FR2930031A1 - Dispositif et procede d'analyse exaltee d'un echantillon de particules. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un dispositif d'analyse d'un échantillon (2) de particules en solution, ledit dispositif comportant un système de microscopie (1), ledit système de microscopie (1) comportant des moyens de support (3) dudit échantillon (2), des moyens d'illumination (4) aptes à émettre un faisceau lumineux d'excitation (10), des moyens de focalisation (5) dudit faisceau lumineux d'excitation (10) en un point de focalisation (12) au niveau de l'échantillon (2) et des moyens de filtrage spatial (7) aptes à définir autour du point de focalisation (12) un volume d'analyse (13), caractérisé en ce que ledit système de microscopie (1) comporte également des moyens d'exaltation (14) dudit faisceau lumineux d'excitation (10), lesdits moyens d'exaltation (14) présentant une focale strictement positive et un indice de réfraction supérieur à l'indice de réfraction dudit échantillon (2), une partie au moins desdits moyens d'exaltation (14) étant disposés sur le trajet dudit faisceau lumineux d'excitation (10) en aval desdits moyens de support (3) et en amont dudit point de focalisation (12). La présente invention concerne également un procédé d'analyse d'un échantillon (2) de particules en solution par un tel dispositif d'analyse.

Description

DISPOSITIF ET PROCÉDÉ D'ANALYSE EXALTÉE D'UN ECHANTILLON DE PARTICULES

La présente invention concerne un dispositif et un procédé d'analyse exaltée d'un échantillon de particules.

DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention se rapporte au domaine des dispositifs d'analyse de particules luminescentes ou optiquement diffusantes.

Elle se rapporte plus particulièrement à un dispositif d'analyse d'un échantillon de particules en solution, ledit dispositif comportant un système de microscopie, ledit système de microscopie comportant des moyens de support dudit échantillon, des moyens d'illumination aptes à émettre un faisceau lumineux d'excitation, des moyens de focalisation dudit faisceau lumineux d'excitation en un point de focalisation au niveau de l'échantillon et des moyens de filtrage spatial aptes à définir autour du point de focalisation un volume d'analyse. ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE

Un tel dispositif vise à être utilisé dans tout type d'application d'analyse optique sur des particules ayant un marquage de luminescence ou de diffusion, c'est-à-dire possédant une réponse déterminée en luminescence ou diffusion à une lumière excitatrice. Les particules à analyser sont des molécules ou des assemblages moléculaires, par exemple des complexes moléculaires, des nanocristaux ou des nanobilles, et présentent des dimensions inférieures à la longueur d'onde de la lumière émise par les moyens d'illumination. Il trouve en particulier son application dans le domaine de la détection de molécules fluorescentes en solution, et plus particulièrement en spectroscopie de corrélation de fluorescence. Il trouve également une application dans les tests biologiques et plus précisément le test de biopuces à ADN ou à protéine. L'état de la technique dans ce domaine comporte des dispositifs d'analyse comprenant un système de microscopie confocale. Un tel système vise à analyser un échantillon, par exemple des particules en solution, luminescentes ou optiquement diffusantes. Dans le cas par exemple de l'analyse de particules fluorescentes, le système comprend une source laser émettant un faisceau laser à une longueur d'onde donnée, un miroir dichroïque, un objectif de microscope présentant un grandissement et une ouverture numérique très élevés, des moyens d'imagerie optique, des moyens de filtrage spatial et un détecteur. Le faisceau laser est rendu convergent par l'objectif en un point de focalisation situé au niveau du volume d'analyse que l'on souhaite analyser. La lumière du faisceau laser focalisé est alors absorbée par les particules puis réémise à une longueur d'onde supérieure à celle du faisceau laser pour être ensuite dirigée jusqu'au niveau du détecteur. Les moyens d'imagerie optique sont agencés de sorte à conjuguer le point de focalisation du faisceau laser avec le détecteur.

Les moyens de filtrage spatial permettent de délimiter un volume d'analyse et d'obtenir ainsi une résolution spatiale inférieure au micromètre. Pour cela, ils comprennent une ouverture disposé en amont du détecteur, dans un plan conjugué au plan focal de l'objectif de microscope. De cette manière, seuls les photons situés dans un volume autour du point de focalisation du faisceau laser participent à la formation de l'image au niveau du détecteur.

Afin d'obtenir un nombre important d'informations sur des particules fluorescentes en solution, un corrélateur est relié au détecteur afin d'analyser les fluctuations temporelles de la lumière fluorescente émise par le volume d'analyse, de sorte à réaliser une détection par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS). La fluorescence ainsi que les fluctuations temporelles de celle-ci sont ainsi analysées. Ces fluctuations sont directement reliées à la diffusion des fluophores au travers du volume d'analyse. Aux temps courts, la fonction d'autocorrélation de l'intensité lumineuse détectée permet d'avoir accès aux paramètres photophysiques des émetteurs ainsi qu'au nombre moyen de molécules détectées. Aux temps longs, cette fonction renseigne sur le temps de séjour moyen ù le temps de diffusion ù des molécules et sur leur mode de diffusion au travers du volume d'analyse.

Un tel dispositif permet de bénéficier d'une ouverture importante afin de collecter le maximum de lumière et donc de fluorescence, ainsi que de réduire le volume d'analyse et par conséquent de diminuer le bruit par diffusion dans la solution.

Néanmoins, pour une application où l'on souhaite une résolution d'analyse sur une molécule unique, un tel dispositif présente plusieurs inconvénients. En effet, les phénomènes de diffraction fixent une limite fondamentale à la dimension de la tâche focale du laser, et donc à la dimension du volume d'analyse. Ces phénomènes entraînent des limitations sur le taux de comptage par molécule à puissance fixée et sur la concentration maximale permettant la détection de molécules uniques, dans la mesure où l'on ne cherche à analyser qu'une molécule par volume d'analyse. De plus, la réduction du bruit de fond ù dû à la contribution des diffusions de Rayleigh et de Raman ù est limitée puisque ce bruit de fond est proportionnel aux dimensions du volume d'analyse. Ces inconvénients rendent de tels dispositifs peu adaptés en vue de l'analyse de molécules uniques dans des solutions de fortes concentrations (supérieures à une dizaine de nanomolaires).

Une solution est décrite dans le document de brevet FR 2 827 959 afin de résoudre le problème de la définition du volume d'analyse. Dans ce document, un dispositif de mesure d'un échantillon par spectroscopie par corrélation comprend un microscope confocal comportant un système optique de focalisation dont le champ définit un volume de collection ù ou volume d'analyse ù, des moyens aptes à produire un faisceau d'excitation et à le diriger sur l'échantillon au travers du microscope, des moyens de détection de l'intensité du flux lumineux produit par l'interaction du faisceau d'excitation sur l'échantillon et collecté par le microscope, ainsi que des moyens de traitement du signal produit par les moyens de détection. Ce dispositif comporte également une structure photonique augmentant le flux lumineux collecté, placé au foyer du système optique de focalisation du microscope et formant des franges d'interférence dans le volume de collection. Cette structure photonique peut être par exemple un miroir diélectrique résistant à l'eau et constitué d'un empilement de couches de très faible épaisseur optique. Elle est placée au foyer du système optique de focalisation du microscope pour former des franges d'interférence dans le volume de collection. La mise en oeuvre de cette structure permet, d'une part, une augmentation significative du signal collecté par molécule et, d'autre part, de résoudre le problème de la définition du volume de collection.

L'inconvénient de cette solution réside dans la difficulté d'obtenir une réjection suffisante du bruit induit par la réflexion du faisceau d'excitation sur le miroir et par la luminescence parasite induite dans le miroir. De plus, la réduction maximale du volume d'analyse qu'il est possible d'obtenir est d'environ 3, ce qui n'apporte pas un gain substantiel dans les applications pratiques.

D'autres solutions pour améliorer la résolution de ces dispositifs d'analyse pourraient être envisagées. En particulier, de sorte à amplifier la puissance lumineuse reçue par le détecteur, il peut être envisagé d'augmenter la puissance du faisceau laser, mais cela risque de photodétruire la molécule. Une autre option est d'augmenter l'ouverture numérique de l'objectif de microscope, mais cela est rendu difficile dans la mesure où la technologie des objectifs de microscope est très avancée et ne rencontre plus d'augmentation nette de l'ouverture numérique. De sorte également à limiter les conséquences du phénomène de diffraction, une solution peut consister à utiliser une source laser de plus courte longueur d'onde, mais une telle augmentation est limitée au niveau de l'excitation laser. Une autre solution peut mettre en oeuvre un moyen de support de plus grand indice de réfraction, par exemple en diamant, mais de tels matériaux engendrent des coûts importants et sont difficiles à usiner. D'autres solutions sont envisageables, comme l'emploi de microscopes à sondes de champ proche ou de déplétion stimulée de la luminescence, mais ces techniques sont difficiles à mettre en oeuvre et engendrent des coûts importants.

Ainsi, aucune solution de l'état de la technique ne permet de détecter efficacement des molécules individualisées dans des solutions de fortes concentrations en assurant une simplicité d'usage et un faible coût d'opération et de maintenance.

OBJET DE L'INVENTION Le but de la présente invention est de remédier à ces problèmes techniques, en permettant la diminution significative du volume d'analyse de sorte à ce qu'il ne contienne qu'une quantité de molécules allant jusqu'à l'unité et par la mise en oeuvre de moyens d'exaltation à la fois du faisceau lumineux d'excitation et de la collection de la luminescence émise. Ces moyens d'exaltation sont disposés de sorte à rendre plus intense et plus condensé le champ focal défini par le faisceau lumineux d'excitation au niveau de l'échantillon, ce champ étant susceptible d'atteindre des dimensions inférieures à la limite de diffraction, ce qui permet l'analyse sur un volume inférieur au femtolitre et donc susceptible de ne contenir qu'une seule molécule dans des solutions de concentrations élevées (supérieures à 10 nanomolaires).

L'approche de la solution a consisté à mettre en oeuvre des dispositifs d'émission nanophotonique û dits à jet photonique û en vue de diminuer le champ focal défini par le faisceau lumineux d'excitation au niveau de l'échantillon et augmenter l'efficacité de collection de la lumière émise. L'état de l'art de ce type de dispositif comporte une microbille disposée sur le trajet d'un faisceau collimaté afin de focaliser ce faisceau. Ceci confère audit faisceau une faible divergence, ainsi qu'une invariance suivant son axe, par rapport à un faisceau normal, susceptible de diffracter de manière importante sur une faible étendue. Ce type de dispositif n'est donc apparemment pas compatible avec une utilisation sur un trajet de faisceau lumineux fortement focalisé, tel que le faisceau lumineux d'excitation d'un dispositif d'analyse par microscopie, rendu convergeant en un point de focalisation. Or l'étude du comportement du faisceau lumineux d'excitation traversant en partie un tel dispositif d'émission nanophotonique, ainsi que sa mise en oeuvre, ont alors permis de mettre en évidence une réduction significative du volume d'analyse sur l'échantillon.

Dans ce but, l'invention a pour objet un dispositif d'analyse du type mentionné ci- dessus dans lequel, outre les caractéristiques déjà mentionnées, le système de microscopie comporte également des moyens d'exaltation dudit faisceau lumineux d'excitation, lesdits moyens d'exaltation présentant une focale strictement positive et un indice de réfraction supérieur à l'indice de réfraction dudit échantillon, une partie au moins desdits moyens d'exaltation étant disposés sur le trajet dudit faisceau lumineux d'excitation en aval desdits moyens de support et en amont dudit point de focalisation.

Les moyens d'exaltation ainsi mis en oeuvre permettent de sur-focaliser le faisceau lumineux d'excitation en une zone de plus petites dimensions que le volume d'analyse initial. En effet, la partie du faisceau lumineux incident qui traverse les moyens d'exaltation converge dans une zone limitrophe desdits moyens d'exaltation, cette zone étant rendue plus étroite par la focale et l'indice de réfraction desdits moyens d'exaltation. La partie du faisceau lumineux qui ne traverse pas lesdits moyens d'exaltation va interférer avec la partie qui les a traversés selon un phénomène d'interférence destructive. L'essentiel de l'intensité lumineuse du faisceau incident est ainsi concentré dans un volume de dimension longitudinale de l'ordre de la moitié de la longueur d'onde et de dimension axiale de l'ordre de la longueur d'onde, donc de dimensions inférieures à la limite de diffraction.

De plus, du fait de la valeur de l'indice de réfraction des moyens d'exaltation, le faisceau lumineux de réponse, produit en réponse à l'interaction du faisceau lumineux d'excitation sur l'échantillon et collecté par les moyens de focalisation, est dirigé de manière privilégiée dans une ou des directions spécifiques de l'espace. En effet, les particules vont réémettre de la lumière de manière privilégiée vers les moyens d'exaltation parce que son indice de réfraction est le plus grand. Ainsi un flux lumineux de réponse d'autant plus important sera collecté puis détecté, ce qui permet donc d'exalter également la collection de la luminescence émise.

Le dispositif d'analyse selon l'invention, ainsi constitué de la combinaison des moyens d'exaltation avec un système classique de microscopie comportant des moyens de filtrage spatial, permet donc de réduire de manière significative le volume d'analyse au niveau de l'échantillon afin d'analyser des molécules uniques, tout en concentrant le faisceau lumineux d'excitation dans ce volume de sorte à bénéficier d'une collection de signal par molécule suffisante pour une analyse, par exemple pour des applications de spectroscopie par corrélation. Par ailleurs, l'interface microstructurée définie par les moyens d'exaltation peut être simple à fabriquer et étendue à grande échelle.

Dans un premier mode de mise en oeuvre de l'invention, au moins une partie des moyens d'exaltation est solidaire des moyens de support. Dans ce cas, il peut être prévu que la partie des moyens d'exaltation solidaire des moyens de support soit constituée d'une saillie sur lesdits moyens de support, ladite saillie présentant une courbure strictement positive.

Dans un deuxième mode de mise en oeuvre de l'invention, au moins une partie des moyens d'exaltation n'est pas solidaire des moyens de support. Dans ce cas, il peut être prévu plusieurs modes de réalisation des moyens d'exaltation parmi lesquels : - la partie des moyens d'exaltation non solidaire des moyens de support comprend au moins une microlentille, - la partie des moyens d'exaltation non solidaire des moyens de support comprend au moins une microgoutte, et - la partie des moyens d'exaltation non solidaire des moyens de support comprend au moins une microbille.

Dans le cas où la partie des moyens d'exaltation non solidaire des moyens de support est constituée d'une microbille, il est avantageusement prévu que la (ou les) microbille(s) présente(nt) un diamètre sensiblement entre 1 et 5 micromètres. Cela permet de concentrer de manière optimale l'intensité lumineuse du faisceau lumineux d'excitation dans un volume d'analyse de faibles dimensions. De façon à optimiser au mieux les dimensions du volume d'analyse, il est prévu que la (ou les) microbille(s) présente(nt) un diamètre sensiblement égal à 2 micromètres.

Dans des modes de réalisation préférentiels visant à améliorer l'intensité lumineuse du faisceau lumineux d'excitation dans un volume d'analyse de faibles dimensions, il est prévu que : - les moyens d'exaltation soient centrés axialement sur l'axe du faisceau lumineux d'excitation, et - les moyens d'exaltation soient centrés longitudinalement sur le point de focalisation du faisceau lumineux d'excitation.

Dans un mode de réalisation avantageux visant à exalter davantage l'émission optique tout en n'affectant que très peu la transmission du fait de sa faible épaisseur, il est prévu que les moyens d'exaltation soient recouverts au moins en partie d'au moins une fine couche métallique.

Préférentiellement, le système de microscopie comporte également des moyens de détection de l'intensité du faisceau lumineux de réponse produit en réponse à l'interaction du faisceau lumineux d'excitation sur l'échantillon et collecté par les moyens de focalisation. Cela permet d'effectuer des mesures seulement sur le volume d'analyse, par mesure de l'intensité lumineuse reçue par les moyens de détection en réponse à l'excitation des particules de l'échantillon contenues dans le volume d'analyse.

Préférentiellement, le système de microscopie comporte également des moyens de traitement du signal fourni par les moyens de détection. Cela permet de réaliser des mesures non seulement de réponse lumineuse, mais également des fluctuations temporelles de cette réponse lumineuse, ce qui donne l'accès à un nombre significativement plus important d'informations sur les particules contenues dans l'échantillon.

Dans un mode de réalisation particulier, les moyens de support sont constitués d'un substrat de verre.

Préférentiellement, les moyens d'illumination sont constitués d'une source laser. En amont des moyens de focalisation, on dispose ainsi d'un faisceau lumineux d'excitation collimaté, monochromatique et de bonne qualité de front d'onde optique.

Selon un premier mode de réalisation des moyens de focalisation, il est prévu qu'ils soient constitués d'un objectif de forte ouverture numérique (typiquement supérieure à 0,7). Selon un deuxième mode de réalisation desdits moyens de focalisation, il est prévu qu'ils soient constitués d'une lentille de faible ouverture 30 numérique (typiquement inférieure à 0,7).

Selon un premier mode de réalisation des moyens de focalisation, il est prévu qu'ils soient constitués d'un objectif de forte ouverture numérique (typiquement supérieure à 0,7). Selon un deuxième mode de réalisation desdits moyens de focalisation, il est prévu qu'ils soient constitués d'une lentille de faible ouverture numérique (typiquement inférieure à 0,7).

Préférentiellement, le système de microscopie est confocal, les moyens de filtrage spatial comprenant une ouverture de dimension variable. Cela permet de régler la dimension du volume d'analyse, qui en combinaison avec les moyens d'exaltation, permet la réduction significative du volume d'analyse.

Préférentiellement, les moyens d'exaltation du faisceau lumineux d'excitation sont disposés en parallèle. Cela permet de disposer d'un volume d'analyse couvrant une surface large mais de faible épaisseur. La détection peut alors se faire avec un capteur comprenant une pluralité de pixels.

La présente invention concerne également un procédé d'analyse d'un échantillon de particules en solution par un dispositif d'analyse comportant un système de microscopie, ledit système de microscopie comportant des moyens de support dudit échantillon, des moyens d'illumination aptes à émettre un faisceau lumineux d'excitation, des moyens de focalisation dudit faisceau lumineux d'excitation en un point de focalisation au niveau de l'échantillon et des moyens de filtrage spatial aptes à définir autour du point de focalisation un volume d'analyse, caractérisé en ce que : - au moins une partie dudit faisceau lumineux d'excitation est exalté en aval desdits moyens de support et en amont dudit point de focalisation par une focalisation strictement convergente et une réfraction d'indice supérieur à l'indice de réfraction dudit échantillon, et - l'intensité du faisceau lumineux de réponse est mesurée en fonction du temps, ledit faisceau lumineux de réponse étant issu de l'interaction du faisceau lumineux d'excitation avec l'échantillon au niveau du volume d'analyse.

BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS

L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée d'un exemple non limitatif de réalisation, accompagnée de figures représentant respectivement : - la figure 1, un schéma d'un dispositif d'analyse par spectroscopie de corrélation de fluorescence selon un premier mode de réalisation de l'invention, - les figures 2A à 2D, différents modes de réalisation des moyens d'exaltation selon l'invention, et - la figure 3, un schéma d'un dispositif d'analyse par spectroscopie de corrélation de fluorescence selon un deuxième mode de réalisation de l'invention.

EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS 15 On entendra par point de focalisation du faisceau lumineux d'excitation le point de focalisation du faisceau lorsque aucune partie du faisceau ne traverse au moins une partie des moyens d'exaltation. Ainsi il pourra être dit, par exemple, d'une partie des moyens d'exaltation qu'elle est disposée en amont du point de 20 focalisation du faisceau lumineux d'excitation, de sorte à comprendre que le centre de cette partie des moyens d'exaltation est disposé en amont du point de focalisation du faisceau s'il n'y avait pas de moyens d'exaltation.

La figure 1 représente un schéma d'un dispositif d'analyse par spectroscopie de 25 corrélation de fluorescence selon un premier mode de réalisation de l'invention.

Le dispositif d'analyse vise à analyser un échantillon 2. Cet échantillon peut être un milieu liquide, gazeux, ou un objet biologique contenant des particules à analyser. Les particules à analyser sont des molécules ou des assemblages 30 moléculaires, par exemple des complexes moléculaires, des nanocristaux ou des nanobilles, et présentent des dimensions inférieures à la longueur d'onde de la lumière émise par les moyens d'illumination. 10 Le dispositif d'analyse comprend un système de microscopie confocale 1. Ce système est un arrangement comportant des moyens de support 3, d'illumination 4, de focalisation 5, de séparation dichroïque 6, de filtrage spatial 7, de détection 8, de traitement 9 et d'exaltation 14.

Les moyens de support 3 sont constitués d'un substrat de verre. Ce substrat peut être une lamelle de microscope d'épaisseur comprise entre 100 et 200 micromètres. Ce substrat supporte l'échantillon 2, qui est avantageusement enfermé dans une boîte étanche dont les parois latérales sont formées par des cales autocollantes d'épaisseur comprise entre 50 et 100 micromètres et résistantes à l'eau. Le substrat est ainsi disposé au sommet de ladite boîte étanche.

Les moyens d'illumination 4 émettent un faisceau lumineux d'excitation 10. Ce faisceau 10 est collimaté en sortie des moyens d'illumination 4. Ces moyens sont avantageusement constitués d'un laser. Selon différents modes de réalisation, le laser peut être un laser solide pompé par diode opérant à une longueur d'onde de 488 nanomètres ou un laser hélium-néon opérant à une longueur d'onde de 633 nanomètres.

Le faisceau lumineux d'excitation 10 est dirigé vers les moyens de séparation dichroïque 6. Ces moyens 6 sont avantageusement constitués d'une filtre dichroïque de type coupe-bande. Ce filtre est choisi de sorte que sa longueur d'onde de coupure et sa largeur de bande permettent de réfléchir le faisceau lumineux d'excitation 10 et de transmettre le faisceau lumineux de réponse 11.

La longueur d'onde du faisceau de réponse 11 est en effet supérieure à celle du faisceau d'excitation 10 puisque les particules sont fluorescentes. Dans le cas par exemple de molécules Alexa 647 excités à 633 nanomètres, la réponse lumineuse est attendue à 670 nanomètres, ce qui impose une longueur d'onde de coupure du filtre dichroïque de l'ordre de 640 nanomètres. Ce filtre est également choisi de sorte à posséder un facteur de transmission maximal pour la longueur d'onde du faisceau de réponse 11.

Avantageusement, le filtre dichroïque est disposé à 45° du faisceau incident d'excitation 10. Le filtre dichroïque peut ainsi diriger, après réflexion sur les moyens de séparation dichroïque 6, le faisceau lumineux d'excitation 10 vers les moyens de focalisation 5. Ces moyens 5 sont aptes à diriger le faisceau vers un point de focalisation 12 sur l'échantillon 2 au travers du système de microscopie confocale 1. Ces moyens 5 sont pour cela constitués d'un objectif ou d'une lentille.

De manière avantageuse, et comme illustré en figure 1, les moyens de focalisation 5 sont constitués d'un objectif de microscope. Cet objectif est par exemple un objectif apochromatique présentant un grandissement de 40x et une ouverture numérique de 1,2. Cette ouverture numérique élevée permet de collecter une intensité lumineuse optimale en réponse à l'excitation par le faisceau lumineux 10. L'efficacité de focalisation et l'efficacité de collection sont alors rendues optimales.

Dans un autre mode de réalisation, les moyens de focalisation 5 sont constitués d'une lentille. Ce type de moyen de focalisation présente une ouverture numérique peu élevée, ce qui ne permet pas d'exploiter de manière optimale l'effet supplémentaire obtenu par les moyens d'exaltation 14. Néanmoins, pour un coût moindre qu'un objectif de microscope, la faible efficacité de focalisation et de collection est compensée par les moyens d'exaltation 14.

Le faisceau lumineux d'excitation 10 ainsi focalisé interagit avec des particules en solution dans l'échantillon 2 selon un phénomène de fluorescence. Ainsi chaque particule excitée va émettre par fluorescence une réponse lumineuse à une longueur d'onde supérieure à celle du faisceau d'excitation 10. Une partie de cette réponse lumineuse est alors collectée par les moyens de focalisation 5 de sorte à former un faisceau lumineux de réponse 11.

Ce faisceau lumineux de réponse 11 est envoyé vers les moyens de détection 8 au travers des moyens respectivement de focalisation 5, de séparation dichroïque 6 et de filtrage spatial 7. La longueur d'onde de coupure du filtre dichroïque est en effet choisie de sorte à transmettre le faisceau lumineux de réponse 11, dont la longueur d'onde est supérieure à celle du faisceau d'excitation 10. Afin de réaliser la détection du faisceau de réponse 11, les moyens de filtrage spatial comprennent en outre un ensemble de lentilles 7' et 7"' permettant de conjuguer le plan focal des moyens de focalisation 5 avec le plan de captation des moyens de détection 8.

Les moyens de filtrage spatial 7 comprennent également une ouverture 7" de dimension réglable. Cette ouverture est disposée suivant l'axe 15 du faisceau lumineux de réponse 11. Elle est conjuguée optiquement avec le point de focalisation 12 des moyens de focalisation 5. Elle permet de sélectionner un volume de détection û ou volume de filtrage spatial û autour du point de focalisation 12, puisque des rayons lumineux ne provenant pas de ce volume de filtrage spatial ne traversent pas l'ouverture 7". Les dimensions de la zone de détection sont d'autant plus courtes que celles de l'ouverture 7" le sont également. L'ensemble 7 constitué des éléments 7', 7" et 7"' forme ainsi un sténopé ayant une ouverture variable 7" placée dans un plan intermédiaire image de sorte que le système de microscopie conjugue le point de focalisation 12 du faisceau d'excitation 10 avec l'ouverture variable 7" du sténopé.

Dans d'autres modes de réalisation, les moyens de filtrage spatial 7 ne comprennent pas d'ouverture 7". Ils peuvent en effet être constitués d'autres éléments permettant de réaliser un filtrage spatial. Le système de microscopie ainsi mis en oeuvre n'est alors plus de type confocal. Ces éléments peuvent être par exemple : - un trou dans une plaque métallique, - une fibre optique, dont le diamètre de coeur fixe l'ouverture utile, - les moyens de détection, leur surface étant petite, de l'ordre de quelques dizaines de micromètres de diamètre, ou - le faisceau d'excitation lui-même, dans le cas d'une excitation à deux photons.

Dans le cas d'une excitation par fluorescence à deux photons, celle-ci met en oeuvre l'absorption simultanée de deux photons pompe pour exciter la molécule. Elle est moins efficace que la fluorescence à un photon, mais dans la mesure où elle dépend quadratiquement de l'intensité d'excitation, seul un volume très petit autour du point de focalisation est apte à contribuer efficacement au signal. Dans ce cas, il n'est pas nécessaire d'utiliser de filtrage de type confocal.

Les moyens de détection 8 permettent la mesure de l'intensité du flux lumineux de réponse 11 produit par l'interaction du faisceau d'excitation 10 sur l'échantillon 2 et collecté par le système de microscopie 1. Dans un mode de réalisation particulier, ces moyens 8 comprennent des photodétecteurs à amplification d'électrons. Ces photodétecteurs sont avantageusement des photodiodes fonctionnant en régime d'avalanche ou de cascade û APD (photodiode à avalanche, soit avalanche photodiode en langue anglo- saxonne). Ces photodétecteurs peuvent également être des photomultiplicateurs. Selon d'autres modes de réalisation particuliers, ces moyens de détection 8 comprennent des photodétecteurs à amplification optique, des caméras CCD ou CMOS refroidies, par exemple à air liquide ou élément Peltier.

Ces moyens de détection 8 peuvent fonctionner selon deux modes de lecture. Selon un premier mode de mise en oeuvre de l'invention, la détection s'effectue suivant un régime continu, où le signal optique émis par les cibles est détecté en intégrant le signal pour chaque pixel ou groupe de pixels û dans le cas où les moyens de détection comportent plusieurs pixels û du détecteur. Des mesures radiométriques sont alors également possibles entre plusieurs pixels ou groupes de pixels. Selon un deuxième mode de mise en oeuvre de l'invention, la détection s'effectue suivant un régime temporel où le détecteur intègre le signal sur des plages temporelles courtes par rapport au processus à analyser. L'information est alors donnée par l'analyse de cette trace temporelle.

Le signal issu de ces moyens de détection 8 est envoyé vers des moyens de traitement 9 du signal. Ces moyens 9 comprennent avantageusement un compteur et un corrélateur qui permet de traiter numériquement les données reçues. En particulier, le compteur réalise l'enregistrement de la valeur de l'intensité lumineuse de fluorescence reçue et le corrélateur réalise l'analyse temporelle des fluctuations de l'intensité lumineuse de fluorescence reçue. Cette analyse peut se faire aux temps courts et aux temps longs de sorte à obtenir des informations complémentaires sur les particules en solution dans l'échantillon 2.

Aux temps courts, la fonction d'autocorrélation de l'intensité lumineuse détectée permet d'avoir accès aux paramètres photophysiques des émetteurs ainsi qu'au nombre moyen de molécules détectées. Aux temps longs, cette fonction renseigne sur le temps de séjour moyen ù temps de diffusion ù des molécules et sur leur mode de diffusion au travers du volume de filtrage spatial.

Les moyens d'exaltation 14 permettent de modifier la forme du faisceau lumineux d'excitation 10 de sorte à exalter le flux lumineux et ainsi le concentrer dans un volume d'analyse de plus petites dimensions. Pour cela, les moyens d'exaltation 14 sont disposés sur le trajet du faisceau lumineux d'excitation en aval des moyens de support 3 et en amont du point de focalisation 12.

Ces moyens d'exaltation 14 présentent une focale strictement positive et un indice de réfraction supérieur à l'indice de réfraction dudit échantillon 2. Dans ces conditions, la partie du faisceau lumineux incident 10 qui traverse les moyens d'exaltation 14 converge dans une zone limitrophe desdits moyens d'exaltation 14. Cette zone est rendue plus étroite car leur focale est strictement positive et leur indice de réfraction est supérieur à celui de la solution dans l'échantillon 2. La partie du faisceau lumineux 10 qui ne traverse pas lesdits moyens d'exaltation 14 va interférer avec la partie qui les a traversés selon un phénomène d'interférence destructive. L'essentiel de l'intensité lumineuse du faisceau incident 10 est ainsi concentré dans un volume de dimension longitudinale de l'ordre de la moitié de la longueur d'onde et de dimension axiale de l'ordre de la longueur d'onde, donc de dimensions inférieures à la limite de diffraction, ce qui permet d'atteindre un volume d'analyse inférieur au dixième de femtolitre.

De plus, leur indice de réfraction étant supérieur à celui de l'échantillon 2, le faisceau lumineux de réponse 11 est dirigé de manière privilégiée de sorte à ce que la lumière soit réémise vers les moyens d'exaltation 14. Ainsi un flux lumineux de réponse 11 d'autant plus important sera collecté puis détecté. Les moyens d'exaltation 14 constituent ainsi une interface microstructurée entre les moyens de support 3 et le point de focalisation 12 du faisceau d'excitation 10, de sorte à diminuer les dimensions du volume d'analyse à détecter et à y concentrer une intensité lumineuse supérieure à celle sans moyens d'exaltation.

Les moyens d'exaltation 14 présentent des dimensions micrométriques, de l'ordre de 1 à 5 micromètres, et un indice de réfraction élevé, de l'ordre de 1,4 à 1,6. Selon différents modes de réalisation particuliers, les moyens d'exaltation 14 ne sont pas solidaires des moyens de support 3, sont au moins en partie solidaires desdits moyens de support 3, ou sont entièrement solidaires desdits moyens de support 3. 10 Selon le mode de réalisation illustré par la figure 2A, les moyens d'exaltation 14 sont solidaires des moyens de support 3. Les moyens d'exaltation sont ainsi constitués d'une saillie 14' sur les moyens de support 3. Cette saillie présente une courbure strictement positive de sorte que la focale des moyens d'exaltation 15 ainsi constitués soit strictement positive.

Selon les modes de réalisation illustrés par les figures 2B à 2D, les moyens d'exaltation 14 ne sont pas solidaires des moyens de support 3. L'interface microstructurée ainsi constituée des moyens d'exaltation 14 peut être fabriquée 20 par dispersion desdits moyens 14 sur le substrat de verre des moyens de support 3.

En référence à la figure 2B, les moyens d'exaltation 14" sont constitués d'une microlentille convergente. Cette lentille, de dimensions micrométriques, présente 25 avantageusement une focale élevée de sorte de concentrer au mieux le flux lumineux issu du faisceau d'excitation 10 dans une zone la plus proche possible de la lentille. Cette zone est ainsi d'autant plus isolée du reste de l'échantillon 2 où d'autres particules sont susceptibles d'être excitées.

30 En référence à la figure 2C, les moyens d'exaltation 14" sont constitués d'une microgoutte. La focale de cette goutte micrométrique présente avantageusement une courbure élevée afin de concentrer au mieux le flux lumineux issu du faisceau d'excitation 10 dans une zone la plus proche possible de la goutte.5 En référence à la figure 2D, les moyens d'exaltation 14" sont préférentiellement constitués d'une microbille. Cette microbille est une bille diélectrique d'indice de réfraction élevée et de dimensions micrométriques. Cette bille peut être par exemple réalisée en latex ou en polystyrène, dont l'indice vaut 1,6 et qui présente également l'avantage d'être plus souple que le verre de sorte à ne pas subir de détérioration lors de la fabrication de l'interface microstructurée. La microbille présente l'avantage de disposer de courbures très élevées, ce qui permet de concentrer de manière optimale l'intensité lumineuse du faisceau d'excitation dans un volume d'analyse de faibles dimensions. Le diamètre d'une microbille est situé entre 1 et 5 micromètres, et préférentiellement de 2 micromètres.

Il est entendu que l'homme du métier est à même de réaliser différentes variantes de ces moyens d'exaltation illustrées par les figures 2A à 2D, en particulier par la combinaison des exemples de réalisation ci-dessus, sans pour autant sortir du cadre du brevet. Plus particulièrement, les moyens d'exaltation 14 peuvent comprendre à la fois une partie solidaire 14' et une partie non solidaire 14" des moyens de support 3.

Pour chacun des modes de réalisation des moyens d'exaltation 14 décrits ci-dessus ainsi que pour toute combinaison possible de ceux-ci, lesdits moyens d'exaltation 14 sont avantageusement centrés axialement sur l'axe 15 du faisceau lumineux d'excitation 10. Ils sont également avantageusement centrés longitudinalement sur le point de focalisation 12 du faisceau lumineux d'excitation 10. Ces centrages des moyens d'exaltation 14 par rapport au faisceau lumineux d'excitation 10 permettent d'exalter ledit faisceau 10 de manière optimale.

De manière préférentielle et aux fins d'exalter davantage l'émission optique, les moyens d'exaltation 14 sont recouverts au moins en partie d'au moins une fine couche métallique. Le métal utilisé pour cette couche est un métal choisi parmi l'aluminium et des métaux nobles, tels que l'or, l'argent, le cuivre et le nickel. L'épaisseur de cette couche est avantageusement inférieure ou égale à 30 nanomètres afin d'éviter de disposer d'une couche trop opaque qui diminuerait significativement la transmission du système de microscopie. Cette fine couche métallique peut être par exemple une couche en or, d'épaisseur égale à 20 nanomètres, recouvrant entièrement ou partiellement les moyens d'exaltation.

La figure 3 représente un schéma d'un dispositif d'analyse par spectroscopie de corrélation de fluorescence selon un deuxième mode de réalisation de l'invention.

Dans ce mode de réalisation visant à réaliser en même temps une analyse par 10 spectroscopie par corrélation de fluorescence et une analyse par spectroscopie Raman, le système de microscopie confocale comprend : - une source laser hélium-néon 20 émettant à 633 nanomètres, pour lequel une réponse lumineuse issue d'une interaction avec des molécules fluorescentes est attendue à 670 nanomètres, 15 - une source laser solide pompée par diode 21 émettant à 488 nanomètres, pour lequel une réponse lumineuse issue d'une interaction avec des molécules fluorescentes est attendue à 520 nanomètres, - un dispositif de microscopie classique 22 comportant un objectif de microscope 23 et une lamelle de verre 24 supportant un échantillon 25 contenant 20 les particules en solution, - un premier filtre dichroïque 26 coupe-bande autour de 633 nanomètres, - un deuxième filtre dichroïque 27 coupe-bande autour de 488 nanomètres, - un sténopé 28 comportant une ouverture réglable et deux lentilles disposées de sorte à filtrer spatialement un volume de détection autour du point 25 de focalisation des faisceaux issus des deux sources lasers 20 et 21, - un troisième filtre dichroïque 29 passe-haut dont la longueur d'onde de coupure est située entre 520 et 670 nanomètres de sorte à séparer les réponses lumineuses en fluorescence issues de l'interaction des particules avec chacune des sources lasers 20 et 21, 30 - un dispositif de spectroscopie Raman 30 pour l'analyse de la fluorescence des particules excitées à 488 nanomètres, - un cube séparateur 34, - deux photodiodes à avalanche 35 et 36 précédées respectivement de filtres 37 et 38 pour mesurer l'intensité du flux lumineux de fluorescence à 670 nanomètres collecté par le système de microscopie, et - un compteur 39 et un corrélateur 40 permettant de mesurer les fluctuations temporelles de l'intensité lumineuse de fluorescence à 633 nanomètres.

Le dispositif de spectroscopie 30 permet d'analyser la composition spectrale de la lumière sur une plage spectrale de 500 à 700 nanomètres pour une longueur d'onde d'excitation de 488 nanomètres. L'intensité de la lumière émise est mesurée par un détecteur 31, qui peut être monocanal, par exemple de type photomultiplicateur, ou multicanaux, par exemple de type CCD. Il est avantageusement adjoint au dispositif 30 un filtre passe-haut 32 et un filtre coupe-bande de façon à améliorer la qualité de signal transmis au détecteur 31.

Un tel dispositif d'analyse selon l'invention, combinant une analyse par spectroscopie par corrélation de fluorescence et une analyse par spectroscopie Raman, permet ainsi d'obtenir non seulement des informations statistiques et temporelles sur les particules en solution, mais également des informations sur des particules prises de manière individuelle.

La combinaison décrite ci-dessus des moyens d'exaltation et d'un système de microscopie confocale classique, selon l'un quelconque des modes de réalisation décrits ci-dessus, permet de diminuer le volume d'analyse et d'exalter la détection. Un régime de détection de forte efficacité où des particules individuelles sont détectées peut ainsi être envisagé. Ce régime permet d'obtenir des informations à l'échelle de la molécule individuelle qui ne sont pas accessibles par des mesures d'ensemble û dynamique temporelle et répartition statistique des réactions. Cela offre de nouveaux moyens d'étude et de diagnostic, notamment pour des applications d'analyse d'associations moléculaires, permanentes ou transitoires.

Les modes de réalisation précédemment décrits de la présente invention sont donnés à titre d'exemples et ne sont nullement limitatifs. Il est entendu que l'homme du métier est à même de réaliser différentes variantes de l'invention, en particulier avec l'évolution des technologies, sans pour autant sortir du cadre du brevet.

Ainsi, les moyens d'exaltation 14 du faisceau lumineux d'excitation 10 peuvent être disposés en parallèle. Un exemple de réalisation est un tapis de microbilles disposé contre le substrat de verre 3. Cet ensemble microstructuré de microbilles permet d'obtenir un volume d'analyse de surface large et de faible épaisseur. La détection peut alors également se faire avec un capteur multipixels CCD ou CMOS. Également, les particules à analyser peuvent également avoir des propriétés de chemiluminescence, de bioluminescence, de diffusion (Rayleigh ou Hyper-Rayleigh), de spectroscopie vibrationnelle (Raman spontanée ou stimulée), d'émissivité thermique ou de réflexion (cas des études granulométriques). 20

Claims (1)

1. REVENDICATIONS1 ù Dispositif d'analyse d'un échantillon (2) de particules en solution, ledit dispositif comportant un système de microscopie (1), ledit système de microscopie (1) comportant des moyens de support (3) dudit échantillon (2), des moyens d'illumination (4) aptes à émettre un faisceau lumineux d'excitation (10), des moyens de focalisation (5) dudit faisceau lumineux d'excitation (10) en un point de focalisation (12) au niveau de l'échantillon (2) et des moyens de filtrage spatial (7) aptes à définir autour du point de focalisation (12) un volume d'analyse (13), caractérisé en ce que ledit système de microscopie (1) comporte également des moyens d'exaltation (14) dudit faisceau lumineux d'excitation (10), lesdits moyens d'exaltation (14) présentant une focale strictement positive et un indice de réfraction supérieur à l'indice de réfraction dudit échantillon (2), et en ce qu'une partie au moins desdits moyens d'exaltation (14) est disposée sur le trajet dudit faisceau lumineux d'excitation (10) en aval desdits moyens de support (3) et en amont dudit point de focalisation (12). 2 ù Dispositif d'analyse selon la revendication 1, dans lequel au moins une partie (14') des moyens d'exaltation (14) est solidaire des moyens de support (3). 3 ù Dispositif d'analyse selon la revendication 2, dans lequel la partie (14') des moyens d'exaltation (14) solidaire des moyens de support (3) est constituée d'une saillie sur lesdits moyens de support (3), ladite saillie présentant une courbure strictement positive. 4 ù Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel au moins une partie (14") des moyens d'exaltation (14) n'est pas solidaire des moyens de support (3). 30 5 ù Dispositif d'analyse selon la revendication 4, dans lequel la partie (14") des moyens d'exaltation (14) non solidaire des moyens de support (3) comprend au moins une microlentille. 6 ù Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, 25dans lequel la partie (14") des moyens d'exaltation (14) non solidaire des moyens de support (3) comprend au moins une microgoutte. 7 ù Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, 5 dans lequel la partie (14") des moyens d'exaltation (14) non solidaire des moyens de support (3) comprend au moins une microbille. 8 ù Dispositif d'analyse selon la revendication 7, dans lequel la (ou les) microbille(s) présente(nt) un diamètre sensiblement entre 1 et 5 micromètres. 9 ù Dispositif d'analyse selon la revendication 8, dans lequel la (ou les) microbille(s) présente(nt) un diamètre sensiblement égal à 2 micromètres. 10 ù Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications 15 précédentes, dans lequel les moyens d'exaltation (14) sont centrés axialement sur l'axe (15) du faisceau lumineux d'excitation (10). 11 ù Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les moyens d'exaltation (14) sont centrés 20 longitudinalement sur le point de focalisation (12) du faisceau lumineux d'excitation (10). 12 ù Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les moyens d'exaltation (14) sont recouverts au moins 25 en partie d'au moins une fine couche métallique. 13 ù Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le système de microscopie (1) comporte également des moyens de détection (8) de l'intensité du faisceau lumineux de réponse (11) 30 produit en réponse à l'interaction du faisceau lumineux d'excitation (10) sur l'échantillon (2) et collecté par les moyens de focalisation (5). 14 ù Dispositif d'analyse selon la revendication précédente, dans lequel le système de microscopie (1) comporte également des moyens de traitement (9) 10du signal fourni par les moyens de détection (8). 15 û Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les moyens de support (3) sont constitués d'un substrat 5 de verre. 16 û Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les moyens d'illumination (4) sont constitués d'une source laser. 17 û Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans lequel les moyens de focalisation (5) sont constitués d'un objectif. 18 û Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, 15 dans lequel les moyens de focalisation (5) sont constitués d'une lentille. 19 û Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le système de microscopie (1) est confocal, les moyens de filtrage spatial (7) comprenant une ouverture (7") de dimension variable. 20 û Dispositif d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les moyens d'exaltation (14) du faisceau lumineux d'excitation (10) sont disposés en parallèle. 25 21 û Procédé d'analyse d'un échantillon (2) de particules en solution par un dispositif d'analyse comportant un système de microscopie (1), ledit système de microscopie (1) comportant des moyens de support (3) dudit échantillon (2), des moyens d'illumination (4) aptes à émettre un faisceau lumineux d'excitation (10), des moyens de focalisation (5) dudit faisceau lumineux d'excitation (10) en un 30 point de focalisation (12) au niveau de l'échantillon (2) et des moyens de filtrage spatial (7) aptes à définir autour du point de focalisation (12) un volume d'analyse (13), caractérisé en ce que : - au moins une partie dudit faisceau lumineux d'excitation (10) est exalté en aval desdits moyens de support (3) et en amont dudit point de focalisation (12) 10 20 par une focalisation strictement convergente et une réfraction d'indice supérieur à l'indice de réfraction dudit échantillon (2), et - l'intensité du faisceau lumineux de réponse (11) est mesurée en fonction du temps, ledit faisceau lumineux de réponse (11) étant issu de l'interaction du faisceau lumineux d'excitation (10) avec l'échantillon (2) au niveau du volume d'analyse (13).