FR2661112A1

FR2661112A1 - DEVICE FOR GASING A LIQUID, IN PARTICULAR FOR CELL CULTURE OXYGENATION.

Info

Publication number: FR2661112A1
Application number: FR9005064A
Authority: FR
Inventors: Almanza Sauveur; Dhainaut Frederic; Diez Ibanez Miguel; Durand Alain; Maratray Jacques; Pelletier Andre; Pelletier Bernard; Renaud Raoul
Original assignee: Spiral Recherche et Developpement
Current assignee: Spiral Recherche et Developpement
Priority date: 1990-04-20
Filing date: 1990-04-20
Publication date: 1991-10-25
Anticipated expiration: 2010-04-20
Also published as: AU7797191A; FR2661112B1; WO1991016126A1

Abstract

This liquid gassing device, applicable in particular to cytogenerators, comprises a vessel (1) containing the liquid (4), a rotating blade device (15, 16) dipping at least partially into the liquid (4) in order to stir it, a device (21) for recyling the liquid to draw it from and return it to the vessel (1); said device further comprises a disk (18) rotating above the liquid, on which converge the gasses (7) and the recycled liquid (22) driving away the latter radially by centrifugal force, and a funnel (19) arranged in relation to the disk (18) so as to receive the radially dispersed liquid and return it to the liquid surface.

Description

DISPOSITIF DE GAZAGE D'UN LIQUIDE, NOTAMMENT POUR
L'OXYGENATION DE CULTURE DE CELLULES
L t invention concerne un dispositif pour gazer un liquide, du type comportant un récipient contenant le liquide et définissant une surface de liquide, au moins un dispositif tournant à pales plongeant au moins partiellement dans le liquide pour le brasser et des moyens de recyclage du liquide.DEVICE FOR GASING A LIQUID, IN PARTICULAR FOR
OXYGENATION OF CELL CULTURE
The invention relates to a device for gassing a liquid, of the type comprising a container containing the liquid and defining a liquid surface, at least one rotating device with blades at least partially immersed in the liquid for stirring it and means for recycling the liquid. .

L'invention vise notamment les systèmes de gazage des cultures de cellules et de microorganismes supportant mal les systèmes d'aération et d'agitation classiques. Notamment les cellules animales comme tous les organismes supérieurs vivants ont besoin d'oxygène pour leur métabolisme. La plupart des microorganismes sont capables de survivre et pour certains d'entre eux de se multiplier en anaérobie mais les croissances sont ralenties de même que les métabolismes responsables des excrétions. The invention relates in particular to gassing systems of cell and microorganism cultures which do not support conventional aeration and agitation systems. In particular animal cells like all higher living organisms need oxygen for their metabolism. Most microorganisms are able to survive and for some of them to multiply anaerobically but growth is slowed down as are the metabolisms responsible for excretion.

Les cellules fonctionnant en anaérobie utilisent le glucose comme source énergétique par la voie de la glycolyse. I1 en résulte une excrétion importante d'acides organiques (acide pyruvique et acide lactique) qui diminuent le pH du milieu de culture, ce qui contribue à diminuer la croissance cellulaire, la viabilité et à diminuer par exemple l'excrétion des protéines biosynthétisées. The anaerobic cells use glucose as an energy source through the glycolysis pathway. I1 results in a significant excretion of organic acids (pyruvic acid and lactic acid) which decrease the pH of the culture medium, which contributes to decrease cell growth, viability and to decrease for example the excretion of biosynthesized proteins.

Dans les boîtes ou les flacons de culture, l'apport en oxygène au niveau cellulaire est assuré par diffusion de surface (loi de Fick). La concentration en oxygène dissous dans le milieu de culture au voisinage des cellules est alors variable. Cette concentration dépend de la nature du gaz employé pour aérer les flacons, de la température, de la pression atmosphérique, de la composition du milieu de culture, du rapport volume/surface et surtout de la biomasse. In culture dishes or flasks, the oxygen supply at the cellular level is ensured by surface diffusion (Fick's law). The concentration of dissolved oxygen in the culture medium in the vicinity of the cells is then variable. This concentration depends on the nature of the gas used to aerate the flasks, on the temperature, on the atmospheric pressure, on the composition of the culture medium, on the volume / surface ratio and especially on the biomass.

Dans les boites ou les flacons de culture, la concentration en oxygène dissous dans le milieu n'est ni mesurée, ni régulée. Dans les cytogénérateurs, il est possible d'installer un capteur afin de mesurer cette concentration. On s'aperçoit alors que l'oxygène dissous est rapidement consommé. Les cellules animales consomment entre 2 et 10.10-12 g d'02/cellule/heure ou entre 0,06 et 0,3 mmol d'02/109 cellules/heure. Suivant la biomasse présente, il est alors nécessaire d'incorporer dans le milieu de culture au moins la même quantité d'oxygène que celle qui a été consommée. In culture dishes or flasks, the concentration of dissolved oxygen in the medium is neither measured nor regulated. In cytogenerators, it is possible to install a sensor to measure this concentration. We then realize that the dissolved oxygen is quickly consumed. Animal cells consume between 2 and 10.10-12 g of 02 / cell / hour or between 0.06 and 0.3 mmol of 02/109 cells / hour. Depending on the biomass present, it is then necessary to incorporate into the culture medium at least the same amount of oxygen as that which has been consumed.

Un milieu de culture n'est capable d'incorporer qu'une certaine quantité d'oxygène dissous. En gazant de l'eau avec de l'oxygène pur à 370C, et à la pression atmosphérique, on considère que la quantité d'oxygène dissous est de 34 mg/l, ce qui correspond à la saturation du liquide pour l'oxygène dissous. Si l'on gaze le liquide avec de l'air toujours à la même température de 370C et à la pression atmosphérique, la quantité d' 2 dissous est alors de 34 x 0,21 = 7,14 mg d'O2. I1 est admis que la concentration en 2 dissous dans un milieu de culture pour cellules animales est de 7 mg/l, du fait de la présence de sels minéraux.Lors d'une étude de l'influence du X d'oxygène dissous sur la croissance cellulaire, il est apparu que la croissance optimale des cellules animales est obtenue pour des % en oxygène dissous compris entre 6 et 20 % par rapport à la saturation (c'est-à dire 34 mgO2/l) soit entre 0,2 et 0,6 mmol/l ou entre 2 et 7 mg/l. A culture medium is only capable of incorporating a certain amount of dissolved oxygen. By gassing water with pure oxygen at 370C, and at atmospheric pressure, it is considered that the amount of dissolved oxygen is 34 mg / l, which corresponds to the saturation of the liquid for dissolved oxygen . If the liquid is gassed with air always at the same temperature of 370C and at atmospheric pressure, the amount of dissolved 2 is then 34 x 0.21 = 7.14 mg of O2. It is recognized that the concentration of 2 dissolved in a culture medium for animal cells is 7 mg / l, due to the presence of mineral salts. During a study of the influence of dissolved oxygen X on the cell growth, it appeared that the optimal growth of animal cells is obtained for% of dissolved oxygen of between 6 and 20% relative to saturation (that is to say 34 mgO2 / l) or between 0.2 and 0.6 mmol / l or between 2 and 7 mg / l.

En général, les cellules sanguines ou les hybridomes nécessitent des concentrations élevées en O2 dissous alors que par exemple des cellules épithéliales et des fibroblastes nécessitent des concentrations en 2 dissous assez faibles. In general, blood cells or hybridomas require high concentrations of dissolved O2 whereas, for example, epithelial cells and fibroblasts require fairly low dissolved 2 concentrations.

La méthode connue la plus efficace pour aérer un milieu de culture est le bullage. Elle est employée pour l'oxygénation des milieux de culture pour microorganismes dans les processus de fermentation aérobie. De nombreux auteurs ont montré que le bullage avait des effets néfastes pour les cellules animales et humaines, principalement du fait des forces de cisaillement occasionnées par cette méthode d'oxygénation qui endommage les cellules dont la membrane est peu épaisse. The most effective known method for aerating a culture medium is bubbling. It is used for the oxygenation of culture media for microorganisms in aerobic fermentation processes. Many authors have shown that bubbling has harmful effects on animal and human cells, mainly due to the shear forces caused by this oxygenation method which damages cells with thin membranes.

En outre, la plupart des milieux de culture contiennent du sérum ou des fractions de sérum avec de l'albumine.In addition, most culture media contain serum or fractions of serum with albumin.

Le fait de buller dans ces types de milieux de culture provoque une mousse abondante qui risque de colmater les filtres de sortie d'air. Dans le cas de cultures sur micro-supports, ces bulles entraînent les micro-supports à la surface du cytogénérateur si bien que les cellules ne sont plus en contact avec le milieu de culture. Bien sûr, il existe sur le marché des agents antimoussants mais la plupart d'entre eux sont toxiques pour les cellules et diminuent fortement la solubilité de 11 oxygène dans le milieu de culture. I1 a été également montré que les dommages causés aux cellules étaient dus à la fois à l'éclatement des bulles à la surface et à l'augmentation des forces de cisaillement.Bubbling in these types of culture media causes an abundant foam which could clog the air outlet filters. In the case of cultures on micro-supports, these bubbles carry the micro-supports to the surface of the cytogenerator so that the cells are no longer in contact with the culture medium. Of course, there are anti-foaming agents on the market, but most of them are toxic to cells and greatly reduce the solubility of oxygen in the culture medium. It has also been shown that damage to the cells was due to both the bursting of the bubbles on the surface and the increase in shear forces.

Une autre méthode connue d'apport en oxygène utilise une membrane poreuse. I1 existe en effet des matériaux poreux laissant passer l'oxygène gazeux tels que le polyéthylène ou le silicone. Cette méthode d'oxygénation a été utilisée pour des cultures réalisées dans des cytogénérateurs de 14 1 contenant des micro-supports sur lesquels étaient fixées les cellules. Cette solution d'oxygénation au moyen de tube de silicone a été adoptée par la société BRAUN qui a développé un réacteur de 2 1 oxygéné au moyen d'un tube de silicone de 5 m dans lequel circule un mélange gazeux commandé par les régulateurs oxygène dissous et pH, lesquels font varier les pourcentages en 02, N2 et CO2 gazeux de façon à maintenir les points de consigne. Another known method of oxygen supply uses a porous membrane. I1 exists in fact porous materials letting pass gaseous oxygen such as polyethylene or silicone. This oxygenation method was used for cultures carried out in 14 l cytogenators containing micro-supports on which the cells were fixed. This oxygenation solution by means of silicone tube was adopted by the company BRAUN which developed a 2 1 reactor oxygenated by means of a silicone tube of 5 m in which circulates a gas mixture controlled by the dissolved oxygen regulators. and pH, which vary the percentages of 02, N2 and CO2 gas so as to maintain the set points.

Cette méthode permet d'oxygéner un milieu de culture sans provoquer la formation de mousse. Le transfert d'oxygène dans le milieu de culture est d'autant plus important que le mélange gazeux est riche en 02, que la paroi du tube est peu épaisse, que l'agitation est élevée et que la surpression dans le tube est importante. This method allows oxygenating a culture medium without causing foaming. The transfer of oxygen into the culture medium is all the more important as the gas mixture is rich in O 2, the wall of the tube is not very thick, the agitation is high and the overpressure in the tube is high.

La Société CRBS a fabriqué un appareil connu sous le nom d'OPTICELL qui utilise également un tube de silicone pour aérer le milieu de culture. Dans ce cas, le milieu de culture passe dans le tube de silicone qui est situé dans une enceinte dont l'atmosphère est contrôlée par les régulateurs. The CRBS Company has manufactured an apparatus known as OPTICELL which also uses a silicone tube to aerate the culture medium. In this case, the culture medium passes through the silicone tube which is located in an enclosure whose atmosphere is controlled by the regulators.

Le transfert d'oxygène au travers d'un mètre de tube de silicone de 7,7 mm de diamètre externe et 5,8 mm de diamètre interne a été évalué à 0,6 mmol 02/atmosphère/mètre de tube et par heure. I1 en résulte donc que 1 m de tube de silicone est capable d'apporter suffisamment d'oxygène à une population cellulaire comprise entre 2 et 10 109 cellules. Cette biomasse correspond à ce qu'il est possible d'obtenir à partir de culture sur des support s dans 1 litre de milieu. Donc il faut au moins 1 m de tube par litre de milieu de culture. Cela est possible à réaliser pour des réacteurs de petite dimension mais beaucoup plus difficile pour des réacteurs de dimensions plus élevées. The oxygen transfer through one meter of silicone tube with an external diameter of 7.7 mm and an internal diameter of 5.8 mm was evaluated at 0.6 mmol O 2 / atmosphere / meter of tube and per hour. It therefore follows that 1 m of silicone tube is capable of supplying sufficient oxygen to a cell population of between 2 and 10 109 cells. This biomass corresponds to what it is possible to obtain from culture on supports s in 1 liter of medium. So you need at least 1 m of tube per liter of culture medium. This is possible for small reactors but much more difficult for larger reactors.

D'autres systèmes permettent l'apport d'oxygène par perfusion au moyen d'une boucle. Other systems allow the oxygen supply by perfusion by means of a loop.

Dans ce cas, la culture est réalisée dans un réacteur et l'oxygénation dans un autre récipient. Le milieu de culture circule de l'un à l'autre au moyen de pompes. L'oxygénation est réalisée soit par augmentation de la vitesse d'agitation soit par bullage. Cette méthode d'oxygénation a été utilisée dans le cas de culture sur billes de verre et dans le cas de culture sur supports. Cette méthode peut être réalisée facilement, le régulateur en oxygène dissous commandant la vitesse de la pompe de circulation. L'inconvénient principal-de cette méthode d'oxygénation réside dans le fait qu'il est nécessaire d'avoir deux récipients pour une seule culture, d'où un coût élevé des cultures. De plus, de la mousse peut se former, ce qui peut conduire à l'arrêt de la culture dans le cas où des filtres se colmatent. In this case, the culture is carried out in a reactor and the oxygenation in another container. The culture medium circulates from one to the other by means of pumps. Oxygenation is carried out either by increasing the stirring speed or by bubbling. This oxygenation method was used in the case of culture on glass beads and in the case of culture on supports. This method can be easily carried out, the dissolved oxygen regulator controlling the speed of the circulation pump. The main drawback of this method of oxygenation is that it is necessary to have two containers for a single culture, hence the high cost of cultures. In addition, foam may form, which can lead to the stopping of the culture in the event that filters become clogged.

Il est encore possible d'augmenter l'incorporation de l'oxygène gazeux au niveau de la surface du milieu de culture en augmentant la concentration en 2 par rapport à l'air ou en augmentant la pression à l'intérieur du cytogénérateur. It is also possible to increase the incorporation of oxygen gas at the surface of the culture medium by increasing the concentration in 2 relative to the air or by increasing the pressure inside the cytogenerator.

I1 est aussi possible d'utiliser des perfluorocarbones qui permettent de solubiliser dans l'eau jusqu'à 7 fois plus d'O2. Dans ce cas, le perfluorocarbone plus dense que l'eau est pompé du fermenteur, oxygéné et réintroduit en surface. Mais il a été montré que les perfluorocarbones pouvaient avoir un effet toxique sur les cellules, en particulier en diminuant l'adhérence de celles-ci, en augmentant leur pouvoir agrégatif et en réduisant leur viabilité. It is also possible to use perfluorocarbons which make it possible to dissolve in water up to 7 times more O2. In this case, the perfluorocarbon, which is denser than water, is pumped from the fermenter, oxygenated and reintroduced on the surface. However, it has been shown that perfluorocarbons can have a toxic effect on cells, in particular by reducing their adhesion, by increasing their aggregative power and by reducing their viability.

Il est également possible de générer chimiquement l'oxygène au moyen d'enzymes (peroxydases et catalases). It is also possible to chemically generate oxygen by means of enzymes (peroxidases and catalases).

Isolément ou en complément des méthodes précitées, divers moyens de brassage du milieu, d'une part à l'interfaceliquide-gaz et d'autre part, en profondeur ont été proposés. Mais ces dispositifs, employés, seuls, exigent des vitesses de rotation élevées (par exemple 850 trs/min) pour donner une incorporation d' 2 satisfaisante. A cette vitesse malheureusement il se produit généralement des mousses gênantes, et les forces de cisaillement induites interdisent toute survie cellulaire. In isolation or in addition to the aforementioned methods, various means for mixing the medium, on the one hand with gas-interfaceliquid and on the other hand, in depth have been proposed. However, these devices, used alone, require high rotational speeds (for example 850 rpm) to give a satisfactory incorporation of 2. Unfortunately, this annoying foam is generally produced at this speed, and the induced shearing forces prevent any cell survival.

Dans tous les cas, la capacité de transfert de 1'02 gazeux en O2 dissous a été trouvée, dans des conditions d'expérimentation normales, de l'ordre de 4 h-l au plus. Cette capacité correspond à la pente de la droite obtenue en représentant l'évolution de
Ln (C /(C*CL)) en fonction du temps t, à partir de l'équation suivante, dérivée de la loi de Fick
Ln(C*/(C*-Ct)) = KLa t où : C est la concentration d'O2 à la saturation
CL est la concentration d'O2 au temps t
KL est le coefficient global de transfert de masse
par rapport au film liquide (cm/h)
a est la surface spécifique d'échange (cm2/cm3).In all cases, the transfer capacity of the O 2 gas in dissolved O 2 was found, under normal experimental conditions, of the order of 4 hl at most. This capacity corresponds to the slope of the line obtained by representing the evolution of
Ln (C / (C * CL)) as a function of time t, from the following equation, derived from Fick's law
Ln (C * / (C * -Ct)) = KLa t where: C is the concentration of O2 at saturation
CL is the concentration of O2 at time t
KL is the overall mass transfer coefficient
relative to the liquid film (cm / h)
a is the specific exchange surface (cm2 / cm3).

La capacité de transfert KLa, exprimée en h permet de connaître la vitesse de transfert de l'oxygène en mM ou ml ou mg d' 2 par unité de volume et par unité de temps. The transfer capacity KLa, expressed in h makes it possible to know the speed of transfer of oxygen in mM or ml or mg of 2 per unit of volume and per unit of time.

Le but de l'invention est de proposer un dispositif d'oxygénation qui ne présente pas les inconvénients des méthodes précitées et permette d'élever de manière appréciable la capacité de transfert en 02. The object of the invention is to propose an oxygenation device which does not have the drawbacks of the aforementioned methods and makes it possible to appreciably increase the capacity for transferring O 2.

Ce but est atteint selon l'invention dans le cadre d'un dispositif du type mentionné en tête de ce mémoire par le fait qu'il comprend en outre une première surface entràînée en rotation au dessus de la surface du liquide, sur laquelle est renvoyée au moins une partie du liquide recyclé de façon à chasser radialement celleci par l'effet de la force centrifuge, et une seconde surface disposée par rapport à la première surface de manière à recevoir la partie de liquide chassée radialement et à la retourner vers la surface de liquide. This object is achieved according to the invention in the context of a device of the type mentioned at the head of this thesis by the fact that it further comprises a first surface driven in rotation above the surface of the liquid, to which is returned. at least a portion of the liquid recycled so as to expel it radially by the effect of centrifugal force, and a second surface arranged relative to the first surface so as to receive the portion of liquid expelled radially and to return it to the surface liquid.

I1 est avantageux que la première surface soit constituée par un disque sensiblement horizontal et réglable en hauteur le long d'un arbre, et qu'il soit entraîné en rotation au moyen d'un arbre tournant portant le dispositif de brassage à pales. I1 is advantageous that the first surface is constituted by a substantially horizontal disk and adjustable in height along a shaft, and that it is rotated by means of a rotating shaft carrying the mixing device with blades.

La seconde surface est de préférence constituée par un entonnoir entourant la première surface. I1 est avantageux que cet entonnoir soit lui-même monté tournant, en étant solidaire du dispositif à pales ou directement du disque. I1 est situé au-dessus du dispositif de brassage à pales de façon que celui-ci introduise dans le milieu liquide le liquide enrichi en 2 qui s'égoutte de l'entonnoir. The second surface is preferably constituted by a funnel surrounding the first surface. I1 is advantageous that this funnel is itself rotatably mounted, being integral with the paddle device or directly from the disc. I1 is located above the paddle mixing device so that it introduces into the liquid medium the liquid enriched in 2 which drips from the funnel.

Le dispositif de brassage comporte avantageusement une roue horizontale à pales droites à demiimmergées, disposée à l'interface liquide-gaz. I1 peut aussi comporter une hélice horizontale type bateau immergée dans le liquide. Tous ces dispositifs, ainsi que le disque, sont portés par un même arbre entraîné par un moteur unique. The stirring device advantageously comprises a horizontal wheel with half-immersed straight blades, arranged at the liquid-gas interface. I1 can also include a horizontal boat type propeller immersed in the liquid. All these devices, as well as the disc, are carried by the same shaft driven by a single motor.

Le dispositif de recirculation comporte avantageusement une prise de liquide profonde, et une pompe péristaltique qui assure le recyclage du liquide dans l'entonnoir. The recirculation device advantageously comprises a deep liquid intake, and a peristaltic pump which recycles the liquid in the funnel.

L'invention convient particulièrement bien aux réacteurs dans lesquels sont cultivées des cellules ou des microorganismes supportant mal les systèmes d'aération et d'agitation classique. The invention is particularly suitable for reactors in which cells or microorganisms are cultivated which do not support conventional aeration and agitation systems.

L'invention concerne également un cytogénérateur faisant application du dispositif de gazage défini cidessus. The invention also relates to a cytogenerator applying the gassing device defined above.

En ce qui concerne les cultures de cellules, il est toujours néfaste d'agiter les cultures par quelque moyen que ce soit. I1 a été montré que des cellules soumises à des forces de cisaillement proliférent moins vite et atteignent des densités en fin de culture qui sont faibles. I1 a été montré également que les potentialités de synthèse des cellules animales et humaines sont souvent plus faibles quand celles-ci sont isolées que lorsqu'elles sont réunies, comme s'il y avait un effet de coopération. A partir de ces éléments, il faut concevoir un cytogénérateur qui permette de fixer les cellules, le milieu de culture perfusant le support. I1 faut également penser que le support doit convenir aussi bien pour la culture de cellules en suspension que pour la culture de cellules adhérentes. Les caractéristiques physiques et chimiques peuvent être définies ainsi - le support doit être inerte et ne pas relarguer de
substance toxique pour les cellules, - le support doit pouvoir être stérilisé à l'autoclave
(1250C, 30 minutes), - le support doit pouvoir laisser passer relativement
facilement le milieu de culture. I1 doit donc être
poreux, soit organisé de telle façon qu'il existe
des espaces libres (billes, cubes, cylindres...), - le support doit offrir une surface de culture par
unité de volume la plus importante possible pour
les cultures de cellules adhérentes. I1 serait
alors intéressant que le support ait une structure
poreuse, - le support doit pouvoir retenir les cellules en
suspension, - le support doit avoir une résistance mécanique suffi
sante et pouvoir se mettre facilement en forme, - le support doit si possible être réutilisable et/ ou
ne pas avoir un prix trop élevé.As far as cell cultures are concerned, it is always harmful to shake the cultures by any means. It has been shown that cells subjected to shear forces proliferate more slowly and reach densities at the end of culture which are low. It has also been shown that the potential for synthesis of animal and human cells is often lower when these are isolated than when they are combined, as if there was a cooperative effect. From these elements, it is necessary to design a cytogenerator which makes it possible to fix the cells, the culture medium perfusing the support. It should also be borne in mind that the support must be suitable both for the culture of cells in suspension and for the culture of adherent cells. Physical and chemical characteristics can be defined as follows - the support must be inert and not release
substance toxic to cells, - the support must be autoclavable
(1250C, 30 minutes), - the support must be able to pass relatively
easily the culture medium. I1 must therefore be
porous, be organized in such a way that it exists
free spaces (balls, cubes, cylinders ...), - the support must provide a growing area by
largest possible volume unit for
adherent cell cultures. He would
so interesting that the support has a structure
porous, - the support must be able to retain the cells in
suspension, - the support must have sufficient mechanical resistance
health and be able to get in shape easily, - the support must if possible be reusable and / or
not to be priced too high.

Sur la conception générale du cytogénérateur, certaines caractéristiques peuvent être précisées - le cytogénérateur doit pouvoir fonctionner en continu
(arrivée automatique du milieu de culture frais et
sortie du milieu usagé), - la température, le pH et l'oxygène dissous sont des
paramètres qui doivent être mesurés et régulés en
permanence avec des seuils de précision aussi étroits
que possible, - par le choix d'un support adéquat, le nombre de cellu
les à l'intérieur du réacteur sera important.De ce
fait, le cytogénérateur doit être muni d'un système
d'oxygénation performant assurant un bon transfert
d'O2 aux cellules, - le cytogénérateur ne doit pas être de manipulation
complexe et il faut limiter le plus possible le nom
bre de tuyaux qui sont des sources de contamination
potentielles, si les cellules sont incluses dans un support, il est
impossible d'effectuer des prélèvements stérilement
pour évaluer la biomasse. I1 faut donc trouver un au
tre moyen d'estimation.Le moyen le plus employé ac
tuellement est l'évaluation de l'oxygène consommé. I1
faut donc que le cytogénérateur soit capable d'adapter
automatiquement la vitesse de renouvellement du milieu
de culture et le débit d'arrivée du milieu frais, - le cytogénérateur doit être pilotable à distance et
pouvoir donner le plus grand nombre d'information pos
sible quant au déroulement de la culture
* ouverture des électrovannes
* consommation de bicarbonate
* consommation d'oxygène par les cellules
* débit d'arrivée du milieu frais
* vitesse d'agitation, pH, tO, p02 (concentra
tion en oxygène dissous)
* temps de culture
* débit de renouvellement du milieu.On the general design of the cytogenerator, certain characteristics can be specified - the cytogenerator must be able to operate continuously
(automatic arrival of fresh culture medium and
leaving the used medium), - temperature, pH and dissolved oxygen are
parameters that must be measured and regulated in
permanence with such narrow precision thresholds
as possible, - by choosing a suitable support, the number of cells
them inside the reactor will be important.
done, the cytogenerator must have a system
efficient oxygenation ensuring good transfer
of O2 to cells, - the cytogenerator must not be manipulated
complex and the name should be kept as small as possible
number of pipes that are sources of contamination
potential, if cells are included in a carrier, it's
impossible to sample sterile
to assess biomass. We must therefore find a
The most widely used means of estimation.
is the evaluation of the oxygen consumed. I1
therefore, the cytogenerator must be able to adapt
automatically the renewal speed of the medium
of culture and the flow rate of arrival of the fresh medium, the cytogenerator must be remotely controllable and
be able to give as much information as possible
sible about the course of the culture
* opening of the solenoid valves
* consumption of bicarbonate
* oxygen consumption by cells
* fresh medium arrival flow
* stirring speed, pH, tO, p02 (concentration
dissolved oxygen)
* culture time
* medium renewal rate.

C'est pour répondre à ces différentes exigences que l'invention propose un cytogénérateur entièrement intégré comprenant le dispositif de gazage défini plus haut. La cuve du cytogénérateur comporte une partie supérieure de relativement grande surface permettant l'intégration et l'efficacité du système d'oxygénation, et une partie inférieure constituée par un lit de supports (par exemple des billes de verre) représentant un volume assez faible, ce qui présente certains avantages : le réacteur peut être utilisé comme réacteur de laboratoire; la consommation de milieu de culture est assez faible et les réserves de milieu frais ont une autonomie plus grande. La cuve comporte un couvercle (ou platine) associé, supportant l'ensemble du dispositif tournant ainsi que les tubulures d'amenée de fluide et les diverses sondes. It is to meet these different requirements that the invention proposes a fully integrated cytogenerator comprising the gassing device defined above. The cytogenator tank has an upper part with a relatively large surface area allowing the integration and efficiency of the oxygenation system, and a lower part consisting of a bed of supports (for example glass beads) representing a fairly small volume, which has certain advantages: the reactor can be used as a laboratory reactor; the consumption of culture medium is fairly low and the reserves of fresh medium have greater autonomy. The tank has an associated cover (or plate), supporting the entire rotating device as well as the fluid supply pipes and the various probes.

I1 est prévu une conduite automatique intégrant des alarmes, des étalonnages automatiques. I1 is planned an automatic control integrating alarms, automatic calibrations.

Ce cytogénérateur de laboratoire peut être transformé en réacteur pilote uniquement en changeant la cuve et en la remplaçant par une cuve droite classique à fond hémisphérique. De ce fait, le lit de suppports se trouve augmenté. La platine et tout le système d'aération restent inchangés. This laboratory cytogenerator can be transformed into a pilot reactor only by changing the tank and replacing it with a classic straight tank with a hemispherical bottom. As a result, the support bed is increased. The stage and the whole ventilation system remain unchanged.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description suivante d'un mode de réalisation de cytogénérateur conforme à l'invention. Il sera fait référence aux dessins annexés sur lesquels
- la figure 1 est un schéma du dispositif de l'invention,
- la figure 2 est une vue de détail des moyens de brassage et d'incorporation d'oxygène.Other characteristics and advantages of the invention will emerge from the following description of an embodiment of a cytogenerator according to the invention. Reference will be made to the accompanying drawings on which
FIG. 1 is a diagram of the device of the invention,
- Figure 2 is a detailed view of the stirring and oxygen incorporation means.

- la figure 3 est un schéma d'un cytogénérateur conforme à l'invention. - Figure 3 is a diagram of a cytogenerator according to the invention.

La figure 1 montre un récipient cylindrique 1 placé dans une enceinte 2 à température contrôlée grace à une circulation d'eau thermostatée 3. Le récipient contient une solution aqueuse 4. FIG. 1 shows a cylindrical container 1 placed in an enclosure 2 at controlled temperature thanks to a circulation of thermostatically controlled water 3. The container contains an aqueous solution 4.

Un volume mort 5 est interposé entre le liquide 4 et le couvercle 6 du récipient 1. Le couvercle comporte des moyens d'entrée 7 et de sortie 8 d'un gaz sélectionné (par exemple air, 2 N2). A dead volume 5 is interposed between the liquid 4 and the cover 6 of the container 1. The cover has inlet 7 and outlet 8 means for a selected gas (for example air, 2 N2).

Une sonde 9 à oxygène dissous baigne dans le liquide 4 et est reliée à un amplificateur 10, lui-même relié à un enregistreur il. A dissolved oxygen probe 9 is immersed in the liquid 4 and is connected to an amplifier 10, itself connected to a recorder 11.

Un moteur 12, à vitesse contrôlable par des moyens 13, est monté sur le couvercle 6, et entraîne en rotation un arbre vertical 14 plongeant dans le liquide 4. A motor 12, at a speed controllable by means 13, is mounted on the cover 6, and rotates a vertical shaft 14 immersed in the liquid 4.

Sur l'arbre 14 est montée une hélice 15 à 3 pales de type bateau (et de 55 mm d'envergure dans un exemple de réalisation) tournant horizontalement au sein du liquide 4. Sur le même arbre 14, une roue à 4 pales planes verticales ou aubes 16 est calée au niveau de la surface 17 du liquide 4. Dans l'exemple de réalisation, les pales mesurent 28 x 18 mm, et le diamètre extérieur de la roue est de 85 mm. On the shaft 14 is mounted a propeller 15 with 3 boat type blades (and of 55 mm wingspan in an exemplary embodiment) rotating horizontally within the liquid 4. On the same shaft 14, a wheel with 4 plane blades vertical or blades 16 is wedged at the surface 17 of the liquid 4. In the embodiment, the blades measure 28 x 18 mm, and the outside diameter of the wheel is 85 mm.

Dans le volume mort 5, un disque horizontal 18 est calé sur l'arbre 14 et est entouré d'un entonnoir tronconique 19 convergent vers la base (diamètre supérieur : 85 mm; diamètre inférieur : 55 mm; hauteur 45 mm). Cet entonnoir est mis en rotation par le fait qu'il est solidaire soit de l'arbre 14 par des entretoises non représentées soit du plateau 18 par des entretoises non représentées, soit de la partie supérieure de la roue à pales 16. Un intervalle sépare les bords du disque 18-de la paroi interne de l'entonnoir 19 (dont le bord supérieur est situé 15 mm au-dessus du disque 18). In the dead volume 5, a horizontal disc 18 is wedged on the shaft 14 and is surrounded by a frustoconical funnel 19 converging towards the base (upper diameter: 85 mm; lower diameter: 55 mm; height 45 mm). This funnel is rotated by the fact that it is secured either to the shaft 14 by not shown spacers or to the plate 18 by not shown spacers, or to the upper part of the paddle wheel 16. An interval separates the edges of the disc 18-of the internal wall of the funnel 19 (the upper edge of which is located 15 mm above the disc 18).

Une prise 20 plonge au fond du récipient 1; une pompe péristaltique 21 raccordée à cette prise 20 aspire le liquide 4 du fond du récipient et le renvoie par une conduite 22 juste au-dessus du disque 18. A socket 20 plunges into the bottom of the container 1; a peristaltic pump 21 connected to this socket 20 sucks the liquid 4 from the bottom of the container and returns it via a pipe 22 just above the disc 18.

Le fonctionnement du dispositif est le suivant. The operation of the device is as follows.

Le moteur est mis en route et entraîne l'arbre 14. La pompe 21 assure la recirculation du liquide. Le liquide recyclé tombe sur le disque 18 et est chassé radialement par la force centrifuge : il ruisselle sur la paroi intérieure de l'entonnoir avant d'être incorporé dans le liquide 4 au niveau de la roue à pales 16. The engine is started and drives the shaft 14. The pump 21 ensures the recirculation of the liquid. The recycled liquid falls on the disc 18 and is driven out radially by centrifugal force: it trickles over the inner wall of the funnel before being incorporated into the liquid 4 at the level of the paddle wheel 16.

L'avantage du système de l'invention est que l'oxygénation du milieu de culture se fait à l'intérieur du réacteur et que plus le débit de la pompe est élevé, plus la quantité d'oxygène transféré est importante. The advantage of the system of the invention is that the oxygenation of the culture medium takes place inside the reactor and that the higher the flow rate of the pump, the greater the quantity of oxygen transferred.

Dans le cas d'une culture cellulaire, le milieu qui sera pompé au bas du réacteur sera appauvri en oxygène dissous. I1 sera alors réintroduit par l'arrivée 22, ce qui permettra à nouveau son gazage.In the case of a cell culture, the medium which will be pumped at the bottom of the reactor will be depleted in dissolved oxygen. I1 will then be reintroduced via arrival 22, which will again allow it to be gassed.

Pour mesurer les performances du système d'aération de l'invention, les conditions expérimentales ont été fixées de la façon suivante - la température de l'eau 3 : 370C - volume du tampon phosphate 4 = 4,4 1 - le débit de la pompe de recirculation 21 a été gardé
constant à 54 l/h - le débit d'air arrivant par l'entrée 7 a été gardé
constant à 60 l/h - deux vitesses de rotation du moteur 12 ont été tes
tées : 100 et 200 trs/min.To measure the performance of the aeration system of the invention, the experimental conditions were fixed as follows - the water temperature 3: 370C - volume of the phosphate buffer 4 = 4.4 1 - the flow rate of the recirculation pump 21 was kept
constant at 54 l / h - the air flow arriving through inlet 7 has been kept
constant at 60 l / h - two speeds of rotation of engine 12 have been
tees: 100 and 200 rpm.

Divers essais résumés dans le tableau I annexé ont été conduits. Les valeurs mentionnées dans ce tableau sont les valeurs de KLa en h-l. Various tests summarized in the attached Table I have been carried out. The values mentioned in this table are the values of KLa in h-l.

On peut constater qu'avec une recirculation sur le plateau, on obtient des KLa d'environ 4 h-1 à 100 trs/min et 12 h-1 à 200 trs/min. Dans ces conditions, on obtient -les valeurs de OTR ("Oxygene Transfer Rate", c'est-à-dire taux de transfert d'oxygène = KLa (C*CL)) suivantes sur la base d'un C* égal à 7 mg/l soit 30,8 mg d'O2 pour le volume total utilisé
A 100 trs/min = OTR = 123,2 mg d'O2 par heure
200 trs/min = OTR = 370,0 n
Toutes ces valeurs ont été obtenues en gazant le milieu avec uniquement de l'air.We can see that with recirculation on the plate, we obtain KLa of approximately 4 h-1 at 100 rpm and 12 h-1 at 200 rpm. Under these conditions, the following values of OTR ("Oxygene Transfer Rate", that is to say oxygen transfer rate = KLa (C * CL)) are obtained on the basis of a C * equal to 7 mg / l or 30.8 mg of O2 for the total volume used
At 100 rpm = OTR = 123.2 mg of O2 per hour
200 rpm = OTR = 370.0 n
All these values were obtained by gassing the medium with only air.

I1 est d'autre part important de noter que si le gazage s'effectue par apport d'air enrichi en oxygène ou a fortiori d'oxygène pur, la valeur de C se trouve augmentée et par là même les valeurs de OTR correspondantes. It is also important to note that if the gassing is carried out by the supply of air enriched with oxygen or a fortiori with pure oxygen, the value of C is increased and thereby the corresponding OTR values.

Par ailleurs, on a montré dans d'autres expériences que le transfert d'oxygène croît pratiquement linéairement avec la vitesse de recirculation du liquide; avec la pression à l'intérieur du réacteur. Furthermore, it has been shown in other experiments that the transfer of oxygen increases practically linearly with the rate of recirculation of the liquid; with the pressure inside the reactor.

Si on prend comme bases de calcul
10 10-12 g d'oxygène par cellule et par heure
123,2 mg d'oxygène par heure pour 4,4 1 soit
28 mg d'O2/1 x h, le système de l'invention permettra d'obtenir 2,8 milliards de cellules par litre de milieu.If we take as bases of calculation
10 10-12 g oxygen per cell per hour
123.2 mg of oxygen per hour for 4.4 1, i.e.
28 mg of O2 / 1 xh, the system of the invention will make it possible to obtain 2.8 billion cells per liter of medium.

Si on prend comme bases de calcul
2 10-12 g d'oxygène par cellule et par heure
370 mg d' 2 par heure pour 4,4 1 soit 84 mg
d'02/1 x h, le système de l'invention permettra d'obtenir 42 milliards de cellules par litre de milieu.If we take as bases of calculation
2 10-12 g oxygen per cell per hour
370 mg of 2 per hour for 4.4 1 or 84 mg
of 02/1 xh, the system of the invention will make it possible to obtain 42 billion cells per liter of medium.

Ce système présente l'avantage (par rapport à des systèmes concurrents) d'être à l'intérieur du réacteur, ce qui minimise les risques de contamination puisqu'il suffit de filtrer stérilement le gaz avant que celui-ci soit introduit dans le réacteur. This system has the advantage (compared to competing systems) of being inside the reactor, which minimizes the risks of contamination since it suffices to sterile filter the gas before it is introduced into the reactor .

Ce système fonctionne sans membrane et sans tuyau, ces derniers matériaux pouvant soit se déchirer, soit se percer. La régulation de la teneur en oxygène dissous peut être réalisée de façon classique au moyen d'un régulateur proportionnel intégral commandant des vannes tout au rien d'air, d'oxygène et d'azote. Enfin, il peut être adapté très facilement sur tous les types de réacteurs. This system works without a membrane and without a hose, the latter materials being able to either tear or be pierced. The regulation of the dissolved oxygen content can be carried out in a conventional manner by means of an integral proportional regulator controlling air, oxygen and nitrogen valves. Finally, it can be easily adapted to all types of reactors.

Diverses modifications peuvent être prévues sans sortir du cadre de l'invention. C'est ainsi que ltenton- noir 19 peut ne pas être tronconique; sa paroi interne peut être ondulée ou lisse, et munie de chicanes. En ce qui concerne la surface 18, elle peut ne pas être plane ni lisse; elle peut être munie de trous par lesquels s'écoulerait une partie du liquide recyclée, cette dernière retombant sur une ou plusieurs autres surfaces également solidaires de l'arbre 14 et à leur tour perforées (à l'exception éventuellement de la dernière surfa ce inférieure). Sur la partie de l'arbre tournant 14 lui-même située à l'intérieur de l'entonnoir peuvent venir se caler des chicanes solidaires de cet arbre. Various modifications can be provided without departing from the scope of the invention. This is how ltenton-noir 19 may not be frustoconical; its internal wall can be wavy or smooth, and provided with baffles. As regards the surface 18, it may not be flat or smooth; it can be provided with holes through which a part of the recycled liquid would flow, the latter falling on one or more other surfaces also integral with the shaft 14 and in their turn perforated (with the possible exception of the last lower surface ). On the part of the rotating shaft 14 itself located inside the funnel can be wedged baffles integral with this tree.

Quant à la roue à pales 16, le nombre de ces pales peut varier; les pales peuvent ne pas être disposées perpendiculairement à la surface du liquide et la surface des pales peut ne pas être plane.As for the paddle wheel 16, the number of these blades may vary; the blades may not be arranged perpendicular to the surface of the liquid and the surface of the blades may not be planar.

La figure 3 représente un cytogénérateur conforme à l'invention, appliquant le système de gazage décrit ci-dessus
Le cytogénérateur comprend essentiellement une cuve 101 en verre pyrex, munie d'une double enveloppe 130, 131 constituant une chemise d'eau pourvue d'une entrée 132 et d'une sortie 133 permettant la circulation d'eau thermostatée, grâce à un bain thermostaté 134 et une pompe 135.FIG. 3 represents a cytogenerator according to the invention, applying the gassing system described above
The cytogenerator essentially comprises a tank 101 in pyrex glass, provided with a double envelope 130, 131 constituting a water jacket provided with an inlet 132 and an outlet 133 allowing the circulation of thermostatically controlled water, thanks to a bath. thermostat 134 and a pump 135.

La cuve 101 comporte deux zones cylindriques superposées séparées par un raccordement tronconique. The tank 101 has two superimposed cylindrical zones separated by a frustoconical connection.

La zone inférieure 136, de plus petit diamètre (par exemple 110 mm), a un fond hémisphérique 137 dans lequel est prévue la sortie inférieure 120. Une nervure périphérique 138 permet de supporter une grille 139 audessus du fond 137. La grille 139 est destinée à retenir un lit 140 de supports. The lower zone 136, of smaller diameter (for example 110 mm), has a hemispherical bottom 137 in which the lower outlet 120 is provided. A peripheral rib 138 makes it possible to support a grid 139 above the bottom 137. The grid 139 is intended to retain a bed 140 of supports.

La zone supérieure 141, de plus grand diamètre (par exemple 230 mm) comporte à sa partie inférieure une sortie supérieure 142 destinée au pompage du milieu de culture avant qu'il ne traverse le lit 140. The upper zone 141, of larger diameter (for example 230 mm) has at its lower part an upper outlet 142 intended for pumping the culture medium before it crosses the bed 140.

La cuve 101 est fermée par une platine 106 en acier inoxydable, munie d'un joint torique et de systèmes de serrage en vue d'une fermeture hermétique. Cette platine 106 comporte les orifices nécessaires au passage des tubulures et organes qui seront décrits par la suite. The tank 101 is closed by a plate 106 in stainless steel, provided with an O-ring and clamping systems for a hermetic closure. This plate 106 has the orifices necessary for the passage of the pipes and members which will be described later.

La cuve 101 est associée au dispositif de gazage de l'invention comprenant un moteur 112 faisant tourner un arbre 114 au moyen d'un dispositif à entraînement magnétique 143, 144 assurant une parfaite étanchéité entre l'extérieur et l'intérieur de la cuve, de part et d'autre de la platine 106. Sur l'arbre 114, on retrouve le disque 118, l'entonnoir 119, la roue à 8 pales 116 et l'hélice 115 qui ne seront donc pas décrits plus en détail. The tank 101 is associated with the gassing device of the invention comprising a motor 112 rotating a shaft 114 by means of a magnetic drive device 143, 144 ensuring a perfect seal between the outside and the inside of the tank, on either side of the plate 106. On the shaft 114, there is the disc 118, the funnel 119, the 8-blade wheel 116 and the propeller 115 which will therefore not be described in more detail.

L'arrivée 107 des gaz amène à la cuve 101 par une tubulure unique des gaz provenant des sources 145 d'air, 146 d'O2, 147 de N2 et 148 de CO2, associées à des électrovannes respectives (ainsi qu'à des débitmètres et dispositifs de sécurité non représentés). Les électrovannes sont commandées par une unité électronique et informatique 149 - sous le contrôle d'un calculateur superviseur 150 (les liaisons de commande sont schématisées par des tirets). I1 est prévu une sortie 108 des gaz munie d'un condenseur à eau froide 155. The gas inlet 107 leads to the tank 101 by a single tube of the gases coming from the sources 145 of air, 146 of O2, 147 of N2 and 148 of CO2, associated with respective solenoid valves (as well as with flowmeters and safety devices not shown). The solenoid valves are controlled by an electronic and computer unit 149 - under the control of a supervisor computer 150 (the control links are shown diagrammatically by dashes). There is an outlet 108 for gases provided with a cold water condenser 155.

Diverses sondes traversent la platine 106. Ce sont
- une sonde à oxygène dissous 109 d'entrée
(c'est-à-dire par le milieu entrant dans la
cuve),
- une sonde de température 151,
- une sonde de pH 152,
- une sonde de niveau 153,
- une sonde de niveau de sécurité 154.Various probes pass through stage 106. These are
- an input dissolved oxygen sensor 109
(i.e. through the medium entering the
tank),
- a temperature probe 151,
- a pH 152 probe,
- a level 153 probe,
- a safety level sensor 154.

Ces diverses sondes communiquent leurs données à l'unité 149. These various probes communicate their data to unit 149.

I1 est prévu sous la platine 106, une chambre de mesure 156 alimentée au voisinage de son fond par une entrée 157 raccordée à la sortie inférieure 120 de la cuve au travers d'une électrovanne 158, d'une pompe 159 toutes deux commandées par l'unité 149, et d'une tubulure de retour de milieu 122. La chambre de mesure 156 possède une sortie haute 160 débouchant sur le disque 118. I1 is provided under the plate 106, a measurement chamber 156 supplied in the vicinity of its bottom by an inlet 157 connected to the lower outlet 120 of the tank through a solenoid valve 158, of a pump 159 both controlled by the 'unit 149, and of a medium return pipe 122. The measurement chamber 156 has a high outlet 160 opening onto the disc 118.

Une sonde 161 traverse la platine 106 pour pénétrer dans la chambre de mesure 156 et y déterminer l'oxygène dissous dans le milieu ayant traversé le lit 140. A probe 161 crosses the plate 106 to enter the measurement chamber 156 and determine there the oxygen dissolved in the medium having passed through the bed 140.

La sortie supérieure 142 de la cuve 101 est reliée par une électrovanne 162 et une pompe 163, commandées par l'unité 149, à un circuit utilisateur d'aval. The upper outlet 142 of the tank 101 is connected by a solenoid valve 162 and a pump 163, controlled by the unit 149, to a downstream user circuit.

Enfin, l'ensemble comprend une alimentation 164 de la cuve en milieu frais, réglée par une pompe commandée 165 ainsi qu'une alimentation 166 en bicarbonate également réglée par une pompe commandée 167. Finally, the assembly includes a supply 164 of the tank in fresh medium, regulated by a controlled pump 165 as well as a supply 166 of bicarbonate also regulated by a controlled pump 167.

Deux types de fonctionnement sont prévus
- la culture discontinue (les pompes 165 et 163 ne sont pas commandées)
- la culture continue (la pompe 165 permet l'apport à débit variable de milieu frais et la pompe 163 est actionnée par le signal délivré par la sonde de niveau 153).Two types of operation are provided
- discontinuous cultivation (pumps 165 and 163 are not ordered)
- continuous culture (the pump 165 allows the variable medium supply of fresh medium and the pump 163 is actuated by the signal delivered by the level probe 153).

Quel que soit le type de fonctionnement, l'ensemble du système fonctionne comme suit
Le réacteur contient à sa partie inférieure un lit de support 140 permettant aux cellules suivant leur type soit d'adhérer, soit d'être emprisonnées. Ce lit de macrosupport va être perfusé par le liquide de haut en bas. Pour cela, l'électrovanne 158 est ouverte; la pompe 159 à débit variable (appelée "coeur") assure la circulation du milieu de culture qui pénètre via la tubulure 11 dans la chambre 156 de mesure de la p02 sortie (sonde 161). Le milieu se déverse ensuite au centre du plateau 118 du système d'oxygénation. Whatever the type of operation, the whole system works as follows
The reactor contains at its lower part a support bed 140 allowing the cells according to their type either to adhere or to be trapped. This macrosupport bed will be perfused by the liquid from top to bottom. For this, the solenoid valve 158 is open; the pump 159 with variable flow (called "heart") ensures the circulation of the culture medium which enters via the tubing 11 in the chamber 156 for measuring the p02 output (probe 161). The medium then pours into the center of the tray 118 of the oxygenation system.

Un certain nombre de paramètres de culture sont régulés par l'intermédiaire des capteurs immergés dans le liquide, de l'armoire électronique et informatique 149 conditionnant les signaux et assurant des actions, le tout étant géré par le calculateur superviseur 150 avec des logiciels de conduite, de gestion d'alarmes, de régulation, d'exploitation des données. A certain number of culture parameters are regulated by means of the sensors immersed in the liquid, of the electronic and computer cabinet 149 conditioning the signals and ensuring actions, the whole being managed by the supervising computer 150 with driving software. , alarm management, regulation, data processing.

Les diverses régulations vont maintenant être décrites. The various regulations will now be described.

La température de l'ensemble du réacteur est régulée à la température souhaitée (en général 370C) par l'intermédiaire
- du bain thermostaté 134 comportant une résis
tance électrique commandée via l'armoire 149
et le calculateur 150 par la sonde de tempé
rature 151,
- d'une pompe 135 à débit fixe assurant la cir
culation d'eau thermostatée dans la double en
veloppe 130,131 du cytogénérateur.The temperature of the entire reactor is regulated to the desired temperature (in general 370C) via
- of the thermostatically controlled bath 134 comprising a resis
electrical voltage controlled via cabinet 149
and the computer 150 by the temperature probe
cross out 151,
- a 135 fixed-flow pump ensuring the cir
culation of thermostatically controlled water in the double
130,131 of the cytogenerator.

La sonde pH 152 immergée dans le liquide délivre un signal au calculateur superviseur 149,150. Deux types de régulation de pH sont possibles - régulation par addition de solutions acides ou basiques. Dans ce cas, le calculateur actionne deux pompes à débit fixe, - régulation par addition de CO2 ou de bicarbonate. Dans ce cas, le calculateur actionne soit l'électrovanne correspondante pour l'addition de C02, soit la pompe bicarbonate 167. The pH 152 probe immersed in the liquid delivers a signal to the supervisor computer 149,150. Two types of pH regulation are possible - regulation by adding acidic or basic solutions. In this case, the computer operates two fixed flow pumps, - regulation by adding CO2 or bicarbonate. In this case, the computer operates either the corresponding solenoid valve for the addition of C02, or the bicarbonate pump 167.

La concentration en oxygène dissous peut être régulée entre O % et 100 Z (par rapport à la saturation du milieu en oxygène) de la façon suivante - le capteur 109 (sonde p02 entrée) délivre un signal au calculateur 149,150, - le calculateur par l'intermédiaire d'un logiciel développé actionne soit les électrovannes associées aux sources de gaz 145-148, soit la vitesse d'agitation du moteur 112, soit le débit de la pompe 159. The dissolved oxygen concentration can be regulated between O% and 100 Z (in relation to the oxygen saturation of the medium) as follows - the sensor 109 (input p02 probe) delivers a signal to the computer 149,150, - the computer by l 'Intermediate software developed operates either the solenoid valves associated with gas sources 145-148, or the stirring speed of the motor 112, or the flow rate of the pump 159.

Chaque circuit de gaz est constitué de la façon suivante : Une bouteille munie d'un détendeur, un détecteur de pression permettant via le calculateur d'informer l'utilisateur sur le niveau de pression restant dans la bouteille. Each gas circuit is made up as follows: A bottle fitted with a pressure reducer, a pressure detector allowing via the computer to inform the user about the pressure level remaining in the bottle.

Ce montage permet d'avoir une sécurité de fonctionnement en alertant l'utilisateur. This arrangement provides operational safety by alerting the user.

La sonde p02 entrée 109 mesure le taux d'oxygène dissous du milieu liquide avant perfusion à travers le lit 140 contenant les cellules. La sonde pO2 sortie 161 mesure le taux d'oxygène dissous du milieu circulant après passage à travers le lit. Ce taux est inférieur à la pO2 entrée du fait de la consommation d'O2 par les cellules. Cette p02 peut être corrélée à la quantité de cellules présentes dans le lit 140. The p02 probe input 109 measures the dissolved oxygen level of the liquid medium before perfusion through the bed 140 containing the cells. The pO2 probe output 161 measures the dissolved oxygen level in the circulating medium after passage through the bed. This rate is lower than the pO2 entered due to the consumption of O2 by the cells. This p02 can be correlated with the quantity of cells present in the bed 140.

Toutefois, pour augmenter la précision de la mesure de cette différence, il est nécessaire périodiquement de vérifier ltétalonnage de la sonde p02 sortie 161 par rapport à la sonde p02 entrée 109. Pour ce faire, une procédure automatique est mise en oeuvre par le calculateur
- fermeture de l'électrovanne 158,
- ouverture de l'électrovanne 162,
- la pompe 159 continuant de fonctionner, la
sonde p02 161 en sortie, se trouve immergée
dans le liquide de la cuve comme la sonde pO2
109 à l'entrée, donc avec le même taux d'oxy
gène dissous,
- le calculateur, si besoin est, ajuste la sonde
p02 161 sur la même valeur que celle délivrée
par la sonde p02 109. La fréquence de ce
réajustement peut être choisie par l'utilisa
teur.However, to increase the accuracy of the measurement of this difference, it is necessary periodically to check the calibration of the p02 probe output 161 compared to the p02 probe 109 input. To do this, an automatic procedure is implemented by the computer
- closing of the solenoid valve 158,
- opening of the solenoid valve 162,
- the pump 159 continuing to operate, the
p02 161 probe at output, is submerged
in the tank liquid like the pO2 probe
109 at the entrance, therefore with the same rate of oxy
dissolved gene,
- the computer, if necessary, adjusts the probe
p02 161 on the same value as that delivered
by the p02 109 probe. The frequency of this
readjustment can be chosen by the user
tor.

Une fois ce réajustement effectué, fermeture électrovanne 162 et ouverture électrovanne 158. Once this readjustment has taken place, solenoid valve 162 and solenoid valve 158 open.

Enfin, la régulation de niveau fonctionne de la manière suivante. Finally, the level regulation works as follows.

Dans le cas d'une culture continue, un apport continu de milieu frais est effectué par la pompe à débit variable 165. La sonde de niveau 153 déclenche la pompe de soutirage 163 pour maintenir le volume de liquide dans la cuve constant. In the case of a continuous culture, a continuous supply of fresh medium is made by the variable flow pump 165. The level probe 153 triggers the withdrawal pump 163 to keep the volume of liquid in the tank constant.

Une sécurité a été introduite. Dans le cas d'un disfonctionnement de la pompe de soutirage 163 ou de la sonde de niveau 153, une deuxième sonde de niveau 154 a pour fonction de couper la pompe d'arrivée de milieu frais 165. Security has been introduced. In the event of a malfunction of the withdrawal pump 163 or of the level probe 153, a second level probe 154 has the function of switching off the fresh medium inlet pump 165.

TABLEAU I
Sans recirculation Recirculation sur le Recirculation dans plateau 18 le milieu 4
Configuration 100 trs/min. 200 trs/min 100 trs/min. 200 trs/min. 100 trs/min. 200 trs/min.TABLE I
Without recirculation Recirculation on the Recirculation in tray 18 the middle 4
Configuration 100 rpm. 200 rpm 100 rpm. 200 rpm. 100 rpm. 200 rpm.

Système complet 1,2 11,2 4,2 16,5 1,7 10,8
Entonnoir enlevé (19) 1,1 13,8 4,2 15,0 1,7 10,7
Plateau enlevé (18) 1,2 12,3 3,8 13,2 1,8 11,8
Pales enlevées (16) 0,5 0,6 3,8 4,0 1,0 1,0
Plateau seul (18) 0 0 2,5 2,9 0,6 0,6
Entonnoir seul (19) 0 0 2,7 2,4 0,6 0,6
Pales seules (16) 3,3 12,0 3,1 13,5 2,2 10,9
Hélice seule (15) 0 0 2,6 2,2 1,0 1,0
Pales + hélice (15 + 16) 1,2 14,2 4,0 15,0 1,70 13,5 Complete system 1.2 11.2 4.2 16.5 1.7 10.8
Funnel removed (19) 1.1 13.8 4.2 15.0 1.7 10.7
Tray removed (18) 1.2 12.3 3.8 13.2 1.8 11.8
Blades removed (16) 0.5 0.6 3.8 4.0 1.0 1.0
Tray only (18) 0 0 2.5 2.9 0.6 0.6
Funnel only (19) 0 0 2.7 2.4 0.6 0.6
Single blades (16) 3.3 12.0 3.1 13.5 2.2 10.9
Propeller alone (15) 0 0 2.6 2.2 1.0 1.0
Blades + propeller (15 + 16) 1.2 14.2 4.0 15.0 1.70 13.5

Claims

CLAIMS 1. Device for gassing a liquid, of the type comprising a container (1) containing the liquid (4) and defining a surface (17) of liquid, at least one rotating device with blades (15, 16) plunging at least partially in the liquid (4) for stirring it, a device for recycling (21) the liquid for withdrawing and returning the liquid in the container (1), characterized in that it further comprises a first surface (18) driven in rotation above the surface (17) of the liquid, on which the gases (7) arrive on the one hand and on the other hand the recycled liquid (22), so as to expel it radially by centrifugal force, and a second surface (19) disposed relative to the first surface (18) so as to receive the liquid expelled radially and to return it to the surface (17) of the liquid.

2. Device according to claim 1, characterized in that the first surface (18) is constituted by a preferably horizontal disc and adjustable in height along a shaft (14).

3. Device according to any one of claims 1 or 2, characterized in that the first surface (18) is rotated by means of a rotating shaft (14) carrying the blade device (15,16).

4. Device according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the second surface (19) is constituted by a funnel.

5. Device according to claim 4, characterized in that said funnel (19) is arranged above said paddle device (15,16).

6. Device according to claim 5, characterized in that said funnel (19) is rotated by the fact that it is secured either to the shaft (14) by spacers, or to the plate (18) by spacers either at the upper part of the paddle wheel (16).

7. Device according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the blade device comprises blades (18) half immersed.

8. Device according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the blade device comprises a propeller (15) totally immersed in the liquid (4).

9. Device according to any one of the preceding claims, characterized in that the container (1,101) comprises a sealed cover (6,106) supporting the assembly of the rotating device (12,14; 112,114), as well as pipes (166,164,108,107) fluids, and probes (109,151-154).

10. Device according to any one of the preceding claims, characterized in that the container (101) has a lower zone (136) of smaller diameter adapted to receive a bed of supports (140).