ES2983571T3 - Terapias dirigidas a CD47 para el tratamiento de enfermedades infecciosas - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para tratar a un sujeto con una infección por un patógeno intracelular, mediante la administración de un agente que reduce la unión de CD47 en una célula infectada a SIRPα en una célula fagocítica huésped, en una dosis eficaz para aumentar la fagocitosis de las células infectadas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Terapias dirigidas a CD47 para el tratamiento de enfermedades infecciosas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La renovación de las células comienza con la inducción de un programa apoptótico u otros cambios celulares que las marcan para su eliminación, y el posterior reconocimiento de marcadores por parte de los fagocitos, incluidos los macrófagos, las células dendríticas y similares. Este proceso requiere una eliminación específica y selectiva de las células no deseadas. A diferencia de las células sanas, las células no deseadas/envejecidas/muertas muestran marcadores o ligandos denominados señales "cómeme", es decir, "yo alterado", que a su vez pueden ser reconocidos por los receptores de los fagocitos. Las células sanas pueden mostrar señales de "no me comas" que inhiben activamente la fagocitosis; estas señales están reguladas a la baja en las células moribundas, están presentes en una conformación alterada o son sustituidas por la regulación positiva de las señales "cómeme" o pro fagocíticas. La proteína CD47 de la superficie celular de las células sanas y su compromiso con un receptor fagocítico, SIRPa, constituye una señal clave de "no me comas" que puede desactivar la fagocitosis mediada por múltiples modalidades, incluida la eliminación de células apoptóticas y la fagocitosis mediada por FcR. El bloqueo del compromiso de SIRPa mediado por CD47 en un fagocito, o la pérdida de expresión de CD47 en ratonesknockout,puede provocar la eliminación de células vivas y eritrocitos no envejecidos. Alternativamente, el bloqueo de SIRPa también permite la absorción de objetivos que normalmente no son fagocitados, para aquellas células en las que las señales prefagocíticas también están presentes.

CD47 es una glicoproteína transmembrana expresada ampliamente con un solo dominio similar a Ig y cinco regiones que abarcan la membrana, que funciona como un ligando celular para SIRPa con la unión mediada por el dominio NH2-terminal de tipo V de SIRPa. La SIRPa se expresa principalmente en células mieloides, como macrófagos, granulocitos, células dendríticas mieloides (DC), mastocitos y sus precursores, incluidas las células madre hematopoyéticas. Los determinantes estructurales de la SIRPa que median la unión a CD47 son analizados por Lee et al. (2007) J. Immunol. 179:7741-7750; Hatherley et al. (2007) J.B.C. 282:14567-75; y el papel de la dimerización cis de SIRPa en la unión a CD47 se discute en Lee et al. (2010) J.B.C. 285:37953-63.

En consonancia con la función de CD47 de inhibir la fagocitosis de células normales, existen pruebas de que se regula positivamente de modo transitorio en las células madre hematopoyéticas (HSC) y progenitoras justo antes y durante su fase migratoria, y que el nivel de CD47 en estas células determina la probabilidad de que sean engullidas in vivo. CD47 también se regula positivamente de forma constitutiva en varios tipos de cáncer. La sobreexpresión de CD47 por las células tumorales puede aumentar la patogenicidad al permitir que la célula eluda la fagocitosis.

Suparaket al.(2011)Microbes and Infection13:1006-1011 informa de que la fusión celular inducida porBurkholderia pseudomalleien macrófagos U937 puede ser inhibida por anticuerpos monoclonales contra moléculas de la superficie celular del huésped. El documento WO 2011/143624 describe anticuerpos monoclonales humanizados y quiméricos frente a CD47. El documento WO 2010/130053 describe composiciones y métodos para tratar cánceres hematológicos dirigidos a la interacción SIRPa-CD47. El documento WO 2009/131453 describe composiciones y métodos para mejorar el sistema inmunitario.

La muerte celular programada (PCD) y la eliminación de células fagocíticas son formas habituales en que las células dañadas, precancerosas, inflamadas o infectadas responden a las amenazas patógenas para el organismo. Sin embargo, algunas infecciones persisten durante largos periodos de tiempo, lo que sugiere que las infecciones persistentes exitosas superan las vías de PCD y de eliminación de células fagocíticas. La identificación y selección de un mecanismo por el cual los agentes infecciosos superan la PCD y/o la eliminación de las células fagocíticas resultará útil para el tratamiento de las enfermedades infecciosas mediante la interrupción del mecanismo identificado. La presente invención proporciona métodos para el tratamiento de enfermedades infecciosas utilizando reactivos bloqueantes de CD47.

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona una composición para su uso en un método de tratamiento de un sujeto mamífero por infección patógena intracelular, en el que el patógeno es un retrovirus, comprendiendo el método:

administrar al sujeto un agente anti-CD47 que reduzca la unión de CD47 en una célula infectada a SIRPa en una célula fagocítica, a una dosis eficaz para aumentar la fagocitosis de la célula infectada,

en el que el agente anti-CD47 es:

(a) un anticuerpo anti-CD47,

(b) un anticuerpo anti-SIRPa que no estimula la señalización a través de SIRPa,

(c) un polipéptido derivado de SIRPa que se une específicamente a CD47, o

(d) un polipéptido soluble de CD47 que se une específicamente a SIRPa y no estimula la señalización a través de SIRPa.

Se divulgan aquí métodos para tratar a un individuo infectado con un patógeno intracelular, administrando una dosis eficaz de un agente que reduce la unión entre CD47 presente en una célula infectada con el patógeno intracelular, a SIRPa en una célula fagocítica presente en el individuo, donde la dosis es eficaz para aumentar la fagocitosis de las células infectadas. Los agentes adecuados incluyen polipéptidos SIRPa solubles de alta afinidad; CD47 soluble; anticuerpos anti CD47, anticuerpos anti-SIRPa, y similares. Los anticuerpos de interés incluyen anticuerpos humanizados, o caninizados, felinizados, equinizados, bovinizados, porcinizados, etc., y sus variantes. En la invención, el patógeno intracelular es un retrovirus.

Las realizaciones de la invención incluyen el tratamiento de un sujeto mamífero, incluyendo sin limitación perro, gato, cerdo, oveja, vaca, caballo, humano,etc.

En algunas realizaciones, los métodos son para dirigir o agotar las células infectadas, comprendiendo el contacto de una población de células con un agente que se une específicamente a CD47, con el fin de dirigir o agotar las células infectadas. En ciertos aspectos, el agente es un anticuerpo anti-CD47 o SIRPa soluble de alta afinidad conjugado con un agente citotóxico,p. ej.,isótopo radiactivo, agente quimioterapéutico, toxina,etc.Se describen métodos para la selección in vivo de células infectadas en un sujeto mediante la administración de dicho agente al sujeto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 A-D demuestra una regulación positiva de CD47 en células infectadas por el virus Friend (FV) en comparación con células no infectadas del mismo animal (7 días post-infección de ratones adultos). (A y B) Células B CD19+ (C y D) Células eritroides Ter119+. "34+" es un marcador de células infectadas por el virus, mientras que "34-" indica células no infectadas.

La Fig. 2 A-B demuestra una regulación positiva de CD47 en células infectadas por Fr98 frente a células no infectadas del mismo animal (neonatos de ratón). "34+" es un marcador de células infectadas por el virus, mientras que "34-" indica células no infectadas. El Fr98 es un virus neurotrópico de la leucemia de ratón. La Fig. 3 A-B demuestra una regulación positiva de CD47 en tipos celulares individuales infectados con el virus de la leucemia neurotrópica de ratón Fr98. (A) indica el porcentaje de cada tipo de célula que se tiñó positivamente para mAb34+ cuando se infectó con el virus en comparación con una infección simulada. (B) indica el nivel de expresión de CD47 por célula (IFM - Intensidad Media de Fluorescencia) para las células infectadas frente a las no infectadas del mismo animal. Se ensayaron múltiples tipos de células diferentes. La Fig. 4 A-D demuestra un aumento de la expresión de CD47 tras la infección por HIV de células humanas. (A-B) Se aislaron células T de personas (A) infectadas por el HIV o (B) con infección simulada. El porcentaje de células que expresaban el antígeno p24 se determinó mediante FACS. (C-D) demuestran una mayor expresión de CD47 en células T infectadas por el HIV en relación con células T no infectadas dentro de una misma muestra. Los dos gráficos en C representan experimentos duplicados. Los dos gráficos en D representan experimentos duplicados.

La Fig. 5 demuestra el aumento de los niveles de CD47 en células infectadas por el virus de La Crosse en comparación con células no infectadas para una variedad de tipos celulares diferentes (28 días post-infección de ratones).

La Fig. 6 A-B demuestra una regulación positiva de CD47 en células HeLa infectadas conChlamydiaserovar A, una cepa con tropismo macrófago reducido. La expresión de CD47 se detectó mediante tinción con la proteína de fusión recombinante SIRPa-Fc.

La Fig. 7 A-D presenta una evaluación de la actividad antiviral del anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD475F9-hlgG4 contra la infección establecida por HIV-1 (JR-CSF) en ratones SCID-hu Thy/Liv tratados por inyección intraperitoneal. (A) Resumen del protocolo experimental. (B) indica los niveles de antígeno p24 del HIV y el número de copias de ARN del HIV-1 tras el tratamiento de control o anti-CD47, según se indique. (C) representa el análisis citométrico de flujo de timocitos humanos tras el tratamiento de control o anti-CD47 según se indica. (D) muestra los recuentos celulares absolutos y el cambio de peso corporal de los animales tratados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención se refiere a una composición para su uso en un método de tratamiento de una infección por retrovirus en un sujeto mamífero mediante la administración de un agente que reduce la unión de CD47 a SIRPa, que puede denominarse en el presente documento agente anti-CD47.

Los términos "tratamiento", "en tratamiento", "tratar" y similares se utilizan aquí para referirse en general a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención total o parcial de una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de estabilización parcial o completa o curación de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", tal como se utiliza en el presente documento, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, en particular un ser humano, e incluye: (a) prevenir la aparición de la enfermedad o síntoma en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero al que aún no se le ha diagnosticado; (b) inhibir el síntoma de la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar el síntoma de la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o síntoma. Las personas que necesitan tratamiento son tanto las que ya tienen una infección como aquellas en las que hay que prevenirla. Como tal, un tratamiento terapéutico es aquel en el que el sujeto está infectado antes de la administración y un tratamiento profiláctico es aquel en el que el sujeto no está infectado antes de la administración. En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto está infectado antes de la administración. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un mayor riesgo de infección antes de la administración. En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto tiene un mayor riesgo de infección antes de la administración.

Los términos "receptor", "individuo", "sujeto", "huésped" y "paciente" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier sujeto mamífero para el que se desee un diagnóstico, tratamiento o terapia, en particular los seres humanos. "Mamífero" a efectos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluidos los seres humanos, los animales domésticos y de granja, y los animales de zoológico, deportivos o de compañía, como perros, caballos, gatos, vacas, ovejas, cabras, cerdos, etc. Preferiblemente, el mamífero es humano.

Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. Para los fines de esta invención, una cantidad eficaz de un agente anti-CD47 es una cantidad que es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, prevenir, ralentizar o retrasar la progresión del estado de la enfermedad (p. ej., infección) mediante el aumento de la fagocitosis de una célula diana.

Tal como se utiliza en el presente documento, una "célula diana" es una célula que expresa CD47 en la superficie, en la que el enmascaramiento o la alteración de otro modo del fenotipo CD47 positivo (p. ej., mediante la administración de un agente anti-CD47) produce un aumento de la fagocitosis. Por lo general, una célula diana es una célula de mamífero, por ejemplo, una célula humana.

Tal como se utiliza aquí, el término "infección" se refiere a cualquier estado en el que al menos una célula de un organismo (es decir, un sujeto) está infectada por un agente infeccioso. Tal como se utiliza aquí, el término "agente infeccioso" se refiere a una entidad biológica extraña, es decir, un patógeno, que induce un aumento de la expresión de CD47 en al menos una célula del organismo infectado. Por ejemplo, los agentes infecciosos incluyen, entre otros, bacterias, virus, protozoos y hongos. Los patógenos intracelulares revisten especial interés. Las enfermedades infecciosas son trastornos causados por agentes infecciosos. Algunos agentes infecciosos no causan síntomas reconocibles o enfermedad en determinadas condiciones, pero tienen el potencial de causar síntomas o enfermedad si cambian las condiciones.

Como se usa aquí, el término "agente anti-CD47" se refiere a cualquier agente que reduce la unión de CD47 (p. ej., en una célula infectada) a SIRPa (p. ej., en una célula fagocítica). Ejemplos no limitantes de reactivos anti -CD47 adecuados incluyen reactivos SIRPa de alta afinidad, anticuerpos anti-SIRPa, polipéptidos CD47 solubles y anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-CD47. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 adecuado (p. ej., un anticuerpo anti-CD47, un reactivo SIRPa de alta afinidad, etc.) se une específicamente a CD47 para reducir la unión de<c>D47 a SIRPa. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 adecuado (p. ej., un anticuerpo anti-SIRPa, un polipéptido CD47 soluble, etc.) se une específicamente a SIRPa para reducir la unión de CD47 a SIRPa. Un agente anti-CD47 adecuado que se une a SIRPa no activa SIRPa (p. ej., en la célula fagocítica que expresa SIRPa). La eficacia de un agente anti-CD47 adecuado puede evaluarse ensayando el agente (descrito más adelante). En un ensayo ejemplar, las células infectadas se incuban en presencia o ausencia del agente candidato. Un agente para el uso de la invención aumentará la fagocitosis en al menos un 10% (p. ej., al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 100%, al menos un 120%, al menos un 140%, al menos un 160%, al menos un 160% o al menos un 200%) en comparación con la fagocitosis en ausencia del agente. Del mismo modo, un ensayoin vitrode los niveles de fosforilación de tirosina de SIRPa mostrará una disminución de la fosforilación de al menos el 5% (p. ej., al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o el 100%) en comparación con la fosforilación observada en ausencia del agente candidato.

En algunas realizaciones, el agente anti-CD47 no activa CD47 tras la unión. Cuando CD47 se activa, se produce un proceso similar a la apoptosis (es decir, la muerte celular programada) (Manna y Frazier, Cancer Research, 64, 1026-1036, 1 de febrero de 2004). Así, en algunas realizaciones, el agente anti-CD47 no induce directamente la muerte celular de una célula que expresa CD47.

Los términos "unión específica", "se une específicamente" y similares se refieren a la unión preferente no covalente o covalente a una molécula en relación con otras moléculas o moléculas en una solución o mezcla de reacción (p. ej., un anticuerpo se une específicamente a un polipéptido o epítopo particular en relación con otros polipéptidos disponibles, o la unión de alta afinidad de un polipéptido SIRPa). En algunas realizaciones, la afinidad de una molécula por otra molécula a la que se une específicamente se caracteriza por una K<d>(constante de disociación) de 10'5 M o menos (p. ej., 10'6 M o menos, 10'7 M o menos, 10'8 M o menos, 10'9 M o menos, 10'10 M o menos, 10'11 M o menos, 10'12 M o menos, 10'13 M o menos, 10'14 M o menos, 10'15 M o menos, o 10'16 M o menos). "Afinidad" se refiere a la fuerza de unión, una mayor afinidad de unión se correlaciona con una K<d>menor.

El término "miembro de unión específica", tal como se utiliza aquí, se refiere a un miembro de un par de unión específica (es decir, dos moléculas, normalmente dos moléculas diferentes, en las que una de las moléculas, p. ej., un primer miembro de unión específica, a través de medios no covalentes se une específicamente a la otra molécula, p. ej., un segundo miembro de unión específica). Los miembros de unión específicos adecuados incluyen agentes que se unen específicamente a CD47 (es decir, agentes anti-CD47), o que bloquean de otro modo la interacción entre CD47 y SIRPa.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos también se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a los polímeros de aminoácidos naturales y a los polímeros de aminoácidos no naturales.

En una realización de la invención, el agente anti-CD47, o una composición farmacéutica que comprende el agente, se proporciona en una cantidad eficaz para inhibir detectablemente la unión de CD47 a SIRPa presente en la superficie de células fagocíticas. La cantidad efectiva se determina mediante pruebas empíricas de rutina en la técnica, por ejemplo, en una muestra biológica tomada de un individuo infectado. La cantidad efectiva puede variar en función del número de células a las que se dirige, la localización de las células y factores específicos del sujeto.

Los términos "células fagocíticas" y "fagocitos" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a una célula capaz de fagocitosis. Existen tres categorías principales de fagocitos: macrófagos, células mononucleares (histiocitos y monocitos); leucocitos polimorfonucleares (neutrófilos) y células dendríticas.

El término "muestra" con respecto a un paciente, abarca la sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejidos sólidos como una muestra de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de los mismos y su progenie. La definición también incluye las muestras que han sido manipuladas de algún modo tras su obtención, como por ejemplo mediante tratamiento con reactivos; lavado; o enriquecimiento para determinadas poblaciones celulares, como las células cancerosas. La definición también incluye muestras que han sido enriquecidas para determinados tipos de moléculas, p. ej., ácidos nucleicos, polipéptidos,etc.

El término "muestra biológica" abarca una muestra clínica y también incluye tejido obtenido por resección quirúrgica, tejido obtenido por biopsia, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, muestras de tejido, órganos, médula ósea, sangre, plasma, suero y similares. Una "muestra biológica" incluye una muestra obtenida de una célula infectada de un paciente,p. ej.,una muestra que comprende polinucleótidos y/o polipéptidos que se obtiene de una célula infectada de un paciente(p. ej.,un lisado celular u otro extracto celular que comprende polinucleótidos y/o polipéptidos); y una muestra que comprende células infectadas de un paciente. Una muestra biológica que comprende una célula infectada de un paciente también puede incluir células no infectadas.

Reactivo SIRPa de alta afinidad.En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 sujeto es un "reactivo SIRPa de alta afinidad", que incluye polipéptidos derivados de SIRPa y análogos de los mismos. Los reactivos SIRPa de alta afinidad se describen en la publicación de patente internacional WO 2013/109752. Los reactivos SIRPa de alta afinidad son variantes de la proteína SIRPa nativa. En algunas realizaciones, un reactivo SIRPa de alta afinidad es soluble, en el que el polipéptido carece del dominio transmembrana SIRPa y comprende al menos un cambio de aminoácido en relación con la secuencia SIRPa de tipo salvaje, y en el que el cambio de aminoácido aumenta la afinidad de la unión del polipéptido SIRPa a CD47, por ejemplo, disminuyendo la tasa de desactivación en al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces, o más.

Un reactivo SIRPa de alta afinidad comprende la porción de SIRPa que es suficiente para unirse a CD47 con una afinidad reconocible,p. ej.,alta afinidad, que normalmente se encuentra entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, o un fragmento del mismo que retiene la actividad de unión. El reactivo SIRPa de alta afinidad comprenderá normalmente al menos el dominio d i de SIRPa con residuos de aminoácidos modificados para aumentar la afinidad. En algunas realizaciones, una variante de SIRPa es una proteína de fusión,p. ej.,fusionada en marco con un segundo polipéptido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es capaz de aumentar el tamaño de la proteína de fusión,p. ej.,para que la proteína de fusión no se elimine rápidamente de la circulación. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es parte o la totalidad de una región Fc de inmunoglobulina. En otras realizaciones, el segundo polipéptido es cualquier polipéptido adecuado que sea sustancialmente similar a Fc,p. ej.,proporcionando mayor tamaño, dominios de multimerización y/o unión o interacción adicional con moléculas lg.

Un reactivo SIRPa de alta afinidad adecuado reduce (por ejemplo, bloquea, impide, etc.) la interacción entre las proteínas nativas SIRPa y CD47. Los cambios de aminoácidos que aumentan la afinidad se localizan en el dominio d1, por lo que los reactivos SIRPa de alta afinidad comprenden un dominio d i de SIRPa humana, con al menos un cambio de aminoácido en relación con la secuencia de tipo salvaje dentro del dominio d i. Dicho reactivo SIRPa de alta afinidad comprende opcionalmente secuencias de aminoácidos adicionales, por ejemplo, secuencias Fc de anticuerpos; porciones de la proteína SIRPa humana de tipo salvaje distintas del dominio d i, incluyendo sin limitación los residuos 150 a 374 de la proteína nativa o fragmentos de la misma, generalmente fragmentos contiguos al dominio d1; y similares. Los reactivos SIRPa de alta afinidad pueden ser monoméricos o multiméricos, es decir, dímeros, trímeros, tetrámeros,etc.

Anticuerpos anti-CD47.En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 sujeto es un anticuerpo que se une específicamente a CD47 (es decir, un anticuerpo anti-CD47) y reduce la interacción entre CD47 en una célula (p. ej., una célula infectada) y SIRPa en otra célula (por ejemplo, una célula fagocítica). En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD47 adecuado no activa CD47 al unirse. Ejemplos no limitantes de anticuerpos adecuados incluyen los clones B6H12, 5F9, 8B6 y C3 (por ejemplo, como se describe en la Publicación de Patente Internacional WO 2011/143624).

Anticuerpos anti-SIRPa.En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 sujeto es un anticuerpo que se une específicamente a SIRPa (es decir, un anticuerpo anti-SIRPa) y reduce la interacción entre CD47 en una célula (p. ej., una célula infectada) y SIRPa en otra célula (por ejemplo, una célula fagocítica). Los anticuerpos anti-SIRPa adecuados pueden unirse a SIRPa sin activar o estimular la señalización a través de SIRPa porque la activación de SIRPa inhibiría la fagocitosis. En cambio, los anticuerpos anti-SIRPa adecuados facilitan la fagocitosis preferencial de las células infectadas sobre las no infectadas. Aquellas células que expresen niveles más altos de CD47 (p. ej., células infectadas) en relación con otras células (células no infectadas) serán fagocitadas preferentemente. Así, un anticuerpo anti-SIRPa adecuado se une específicamente a SIRPa sin activar/estimular lo suficiente una respuesta de señalización como para inhibir la fagocitosis.

PolipéptidosCD47solubles.En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 sujeto es un polipéptido CD47 soluble que se une específicamente a SIRPa y reduce la interacción entre CD47 en una célula (p. ej., una célula infectada) y SIRPa en otra célula (p. ej., una célula fagocítica). Un polipéptido CD47 soluble adecuado puede unirse a SIRPa sin activar o estimular la señalización a través de SIRPa porque la activación de SIRPa inhibiría la fagocitosis. En cambio, los polipéptidos CD47 solubles adecuados facilitan la fagocitosis preferencial de las células infectadas sobre las no infectadas. Aquellas células que expresen niveles más altos de CD47 (p. ej., células infectadas) en relación con otras células (células no infectadas) serán fagocitadas preferentemente. Así, un polipéptido CD47 soluble adecuado se une específicamente a SIRPa sin activar/estimular lo suficiente una respuesta de señalización para inhibir la fagocitosis.

En algunos casos, un polipéptido CD47 soluble adecuado puede ser una proteína de fusión (por ejemplo, como se describe estructuralmente en la Publicación de Patente US20100239579). Sin embargo, sólo las proteínas de fusión que no activan/estimulan la SIRPa son adecuadas para los métodos aquí divulgados. Los polipéptidos CD47 solubles adecuados también incluyen cualquier péptido o fragmento peptídico que comprenda secuencias CD47 variantes o naturalmente existentes (p. ej., secuencias de dominio extracelular o variantes de dominio extracelular) que puedan unirse específicamente a SIRPa e inhibir la interacción entre CD47 y SIRPa sin estimular suficiente actividad de SIRPa para inhibir la fagocitosis.

En ciertas realizaciones, el polipéptido CD47 soluble comprende el dominio extracelular de CD47, incluyendo el péptido señal (SEQ ID N.°: 2), de tal manera que la porción extracelular de CD47 tiene típicamente 142 aminoácidos de longitud, y tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.°: 3. Los polipéptidos solubles CD47 descritos en el presente documento también incluyen variantes del dominio extracelular CD47 que comprenden una secuencia de aminoácidos de al menos 65%-75%, 75%-80%, 80-85%, 85%- 90%, o 95%-99% (o cualquier porcentaje de identidad no enumerado específicamente entre 65% y 100%), cuyas variantes conservan la capacidad de unirse a SIRPa sin estimular la señalización de SIRPa.

En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del péptido señal puede sustituirse por una secuencia de aminoácidos del péptido señal derivada de otro polipéptido (p. ej., una inmunoglobulina o CTLA4). Por ejemplo, a diferencia del CD47 de longitud completa, que es un polipéptido de la superficie celular que atraviesa la membrana celular externa, los polipéptidos CD47 solubles son secretados; en consecuencia, un polinucleótido que codifica un polipéptido CD47 soluble puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal que está asociado con un polipéptido que normalmente es secretado por una célula.

En otras realizaciones, el polipéptido CD47 soluble comprende un dominio extracelular de CD47 que carece del péptido señal. En una realización ejemplar, el dominio extracelular CD47 que carece del péptido señal tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.°: 1 (124 aminoácidos). Como se describe en el presente documento, los péptidos señal no están expuestos en la superficie celular de una proteína secretada o transmembrana porque, o bien el péptido señal se escinde durante la translocación de la proteína, o bien el péptido señal permanece anclado en la membrana celular externa (dicho péptido también se denomina anclaje señal). Se cree que la secuencia del péptido señal de CD47 se escinde del polipéptido precursor CD47 in vivo.

En otras realizaciones, un polipéptido CD47 soluble comprende una variante del dominio extracelular CD47. Dicho polipéptido CD47 soluble conserva la capacidad de unirse a SIRPa sin estimular la señalización de SIRPa. La variante del dominio extracelular CD47 puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos 65%-75%, 75%-80%, 80-85%, 85%-90%, o 95%-99% idéntica (lo que incluye cualquier porcentaje de identidad entre cualquiera de los intervalos descritos) a SEQ ID N.°: 1.

En algunos casos, un agente anti-CD47 no es un polipéptido CD47 soluble (es decir, es un agente anti-CD47 distinto de un polipéptido CD47 soluble). En algunos casos, un agente anti-CD47 se une a SIRPa pero no es un polipéptido CD47 soluble (es decir, es un agente anti-CD47 de unión a SIRPa distinto de un polipéptido CD47 soluble).

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y abarca específicamente los anticuerpos monoclonales (incluidos los anticuerpos monoclonales de longitud completa), los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (p. ej., los anticuerpos biespecíficos) y los fragmentos de anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada. Los "anticuerpos" (Abs) y las "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas con las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos presentan especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a los anticuerpos que carecen de especificidad antigénica. Los polipéptidos de este último tipo son producidos, por ejemplo, a niveles bajos por el sistema linfático y a niveles elevados por los mielomas.

"Fragmento de anticuerpo", y todas sus variantes gramaticales, tal como se utiliza en el presente documento, se define como una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto, en la que la porción está libre de los dominios constantes de cadena pesada (es decir, CH2, CH3 y CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo) de la región Fc del anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpos se incluyen fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')<2>y Fv; diacuerpos; cualquier fragmento de anticuerpo que sea un polipéptido con una estructura primaria consistente en una secuencia ininterrumpida de residuos de aminoácidos contiguos (denominado en el presente documento "fragmento de anticuerpo de cadena única" o "polipéptido de cadena única"), incluyendo sin limitación (1) moléculas Fv de cadena única (scFv) (2) polipéptidos de cadena única que contengan sólo un dominio variable de cadena ligera, o un fragmento del mismo que contenga las tres CDR del dominio variable de cadena ligera, sin una fracción de cadena pesada asociada (3) polipéptidos de cadena única que contengan sólo una región variable de cadena pesada, o un fragmento del mismo que contenga las tres CDR de la región variable de cadena pesada, sin una fracción de cadena ligera asociada y (4) nanocuerpos que comprendan dominios Ig únicos de especies no humanas u otros módulos de unión de dominio único específicos; y estructuras multiespecíficas o multivalentes formadas a partir de fragmentos de anticuerpos. En un fragmento de anticuerpo que comprende una o más cadenas pesadas, la(s) cadena(s) pesada(s) puede(n) contener cualquier secuencia de dominio constante (p. ej., CH1 en el isotipo IgG) que se encuentre en una región no-Fc de un anticuerpo intacto, y/o puede(n) contener cualquier secuencia de región bisagra que se encuentre en un anticuerpo intacto, y/o puede(n) contener una secuencia de cremallera de leucina fusionada o situada en la secuencia de región bisagra o en la secuencia de dominio constante de la(s) cadena(s) pesada(s).

Tal como se utiliza en esta invención, el término "epítopo" significa cualquier determinante antigénico de un antígeno al que se une el paratopo de un anticuerpo. Los determinantes epitópicos suelen consistir en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y suelen tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

Los anticuerpos anti-CD47 adecuados incluyen versiones totalmente humanas, humanizadas o quiméricas de dichos anticuerpos. Los anticuerpos humanizados son especialmente útiles para aplicaciones in vivo en humanos debido a su baja antigenicidad. Del mismo modo, los anticuerpos caninizados, felinizados, etc. son especialmente útiles para aplicaciones en perros, gatos y otras especies, respectivamente.

Métodos

Los métodos descritos en el presente documento incluyen administrar a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz o una dosis eficaz de un agente anti-CD47, incluyendo sin limitación combinaciones del reactivo con otro fármaco.

En algunas realizaciones, la infección es una infección crónica, es decir, una infección que no es eliminada por el sistema inmunitario del huésped en un período de hasta 1 semana, 2 semanas, etc. En algunos casos, las infecciones crónicas implican la integración de elementos genéticos patógenos en el genoma del huésped, p. ej. retrovirus. Además, en algunas realizaciones, la infección está en fase latente.

Los patógenos virales de interés incluyen, sin limitación, el HIV-1; HIV-2, HTLV, y SIV.

Una infección tratada con los métodos generalmente implica un patógeno con al menos una porción de su ciclo de vida dentro de una célula huésped, es decir, una fase intracelular. Los métodos proporcionan una eliminación más eficaz de las células infectadas por las células fagocíticas del organismo huésped, en relación con la fagocitosis en ausencia de tratamiento, y por lo tanto están dirigidos a la fase intracelular del ciclo de vida del patógeno.

En algunas realizaciones, los métodos implican el diagnóstico de un paciente que padece una infección intracelular patógena; o la selección de un paciente diagnosticado previamente que padece una infección intracelular patógena; el tratamiento del paciente con un régimen de terapia anti-CD47, opcionalmente en combinación con una terapia adicional; y la monitorización del paciente para comprobar la eficacia del tratamiento. p. ej. La monitorización puede medir indicios clínicos de infección, p. ej., fiebre, recuento de glóbulos blancos, etc., y/o monitorización directa de la presencia del patógeno.

El tratamiento puede combinarse con otros agentes activos. Las clases de antibióticos incluyen penicilinas,p. ej.,penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas en combinación con p-inhibidores de la lactamasa, cefalosporinas, porejemplo.cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactama, etc.; carbapenems; monobactámicos; aminoglucósidos; tetraciclinas; macrólidos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloranfénicos; metronidazol; espectinomicina; trimetoprima; vancomicina;etc.También pueden incluirse citocinas,p. ej.,interferóny,factor de necrosis tumoral a, interleucina 12, etc. En el tratamiento también pueden utilizarse agentes antivirales,p. ej.,aciclovir, ganciclovir, etc.

Las dosis eficaces de la entidad terapéutica para su uso según la presente invención varían en función de muchos factores diferentes, incluida la naturaleza del agente anti-CD47, los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Normalmente, el paciente es un ser humano, pero también pueden tratarse mamíferos no humanos, p. ej., animales de compañía como perros, gatos, caballos,etc.,mamíferos de laboratorio como conejos, ratones, ratas,etc.,y similares. Las dosis de tratamiento pueden ajustarse para optimizar la seguridad y la eficacia.

En algunas realizaciones, la dosis terapéutica puede oscilar entre aproximadamente 0,0001 y 500 mg/kg, y más habitualmente entre 0,01 y 100 mg/kg, del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-50 mg/kg. La dosificación puede ajustarse al peso molecular del reactivo. Un régimen de tratamiento ejemplar conlleva la administración diaria, quincenal, semanal, quincenal, mensual,etc.En otro ejemplo, el tratamiento puede administrarse en infusión continua. Las entidades terapéuticas de la presente invención suelen administrarse en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis únicas pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares según lo indique la medición de los niveles sanguíneos de la entidad terapéutica en el paciente. Alternativamente, las entidades terapéuticas de la presente invención pueden administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosis y la frecuencia varían en función de la semivida del polipéptido en el paciente. Se entenderá por un experto en la materia que dichas directrices se ajustarán al peso molecular del agente activo,p. ej.,en el uso de fragmentos de anticuerpos, en el uso de conjugados de anticuerpos, en el uso de reactivos SIRPa de alta afinidad, etc. La dosificación también puede variar para la administración localizada, porejemplo,intranasal, por inhalación,etc.,o para la administración sistémica,p. ej.,i.m., i.p., i.v., y similares.

Para el tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada del agente anti-CD47 dependerá del tipo de enfermedad a tratar, como se definió anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el agente se administra con fines preventivos, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico tratante. El agente anti-CD47 se administra adecuadamente al paciente de una sola vez o a lo largo de una serie de tratamientos.

Los agentes anti-CD47 adecuados pueden proporcionarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para uso terapéutico,p. ej.,para tratamiento humano. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen una o más entidades terapéuticas de la presente invención o sales, ésteres o solvatos farmacéuticamente aceptables de las mismas. En algunas otras realizaciones, el uso de un agente anti-CD47 incluye el uso en combinación con otro agente terapéutico, p. ej., otro agente antiinfeccioso. Las formulaciones terapéuticas que comprenden uno o más agentes anti-CD47 de la invención se preparan para su almacenamiento mezclando el agente anti-CD47 que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. La composición del agente anti-CD47 se formulará, dosificará y administrará de acuerdo con las buenas prácticas médicas. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno concreto a tratar, el mamífero concreto a tratar, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el lugar de administración del agente, el método de administración, el calendario de administración y otros factores conocidos por los médicos. La "cantidad terapéuticamente eficaz" del agente anti-CD47 a administrar se regirá por tales consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para prevenir la enfermedad asociada a CD47.

El agente anti-CD47 puede administrarse por cualquier medio adecuado, incluyendo tópico, oral, parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal o subcutánea. Además, el agente anti-CD47 se administra adecuadamente mediante infusión en pulsos, en particular con dosis decrecientes del agente.

No es necesario que el agente anti-CD47 sea, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes que potencian la actividad, o que de otro modo aumentan el efecto terapéutico. Por lo general, se utilizan en las mismas dosis y con las mismas vías de administración que en el presente documento o en un porcentaje comprendido entre el 1 y el 99% de las dosis empleadas hasta ahora.

Un agente anti-CD47 se administra a menudo como una composición farmacéutica que comprende un agente terapéutico activo y otro excipiente farmacéuticamente aceptable. La forma preferida depende del modo de administración previsto y de la aplicación terapéutica. Las composiciones también pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables y no tóxicos, que se definen como vehículos comúnmente utilizados para formular composiciones farmacéuticas para administración animal o humana. El diluyente se selecciona de forma que no afecte a la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluyentes son el agua destilada, la solución salina fisiológica tamponada con fosfato, las soluciones de Ringer, la solución de dextrosa y la solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros portadores, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.

En algunas otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas también pueden incluir macromoléculas grandes de metabolización lenta como proteínas, polisacáridos como quitosano, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y copolímeros (como Sepharose™ funcionalizada con látex, agarosa, celulosa y similares), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados lipídicos (como gotas de aceite o liposomas).

Un portador puede portar los agentes de diversas maneras, incluida la unión covalente directa o a través de un grupo enlazador, y las asociaciones no covalentes. Entre los portadores de enlace covalente adecuados se incluyen proteínas como las albúminas, péptidos y polisacáridos como el aminodextrano, cada uno de los cuales tiene múltiples sitios para la unión de moléculas. Un portador también puede llevar un agente antiCD47 por asociaciones no covalentes, como la unión no covalente o por encapsulación. La naturaleza del portador puede ser soluble o insoluble a efectos de la invención. Los expertos en la materia conocerán otros portadores adecuados para la unión de agentes anti-CD47, o podrán determinarlos mediante experimentación rutinaria.

Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes como ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de unos 10 residuos); proteínas, como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos, como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, como glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, como EDTA; azúcares, como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal, como sodio; complejos metálicos (p. ej., complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Las formulaciones que se utilicen para la administracióninvivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

Los principios activos también pueden quedar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o gelatinamicrocápsula y poli(metilmetacilato) microcápsula, respectivamente, en sistemas coloidales de administración de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Los portadores y enlazadores específicos para agentes radionucleidos incluyen pequeñas moléculas radiohalogenadas y compuestos quelantes. Un quelato de radionucleido puede formarse a partir de compuestos quelantes que incluyen aquellos que contienen átomos de nitrógeno y azufre como átomos donantes para unir el radionucleido metálico, o de óxido metálico.

Las moléculas radiográficas para su uso como moléculas de formación de imágenes incluyen compuestos y quelatos con átomos relativamente grandes, como oro, iridio, tecnecio, bario, talio, yodo y sus isótopos. Es preferible que se utilicen moléculas de imagen radiográfica menos tóxicas, como el yodo o isótopos de yodo. Dichas moléculas pueden conjugarse con el agente anti-CD47 mediante un enlazador químico aceptable o un portador de quelación. Las moléculas emisoras de positrones incluyen 18F, que puede conjugarse fácilmente mediante una reacción de fluoración con el agente anti-CD47.

Típicamente, las composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. El preparado también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas o micropartículas como polilactida, poliglicólido o copolímero para mejorar el efecto adyuvante, como se ha comentado anteriormente. Langer, Science 249: 1527, 1990 y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. Los agentes de esta invención pueden administrarse en forma de inyección de depósito o preparación de implante que puede formularse de tal manera que permita una liberación sostenida o pulsátil del ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas se formulan generalmente como estériles, sustancialmente isotónicas y en pleno cumplimiento de todas las normas de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) del Organismo para el Control de Alimentos y Medicamentos de EE. UU.

La toxicidad de los agentes anti-CD47 puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación,p.ej.,determinando la LD<50>(la dosis letal para el 50% de la población) o la LD<100>(la dosis letal para el 100% de la población). La relación de dosis entre el efecto tóxico y el terapéutico es el índice terapéutico. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos en cultivos celulares y estudios en animales pueden utilizarse en la formulación de un intervalo de dosis que no sea tóxica para su uso en humanos. La dosificación de las proteínas aquí descritas se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la dosis eficaz con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y de la vía de administración utilizada. El médico puede elegir la formulación exacta, la vía de administración y la dosis en función del estado del paciente.

Ahora que la invención está descrita en su totalidad, será evidente para un experto en la materia que se pueden realizar varios cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de la invención.

EXPERIMENTAL

Los siguientes ejemplos se exponen con el fin de proporcionar a los expertos en la materia una descripción completa de cómo realizar y utilizar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni que los experimentos que se exponen a continuación sean todos o los únicos experimentos realizados. Se ha procurado garantizar la exactitud de las cifras utilizadas(p. ej.,cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio, la temperatura es en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.

La presente invención se ha descrito en términos de realizaciones particulares encontradas o propuestas por el presente inventor para comprender modos preferidos para la práctica de la invención. Se apreciará por aquellos con habilidad en el arte que, a la luz de la presente divulgación, numerosas modificaciones y cambios se pueden hacer en las realizaciones particulares ejemplificadas sin apartarse del alcance de la invención. Por ejemplo, debido a la redundancia de codones, pueden introducirse cambios en la secuencia de ADN subyacente sin que ello afecte a la secuencia de la proteína. Además, debido a consideraciones de equivalencia funcional biológica, pueden introducirse cambios en la estructura de la proteína sin afectar a la acción biológica en especie o cantidad. Todas estas modificaciones se incluyen en el ámbito de aplicación de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Los datos aquí presentados demuestran que el aumento de la expresión de CD47 es un mecanismo común mediante el cual los agentes infecciosos (p. ej., virus, hongos, bacterias, protozoos, etc.) eluden la respuesta inmunitaria del organismo huésped. Cuando un agente infeccioso induce a una célula infectada a expresar niveles elevados de CD47, la célula infectada presenta una señal de "no me comas" (CD47) a los macrófagos y fagocitos del organismo huésped. Así, el agente infeccioso impide la fagocitosis y la eliminación de la célula infectada. Para contrarrestar este proceso y permitir la fagocitosis y eliminación de las células infectadas en un sujeto, puede administrarse un agente anti-CD47 para reducir la unión de CD47 en la célula infectada, a SIRPa en una célula huésped fagocítica y permitir así que prevalezcan las señales cómeme.

Se realizaron los siguientes experimentos, que revelaron que las células infectadas con diversos agentes infecciosos expresan niveles más altos de CD47 que las células no infectadas.

Ratones adultos fueron infectados experimentalmente con el Virus Friend (virus FV, una cepa del virus de la leucemia murina que es un miembro de retroviridae que tiene un genoma ARNss). Se aislaron células no infectadas e infectadas (es decir, células infectadas por el FV) del mismo animal 7 días después de la infección y se analizaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para determinar los niveles relativos de expresión de CD47 (utilizando un anticuerpo anti-CD47). Las células infectadas por el FV (células B, así como células eritroides) expresaron niveles más altos de CD47 en comparación con las células no infectadas del mismo animal(Fig. 1).

Se aislaron células infectadas y no infectadas de neonatos de ratón infectados con el virus de la leucemia neurotrópica de ratón Fr98-. Las células infectadas con FR98 expresaron niveles aumentados de CD47 en comparación con las células no infectadas del mismo animal(Fig. 2).Esta tendencia se mantuvo para múltiples tipos celulares individuales que fueron aislados, demostrando una tendencia general de que las células infectadas expresan mayores niveles de CD47 en comparación con las células no infectadas, independientemente del tipo celular(Fig. 3).

Las células infectadas por el HIV expresaron mayores niveles de CD47 que las células no infectadas(Fig. 4).

Se aislaron PBMC de 3 personas diferentes, y las células se sometieron a selección negativa con microesferas CD8-CD56 y a estimulación con anti-CD3, anti-CD28 e IL-2 durante 4 días.

Se expresaron mayores niveles de CD47 por una variedad de diferentes tipos de células infectadas aisladas de ratones 28 días después de la infección con el Virus La Crosse en comparación con células no infectadas(Fig. 5).

Las células HeLa infectadas con Chlamydia trachomatis serovar A (un patógeno bacteriano) expresaron mayores niveles de CD47 que las células no infectadas(Fig. 6).

Basándose en los resultados anteriores, se espera que la unión de CD47 en una primera célula a SIRPa en una segunda célula aumente la fagocitosis de células infectadas. Para probar esta expectativa, se administró un agente antiCD47 (el anticuerpo anti-CD47 5F9-hlgG4) a ratones (SCID-hu Thy/Liv) portadores de una infección por HIV.

Como se describe en Stoddart et al. (Stoddart CA et al., PLoS One. 2007 Aug 1 ;2(7):e655), el modelo de ratón SCID-hu, en el que se implantan órganos linfoides humanos en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID), se diseñó para proporcionar un modelo animal pequeño para el estudio de la hematopoyesis humana (McCune, 1988, Science 241:1632-1639). Estos ratones facilitaron el estudio de la patogénesis del HIV-1 en órganos hematolinfoides humanos y la evaluación de compuestos contra el HIV-1in vivo.En este modelo, a los ratones SCID se les implantan diversos órganos fetales humanos, como hueso, hígado, timo, ganglios linfáticos y bazo. Los implantes fetales se vuelven tolerantes al entorno del ratón y, recíprocamente, el crecimiento del tejido humano se ve permitido por el estado de inmunocompromiso del ratón SCID receptor.

El ratón SCID-hu Thy/Liv, reportado por primera vez por Namikawa et al. en 1990 (J Exp Med 172: 1055-1063, 1990), se genera coimplantando timo e hígado fetales humanos bajo la cápsula renal del ratón. De forma altamente reproducible, estos órganos se fusionan, se vascularizan y crecen hasta formar un órgano estable denominado "Thy/Liv", alcanzando una masa total de 100- 300x106 células humanas en 18 semanas. El implante Thy/Liv reproduce la diferenciación, proliferación y función de las células progenitoras hematopoyéticas humanas derivadas del hígado fetal dentro del timo humano. Los implantes poseen compartimentos corticales y medulares histológicamente normales que mantienen la hematopoyesis humana multilinaje durante 6-12 meses, generando una fuente continua de timocitos que expresan CD4 y que pueden servir como células diana para la infección y replicación del HIV-1. Es importante destacar que, para un modelo de quimioterapia antiviral, pueden fabricarse 50-60 ratones SCID-hu Thy/Liv con tejidos de un único donante fetal, y que el implante Thy/Liv es susceptible de manipulación experimental e infección con HIV-1. Los implantes Thy/Liv soportan la replicación viral tras la inoculación del HIV-1 por inyección directa, y la depleción de timocitos se produce tanto con clones moleculares como con aislados clínicos del HIV-1 en 3-5 semanas. Esta depleción incluye la pérdida de timocitos corticales inmaduros CD4+CD8+ (doble positivo, DP) y una disminución de la proporción CD4/CD8 en la médula tímica.

El modelo de ratón SCID-hu Thy/Liv de infección por HIV-1 se considera en la técnica una plataforma útil para la evaluación preclínica de la eficacia antiviral in vivo. Este modelo de HIV se considera un modelo de ratón altamente reproducible que probablemente prediga la eficacia antiviral clínica en humanos (Stoddart CA et al., PLoS One. 2007 Aug 1;2(7):e655).

Se administró un agente anti-CD47 (un anticuerpo monoclonal humanizado 5F9-hlgG4) mediante inyección intraperitoneal a ratones SCID-hu Thy/Liv que albergaban una infección persistente por HIV. En laFigura 7se presenta una evaluación de la actividad antiviral del agente anti-CD47, que demuestra la eficacia de las composiciones para uso de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición para su uso en un método de tratamiento de un sujeto mamífero para la infección intracelular por patógenos, en el que el patógeno es un retrovirus, el método comprende:

administrar al sujeto un agente anti-CD47 que reduce la unión de CD47 en una célula infectada a SIRPa en una célula fagocítica, a una dosis eficaz para aumentar la fagocitosis de la célula infectada, donde el agente anti-CD47 es: (a) un anticuerpo anti-CD47,

(b) un anticuerpo anti-SIRPa que no estimula la señalización a través de SIRPa,

(c) un polipéptido derivado de SIRPa que se une específicamente a CD47, o

(d) un polipéptido soluble de CD47 que se une específicamente a SIRPa y no estimula la señalización a través de SIRPa.

2. La composición para uso de la reivindicación 1, en la que el retrovirus es el virus Friend o el virus de la leucemia de ratón neurotrópica Fr98.

3. La composición para uso de la reivindicación 1, en la que el retrovirus se selecciona entre HIV-2, HTLV, FIV y SIV.

4. La composición de uso de la reivindicación 3, en la que el retrovirus es el HIV-2.

5. La composición para uso de la reivindicación 3, en la que el retrovirus es HTLV.

6. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el sujeto es humano.

7. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el agente anti-CD47 es un anticuerpo anti-CD47.

8. La composición para uso de la reivindicación 7, en la que el anticuerpo anti-CD47 es un anticuerpo totalmente humano, humanizado o quimérico.

9. La composición para uso de la reivindicación 6, en la que el anticuerpo es 5F9-hlgG4 humanizado.

10. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el agente anti-CD47 es un anticuerpo anti-SIRPa que no estimula la señalización a través de SIRPa.

11. La composición para uso de la reivindicación 10, en la que el anticuerpo anti-SIRPa es un anticuerpo humanizado.

12. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 7-11, en la que el anticuerpo anti-CD47 o el anticuerpo anti-SIRPa es:

(i)un anticuerpo monoclonal, o

(ii)un fragmento de anticuerpo, opcionalmente en el que el fragmento de anticuerpo es:

(a)Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 o fragmento Fv o

(b)un diacuerpo.

13. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el agente anti-CD47 es un polipéptido derivado de SIRPa que se une específicamente a CD47, opcionalmente en la que el polipéptido derivado de SIRPa comprende al menos el dominio d i de SIRPa con residuos de aminoácidos modificados para aumentar la afinidad.

14. La composición para uso de la reivindicación 13, en la que el polipéptido derivado de SIRPa es una proteína de fusión, opcionalmente en la que el polipéptido derivado de SIRPa está fusionado en marco con una región Fc de inmunoglobulina.

15. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el agente anti-CD47 es un polipéptido CD47 soluble que se une específicamente a SIRPa y no estimula la señalización a través de SIRPa.