FI79550B - Foerfarande foer framstaellning av ett humant hybridleukocytinterferon. - Google Patents

Description

1 79550

Menetelmä ihmisen hybridileukosyytti-interferonin tuottamiseksi

Keksintö koskee noin 165 - 166 aminohappoa käsit-5 tävien ihmisen hybridileukosyytti-interferonien tuottamista E. colin avulla käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa. Interferonit käsittävät erillisen ihmisen interferonin A aminohapposekvenssin ja erillisen ihmisen interferonin B tai D aminohapposekvenssin, kokonaisaminohapposekvenssin 10 erotessa luonnossa esiintyvien leukosyytti-interferonien sekvenssistä. Keksintö koskee myös menetelmiä yhdistelmä-DNA:n muodostamiseksi, yhdistelmä DNA:n sekä sitä sisältäviä ekspressioplasmideja.

Interferonia käytetään virusperäisten ja neoplas-15 tisten tautien hoidossa.

Normaalien tai leukemiaa potevien luovuttajien leukosyyteistä on saatu suhteellisen homogeenisiä leukosyytti-interferoneja. Nämä interferonit ovat ryhmä proteiineja, joille on ominaista se, että niillä on voimakas kyky 20 saada aikaan virusten vastainen tila kohdesolussa. Lisäksi interferoni voi inhiboida solujen jakautumista ja moduloida immuunivasteen. Nämä ominaisuudet ovat antaneet sysäyksen käyttää interferonia kliinisesti terapeuttisena aineena virusperäisten infektioiden ja pahanlaatuisten kasvain-25 ten hoidossa.

Aivan äskettäin yhdistelmä-DNA-tekniikkaa on käytetty aikaansaamaan mikrobiperäinen tuotanto joukolle erilaisia leukosyytti-interferoneja, joiden aminohapposekvenssit ovat noin 70-%:isesti homologisia, toinen toisel-30 leen läheisiä, ja jotka kaikki on esitetty julkaisussa David V. Goeddel et ai.; Nature 290 (1981), ss. 20 - 26. Geenejä, jotka koodaavat erilaisten leukosyytti-interferonien aminohapposekvenssejä, joita interferoneja merkitään vastaavasti mm. LeIF-A:ksi, B:ksi, C:ksi, D:ksi, F:ksi, 35 G:ksi ja H:ksi, saadaan solulajista KG-1, jonka ovat ku- 2 79550 vanneet Koeffler, H. P. ja Golde, D. W. julkaisussa Science 200 (1978), ss. 1153 - 1154; David V. Goeddel ja Sidney Petska. Soluiinja KG-1 on talletettu kokoelmaan American Type Culture Collection, ATCC-numerolla CRL 8031. Sellai-5 siä geenejä, joita on sopivasti kehitetty plasmideissa bakteeriperäistä ekspressiota varten, voidaan käyttää isäntäbakteerien transformoimiseksi, edullisesti E. coli K-12 kannan 294; ATCCtn talletusnumero 31446, talletettu 28.10.1978, transformointiin.

10 Yhdistelmä-DNA-tekniikan työväline on plasmidi, ei-kromosomiperäinen, kaksisäikeinen DNA-rengas, joka esiintyy bakteereissa ja muissa mikrobeissa usein solua kohti multippelikopioina. Plasmidi-DNA:n koodaamaan informaatioon sisältyy edellytys, että tytärsoluissa tuotetaan 15 jälleen plasmidi (ts. "replikoni"), ja tavallisesti siinä on yksi tai useampia valintaominaisuuksia (kuten esim. bakteerien tapauksessa resistenssi antibiootteja kohtaan), jotka ominaisuudet sallivat kyseessä olevan plasmidin sisältävien isäntäsolujen kloonien tunnistamisen sekä en-20 sisijaisesti niiden viljelyn selektiivisessä elatusainees-sa. Plasmidien käyttökelpoisuus perustuu siihen tosiseikkaan, että niitä voidaan spesifisesti pilkkoa jollakin restriktioendonukleaasilla tai "restriktioentsyymillä", joista kukin tunnistaa eri kohdan plasmidi-DNA:sta. Tämän 25 jälkeen heterologisia geenejä tai geenifragmentteja voidaan yhdistää plasmidiin päittäin suoritettavan liittämisen avulla, pilkkomiskohdassa tai pilkkomiskohdan vieressä uudelleen muodostetuissa päissä. DNA-rekombinaatio suoritetaan solun ulkopuolella, mutta tuloksena oleva "rekom-30 binantti"-plasmidi voidaan liittää siihen transformaationa tunnetulla menetelmällä, ja suuria määriä heterologista geeniä sisältävää rekombinanttiplasmidia saadaan transfor-manttia kasvattamalla. Ennen kaikkea, silloin, kun geenin insertio on sopivasti saatu aikaan plasmidin osien suh-35 teen, jotka määräävät DNA:n koodaamaa transkriptiota ja 3 79550 translaatiota, syntyvää ekspressiovälinettä voidaan käyttää varsinaisesti tuottamaan polypeptidisekvenssiä, jota insertoitu geeni koodaa; menetelmää nimitetään ekspres-sioksi.

5 Ekspressio alkaa alueella, joka tunnetaan promoot torina, jonka RNA-polymeraasi tunnistaa ja sitoo. Joissakin tapauksissa, kuten tryptofaani (eli "trp") -promoottorin ollessa kyseessä, jota promoottoria pidetään parempana esillä olevan keksinnön toteutuksessa, promoottori-10 alueet menevät limittäin "operaattori"-alueiden kanssa, jotta yhdistetty promoottori-operaattori muodostuu. Operaattorit ovat DNA-sekvenssejä, joita tunnistavat ns. re-pressoriproteiinit, jotka toimivat säädellen transkription alkamisfrekvenssiä tietyssä promoottorissa. Polyme-15 raasi kulkee DNA:ta myöten transkriboiden informaation, joka sisältyy koodaavaan säikeeseen, koodaavan säikeen 5'-päästä 3'-päähän lähetti-RNA:ksi, joka vuorostaan luetaan polypeptidiksi, jolla on aminohapposekvenssi, jota DNA koodaa. Kutakin aminohappoa koodaa nukleotiditripletti eli 20 "kodoni", jota kyseessä olevia tarkoituksia varten voidaan pitää "rakennegeeninä", ts. sinä osana, joka koodaa eks-pressiotuotteen aminohapposekvenssiä. Promoottoriin tapahtuvan sitoutumisen jälkeen RNA-polymeraasi ensin transkriboi nukleotidit, jotka koodaavat ribosomin sitoutumiskoh-25 dan, sitten translaation aloituksen eli "lähtö"-signaalin (tavallisesti ATG, josta syntyvässä lähetti-RNA:ssa tulee AUG), sitten rakennegeenissä itsessään sijaisevät nukleo-tidikodonit. Ns. päätekodonit transkriboidaan rakennegee-nin päässä, jonka jälkeen polymeraasi voi muodostaa lähet-30 ti-RNA:n lisäsekvenssin, joka pääteslgnaalin läsnäolon vuoksi jää ribosomellta lukematta. Ribosomit kiinnittyvät lähetti-RNA:11a sijaitseviin sitomiskohtiln, bakteereissa tavallisesti kun m-RNA muodostuu, ja tuottavat itse koodatun polypeptidin aloittaen translaation alkusignaalista ja 35 päättäen aiemmin mainittuun päätesignaaliin. Haluttu tuote 4 79550 valmistetaan, jos ribosomin sitomiskohtaa koodaavat sekvenssit sijaitsevat sopivasti AUG-aloituskodonin suhteen ja jos kaikki jäljelle jäävät kodonit seuraavat aloitus-kodonia vaiheittain. Syntyvä tuote voidaan saada liuot-5 tantalla isäntäsolu ja ottamalla tuote talteen puhdistamalla se sopivasti muun bakteeriproteiinin suhteen.

Erilaisia leukosyytti-interferoneja koodaavien geenien nukleotidisekvenssien tutkimukset osoittavat yhteisiä piirteitä tietyn restriktioendonukleaasin tunnistamien 10 pilkkoutumiskohtien läsnäolon ja sijainnin suhteen. Esillä olevan keksinnön mukaisesti näitä yhteisiä piirteitä voidaan käyttää hyväksi muodostettaessa DNA-rekombinaation avulla uusia hybridigeenejä, jotka ovat käyttökelpoisia tuotettaessa mikrobiologisesti leukosyytti-interferoneja, 15 joilla voidaan odottaa olevan suuremmassa tai pienemmässä määrin virusten vastaisia tai muita ominaisuuksia, joita on kantasoluista peräisin olevien geenien koodaamilla interferoneilla. Tällaisilla hybridileukosyytti-interfero-neilla voi olla lisääntynyt aktiivisuus verrattuna kan-20 tasoluista peräisin olevien geenien koodaamiin interfero-neihin.

Kantasoluista peräisin olevilla leukosyytti-interferonin geeneillä, jotka koodaavat tässä yhteydessä tarkoitettujen leukosyytti-interferoniproteiinien ryhmää, on 25 luonnollisia oleellisia variaatioita eri yksilöiden välillä. Näitä variaatioita voidaan havainnollistaa kokonais-proteiinisekvenssin aminohappoerojen tai mainitun sekvenssin aminohappojen deleetioiden, substituutioiden, inser-tioiden, inversioiden tai lisäysten avulla. Kunkin kan-30 tasoluista peräisin olevan leukosyytti-interferonin, jota nimitetään LeIF-A:ksi, LeIF-B:ksi...jne. sellaiset oleelliset variaatiot sisältyvät tavalla tai toisella määritellyn nimen tai termin piiriin.

Keksinnön mukaisesti hybridileukosyytti-interfero-35 nit ja niitä koodaavat DNA-sekvenssit valmistetaan patent- 5 79550 tivaatimuksissa 1 ja 2 mainitulla tavalla. Keksinnön kohteena olevat ja menetelmissä käytetyt DNA-sekvenssit ja ekspressioplasmidit ovat vaatimuksen 3, 4 tai 6 mukaisia.

Menettelytapa, jolla nämä ja muut keksinnön kohteet 5 ja edut saavutetaan, tulevat edelleen ilmi yksityiskohtaisesta kuvauksesta, joka esitetään seuraavana, sekä liitteenä olevista piirroksista, joissa:

Kuvio 1 kuvaa 3:n leukosyytti-interferonin ("LelF") komplementaaristen DNA ("cDNA" )-kodonien koodaavien aluei-10 den nukleotidisekvenssejä. Kunkin LelF-kodonin ATG-trans-lationaalinen alkukodoni ja päätetripletti on alleviivattu.

Kuvio 2 kuvaa kloonattujen cDNAriden kolmen LelF-tyypln restriktioendonukleaasikarttaa (A, B ja D). Kloone-15 ja sisältävät plasmidit konstruoitiin dC:dG-pääteliitos-menetelmän avulla [Goeddler, D. V. et ai., Nature 287 (1980), ss. 411 - 416]. Siten cDNA-instertit voidaan poistaa käyttämällä Pst I:tä, ts. kunkin insertin kumpikin pää on Pst I-restriktioendonukleaasin pilkkomiskohta. 20 Kunkin cDNA-insertion päätteessä sijaitsevat osat edustavat reunustavia, homopolymeerisiä dC:dG-päätteitä. Pvu II:lle, Eco Rl:lie ja Bgl II:lie spesisfisten restriktio-kohtien sijainnit on ilmaistu. Kuvion varjostetut alueet edustavat kypsien LeiF:ien koodaavia sekvenssejä; risti-25 viivoituksella varjostetut alueet ilmaisevat signaalipep-tidejä koodaavia sekvenssejä, avoimet alueet ilmaisevat 3' ja 5' ei-koodaavia sekvenssejä.

Kuvio 3 on nukleotidisekvensseistä ennustetun kolmen LeilF-proteiinisekvenssin vertailu. Yhdellä kirjaimel-30 la esitettyjä lyhennyksiä, joita IUPAC-IUB Comission on Biochemical Nomenclature on suositellut, käytetään seuraavasti: A = alaniini, C = kysteiini, D = asparagiinihappo, E = glutamiinihappo, F = fenyylialaniini, G = glysiini, H * histidiini, I = isoleusiini, K - lysiini, L = leusiini, 6 79550 M = metioniini, N * asparagiini, P = proliini, Q = gluta-miini, R = arginiini, S = seriini, T = treoniini, V = väliini, W = tryptofaani ja Y = tyrosiini. Numerot tarkoittavat aminohapon asemaa (S tarkoittaa signaalipeptidiä).

5 165 aminohappoa käsittävän LeIF-A-sekvenssin kohdassa 44 oleva viiva on otettu käytäntöön sijoittamaan LeIF-A:n sekvenssi riviin muiden 166 aminohappoa käsittävien LeIF:ien sekvenssien kanssa. On esitetty myös aminohapot, jotka ovat yhteisiä kaikille LeIF:ille. Alleviivatut täh-10 teet ovat aminohappoja, jotka ovat läsnä myös ihmisen fibroblasti-interferonissa.

Kuvion 1 yhteydessä nukleotidit +1 - 69 vastaavat kuvion 3 SI - S23 aminohappoja. Kuvion 1 kodoni TGT (nukleotidit 70 - 72) vastaa kuvion 3 kysteiiniä (C, aminohap-15 po 1). Kuviossa 3 Pvu-restriktioendonukleaasin pilkkomis-kohta sijaitsee LeIF-A:ssa, B:ssä ja D:ssä, aminohappojen 92 ja 93 kodonien välissä, ts. kuvion 1 nukleotidien 346 ja 347 välillä.

Kuvio 4 vertaa kypsien leukosyytti-interferonien A 20 ja D aminohapposekvenssejä, aminohappo 44:n puuttuminen LeIF-A:ssa on siinä esitetty viivoin. Ainoastaan ne LelF-D-aminohapot, jotka eroavat vastaavista LeIF-A:n aminohapoista, on kuvattu, muutoin LeIF-D:n aminohapposekvenssi on identtinen LeIF-A:n kanssa. Kuvio 4 ilmaisee myös vas-25 taavaa paikkaa Bgl II:n vastaavassa geenissä sekä Pvu-restriktioendonukleaasin pilkkomiskohdat, joita on käytetty muodostettaessa keksinnön mukaisia, parempana pidettyjä hybridileukosyyttigeenej ä.

Kuviot 5 ja 6 valaisevat parempana pidetyn hybridi-30 leukosyytti-interferonin ("LeIF-A/D") vertailevan kokeen tuloksia, jotka saatiin vastaavasti hiiren soluissa aktiivisuuden suhteen sekä enkefalomyokarditisvirusta ("EMC") sekä rakkulasuutulehdusta ("VSV") vastaan.

Kuviot 7 ja 8 kuvaavat LelF-A/D:llä ja muilla in-35 terferoneilla EMC-virusinfektiota vastaan suoritetun ko- 7 79550 keen tuloksia, jotka saatiin vastaavasti hiirillä ja hamstereilla. Kuviossa 7 esitetyt tulokset ovat peräisin 3 tuntia ennen infektiota intraperitoneaalisesti suoritetuista käsittelyistä. LeIF-A/D ja LeIF-A:n annokset ovat 5 WISH-soluilla suoritettujen titrausten mukaisia.

Kuvio 9 esittää LeIF-A-proteiinin DNA-sekvenssit.

Keksinnön mukaisesti muodostettujen plasmidien ekspressiotuotteet voidaan tutkia virusten vastaisen aktiivisuuden suhteen tavanomaisella tavalla, kuten seuraa-10 vassa on kuvattu biologisten aktiivisuusmääritysten yhteydessä.

E. coli K-12 kanta 294 transformoitiin itsenäisesti plasmideilla pLelF trp A 25, pLeiF trp D, pLelF trp A/D (Bgl II) sekä pLelF trp D/A (Bgl II). Transformantteja 15 kasvatettiin erikseen 5 ml:n viljelmissä L-ravintoliuok-sessa, joka sisälsi tetrasykliiniä 5 mg/ml A550:n arvoon noin 1,0, sitten viljelmä laimennettiin 1 litraksi M9-elatusaineella, joka sisälsi 5mg/ml tetrasykliiniä. Solut koottiin, kun A550 saavutti arvon 1,0, ja solupelletit 20 suspendoitiin 10 ml:aan 15-%:ista sakkaroosia, 50 mM tris-HC1 (pH 8,0), 50 mM EDTA. Lisättiin 10 mg lysotsyymiä ja 5 minuutin kuluttua 0°C:ssa solut rikottiin sonikoimalla. Näytteitä sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 15 000 rpm:llä Sorvali SM-24-roottorilla. Supernatanteissa oleva inter-25 feroniaktiivisuus tutkittiin virusten vastaisen aktiivi suuden suhteen.

Näiden interferonien viljelmän saannot litraa kohti ihmisen solulinjaa (WISH) vastaan titrattuna, on esitetty taulukossa 1, josta käy ilmi, että LeIF-A/D-aktiivisuutta 30 tuotetaan enemmän kuin muita interferoneja. Tämä ero voisi johtua LeIF-A/D:n suuremmasta sisäisestä aktiivisuudesta tai suuremmasta saannosta tämän interferonin proteiinin mg-määrinä ilmaistuna. Koska geneettinen yhdysside oli yhtäläinen kaikilla näillä interferoneilla, näyttää luul- 8 79550 tavimmalta että LeIF-A/D:llä on oleellisesti suurempi aktiivisuus kuin muilla interferoneilla.

Taulukko 1 5 Leukosyytti-interferonien saanto E. colin ravis- tuspulloviljelmistä

Interferoni Aktiivisuuden saanto/litra tyyppi (yksikköjä WISH:lla(* 10 - A 8 x 107 D 5 x 106 AD (Bgl II) 2 x 108 DA (Bgl II) 1 x 106 15 - *) määritetty inhiboimalla sytopaattinen vaikutus WISH-soluilla VSV:n toimiessa infektion aiheuttajana Määritettiin erilaisten interferonien teho joukossa 20 nisäkässolulinjoja (ihminen, WISH; afrikkalainen vihreä apina, VERO; hamsterin fibroblasti, BHK; kaniinin munuais-solut, RK-13; hiiri, L-929; ja härän munuainen, MDBK-so-lut). Interferonien suhteellisen aktiivisuuden määrittämiseksi laskettiin niiden aktiivisuus erilaisia soluja koh-25 taan suhteessa niiden aktiivisuuteen WlSH-soluja kohtaan, joka otettiin arvoksi 100. Tulokset taulukossa 2 ilmaisevat, että LeIF-A/D:llä on erittäin korkea aktiivisuus VERO-ja L-929-soluissa, kun taas LeIF-D/A:lla on näissä solupolvissa alhainen aktiivisuus. Nämä tulokset ilmaise-30 vat, että LeIF-A:n N-terminaalisen osan ja LeIF-D:n C-terminaalisen osan yhdistelmä yhdessä molekyylissä (LelF-A/D) antaa hybridiproteiinille erityisen tehon, joka on ilmeinen monissa nisäkäslajeissa. Ennen kaikkea, nämä ominaisuudet eivät ole yksinkertaisesti kantainterferonien 35 ominaisuuksien summa. Tämä on selvästi nähtävissä, kun on 9 79550 kysymyksessä aktiivisuus L-929-soluihin nähden (taulukko 2), missä tapauksessa ei LelF-A:n ja LeIF-D:n seoksella eikä LeIF-D/A:n toisella hybridillä ole merkittävää aktiivisuutta .

5

Taulukko 2

Erilaisten leukosyytti-interferonien titraus eri nisäkäslajeista saaduissa solulinjoissa 10 Leukosyytti-interferonit( *

Solu- Ruskean kel- linja A D A/D D/A A + D takuorinen WISH 100 100 100 100 100 100 15 VERO 250 75 1670 20 200 200 BHK 400 200 833 2000 400 20 RK-13 12 500 6 N.D. N.D. 120 L-929 150 5 3300 2 10 0,1 20 *) Interferonit testattu eri solupolvien VSV-infektioita vastaan. Aktiivisuudet ilmaistu WISH-soluissa havaitun aktiivisuuden prosentteina.

Tutkittiin myös LeIF-A/D:n aktiivisuus muita viruk-25 siä vastaan. Kuviossa 5 esitetyt tulokset ilmaisevat virusten vastaisia vaikutuksia L-solujen EMC-virusinfektiota vastaan ja kuvion 6 tulokset ilmaisevat vaikutuksia L-solujen VSV-infektiota vastaan. Näiden tulosten perusteella on selvää, että LeIF-A/D:n suurempi aktiivisuus ei 30 rajoitu yhteen virukseen (VSV) ja sen suurempi aktiivisuus on todennäköisesti oleva yleisin ominaisuus nuoria viruksia kohtaan. Luonnollisilla, ihmisen ruskeankeltakuorisil-la (bufly-coat) interferonivalmisteilla ei ole mitään vaikutusta hiirien soluja kohtaan (ks. taulukko 2). Sen 35 vuoksi tutkittiin LeIF-A/D:n aktiivisuutta CD-l-hiiren ίο 7 9 550 EMC-virusinfektiota vastaan. Kuviossa 7 esitetyt tulokset ilmaisevat, että LeIF-A/D on erittäin tehokas letaalista EMC-virusinfektiota vastaan ja LeIF-A:lla on myös viruksen vastaista aktiivisuutta, kuten on odotettavissa aktiivi-5 suudesta solupolvissa (taulukko 1). Kuviossa 7 esitetyt tiedot ovat tuloksena i.p. käsittelyistä 3 tuntia ennen infektiota. LeIF-A/D:n ja LeIF-A:n annokset on esitetty WISH:11a titrattuina.

LeIF-A/D ja LeIF-A (kuvio 8) vaikuttavat muös hams-10 tereiden letaalin EMC-viruksen aiheuttamaan infektioon, ensiksi mainitun ollessa tällöin tehokkaimman ja keltarus-keakuorisen interferonin osoittaessa vain vähäistä ja statistisesta merkityksetöntä vaikutusta. Kuvion 8 tapauksessa kaikki interferonit annettiin i.p. 3 tuntia ennen 15 infektiota annoksena 5 x 105 pg/kg; titrattu WISH-soluil-la.

Nämä tulokset ilmaisevat, että LeIF-A/D:n mainitut viruksen vastaiset vaikutukset nisäkäslajien alueella eivät rajoitu soluviljelmiin, vaan ne havaitaan myös le-20 taaleissa virusinfektioissa.

EMC-virusta voidaan pitää mallijärjestelmänä, jota kohtaan viruksen vastaisen vaikutuksen havainnollistaminen voi ennustaa viruksen vastaista vaikutusta esitettyjä virussukuja kohtaan, esim. pikornavirus-suku, jonka jäse-25 net aiheuttavat jalkojen ja suun sairauksia sekä poliota. VSV-virusta voidaan pitää mallijärjestelmänä, jota kohtaan viruksen vastaisen vaikutuksen havainnollistaminen voi ennustaa viruksen vastaista vaikutusta mainittua virus-sukua kohtaan, esim. Rhabdo-virussuku, jonka tärkeä jäsen 30 on vesikauhun aiheuttaja.

Taulukossa 3 on esitettyinä erilaisten LelF-hybri-dien aktiivisuudet WISH ja MDBK-soluja kohtaan, sekä niiden aktiivisuussuhteet.

“ 79550

Taulukko 3

LelF- Yksikkö/litra Yksikkö/litra Aktiivisuuksien hybridi WISH-solujen MDBK-solu jen suhde

5 (Pvu II) viljelmää viljelmää WISH/MDBK

AB 2,4 x 108 4 x 107 6 AD 1,2 x 108 2 x 107 6 A* 8 x 107 1,2 x 108 0,7 10 B* 8 x 107 4 x 108 0,2 C* 2 x 107 1,5 x 107 1,3 D* 5 x 106 2,5 x 107 0,2 F* 2 x 107 2 x 108 0,1 I* 1,6 x 107 1,2 x 107 1,3 15 -- *) Vertailun vuoksi esitetty

Hybridileukosyytti-interferoneja voidaan antaa parenteraalisesti henkilöille, jotka tarvitsevat kasvaimen 20 tai viruksen vastaista hoitoa sekä niille, jotka potevat immunosupressiivisiä tiloja. Annos ja annostiheys voi olla samansuuntainen annoksen kanssa, joka on yleisesti käytössä ihmisistä peräisin olevien materiaalien kliinisessä tutkimuksessa, esim. noin 1 - 10 x 106 yksikköä päivittäin, sekä 25 kun kysymyksessä ovat aineet, joiden puhtaus on suurempi kuin 1 %, todennäköisesti esim. 5 x 107 yksikköön saakka päivittäin. Edellä kuvatun apinakokeen alustavat tulokset tuntuvat osoittavan, että bakteeriperäisen LeIF:n annoksia voitaisiin merkittävästi nostaa suuremman vaikutuksen ai-30 kaansaamiseksi, siksi että muut ihmisestä peräisin olevat proteiinit kuin LelF olleellisesti puuttuvat, jotka muut proteiinit voivat leukosyyttiperäisissä materiaaleissa toimia pyrogeeneinä, joilla on päinvastaisia vaikutuksia, esim. pahoinvointia, lämmönnousua jne.

12 79550

Oleellisesti homogeenisen bakteeriperäisen LeIF:n sopivan annosmuodon esimerkkinä parenteraalisessa muodossa käyttökelpoinen Mutatis mutandis (3 mg LelF), spesifiseltä aktiivisuudeltaan esim. 2 x 108 U/mg, voidaan liuottaa 25 5 ml:aan 5N seerumin albumiinia (ihmisen) - USP, liuos viedään bakteriologisen suodattimen läpi, ja suodatettu liuos jaetaan aseptisesti 100:aan pulloon, joista kukin sisältää 6 x 106 yksikköä puhdasta interferonia, joka soveltuu pa-renteraaliseen annosteluun. Pullot säilytetään mieluummin 10 kylmässä (-20°C:ssa) ennen käyttöä.

Keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan formuloida tunnettujen menetelmien mukaisesti farmaseuttisesti käyttökelpoisten koostumusten valmistamiseksi, jolloin polypep-tidi yhdistetään seokseen farmaseuttisesti hyväksyttävän 15 kantaja-aineen kanssa. Sopivia kantaja-aineita ja niiden formulaatioita kuvaa E. W. Martin julkaisussa Remington's Pharmaceutical Sciences (joka tässä mainitaan viitteenä). Sellaiset koostumukset sisältävät tehokkaan määrän inter-feroniproteiinia yhdessä sopivan apuaineen kanssa siten, 20 että saadaan farmaseuttisesti hyväksyttäviä tehokkaaseen annosteluun soveltuvia koostumuksia.

Käytetyt mikro-organismit

Kuvatussa työssä käytetään kahta mikro-organismia: E. coli x 1776 - kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 190 495, 25 ja E. coli K-12 kanta 294 (pääte A, thi* , hsr' , hsrn^.' ) -kuvattu GB-patenttijulkaisussa 2 055 382A. Kumpikin on talletettu talletuslaitokseen American Type Culture Collection, ATCC-numeroilla 31537 ja 31446 (3.7.1979 ja 28.10.1978). Koko yhdistelmä-DNA-työ suoritettiin National 30 Institutes of Health'in käytettävissä olevien ohjeiden mukaisesti.

Keksintöä kuvataan viitaten E. coliin, mukaanluettuina ei ainoastaan kannat E. coli x 1776 ja E. coli K-12 kanta 294, jotka ovat edellä määritellyt, vaan myös muut 35 tunnetut E. coli-kannat, kuten esim. E. coli B, joista i3 79550 monet on talletettu arvostettuihin mikro-organismien kokoelmiin, kuten ATCCrhen, ja ovat (mahdollisesti) niistä saatavissa (ks. ATCC-luettelo ja DE-patenttijulkaisu 2 644 432).

5 LelF-hybridejä valmistetaan keksinnön mukaisesti käyttämällä hyväksi restriktioendonukleaasin pilkkomiskoh-tia, jotka tavallisesti sijaitsevat yksittäisissä kanta-geeneissä ja niiden kumpikin pää on liittyneenä samojen kohtien kanssa kantaja-ekspressio-plasmideissa (vektorit)» 10 Esimerkiksi suuri (^3900 bp) Xba I - Pst I-fragmentti, pLeIF-A trp 25 ekspressioplasmidin lyhennelmä, voidaan sitoa Xbal:n kanssa Pvu II:een ja Pva erilaisten Lei F-kantageenien Pst I-lyhennelmäfragmentteihin, jotta saadaan ekspressioplasmideja, jotka ovat käyttökelpoisia vastaavan 15 LelF-hybridin saamisessa.

Kukin LelF-ekspressioplasmidi rakennettiin itsenäisesti digestio-fragmenttien avulla, jotka oli eristetty erilaisista LelF-plasmideista, esim. pLeIF-A trp 25, pLeIF-B trp 7 ja pLeIF-D trp 11, joiden konstruktiota kuva-20 taan julkaisussa Gene 2 (1977), s. 95. Tietyissä näissä plasmideissa "trp" merkitsee tryptofaanipromoottoria (bakteeriperäiselle ekspressiolle parhaimpana pidettyä operaattori järjestelmää ) , kuten on kuvattu EP-patenttihakemuksessa 36 776.

25 Ensimmäisen kypsän leukosyytti-interferonin suora ekspresslo

Seuraava menetelmä koskee LeIF-A:n ekspressiota suoraan kypsänä interferonipolypeptidinä; siihen sisältyy synteettisten (N-terminaalisten) ja komplementaaristen 30 DNA:ien yhdistelmä. Sau 3a-endonukleaasin restriktiokohta sijaitsee sopivasti LeIF-A:n kodonien 1 ja 2 välissä. Konstruoitiin 2 synteettistä deoksioligonukleotidiä, jotka sisälsivät yhden translaation ATG-alkukodonin, säilyttivät kodonin aminohappoa 1 (kysteiini) varten ja saivat aikaan 35 Eco Rl-tarttuvan pään. Nämä oligomeerit yhdistettiin pL31:n i4 79550 34 emäsparia (bp) käsittävään Sau 3a - Ava II-fragment-tiin. Syntyvä 45 bp-tuote liitettiin kahteen lisä-DNA-fragmenttiin 865 emäsparia käsittävän synteettisen - luonnonmukaisen hybridigeenin konstruoimiseksi, joka on Eco 5 Rl:n ja Pst I:n restriktiokohtien rajoittama. Tämä geeni sisällytettiin pBR322:een Eco RI:n ja Pst I:n välille, jotta saatiin plasmidi pLeIF-Al.

Plasmidissa pGMl on E. colin tryptofaani-operoni, joka sisältää deleetion ALE1413 [G. E. Miozzari et ai., 10 J. Bacteriology 133 (1978), ss. 1457 - 1466] ja näin ollen tuottaa fuusioproteiinin, joka käsittää trp-ohjaajan ensimmäiset 6 aminohappoa sekä läheisesti trp-E-polypeptidin viimeisen kolmanneksen (tässä yhteydessä myöhemmin pidetään konjugaatiossa LE'inä), sekä trp-D-polypeptidin kokonai-15 suudessaan, jotka kaikki ovat trp-promoottori-operaattori-järjestelmän säätelyn alaisia. 20 pg plasmidia digestoitiin restriktioentsyymi Pvu II:11a, joka pilkkoo plasmidin viidestä kohdasta. Seuraavaksi geenifragmentit yhdistettiin Eco RI-linkkerien avulla (jotka sisältävät sekvenssin 20 pCATGAATTCATG komplementaarisen oligonukleotidin) tarjoten Eco RI-pilkkoutumiskohdan myöhempää kloonausta varten plas-midiin, joka sisältää Eco RI-kohdan. 20 pg DNA-fragmentteja, jotka oli saatu pGMl:stä, käsiteltiin 10 yksiköllä T4-DNA-ligaasia, 5'-fosforyloidun synteettisen oligonuk-25 leotidin pCATGAATTCATG läsnäollessa 200 pikomoolina ja 20 pl:ssa T4-DNA-ligaasin puskuria (20 mM Tris, pH 7,6; 0,5 mM ATP; 10 mM MgCl2 ja 5 mM ditiotreitolia) läsnäollessa 4°C:ssa yön yli. Sitten liuosta kuumennettiin 10 minuutin ajan 70°C:ssa sitomisen pysäyttämiseksi. Linkkerit pilkot-30 tiin Eco RI-digestiolla ja fragmentit, joissa nyt oli Eco Rl-päätteet, erotettiin käyttämällä 5-%:ista polyakryyli-amidigeeli-elektroforeesia (tässä yhteydessä myöhemmin nimitetty "PAGE":ksi), ja 3 suurinta fragmenttia eristettiin geelistä värjäämällä ensin etidiumbromidilla, paikal-35 listamalla fragmentit ultraviolettivalon avulla ja leik- is 79550 kaarnalla geelistä kiinnostavimmat osat. Kukin geelifrag-menttl sekä 300 ml 0,1 x TBE:a pantiin dialyysipussiin ja suoritettiin elektroforeesi 100 V:n jännitteellä 1 tunnin ajan 0,1 x TBE-puskurissa (TBE-puskuri sisältää 10,8 g 5 Tris-emästä, 5,5 g boorihappoa ja 0,09 g Na2EDTA:a 1 litrassa vettä). Dialyysipusseista koottiin vesiliuos, uutettiin fenolilla ja kloroformilla sekä tehtiin 0,2 miksi natriumkloridillä; DNA saatiin talteen vedestä etanolisaos-tuksen jälkeen. Trp-promoottori-operaattorin sisältävä 10 geeni, jossa oli Eco RI:n tarttuvat päät, identifioitiin seuraavassa kuvatulla menetelmällä, joka päättyy fragmenttien sisällyttämiseen tetrasykliinille herkkään plasmidiin, josta promoottori-operaattori-insertion jälkeen tulee tetrasykliinille resistentti.

15 Plasmidi pBRHl [R. J. Rodrigues et ai.? Nucleic

Acids Research 6 (1979), ss. 3267 - 3287] ekspressoi am-pisilliiniresistenssin ja sisältää geenin tetrasykliini-resistenssille, mutta koska siihen ei ole assosioitunut promoottoria, se ei ekspressoi tätä resistenssiä. Sen mu-20 kaisesti plasmidi on herkkä tetrasykliinille. Liittämällä promoottori-operaattori-järjestelmä Eco RI-kohtaan plasmidi voidaan tehdä tetrasykliinille resistentiksi.

pBRHl pilkottiin Eco Rilliä, ja entsyymi poistettiin fenoliuuton avulla, mitä seurasi kloroformiuutto ja se 25 otettiin talteen vedestä etanolisaostuksen jälkeen. Saatu DNA-molekyyli yhdistettiin erillisissä reaktioseoksissa jokaisen edellä saadun kolmen DNA-fragmentin kanssa, ja se liitettiin T4-DNA-ligaasin avulla, kuten on aiemmin kuvattu. Reaktioseokseen sisältyvää DNA:ta käytettiin 30 kompetenttien E. coli K-12 kanta 294:n solujen [K. Backman et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73 (1976), ss. 4174-4198] transformointiin, joka suoritettiin standardimenetelmien avulla [V. Hershfield et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 71 (1974), ss. 3455 - 3459], ja bakteereja levitettiin 35 ohuesti LB-maljoille, jotka sisälsivät 20 pg/ml tetrasyk- ie 79550 liiniä. Valittiin useita tetrasykliinille resistenttejä pesäkkeitä, eristettiin plasmidi-DNA, ja halutun fragmentin läsnäolo varmistettiin restriktioentsyymillä suoritetun analyysin avulla. Syntyvää plasmidia nimitetään pBRHrksi.

5 Hepatiitti B:n virusgenomin Eco Rl:n ja BamHI:n digestiotuote saatiin tavanomaisin keinoin ja kloonattiin plasmidi-pGH6:n Eco Rl- ja BamHI-kohtiin [D. V. Goeddel et ai.. Nature 281 (1979), s. 544] plasmidi pHS32:n muodostamiseksi. Plasmidi pHS32 pilkottiin Xbalrllä, uutettiin 10 fenolilla ja kloroformilla ja saostettiin etanolilla. Sitten sitä käsiteltiin 1 pl:lla E. coli-polymeraasi I:n Klenow-fragmenttia (Boehringer-Mannheim) 30 pl:ssa poly-meeripuskuria (50 mM kaliumfosfaattia, pH 7,4; 7 mM MgCl2 ; 1 mM β-merkaptoetanolia), joka sisälsi 0,1 mM dTTPra sekä 15 0,1 mM dCTP:a, 30 minuutin ajan 0°C:ssa, sitten 2 tunnin ajan 37°C:ssa. Tämä käsittely aikaansai Xbal:n pilkkomis-kohdan 5' ulostyöntyvälle päälle komplementaarisista neljästä nukleotidistä kahden täyttymisen: 20 5' CTAGA- 5' CTAGA ---------- -> 3' T 3’ TCT ---

Liitettiin kaksi nukleotidiä, dl ja dt, muodostaen 25 täten pääte, jossa oli kaksi 5' ulostyöntyvää nukleotidia. Plasmidin pHS32 lineaarinen tähde (fenoli- ja klorofor-miuuton sekä etanolisaostuksen jälkeen vesiliuoksesta takaisin saatu) pilkottiin Eco RI:llä. Suuri plasmidifrag-mentti erotettiin pienemmästä Eco Rl - Xbal-fragmentista 30 PAGE:n avulla sekä eristettiin elektroeluaatin jälkeen.

Tämä pHS32:sta (0,2 pg) saatu DNA-fragmentti liitettiin edellä kuvattujen kaltaisissa olosuhteissa tryptofaani-operonin ('v 0,01 pg) Eco Rl - Taq I-fragmenttiin, joka oli peräisin pBRH-trp:stä.

i7 79550

Menetelmässä, jossa fragmentti pHS32 liitetään Eco Rl - Taq I-fragmenttiin, kuten edellä on kuvattu, Taq I esiintyöntyvä pää liitetään jäljellä olevaan esiintyönty-vään Xba I-päähän, vaikka se ei täysin vastaa Watson-Crick-5 emäspareja: ___T CTAGA __ _ TACTAGA__ + ---------> _AGC TCT _ . ____AGCTCT______ 10 Tästä ligaatioreaktioseoksesta osa transformoitiin E. coli 294-soluihin, käsiteltiin lämmöllä, ja sitä levitettiin ohuesti LB-maljoille, jotka sisälsivät ampisil-liiniä. Valittiin 24 pesäkettä, jotka olivat kasvaneet 3 15 ml:ssa LB-alustaa, ja plasmidi eristettiin. Kuudella näistä havaittiin olevan Xba I-kohta, joka oli regeneroitu E. colin katalysoiman DNA:n muutoksen ja replikaation välityksellä:

20 _ TCT AGA__ - ______ T AT AGA

__AGCTCT_ ________ AGATCT___ Näiden plasmidien havaittiin myös pilkkoutuvan Eco RI:llä ja Hpa I:llä ja antavan odotetut restriktiofragmen*-25 tit. Yhtä plasmidia, joka oli merkitty pTrp 14:ksi, käytettiin heterologisten polypeptidien ekspressioon, kuten seu-raavassa on esitetty.

Plasmidi pHGH 107 [D. V. Goeddel et ai., Nature 281 (1979), s. 544] sisältää ihmisen kasvuhormonia vas-30 taavan geenin, joka on muodostunut 23 aminohappokodonista, jotka synteettiset DNA-fragmentit ovat tuottaneet, sekä 163 aminohappokodonista, jotka on saatu komplementaarisesta DNA:sta, joka on tuotettu ihmisen kasvuhormonin lähetti-RNA:n käänteistranskription avulla. Tämä geeni, vaikka 35 siltä puuttuu ihmisen kasvuhormonin "pre"-sekvenssi, si- ie 79550 sältää translaation ATG-alkukodonia. Geeni eristettiin 10 pg:sta pHGH 107:ää Eco RI:llä suoritetun käsittelyn jälkeen, jota seurasi käsittely E. coli-polymeraasi I:n Kle-now-fragmentilla ja dTTPrllä ja dATPrllä, kuten edellä on 5 kuvattu. Fenolilla ja kloroformilla suoritetun uuttamisen ja etanolisaostuksen jälkeen plasmidia käsiteltiin Bam-HI:llä.

Ihmisen kasvuhormonigeenin ("HGH") sisältävä fragmentti eristettiin PAGE:n avulla, jota seurasi elektro-10 eluutio. Syntyvä DNA-fragmentti sisältää siis tetrasyk-liinille resistentin rakennegeenin ensimmäiset 350 nukleotidiä, mutta siltä puuttuu tetrasykliini-promoottori-operaattorijärjestelmä niin, että kun sen jälkeen kloonataan ekspressioplasmidiin, plasmidit, jotka sisältävät 15 mutatoituneen kohdan, voidaan paikallistaa tetrasykliini-resistenssin säilymisen perusteella. Koska fragmentin Eco Rl-pää on täydennetty Klenow-polymeraasi I-menetelmän avulla, fragmentilla on yksi tylppä ja yksi tarttuva pää varmistaen sopivan orientaation, kun se on myöhemmin inser-20 toitu ekspressioplasmidiin.

Seuraavaksi valmistettiin ekspressioplasmidi pTrp 14 ottamaan vastaan edellä valmistetun HGH-geenin sisältämä fragmentti. Tällöin pTrp 14 pilkottiin Xbalrllä ja muodostuneet tarttuvat päät täydennettiin Klenow-polymeraasi I-25 menetelmän avulla käyttämällä dATP:a, dTTP:a, dGTP:a ja dCTP:a. Fenoli- ja kloroformiuuton ja etanolisaostuksen jälkeen syntyvää DNA:ta käsiteltiin PAGE:n ja elektroeluu-tion avulla. pTrp 14:sta peräisin olevalla fragmentilla on yksi tylppä pää ja yksi tarttuva pää sallien täten re-30 kombinaation sopivassa asemassa HGH-geenin kanssa, joka sisältää aiemmin kuvatun fragmentin.

HGH-geenifragmentti ja pTrp 14 Xba-BamHI-frag-mentti yhdistettiin ja liitettiin yhteen edellä kuvatuissa olosuhteissa. Täydennetyt Xbal- ja Eco Rl-päät liitettiin i9 79550 yhteen tylppäpää-ligaatiolla Xbal- ja Eco Rl-kohdan uudelleen aikaansaamiseksi:

Xba täydennetty Eco Rl täydennetty HGH-geenin alku

5 _TCTAG AATTCTATG _TCT AGAAT TCTATG

+ ---> _AGATC TTAAGATAC — AGATCTTAAGATAC —

Xba I Eco Rl 10 Tämä konstruktio saa myös uudelleen aikaan tetrasyk- liinille resistentin geenin. Koska plasmidi pHGH 107 eks-pressoi resistenssin tetrasykliinille promoottorista, joka sijaitsee HGH-geenistä käsin ylävirtaan (lac-promoottori), tämä konstruktio, joka on merkitty pHGH 207:ksi, sallii 15 geenin ekspression tetrasykliiniresistenssin suhteen tryp-tofaanipromoottori-operaattorin kontrollin alaisena. Li-gaatioseos siirrettiin E. coli 294:ään ja valittiin pesäkkeitä LB-maljoille, jotka sisälsivät tetrasykliiniä 5 pg/ml.

20 Plasmidi pHGH 207 oli Eco Rl:n digestoima ja trp- promoottori, joka sisälsi 300 bp Eco RI-fragmentin, saatiin takaisin PAGE:n avulla, jota seurasi elektroeluutio. 300 bp Eco RI-fragmentti sisältää E. coli trp-promoottorin, operaattorin ja trp-ohjaajaribosomin sitoutumiskohdan, 25 mutta siltä puuttuu ATG-sekvenssi translaation aloittamista varten. Tämä DNA-fragmentti kloonattiin pLeIF-A:n Eco RI-kohtaan.

Edellä esitetty trp-fragmentti on E. coli-trypto-faanioperonin analogi, jossa ns. trp-vaimennin on poistettu 30 ekspressiotason lisäämiseksi hallitusti. Ekspressioplas- mideja, jotka sisältävät muunnellun trp-regulonin, voidaan kasvattaa ennalta määritellyille tasoille elatusaineessa, johon on lisätty tryptofaania riittävässä määrin promoottori-operaattori- järjestelmän repressoimiseksi, sitten 20 79550 tryptofaani poistetaan niin, että systeemin ekspressio estetään ja saadaan aikaan aiotun tuotteen ekspressio.

Aivan erityisesti 250 pg plasmidi pL31:ta diges-toitiin Pst I:llä ja 1000 bp insertti eristettiin geeli-5 elektroforeesin avulla 6-%:isella polyakryyliamidigeelillä. Geelistä elektroeluoitiin noin 40 pg inserttiä ja jaettiin 3:een erään jatkodigestiota varten: a) 16 pg:n näyte tätä fragmenttia digestoitiin osittain 40 yksiköllä Bgl II:ta 45 minuutin ajan 37°C:ssa, ja reak- 10 tioseosta puhdistettiin 6-%:isella polyakryyliamidigeelillä. Saatiin noin 2 pg haluttua 670 bp-fragmenttia.

b) Eräs toinen näyte (8 pg), joka käsitti 1000 bp Pst I-inserttiä, pilkottiin sekvenssispesifisesti Ava II:11a ja Bgl II:11a. Saatiin 1 pg 150 bp-fragmenttia geelielekt- 15 roforeesin jälkeen; ja c) 16 pg 1000 bp-fragmenttia käsiteltiin Sau 3a:lla ja Ava II:11a, 10-%:isella polyakryyliamidigeelillä suoritetun elektroforeesin jälkeen saatiin noin 0,25 pg 10 pmoolia) 34 bp-fragmenttia.

20 Kaksi desoksioligonukleotidiä, 5’-dAATTCATGTGT

(fragmentti 1) ja 5'-dGATCACACATG (fragmentti 2) syntetisoitiin fosforiesterimenetelmällä [Maxam ja Gilbert, Methods Enzymol 65 (1980), ss. 499 - 560]. Fragmentti 2 fos-foryloitiin seuraavasti: 200 pl (40 pmoolia) ( y*32P) ATP:tä 25 (Amersham, 5000 Ci/mmooli) kuivattiin ja liuotettiin uudestaan 30 pl:aan 60 mM Tris-HCl (pH 8), 20 mM MgCl2:a, 15 mM β-merkaptoetanolia, joka sisälsi 100 pmoolia DNA-frag-menttia ja 2 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia. 15 minuutin kuluttua 37°C:ssä lisättiin 1 pl 10 mM ATP:tä ja reak-30 tion annettiin tapahtua vielä toiset 15 minuuttia. Seosta kuumennettiin sitten 70°C:ssa 15 minuutin ajan, ja se yhdistettiin 100 pmoolin kanssa 5'-OH-fragmentti l:tä sekä 10 pmoolin kanssa 34 bp Sau 3A - Ava ΙΙ-fragmenttia. Ligaa-tio suoritettiin 5 tunnin ajan 4°C:ssa 50 pl:ssa 20 mM 35 Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitolia, 0,5 2i 79550 mM ATP ja 10 yksikköä T4-DNA-ligaasia. Seokselle suoritettiin elektroforeesi 6-%:isella polyakryyliamidigeelillä ja elektroeluution avulla saatiin 45 bp-tuote. Saatiin 860 000 Cerenkov cpm (•'v 30 ng, 1 pmooli) ja näyte yhdistet-5 tiin 0,5 pg:n kanssa (5 pmoolia) 150 bp Ava II -Bgl II-fragmenttia sekä 1 pg:n kanssa (2 pmoolia) 670 bp Bgl II - Pst I-fragmenttia. Ligaatio suoritettiin 20°C:ssa 16 tunnin ajan käyttäen 20 yksikköä T4-DNA-ligaasia. Ligaasi inaktivoitiin kuumentamalla 65°C:seen 10 minuutin ajaksi. 10 Seosta digestoitiin sitten Eco RI:llä ja Pst I:llä geenin polymeerien poistamiseksi. Seosta puhdistettiin 6-%:isella polyakryyliamidigeeli-elektroforeesilla. Eristettiin 865 bp-tuote 36 000 cpm (/« 0,04 pmoolia, 20 ng). Tästä puolet (10 ng) liitettiin pBR322:teen (0,3 pg) Eco 15 Rl- ja Pst I-kohtien välillä. E. coli 294:n transformaatio tuotti 70 tetrasykliinille resistenttiä ampisilliinille herkkää transformanttia. 18 näistä transformanteista eristettyä plasmidi-DNA:ta digestoitiin Eco RI:llä ja Pst I:llä. 18 plasmidista 16 oli 865 bp Eco Rl - Pst I-frag-20 mentti koko pituudessaan. 1 pg:n verran yhtä näistä (pLelF-A:ta) pilkottiin Eco RI:llä ja liitettiin 300 bp Eco RI-fragmenttiin (0,1 pg), joka sisälsi E. colin trp-promoot-torin sekä trp-ohjaajaribosomin sitoutumiskohdan, edellä kuvatulla tavalla valmistettuna. Trp-promoottorin sisältä-25 vät transformantit identifioitiin käyttämällä 3 2 P-trp-koetinta käyttäen Grunstein-Hogness et ai.:n pesäkkeiden seulontamenetelmää [Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 72 (1975), s, 3961]. Asymmetrisesti sijainnut trp-fragmentin Xba I-kohta antoi mahdollisuuden määrittää rekombinantit, joissa 30 trp-promoottori sijaitsi LeIF-A-geenin suunnassa.

Uutteet IF-määritystä varten valmistettiin seuraavasti: 1 ml:n viljelmiä kasvatettiin L-ravintoliuoksessa, joka sisälsi 5 pg/ml tetrasykliiniä A550:n arvoon noin 1,0, sitten se laimennettiin 25 ml:aan M9-elatusaineella, 35 joka sisälsi 5 pg/ml tetrasykliiniä. 10 ml:n näytteet 22 79550 koottiin sentrifugoiden, kun A550 saavutti arvon 1,0, ja solupelletit suspentoitiin 1 ml:aan 15-%:ista sakkaroosia, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) ja 50 mM EDTA. Lisättiin 1 mg lysotsyymiä ja 5 minuutin kuluttua 0°C:ssa solut rikot-5 tiin sonikaatiolla. Näytteitä sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 15 000 rpm:lla Sorvali SM-24-roottorilla. Supernatant-tien interferoniaktiivisuus määritettiin vertailemalla LeiF-standardeihin sytopaattisen vaikutuksen (CPE) inhibii-tiomäärityksen avulla. IF-molekyylien lukumäärän määrit-10 tämiseksi solua kohti käytettiin LelF-spesifistä aktiivisuutta 4 x 10® yksikköä/mg [Rubinstein et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76 (1979), s. 640].

Klooni pLeIF-A trp 25, jossa trp-promoottori oli insertoitu toivottuun suuntaan, tuotti korkeita aktiivi-15 suustasoja (aina 2,5 x 10® yksikköä/litra). E. coli K-12 kannan 294/pLeIF-A trp 25: n tuottama IF toimi kuten autenttinen ihmisen LeiF; se on kestävä pH:ssa 2 suoritetun käsittelyn suhteen, ja kaniinin leukosyytti-vasta-aineet neutraloivat sen. Interferonin näennäinen molekyylipaino 20 on noin 20 000.

cDNA:iden eristys toisten leukosyytti-interferonien saamiseksi DNA poistettiin Pst I:n avulla täysin karakterisoidusta LeIF-A:n cDNA:ta sisältävästä plasmidista, eristet-25 tiin elektroforeettisesti ja leimattiin julkaistun menetelmän mukaisesti [Taylor et ai., Biochem. Biophys. Acta 442 (1976), s, 324] 32P:11a. Syntyvää, radioaktiivisesti leimattua DNA:ta käytettiin koettimena seulottaessa uusia E. coli 294-transformantteja in situ pesäkkeiden seulon-30 tamenetelmällä (Grunstein et ai., supra). Eristettiin pesäkkeitä, jotka hybridisoituivat vaihtelevissa määrin koettimen kanssa. Näistä pesäkkeistä peräisin oleva plas-midi-DNA ja 10 edellä esitetystä menettelystä peräisin olevaa hybridisoituvaa pesäkettä eristettiin Pst-pilkkomi-35 sen avulla ja karakterisoitiin 3:11a eri menetelmällä.

23 7 9 5 5 0

Ensin näitä Pst-fragmentteja karakterisoitiin pilkkomalla niitä restriktioendonukleaasilla, käyttäen entsyymejä Bfl II, Pvu II ja Eco Rl. Tämä analyysi teki mahdolliseksi luokitella eri tyypit (LeIF-A, LeIF-B ja LeIF-D), joiden 5 eri pilkkoutumiskohdat muistuttavat LeIF-A:ta koodaavaa tunnettua sekvenssiä ja presekvenssiä. LeIF-D:n uskotaan olevan identtinen Nagatan et ai., Nature 284 (1980), s. 316 kuvaaman kanssa.

Seuraavaksi tiettyjä DNA:itä tutkittiin tunnetulla 10 hybridisaatiovalintamääritysmenetelmällä [Cleveland et ai., Cell 20 (1980), s. 95] sen suhteen, oliko niillä kyky selektiivisesti poistaa LelF mRNArn KG-l-solun RNA:sta, joka sisältää poly-A:n. LeIF-A ja -B olivat tässä kokeessa positiivisia. Jälkimmäiset Pst-fragmentit sisällytettiin 15 ekspressioplasmidiin, jolla transformoitiin E. coli 294, ja fragmentit ekspressoitiin. Ekspressiotuotteet, joiden uskottiin olleen preinterferoneja, olivat kaikki positiivisia CPE-määrityksessä interferoniaktiivisuuden suhteen. Edellä esitetyn lisäksi kaikki kuvatut LelF-tyypit on 20 sekvensoitu.

Toinen kypsä leukosyytti-interferoni

Kypsän LeIF-B:n geenin sisältävän eristetyn fragmentin sekvenssi osoittaa tyyppien A ja D ensimmäisten 14 nukleotidin olevan identtiset. Sen mukaisesti eristettiin 25 fragmentti pLelF-A 25:stä, joka kantaa trp-promoottori-operaattorin, ribosomin sitoutumiskohdan sekä LelF- (A = B) geenin alun, ja yhdistettiin tämä B-sekvenssin jäljelle jäävään osaan ekspressioplasmidissa.

Kuviossa 7a esitetyn sekvenssin saamiseksi noin 30 950 bp Sau 3a - Pst I-fragmentista useat vaiheet olivat tarpeellisia yhden tai useamman välissä olevan Sau 3a-pilk-komiskohdan läsnäolon vuoksi, ts.: 79550 24 X) Eristettiin seuraavat fragmentit: a) 110 bp Sau 3a:sta Eco RI:een b) 132 bp Eco Rl:stä Xba:han c) > 700 bp Xba:sta Pst:hen.

5 2) Fragmentit la) ja Ib) ligatoitiin ja pilkottiin Xba:lla ja Bgl II:11a Sau 3a:n ja Xba:n loppupäiden itsepolymeri-soitumisen poissulkemiseksi (asiaankuuluva Sau 3a-kohta oli Bgl II-kohdan sisäpuolella; Bgl II pilkkoo siten, että jäljelle jää Sau 3a:n tarttuva pää). 242 bp-fragmentti 10 eristettiin.

3) 2:n ja lc):n tuote ligatoitiin ja pilkottiin Pst I:llä ja Bgl II:11a, jotta jälleen estettiin itsepolymerointi. Kuvion 7a mukainen, noin 950 bp-fragmentti, Sau 3a - Pst I, eristettiin. Tämä fragmentti käsitti LelF-B-geenistä 15 sen osan, joka ei ollut yhteinen LeIF-A:n kanssa.

4) Noin 300 bp-fragmentti (Hind III - Sau 3a) käsittäen trp-promoottori-operaattorin, ribosomin sitoutumiskohdan, ATG-alkusignaalin sekä LeIF-A:n kysteiinikodonin, eristettiin pLeIF-A 25:stä.

20 5) Noin 3600 bp-fragmentti (Pst I - Hind III) eristettiin pBr 322:sta. Tämä käsitti replikonin ja koodatun tetrasyk-liinin, mutta ei ampisilliini-resistenssiä.

6) Vaiheissa 3, 4 ja 5 saadut fragmentit liitettiin trip-letiksi ja syntyvä plasmidi transformoitiin E. coli K-kanta 25 294:ään.

Transformanteille suoritettiin pienoisseulonta [Birnboim et ai., Nucleid Acid. Research 7, (1979), s.

1513], ja plasmidinäytteitä pilkottiin Eco RI:llä. Pilkkomiset antoivat 3 fragmenttia; luonteeltaan seuraavat: 30 1) Eco Rl - Eco Rl trp promoottori-fragmentti; 2) pL4:n sisäinen Eco Rl - Eco Rl-fragmentti; ja 3) proteiinitranslaation lähtösignaali pL4:n Eco Rl-fragmentille.

CPE-määrityksessä edellä kuvatulla tavalla valmis-35 tetuista klooneista saadut bakteeriuutteet antavat tyypil- 25 79550 lisesti noin 10 x 106 yksikköä interferoniaktiivisuutta litraa kohti, kun A550 - 1. Tällä tavalla valmistettu edustava pesäke on 294/pLeIF-B trp 7.

Muita kypsiä leukosyyttejä 5 Muita täyspitkiä geenifragmentteja, jotka käsittävät muita LeiF-tyyppejä, voidaan valmistaa toivomusten mukaisesti ja sisällyttää ekspressiovälineisiin ekspressiota varten, kuten LeIF-A:n tapauksessa. Tavanomaisin keinoin suoritettu täydellinen sekvenssointi paljastaa, sijaitseeko 10 restriktiokohta riittävän lähellä kypsän interferonityypin ensimmäistä aminohappokodonia presekvenssin eliminoimiseksi restriktiopilkonnan avulla sekä N-terminaalisten aminohappojen kodonien korvaamiseksi, jotka aminohapot poistuvat presekvenssiä poistettaessa ligantoimalla synteettinen 15 DNA-fragmentti, kuten edellä on kuvattu. Jos näin ei ole, voidaan käyttää menetelmää, jota Kleid et ai., supra, ovat käyttäneet. Lyhyesti sanottuna, tähän kuuluu presekvenssin sisältävän fragmentin pilkkominen täsmälleen ennen kohtaa, jossa kypsän polypeptidin ensimmäisen aminohapon 20 kodoni alkaa; seuraavilla tavoilla: 1) muuttamalla kaksisäikeinen DNA yksisäikeiseksi DNArksi mainittua kohtaa ympäröivällä alueella; 2) hybridisoimalla vaiheessa a) muodostuneelle yksisäikei-selle alueelle yksisäikeisen DNA:n komplementaarinen alku- 25 pätkä, jonka 5'-pää sijaitsee vastapäätä nukleotidiä, joka yhdistää tarkoitetun pilkkomiskohdan; 3) palauttamalla toisen säikeen se osa, joka eliminoitui vaiheessa 1 ja joka sijaitsee alukkeesta 3'-suunnassa, DNA-polymeraasin reaktion avulla adeniinia, tyrniiniä, guaniinia 30 sekä sytosiiniä sisältävien desoksinukleotiditrifosfaattien läsnäollessa; ja 4) digestoimalla jäljelle jäävä DNA:n yksisäikeinen pala, joka ulottuu aiotun pilkkomiskohdan toiselle puolelle.

Lyhyt pätkä synteettistä DNA:ta, joka koodaavan 35 säikeen 3'-päässä päättyy translationaalisen lähtösignaalin 26 79550 ATGrhen, voidaan sitten liittää esim. tylppäsidoksella syntyvään kypsien interferonien geeniin, ja geeni voidaan liittää insertion avulla ekspressioplasmidiin ja saattaa promoottorin ja siihen assosioituneen ribosomin sitomiskoh-5 dan kontrollin alaiseksi.

Edellä kuvatulla tavalla LeIF-D:tä koodaavat geeni-fragmentit koottiin sopivasti suoraa bakteeri-ekspressiota varten. Näiden lisäleukosyytti-interferonien tuottamissuun-nitelmaan kuului kussakin tapauksessa käyttää likimain 10 300 bp-fragmenttia (Hind III - Sau 3a), joka sisältää trp- promoottori-operaattorin, ribosomin sitomiskohdan, ATG-lähtösignaalin ja pLeIF-Α 25:stä LeIF-A:n kysteiinikodonin. Tähän yhdistettiin geenifragmentteja lisäinterferonin geeneistä, jotka koodaavat niiden vastaavia aminohapposek-15 venssejä kaikille yhteisen alkukysteiinin toisella puolella. Kutakin syntyvää plasmidia käytetään E. coli K-12 kanta 294:n transformaatioon. Vastaavien geenien muodostamiseksi suoritetut ligaatiot olivat seuraavat:

LeIF-D

20 Eristetään pLeIF-D:stä: a) 35 bp Sau 3a:sta Ava II:een b) 150 bp Ava Il:sta Bgl II:een c) likimain 700 bp Bgl:stä Pst I:een

Eristetään pLeIF-Α 25:stä: 25 d) 300 bp Hind III:sta Sau 3a:hän Eristetään pBr 322:sta: e) likimain 3600 bp Hind III:sta Pst I:een Rakenne 1) Yhdistetään a) + b), pilkotaan Bgl II ja puhdistetaan 30 185 bp tuote (1).

2) yhdistetään (1) + d), pilkotaan Hind III, Bgl II ja puhdistetaan likimääräisesti 500 bp tuote (2).

3) yhdistetään (2) + c) + e) ja transformoidaan E. coli syntyvällä plasmidilla.

27 79550 Tällä tavalla valmistettu edustava klooni on E. coli K-12 kanta 294/pLeIF-D trp 11.

Seuraavissa rakennelmissa käytetyt menetelmät ja materiaalit olivat edellä esitetyn kuvauksen mukaiset. 5 Seuraavassa taulukossa 4 esitetään hybridi-LelF-plasmidien tiettyjen rakenteiden yksityiskohdat.

28 79550 i i o ~ ~ ο ^ 2c ~ n ~

:ii W »1 C HQ H < HQ H < H

> Q) (O H H H H H

>1 O H Q Q Q Q Q

4-) Οι Οι -H H 0 H 0 H HH HH 0 c to ο ό a> a > <u a, > m Ch tj> w a, tn a> Οι > >i x* -h -h q o q q o q q o cq q o pq q o q

Cfl <D CO 6 Oi 4-> — Cu 4-> — Oi 4-) — O, 4-> — di 4-1 '—

.._______ *H

— _ .p

I vo in vd m vd 4J

04-1 VD VD VD VD VD C

CO 1—1 ·—I 1—* *—I 1—( Cl) •HO. I I I I 1 — 6 6 (0 oo 04 ^ oo — oo :it3 tr> 1¾ X2 σν co vd vd :a! cn 4-) (0

___ 4-) 10 H

U) .. 4-1 C ·· C O, HH HLD HH -H C Oi -H OQ X2 — H 04 Η (XJ X2 (0 Οι 4-) — 4-1 — 4-1 — 4-) Q O 4-> Q O X2 •H — 10 CU :(0 (0 O, :(0 (0 O, :(0 4-· H O 4-> -H uo 4-) :(0 C4C4-)Q>44-)QM4J-HQjr'-H(Ur' o

4-) :(0 4-1 (0 4-)(0 -PIOIOQ^COQ-. O

c ex i - I --I ·· o a. — o a < σ, Φ 0 q ο. <c Pi p ft — oo 6 Oi H X) H X) H X) H - in H _

tn Oj HQ HQ HQ H H 00 H H 0- C

(OO HOHOHO

0 H 0(D(D 0ajinHa>OH4->Oi04->0,

Q -- >Qin >Qin Co Q vd CotOO > (0 Μ -H

Q 0( e Q Oi ? CO Pi ? CQQ4-) QQ4-) 0 —- I 10 —-—— -----0 1 (0 0 CO H (N OVI OO H c

-HQiCn <Ti vd vd σν O

6 <0 I I I I I C -H

(¾ XC 1—I 1—I 1—( 1—I <—* (1)4-) -H (0 _____ x a) vr h cr>

:.0 0 -H

O 0 (0 XI

M -H (0 -H (0 1

Ai HID HH I—14-· · H 4-) -HH

0 H 04 H H 4-lvn+JHH 0 Η -H — — 4-)C(N4-ICHHuO Oj 4-) 0 4-> — 0 Oi :(0 0 0( :(0 (0 (1) (OO) 04 _ in

(0 -P :0 >O4-)>O4-)PM6O(Q6C40 :(0 -HQ

Eh C :0 q 4-> to Q 4-) (0 CnO tr> 0 > Oi 4-> C

► · 0) Oi ·· ·· 1(04-· Ir04-)QC(0-Hl

6 O I < O, I Q Qj U H 4-> ·· -H

CP X2 Λ X2 H M-t H 44 Q I OiCH

(0 H HQ HQ H H (0X20 . O (0 Hin H00 -HQ -HQ H -H(0 * - Q — iOO)OO0a)COHCHHS-(H Q in -O X2

. : X2QO4X3Q<NCn0<DtT(0a)(OHOoa)X

X Oi —' X a. ^ CQ0Q PQ0Q X3 Q) 04 g (OOi (OQiXQ1— c --------------- -. . ______ c · 0) 1J0 0 C 04

•H * -H

(0 Ή -H I—I 0( (0 XS O (0 u QJ -H O (0 4-)

)-1 6 4-) (0 (0 I I (0 C

D( 10 Xi -H <C, to 0 o; 6

X H > HQ

W 0( — Q) H

__ 4-> 0)

I Q

z a 10 — — H -X * 0 : 0 I — C O 4-) OCOio vd in vd m X-hO(Vd vd vd vd vd

C 6 0 H H I—I (—l H

! x m xo

- -H

I Ό

-- Q -H

HO Q < Q (< CQ

Q)X2CQ(<Q< Q >.

XC______ 29 79550

Edelleen taulukkoon 4 viitaten, ensimmäiset 4 kuvattua hybridi-LeIF:a on tuotettu kahdesta LelF-ekspressio-plasmldlsta. Bgl II-kohtaa, joka on yhteinen LelF-A:n ja D:n DNA:ille, on käytetty konstruoimaan ekspressloplasmldl 5 pLelF trp AD (Bgl II), joka koodaa LeIF-A:n 63 aminoter-mlnaallsta aminohappoa ja LeIF-D:n 102 karboksitermihaa-llsta aminohappoa. Samaa kohtaa käytettiin konstruoitaessa ekspressloplasmidia pLelF trp DA:sta (Bgl II), joka koodaa LeIF-D:n 64 amlnotermlnaallsta aminohappoa ja LeIF-A:n 10 102 karboksltermlnaallsta aminohappoa. Pvu II-kohtaa on käytetty konstruoitaessa kahta muuta hybridi-interferonin ekspressloplasmidia: A:n 91 amlnotermlnaallsta aminohappoa D:n 74 karboksiterminaalisen aminohapon kanssa [pLelF trp AD (Pvu II)] sekä LeIF-D:n 92 amlnotermlnaallsta aminohap-15 poa LeIF-A:n 74 karboksiterminaalisen aminohapon kanssa [pLelF trp DA (Pvu II)]. Kaikkiaan seuraavasti: pLelF-ΑΡ trp (Pvu II): pLeIF-A trp 25:stä Xb I - ja Pst I-digestion avulla saatu suuri (^ 39000 bp) fragmentti liitettiin pLeIF-A 20 trp 25:n 285 bp Xba I - Pvu II-fragmenttiin ja pLeIF-D trp 11:n likimain 550 bp Pvu II - Pst I-fragmenttiin. pLeIF-DA trp (Pvu II): pLeIF-A trp 25:stä Xba I - ja Pst I-digestion avulla saatu suuri (^3900 bp) fragmentti liitettiin pLeIF-D trp 25 11 :n kanssa 288 bp Xba I - Pvu II-fragmenttiin sekä pLelF- A trp 25:n likimain 550 bp Pvu II - Pst I-fragmenttiin. pLelF-ΑΡ trp (Bgli II): pLeIF-A trp 25:stä Bgl II - ja Pst I-digestion avulla saatu suuri fragmentti liitettiin pLeIF-D trp 11:n 30 600 bp Bgl II - Pst I-fragmenttiin.

pLeIF-DA trp (Bgl II): pLeIF-D trp ll:stä Bgl II - ja Pst I-digestion avulla saatu suuri fragmentti liitettiin likimain 700 bp-fragmenttiin, joka oli saatu pilkkomalla pLeIF-A trp 25:ttä 3o 7 9550

Pst I:llä sekä sitä seuraavalla osittaisella Bgl Il-diges-tiolla.

pLeiF-AB trp (Pvu II): pLeIF-A trp 25:stä Xba Itllä ja Pst I:llä suoritetun 5 digestion avulla saatu suuri (* 3900 bp) fragmentti liitettiin pLeIF-A trp 25:n 285 bp Xba I - Pvu II-fragment-tiin ja pLeIF-Β trp 7:n likimain 750 bp Pvu II (osittais)-Pst I-fragmenttiin.

Claims (12)

1. 3i 79550