FR2815964A1 - Proteine recepteur de la renine et/ou de la prorenine, acide nucleique codant pour ce recepteur et leur applications - Google Patents
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Abstract
Cette invention concerne une protéine isolée à activité de récepteur de la rénine, un acide nucléique codant pour cette protéine et leurs applications, notamment pour le criblage de composés antagonistes ou agonistes de la liaison rénine-récepteur, utiles notamment dans le traitement d'affections impliquant le système rénine/ angiotensine, et atteignant en particulier le coeur, les reins et le cerveau.
Description
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La présente invention a trait à une protéine récepteur de la rénine et/ou de la prorénine, à un acide nucléique codant pour ce récepteur et à leurs applications, notamment pour le criblage de composés agonistes ou antagonistes de ce récepteur.
La rénine est une enzyme de la famille des aspartyl-protéases, essentiellement synthétisée au niveau de l'appareil juxtaglomérulaire par les cellules myoépithélioïdes des artérioles glomérulaires afférentes, et à un moindre degré par les cellules mésangiales humaines (Chansel et al, 1987). La rénine se distingue par sa spécificité d'action sur un seul substrat, l'angiotensinogène, qu'elle active en angiotensine 1. Cette activation par protéolyse limitée de l'angiotensinogène constitue l'étape limitant de la génération d'angiotensine Il (Ang Il). Il existe des arguments en faveur d'une production tissulaire, locale, d'Ang Il. Cette production tissulaire d'Ang Il peut résulter d'une synthèse locale de rénine et d'angiotensinogène, soit d'une capture des protéines à partir du plasma.
Plusieurs sites de fixation de la rénine ont été rapportés à ce jour : la RnBp et le récepteur mannose-6-phosphate ont été bien caractérisés, tandis que d'autres sites de fixation tissulaires ont été simplement décrits, en particulier des protéines de masse moléculaire 70 et 40 kDa. La RnBp ou "renin-binding protein"a été purifiée à partir de rein de porc (Takahashi et al, 1983) puis clonée chez l'homme (Inoue et al, 1991). C'est une protéine de 417 acides aminés et de poids moléculaire 45 kDa, localisée dans le cytosol. Elle est caractérisée par un motif leucine zipper important pour la formation d'homodimères RnBp et d'hétérodimère RnBp-rénine. Très récemment, il a été montré que la RnBp était identique à la N-Acyl-D-glucosamine 2-épimerase (Maru et al, 1996). La fixation de la rénine au récepteur mannose-6-P a été montrée sur les cellules endothéliales humaines de veines de cordon ombilical et sur les cardiomyocytes de rat. La fixation de rénine et de pro-rénine entraîne une internalisation des ligands et une activation de la pro-rénine (van Kesteren
et al, 1997 ; Admiraal et al, 1999). Campbell et Valentijn ont également rapporté chez le rat l'existence de deux protéines capables de lier la rénine (1994). Ces protéines ont été décrites dans des préparations de membranes
et al, 1997 ; Admiraal et al, 1999). Campbell et Valentijn ont également rapporté chez le rat l'existence de deux protéines capables de lier la rénine (1994). Ces protéines ont été décrites dans des préparations de membranes
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d'artères mésentériques et de cellules musculaires lisses d'aorte, mais elles n'ont pas été retrouvées dans les préparations membranaires de cortex rénal.
La fixation de la rénine aux membranes d'artère mésentérique était de faible affinité (kD de l'ordre du uM) et était totalement inhibée en présence d'un inhibiteur de l'activité de la rénine. Enfin Sealer et coli. (1996) ont décrit des sites de fixation de haute affinité pour la rénine et la pro-rénine (900 et 200 pM, respectivement) dans de nombreux tissus de rat. Ces sites de fixation semblent être distincts du récepteur mannose-6-P.
Puisque les cellules mésangiales sont des cellules dérivées des cellules musculaires lisses et sont capables de synthétiser de la rénine, et que le système rénine-angiotensine peut être activé localement, l'hypothèse d'un système autocrine/paracrine de la rénine au niveau des cellules mésangiales humaines a été testée (Nguyen et al, 1998). Dans le cadre de cette étude, une protéine de poids moléculaire de 57 kDa avait été partiellement purifiée, par chromatograpie d'affinité.
Toutefois, le protocole de purification mentionné dans l'article de Nguyen et al, de 1998 n'a jamais pu aboutir, faute de quantité suffisante de matériel biologique.
Adoptant une nouvelle stratégie, les auteurs de l'invention sont parvenus à cloner un ADNc de 2 040 paires de bases (pb), comportant un cadre de lecture ouvert d'environ 1 100 pb, qui code pour une protéine de 350 acides aminés à activité de récepteur humain de la rénine, d'un poids moléculaire d'environ 39 kDa.
La liste des séquences annexée présente cet ADNc (SEQ ID no 1), et la séquence polypeptidique correspondante (SEQ ID no 2). La séquence
SEQ ID no 7 représente la séquence d'ADNc du récepteur de la rénine chez la souris, la séquence SEQ ID na 8 étant la séquence d'acides aminés correspondante.
SEQ ID no 7 représente la séquence d'ADNc du récepteur de la rénine chez la souris, la séquence SEQ ID na 8 étant la séquence d'acides aminés correspondante.
La présente invention a donc pour objet un acide nucléique isolé, comprenant la séquence SEQ ID n 1 ou no 7.
Il est entendu que sont également comprises les séquences homologues, définies comme :
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i) des séquences similaires à au moins 70 % de la séquence SEQ ID no 1 ou no 7 ; ou ii) des séquences hybridant avec la séquence SEQ ID no 1 ou no 7, ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation, ou iii) des séquences codant pour la protéine, à activité de récepteur de la rénine, telle que définie précédemment.
De préférence, une séquence nucléotidique homologue selon l'invention est similaire à au moins 75 % des séquences SEQ ID n'l ou no 7, de préférence encore au moins 85 %, ou au moins 90 %.
De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement aux séquences complémentaires de la séquence SEQ ID no 1 ou no 7, dans des conditions stringentes. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm=81,5+0, 41 (% G+C) +16,6Log (concentration en cations)- 0,63 (% formamide)- (600/nombre de bases) (Sambrook et al., 1989).
Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm= 4 (G+C) + 2 (A+T).
Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation peut être de préférence de 5 à 10 C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de force ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple.
Le terme "séquences similaires" employé plus haut se réfère à la ressemblance parfaite ou identité entre les nucléotides comparés mais aussi à la ressemblance non parfaite que l'on qualifie de similitude. Cette recherche de similitudes dans les séquences nucléiques distingue par exemple les purines et les pyrimidines.
Une séquence nucléotidique homologue à l'ORF représentée à la SEQ ID n 1 ou no 7 inclut donc toute séquence nucléotidique qui diffère de la séquence SEQ ID no 1 ou no 7 par mutation, insertion, délétion ou substitution
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d'une ou plusieurs bases, ou par la dégénérescence du code génétique, pour autant qu'elle code pour une protéine présentant l'activité biologique du récepteur de la rénine.
Parmi de telles séquences homologues, sont comprises les séquences des gènes de vertébrés, de préférence de mammifères autres que l'homme, codant pour ce récepteur, de préférence d'un primate, d'un bovin, ovin ou porc, ou encore d'un rongeur, mais aussi des poissons tels que la truite (pour lesquels il est connu que le système rénine/angiotensine est impliqué dans l'adaptation eau de mer/eau de source) ainsi que les variants alléliques.
La présente invention a également pour objet une protéine isolée, à activité de récepteur de la rénine, comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID no 2 ou no 8. Il est entendu que sont également comprises les séquences homologues, définies comme i) les séquences similaires à au moins 70% de la séquence SEQ ID no 2 ou no 8 ; ou ii) les séquences codées par une séquence d'acide nucléique homologue telle que définie précédemment c'est-à-dire une séquence d'acide nucléique hybridant avec la séquence SEQ ID no 1 ou no 7 ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation.
Là encore, le terme"similaires"se réfère à la ressemblance parfaite ou identité entre les acides aminés comparés mais aussi à la ressemblance non parfaite que l'on qualifie de similitude. Cette recherche de similitudes dans une séquence polypeptidique prend en compte les substitutions conservatives qui sont des substitutions d'acides aminés de même classe, telles que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non chargées (tels que l'asparagine, la glutamin, la serine, la thréonine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine, l'arginine, et l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique) ; d'acides aminés aux
chaînes latérales apolares (tels que la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, et la cystéine).
chaînes latérales apolares (tels que la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, et la cystéine).
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Plus généralement, par séquence d'acides aminés homologue , on entend donc toute séquence d'acides aminés qui diffère de la séquence SEQ ID no 2 ou no 8 par substitution, délétion et/ou insertion d'un acide aminé ou d'un nombre réduit d'acides aminés, notamment par substitution d'acides aminés naturels par des acides aminés non naturels ou pseudoacides aminés à des positions telles que ces modifications ne portent pas significativement atteinte à l'activité biologique du récepteur de la rénine.
De préférence, une telle séquence d'acides aminés homologue est similaire à au moins 85 % de la séquence SEQ ID no 2 ou no 8, de préférence au moins 95 %.
L'homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705). Des séquences d'acides aminés similaires sont alignées pour obtenir le maximum de degré d'homologie (i. e. identité ou similitude, comme défini plus haut). A cette fin, il peut être nécessaire d'introduire de manière artificielle des espaces ( gaps ) dans la séquence. Une fois l'alignement optimal réalisé, le degré d'homologie est établi par enregistrement de toutes les positions pour lesquelles les acides aminés des deux séquences comparées sont identiques, par rapport au nombre total de positions.
L'activité biologique du récepteur de la rénine/prorénine se réfère à sa capacité de fixation de la rénine ou de la prorénine et d'induction de différents phénomènes mesurables, tels que : - une augmentation de l'incorporation de thymidine tritiée ; - une augmentation de la sécrétion de l'inhibiteur type-1 de l'activateur tissulaire du plasminogène (PAI1) associée à un clivage du PAI1 en une forme inactive. Le PAI1 est une anti-protéase essentielle dans le contrôle de la fibrinolyse intra-vasculaire et dans la régulation du remodelage de la matrice extra-cellulaire ; - une inhibition de la génération de GMP cyclique (second messager intracellulaire) induite par le peptide natriurétique de type C (CNP) ;
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une augmentation de la vitesse de catalyse de l'angiotensinogène en angiotensine 1.
Le récepteur de la rénine selon l'invention serait impliqué dans des pathologies cardio-vasculaires et rénales telles que les cardiopathies hypertrophiques et les insuffisances rénales. Le coeur et le rein sont en effet deux organes dans lesquels l'existence d'un système rénine-angiotensine (SRA) local est bien démontré. Il existe également un SRA dans le cerveau, l' il, le placenta, les testicules et cette liste est non exhaustive. De fait, le récepteur de la rénine pourrait jouer un rôle dans toutes les pathologies impliquant le SRA local.
La protéine récepteur de la rénine présente une partie extramembranaire (séquence d'acides aminés no 1 à no 308 de SEQ ID no 2, représentée SEQ ID nO 4), un domaine transmembranaire, et une queue
intracytoplasmique (séquence d'acides aminés no 331 à no 350, de SEQ ID no 2, représentée SEQ ID nO 6).
intracytoplasmique (séquence d'acides aminés no 331 à no 350, de SEQ ID no 2, représentée SEQ ID nO 6).
Le polypeptide extramembranaire comprenant la séquence SEQ ID no 4, ou le polypeptide intracytoptasmique comprenant la séquence SEQ ID no 6, et les acides nucléiques codant pour ces polypeptides, comprenant par exemple respectivement les séquences représentées SEQ ID no 3 ou no 5, font partie de l'invention.
Les acides nucléiques et polypeptides homologues font également partie de l'invention, selon la définition de l'homologie mentionnée plus haut et considérée par analogie.
Le polypeptide comprenant la séquence SEQ ID no 4 ou ses homologues présente la capacité de capter la rénine et/ou la prorénine. Il peut donc par exemple être utile dans des procédés de criblage des composés susceptibles d'être des ligands du récepteur de la rénine.
Le polypeptide comprenant la séquence SEQ ID no 6 ou ses homologues contient des résidus sérine et tyrosine phosphorylables. Il peut être notamment utile dans des procédés de criblage de composés qui empêchent ou stimulent la phosphorylation de ces résidus.
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Dans la description ci-après, on entend, sauf indication contraire, par"protéine de l'invention" indifféremment la protéine entière récepteur de la rénine et de la prorénine, ou les polypeptides correspondant au domaine extramembranaire et au domaine intracytoplasmique, ou encore les protéines ou polypeptides homologues.
La protéine de la présente invention peut être synthétisée par toutes les méthodes bien connues de l'homme du métier. La protéine de l'invention peut par exemple être synthétisée par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production.
Une protéine recombinante peut également être produite par un procédé, dans lequel un vecteur contenant un acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID no 1, 5 ou 7 ou une séquence homologue est transféré dans une cellule hôte qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression de la protéine correspondante.
La protéine produite peut ensuite être récupérée et purifiée.
Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. La protéine recombinante obtenue peut être purifiée à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono-ou polyclonaux spécifiques, etc.
La protéine obtenue peut donc être une protéine soluble ou une protéine qui s'intègre dans une membrane cellulaire.
La séquence d'acide nucléique d'intérêt peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de manière opérante à des éléments permettant la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs, activateurs et/ou terminateurs de transcription.
Les signaux contrôlant l'expression des séquences nucléotidiques (promoteurs, activateurs, séquences de terminaison...) sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon
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l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation ou la précipitation au phosphate de calcium.
Les vecteurs de clonage et/ou d'expression tels que décrits cidessus, contenant une séquence nucléotidique définie selon l'invention font également partie de la présente invention.
L'invention vise en outre les cellules hôtes transfectées, de manière transitoire ou stable, par ces vecteurs d'expression. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes, procaryotes ou eucaryotes, d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Des exemples de cellules hôtes incluent notamment des cellules de mammifères, telles que les lignées et les cellules rénales en culture primaire, ou encore les cellules CHO, COS-7,293, MDCK, des cellules d'insectes telles que les cellules SF9, des bactéries telles que E. coli et des souches de levures telles que L40 et Y90.
Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences d'ADN ou d'ARN, obtenues par criblage de banques de séquences au moyen de sondes élaborées sur la base de la séquence SEQ ID no 1. De telles banques peuvent être préparées par des techniques classiques de biologie moléculaire, connues de l'homme de l'art.
La séquence nucléotidique selon l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage des banques.
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La séquence nucléotidique de l'invention permet la réalisation de sondes ou amorces, hybridant spécifiquement avec la séquence SEQ ID no 1 selon l'invention, ou son brin complémentaire. Les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions de température et de force ionique usuellement utilisées par l'homme du métier, de préférence dans des conditions stringentes telles que définies précédemment. Ces sondes peuvent être utilisées comme outil de diagnostic in vitro pour la détection, par des expériences d'hybridation, notamment d'hybridation"in situ", de transcrits spécifiques de la protéine de l'invention dans des échantillons biologiques ou pour la mise en évidence de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques résultant d'un polymorphisme, de mutations ou d'un mauvais épissage.
Les acides nucléiques de l'invention utiles comme sondes comportent au minimum 15 nucléotides, préférentiellement au moins 20 nucléotides, préférentiellement encore au moins 100 nucléotides, mais de préférence inférieure à la taille de la séquence SEQ ID no 1 elle-même.
On peut par exemple utiliser comme sonde le fragment des nucléotides 90 à 1945 de SEQ ID no 1.
Les acides nucléiques utiles comme amorces comportent au minimum 15 nucléotides, de préférence au moins 18 nucléotides, et préférentiellement moins de 40 nucléotides.
On peut par exemple utiliser comme amorce, pour une amplification, les acides nucléiques constitués des séquences des nucléotides 128 à 151, 796 à 819,228 à 248 ou 454 à 474 de SEQ Il ne 1.
Plus précisément, la présente invention a pour objet un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides, qui hybride spécifiquement avec l'une des séquences d'acide nucléique SEQ ID no 1 ou son complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation.
Préférentiellement, les sondes ou amorces de l'invention sont marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la portée de l'homme du métier comme par exemple le marquage fluorescent, radioactif, chimioluminescent ou enzymatique.
Les méthodes de diagnostic in vitro dans lesquelles ces oligonucléotides sont mis en oeuvre pour la détection de mutations ou de
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remaniements génomiques, au niveau du gène du récepteur de la rénine, sont incluses dans la présente invention. Ces méthodes sont particulièrement utiles en diagnostic prénatal, au cours du développement de l'embryon et du foetus ainsi que plus généralement pour le diagnostic d'affections impliquant les systèmes rénine/angiotensine locaux.
L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de l'expression du récepteur de la rénine tel que défini précédemment dans un échantillon cellulaire ou tissulaire, comprenant les étapes consistant à : - préparer l'ARN dudit échantillon ; - mettre en contact ledit ARN obtenu avec une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec un acide nucléique codant pour une protéine à activité de récepteur de la rénine, telle que définie précédemment ; - détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde, indicatrice de l'expression dudit récepteur.
L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de l'expression de ce récepteur dans des cellules ou un tissu par hybridation in situ, comprenant les étapes consistant à : - mettre en contact lesdites cellules ou ledit tissu avec une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec un acide nucléique codant pour une protéine à activité de récepteur de la rénine, telle que définie précédemment ; - détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde, indicatrice de l'expression dudit récepteur.
L'invention concerne également une méthode in vitro pour la détection ou la mesure du taux d'expression du récepteur de la rénine dans un prélèvement biologique, comprenant la mise en contact d'au moins un anticorps dirigé contre ce récepteur avec ledit prélèvement biologique dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre ce récepteur et le ou lesdits anticorps et la détection des complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés.
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L'invention a également pour objet des anticorps dirigés contre la protéine récepteur de la rénine telle que définie précédemment, ou contre les fragments épitopiques de celle-ci, tels que les fragments définis entre les résidus 23 à 38 de SEQ ID no 2 (NH2-KSP GSV VFR NGN WPI P-CONH2) ; 221 à 235 de SEQ ID no 2 (NH2-EIG KRY GED SEQ FRD C-CONH2) ; 277 à 291 de SEQ ID no 2 (NH2-CTR TIL EAK QAK NPA S-CONH2) ; 338 à 350 de SEQ ID no 2 (NH2 - Cil YRM TNQ KIR MD-CONH2).
Il peut s'agir d'anticorps poly-ou monoclonaux ou de leurs fragments, d'anticorps chimériques, notamment humanisés ou immunoconjugués.
Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre une protéine selon les modes opératoires usuels.
Selon un mode de réalisation de l'invention, on peut utiliser comme antigène un fragment peptidique approprié, tel que défini plus haut, pouvant être couplé par l'intermédiaire d'un résidu réactif à une protéine (telle que l'hémocyanine de patelle KLH) ou un autre peptide. Des lapins sont immunisés avec l'équivalent de 1 mg de l'antigène peptidique selon la procédure décrite par Benoit et al. (1982). A des intervalles de quatre semaines, les animaux sont traités par des injections de 200 ug d'antigène et saignés 10 à 14 jours plus tard. Après la troisième injection, l'anti-sérum est examiné pour déterminer sa capacité à se lier au peptide antigène radiomarqué à l'iode, préparé par la méthode chloramine-T et est ensuite purifié par une chromatographie sur colonne échangeuse d'ion carboxyméthyl cellulose (CMC). Les molécules d'anticorps sont ensuite recueillies dans les mammifères et isolées jusqu'à la concentration souhaitée par les méthodes bien connues de l'homme de l'art, par exemple, en utilisant DEAE Sephadex pour obtenir la fraction IgG.
Afin d'augmenter la spécificité du sérum polyclonal, les anticorps peuvent être purifiés par une chromatographie d'immuno-affinité en utilisant des polypeptides immunisants en phase solide. L'anticorps est mis en contact avec le polypeptide immunisant en phase solide pendant une durée suffisante de façon à faire immuno-réagir le polypeptide avec la molécule d'anticorps afin de former un complexe immunologique en phase solide.
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Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Köhler et Milstein (1975).
Les anticorps ou fragments d'anticorps de l'invention peuvent être par exemple des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab et F (ab') 2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués.
Les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent notamment être utilisés pour l'analyse par immunohistochimie du récepteur de la rénine sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoperoxydase...
Les anticorps ainsi produits peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression du récepteur de la rénine doit être observée.
L'invention a plus généralement pour objet l'utilisation d'au moins un anticorps ainsi produit pour la détection ou la purification d'une protéine telle que définie précédemment dans un échantillon biologique.
L'invention a également pour objet un kit pour la mise en oeuvre de cette méthode comprenant : - au moins un anticorps spécifique du récepteur de la rénine, éventuellement fixé sur un support ; - des moyens de révélation de la formation de complexes antigènes/anticorps spécifiques entre le récepteur de la rénine et ledit anticorps et/ou des moyens de quantification de ces complexes.
L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'animal non humain, de préférence une souris, dans lequel on invalide le gène du récepteur de la rénine. L'animal susceptible d'être obtenu par ce procédé fait également partie de l'invention. Un tel animal, désigné"knock-out"pour ce gène, est un modèle notamment utile pour étudier la susceptibilité à développer des lésions, notamment de type lésions vasculaires ou modifiant la composition
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de la matrice extracellulaire, ou par exemple pour évaluer la cytotoxicité ou l'activité thérapeutique de certaines molécules.
L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'animal non humain transgénique, de préférence une souris, dans le génome duquel on intègre une séquence nucléotidique codante pour le récepteur de la rénine selon l'invention. Ladite séquence codante peut être une séquence homologue vis à vis de l'animal (par exemple une séquence murine intégrée dans le génome d'une souris) ou hétérologue (par exemple une séquence humaine intégrée dans le génome d'une souris). Un tel animal transgénique peut être un modèle utile pour étudier plus avant les fonctions du récepteur, mais aussi pour tester des molécules susceptibles d'agir sur celui-ci.
Les techniques classiquement utilisées pour obtenir des animaux transgéniques sont la technique de micro-injection d'ADN dans l'ovocyte, ou la technique d'injection dans le blastocyte et la technique d'agrégation (Hogan et al, 1994).
La protéine de l'invention ou l'acide nucléique codant pour cette protéine sont utiles à titre de médicament, notamment pour le traitement d'affections, dans lesquelles on observe par exemple l'expression d'un récepteur de la rénine modifié, et pour le traitement desquelles on cherche à restaurer l'activité de ce récepteur sauvage. Ces médicaments seraient en particulier utiles pour le traitement de pathologies associées à une augmentation de PAI 1 eVou une accumulation de matrice extracellulaire (inflammation, fibrose).
L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant une protéine telle que définie précédemment ou un acide nucléique codant pour ladite protéine, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques des compositions pharmaceutiques selon l'invention, contenant au moins une protéine, peuvent être déterminées de manière usuelle par l'homme du métier, notamment selon les critères généralement pris en compte pour l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, comme par
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exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, et les effets secondaires constatés, etc.
De manière générale, une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace variant d'environ 0, 1 ug à environ 1 mg peut être administrée à des adultes humains.
L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique tel que défini précédemment, codant pour le récepteur de la rénine et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, ladite composition étant destinée à être utilisée en thérapie génique. L'acide nucléique de préférence inséré dans un vecteur généralement viral (tels que les adénovirus et les rétrovirus) peut être administré sous forme nue, exempt de tout véhicule favorisant le transfert à la cellule cible, ou au contraire en association avec un agent facilitant la transfection.
Lorsque les constructions d'acide nucléique de l'invention recouvrent des microparticules, celles-ci peuvent être injectées par voie intradermique ou intraépidermique par la technique du canon à gènes, "gene gun" (WO 94/24263).
La quantité à utiliser comme médicament dépend notamment de la construction d'acide nucléique elle-même, de l'individu auquel cet acide nucléique est administré, du mode d'administration et du type de formulation, et de la pathologie. De manière générale, une quantité thérapeutiquement ou prophylactiquement efficace variant d'environ 0,1 ug à environ 1 mg, de préférence d'environ 1 ug à environ 800 ug et, de manière préférentielle d'environ 25 ug à environ 250 ug, peut être administrée à des adultes humains.
Les constructions d'acides nucléiques de l'invention peuvent être administrées par toute voie d'administration conventionnelle telle que notamment par voie parentérale. Le choix de la voie d'administration dépend en particulier de la formulation choisie.
L'invention a donc enfin pour objet une méthode de traitement thérapeutique, dans laquelle on administre à un patient nécessitant un tel traitement, une quantité efficace d'une protéine à activité de récepteur de la rénine tel que défini précédemment ou un acide nucléique codant pour cette protéine, dans le cadre d'une thérapie génique.
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Le patient visé est généralement un être humain, mais l'application peut également être étendue à tout mammifère le cas échéant.
A l'inverse, dans d'autres circonstances où l'on observe par exemple une surexpression du récepteur de la rénine, en corrélation avec un phénotype pathologique, on peut chercher à bloquer ou inhiber l'activité de ce récepteur.
L'invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un anticorps dirigé contre ledit récepteur, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable.
L'invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique comprenant une séquence anti-sens bloquant l'expression du gène codant pour le récepteur, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La formulation de ces compositions pharmaceutiques et la posologie associée sont à la portée de l'homme du métier, au vu notamment des informations données précédemment, concernant les compositions pharmaceutiques à base de protéine récepteur ou d'acide nucléique codant pour le récepteur.
L'invention a également pour objet un procédé de criblage de composés susceptibles de se lier à la protéine à activité de récepteur de la rénine selon l'invention ou au polypeptide corespondant au domaine extramembranaire de celle-ci, dans lequel on met en contact lesdits composés avec ladite protéine récepteur ou ledit polypeptide et on évalue le taux de liaison entre lesdits composés et ladite protéine récepteur.
Les nouveaux ligands obtenus ou pouvant être obtenus par ce procédé, en particulier des ligands synthétiques, font également partie de l'invention.
Ces tests de liaison peuvent être également appliqués à la détermination de la présence ou de l'absence de rénine ou de ses analogues dans un échantillon biologique, ainsi qu'à l'isolement de nouveaux ligands endogènes.
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L'invention a donc également pour objet un procédé d'identification de ligands du récepteur de la rénine comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact un échantillon biologique susceptible de contenir des ligands du récepteur avec une protéine ou un polypeptide extramembranaire selon l'invention ou une cellule hôte exprimant ladite protéine, b) isoler les complexes ligand-récepteur formés, et c) identifier les ligands du récepteur de la rénine.
Les tests de liaison utilisés dans le cadre de la présente invention peuvent être réalisés selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. On peut notamment marquer préalablement les composés susceptibles de se lier à la protéine récepteur, qui peuvent être utilisés seuls ou en compétition avec d'autres composés non marqués.
Plus particulièrement, on peut réaliser par exemple des tests de liaison compétitifs, des tests de type ELISA ou IRMA.
L'invention a également pour objet un procédé d'évaluation des propriétés pharmacologiques des composés capables de se lier à la protéine récepteur de la rénine, appelés ligands dudit récepteur, comprenant les étapes consistant à : a) cultiver des cellules exprimant ladite protéine récepteur, en présence d'au moins un ligand dudit récepteur ; et b) évaluer la capacité du ligand à moduler l'activité du récepteur.
Plus particulièrement, on peut évaluer la capacité d'un ligand à moduler l'activité du récepteur en évaluant la phosphorylation du récepteur.
La protéine récepteur de la rénine présente en effet dans sa queue cytoplasmique des résidus sérine et tyrosine phosphorylables.
On peut également évaluer la modulation de l'activité du récepteur en mesurant par exemple une modification de l'incorporation de thymidine tritiée, de la sécrétion de PAI1, de la génération de GMPC induite par
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le peptide natriurétique de type C, ou encore une modification de la vitesse de catalyse de l'angiotensinogène en angiotensine 1.
Selon une variante de ce mode de réalisation, on peut de manière avantageuse cultiver lesdites cellules en présence : - soit de concentrations accrues d'au moins un ligand du récepteur de la rénine dont le profil pharmacologique est recherché et d'une concentration déterminée d'au moins un agoniste connu de ce récepteur, tel que la rénine ou la prorénine ; - soit de concentrations accrues d'au moins un agoniste connu du récepteur de la rénine et d'une concentration déterminée d'au moins un ligand de ce récepteur dont le profil pharmacologique est recherché.
Les tests biologiques selon l'invention tels que décrits ci-dessus permettent ainsi d'évaluer le profil pharmacologique des composés testés, notamment de déterminer si les composés testés sont capables d'agir comme agonistes ou antagonistes du récepteur de la rénine selon l'invention.
Les antagonistes ou agonistes de la liaison rénine/récepteur sont en particulier des candidats particulièrement avantageux pour prévenir et/ou traiter les affections mentionnées ci-dessus, telles que notamment des affections cardiaques, rénales ou cérébrales.
Selon un mode de réalisation préféré, ces antagonistes ou agonistes de la liaison rénine/récepteur peuvent être identifiés rapidement à l'aide d'une méthode de criblage, comprenant la mise en contact d'une molécule à tester avec : (i) un premier partenaire de liaison qui est le récepteur de la rénine ou un fragment de celui-ci qui se fixe à la rénine, et (ii) un deuxième partenaire de liaison qui est la rénine ou un fragment de celle-ci qui se fixe au récepteur, le (s) dit (s) premier et/ou deuxième partenaire (s) de liaison pouvant être marqué (s) de manière à être détectés, et l'évaluation de l'inhibition ou de la stimulation de l'interaction entre lesdits partenaires de liaison par la molécule à tester.
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Pour mettre en oeuvre ces tests de liaison compétitifs, par exemple du type ELISA ou IRMA, on peut donc utiliser un fragment du récepteur qui se fixe à la rénine, à savoir tout ou partie du domaine extramembranaire du récepteur.
L'un ou l'autre de ces partenaires de liaison peut être marqué de manière détectable, les moyens de marquage des protéines étant bien connus de l'homme du métier. Il peut s'agir d'un agent de marquage fluorescent qui se lie chimiquement aux protéines sans dénaturation pour former un fluorochrome colorant qui est un indicateur immunofluorescent utile. L'agent de marquage peut aussi être une enzyme, telle que la peroxydase (HRP) ou la glucose oxydase. Des éléments radioactifs peuvent être également utilisés comme agents de marquage.
De manière préférentielle, on utilise une protéine (de préférence, 1 la rénine) fusionnée ou couplée à une protéine de type biotine, glutathion-S- transferase, poly-histidine....
L'un ou l'autre des partenaires de liaison (de préférence, le récepteur) peut être immobilisé de manière avantageuse sur une phase solide (membrane, billes, plastique...).
L'interaction entre les partenaires de liaison est donc ainsi mise en évidence par un test enzymatique, de fluorescence, ou par autoradiographie,...
Pour mettre en oeuvre ces tests de liaison compétitifs, on peut également utiliser un BIACORE@ (Biospecific Interaction Analysis CORE de la société Pharmacia). Cet appareil permet de mesurer en temps réel et sans marquage, l'interaction entre lesdits partenaires de liaison ainsi que la modification éventuelle de l'interaction en présence de la molécule à tester, par le biais de la mesure des modifications de résonance induite par toute interaction moléculaire.
Les molécules sélectionnées par cette méthode peuvent ensuite être soumises à un test de précipitation du récepteur produit dans des cellules de mammifères. Le récepteur est précipité à partir d'un lysat cellulaire grâce à la rénine et révélé par Western Blot ou par toute autre méthode suffisamment sensible.
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Les molécules dont l'activité agoniste ou antagoniste de l'interaction rénine (ou prorénine) est confirmée sont retenues pour être testées sur des cellules, telles que des cellules rénales, afin d'évaluer leur capacité à stimuler ou inhiber la multiplication cellulaire ou à modifier la composition de la matrice extracellulaire par exemple.
Alternativement, un test double-hybride ou triple-hybride de la levure peut être mis en oeuvre à cette fin (Zhang et al, 1996).
Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
LEGENDE DES FIGURES :
La figure 1 représente une analyse en Northern Blot de la distribution tissulaire de l'ARNm du clone N14F.
La figure 1 représente une analyse en Northern Blot de la distribution tissulaire de l'ARNm du clone N14F.
La figure 2A montre l'expression des sites de liaison de la rénine dans des cellules mésangiales humaines (CMH) transformées avec N14F. La saturation de la liaison du clone 2 de CMH (CMH2, D totale o non spécifique) et sur CM H (x totale, + non spécifique).
La figure 2B représente un graphique de Scatchard de la liaison de la rénine sur CMH2.
La figure 3A représente une analyse de la transcription/traduction in vitro de la protéine de fusion N14F/FLAG (système de lysat de réticulocytes couplé au TNT, Promega) marquée avec de la méthionine 35S (piste A) avec un vecteur vide de contrôle (piste B), par SDS-PAGE à 10 % et fluorographie.
La figure 3B représente la coprécipitation de la rénine liée aux cellules CMH2. Les cellules sont incubées deux heures à 37 C avec 10 nM de rénine, Iysées et le lysat est immunoprécipité avec un anticorps anti-FLAG. Le produit d'élution est séparé sur SDS-PAGE à 10 %, transféré et mis en présence d'un anticorps polyclonal anti-rénine puis révélé avec un anticorps de chèvre anti-lapin marqué au moyen de phosphatase alcaline. Piste A : rénine humaine recombinante ; piste B : membrane CMH2.
La figure 4 représente un profil de phosphorylation du récepteur de la rénine après stimulation par la rénine. Les cellules CMH2 ont été
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incubées avec de la rénine à 50 nM pendant 0, 3 et 10 minutes. Les cellules Iysées sont immunoprécipitées avec un anticorps anti-FLAG couplé à de l'agarose (SIGMA). L'agarose est élué et le produit d'élution est séparé sur un gel SDS-polyacrylamide à 10 % et transféré sur une membrane PVDF. La membrane est mise en contact avec des anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines phosphotyrosine (Chemical International), à gauche, ou phosphosérine (Sigma), à droite, et les bandes sont visualisées par chimioluminescence (système ECL, Amersham Pharmacia Biotech). EXEMPLES :
Exemple 1 :
Clonage du récepteur humain de la rénine
Les auteurs de l'invention ont criblé un million de clones d'une banque commerciale d'expression de rein humain dans des phages lambda gt 11 (Clontech) avec de la rénine humaine recombinante marquée à)' iode.
Le criblage de ces phages s'effectue comme suit : 1 x 106 pfu ont été déposés sur des E. coli dans du milieu Y1090 à une densité de 150 000 pfu pour une boîte de 245 x 245 mm. Les réplicats ont été transférés sur des membranes de PVDF pendant trois heures. Les filtres ont été lavés quatre fois dans du tampon phosphate 50 mM contenant 5 % de lait écrémé en poudre, 0,1 % de NP-40 et 0,05 % d'azoture de sodium et incubés dans le même tampon contenant de la rénine 1251 (1 x 106 cpm/ml) dans un sac scellé à chaud pendant 24 heures. Après lavage extensif, les filtres ont été séchés et exposés aux rayons X, à -70oC. La protéine de fusion lambda a été purifiée par dilution répétée et un stock de solution finale à titre élevé a été réalisé en Iysant la plaque avec 2 ml de Tris-HCI à 50 mM, pH 7,5 contenant 100 mM NaCI, 10 mM MgSO4, et 0,01 % de gélatine et deux gouttes de chloroforme. La PCR a été réalisée sur des lysats de phages, en utilisant des amorces spécifiques de lambda gt 11 et le système PCR à longue matrice Expand (Roche). Les produits de PCR ont été sous-clonés dans un vecteur pGEM T-easy (Promega) et amplifiés pour le séquençage.
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La séquence d'un clone (N14F) représentait une nouvelle protéine avec aucune homologie avec une famille quelconque de récepteurs membranaires connue. Le clone positif a été séquencé dans les deux directions en utilisant la méthode de terminaison de chaînes dideoxy. L'intégrité de l'extrémité 5'a été évaluée par amplification rapide de l'extrémité 5'de l'ADNc complémentaire par la réaction en chaîne par la polymérase (RACE) et par comparaison avec des séquences EST dans les bases de données. Le codon d'initiation est entouré de séquences consensus nucléotiques Kozak optimales et le cadre de lecture ouvert code pour une protéine de 350 acides aminés (poids moléculaire : 39,008). L'analyse de l'hydrophobicité de la séquence protéique traduite selon Kyte-Doolittle a montré deux régions hydrophobes. Une région est localisée dans la partie N-terminale (acides aminés 1-16) et est susceptible de représenter un peptide signal, l'autre séquence hydrophobe étant dans la partie C-terminale (acides aminés : 306- 326) et est susceptible de représenter une région transmembranaire. Les 24 acides aminés de la queue cytoplasmique Ser 337, Thr 343, Tyr 335 et Tyr 340 représentent des sites possibles pour la phosphorylation régularice, Tyr 335 apparaissant être le site phosphorylé potentiel le plus probable.
Exemple 2 : Expression tissulaire du récepteur de la rénine
Une membrane contenant l'ARNm poly-A+ isolée à partir de tissus humains a été obtenue auprès de Clontech. La quantité d'ARN a été ajustée de manière à ce que le signal d'hybridation de la-actinie soit d'intensité comparable dans chaque piste. Les membranes ont été hybridées et lavées en utilisant le système ExpressHyb (Clontech). Le fragment Not1-Xba1 (1,3 kb) contenant la région codante entière de l'ADNc de clone N14F a été radiomarqué avec le kit de marquage Priment (Strategene) en utilisant du 32p~ dCTP. Après hybridation, un fort signal correspondant à une bande d'ARNm de 2,4 kb a été détecté dans le coeur, le cerveau et le placenta, un signal plus
Une membrane contenant l'ARNm poly-A+ isolée à partir de tissus humains a été obtenue auprès de Clontech. La quantité d'ARN a été ajustée de manière à ce que le signal d'hybridation de la-actinie soit d'intensité comparable dans chaque piste. Les membranes ont été hybridées et lavées en utilisant le système ExpressHyb (Clontech). Le fragment Not1-Xba1 (1,3 kb) contenant la région codante entière de l'ADNc de clone N14F a été radiomarqué avec le kit de marquage Priment (Strategene) en utilisant du 32p~ dCTP. Après hybridation, un fort signal correspondant à une bande d'ARNm de 2,4 kb a été détecté dans le coeur, le cerveau et le placenta, un signal plus
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faible étant observé dans le foie, le pancréas et le rein tandis que l'ARNm était à peine détectable dans le poumon et le muscle squelettique (figure 1).
Chez la souris, l'analyse par Northern Blot avec une sonde de souris montre une forte expression du récepteur de la rénine dans le cerveau, dans l'oeil et dans le rein, et à un moindre degré dans le coeur et le foie.
Exemple 3 :
Analyse de la capacité de liaison à la rénine de cellules transfectées par l'ADNc cloné
L'identification de l'ADNc cloné à partir de la banque de rein humain a été réalisée par transfection stable de cellules mésangiales humaines immortalisées et analyse de la capacité de liaison à la rénine des cellules transfectées ainsi que des effets de la rénine sur le profil de phosphorylation du récepteur. Le fragment Not1-Xba1 dans pADNc 3.1 a été utilisé pour transfecter deux différentes lignées cellulaires mésangiales humaines (M12 : Sraer et ai, 1996 ; et CMH : Banas et al, 1999) en utilisant la méthode Fugen@ (Roche). On a observé sur les cellules M12 dérivées de cellules mésangiales humaines une liaison spécifique à la rénine marquée humaine avec une constante de dissociation (Kd) de 1 nM et 2 000 sites de liaison par cellules (Nguyen et al, 1996). Les cellules M12 ont été aussi détectées positives pour N14F par PCR utilisant des amorces dans la région codante.
Analyse de la capacité de liaison à la rénine de cellules transfectées par l'ADNc cloné
L'identification de l'ADNc cloné à partir de la banque de rein humain a été réalisée par transfection stable de cellules mésangiales humaines immortalisées et analyse de la capacité de liaison à la rénine des cellules transfectées ainsi que des effets de la rénine sur le profil de phosphorylation du récepteur. Le fragment Not1-Xba1 dans pADNc 3.1 a été utilisé pour transfecter deux différentes lignées cellulaires mésangiales humaines (M12 : Sraer et ai, 1996 ; et CMH : Banas et al, 1999) en utilisant la méthode Fugen@ (Roche). On a observé sur les cellules M12 dérivées de cellules mésangiales humaines une liaison spécifique à la rénine marquée humaine avec une constante de dissociation (Kd) de 1 nM et 2 000 sites de liaison par cellules (Nguyen et al, 1996). Les cellules M12 ont été aussi détectées positives pour N14F par PCR utilisant des amorces dans la région codante.
Huit clones de transformants stables M12 sélectionnés par résistance au G418 ont été testés. Ils ont tous montré une affinité similaire à celles des cellules parentes (de 1,9 à 3,0 nM), mais présentaient un nombre accru de sites de liaison allant de 7 000 à 36 000 sites par cellules. En revanche, les cellules CMH dérivées des cellules mésangiales foetales humaines ne liaient pas spécifiquement la rénine et n'exprimaient pas N14F ni par PCR avec des amorces spécifiques de N14F ni par analyse en Northern Blot.
Des cellules CMH, immortalisées avec un plasmide contenant un gène de résistance à la néomycine ont été transfectées avec le fragment Not1Xba1 de N14F sous-cloné dans pADNc 3.1 avec un gène de résistance à la
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zéocine et marqué ("tagué") sur l'extrémité 3'avec un peptide FLAG (Asp-TyrLys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), par introduction en PCR de la séquence (GAC- TAC-MG-GAC-GAC-GAT-GAC-MG) avant le codon stop. Deux clones des transformants stables de CMH (CMH2 et CMH4) ont été analysés pour l'expression d'un récepteur par des tests de liaison.
Les résultats montrent que ces cellules lient spécifiquement la rénine. La liaison à la rénine est réversible (100 % de rénine liée marquée aux cellules était dissociée après 1,5 à 2 heures). La liaison spécifique était inhibée par la prorénine 100 nM et la rénine préincubée avec un inhibiteur du site actif (Fischli et al, 1991). La liaison de la rénine sur les cellules transformantes est saturable avec un Kd de 5,0 nM et un Bmax de 2,8 fmole pour 100 000 cellules correspondant à approximativement 17 000 sites par cellules pour CMH2, et un Kd de 0,8 nM et un Bmax de 1,8 fmoles pour 100 000 cellules approximativement 11 000 sites par cellules pour CMH4, tandis que les cellules CMH contrôles ne présentaient aucune liaison rénine spécifique (figure 2).
La spécificité de la liaison a été en outre évaluée par des expériences de compétition avec d'autres aspartyl-protéases, la pepsine et la cathepsine D.
Exemple 4 :
Confirmation de la capacité du récepteur à lier la rénine
Pour confirmer la capacité du récepteur tagué avec le peptide FLAG à lier la rénine, les auteurs de la présente invention ont réalisé des expériences de coprécipitation des cellules incubées avec la rénine, imunoprécipitées avec un anticorps ANTI-FLAG et révélées par un anticorps anti-rénine.
Confirmation de la capacité du récepteur à lier la rénine
Pour confirmer la capacité du récepteur tagué avec le peptide FLAG à lier la rénine, les auteurs de la présente invention ont réalisé des expériences de coprécipitation des cellules incubées avec la rénine, imunoprécipitées avec un anticorps ANTI-FLAG et révélées par un anticorps anti-rénine.
Plus précisément, les cellules ont été incubées deux heures à 37 C avec 10 nM de rénine Iysée et le lysat immunoprécipité avec un anticorps anti-FLAG. Le produit d'élution a été séparé sur SDS-PAGE à 10 %, mis en contact avec un anticorps polyclonal anti-rénine et révélé par un anticorps de chèvre anti-lapin marqué à la phosphatase alcaline (figure 3).
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Pour évaluer le profil de phosphorylation du récepteur de la rénine après stimulation par la rénine, les cellules CMH2 ont été incubées avec de la rénine 50 nM pendant 0,3 et 10 minutes. Les cellules ont été Iysées dans du Tris 10 mM pH 7,4, NaCI 150 mM contenant 1 % de Triton X100, PMSF 1 mM, Trasylol 100 U/m !, EDTA 5 mM, fluorure de sodium 50 mM, et vanadate de sodium 0,2 mM. Le lysat a été immunoprécipité avec un anticorps antiFLAG couplé à de l'agarose (Sigma). L'agarose a été éluée avec de la glycine 50 mM, pH 3,5 et le produit d'elution a été séparé sur un gel SDSpolyacrylamide à 10 % et transféré sur une membrane PVDF. La membrane a été mise en contact avec des anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines-phosphotyrosine (Chemicon International) ou-phosphosérine (Sigma) et les bandes ont été visualisées par chimioluminescence.
L'analyse du profil de phosphorylation du récepteur après stimulation par la rénine a montré que le récepteur était phosphorylé sur les résidus sérines et tyrosines (figure 4). La phosphorylation des résidus sérines intervient plus rapidement que celle des tyrosines, et était déjà détectable après trois minutes d'un contact avec la rénine, tandis que la phosphorylation des résidus tyrosines apparaissait après 10 minutes. La protéine immunoprécipitée avait un poids moléculaire apparent de 44-47 kD, qui est donc plus élevé que le produit de traduction in vitro (39 kD), cette observation indiquant que des modifications post-traductionnelles étaient intervenues dans la cellule eucaryote. Les caractéristiques de liaison à la rénine des cellules transfectées de manière stable par l'ADNc N14F et la phosphorylation du récepteur induite par la rénine indiquent l'expression d'un récepteur de la rénine fonctionnelle.
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Claims (23)
1. Protéine isolée à activité de récepteur de la rénine, comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ! D n 2, ou no 8.
2. Polypeptide isolé comprenant la séquence d'acides aminés SEO ID no 4.
3. Polypeptide isolé comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID no 6.
4. Acide nucléique isolé, comprenant une séquence nucléotidique codant pour une protéine selon la revendication 1, de préférence comprenant la séquence choisie parmi SEQ ID no 1, ou no 7.
5. Acide nucléique isolé, comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon la revendication 2, de préférence la séquence SEQ ID no 3.
6. Acide nucléique isolé, comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon la revendication 3, de préférence la séquence SEQ ID no 5.
7. Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 4 à 6.
8. Cellule hôte transfectée par un vecteur selon la revendication 7.
9. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6, pour l'obtention de sondes ou d'amorces ayant au moins 15 nucléotides, qui hybrident spécifiquement avec la séquence d'acide nucléique des
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revendications 4 à 6, ou son complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation.
10. Procédé de production d'une protéine récepteur de la rénine recombinant ou d'un polypeptide fragment de celle-ci, dans lequel un vecteur contenant un acide nucléique selon l'une des revendications 4 à 6, est transféré dans une cellule hôte, qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression d'une protéine ou d'une polypeptide selon la revendication 1,2 ou 3, respectivement.
11. Anticorps dirigé contre la protéine ou le polypeptide tel que défini dans l'une des revendications 1 à 3.
12. Utilisation d'au moins un anticorps selon la revendication 11 pour la détection ou la purification d'une protéine ou le polypeptide tel que défini dans l'une des revendications 1 à 3 dans un échantillon biologique.
13. Kit comprenant : - au moins un anticorps selon la revendication 11, éventuellement fixé sur un support ; - des moyens de révélation de la formation de complexes antigènes/anticorps spécifiques entre la protéine ou le polypeptide de l'une des revendications 1 à 3 et ledit anticorps et/ou des moyens de quantification de ces complexes.
14. Procédé d'obtention d'un animal non humain dans lequel soit on invalide le gène codant pour la protéine telle que définie à la revendication 1, soit on intègre dans son génome une séquence recombinante codante pour ladite protéine.
15. Animal non humain susceptible d'être obtenu par le procédé de la revendication 14.
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16. Procédé de détection de l'expression du récepteur de la rénine dans un échantillon cellulaire ou tissulaire, comprenant les étapes consistant à : -préparer l'ARN dudit échantillon ; - mettre en contact ledit ARN obtenu avec une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec un acide nucléique tel que défini dans la revendication 4 ; - détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde, indicatrice de l'expression du récepteur de la rénine.
17. Procédé de détection in vitro de l'expression du récepteur de la rénine dans des cellules ou un tissu par hybridation in situ, comprenant les étapes consistant à : - mettre en contact lesdites cellules ou ledit tissu avec une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec un acide nucléique tel que défini dans la revendication 4 ; - détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde, indicatrice de l'expression du récepteur de la rénine.
18. Procédé de criblage de composés susceptibles de se lier à la protéine récepteur selon la revendication 1, appelés ligands dudit récepteur, dans lequel on met en contact lesdits composés avec ladite protéine récepteur ou un polypeptide selon la revendication 2 et on évalue le taux de liaison entre lesdits composés et ladite protéine récepteur.
19. Procédé d'évaluation des propriétés pharmacologiques des composés capables de se lier à la protéine récepteur selon la revendication 1, appelés ligands du récepteur de la rénine, comprenant les étapes consistant à : a) cultiver des cellules exprimant ladite protéine récepteur, en présence d'au moins un ligand dudit récepteur ; et b) évaluer la capacité du ligand à moduler l'activité du récepteur.
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20. Méthode de criblage de molécules inhibant ou activant la liaison entre la rénine et le récepteur, comprenant : - la mise en contact d'une molécule à tester avec (i) un premier partenaire de liaison qui est la protéine récepteur telle que définie à la revendication 1 ou un fragment de celui-ci capable de fixer la rénine de préférence un polypeptide selon la revendication 2, et (ii) un deuxième partenaire de liaison qui est la rénine ou un fragment de celle-ci capable de fixer la protéine récepteur telle que définie à la revendication 1, le (s) dit (s) premier et/ou deuxième partenaire (s) de liaison étant au besoin marqué (s) de manière à être détectés, - l'évaluation de l'inhibition ou de l'activation de l'interaction entre lesdits partenaires de liaison par la molécule à tester.
21. Composition pharmaceutique comprenant : i) une protéine telle que définie dans la revendication 1, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable ; ou ii) un acide nucléique tel que défini dans la revendication 4, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
22. Composition pharmaceutique comprenant : i) un anticorps dirigé contre la protéine de la revendication 1, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable ; ou ii) un acide nucléique anti-sens de l'acide nucléique tel que défini dans la revendication 4, bloquant son expression, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
23. Utilisation d'une composition pharmaceutique selon la revendication 21 ou 22 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'affections impliquant le système rénine/angiotensine.
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