl 48.0ｇを氷冷下に 10％−１，２−エ
タンジチオール含有ＴＦＡ210mlに溶解し、室温下に15
分間放置した。溶媒を留去し、残留物に４Ｎ−ＨＣl−
ジオキサン14.5ｍlを加えよくかきまぜたのち、ジエチ
ルエーテルを加え、析出物をろ取した。これをＤＭＦ 3
00ｍlに溶解し、氷冷下ＴＥＡ42ｍlで中和したのち、析
出するＴＥＡ−ＨＣlをろ去し、ろ液にBoc-Leu-ONB 27.
3ｇを加え、一晩撹拌した。溶媒を減圧留去し、残留物
にCHCl₃ 600ｍlを加えて溶解し、10％−クエン酸水、５
％−ＮａＨＣＯ_３、水で洗い無水ＭｇＳＯ_４で乾燥し
た。残留物に石油エーテルを加え析出物をろ取し、含水
アセトニトリルより再結晶した。収量 53.1ｇ（97.5
％）〔α〕_D ¹⁸−20.6°(c＝1.02, CHCl₃）元素分析：Ｃ₅₂Ｈ₇₀Ｎ₆Ｏ₁₀・1/2Ｈ_２Ｏとしての計算値：Ｃ，65.87；Ｈ，7.55；Ｎ，8.86 実測値：Ｃ，66.08；Ｈ，7.58；Ｎ，8.78 Boc-His-Leu-Asp(OBzl)-Ile-Ile-Trp-OBzl：Boc-Leu-As
p（OBzl)-Ile-Ile-Trp-OBzl 46.5ｇを氷冷下に10％−
１，２−エタンジチオール含有ＴＦＡ220ｍlに溶解し、
室温下15分間放置した。溶媒を減圧留去し、残留物にジ
エチルエーテルを加えろ取した。これをＤＭＦ25ｍlに
溶解し、ＴＥＡ20ｍlを加えよくかきまぜたのち、ジエ
チルエーテル 500ｍlを加え析出物を粉末としてろ取し
た。これをＤＭＦ 200ｍlに溶解し、Boc-His(Tos)-OH 2
2.3ｇ, HONB 11.7ｇ,ＤＣＣ 13.5ｇより調製した Boc-H
is(Tos)-ONB を加え、一晩攪拌した。溶媒を留去し、残
留物にアセトニトリルを加え、粉末をろ取した。収量
45.9ｇ（86.2％）〔α〕_D ¹⁸−16.6°(c＝1.0, ＤＭＦ）元素分析：Ｃ₅₈Ｈ₇₇Ｎ₉Ｏ₁₁・2.5Ｈ_２Ｏとしての計算値：Ｃ，62.13；Ｈ，7.37；Ｎ，11.24 実測値：Ｃ，62.25；Ｈ，7.02；Ｎ，11.03 Boc-Cys(MeBzl)-His-Leu-Asp(OBzl)-Ile-Ile-Trp-OBz
l：Boc-His-Leu-Asp(OBzl)-Ile-Ile-Trp-OBzl 17.2ｇを
氷冷下、10％−１，２−エタンジチオール含有ＴＦＡ88
ｍlに溶解し、室温下15分間放置した。溶媒を減圧留去
し、残留物にエーテルを加え粉末としてろ取したのちＤ
ＭＦ 25mlに溶解した。これにＴＥＡ25ｍlを加えよく撹
拌したのち、エーテル 500ｍlを加え析出物を粉末とし
てろ取した。これをＤＭＦ40ｍlに溶解し、Boc-Cys（Me
Bzl)-OH 5.72ｇ，HONB 3.48ｇ,ＤＣＣ 4.00ｇより調製
した Boc-Cys(MeBzl)-ONB を加え、一晩撹拌した。溶媒
を留去し、残留物にアセトニトリルを加え、析出物を粉
末としてろ取し、さらに熱アセトニトリル中で洗い、室
温に冷却後粉末をろ取した。収量 15.0ｇ（72.9％）〔α〕_D ¹⁸−23.3°(c＝1.02, ＤＭＦ）元素分析：Ｃ₆₉Ｈ₉₀Ｎ₁₀Ｏ₁₂Ｓ・３Ｈ_２Ｏとしての計算値：Ｃ，61.96；Ｈ，7.23；Ｎ，10.47；Ｓ，2.40 実測値：Ｃ，62.24；Ｈ，6.90；Ｎ，10.49；Ｓ，2.53 H-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-OH：Boc-Cys（MeBzl)-
His-Leu-Asp（OBzl)-Ile-Ile-Trp-OBzl 100mｇを氷冷
下、10％−１，２−エタンジチオール含有ＴＦＡ１ｍl
に溶解し、室温下15分間放置後、溶媒を減圧留去した。
残留物にエーテルを加え粉末としてろ取、乾燥したの
ち、ｍ−クレゾール 0.5ｍlと共にＨＦ５ｍlで０℃、１
時間処理した。ＨＦを減圧留去し、残留物にジエチルエ
ーテルを加え、析出物を粉末としてろ過し、水洗した。
これを60％酢酸に溶解し、同溶媒で充填したセファデッ
クスＬＨ−20（2.5×90cm）のカラムに付し160ｍl〜180
ｍlの区分を集め凍結乾燥した。収量 23mg（32.8％）

【００１８】ii）H-Arg-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-OH
(エンドセリン−３Ｃ端部に類似、溶解性大）の合成 Boc-His-Leu-Asp(OBzl)-Ile-Ile-Trp-OBzl 538mgを氷冷
下、20％−１，２−エタンジオチール含有ＴＦＡ５ｍl
に溶解し、室温下15分放置後、pTsOH・H₂O 95mgを加え
溶解したのち、溶媒を減圧留去した。残留物をＤＭＦ
５ｍlに溶解し、氷冷下、10％−ＴＥＡ含有ＤＭＦ 0.75
ｍlを加え中和した。これにBoc-Arg(NO₂)-OH 60mg,HON
B 50mg,WSCD・HCl 50mgを加え一晩撹拌した。溶媒を減
圧留去し、残留物に水を加え沈殿をろ取した。これを乾
燥ののち熱アセトニトリル10ｍlに懸濁し、室温に冷却
後、析出物をろ取した。収量 0.5ｇ（78.3％）このうち 102mgをアニソール 0.2ｍl、１，２−エタン
ジチオール 0.2ｍlと共にＨＦで０℃60分間処理し、Ｈ
Ｆを減圧留去した。残留物をジエチルエーテルで洗った
のち、50％−酢酸６ｍlに溶解し、同じ溶媒で充填した
セファデックスＧ−25（2.5×90cm）のカラムに付し展
開し、100〜137ｍlの区分を集め凍結乾燥した。収量 2
0 mg（26.3％）

【００１９】Ｉ−２免疫原の作製上記Ｉ−１（ｉ）で得られたポリペプタイド Cys His L
eu Asp Ile Ile Trpと牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと
略す）との縮合物を以下に述べるマレイミド架橋法によ
り作製し、免疫原とした。即ち、ＢＳＡ 20mgを 1.4ｍl
の0.1Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ 7.0に溶解させ、Ｎ−（γ
−マレイミドブチリロキシ）サクシニミド（以下ＧＭＢ
Ｓと略す）2.6mgを含むＤＭＦ溶液100μlと混合し、室
温で 40分反応させた。反応後、あらかじめ、2.5ｍＭの
ＥＤＴＡを含む、0.1 Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ 6.5で平衡
化したセファデックスＧ−25カラムで分画した。次にマ
レイミド基の導入されたＢＳＡ 5.4 mgを含む該溶出画
分 1.2 ｍlと、90％ジメチルスルホキシドを含む水溶液
1.2 ｍlに溶解あるいは分散させたポリペプチド Cys H
is Leu Asp Ile Ile Trp 1.8mgとを４℃で３日間反応さ
せた。反応後、生理食塩水に対し、４℃、２日間透析し
た。

【００２０】Ｉ−３免疫上記Ｉ−２で得た免疫原600μgを含む生理食塩水450μl
に550μlの完全フロイントアジュバント(Freund comple
te adjuvant)を加えてよく混和し乳剤を作成し、ウサギ
の皮下約20ヶ所に接種した。６週間後に、不完全フロイ
ントアジュバントを用い、同様の操作で乳剤を作りウサ
ギの皮下に接種した。この操作を以後１ヶ月おきに４回
行ない、追加免疫の７日後、ウサギから血液を部分採取
し常法により抗血清を得た。

【００２１】Ｉ−４アフィニティ固相の作製ポリペプタイド Arg His Leu Asp Ile Ile Trpを直接Ｃ
ＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに結合させ、アフィニテ
ィ固相とした。即ち、Arg His Leu Asp Ile Ile Trp 1.
5 mgを10ｍlの0.5Ｍ食塩を含む0.1Ｍ炭酸水素ナトリウ
ムに溶解させ、１ｇのＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ
と室温３時間反応させた。次に、未反応の活性基を 0.1
Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８で処理したのち、ＰＢＳ
に分散させ、４℃で保存した。

【００２２】Ｉ−５アフィニティ固相による抗エンド
セリン−３Ｃ端ペプタイド抗体の精製上記Ｉ−３記載ウサギ抗血清16mlから、硫安塩析法によ
り抗体を部分精製した。すなわち、抗血清10ｍlにＰＢ
Ｓ10ｍlを加え、さらに16.5ｍlの飽和硫安を徐々に撹拌
しながら加えた（最終45％）。30分間放置したのち、1
2,000×ｇで20分間遠心し、沈殿をＰＢＳ 10ｍlに溶解
させた。次に、同様に飽和硫安を最終30％飽和になるよ
うに加えたのち遠心した。沈殿を、0.15Ｍ食塩を含む0.
01Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８（以下ＢＢＳと略す），10ｍ
lに溶解させたのち0.01Ｍ食塩を含む0.01Ｍリン酸緩衝
液ｐＨ８（緩衝液Ｂ）に対し、４℃，２日間透析した。
抗体画分をＢＢＳに透析した後、上記Ｉ−４記載のアフ
ィニティ固相を充填したカラム（10mmφ×40mm)に付し
た。ＢＢＳで十分に洗浄したのち特異抗体を、0.5Ｍ食
塩を含む 0.1Ｍ酢酸緩衡液、pＨ 4.5で溶出し、さらに
0.1Ｍ食塩を含む 0.05Ｍグリシン−塩酸緩衡液、pＨ2.0
で溶出した。溶出液は中和したのち、ＢＢＳに対し透析
した。特異抗体はｐＨ２で溶出した画分に認められ、該
画分から18mgの特異抗体が得られた。

【００２３】Ｉ−６西洋ワサビパーオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）標識化抗エンドセリン−３Ｃ端ペプタイド抗体
の作製上記Ｉ−５記載のアフィニティ精製抗Ｃys Ｈis Ｌeu
Ａsp Ile Ile Ｔrp抗体より石川らの方法〔ジャーナル
オブアプライドバイオケミストリィー（J. Appl. Bio
chem).,6：56−63(1984)〕に従ってＦab'-ＨＲＰ標識体
を作製した。即ち、0.1Ｍ酢酸緩衡液、ｐＨ4.5に溶解し
た特異抗体 6.4mg にペプシン（シグマ社、２回結晶）1
60μgを加え、37℃、16 時間反応させたのち、ＢＢＳで
平衡化したスーパーロース12カラムを用いるＦＰＬＣ
（ファルマシア社製）でＦ(ab')2画分を精製した。該画
分を 0.1Ｍ酢酸緩衡液、ｐＨ５で透析したのち、最終20
mＭのβ−メルカプトエチルアミンを加え、37℃で90分
放置した。反応液を 2.5mＭＥＤＴＡを含む 0.1Ｍリン
酸緩衡液、ｐＨ 6.0で平衡化したスーパーロース12カラ
ムを用いるＦＰＬＣで分離し、Ｆab'画分を得た。一
方、西洋ワサビペルオキシダーゼ５mgを 0.9mlの0.1Ｍ
リン酸緩衡液、ｐＨ７に溶解させ、50μlのＤＭＦに溶
解させたＧＭＢＳ 1.05 mgを加えて室温 40分反応させ
た。反応液をセファデックスＧ−25カラム（溶離液0.1
Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ6.8）で分離し、得られたマレイ
ミド化ペルオキシダーゼ 3.5 mgと上記Ｆab′画分 0.8m
gとを混合し、コロジオンパック(エムエス機器社）で約
0.3ｍlにまで濃縮したのち、４℃で 16時間放置した。
反応液を溶離液に0.1Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ6.5を用いる
ウルトロゲルＡｃＡ44カラム(10mmφ×40mm)に供し、Ｆ
ab′−ペルオキシダーゼ複合体画分を精製した。

【００２４】II．モノクローナル抗エンドセリン−３抗
体の作製 II−１免疫原の作製エンドセリン−３と牛チログロブリン（ＴＧ）とを以下
に述べるマレイミド架橋法により縮合させ、免疫原とし
た。即ち、エンドセリン−３（ペプチド研究所より購
入）265ｎmoleを450μlの0.1Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．
０（10％のＤＭＦを含む）に溶解させ、ＧＭＢＳ６．
６μmoleを含むＤＭＦ溶液50μlと混合し、室温で30分
反応させた。一方、ＴＧ 20mg（40 ｎmole）を0.15Ｍ食
塩を含む 0.02Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ 6.8、1.4ｍlに溶
解させ、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（以下ＳＰＤＰと略す）2.5mg（8.0
μmole）を含むＤＭＦ溶液100μlを混合したのち室温4
0分間反応させた。反応後、ジチオスレイトール 12.4mg
（80 μmole）を含む0.1Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ 4.5、0.5
ｍlを加え、室温20分反応させたのち、セファデックス
Ｇ−25カラムで分画を行ない、ＳＨ基の導入されたＴＧ
12mg（24 ｎmole）を得た。次にマレイミド基導入エン
ドセリン−３ 190ｎmoleと、ＳＨ基導入ＴＧ 5.9ｎmole
とを混合し、４℃で２日間反応させたのち、生理食塩
水に対し、４℃、２日間透析した。

【００２５】II−２免疫６〜８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスに上記II−１記載の
免疫原100 μg／匹をアジュバントとともに皮下免疫し
た。以後３週間おきに２〜３回追加免疫を実施した。

【００２６】II−３ＨＲＰ標識化エンドセリン−３の
作製エンドセリン−３ 80 nmoleを450μlの0.1Ｍリン酸緩衝
液、ｐＨ 7.0に溶解させ、ＧＭＢＳ 295μg（2.0μmol
e）を含むＤＭＦ溶液 50μlと混合し、室温で３０分反
応させた。反応後、セファデックスＧ−１５カラムで分
画を行ないマレイミド基の導入されたポリペプチド60 n
moleを得た。一方、ＨＲＰ 10mg（250ｎmole）を0.15Ｍ
食塩を含む0.02Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ 6.8、1.4ｍlに溶
解させ、ＳＰＤＰ 1.17mg(3.75μmole）を含むＤＭＦ溶
液100μlを混合したのち室温40分間反応させた。反応
後、ジチオスレイトール12.4mg（80μmole）を含む 0.1
Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ4.5、0.5ｍlを加え、室温20分反応
させたのち、セファデックスＧ−25カラムで分画を行な
い、ＳＨ基の導入された酵素６mg（150 ｎmole）を得
た。次に、マレイミド基導入エンドセリン−３ 50ｎmol
eとＳＨ基導入ペルオキシダーゼ20ｎmole とを混合し、
４℃、16時間反応させた。反応後、ウルトロゲルＡｃＡ
44（ＬＫＢ−ファルマシア社製）カラムで分画し、ペル
オキシダーゼ標識化エンドセリン−３を得た。

【００２７】II−４細胞融合比較的高い抗体価を示したマウスに対して240μgの免疫
原を生理食塩水 0.25mlに溶解させたものを静脈内に接
種することにより最終免疫を行なった。最終免疫３日後
のマウスから脾臓を摘出し、ステンレスメツシュで圧
迫、ろ過し、イーグルズ・ミニマム・エツセンシヤルメ
デイウム（ＭＥＭ）に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液を得
た。細胞融合に用いる細胞として、ＢＡＬＢ／Ｃマウス
由来ミエローマ細胞Ｐ３−× 63.Ａg８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ
１）を用いた〔カレントトピツクスインマイクロバイ
オロジーアンドイムノロジー、81、１（1978)〕。細
胞融合は、原法〔ネイチャー、256、495(1975)〕に準じ
て行なった。即ち、脾臓細胞およびＰ３Ｕ１をそれぞれ
血清を含有しないＭＥＭで３度洗浄し、脾臓細胞とＰ３
Ｕ１数の比率を５：１になるよう混合して、800 回転で
15分間遠心を行なって細胞を沈殿させた。上清を充分に
除去した後、沈殿を軽くほぐし、45％ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）6000（コッホライト社製）を0.3ml加
え、37℃温水槽中で７分間静置して融合を行なった。融
合後細胞に毎分２ｍlの割合でＭＥＭを添加し、合計12m
lのＭＥＭを加えた後 600回転15分間遠心して上清を除
去した。この細胞沈殿物を10％牛胎児血清を含有するＧ
ＩＴメデイウム(和光純薬）（ＧＩＴ−１０ＦＣＳ）に
Ｐ３Ｕ１が１ｍl当り２× 10⁶個になるように浮遊し、2
4穴マルチデイシユ(リンブロ社製)に１ウェル１ｍlずつ
120ウェルに播種した。播種後、細胞を 37℃で５％炭
酸ガスフラン器中培養した。24時間後ＨＡＴ（ヒポキサ
ンチン１×10^-4Ｍ、アミノブリテリン４×10^-7Ｍ、チミ
ジン 1.6×10^-3Ｍ）を含んだＧＩＴ−10ＦＣＳ培地（Ｈ
ＡＴ培地）を１ウェル当り１mlずつ添加することによ
り、ＨＡＴ選択培養を開始した。ＨＡＴ選択培養は、培
養開始３、６、９日後に旧液を１ml捨てたあと、１mlの
ＨＡＴ培地を添加することにより継続した。ハイブリド
ーマの増殖は、細胞融合後９〜14日で認められ、培養液
が黄変したとき(約１×10⁶セル／ｍl)、上清を採取し、
後述するＥＩＡ法で、抗体価を測定した。

【００２８】II−５ハイブリドーマのスクリーニングハイブリドーマ培養上清中の抗体価を以下の２種の方法
により測定した。いずれの方法にも抗マウスイムノグロ
ブリン抗体結合マイクロプレートを用いた。該プレート
は、まず抗マウスイムノグロブリン抗体（ＩｇＧ画分、
カッペル社製）を 20μg／ml含む 0.1Ｍ炭酸緩衝液、ｐ
Ｈ 9.6溶液を 96ウェルマイクロプレートに 100μlずつ
分注し、４℃で 24 時間放置した。次に、プレートをＰ
ＢＳで洗浄したのち、ウェルの余剰の結合部位をふさぐ
ため25％ブロックエース（雪印乳業社製）を含むＰＢＳ
を300μlずつ分注し、少なくとも４℃で 24時間処理し
た。ｉ）ＨＲＰ標識化エンドセリン−３を用いるＥＩＡ法抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに
バッファーＥ(10％ブロックエース、２mg／ｍl ＢＳ
Ａ、0.4ＭＮａＣl、２ｍＭＥＤＴＡおよび0.1％Ｎａ
Ｎ₃を含む0.02Ｍリン酸緩衝液、pH7.0）50μlおよびハ
イブリドーマ培養上清50μlを加え、室温４時間反応さ
せた。反応後、ＰＢＳで洗浄したのち、上記II−３で作
製したＨＲＰ標識化エンドセリン−３〔１％ＢＳＡを含
む0.02Ｍリン酸緩衝液、pH７（バッファーＡ）で100倍
希釈〕100μlを加え、４℃で16時間反応させた。反応後
ＰＢＳで洗浄したのち、固相上の酵素活性を測定するた
め 0.2％オルソフェニレンジアミン、0.02％過酸化水素
を含む 0.1Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ5.5を100μlずつ分
注し、室温で10分間反応させた。４規定硫酸 100μlを
加え、反応を停止させたのち 492ｎｍの吸収をプレート
リーダー（ＭＴＰ−32,コロナ社製)で測定した。このよ
うにして、ハイブリドーマの増殖が認められた全120ウ
ェルの上清を調べたところ、Ｎｏ．５およびＮｏ．93の
ウェルに強い抗体価が検出された。 ii）ＨＲＰ標識化エンドセリン−３Ｃ端ペプチド抗体
を用いるＥＩＡ法抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに
バッファーＥ50μl、ハイブリドーマ培養上清50μl、お
よび６ｎｇ／ｍlのエンドセリン−３を含むバッファー
Ｅ溶液50μlを加え、室温で４時間反応させた。プレー
トをＰＢＳで洗浄したのち、上記Ｉ−６で作製したＨＲ
Ｐ標識化エンドセリン−３Ｃ端ペプチド抗体〔バッフ
ァーＣ（１％ＢＳＡ、0.4ＭＮａＣl、２ｍＭＥＤＴＡ
を含む0.02Ｍリン酸緩衝液、pH7.2）で300倍に希釈〕10
0μlを加え、４℃で16時間反応させた。次に、プレート
をＰＢＳで洗浄したのち、固相上の酵素活性を上記II−
５（ｉ）記載の方法により測定した。このようにして、
ハイブリドーマの増殖が認められた全120ウェルの上清
を調べたところ、Ｎｏ．93のウェルに強い抗体価が検出
された。

【００２９】II−６クローニング抗体活性が陽性を示したＮｏ．５およびＮｏ．93のウェ
ルの各ハイブリドーマを限界希釈法によるクローニング
に付した。即ちハイブリドーマが 1.5個／mlになるよう
ＲＰＭＩ1640−20ＦＣＳに浮遊させ、96穴マイクロプレ
ート(ヌンク社製)に１ウェル当り 0.2ｍlずつ分注し
た。分注する際、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマ
ウスの胸腺細胞をウェル当り５× 10⁵個になるように加
えた。約１週間後には細胞の増殖が認められるようにな
り、上清中の抗体価を上記II−５記載のＥＩＡ法により
調べたところ、Ｎo.５ハイブリドーマでは 41クローン
中８クローンが、またＮｏ.93のハイブリドーマでは41
クローン中７クローンが抗体を産生していた。これらの
クローンのうち、Ｎｏ.93−18 より得られたクローンＡ
ＥＴ-30およびその産生するモノクローナル抗体ＡＥＴ-
30ａに注目し、以下の実験を実施した。

【００３０】II−７大量のモノクローナル抗体の調製ミネラルオイル 0.5mlを腹腔内投与されたマウス、ある
いは未処置マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）にハイブリドーマＡ
ＥＴ−30 １〜３×10⁶セル／匹を腹腔内注射したのち、
10〜30日後に抗体含有腹水を採取した。

【００３１】II−８モノクローナル抗体の精製上記II−７調製腹水よりプロテイン−Ａカラムによりモ
ノクローナル抗体を精製した。即ち腹水８mlを等量の結
合緩衡液（3.5ＭＮａＣl、0.05％ＮａＮ₃を含む1.5Ｍ
グリシン、ｐＨ9.0）で希釈したのち、あらかじめ結合
緩衡液で平衡化したプロテイン−Ａ−セファロース（フ
ァルマシア製）カラムに供し、特異抗体を溶離緩衡液
（0.05％ＮａＮ₃を含む0.1Ｍクエン酸緩衡液、ｐＨ3.
0）で溶出した。以上の操作により、40mgの特異抗体を
得た。

【００３２】II−９モノクローナル抗体のクラス・サ
ブクラスの決定上記II−８精製モノクローナル抗体を１μg／ｍl含む0.
1Ｍ炭酸緩衡液、pＨ9.6 溶液を96ウェルマイクロプレー
トに 100μlずつ分注し、４℃で24時間放置した。上記I
I−５で述べた方法に従って、ウェルの余剰の結合部位
をブロックエースでふさいだのち、アイソタイプタイピ
ングキット（ Mouse-Typer^TM Sub-Isotyping Kit バイ
オラッド社製）を用いるエンサイム−リンクトイムノソ
ーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってクラス、サブ
クラスを調べた。その結果ＡＥＴ−30ａはＩgＧ１、κ
クラスに属することが分かった。

【００３３】III．競合法−ＥＩＡ上記II−５記載の抗マウスイムノグロブリン抗体結合マ
イクロプレートに、バッファーＣで75倍に希釈したＡＥ
Ｔ−30含有培養上清50μl、およびエンドセリン−１標
準液50μlあるいはエンドセリン−３標準液50μlを加
え、室温で１時間反応させたのち、上記II−３記載ＨＲ
Ｐ標識化エンドセリン−３（バッファーＡで100倍希釈)
を加え、４℃で16時間反応させた。反応後、ＰＢＳで洗
浄したのち固相上の酵素活性をII−５（ｉ）記載の方法
により測定した。結果を図１に示す。図中、−●−がエ
ンドセリン−３の標準曲線を、また−○−がエンドセリ
ン−１の標準曲線を示す。図１の結果から、ＡＥＴ−30
ａがエンドセリン−３と反応し、エンドセリン−１と反
応しないことが分った。

【００３４】IV．サンドイッチ法−ＥＩＡ精製したモノクローナル抗体ＡＥＴ−30ａ 20μg／ｍｌ
を含む 0.1Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ 9.6溶液を 96ウェルマ
イクロプレートに100μｌずつ分注し、４℃で24時間放
置した。ウェルの余剰の結合部位をＰＢＳで４倍希釈し
たブロックエース（雪印乳業社製、大日本製薬社販売
）300μｌを加え不活化した。以上のように調製したプ
レートにバッファーＥで希釈したエンドセリン−３、エ
ンドセリン−１、エンドセリン−２(ヒト)、ビッグエン
ドセリン−１(ヒト)、ビッグエンドセリン−１(ブタ)お
よびビッグエンドセリン−３(22−42)(ヒト)標準液100
μｌを加え、４℃で24時間反応させた。ＰＢＳで洗浄し
たのち、上記Ｉ−６で作製したＨＲＰ標識化エンドセリ
ン−３Ｃ端ペプタイド抗体(バッファーＣで300倍希釈)
100μｌを加え、４℃で24時間反応させた。ＰＢＳで洗
浄したのち、上記II−５(i)記載の方法により固相上の
酵素活性を測定した。結果を図２に示す。図中、−●−
がエンドセリン−３の、また−▲−がエンドセリン−１
の、−■−がエンドセリン−２(ヒト)の、−○−がビッ
グエンドセリン−１(ヒト)の、−△−がビッグエンドセ
リン−１(ブタ)、および−□−がビッグエンドセリン−
３(ヒト)の標準曲線を示す。図２の結果から、この測定
法がエンドセリン−３に特異的であり、エンドセリン−
３４×１０^-17モル／ウェルを、他のエンドセリンとは
ほとんど反応することなく（交差反応性、０．１％以
下）、検出し得ることが分った。

【００３５】Ｖ．モノクローナル抗ビッグエンドセリン
−３Ｃ端ペプタイド抗体の作製Ｖ−１．ペプタイドの合成 (1)ビッグエンドセリン−３(big ET-3)(22-42);H-Ile-A
sn-Thr-Pro-Glu-Gln-Thr-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Ser-Asn
-Tyr-Arg-Gly-Ser-Phe-Arg-Gly-OHの合成市販の Boc-Gly-OCH2-PAM樹脂 (アプライドバイオシ
ステムズ社製) 0.77g(0.5 n mole)を用い、ペプチド合
成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル430A)
を使用し、合成した。樹脂上のBoc基を50％トリフルオ
ロ酢酸/塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離させた
後、このアミノ基に、Boc-Arg(Tos), Boc-Phe, Boc-Ser
(Bzl), Boc-Gly, Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Asn, Boc-Leu, B
oc-Pro, Boc-Val, Boc-Thr(Bzl), Boc-Gln,Boc-Glu(OBz
l), Boc-Ileをbig ET-3(22-42)のアミノ酸配列通り順に
HOBt/DCCで活性化し縮合した。さらにDCCまたは、HOBt/
DCCで活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした
後、未反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護
された big ET-3(22-42)-OCH2-PAM樹脂0.88gを得た。
この樹脂0.35gをｐ−クレゾール0.70g共存下無水フッ化
水素５mlで０℃, 60分間処理した後、フッ化水素を減圧
留去し、残渣をエチルエーテル５mlで２回洗浄した後、
残渣を50％-酢酸水５mlで抽出した。不溶物を濾去し、5
0％-酢酸水５mlで洗浄した。濾液、洗液を合し、２〜３
mlに減圧濃縮し、セファデックスＬＨ−２０(2×90cm)
のカラムに付し、50％-酢酸で溶出した。主要画分を集
め濃縮し0.1％トリフルオロ酢酸水100mlに溶解し、ＹＭ
Ｃ−ＯＤＳＡＭ１２０Ｓ−５０樹脂カラム（2.6×7
cm）に付け、0.1％トリフルオロ酢酸水と50％アセトニ
トリル（0.1％トリフルオロ酢酸含有) の間での直線型
濃度勾配で溶出した。主要画分を合し、凍結乾燥し、白
色粉末76mgを得た。アミノ酸分析値 Asp 1.97(2), Thr 1.76(2), Ser 1.68(2), Glu 2.04
(2), Gly 3.00(3), Val 1.00(1), Pro 1.90(2),Ile 0.9
5(1), Leu 0.99(1), Tyr 0.95(1), Phe 1.02(1), Arg
2.27(2) 質量分析による (Ｍ＋Ｈ)⁺ 2356.16 ＨＰＬＣ溶出時間１７．０１分カラム条件カラム: ＹＭＣ−ＯＤＳ（AM-301,S-5 120A) 溶離液: Ａ液（0.1％-トリフルオロ酢酸水) Ｂ液（0.1％-トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル）を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出(50分) 流速
: 1.0ml/分

【００３６】(2) big ET-3(1-42);H-Cys-Thr-Cys-Phe-T
hr-Tyr-Lys-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-Tyr-Cys-His-Leu
-Asp-IleOIle-Trp-Ile-Asn-Thr-Pro-Glu-Gln-Thr-Val-P
ro-Tyr-Gly-Leu-Ser-Asn-Tyr-Arg-Gly-Ser-Phe-Arg-Gly
-OHの合成市販の Boc-Gly-OCH₂-PAM樹脂 (アプライドバイオシ
ステムズ社製) 0.78g(0.5 n mole)を用い、ペプチド合
成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル430A)
を使用し、合成した。樹脂上のBoc基を50％トリフルオ
ロ酢酸/塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離させた
後、このアミノ基に、Boc-Arg(Tos), Boc-Phe, Boc-Ser
(Bzl), Boc-Gly, Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Asn, Boc-Leu, B
oc-Pro, Boc-Val, Boc-Thr(Bzl), Boc-Gln,Boc-Glu(OBz
l), Boc-Ile, Boc-Trp(CHO),Boc-Asp(0Bzl), Boc-His(D
NP), Boc-Cys(MeBzl),Boc-Lys(Cl-Z)をbig ET-3(1-42)
のアミノ酸配列通り順にHOBt/DCCで活性化し縮合した。
さらにDCCまたは、HOBt/DCCで活性化した同じアミノ酸
誘導体で再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水酢
酸でアセチル化し、保護されたbig-ET-3(1-42)-OCH₂-PA
M 樹脂を得た。これをN,N'-ジメチルホルムアミド20ml
に懸濁し、チオフェノール２mlを加え、室温で２時間ゆ
るやかに攪拌した後グラスフィルター上に樹脂を濾過
し、N,N'-ジメチルホルムアミドとジクロロメタンで洗
浄の後乾燥し1.00gの樹脂を得た。この樹脂0.39gをｐ−
クレゾール0.74g, １, ４−ブタンジチオール1.0ml共存
下無水フッ化水素10mlで０℃, 60分間処理した後、フッ
化水素を減圧留去し、残渣をエチルエーテル５mlで２回
洗浄した後、残渣をトリフルオロ酢酸４mlで抽出した。
不溶物を濾去し、トリフルオロ酢酸２mlで２回洗浄し
た。これを4M-ウレア水溶液750mlにそそぎ、氷冷下にpH
8.25に調節し、緩やかに空気を吹き込みながら一晩攪拌
した。Ellmanテストが陰性になったことを確認した後、
全溶液をＹＭＣ−ＯＤＳＡＭ１２０Ｓ−５０樹脂カ
ラム（2.6×7cm）に付け、0.1％トリフルオロ酢酸水と5
0％アセトニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸含有）の間
での直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合し、凍結
乾燥し、白色粉末16mgを得た。同じカラムを用い、20-5
0％のあいだでの直線型濃度勾配の溶出で再クロマト精
製し目的物6.3mgを得た。アミノ酸分析値 Asp 3.84(4), Thr 3.31(4), Ser 2.02(2), Glu 3.04
(3), Pro 2.22(2), Gly 3.31(3), Cys 1.20(2),Val 1.7
7(2), Ile 1.83(3), Leu 2.00(2), Tyr 4.64(5), Phe
1.92(2), Lys 1.78(2), His 0.88(1),Arg 2.12(2) 質量分析による (Ｍ＋Ｈ）⁺ 4979.48 ＨＰＬＣ溶出時間２１．００分カラム条件カラム: ＹＭＣ−ＯＤＳ（AM-301,S-5 120A) 溶離液: Ａ液（0.1％-トリフルオロ酢酸水) Ｂ液（0.1％-トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル) を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出(50分) 流速
: 1.0ml/分

【００３７】(3) big ET-3(22-41)-NH₂;H-Ile-Asn-Thr-
Pro-Glu-Gln-Thr-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Ser-Asn-Tyr-Ar
g-Gly-Ser-Phe-Arg-NH₂の合成市販のｐ−メチルBHA樹脂（アプライドバイオシス
テムズ社製）0.60ｇ(0.5 n mole) を用い、ペプチド合
成機 (アプライドバイオシステムズ社製モデル430A)
を使用し、合成した。樹脂にBoc-Arg(Tos) をHOBt/DCC
で導入した後、樹脂上のBoc基を50％トリフルオロ酢酸/
塩化メチレンで処理し、アミノ基を遊離させた。このア
ミノ基に、Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Gly, Boc-Ar
g('Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Asn, Boc-Leu, Boc-Pro,
Boc-Val, Boc-Thr(Bzl), Boc-Gln, Boc-Glu(OBzl), Bo
c-Ileをbig ET-3(22-41)-NH₂のアミノ酸配列通り順にHO
Bt/DCCで活性化し縮合した。さらにDCCまたは、HOBt/DC
Cで活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした
後、未反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護
されたbig ET-3(22-41)-BHA樹脂1.96gを得た。この樹脂
0.23gをｐ−クレゾール0.40g共存下無水フッ化水素５ml
で０℃，60分間処理した後、フッ化水素を減圧留去し、
残渣をエチルエーテル５mlで２回洗浄した後、残渣を50
％-酢酸水５mlで抽出した。不溶物を濾去し、50％-酢酸
水５mlで洗浄した。濾液、洗液を合し、２〜３mlに減圧
濃縮し、セファデックスＬＨ−２０（2×90cm) のカラ
ムに付し、50％-酢酸で溶出した。主要画分を集め濃縮
し0.1％トリフルオロ酢酸水100mlに溶解し、ＹＭＣ−Ｏ
ＤＳＡＭ１２０Ｓ−５０樹脂カラム（2.6×7cm）に
付け、0.1％トリフルオロ酢酸水と50％アセトニトリル
（0.1％トリフルオロ酢酸含有) の間での直線型濃度勾
配で溶出した。主要画分を合し、凍結乾燥し、白色粉末
56mgを得た。アミノ酸分析値 Asp 1.97(2), Thr 1.88(2), Ser 1.75(2), Glu 2.05
(2), Gly 3.00(3), Val 1.00(1), Pro 1.93(2),Ile 0.9
5(1), Leu 0.98(1), Tyr 0.95(1), Phe 1.02(1), Arg
2.18(2) 質量分析による (Ｍ＋Ｈ）⁺ 2298.19 ＨＰＬＣ溶出時間１７．０１分カラム条件カラム: ＹＭＣ−ＯＤＳ（AM-301,S-5 120A) 溶離液: Ａ液（0.1％-トリフルオロ酢酸水) Ｂ液（0.1％-トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル）を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出(50分) 流速
: 1.0ml/分

【００３８】(4) big ET-3(1-41)-NH₂;H-Cys-Thr-Cys-
Phe-Thr-Tyr-Lys-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-Tyr-Cys-Hi
s-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-Ile-Asn-Thr-Pro-Glu-Gln-Thr-
Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Ser-Asn-Tyr-Arg-Gly-Ser-Phe-Ar
g-NH₂の合成市販のｐ−メチルBHA樹脂 (アプライドバイオシステ
ムズ社製) 0.60g（0.5n mole) を用い、ペプチド合成機
（アプライドバイオシステムズ社製モデル430A) を使
用し、合成した。樹脂にBoc-Arg(Tos）をHOBt/DCCで導
入した後、樹脂上のBoc基を50％トリフルオロ酢酸/塩化
メチレンで処理し、アミノ基を遊離させた後、このアミ
ノ基に、Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Gly, Boc-Arg(To
s), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Asn，Boc-Leu, Boc-Pro, Boc-
Val, Boc-Thr(Bzl), Boc-Gln, Boc-Glu(OBzl), Boc-Il
e, Boc-Trp(CHO), Boc-Asp(0Bzl), Boc-His(DNP), Boc-
Cys(MeBzl), Boc-Lys(Cl-Z)をbig ET-3(1-41)-NH₂のア
ミノ酸配列通り順にHOBt/DCCで活性化し縮合した。さら
にDCCまたは、HOBt/DCCで活性化した同じアミノ酸誘導
体で再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸で
アセチル化し、保護されたbig-ET-3(1-41)-BHA樹脂を得
た。これをN,N'-ジメチルホルムアミド20mlに懸濁し、
チオフェノール２mlを加え、室温で２時間ゆるやかに撹
拌した後グラスフィルター上に樹脂を濾過し、N,N'-ジ
メチルホルムアミドとジクロロメタンで洗浄の後乾燥し
1.34gの樹脂を得た。この樹脂0.74gをｐ−クレゾール1.
0g, １, ４−ブタンジチオール1.0ml共存下無水フッ化
水素10mlで０℃，60分間処理した後、フッ化水素を減圧
留去し、残渣をエチルエーテル５mlで２回洗浄した後、
残渣をトリフルオロ酢酸６mlで抽出した。不溶物を濾去
し、トリフルオロ酢酸２mlで２回洗浄した。これを4M-
ウレア水溶液1000mlにそそぎ、氷冷下にpH8.0に調節
し、緩やかに空気を吹き込みながら一晩撹拌した。Ellm
anテストが陰性になったことを確認した後、全溶液をＹ
ＭＣ−ＯＤＳＡＭ１２０Ｓ−５０樹脂カラム（2.6
×7cm）に付け、0.1％トリフルオロ酢酸水と50％アセト
ニトリル（0.1％トリフルオロ酢酸含有）の間での直線
型濃度勾配で溶出した。主要画分を合し、凍結乾燥し、
白色粉末35mgを得た。同じカラムを用い、20-50％のあ
いだでの直線型濃度勾配の溶出で再クロマト精製を繰り
返し、目的物9.5mgを得た。アミノ酸分析値 Asp 3.89(4), Thr 3.81(4), Ser 1.98(2), Glu 3.04
(3), Pro 2.09(2), Gly 3.30(3), Cys 1.60(2),Val 1.7
9(2), Ile 1.83(3), Leu 2.00(2), Tyr 4.72(5), Phe
1.92(2), Lys 1.88(2), His 0.91(1),Arg 2.20(2) 質量分析による (Ｍ＋Ｈ）⁺ 4921.31 ＨＰＬＣ溶出時間２１．００分カラム条件カラム: ＹＭＣ−ＯＤＳ（AM-301,S-5 120A) 溶離液: Ａ液（0.1％-トリフルオロ酢酸水) Ｂ液（0.1％-トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル) を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出(50分) 流速
: 1.0ml/分

【００３９】Ｖ−２．免疫原の作製上記Ｖ−１で得られたビッグエンドセリン−３Ｃ末端
ペプタイド Ile-Asn-Thr-Pro-Glu-Gln-Thr-Val-Pro-Tyr
-Gly-Leu-Ser-Asn-Tyr-Arg-Gly-Ser-Phe-Arg-Gly と牛
チログロブリン（ＴＧ）とを以下に述べるマレイミド架
橋法により縮合させ、免疫原とした。即ち、ポリペプタ
イド1.28μmoleを350μlの0.1Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ7.0
（10％のＤＭＦを含む）に溶解させ、ＧＭＢＳ 25.6μm
oleを含むＤＭＦ溶液100μlと混合し、室温で30分反応
させた。一方、ＴＧ30mg(60ｎmole)を0.15Ｍ食塩を含む
0.02Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ6.8、1.4ｍｌに溶解させ、Ｓ
ＰＤＰ3.7mg(12.0μmole）を含むＤＭＦ溶液を混合した
のち室温40分間反応させた。反応後、ジチオスレイトー
ル18.6mg(120μmole）を含む0.1Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ4.
5、0.5ｍｌを加え、室温20分反応させた後、セファデッ
クスＧ−２５カラムで分画を行ない、ＳＨ基の導入され
たＴＧ18mg(36 n mole) を得た。次にマレイミド基導入
ポリペプタイド920 n moleと、SH基導入TG29 n moleと
を混合し、４℃で２日間反応させたのち、生理食塩水に
対し、４℃、２日間透析した。

【００４０】Ｖ−３．免疫６〜８週令のBALB/ｃ雌マウスに上記Ｖ−２記載の免疫
原15μg/匹（ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプタイドと
して）をアジュバントとともに皮下免疫した。以後３週
間おきに２回追加免疫を実施した。

【００４１】Ｖ−４．ＨＲＰ標識化ビッグエンドセリン
−３Ｃ端ペプタイドの作製ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプタイド330 n mole を5
00μlの0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0に溶解させ、ＧＭＢＳ
2.78mg（9.9 μ mole)を含むＤＭＦ溶液50μlと混合
し、室温で60分反応させた。反応後、セファデックスＧ
−25カラムで分画を行ないマレイミド基の導入されたポ
リペプチド200 n moleを得た。一方、ＨＲＰ10mg(250 n
mole)を用いて、II−３記載の方法によりＳＨ基の導入
された酵素６mg(150 n mole)を得た。次に、マレイミド
基導入ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプチド200 n mole
とＳＨ基導入ペルオキシダーゼ50 n moleとを混合し、
４℃、16時間反応させた。反応後、ウルトロゲルAcA44
(ＬＫＢ−ファルマシア社製)カラムで分画し、ペルオキ
シダーゼ標識化ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプチドを
得た。

【００４２】Ｖ−５．細胞融合Ｖ−３記載の、ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプチドを
免疫中のマウスを用いて、II−４記載の方法により細胞
融合を実施し、ハイブリドーマを得た。

【００４３】Ｖ−６．ハイブリドーマのスクリーニングハイブリドーマ培養上清中の抗体価を以下の２種の方法
により測定した。すなわち、抗マウスイムノグロブリン
抗体又はビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプタイド結合マ
イクロプレートを用いた。該プレートは、まず抗マウス
イムノグロブリン抗体（IgG 画分、カッペル社製) 又は
ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプタイドを20μg/ml含む
0.1M炭酸緩衝液、pH9.6溶液を96ウェルマイクロプレー
トに100μlずつ分注し、４℃で24時間放置した。次にプ
レートをＰＢＳで洗浄したのち、ウェルの余剰の結合部
位をふさぐため25％ブロックエース（雪印乳業社製）を
含むＰＢＳを300μlずつ分注し、少なくとも４℃で24時
間処理した。ｉ）ＨＲＰ標識化ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプタイ
ドを用いるＥＩＡ法抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに
バッファーＥ（10％ブロックエース、２mg/ml ＢＳ
Ａ、0.4M NaCl、２mM ＥＤＴＡおよび0.1％NaN₃を含む
0.02Mリン酸緩衝液、pH7.0)50μlおよびハイブリドーマ
培養上清50μlを加え、室温４時間反応させた。反応
後、上記Ｖ−４で作製したＨＲＰ標識化ビッグエンドセ
リン−３Ｃ端ペプタイド［バッファーＣで400倍希釈］1
00μlを加え、４℃で16時間反応させた。反応後ＰＢＳ
で洗浄したのち、固相上の酵素活性をII−５（ｉ）に記
載の方法により測定した。このようにして、ハイブリド
ーマの増殖が認められた全120ウェルの上清を調べたと
ころ、No.44およびNo.77のウェルに強い抗体価が検出さ
れた。 ii）ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプチド結合マイク
ロプレートを用いるＥＬＩＳＡ法ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプタイド結合マイクロ
プレートにバッファ−Ｅ50μl、ハイブリドーマ上清100
μlを加え、室温４時間反応させた。反応後ＰＢＳで洗
浄したのち、ＨＲＰ標識抗マウスイムノグロブリン抗体
［バッファーＣで10000倍希釈] 100μlを加え、４℃で1
6時間反応させた。次に、プレートをＰＢＳで洗浄した
のち、固相上の酵素活性を上記Ｖ−６（i）記載の方法
により測定した。このようにして、ハイブリドーマの増
殖が認められた全120ウェルの上清を調べたところ、No.
77のウェルに強い抗体価が検出された。

【００４４】Ｖ−７．クローニング抗体活性が陽性を示したNo.44およびNo.77のウェルの各
ハイブリドーマをII−６の項に従い、クローニングを行
った。約１週間後には細胞の増殖が認められるようにな
り、上清中の抗体価を上記Ｖ−６（i）記載のＥＩＡ法
により調べたところ、No.44ハイブリドーマでは76クロ
ーン中２クローンが、またNo.77のハイブリドーマでは7
6クローン中75クローンが抗体を産生していた。これら
のクローンのうち、No.77−30より得られたクローンbET
-31およびその産生するモノクローナル抗体bET-31a、N
o.44-52より得られたクローンbET-23およびその産生す
るモノクローナル抗体bET-23aに注目し、以下の実験を
実施した。

【００４５】Ｖ−８．大量のモノクローナル抗体の調製ミネラルオイル0.5mlを腹腔内投与されたマウス、ある
いは未処置マウス（BALB/C）にハイブリドーマbET-31ま
たはbET-23 １〜３×10⁶セル/匹を腹腔内注射したの
ち、10〜14日後に抗体含有腹水を採取した。

【００４６】Ｖ−９．モノクローナル抗体の精製上記Ｖ−８調製腹水よりプロティン−Ａカラムによりモ
ノクローナル抗体bET-31aおよびbET-23aをII−８の方法
に従い精製した。bET-31aが30mg bET-23aが50mgの特異
抗体を得た。

【００４７】Ｖ−10．モノクローナル抗体のクラス・サ
ブクラスの決定上記Ｖ−９精製モノクローナル抗体bET-31aおよびbET-2
3aのクラス・サブクラスをII−９で述べた方法に従い決
定した。その結果、bET-31aおよびbET-23aはいずれもIg
Gl、κクラスに属することが分かった。

【００４８】VI．ビッグエンドセリン−３に関する競合
法−ＥＩＡ上記Ｖ−６記載の抗マウスイムノグロブリン抗体結合マ
イクロプレートに、バッファーＣで100倍に希釈したbET
-31aおよびbET-23a含有培養上清50μl、およびビッグエ
ンドセリン−１，エンドセリン−３，ビッグエンドセリ
ン−３，ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプタイド（22-
42)、あるいはビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプタイド
（22-41)-NH₂標準液50μlを加え、室温で１時間反応さ
せたのち、上記Ｖ−４記載ＨＲＰ標識化ビッグエンドセ
リン−３Ｃ端ペプタイド（バッファーＣで200倍希釈)
を加え、４℃で16時間反応させた。反応後、ＰＢＳで洗
浄したのち固相上の酵素活性をII−５（i）記載の方法
により測定した。その結果を図３（Ａ），（Ｂ）に示
す。図中、−▲−がビッグエンドセリン−３を、−〇−
がビッグエンドセリン−１を、−●−がエンドセリン−
３を、−■−がビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプチド
（22-42) を、また、−□−がビッグエンドセリン−３
Ｃ端ペプチド（22-41)-NH₂の標準曲線を示し、(Ａ) がb
ET-31a、(Ｂ)がbET-23aを用いた競合法の結果を示す。
図３の結果から、bET-31aおよびbET-23aはともに、ビッ
グエンドセリン−１およびエンドセリン−３と反応しな
いことから、ビッグエンドセリン−３に特異的な抗体で
あり、さらに、ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプタイ
ド（22-42) およびビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプタ
イド（22-41)-NH₂と同程度に反応することから、ビッグ
エンドセリン−３のＣ端部位に広い特異性を有すること
がわかった。

【００４９】VII．ビッグエンドセリン−３に関するサ
ンドイッチ法−ＥＩＡ VII−１．HRP標識化モノクローナル抗体bET-31aの作製上記Ｖ−９記載の方法で精製したbET-31aをＩ−６記載
の方法に従ってＦab'-ＨＲＰ標識体を作製した。即ち、
0.1M酢酸緩衝液、pH4.5に溶解したモノクローナル抗体b
ET-31a 10.5にペプシン（シグマ社、２回結晶）3.17μg
を加え、37℃，16時間反応させたのち、ＢＢＳで平衡化
したウルトロゲルAcA44カラムでＦ(ab')₂画分を精製し
た。該画分を0.1M酢酸緩衝液、pH５で透析したのち、最
終20mMのβ-メルカプトエチルアミンを加え、37℃で90
分放置した。反応液を2.5mM ＥＤＴＡを含む0.1Mリン酸
緩衝液，pH6.0で平衡化したセファデックスＧ−25カラ
ムで分離し、Ｆab'画分を得た。一方、西洋ワサビペル
オキシダーゼ５mgを0.9mlの0.1Mリン酸緩衝液、pH７に
溶解させ、50μlのＤＭＦに溶解させたＧＭＢＳ 1.05mg
を加えて室温で40分反応させた。反応液をセファデック
スＧ−25カラム (溶離液0.1Mリン酸緩衝液、pH6.8) で
分離し、得られたマレイミド化ペルオキシダーゼ3.5mg
と上記Ｆab'画分1.3mgとを混合し、コロジオンパック
(エムエス機器社) で約0.3mlにまで濃縮したのち、４℃
で16時間放置した。反応液を溶離液に0.1Mリン酸緩衝
液、pH6.5を用いるウルトロゲルAcA44カラム (10mmφ×
40mm) に供し、Ｆab'−ペルオキシダーゼ複合体画分を
精製した。

【００５０】VII−２．HRP標識化モノクローナル抗体bE
T-23aの作製上記VII−１記載の方法に従いモノクローナル抗体bET-2
3a 12.7mgを用いて、ＨＲＰ標識化bET-23aを作製した。

【００５１】VII−３．サンドイッチ法ＥＩＡ IVで作製したAET-30a結合マイクロプレートにバッファ
ーＥで希釈したビッグエンドセリン−３、ビッグエンド
セリン−１（ヒト)、エンドセリン−３、エンドセリン
−１およびエンドセリン−２（ヒト）標準液100μlを加
え、４℃で24時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、
上記VII−１、VII−２で作製したＨＲＰ標識化bET-31a
またはbET-23a(バッファーＣで200倍希釈) 100μlを加
え、４℃で24時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、
上記II−５(i)記載の方法により固相上の酵素活性を測
定した。ＨＲＰ標識化bET-31aを用いた場合の結果を図
４に、ＨＲＰ標識化bET-23aを用いた場合の結果を図５
に示す。図中、−▲−がビッグエンドセリン−３の、ま
た−〇−がビッグエンドセリン−１（ヒト）の、−●−
がエンドセリン−３の、−■−がエンドセリン−１の、
−□−がエンドセリン−２の標準曲線を示す。図４の結
果から、ＨＲＰ標識化bET-31aを用いる測定法はビッグ
エンドセリン−３に特異的であり、他のエンドセリンと
はほとんど反応せず（交差反応性、0.1％以下)、また測
定感度は、６×10^~17モル/ウェルであることが分った。
同様に図５の結果から、ＨＲＰ標識化bET-23aを用いる
測定法は、ビッグエンドセリン−３に特異的であり、他
のエンドセリンとはほとんど反応しない（交差反応性、
0.1％以下）ことが分った。また、測定感度は、８×10
^-16モル/ウェルであった。

【００５２】VIII．羊水中のエンドセリン−３の定量羊水(１ｍｌ)をセップパックＣ-18カートリッジで濃縮
・前処理したのち、エンドセリン−３を上記IV記載サン
ドイッチ法−ＥＩＡにより定量した。羊水の前処理の方
法をスキーム１に、測定結果を表１に示した。表１の結
果より、出産時の羊水中に4.2±3.9ｐg/ｍｌ(mean±Ｓ
Ｄ，ｎ＝８)のエンドセリン−３が存在することが分っ
た。 IX．羊水中のエンドセリン−３の逆相高速液体クロマト
グラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による検出表１、Ｎｏ．３の羊水1.5ｍｌを上記Ｖ記載のセップパ
ックＣ−18カートリッジを用いて前処理したのち、チッ
素気流下で濃縮した。次に濃縮物を、後述する溶離液Ａ
100μｌに溶解したのち、ＲＰ−ＨＰＬＣで分離した。
分離条件を以下に示す。カラム：ＯＤＳ−８０ＴＭ（4.6 mmφ×250mm,東ソー社
製) 溶離液Ａ：0.05％−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む
５％アセトニトリル溶離液Ｂ：0.05％ＴＦＡを含む60％アセトニトリル溶出方法：溶離液Ｂの濃度を最初の５分間の間に０〜40
％に、次の20分間に40〜65％に、さらに次の５分間に65
〜100％に、直線的に上昇させる。流速：１ｍｌ／分分画：0.5ｍｌ／ｔｕｂｅ溶出画分を減圧下、遠心濃縮乾固したのち、250μｌの
バッファーＥに溶解させ、上記IV記載のサンドイッチ法
−ＥＩＡに供した。結果を図６に示す。羊水中のエンド
セリン−３の免疫活性は合成エンドセリン−３の溶出位
置に検出されたことから、該サンドイッチ法−ＥＩＡが
エンドセリン−３を検出していることが確認された。

【００５３】

【化１】

【００５４】

【表１】

【００５５】Ｘ．健常人および透析患者血漿中のエンド
セリン−３の定量ヒト血漿（１ml) をスキーム１に示す方法により、濃
縮、前処理したのち、エンドセリン−３を上記IV記載サ
ンドイッチ法−ＥＩＡにより定量した。健常人17名（男
性、37.5±4.9才) および透析患者24名 (男性、46.0±
7.0才) の血漿の測定結果を図７に示す。この結果か
ら、この測定法により血漿中のエンドセリン−３が定量
可能であること、および、透析患者でエンドセリン−３
の血漿レベルが増加することから、この測定法が臨床上
も有用であることが明らかにされた。

【００５６】XI．健常人および透析患者血漿中のエンド
セリン−３免疫活性のＲＰ−ＨＰＬＣによる検出健常人血漿、20ml、あるいは透析患者血漿80mlを同量の
ＰＢＳで希釈したのち、AET-30の結合セファロース４Ｂ
カラム（Ｉ−４記載の方法により、1.5mgの抗体を１ｇ
のＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに結合させたゲル1.
5mlを含む) に10ml/時間の速度で通した。カラムを15ml
のＰＢＳで洗浄したのち、３mlの0.05％ＴＦＡを含む60
％アセトニトリル溶液で溶出し、窒素気流下濃縮した。
濃縮物を0.05％ＴＦＡおよび0.05％ＣＨＡＰＳ（３−
[(３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］１−プ
ロパンスルホネート）（３−[(３−cholamidopropyl）d
imethylammonio]−１−propanesultonate) を含む５％
アセトニトリル溶液で溶解したのち、IX記載の溶出条件
により、ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。結果を図８に示
す。健常人（Ａ）および透析患者（Ｂ）いずれの免疫活
性も、標準の合成エンドセリン−３の溶出位置に検出さ
れたことから、該サンドイッチ−ＥＩＡが、血漿中のエ
ンドセリン−３を検出していることが確認され、その優
れた特性が明らかとなった。

【００５７】XII モノクローナル抗体ＡＥＴ−３０ａ
の中和活性能の検討ブタ左冠状動脈より摘出した約２cmのらせん状条片を、
混合ガス（95％Ｏ₂＋５％ＣＯ₂）通気下にクレブス−ヘ
ンゼライト液（以下栄養液と略す）で満たされたマグヌ
ス管内に懸垂した。37℃で３時間放置したのち、血管平
滑筋の収縮により発生する張力をアイソメトリックトラ
ンスデューサー（ポリグラフ、ＮＥＣ三栄社製）により
測定した。試料として、あらかじめ２０倍 moleのＡＥ
Ｔ−３０ａと３７℃、２０分間反応させたエンドセリン
-３溶液(最終エンドセリン−３濃度１×10^-8Ｍ）を添
加しても発生する張力は、同濃度のエンドセリン−３に
より惹起される張力の7.0％（ｎ=５）であるのに対し、
対照抗体Ｈ２７２−１１（抗癌胎児性抗原）とエンドセ
リン−３とを反応させた溶液(最終１×10^-8Ｍ）を添加
した場合にはエンドセリン−３と同程度（121％，ｎ＝
５）の収縮による張力が観測された。以上のことから、
ＡＥＴ−３０ａはエンドセリン−３の血管平滑筋収縮活
性を中和することが明らかとなった。

【００５８】

【発明の効果】本発明のエンドセリン−３に対するモノ
クローナル抗体は、極めて高い結合能を有し、かつエン
ドセリン−３の血管平滑筋収縮活性を中和することがで
きる。該モノクローナル抗体とエンドセリン−３のＣ端
部を認識する抗体とを用いるサンドイッチ法による免疫
学的測定法により、エンドセリン−３を高感度にかつエ
ンドセリン−１あるいはエンドセリン−２あるいはビッ
グエンドセリン−３と交差反応することなく定量するこ
とができる。また該抗体は、エンドセリン−３と関連す
る各種疾患において、エンドセリン−３の強力なアンタ
ゴニストとして使用し得る。また、本発明のビッグエン
ドセリン−３Ｃ端ペプチドに対するモノクローナル抗
体は、ビッグエンドセリン−３Ｃ末端に対し、幅広い
特異性を有することから、ビッグエンドセリン−３免疫
活性の検出に有利であり、該モノクローナル抗体とエン
ドセリン−３に対するモノクローナル抗体とを用いるサ
ンドイッチ法による免疫学的測定法により、ビッグエン
ドセリン−３を高感度にかつ、エンドセリン−１、−
２、−３、およびビッグエンドセリン−１と交差反応す
ることなく定量することができる。

【００５９】

【図面の簡単な説明】

【図１】モノクローナル抗体ＡＥＴ−３０ａを用いる競
合法−ＥＩＡにおけるエンドセリン−３およびエンドセ
リン−１の標準曲線を示す。

【図２】モノクローナル抗体ＡＥＴ−３０ａおよび抗エ
ンドセリン−３Ｃ端ペプタイド抗体を用いるサンドイ
ッチ法−ＥＩＡにおけるエンドセリン−３（−●−）、
エンドセリン−１（−▲−）、エンドセリン−２（−■
−）、ヒトビッグエンドセリン−１（−○−）、ブタビ
ッグエンドセリン−１（−□−）、およびビッグエンド
セリン−３（−△−）の標準曲線を示す。

【図３】（Ａ）モノクローナル抗体bET-31aを用いる競
合法−ＥＩＡ、(Ｂ）はモノクローナル抗体bET-23aを用
いる競合法−ＥＩＡ、各々におけるビッグエンドセリン
−３（−▲−)、ビッグエンドセリン−１（ヒト）(−〇
−)、エンドセリン−３（−●−)、ビッグエンドセリン
−３Ｃ端ペプチド（22-42)（−■−)、およびビッグエ
ンドセリン−３Ｃ端ペプチド（22-41)-NH₂（−□−）の
標準曲線を示す。

【図４】モノクローナル抗体AET-30aおよびモノクロー
ナル抗体bET-31aを用いるサンドイッチ法−ＥＩＡにお
けるビッグエンドセリン−３（−▲−）ビッグエンドセ
リン−１（ヒト）(−〇−)、エンドセリン−３（−●
−)、エンドセリン−１（−■−)、およびエンドセリン
−２（−□−）の標準曲線を示す。

【図５】モノクローナル抗体AET-30aおよびモノクロー
ナル抗体bET-23aを用いるサンドイッチ法−ＥＩＡにお
けるビッグエンドセリン−３（−▲−）ビッグエンドセ
リン−１（ヒト)（−〇−)、エンドセリン−３（−●
−)、エンドセリン−１（−■−)、およびエンドセリン
−２（−□−）の標準曲線を示す。

【図６】セップパックＣ−１８カートリッジ処理後のヒ
ト羊水の逆相ＨＰＬＣによる分離および、上記サンドイ
ッチ法−ＥＩＡによる検出結果を示す。矢印は合成標準
エンドセリンおよびビッグエンドセリンの溶出位置を示
す。略号：ＥＴ−３，エンドセリン−３；（ａ）ヒトビッグ
エンドセリン−１の酸化物；ｈｂｉｇ−ＥＴ−１，ヒト
ビッグエンドセリン−１；（ｂ）エンドセリン−１の酸
化物；ｐｂｉｇ−ＥＴ−１，ブタビッグエンドセリン−
１；ＥＴ−１，エンドセリン−１，およびＥＴ−２，エ
ンドセリン−２。

【図７】健常人および透析患者血漿中のエンドセリン−
３濃度の測定結果を示す。

【図８】健常人および透析患者血漿エンドセリン−３免
疫活性の逆相ＨＰＬＣによる分離および上記サンドイッ
チ法−ＥＩＡによる検出結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/28 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｑ 1/28 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｒ 1:91） 33/577 (Ｃ１２Ｐ 21/08 //(Ｃ１２Ｎ 15/02 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ (Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エンドセリン−３前駆体に結合性を有する
モノクローナル抗体。
【請求項２】エンドセリン−３の前駆体が、エンドセリ
ン−３Ｎ端部あるいはＣ端部に、１つ以上のアミノ酸
が付加されたものである、請求項１記載のモノクローナ
ル抗体。
【請求項３】エンドセリン−３の前駆体が、式１の配列
を有するポリペプチド、または式２で表されるビッグエ
ンドセリン−３、もしくはその一部分である、請求項１
または２記載のモノクローナル抗体。式１ Met Glu Pro Gly Leu Trp Leu Leu Phe Gly Leu Thr Val Thr Ser Ala Ala Gly Phe Val Pro Cys Ser Gln Ser Gly Asp Ala Gly Arg Arg Gly Val Ser Gln Ala Pro Thr Ala Ala Arg Ser Glu Gly Asp Cys Glu Glu Thr Val Ala Gly Pro Gly Glu Glu Thr Val Ala Gly Pro Gly Glu Gly Thr Val Ala Pro Thr Ala Leu Gln Gly Pro Ser Pro Gly Ser Pro Gly Gln Glu Gln Ala Ala Glu Gly Ala Pro Glu His His Arg Ser Arg Arg Cys Thr Cys Phe Thr Tyr Lys Asp Lys Glu Cys Val Tyr Tyr Cys His Leu Asp Ile Ile Trp Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg Gly Lys Arg Ser Ala Gly Pro Leu Pro Gly Asn Leu Gln Leu Ser His Arg Pro His Leu Arg Cys Ala Cys Val Gly Arg Tyr Asp Lys Ala Cys Leu His Phe Cys Thr Gln Thr Leu Asp Val Ser Arg Gln Val Glu Val Lys Asp Gln Gln Ser Lys Gln Ala Leu Asp Leu His His Pro Lys Leu Met Pro Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ala Pro Ser Thr Cys Pro Arg Cys Leu Phe Gln Glu Gly Ala Pro 式２ Cys Thr Cys Phe Thr Tyr Lys Asp Lys Glu Cys Val Tyr Tyr Cys His Leu Asp Ile Ile Trp Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg X （Ｘ＝Ｇｌｙ−ＯＨまたはＮＨ₂）
【請求項４】エンドセリン−３前駆体と結合性を有し、
かつエンドセリン−３Ｃ端ペプチド、すなわち Cys Hi
s Leu Asp Ile Ile Trp で表わされるペプチドと反応
しない、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】エンドセリン−３前駆体と結合性を有し、
一方、下記のアミノ酸配列を有する、エンドセリン−１ Cys Ser Cys Ser Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys Val Tyr Phe Cys His Leu Asp Ile Ile Trp、エンドセリン−２ Cys Ser Cys Ser Ser Trp Leu Asp Lys Glu Cys Val Tyr Phe Cys His Leu Asp Ile Ile Trp、およびマウス・エンドセリン−２ Cys Ser Cys Asn Ser Trp Leu Asp Lys Glu Cys Val Tyr Phe Cys His Leu Asp Ile Ile Trp、のいずれとも反応しない、請求項１記載のモノクローナ
ル抗体。
【請求項６】ビッグエンドセリン−３（式２）またはそ
の部分ペプチドと結合性を有し、かつエンドセリン−３
と反応しない請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】式３の配列を有するビッグエンドセリン−
３Ｃ端ペプチドと反応する請求項６記載のモノクローナ
ル抗体。式３ Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg X （Ｘ＝Ｇｌｙ−ＯＨまたはＮＨ₂）
【請求項８】ｂＥＴ−３１ａで標示される、請求項７記
載のマウスモノクローナル抗体。
【請求項９】ｂＥＴ−２３ａで標示される、請求項７記
載のマウスモノクローナル抗体。
【請求項１０】エンドセリン−３前駆体に結合性を有す
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項１１】ｂＥＴ−３１で標示される、請求項１０
記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項１２】ｂＥＴ−２３で標示される、請求項１０
記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項１３】エンドセリン−３前駆体に対する抗体
と、被検液および標識化エンドセリン−３前駆体とを競
合的に反応させ、該抗体に結合した標識化エンドセリン
−３前駆体の割合を測定することを特徴とする、被検液
中のエンドセリン−３前駆体の定量法。
【請求項１４】エンドセリン−３前駆体に対する抗体
と、被検液および標識化ビッグエンドセリン−３または
標識化ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペプチドとを競合
的に反応させ、該抗体に結合した標識化ビッグエンドセ
リン−３または標識化ビッグエンドセリン−３Ｃ端ペ
プチドの割合を測定することを特徴とする、被検液中の
エンドセリン−３前駆体の定量法。
【請求項１５】担体上に不溶化した抗エンドセリン−３
モノクローナル抗体ＡＥＴ−３０ａまたはエンドセリン
−３前駆体に対する抗体に、被検液を接触させた後、標
識化されたエンドセリン−３モノクローナル抗体ＡＥＴ
−３０ａまたは標識化されたエンドセリン−３前駆体に
対する抗体を接触させ、不溶化担体上の標識剤の活性を
測定することを特徴とする、被検液中のエンドセリン−
３前駆体の定量法。
【請求項１６】担体上に不溶化した抗体、および標識化
された抗体の一方がＡＥＴ−３０ａであり、他方がエン
ドセリン−３前駆体に結合性を有するがエンドセリン−
３とは反応しないモノクローナル抗体である、請求項１
５記載のエンドセリン−３前駆体の定量法。
【請求項１７】担体上に不溶化したエンドセリン−３前
駆体に対する抗体、および標識化されたエンドセリン−
３前駆体に対する抗体が請求項７記載のモノクローナル
抗体である請求項１６記載のエンドセリン−３前駆体の
定量法。
【請求項１８】担体上に不溶化したエンドセリン−３前
駆体に対する抗体、および標識化されたエンドセリン−
３前駆体に対する抗体がｂＥＴ−３１ａまたはｂＥＴ−
２３ａである請求項１６記載のエンドセリン−３前駆体
の定量法。
【請求項１９】担体上に不溶化したエンドセリン−３モ
ノクローナル抗体ＡＥＴ−３０ａと標識化されたｂＥＴ
−３１ａまたはｂＥＴ−２３ａとを用いる請求項１８記
載のエンドセリン−３前駆体の定量法。