FI95285B - 2 m-plasmidivektori, menetelmä sen valmistamiseksi sekä sen käyttö - Google Patents

Description

95285 2 /xm-plasmidivektori, menetelmä sen valmistamiseksi sekä sen käyttö 5 Tämä keksintö kohdistuu hiivan erityisesti Saccharomyces ce-revisiaen geenitekniikkaan.

Se, että hiivasolut ottavat talteen eksogeenista DNA:ta sekä tämän DNA:n periytyminen ja ilmentyminen on saatu aikaan me-10 netelmällä, jota kutsutaan transformoinniksi. Transformointi selostettiin ensimmäisen kerran 1970-luvun lopulla käyttämällä menetelmiä, jotka perustuvat DNA:n lisäämiseen protoplas-teihin, mikä on aiheutettu poistamalla entsymaattisesti hiivan soluseinä (Hinnen et ai., 1978; Beggs, 1978). Myöhemmin 15 on esitetty intaktien hiivasolujen transformointi (Hisao et ai., 1983).

Hiivaa voidaan transformoida sopivilla plasmideilla; tähän tarkoitukseen käytetyt plasmidit konstruoidaan "sukkulavekto-20 reiksi", joita voidaan lisätä joko Escherichia colissa tai hiivassa (Hinnen et ai., 1978; Beggs, 1978; Struhl et ai., 1979). E. coli-plasmidi-DNA-sekvenssien inkluusio, kuten pBR322:n (Bolivar, 1978), helpottaa vektori-DNA:n määrällistä valmistamista E. colissa ja siten hiivan tehokasta transfor-25 mointia.

Plasmidit, joita käytetään yleisesti hiivatransformoin-tiin, voidaan jakaa kahteen tyyppiin: (i) replikointivek- toreihin, so. niihin, jotka kykenevät välittämään oman 30 säilymisensä hiivan kromosomaalisesta DNA:sta riippumatta DNA-repiikaation funktionaalisen alkuperän perusteella ja (ii) integrointivektoreihin, jotka perustuvat rekombinaa-: tioon kromosomaalisen DNA:n kanssa ja siten yhdistelmä- DNA:n jatkuvaan säilymiseen isäntäsolussa. Replikointi-35 vektorit voidaan jakaa lisäksi: (a) 2 μιη-perustaisiin plasmi-divektoreihin, joissa DNA-repiikaation alkuperä on johdettu hiivan endogeenisesta 2 μιη-plasmidista, (b) itsenäisesti replikoiviin vektoreihin (ARS), joissa replikaation "ilmeinen" alkuperä on johdettavissa hiivan kromosomaali-40 sesta DNA:sta ja (c) sentromeerisiin plasmideihin (CEN), 2 95285 joissa on Iisaksi yksi hiivan kromosomaalisen DNA:n DNA-rep-likaatiosekvenssin edellä mainituista alkuperistä, jonka tiedetään sisältävän sentromeerin.

Jotta hiiva voidaan transformoida tehokkaasti millä tahansa 5 edellä mainituista vektoreista, on välttämätöntä suorittaa valikointi niiden transformanttien identifioimiseksi, joissa on yhdistelmä-DNA. Tämä saavutetaan sisällyttämällä vektori-DNArhan geeni, jonka fenotyyppi on tunnistettavissa. Tapauksessa, jossa vektoreita käytetään laboratoriohiivan transfor-10 mointiin, käytetään tavallisesti prototrofisiä geenejä, kuten LEU2, URA3 tai TRP1 (Hinnen et ai., 1978; Beggs, 1978; Gerbaud et ai, 1979), isännässä olevien auksotrofisten leesioiden täydentämiseksi. Kuitenkin panimohiivaa ja muita teollisuushii-voja transformoitaessa, jotka hiivat ovat useimmiten polyploi-15 deja, eivätkä täytä auksotrooppisia vaatimuksia, on välttämätöntä käyttää valikointijärjestelmää, joka perustuu dominoivaan valikoitavaan geeniin. Tässä suhteessa replikoivien 2 μπι-perustaisten plasmidivektoreiden on kuvattu sisältävän geenejä, jotka välittävät resistanssia (i) antibiootteihin, esimer-20 kiksi G418:aan (Jiminez et ai., 1980; Webster et ai., 1983), hygromysiiniin B (Gritz et ai., 1983), kloramfenikoliin (Cohen et ai., 1980; Hadfield et ai., 1986) ja (ii) muihin toksisiin aineisiin, kuten herbisidiseen sulfometuroni-metyyliin (Falco et ai., 1985), kompaktiiniin (Rine et ai., 1983) ja kupariin 25 (Henderson et ai., 1985).

Rekombinaatiogeenien perinnöllinen stabiilius hiivassa riippuu transformaation helpottamiseen käytetyn hiivavektorin tyypistä. Vakain edellä kuvatuista kahdesta vektorijärjestelmätyy-pistä ovat integrointivektorit. Integroivan hiivatransformoin-. 30 nin periaatteet ja käytäntö on kuvattu kirjallisuudessa (Bot- stein & Davis, 1982; Winston et ai., 1983; Orr-Weaver et ai., 1983; Rothstein, 1983). Integroiva transformointi on yleisesti suhteellisen tehoton; on selostettu suljettuja sirkulaari-sia integroivia plasmideja, jotka tuottavat suunnilleen 1-10 35 transformanttia per yg DNArta (Hinnen et ai., 1979; Hicks et ai., 1979). Kuitenkin lineaarinen DNA, jonka vapaat päät si- - 95285 3 jaitsevat hiivan kromosomaalisen DNA:n kanssa homologisissa DNA-sekvensseissä, transformoi hiivaa tehokkaammin (1 00-1000-kertaisesti) ja transformoivan DNA:n on yleisesti havaittu olevan integroituneena sekvensseihin homologisesti pilkonta-5 paikan kanssa (Orr-Weaver et ai., 1981). Täten on pilkkomalla vektori-DNA sopivalla restriktioendonukleaasilla mahdollista parantaa transformaation tehokkuutta ja kohdistaa kromosomaalisen integraation paikka. Integrointitransformaatio on sovellettavissa panimohiivan geneettisen muuntamiseen, edellyttäen 10 että transformaation tehokkuus on riittävä suuri ja kohde-DNA-sekvenssi integrointia varten on alueella, joka ei hajota geenejä, jotka ovat isäntäsolun metabolismille oleellisia. Integroiva hiivavektori panimohiivaa varten on kuvattu äskettäin (Yocum, 1985).

15 Toisin kuin integrointivektorit, joilla on suuri perinnöllisen stabiiliuden taso valikoinnin puuttuessa, replikointivek-toreilla on taipumus olla epävakaampia. Perinnöllisen stabiiliuden taso riippuu käytetyn replikointivektorin tyypistä. ARS-plasmideilla, joiden kopiomäärä on suuri (noin 20-50 kopi-‘ 20 ota per solu) (Hyman et ai., 1982), on taipumus olla epäva- kaimpia, ja niitä häviää suuremmassa määrässä kuin 10 % per sukupolvi (Kikuchi, 1983). Kuitenkin ARS-plasmidien stabiiliutta voidaan lisätä liittämällä sentromeeri; sentromeeri-plasmideja on läsnä 1 tai 2 kopiossa per solu (Clarke & Car-25 bon, 1 980 ) ja niitä häviää vain noin 1 % per sukupolvi (Walmsley et ai. , 1 983). Kimeerisillä 2 μπι-perustaisilla plas-mideilla esiintyy perinnöllisen stabiiliuden vaihtelevia tasoja riippuen sekä isäntälajista että plasmidissa olevasta 2 μιη-DNA-sekvenssistä.

: 30 2 μιη-plasmidin tiedetään olevan nukleaarinen solusijainniltaan (Nelson & Fangman, 1979; Livingston & Hahne, 1979; Seligy et ai., 1 980; Taketo et ai., 1 980; Sigurdson et ai., 1 981 ), mutta se periytyy ei-mendelistisella tavalla (Livingston, 1 977). Solut, joissa ei ole 2 μιη~ρΐ38Π^Ϊ3 (cir°), ovat osoittautuneet 35 saavan alkunsa haploideista hiivapopulaatioista, joiden keskimääräinen kopiomäärä on 50 kopiota 2 μπι-plasmidia per solu 95285 4 0,001%-0,01% määrässä soluja per sukupolvi (Futcher & Cox, 1983). Mahdollinen selitys tähän perinnöllisen epästabiiliuden alhaiseen tasoon on se, että plasmidi ei saa aikaan mitään merkittävää etua soluun normaaleissa kasvuolosuhteissa (Bro-5 ach, 1981; Futcher & Cox, 1983; Sigurdson et ai., 1981), vaikka pieniä vaikutuksia kasvumääriin on raportoitu joissakin lajeissa, joissa on 2 pm-plasmidi. Eri S.cerevisiae -lajien analyysit ovat osoittaneet, että plasmidi on läsnä useimmissa hiivalajeissa (Clark-Walker & Miklos, 1974) panimohiiva mukaan 10 lukien (Tubb, 1980; Aigle et ai., 1984; Hinchliffe & Daubney, 1986). Se ilmaisee täten, että plasmidi on kaikkialla läsnäoleva, mikä osoittaa perinnöllisen stabiiliuden korkeaa tasoa luonnossa.

2 pm-plasmidin geneettinen ja molekyylianalyysi on antanut 15 runsaasti tietoa plasmidin replikaatiosta ja vakaasta säilymisestä (Volkert & Broach, 1987). Sisäiseltä olemukseltaan plasmidi koostuu 6318 emäsparin sirkulaarisesta DNA-molekyy-listä (Hartley & Donelson, 1980). Siinä on DNA:n replikaation uniikki kaksisuuntainen alkuperä (Newlon et ai., 1981), joka 20 on kaikkien 2 pm-perustaisten vektoreiden oleellinen komponentti. Plasmidi sisältää neljä geeniä REPI, REP2, REP3 ja FLP, joita tarvitaan suuren plasmidikopiomäärän vakaaseen ylläpitämiseen (Broach & Hicks, 1980; Jayaram et ai., 1983). REPI- ja REP2-geenit koodittavat trans-toimivia proteiineja, 25 joiden uskotaan toimivan yhdessä vuorovaikutuksessa REP3-lo-kuksen kanssa plasmidin vakaan osituksen turvaamiseksi solu-jakaumassa (Volkert & Broach, 1987). Tässä suhteessa REP3-gee-ni toimii cis-toimivana lokuksena, joka vaikuttaa plasmidin vakaaseen segregaatioon ja on fenotyypppisesti analoginen kro-30 mosomaalisen sentromeerin kanssa (Jayaram et ai., 1983; Kiku-chi, 1983). 2 pm-plasmidin tärkeä piirre on kahden käänteis-DNA-sekvenssikerrannaisen (kukin 559 emäsparia pitkä) läsnäolo, jotka erottavat sirkulaarisen molekyylin kahteen uniikkiin alueeseen. Käänteistoistosekvenssien molekyylien välinen 35 rekombinaatio saa aikaan yhden uniikin alueen inversion toiseen ja plasmidin kahden rakenneisomeerin sekapopulaation tuottamisen in vivo, jotka populaatiot on nimetty A:ksi ja 95285 5 B:ksi (Beggs, 1978). Kahden käänteisen toiston välisen rekom-binaation välittää geenin proteiinituote, jota geeniä kutsutaan PLP-geeniksi, ja FLP-proteiini kykenee välittämään suuren määrän rekombinaatiota käänteistoistoalueella. Tämän paikka-5 spesifisen rekombinaatiotapahtuman uskotaan saavan aikaan mekanismin, joka varmistaa plasmidikopiomäärän kasvun (Futcher, 1986; Volkert & Broach, 1986; Som et ai., 1988; Murray et ai., 1987).

Kukin käänteistoistosekvenssi käsittää kolme DNA-toistosek-10 venssialayksikköä (jotka on kuvattu kolmioina kuviossa 3), kaksi viereistä alayksikköä, jotka on keskenään suorassa orientaatiossa, ja kolmannen, joka on epäsuorassa orientaatiossa ja liittyneenä yhteen muista alayksiköistä 8 emäsparin kytkentä- tai välikealueen kautta. Tämä välikealue sisältää uniikin 15 Xbal-paikan ja tunnistaa ja on leikattu reunoistaan FLP-gee-nin tuotteella. Viereiset sekvenssit ovat tietenkin homologisia muiden käänteistoistosekvenssien vastaavien sekvenssien kanssa ja tästä johtuen ne saavat aikaan täsmällisen rekombi-naation, jota seuraa sanottu leikkaaminen. Anders et ai.

20 (1985) ovat havainneet, että 74 emäsparin sekvenssi, joka kä sittää 8 emäsparin välikealueen, on vähimmäisedellytys FLP-paikkaspesifiseile rekombinaatiolle.

Hiivavektoreita, jotka perustuvat 2 μm-plasmidin replikaatio-järjestelmään, on konstruoitu liittämällä heterologisia DNA-25 rakenteita 2 pm-plasmidin alueille, jotka eivät ole oleellisia sen replikaatiolle (Beggs, 1981). Täten on saatu aikaan kaksi vektoriperustyyppiä: (i) kokokonaisia 2 pm-vektoreita ja (ii) 2 pm-alkuperää olevia vektoreita. Ensimmäisessä tapauksessa näissä vektoreissa on kokonainen 2 pm-plasmidi, johon on in-; 30 sertoitu useita heterologisia sekvenssejä, kuten E. coli- plasmidi-DNA. Nämä plasmidit kykenevät pitämään itsensä yllä suuressa kopiomäärässä, jossa perinnäisen stabiiliuden taso on korkea sekä cir+- (2 pm sisältävä) että cir°- (2 pm puuttuva) isännissä. Toisaalta 2 pm-alkuperää olevat vektorit si-35 sältävät tavallisesti minimaalisen DNA-sekvenssin, jossa on 2 pm-alkuperää oleva DNA-replikaatio ja 2 pm:n 599 emäsparin 6 o e n p p, toiston yksittäinen kopio; tällaisia vektoreita voidaan ylläpitää vain cir+-isäntälajeissa, koska ne vaativat REPI- ja REP2-geenien koodittamia proteiineja sijoitettaviksi transiin endogeenisesta plasmidista niiden "vakaan" ylläpidon varmis-5 tamiseksi.

Kun kontruoidaan geneettisesti nodifioitu hiiva, joka kykenee ilmentämään heterologista geeniä kaupallisesti tärkeän poly-peptidin suurien tasojen tuottamiseksi, on tavallisesti toivottavaa valita suurikopiolukuinen hiivavektori. 2 pm-perus-10 täiset vektorit ovat osoittautuneet hyvin menestyksekkäästi käytettäviksi ekspressiovektoreina ja siksi ne usein muodostavat valitun vektorin (Kingsman et ai., 1985).

Euroopalaisessa patenttihakemuksessa 86303039.1 (julkaisu no 0201239 A1 Delta Biotechnology Ltd:n nimissä) kuvataan mene-1 5 telmä heterologisten proteiinien tuottamiseksi panimohiivassa, jolloin teollisuushiivalajia modifioidaan geneettisesti, jotta se kykenee ilmentämään heterologista geeniä siten, ettei primaarin olutkäymisen aikana tapahdu mitään heterologisen geenin ilmentymistä, vaan hiivabiomassa akkumuloituu ja aiheu-20 tetaan heterologisen proteiinin synteesi sen jälkeen, kun hiiva on poistettu oluesta. Tämä saavutetaan transformoimalla panimohiiva 2 pm-perustaisella plasmidilla, jossa on dominant-ti valikoitava merkitsin CUP-1 ja geeni, joka koodittaa modifioitua ihmisen seerumiproteiinia, N-metionyylialbumiinia 25 (Met-HSA), jonka ilmentymistä säädetään transkriptionaalisella tasolla galaktoosilla indusoitavalla promoottorilla. Jotta maksimoidaan heterologisen proteiinisynteesin saanto sanotun menetelmän toiminnan aikana, on välttämätöntä varmistaa: (i) ilmennettävän geenin suuri kopiomäärä (joka koodittaa Met-; 30 HSArta); (ii) mielenkiinnon kohteena olevan geenin perinnöl lisen stabiiliuden korkea taso ei-valikoivan viljelyn aikaisissa olosuhteissa; (iii) se, että rekombinaatiogeeneillä, jotka on transformoitu hiivaan, ei saa olla vahingollisia vaikutuksia hiivaan ja sen kykyyn tuottaa olutta sekä lisäksi 35 heterologista proteiinia; ja (iv) se, että hiivassa läsnäolevat rekombinaatiogeenit pitäisi, niin pitkälle kuin mahdollis-

II

7 95235 ta, rajoittaa "mielenkiinnon kohteena olevaan geeniin" ja viereisiin hiivan säätelygeeneihin. Edellytys (ii) on erityisen tärkeä, koska on sekä epäkäytännöllistä että epätoivottavaa täydentää panimohiivan normaalia viljelyväliainetta, nimittäin 5 humalaa sisältävää mallasuutetta, toksisilla aineksilla, kuten kupari-ioneilla, koska se nostaa menetelmäkustannuksia ja sillä on vahingollisia ja luultavasti ei-hyväksyttyjä vaikutuksia oluen laatuun, joka olut on käyttämisen primäärituote. Edellytyksen (iv) yhteydessä on toivottavaa, että geneettisesti mo-10 difioidussa hiivassa ei ole vieraita DNA-sekvenssejä, kuten sellaisia, jotka on johdettu rekombinaatioplasmidin bakteeri-osasta.

Hakemuksessamme, joka on julkaistu EP-A-251 744:nä, olemme kuvanneet menetelmää hiivasolujen modifioimiseksi sisällyttä-15 mällä endogeeniseen 2 pm-plasmidiin DNA-sekvenssi, joka koo-daa mielenkiinnon kohteena olevaa proteiinia tai peptidiä, valmistamalla integrointivektori, joka käsittää homologisen 2 pm-plasmidi-DNA-sekvenssin kaksi kopiota suorassa orientaatiossa, ja joka ympäröi mielenkiinnon kohteena olevaa DNA-sek-20 venssiä, transformoimalla hiivavektori sanotulla integrointi-vektorilla ja eristämällä sitten transformoidusta hiivasta saadut solut, jotka sisältävät endogeenisen 2 pm-plasmidin, joka on modifioitu sisällyttämällä siihen mielenkiinnon kohteena oleva DNA-sekvenssi. Integrointivektori ei itse säily 25 transformoiduissa hiivasoluissa. Homologiset 2 pm-DNA-sekvens-sit voivat olla, mutta eivät tavallisesti ole, 2 pm-plasmi-ditoistosekvenssin kopioita.

Olemme nyt havainneet, että mainitun hakemuksen menetelmän modifikaatiolla voidaan transformoida hiivasoluja liittämällä ; 30 modifioitu 2 pm-plasmidi.

Esillä olevan hakemuksen mukaisessa menetelmässä käytetty plasmidivektori käsittää DNA-sekvenssin, joka mahdollistaa vektorin lisäämisen bakteereihin, jotka sisältävät kahden homologisen 2 pm-plasmidi-DNA:n välissä FLP-rekombinaatiopaik-35 koja suorassa orientaatiossa, DNA-sekvenssin, joka koodaa mie- 95285 8 lenkiinnon kohteena olevaa proteiinia tai peptidiä, joka on edullisesti, mutta ei välttämättä, sekvenssi, joka on heterolo-ginen hiivan kanssa, ja edullisesti myös valikoitavan merkitsin-DNA-sekvenssin. Keksinnön mukainen 2 μπι-plasmidivektori käsittää 5 täten kolme FLP-rekombinaatiopaikan kopiota, joista yksi pari on suorassa orientaatiossa ja kaksi muuta paria ovat epäsuorassa orientaatiossa. Jos hiiva transformoidaan plasmidivektorilla, jonka rakenne on tällainen, DNA-sekvenssin, joka mahdollistaa vektorin lisäämisen bakteeriin, on havaittu häviävän spontaanis-10 ti ja plasmidivektorista tulee modifioitu 2 μιη-plasmidi, joka kykenee korvaamaan endogeenisen 2 μιη-plasmidin transformoidussa hiivassa. Tästä lähtien tällaisia plasmidivektoreita kutsutaan hajottamisvektoreiksi. Hiiva, joka on transformoitu tällaisilla vektoreilla, voi sisältää modifioidun 2 /xm-plasmidin kerrannai-15 siä ekstrakromosomaalisia kopioita, jotka sisältävät mielenkiinnon kohteena olevan geenin, mutta eivät bakteeri-DNA:ta, jonka on havaittu olevan vakaasti perinnöllinen ei-valikoivissa viljelyolosuhteissa. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

20

Bruschi (13th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Autumn 1986) selostaa, että rekombinaatio 2 μ-perustaisessa plasmidissa voi johtaa bakteeri-DNA-sekvenssien poisleikkautumiseen, mutta hän esitti, että järjestelmää voitai-25 siin käyttää DNA-molekyylin rakennetoiminnallisten suhteiden tutkimiseen. Olemme havainneet nyt, että samankaltaista järjestelmää voidaan käyttää edullisten ekspressiovektoreiden valmistamiseen, joilla vektoreilla on odottamaton stabiilius.

30 Termi "FLP-rekombinaatiopaikka" tässä käytettynä tarkoittaa mitä tahansa paikkaa, joka mahdollistaa rekombinaation vuorovaikutuksen FLP-geenituotteen kanssa tuloksena. Jos Andrewsin löydös : (1985) on oikea, niin FLP-rekombinaatiopaikka käsittää yleisesti vähintään 74 ep sekvenssin, jonka hän on identifioinut. Käytän-35 nössä ei ole merkityksellistä sisällyttää enempää kuin 599 emäs-paria kokonaisesta toistosekvenssistä.

Esillä olevan keksinnön mukainen 2μm-perustaisen hajottamis-vektorin on havaittu kykenevän transformoitumaan sekä labora- 95285 9 torio- että teollisuushiivoissa. Hajottamisvektoria ylläpidetään suuressa kopiomäärässä per solu ja sillä on äärimmäisen suuri perinnöllisen stabiiliuden taso. Lisäksi toisin kuin muut 2 pm-perustaiset plasmidit, joita on kuvattu näin pitkäl-5 le, hajottamisvektori konstruoidaan siten, että hiivan trans-formoinnin jälkeen bakteeriplasmidi-DNA-sekvenssit deletoidaan spontaanisti. Tällöin voidaan konstruoida geneettisesti modifioituja panimohiivalajeja, joissa "mielenkiinnon kohteena olevaa geeniä", joka on sisällytetty 2 pm-plasmidiin, pidetään 10 vakaana jopa ei-selektiivisen viljelyn aikana suuressa kopio-määrässä per solu elimistöön kuulumattomien bakteeriplasmidi-DNA-sekvenssien läsnäollessa. Tällaisen vektorin käyttö geneettisesti modifioidun panimohiivan konstruoinnissa varmistaa, että vain "mielenkiinnon kohteena olevaa geeniä" pidetään 15 vakaana peräkkäisiä sukupolvia varten panimohiivassa siten, että kierretään mitä tahansa potentiaalista haitallista vaikutusta, jota lisä-DNA-sekvensseillä voi olla hiivan ja/tai makuaineen tekniseen käyttäytymiseen sekä hiivalla tuotetun oluen laadullisiin piirteisiin.

20 Käytännössä "mielenkiinnon kohteena oleva geeni" voi olla mikä tahansa rekombinaatiogeeni, joka on joko homologinen tai heterogeeninen hiivan kanssa. Hajottamisvektoria voidaan käyttää esimerkiksi integroimaan vakaasti Met-HSA-geeni panimohiivassa, joka on ilmennetty joko konstitutiivisesta hiivapromoot-25 torista, esimerkiksi fosfoglyseraattikinaasipromoottorista (PGK), EP-A-147 198:ssa kuvatun menetelmän mukaisesti, tai säädetystä hiivapromoottorista, esimerkiksi GAL10/CYC1-hybri-dipromoottroista, kuten EP-A-21 0 239:ssä on kuvattu, tai GAL/-PGK-promoottorista, kuten EP-A-258 067:ssä on kuvattu.

30 Muut geenit, jotka voidaan pitää vakaina tällä järjestelmällä, käsittävät Saccharomyces diastaticuksen DEX1-geenin, joka määrittää solunulkoisen glukoamylaasientsyymin tuotannon hiivassa, ja Bacillus subtiliksen β-glukanaasigeenin, joka määrittää endo-1 ,2-1,4-B-glukanaasin tuotannon panimohiivassa 35 (Hinchliffe & Box, 1985). Tällaisia geenejä voidaan ensin modifioida geneettisesti geenin ilmentymistason säätämiseksi 10 95285 ja/tai sen varmistamiseksi, että panimohiiva erittää proteiinia, jonka synteesiä geeni välittää.

Uuden hajottamisvektorin käyttö on erityisesti edullista EP-A-201 239:ssä kuvatussa menetelmässä, koska tämän keksinnön 5 mukaisesti "mielenkiinnon kohteena olevaa geeniä" säädetään siten, että se ei ilmenny oluen käymisen aikana tai hiivakas-vun normaaleissa olosuhteissa, vaan on pikemminkin indusoitu käymisen jälkeisessä prosessissa. Niin muodoin "mielenkiinnon kohteena olevan geenin" suuren tason ilmentyminen eroaa ajassa 10 hiivabiomassan synteesistä solulisäkasvulla ja täten geenieks-pression mitkä tahansa haitalliset vaikutukset plasmidin stabiiliuteen minimoidaan.

Esillä olevan keksinnön mukainen vektori on edullisesti hajot-tamisvektori (kuten edellä määriteltiin), joka käsittää täy-15 dellisen 2 pm-plasmidin, jossa on lisäksi (i) bakteeriplasmi-di-DNA-sekvenssi, jota tarvitaan vektorin lisäämiseen bakteeri-isännässä; (ii) ylimääräinen 2 pm-FLP-rekombinaatiopaikka; (iii) DNA-sekvenssi, joka koodaa haluttua proteiinia tai peptidiä; ja (iv) valikoitava merkitsin-DNA-sekvenssi hiivatrans-20 formaatiota varten; sanotun bakteeriplasmidi-DNA-sekvenssin ollessa läsnä ja ylimääräisen FLP-rekombinaatiopaikan ollessa luotu restriktiopaikkaan, joka on yhdessä 2 pm-plasmidin kahdesta käänteistoistosekvenssistä, sanotun ylimääräisen FLP-rekombinaatiopaikan ollessa suorassa orientaatiossa suhteessa 25 sanotun yhden toistosekvenssin endogeeniseen FLP-rekombinaa-tiopaikkaan, ja bakteeriplasmidi-DNA-sekvenssin ollessa sijoitettu sanotun yhden toistosekvenssin ylimääräisen FLP-rekombinaatiopaikan ja endogeenisen FLP-rekombinaatiopaikan väliin.

Edullinen hajottamisvektori koostuu täten täydellisestä 2 pm-30 plasmidista, johon insertoidaan yksi tai useampi bakteeriplas-midi-DNA-sekvenssi ja 74 emäsparin FLP-rekombinaatiopaikan ylimääräinen kopio, joka on johdettu 2 pm-plasmidista. Lisäksi "mielenkiinnon kohteena oleva geeni", joka on kolineaarinen valikoitavan merkitsimen hiivatransformaatiota varten kanssa, 35 esim. CUP-1, insertoidaan 2 pm-plasmidin toiseen paikkaan.

II

95285 11

Bakteeriplasmidi-DNA-sekvenssit ja hiiva-DNA-toisto insertoi-daan esim. Xbal-paikkaan, kokonaisen 2 pm-plasmidin käänteis-toistojen yhteen kopioon. DNA-toiston oikea orientaatio on oleellinen plasmidin toiminnalle; plasmidi konstruoidaan si-5 ten, että DNA-lisäämiseen tarvittava bakteeriplasmidisek-venssi, esim. E. coli, sijoitetaan 2 pm-plasmidin FLP-rekom-binaatiopaikan kahden kopion väliin, joka ovat suorassa orientaatiossa. DNA-sekvenssien konfiguraatio on selostettu kuviossa 3 ja sitä on selostettu yksityiskohtaisemmin jäljempänä yk-10 sityiskohtaisemmin. Tämä konstruktio rajoittaa bakteeriplas-midi-DNA-sekvenssit alueelle, joka, kun plasmidi transformoidaan hiivaan, leikkautuu plasmidista paikkaspesifisen rekom-binaatiotapahtuman johdosta kahden suoraan orientoituneen DNA-toiston välistä. Tämä paikkaspesifinen rekombinaatio välittyy 15 2 pm:n FLP-geenin tuotteella, jonka tuotetta voidaan välittää joko hiivan endogeenisellä 2 pm-plasmidilla cir+-soluja transformoitaessa tai itse hajottamisvektorilla transformoitaessa cir°-soluja. Koska keksinnön mukaisia vektoreita voidaan käyttää kypsyttämään transformoitu hiiva endogeenisiksi 2 pm-plas-20 mideiksi ja koska rekombinaatio on nopeampi cir°-soluissa, on edullista, että keksinnön mukainen vektori perustuu täydelliseen 2 pm-plasmidiin. Jos kuitenkin keksinnön mukaisen vektorin on esiinnyttävä endogeenisten 2 pm-plasmideiden kanssa, niin silloin sellaisten geenien, kuten REPI , REP2, REP3 ja FLP 25 ei tarvitse olla läsnä vektorissa, koska näiden geenien tuotteet voidaan välittää transiin; kaikki tämä on välttämätöntä replikaation alulle.

Kuten jäljempänä kuvataan yksityiskohtaisesti, insertoitu DNA, jossa on bakteerisekvenssejä, voi sisältää kummassakin päässä 30 toistosekvenssin vastaavan osan, jossa tapauksessa sanottu DNA insertoidaan endogeeniseen toistosekvenssiin, siten että en-dogeeninen rekombinaatiopaikka tuhotaan vaikuttavasti mutta muodostetaan kaksi uutta FLP-rekombinaatiopaikkaa, jotka kumpikin käsittävät endogeenisen rekombinaatiopaikan osan ja 35 komplementaarisen osan insertoidusta DNAista. Vaihtoehtoisesti täydellinen FLP-rekombinaatiopaikka voi olla insertin toista päätä kohti, joka insertti insertoidaan sitten endogeenisen 12 S 5285 toistosekvenssin viereen tai välimatkan päähän siitä siten, että bakteeri-DNA sijaitsee endogeenisen toistosekvenssin ja insertoidun toistosekvenssin välissä. Jos insertoitu DNA in-sertoidaan paikkaan, joka sijaitsee välimatkan päässä endogee-5 nisestä sekvenssistä, endogeenisen toistosekvenssin ja insertoidun toistosekvenssin välinen endogeeninen DNA leikkautuu myöhemmin pois bakteeri-DNA:n kanssa. Tästä johtuen jos tätä DNA:ta tarvitaan, sen lisäkopio täytyy saada aikaan (edullisesti insertoituun DNA:hän) insertoidun toistosekvenssin puo-10 leelle etäälle endogeenisesta toistosekvenssistä.

Integraalisessa 2 μιη-plasmidissa sijaitseva paikka, johon "mielenkiinnon kohteena oleva geeni" insertoidaan, valitaan ottaen huomioon insertion vaikutuksen plasmidin kopiomäärään ja perinnölliseen stabiiliuteen minimointi. Täten on edullista 15 insertoida "mielenkiinnon kohteena oleva geeni" paikkaan, joka ei hajota REPI :n, REP2:n, REP3:n ja FLP-geenien eheyttä, erityisesti jos plasmidi on tarkoitettu käytettäväksi hiivan cir°-isäntälaj in transformointiin.

Hajottamisvektorin eräänä edullisena piirteenä on se, että jos 20 se viedään cir+-hiivalajeihin, se kykenee, koska siinä on in-tegraalinen 2 pm-plasmidi, vapauttamaan endogeenisen 2 pm-plasmidin joko bakteeripalsmidisekvenssien poisleikkautumisen aikana tai sen jälkeen. Äskettäin on raportoitu analogisesta tilanteesta kokonaisten 2 pm-vektoreiden yhteydessä, jotka 25 vektorit on transformoitu hiivan cir+-isäntäsoluihin (Harford & Peters, 1987). Täten hajottamisevektoria voidaan käyttää myös endogeenisen 2 pm-plasmidin vapauttamiseen hiivalajeista.

Oheen liitetyissä piirroksissa kuvio 1 esittää plasmidia pBA112 (Andrews et ai.,1985). Ohut 30 viiva esittää DNA-sekvenssejä, jotka on johdettu bakteeriplas-midista pUC9; avoin tanko esittää 74 emäsparin DNA-fragment-tia, joka sisältää FLP-rekombinaatiopaikan; kolmiot esittävät kolmen sisäisen DNA-toiston orientaatiota kussakin FLP-rekom-binaatiopaikassa (Andrews et ai., 1985); 35 kuvio 2 esittää plasmidia pSAC112. Plasmidi pSAC112 on ident- 13 55285 tinen pBA112 kanssa paitsi, että BamHI-, PstI- ja HindIII-pai-kat on deletoitu; kuvio 3 esittää plasmidia pSAC3. Paksu viiva esittää DNA-sek-venssejä, jotka ovat peräisin bakteeriplasmidista pUC9; avoi-5 met tangot esittävät 74 emäsparin DNA-fragmenttia, joka sisältää FLP-rekombinaatiopaikan; ohut viiva esittää 2 pm-plasmidi-DNA-sekvenssejä; kolmiot osoittavat kolmen sisäisen DNA-tois-ton orientaatiota kussakin FLP-rekombinaatiopaikassa; kuvio 4 esittää plasmidia pSAC3Ul. Merkinnät ovat samat kuin 10 kuviossa 3; kuvio 5 on pSAC3U2:n plasmidikartta. Merkinnät ovat samat kuin kuviossa 3; kuvio 6 on pSAC300:n plasmidikartta. Merkinnät ovat samat kuin kuviossa 3; 15 kuvio 7 on pSAC310:n plasmidikartta. Merkinnät ovat samat kuin kuviossa 3; kuvio 8 on pSAC3C1:n plasmidikartta. Merkinnät ovat samat kuin kuviossa 3; kuvio 9 perustuu valokuvaan, joka esittää haploidihiivalajien 20 kasvua ja selventää URA3:n ja bakteeri-bla-geenin rinnakkais-periytyrnistä; ja kuvio 10 on kokonaishiiva-DNA:n autoradiografi, joka on tutkittu 32p_merjcityllä pSAC3-DNA: 11a.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

: 25 ESIMERKKI 1

Plasmidien konstruktio pSAC112 (kuvio 2) konstruoitiin hajottamalla plasmidi pBAl12 (kuvio 1, Andrews et ai., 1985) samanaikaisesti restriktioen-donukleeaseilla BamHI ja Hindlll. Lineaarista plasmidi-DNA:ta 30 käsiteltiin DNA-polymeraasi I:llä (Klenow) 0,3 mM dNTPiiden (dATP, dTTP, dCTP ja dGTP) läsnäollessa 10 minuuttia 37° C:s-sa. DNA uutettiin fenolirkloroformilla, etanolipresipitoitiin ja inkuboitiin yön yli 15° C:ssa T4-DNA-ligaasin läsnäollessa. Ligatoitu DNA transformoitiin E. coli -lajiin MC1061 (Casada-35 ban ja Cohen, 1980); plasmidi pSAC112 eristettiin tulokseksi ·. saaduista transformanteista, mitä seurasi identifiointi ja 14 95285 karakterisointi Birnboimin ja Dolyn (1980) menetelmällä.

Plasmidi pSAC3 (kuvio 3) konstruoitiin seuraavalla menetelmällä. Hiiva-2 μιη-plasmidi eristettiin lajista DRI9, kuten Gueri-neau et ai., (1984) ovat kuvanneet. Puhdistettu 2 pm-plasmidi-5 DNA hajotettiin osittain restriktioendonukleaasilla Xbal, kuten Maniatis et ai., (1982) ovat kuvanneet ja ligatoitiin Xbalrllä pilkottuun pSAC11 2reen. Ligatoitu DNA transformoitiin E. coli -lajiin AG1 (saatu NBL Enzymes Ltdrstä, Cramlington, Englanti). Tulokseksi saadut ampisilliiniresistantit transfor-10 mäntit seulottiin homologian 2 μιη-plasmidi-DNA:n kanssa toteamiseksi, mitä seurasi koloniahybridointi (Grunstein ja Hog-ness, 1975) 32p_mer]cittyyn 2,2 kiloemäsparin EcoRI-fragment-tiin, joka on peräisin plasmidista pYF92 (Storms, R.K et ai., 1979). Koloniat, jotka ovat homologisia 2 pm-spesifisen DNA-15 koettimen kanssa, eristettiin ja niiden plasmidi-DNA karakterisoitiin restriktioendonukleaasikartoitusmenetelmillä. Täten saatiin plasmidi pSAC3.

Plasmidit pSAC3Ul (kuvio 4) ja pSAC3U2 (kuvio 5) konstruoitiin pilkkomalla plasmidi pSAC3 restriktioendonukleaasilla Pstl.

20 Lineaarinen DNA tasoitettiin käsittelemällä T4-DNA-polymeraa-silla 0,3 mM dNTPriden (dATP, dTTP, dCTP ja dGTP) läsnäollessa 10 minuuttia 37° Crssa. DNA uutettiin fenolirkloroformilla ja etanolipresipitoitiin ennen ligaatiota. Plasmidi pJBl10 (Beggs, 1981) hajotettiin restriktioendonukleaasilla Hindlll 25 ja DNA-fragmentit alistettiin agaroosigeelielektroforeesiin 1-%:isella geelillä. 1,1 kilomäsparin DNA-Fragmentti, jossa on hiivan URA3-geeni, eristettiin geelistä (Maniatis et ai., 1982) ja se käsiteltiin DNA-polymeraasi Irllä (Klenow) 0,3 mM dNTPriden (dATP, dTTP, dCTP ja dGTP) läsnäollessa. 1,1 kilo-30 emäsparin HindIII-fragmentti uutettiin fenoli:kloroformilla, etanolipresipitoitiin ja ligatoitiin tylppäpäisenä lineaariseen pSAC3-DNA:han, joka oli valmistettu, kuten edellä kuvattiin. Ligatoitu DNA transformoitiin E. coli -lajiin AG1. Tulokseksi saadut ampisilliiniresistantit transformantit seulot-35 tiin homologian URA3-geenin kanssa toteamiseksi, mitä seurasi koloniahybridointi (Grunsteinja Hogness, 1 975) ^2P-merkittyyn il 15 55285 1,1 kiloemäsparin HindIII-fragmenttiin, joka on puhdistettu plasmidista pJBlIO. Plasmidit pSAC3Ul (kuvio 4) ja pSAC3U2 (kuvio 5) eristettiin kolonioista, jotka olivat homologisia URA3-geenikoettimen kanssa, 1,1 kiloemäsparin HindiII-DNA-5 fragmentti, jossa oli URA3-geeni, ligatoitiin myös tylppäpäisenä pSAC3:n uniikkeihin EagI- ja SnaBI-paikkoihin plasmidien, jotka on nimetty pSAC300jksi (kuvio 6) ja pSAC310:ksi (kuvio 7) vastaavasti, saamiseksi.

Plasmidi pSAC3C1 (kuvio 8) konstruoitiin ligatoimalla tylppä-10 päisenä 694 emäsparin Xbal-Kpnl-DNA-fragmentti, jossa on plasmidista pET13:1 peräisin oleva CUPI-geeni (Henderson et ai., 1985), pSAC3:n uniikkiin Pstl-paikkaan.

Hiivan transformointi plasmideilla pSAC3Ul ja pSAC3U2 Hajottamisvektorit pSAC3Ul (kuvio 4) ja pSAC3U2 (kuvio 5) 15 konstruoitiin siten, että kumpikin sisältää valikoitavan hii-vageenin URA3 insertoituna 2 μιη-Β-muodon uniikkiin Pstl-paikkaan. Lisäksi kussakin plasmidissa on bakteeriplasmidista pUC9 johdettuja DNA-sekvenssejä, joiden sivulla on FLP-rekom-binaatiopaikan kaksi kopiota sijoittuneena oikeassa orientaa-20 tiossa. pUC9-DNA:n asema on sellainen, että näiden kahden suoraan orientoidun FLP-rekombinaatiopaikan välinen FLP-välittei-nen rekombinaatio saa aikaan bakteeriplasmidi-DNA:n poisleik-kautumisen hiivan transformoinnin jälkeen. Haploidihiivalajin S150-2B cir+- ja cir°-johdannaiset (Cashmore et ai., 1986) 25 transformoitiin urasiiliprototrofiaan plasmideilla pSAC3U1 ja pSAC3U2 Iton (1 983) menetelmän mukaisesti. URA1-transformantit seulottiin bakteeri-bla-geenin, joka koodittaa B-laktaamispe-sifistä entsyymi-S-laktamaasia hiivassa, rinnakkaisperiytyvyy-den toteamiseksi Chevalierin ja Aiglen (1979) menetelmällä. 30 Kuviossa 9 esitetyt tulokset osoittavat, että kumpikin plasmidi segregoi bla-geenin URA+-geenistä kaikissa cir°-lajin transformanteissa, mikä osoittaa bakteeri-DNA-sekvenssien de-leetion plasmideista hiivatransformoinnin jälkeen. Kuitenkin suurimman osan cir°-lajin URA+-transformanteista havaittiin 35 rinnanperivän bla-geenin (15 20:stä ja 18 20istä pSAC3Ul:stä . ja pSAC3U2:sta vastaavasti). Nämä tiedot osoittavat, että 16 95235 plasmidihajottamisen tehokkuus, so. bakteeriplasmidi-DNA-sek-venssien FLP-välitteinen poisleikkautuminen, on suurempi cir°-lajin transformoinnin jälkeen kuin cir+-lajin transformoinnin j älkeen.

5 Transformanttien molekyylianalyysi

Jotta määritetään, ovatko URA+-transformant it, jotka segregoi-vat bla-geenin (so. β-laktamaasinegatiiviset kloonit, bla~) menettäneet bla-geenin ja viereiset bakteeriplasmidisekvens-sit, analysoitiin hiiva-DNA. pSAC3U1 llä ja pSAC3U2:lla transit) formoitujen cir+- ja cir°-lajien kahta URA+ bla--transformant-tia viljeltiin valikoivassa minimaalisessa väliaineessa, josta puuttui urasiili ja kokonais-DNA uutettiin seuraavalla menetelmällä. Aktiivisesti kasvavat solut kerättiin ja suspen-doitiin uudelleen 5 ml:ssa 1 M sorbitolia, 0,025 M etyleenidi-15 amiini-tetraetikkahappoa (EDTA) pH 8,0, 8 mg/ml diotiotreito-lia 28° C:ssa 15 minuuttia. Solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen 5 ml:ssa 1,2 M sorbitolia, 0,1 M natriumsitraattia, 0,01 M EDTA:a, pH 5,8, 0,025 μΐ/ml tsymolyaasia (Kirin Brewery Co, Ltd.) 28° C:ssa, kunnes saatiin protoplastit. Protoplastit 20 pestiin kolmesti 1,2 M:ssa sorbitolia ennen uudelleensuspen-dointia 1 ml:ssa 3 % sarkosyyliä, 0,5 M tris/HCl:a, pH7, 0,2 M EDTA:a, 100 μΐ/ml proteinaasi K:ta 55° C:ssa 60 minuuttia. DNA-valmisteet uutettiin kloroformi : isopropanolilla, fenolilla, kloroformilla ja eetterillä ennen dialysointia 10 mM 25 tris/HCl:a, 1 mM EDTA:a, pH 7, vasten. Kokonaishiiva-DNA hajotettiin restriktioendonukleaaseilla EcoRI, Xbal ja PstI ja DNA-fragmentit erotettiin agaroosielektroforeesilla. Sen jälkeen Southern transfer (Maniatis et ai., 1982) -kokonaishiiva-DNA hybridoitiin 32p_mer]cittyyn pSAC3-DNAihan. Tulokset on 30 esitetty kuviossa 10, joka on kokonaishiiva-DNAin, joka on testattu 32p_merjcityllä pSAC3-DNA: 11a, autoradiografi. DNA eristettiin S150-2B cir+-lajeista, jotka on transformoitu plasmideilla pSAC3U1 japSAC3U2. Kunkin laji/plasmidikombinaa-tion kaksi Atksi ja B:ksi nimettyä itsenäistä transformanttia 35 analysoitiin. DNA hajotettiin restriktioendonukleaasilla seuraavasti: Xbal, kaistat 1-4 ja 21-24; PstI, kaistat 5-12; EcoRI, kaistat 13-20.

li ,7 95285

Kaista Plasmidi cir+/cir° IsolaattKA/B)

6, 14, 22 PSAC3U1 cir+ A

8, 16, 24 pSAC3Ul cir+ B

5, 13, 21 pSAC3Ul cir° A

5 7, 15, 23 pSAC3Ul cir° B

2, 10, 18 pSAC3U2 cir+ A

4, 12, 20 pSAC3U2 cir+ B

1, 9, 17 pSAC3U2 cir° A

3, 11, 19 pSAC3U2 cir° B

10 Hiivan endogeenisessa 2 pm-plasmidissa esiintyvien tunnettujen restriktiopaikkoj en (Hartley ja Donelson, 1 980) sekä yhdistel-mäplasmidien pSAC3Ul ja pSAC3U2 perusteella voidaan ennustaa hybridisaatiokaava plasmidille pSAC3. Ennustettu hybrisaatio-kaava on esitetty taulukossa 1.

15 Taulukko 1 S150-2B cir+- ja cir°-johdannaisten, jotka on transformoitu pSAC3U1:llä ja pSAC3U2:lla pSAC3:een, odotettu hybridisaatiokaava .

Plasmidi-DNA Restriktionukleaasifragmentit 20 (kiloemäsparia)

EcoRI Xbal PstI

2 pm (endogeeninen) 4,1 3,2 6,3 3,9 3,1 2,4 25 2,2 PSAC3U1 ja 5,3 4,3 10,2 pSAC3U2 (intakti) 4,1 3,2 0,72 2,8 pSAC3U1 ja (5,0) 4,3 7,4 18 95285 pSAC3U2 (hajotettu) 4,1 3,2 3,3 (2,4)

Sulkeissa olevat luvut esiintyvät, jos hajotetut plasmidit 5 ovat joutuneet FLP-välitteiseen keskinäiseen muuntamiseen.

Jos verrataan hybridisaation tulosta (kuvio 20) odotettuihin tuloksiin (taulukko 1 ), voidaan nähdä, että kussakin transfor-mantissa yhdistelmäplasmidi on kokenut deleetion, joka on yhdenmukainen bakteeriplasmidi-DNA-sekvenssien poisleikkautumi-10 sen kanssa, joka sisältyi suoraan orientoituneisiin FLP-rekom-binaatiopaikkoihin. Lisäksi pSAC3U2/B:ksi nimettyjen transfor-manttien tapauksessa lajin S150-2B endogeeninen 2 pm-plasmidi ei ole enää läsnä. Se tarkoittaa, että cir+-laji saa aikaan plasmidin pSAC3U2 kanssa endogeenisen 2 μπι-plasmidin kypsymi-15 sen.

Lisänäyttö, että plasmideista pSAC3Ul ja pSAC3U2 leikkautuu bakteeriplasmidi-DNA pois hiivan transformoinnissa, saatiin hybridoimalla edellä mainitut DNA-valmisteet 32p_mer)cittyyn pUC9-DNA:han (Vieira ja Messing, 1982). URA+ bla“-transforman-20 tit eivät hybridoidu tähän DNA-koettimeen.

Plasmidit pSAC300, pSAC310 ia pSAC3C1 hajoavat hiivatransformoinnissa jälkeen • URA+-plasmideita pSAC300 ja pSAC310 käytettiin S150-2B:n cir+- ja cir°-johdannaisten transformointiin ja tulokseksi 25 saatujen transformanttien URA-ja bla-fenotyypit määriteltiin. Kaikissa tapauksissa havaittiin hajonnut fenotyyppi; täten plasmidit pSAC300 ja pSAC310 kykenevät leikkaamaan pois bak-teerivektori-DNA:n hiivatransformoinnissa. Tässä suhteessa havaittiin, että plasmidi pSAC300 nosti Sl50-2B:n cir°-johdan-30 naisen bla-transformanttien osuutta merkittävästi. Tähän ei tiedetä selitystä. Kuitenkin on mahdollista, että Eagl-paikan hajottaminen URA3-geenin insertoinnilla pSAC300:aan on saattanut interferoida viereisen FLP-geenin ilmentymisen kanssa aiheuttaen FLP-rekombinaasin yli-ilmentymisen.

II

19 95285

Plasmidi pSAC3Cl valmistettiin käytettäväksi kupariherkän teollisuushiivan ja erityisesti panimohiivan transformoinnis-sa. Täten pSAC3C1 transformoitiin Bass-lagerhiivan tavaramerkkilajein, joka on nimetty BB11,0:ksi, ja jonka ovat kuvanneet 5 Hinchliffe ja Daubney (1986). Kupariresistantit transforman-tit tarkistettiin sitten B-laktamaasilevytestillä bla-fenotyy-pin läsnäolon toteamiseksi. Noin 18 % testatuista transforman-teista oli bla~-kupariresistantteja, osoittivat plasmidin pSAC3C1 hajottamista in vivo panimohiivaisannassa.

10 Plasmidien pSAC300, pSAC310 ja pSAC3d in vivo -hajottaminen vahvistettiin seuraavaksi sopivien isäntälajien, joilla on hajotettu fenotyyppi, täydellisellämolekyylikarakteroinnilla. Kun kokonaishiiva-DNA oli hybridoitunut 32p_puc9-DNA:han, kuten aikaisemmin kuvattiin, ei bla~-johdannaisissa voitu havai-15 ta mitään homologiaa.

"Hajotettujen" transformanttien plasmidistabiilius Sl50-2B:n, jossa on pSAC3Ul :n ja pSAC3U2:n, pSAC300:n ja pSAC310:n hajotettuja johdannaisia, cir+- ja cir°-lajeissa olevan URA+-fenotyypin perinnöllinen stabiilius määritettiin 20 viljelemällä hiivaa ei-valikoivasti YPD:ssä, joka sisältää 2 % paino/tilavuus glukoosia, levittämällä samalle väliaineelle ja uudelleen levittämällä minimaaliseen väliaineeseen, josta puuttuu urasiili. Plasmidikatoprosentti per sukupolvi laskettiin ja se on esitetty taulukossa 2.

25 Taulukko 2

Plasmidikatoprosentti per sukupolvi

Plasmidij ohdannainen Plasmidikatoprosentti per sukupolvi (hajotettu vektori) S150-2B S150-2B

cir+ cir° 30 PSAC3U1 0,22 0,19 PSAC3U2 0,31 0,14 20 95285

Taulukko 2 j atkoa

Plasmidij ohdannainen Plasmidikatoprosentti per sukupolvi PSAC300 2,5 pSAC 310 0 0,89 5 Taulukossa 2 esitetyistä tuloksista voidaan nähdä, että kaikki "hajotetut" johdannaiset ovat epävakaita Sl50-2B:n sekä oireetta cir°-johdannaisissa. Kuitenkin pSAC3Ul:ssä, pSAC3U2:ssa ja pSAC310:ssä havaitun epästabiiliuden taso on erityisesti vähintään yhden suuruusasteen pienempi kuin URA+ 2 pm-perus-10 täisissä S150-2B:ssä olevissa yhdistelmävektoreissa havaittu (Cahsmore et ai., 1986).

On mielenkiintoista havaita, että URA3-geenin insertointi pSA3:n 2 pm-osan uniikkiin Eagl-paikkaan saa aikaan hajotetun johdannaisen, joka on huomattavasti vähemmän vakaa kuin ne ha-15 joittajat, jotka on johdettu pSAC3Ul:stä, pSAC3U2:sta ja pSAC310:stä. Siten on ilmeistä, että valikoitavan merkitsimen insertion paikalla voi olla perinpohjainen vaikutus tulokseksi saatavan hajotetun johdannaisen stabiiliuteen. Tässä suhteessa on selvää, että 2 pm-muodon uniikit SnaBa- ja Pstl-pai-20 kat ovat sopivia yhdistelmägeenien sisäänviemiselle, koska tällaisilla insertioilla ei vaikuteta haitallisesti plasmidi-stabiiliuteen.

Panimohiivan "hajotettujen" transformanttien plasmidistabii-lius 25 BB11,0:n pSAC3Cl-transformanttien hajotetut johdannaiset ana lysoitiin myös kupariresistantin fenotyypin stabiiliuden toteamiseksi. Plasmidistabiiliuskokeet suoritettiin, kuten aikaisemmin kuvattiin, ja saatiin arviolta 0,014 % plasmidikato per sukupolvi ei-valikoivissa kasvuolosuhteissa. Näistä tuloksista 30 ilmenee, että pSAC3C1in hajotetut johdannaiset ovat äärimmäisen vakaita panimohiivalajissa BB11,0, joten niillä on yhdis-telmä-2 pm-perustuvissa hiivavektoreissa tähän mennessä ha-vaitsematon stabiiliuden taso.

II

« 95285 21

Hajottamisvektoreita voidaan käyttää "mielenkiinnon kohteena olevien geenien” vakaaseen ylläpitoon hiivassa Plasmidissa pSAC3 on uniikki Pstl-paikka ja uniikki SnaBI-paikka, joista jompaan kumpaan voidaan insertoida DNA-sekvens-5 sejä, kuten edellä kuvattiin, ilman että vaikutetaan haitallisesti hiivassa olevan plasmidin tulokseksi saatavan hajotetun johdannaisen fenotyyppistabiiliuteen. Näitä paikkoja voidaan käyttää lokuksina "mielenkiinnon kohteena olevien geenien", esimerkiksi S. diastaticuksen DEX-1-geenin ja ihmisen 1 0 seerumialbumiinigeenin, jotka on ilmennetty hiivaproraoottoris-ta, sijoittamiseen. Tunnettuja menetelmiä käyttämällä on mahdollista insertoida tällaisia geenejä näihin uniikkeihin lo-kuksiin yhdessä sopivan valikoitavan merkitsimen kanssa hiiva transformointia varten. Vaihtoehtoisesti plasmideja pSAC3U1 , 15 pSAC3U2, pSAC310 ja pSAC2C1 voidaan käyttää vastaanottajina sopivan "mielenkiinnon kohteena olevan geenin" insertointiin. Tässä suhteessa pSAC3Ul, pSAC3U2 ja pSAC310 sisältävät uniikin Smal-paikan, joka sijaitsee URA3-geenin 3'-ei-translatoidulla alueella (Rose et ai., 1984). Tätä Smal-paikkaa voidaan käyt-20 tää lokuksena sopivan "mielenkiinnon kohteena olevan geenin" insertointiin.

SnaBI-paikan käytön toivottavuus mielenkiinnon kohteena olevan geenin insertointiin joko suoraan tai epäsuorasti (esimerkiksi jos URA3-geeni insertoidaan ja sitten mieleenkiinnon kohteena 25 oleva geeni insertoidaan sen Smal-paikkaan) riippuu vektorin hajoamisesta, so. bakteeri-DNA-sekvenssien kadosta, ja muodostaa keksinnön toisen näkökannan. Yleisesti ottaen voitaisiin haluta estää transkription jatkuminen insertoidu(i)sta gee-n(e)istä endogeenisiin 2 pm-alueisiin, erityisesti niin sanot-30 tuun STB-alueeseen, joka on SnaBI-paikan puolella etäällä rep-likaation (ori) hiiva-alkuperästä. Täten käsittää insertoitu sekvenssi edullisesti (a) mielenkiinon kohteena olevan geenin, (b) promoottorin sitä varten viereisen orin sen puolella ja V" (c) 31-trasnkriptioterminaattorin mielenkiinnon kohteena ole-35 van geenin myötävirtaan ja tämän geenin ja STB-alueen välissä.

22 95285

Viitteet

Aigle et ai., (1984), Journal of the American Society of Brewing Chemists, 42, 1 .

Andrews et ai., (1985) Cell, 40, 795.

5 Beggs, (1978), Nature, 275, 104.

Beggs, (1981), "Molecular Genetics in Yeast" Alfred Benzon Symposium No: 16, Munksgaard, Copenhagen.

Birnboim & Doly, (1980), Nucleic Acids Research, T_, 1513.

Bolivar, (1978), Gene, 4_, 121.

10 Botstein & Davis, (1982), "Molecular Biology of the Yeast, Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression", toim. Stra-thern et al., Cold Spring Harbour Laboratory, New York.

Broach & Hicks, (1980), Cell, 2Λ_, 501.

Casadaban & Cohen, (1980), Journal of Molecular Biology, 138, 15 179.

Cashmore et al., (1986), Molecular and General Genetics, 203, 1 54.

Chevallier & Aigle, (1979), FEBS Letters, 108, 179.

Chevallier et al., (1 980), Gene, 11_, 11.

20 Clarke & Carbon, (1980), Nature, 287, 504.

Clark-Walker & Miklos, (1974), European Journal of Biochemistry, £}_, 359.

Cohen et al., (1980), Proceedings of the National Academy of : Sciences, USA, 77, 1078.

23 95285

Falco & Dumas, (1985), Genetics, 109, 21.

Futcher, (1986), Journal of Theoretical Biology, 119, 197.

Futcher & Cox, (1983), Journal of Bacteriology, 154, 612.

Gerbaud et al., (1979), Gene, 5_, 233.

5 Gritz et al., (1983), Gene, 25, 178.

Grunstein & Hogness, (1975), Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 72, 3961 .

Guerineau et al., (1974), Biochemical Biophysics Research Communications, 6£, 462, 10 Hadfield et al., (1986), Gene, 45, 149.

Harford & Gathoye, (1985), DNA, 4_, 80.

Harford & Peters, (1 987), Currennt Genetics, 1_1_. 315.

Hartley & Donelson, (1980), Nature, 286, 280.

Henderson et al., (1 985), Current Genetics, 9_, 113.

15 Hicks et al., (1979), Cold Spring Harbour Symposium Quantitative Biology, £3, 1305.

Hinchliffe & Box, (1985), Proceedings of the European Brewery Convention Congress, 20th, Helsinki, 267.

Hinchliffe & Daubney, (1986), Journal of the American Society 20 of Brewing Chemists, 44, 98.

Hinnen et al., (1978), Proceedings of the National Academy of

Sciences, USA, 7j>, 1929.

24 95285

Ito et ai., (1983), Journal of Bacteriology, 153, 163.

Hyman et ai., (1982), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 79, 1578.

Jayaram et ai., (1983), Cell, 3j4, 95.

5 Jiminez et ai., (1980), Nature, 287, 869.

Kikuchi, (1983), Cell, 35, 487.

Kingsman et ai., (1985), Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 3_, 377.

Livingston, (1 977), Genetics, 86^, 73.

10 Livingston & Hahne, (1979). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 76, 3727.

Maniatis et al., "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Cold Spring Harbour, New York.

Murray et al., (1 987), The EMBO Journal 6_, 4205.

15 Nelson & Fangman, (1979), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, T6.t 6515.

Newlon et al., (1981), ICN-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, 22, 501 .

Orr-Weaver et al., (1981), Proceedings of the National Academy 20 of Sciences, USA, 78, 6354.

Orr-Weaver et al., (1983), "Methods on Enzymology", toim. Wu et al., 101, 228, Academic Press, New York.

it

Rine et al., (1983), Proceedings of the National Academy of : Sciences, USA, 8j0, 6750.

25 95285

Rose et al., (1984), Gene, 29, 133.

Rothstein, (1983), "Methods in Enzymology", toim. Wu et al., 101, 202, Academic Press, New York.

Seligy et al., (1980), Nucleic Acids Research, 8^, 3371 .

5 Sigurdson et al., (1981), Molecular and General Genetics, 1 83, 59.

Som et al., (1983), Cell, 52, 27.

Storms et al., (1979), Journal of Bacteriology, 140, 73.

Struhl et al., (1979), Proceedings of the National Academy of 10 Sciences, USA, 7(5, 1035.

Taketo et al., (1980), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 77_, 3144.

Tubb, (1980), Journal of the Institute of Brewing, 86, 78.

Vieira & Messing, (1 982), Gene, 1_9, 259.

15 Volkert & Broach, (1986), Cell, 46, 541.

’ Volkert & Broach, (1987), Press.

Walmsley et al., (1983), Molecular and General Genetics, 1 92, 361 .

Webster & Dickson, (1983), Gene, 26, 243, 20 Winston et al., (1983), "Methods in Enzymology", toim. Wu et al., 1_01_, 211.

Wu et al., (1986), "UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology: Yeast Cell Biology", toim. Hicks, 323.

95285 26

Yocum, (1985), Eurooppalainen patenttihakemus no 163491.

On huomattava, että voidaan luoda myös plasmideja, joilla on ennen rekombinaatiota vain kaksi FLP-paikkaa suorassa orientaatiossa, joiden paikkojen välissä on ei-haluttu, esimerkik-5 si bakteeriperäinen, DNA (so.rekombinaatiopaikkojen parin erottamana plasmidin kahdesta osasta lyhyempänä). Rekombinaa-tion jälkeen plasmidilla on vain yksi rekombinaatiopaikka ja se ei joudu sen tähden tavalliseen 2 μπι-rekombinaatioon A- ja B-muotoj en sekapopulaation saamiseksi. Tällaiset plasmidit 10 ovat todennäköisesti vähemmän vakaita kuin edellä kuvatut, mutta muodostavat kuitenkin keksinnön kohteen ja ja niitä voidaan esittää sellaisiksi.

Claims (17)

1. 95285 1. 2 μπι-plasmidivektori, tunnettu siitä, että se käsittää a) bakteeri-DNA-sekvenssin, b) hiivan 2 μηι-plasmidista johdetun DNA:n, joka käsittää 5 kolme FLP-rekombinaatiokohtaa, replikaation aloituksen (ori) ja STB-geenin ja c) DNA-sekvenssin, joka koodaa haluttua proteiinia tai peptidiä, 10 yhden FLP-rekombinaatiokohtaparin ollessa suorassa orientaatiossa ja kahden muun parin ollessa epäsuorassa orientaatiossa, bakteerisekvenssin ollessa sijoitettu mainittujen FLP-rekom-15 binaatiokohtien väliin, jotka ovat suorassa orientaatiossa siten, että kun hiiva transformoidaan mainitulla vektorilla, mainittu bakteerisekvenssi eliminoituu, haluttua proteiinia tai peptidiä koodaavan DNA-sekvenssin ei 20 ollessa sijoitettu suorassa orientaatiossa olevien kohtien väliin, ja haluttua proteiinia tai peptidiä koodaavan DNA-sekvenssin ollessa edelleen sijoitettu ori:n ja STB-geenin väliin 2 μιη-25 plasmidista johdetussa DNA:ssa siten, että mainitun DNA-koo-daussekvenssin transkriptio ei jatku ori:hin tai STB:hen.
2. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen 2 μm-plasmidivektori, tunnettu siitä, että se käsittää myös valikoitavan merkitsin-

   30 DNA-sekvenssin.
3. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen 2 μπι-plasmidivektori, tunnettu siitä, että bakteerisekvenssi käsittää sekvenssin, joka sallii vektorin replikoitumisen bakteerissa. 35
4. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen 2 μιη-plasmidivektori, tunnettu siitä, että kaikki bakteeriplasmidi-DNA-sekvenssit on sijoitettu mainittujen suorassa orientaatiossa olevien kohtien väliin. 40 τ~ 28 9 5 2 3 5
5. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen 2 /zm-plasmidivektori, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi, joka koodaa haluttua proteiinia tai peptidiä, on heterologinen hiivalle.
6. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen 2 μιη-plasmidivektori, tunnettu siitä, että haluttua proteiinia tai peptidiä koodaa-va DNA-sekvenssi on HSA:ta koodaava sekvenssi fuusioituneena 5'-päässään geenipromoottoriin, joka toimii hiivassa sekree-tio-ohjaajasekvenssin kautta, joka toimii hiivassa, ja 3'-10 päässään transkriptioterminaatiosignaaliin, joka toimii hiivassa .
7. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen 2 μιη-plasmidivektori, tunnettu siitä, että haluttua proteiinia tai peptidiä koodaa- 15 va DNA-sekvenssi on MET-HSA-geeni fuusioituneena 5'-päässään GAL/CYC1- tai GAL/PGK-hybridipromoottoriin, ja 3'-päässään transkriptioterminaatiosignaaliin, joka toimii hiivassa.
8. 8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen 2 μιη-plasinidivektori, 20 tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi, joka koodaa haluttua proteiinia tai polypeptidiä, on Saccharomyces cerevisiae var. diastaticuksen DEX-1-geeni tai DNA-sekvenssi, joka koodaa Bacillus subtiliksen β-glukanaasia, fuusioituneena 5'-päässään geenipromoottoriin, joka toimii hiivassa sekreetio-oh- 25 jaussekvenssin kautta, joka toimii hiivassa, ja 3'-päässään transkriptioterminaatiosignaaliin, joka toimii hiivassa.
9. 9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen 2 μιη-plasmidivektori, tunnettu siitä, että siinä on haluttu geeni liitettynä suo- 30 raan tai epäsuoraan SnaBI-kohtaan.
10. 10 Patentkrav 1. 2 μπι plasmidvektor, kannetecknad av att den omfattar (a) en bakteriell DNA-sekvens, (b) frän jäst 2 μχα plasmid härrörande DNA omfattande tre FLP-rekombinationssäten, ett replikationsursprung (ori) och 15 en STB-gen samt (c) en DNA-sekvens, som kodar för ett protein eller en peptid av intresse, varvid ett par av nämnda FLP-rekombinationssäten är i direkt 20 orientering och de bäda andra paren är i indirekt oriente-ring, varvid bakteriesekvensen är belägen mellan nämnda FLP-rekombinationssäten, vilka är i direkt orientering sä, att, dä 25 jäst transformeras med nämnda vektor, nämnda bakteriesekvens elimineras, DNA-sekvensen, som kodar för ett protein eller en peptid av intresse ej är belägen mellan säten, som är i direkt oriente-30 ring, och DNA-sekvens, som kodar för ett protein eller en peptid av intresse vidare är belägen mellan ori- och STB-genen i det 2 μιη plasmid-härledda DNA sä, att transkription av nämnda DNA-35 kodningssekvens ej fortsätter in i ori eller STB. 2. 2 /im plasmidvektor enligt patentkrav l, kännetecknad av att den även innehäller en valbar markör-DNA-sekvens. 3i 95285 3. 2 μπι plasmidvektor enligt patentkrav l, kannetecknad av att den bakteriella sekvensen omfattar en sekvens som tillä-ter replikation av vektorn i en bakterie. 5 4. 2 μπι plasmidvektor enligt patentkrav 3, kännetecknad av att samtliga bakteriella plasmid-DNA-sekvenser är belägna mellan nämnda säten i direkt orientering. 5. 2 /im plasmidvektor enligt patentkrav l, kännetecknad av 10 att DNA-sekvensen, som kodar för ett protein eller en peptid av intresse, är heterolog med jäst. 6. 2 /m plasmidvektor enligt patentkrav 5, kännetecknad av att DNA-sekvensen som kodar för ett protein eller en peptid 15 av intresse, är en DNA-sekvens, som kodar för HSA fusionera vid dess 5'-terminal till en genpromotor, som fungerar i jäst över en sekretionsledarsekvens, som fungerar i jäst och vid dess 3'-terminal till en transkriptionsavslutningssignal, som fungerar i jäst. 20 7. 2 /im plasmidvektor enligt patentkrav 6, kännetecknad av att DNA-sekvensen, som kodar för ett protein eller en peptid av intresse, är MET-HSA-genen fusionera vid dess 5'-terminal till GAL/CYC1- eller GAL/PGK-hybridpromotorn, och vid dess 25 3'-terminal till en transkriptionsavslutningssignal, som fungerar i jäst. 8. 2 μπι plasmidvektor enligt patentkrav 1, kännetecknad av att DNA-sekvensen, som kodar för ett protein eller en peptid 30 av intresse, är Saccharomyces cerevisiae var, diastaticus DEX-l-genen eller en DNA-sekvens, som kodar för j8-glukanas av Bacillus subtilis, fusionera vid dess 5'-terminal till en . genpromotor, som fungerar i jäst via en sekretionsledarsek vens, som fungerar i jäst och vid dess 3'-terminal till en 35 transkriptionsavslutningssignal, som fungerar i jäst. 9. 2 μπι plasmidvektor enligt patentkrav 1, kännetecknad av att den har en gen av intresse inserterad direkt eller indi- • rekt vid SnaBI-sätet. 40 9S285 10. 2 μπι plasmidvektor enligt patentkrav 1, kännetecknad av att en DNA-sekvens, som kodar för ett protein eller en peptid av intresse, inserteras direkt eller indirekt vid SnaBI-sä-tet. 5

    10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen 2 μιη-plasmidivektori, • tunnettu siitä, että haluttua proteiinia tai peptidiä koodaa va DNA-sekvenssi insertoidaan suoraan tai epäsuorasti SnaBI- 35 kohtaan.
11. 11. Förfarande för framställning av en 2 μπι plasmid-vektor enligt patentkrav 1, kännetecknat av det omfattar: insertering in i en fullständig 2/i-plasmid, som innehäller ett replikationsursprung (ori) och en STB-gen (i) en DNA-sek- 10 vens för vai av jästtransformanter, (ii) en DNA-sekvens, som kodar för ett protein eller en peptid av intresse och (iii) en insert innehällande (a) bakteriellt plasmid-DNA för att tilläta förökning av vektorn i bakterien och (b) elementer av ett FLP-rekombinationssäte sd, att ett extra FLP-rekombina-15 tionssäte skapas i vektorn och nämnda bakterie-DNA inskjutes mellan tvd FLP-rekombinationssäten i ömsesidig direkt orien-tering, varvid nämnda DNA-sekvens, som kodar för ett protein eller en peptid av intresse, är inserterad mellan ori- och STB-genen av det 2 μπι plasmid-härledda DNA sd att transkrip-20 tionen av nämnda DNA-sekvens ej fortsätter genom ori eller STB.

    11. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen 2 μιη-plasmidi-vektorin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää sen, että täydelliseen 2 μιη-plasmidiin, joka sisältää repli- 40 kaationaloituksen (ori) ja STB-geenin, insertoidaan (i) DNA- 95285 sekvenssi hi ivat rans formant tien valikoimiseksi, (ii) DNA-sek-venssi, joka koodittaa haluttua proteiinia tai peptidiä ja (iii) insertti, joka käsittää (a) bakteeriplasmidi-DNAin, jotta mahdollistetaan vektorin lisääminen bakteerissa ja (b) 5 FLP-rekombinaatiopaikan elementit siten, että ylimääräinen FLP-rekombinaatiopaikka luodaan vektoriin ja sanottu baktee-ri-DNA sijoitetaan kahden FLP-rekombinaatiopaikan väliin keskinäisesti suorassa orientaatiossa, ja mainittu DNA-sekvenssi, joka koodaa haluttua peptidiä tai proteiinia, insertoi-10 daan 2 μιη-plasmidista johdetun DNA:n oriin ja STB-geenin väliin siten, että mainitun DNA:n transkriptio ei jatku oriin tai STBin läpi.
12. 12. Förfarande enligt patentkrav li, kännetecknat av att in-serten är inserterad vid det unika Sbal-sätet av ett endogent

    25 FLP-rekombinationssäte, den ena änden av inserten uppbär den ena del en av en 2 μπι upprepningssekvens och den andra änden av inserten uppbär dterstoden av 2 μπι upprepningssekvensen.

    12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu sii-15 tä, että insertti insertoidaan endogeenisen FLP-rekombinaatiopaikan uniikkiin Xbal-paikkaan, että insertin toisessa päässä on 2 μπι-toistosekvenssin toinen osa ja insertin toisessa päässä on 2 /tm-toistosekvenssin jäljelle jäänyt osa.
13. 13. Jästcell, kännetecknad av att den innehäller en 2 μπι 30 plasmid med ett replikationsursprung (ori) och en STB-gen och innehdllande en icke-bakteriell DNA-sekvens, som kodar för ett protein eller en peptid av intresse, som är heterolog med jäst, varvid plasmiden ej innehäller ndgot bakteriellt DNA, som transformerats in i nämnda cell, varvid DNA-sekvensen, 35 som kodar för proteinet eller peptiden av intresse är belägen mellan ori- och STB-genen, sd att transkriptionen av nämnda DNA-sekvens ej fortsätter genom ori eller STB.

    13. Hiivasolu, tunnettu siitä, että se sisältää 2 jum-plas- midin, jossa on replikaationaloitus (ori) ja STB-geeni, ja joka käsittää ei-bakteeri-DNA-sekvenssin, joka koodaa hiivalle heterologista haluttua peptidiä tai proteiinia, joka plas-midi ei käsitä bakteeri-DNA:ta, joka on transformoitu mainit-25 tuun soluun, ja joka haluttua peptidiä tai proteiinia koodaa-va DNA-sekvenssi on sijoitettu oriin ja STB-geenin väliin siten, että mainitun DNA-sekvenssin transkriptio ei jatku oriin tai STB in läpi.
14. 14. Jästcell härrörande frän en cell enligt patentkrav 13, 40 kännetecknad av att cellen enligt patentkrav 13 framställes li 33 95285 eller dess avkomma reproduceras, och att den innehäller en plasmid omfattande en DNA-sekvens, som kodar för ett protein eller en peptid av intresse, som är heterolog med jäst, var-vid plasmiden ej innehäller ndgot bakteriellt DNA. 5

    14. Patenttivaatimuksen 13 mukaisesta solusta johdettu hii vasolu, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 13 mukaista solua ja sen jälkeläisiä lisätään, ja että se sisältää hiivalle heterologista, haluttua proteiinia tai peptidiä koodaa-van DNA-sekvenssin käsittävän plasmidin, joka ei sisällä bak-35 teeri-DNA:ta.
15. 15. Bryggjäst eller laboratoriejäst, som transformerats med en 2 μτα plasmidvektor enligt patentkrav l.

    15. Patenttivaatimuksen 1 mukaisella 2 pim-plasmidivektorilla . transformoitu panimohiiva tai laboratoriohiiva. 95285

    16. Menetelmä halutun proteiinin tai peptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se on valmistettu fermentoimalla hiiva patenttivaatimuksen 13, 14 tai 15 mukaisesti ja erottamalla haluttu proteiini tai peptidi. 5 17. 2 /xm-plasmidihiivavektori, tunnettu siitä, että siinä on haluttu geeni insertoituna suoraan tai epäsuorasti SnaBI-paikkaan.
16. 16. Förfarande för framställning av ett protein eller en 10 peptid av intresse, kännetecknat av att man jäser en jäst enligt patentkrav 13, 14 eller 15 och frdnseparerar proteinet eller peptiden av intresse.
17. 17. 2 μια jästplasmidvektor, kännetecknad av att den en gen 15 av intresse direkt eller indirekt inserterad vid SnaBI-sätet.