ES2982558T3 - Anticuerpos para Siglec-15 y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Se proporcionan moléculas de unión a Siglec-15. Las moléculas son típicamente un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une inmunoespecíficamente a Siglec-15. También se proporcionan moléculas de unión al ligando Siglec-15. Las moléculas son típicamente un polipéptido Siglec-15 o una proteína de fusión. También se proporcionan métodos para utilizar las moléculas para reducir la inmunosupresión mediada por Siglec-15 en un sujeto que lo necesite. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos para Siglec-15 y métodos de uso de los mismos

Campo de la invención

La invención se refiere generalmente al campo de la inmunomodulación, y más particularmente con composiciones y métodos para modular Siglec-15 y la señalización iniciada a partir de la misma. Más específicamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a SIGLEC-15.

Antecedentes de la invención

Las lectinas similares a Ig de unión a ácido siálico ("Siglec") son miembros de la superfamilia de Ig. Estas proteínas transmembrana de tipo 1 incluyen un dominio del conjunto V en el extremo N de unión a ácido siálico, números variables de dominios de Ig del conjunto C2, una región transmembrana y una cola citosólica, y se unen específicamente a los ácidos siálicos unidos a las regiones terminales de los glucoconjugados de la superficie celular. Se han identificado dos subconjuntos principales de Siglec: un subconjunto incluye CD-33 y Siglec relacionados con CD33, tales como siglec-5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 14 y 16 en seres humanos, y CD33 y siglec-E, F, G y H en ratones (Crocker y Redelinghuys, Biochemical Society Transactions, 36 (6): 1467-1471 (2008)). El segundo subconjunto está formado por Sn (sialoadhesina) (siglec-1), CD22 (siglec-2), MAG (glucoproteína asociada a mielina) (siglec-4) y siglec-15, todas las cuales están bien conservadas en los mamíferos. Con la excepción de la MAG, que se expresa en el sistema nervioso, las Siglec se expresan diferencialmente en diversos subconjuntos de leucocitos donde desempeñan un papel en la regulación positiva y negativa de las respuestas inmunitarias e inflamatorias (McMillan y Crocker, Carbohydr. Res., 343:2050-2056 (2008) y Crocker,et al.,Nat. Rev. Immunol., 7:255266 (2007)).

La investigación indica que muchas Siglec se expresan en células inmunitarias y tienen propiedades inmunosupresoras. Sin embargo, un subconjunto de Siglec, incluyendo Siglec-15, está asociado con la molécula adaptadora de señal, la proteína de activación DNAX de 12 kDa (DAP12), que tiene un motivo de activación del inmunorreceptor a base de tirosina (ITAM, por sus siglas en inglés) y participa en la activación de células inmunitarias (Takamiya,et al.,Glycobiology, 23(2): 178-87 (2013)). Siglec-15 se expresa específicamente en macrófagos y células dendríticas del bazo y los ganglios linfáticos y reconoce preferentemente el antígeno sTn (Angata,et al.,Glycobiology, 17(8):838-46 (2007) Epub, 4 de mayo de 2007). Las células H157 que sobreexpresan sTn (H157/ST6GalNAc-I) estimularon la secreción de TGF-p de macrófagos inducidos por M-CSF que expresan Siglec-15 (Takamiya,et al.,Glycobiology, 23(2):178-87 (2013)). Además, la secreción de TGF-p de las células THP-1 se ve potenciada por la sobreexpresión de Siglec-15 en células THP-1 y ST6GalNAc-I (la enzima responsable de la biosíntesis de la estructura sTn) en células H157, respectivamente, de una manera que puede depender, al menos parcialmente, de la señalización inducida por Siglec-15-DAP12, así como una o más vías independientes de DAP12, dependientes de Sky o posiblemente independientes de Sky. El TGF-p se produce tanto por células tumorales como por leucocitos infiltrantes de tumores, incluidos macrófagos, y contribuye a la progresión y metástasis tumoral, por ejemplo, potenciando la invasión de células tumorales e inhibiendo la función de las células inmunitarias (Flavell,et al.,Nat Rev Immunol, 10:554-567 (2010)). Estos datos pueden indicar que el reconocimiento del sTn asociado a tumor por parte de Siglec-15 activa la vía DAP12-Syk de la vía de transducción de señales que mejora la producción de TGF-p a partir de las células mieloides y, finalmente, modifica el microambiente tumoral que es ventajoso para las células tumorales (Takamiya,et al.,Glycobiology, 23(2):178-87 (2013)). Siglec 15 tiene un dominio ITIM típico (SNYENL (SEQ ID NO:191)) en su dominio citoplasmático. Su función aún está por caracterizarse. Se puede encontrar información sobre los anticuerpos anti SIGLEC-15, entre otros, en los documentos WO2013/034660 y WO2017/083354.

Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de herramientas y técnicas para modular Siglec-15 y la señalización iniciada a partir de la misma.

Por lo tanto, un objeto de la invención es proporcionar composiciones para detectar y modular Siglec-15.

También es un objeto de la invención proporcionar un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a SIGLEC-15 para su uso en métodos para modular Siglec-15 y la señalización iniciada a partir de la misma para aumentar una respuesta inmunitaria o reducir o revertir la supresión inmunitaria.

También es un objeto de la invención proporcionar un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a SIGLEC-15 para su uso en un método para modular la diferenciación de osteoclastos para reducir la resorción ósea o aumentar la formación de hueso.

También es un objeto de la invención proporcionar un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a SIGLEC-15 para su uso en métodos para tratar enfermedades y trastornos mediante la modulación de Siglec-15 y la señalización iniciada a partir de la misma.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a SIGLEC-15, en donde el anticuerpo comprende las tres CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) seleccionadas del grupo que consiste en:

i. SYWIS (SEQ ID NO:208; HCDR1); DIYSGSDTTHYAEKFQG (SEQ ID NO:374; HCDR2); WWDYGSSYDYFDY (SEQ ID NO:71; HCDR3),

ii. SYWIT (SEQ ID NO:204; HCDR1); DIYSGSDTMHYAEKFQG (SEQ ID NO:205; HCDR2); WWDYGSSYDYFD (SEQ ID NO:71; HCDR3);

iii. SYWIT (SEQ ID NO:204; HCDR1); DIYSGSDTTHYAEKFQG (SEQ ID NO:374; HCDR2); WWDYGSSYDYFD (SEQ ID NO:71; HCDR3); y

y un conjunto de tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) seleccionadas del grupo que consiste en

i. KASQDINVYLS (SEQ ID NO: 198; LCDR1); RANRLTS (SEQ ID NO:202; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3).

ii. KASQDINSYLS (SEQ ID NO:28; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPY (SEQ ID NO:43; LCDR3);

iii. KASQDINTYLS (SEQ ID NO: 196; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3);

iv. KASQDINVYL (SEQ ID NO:198; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3); y

v. KASQDIQSYLS (SEQ ID NO:200; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3).

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención junto con un excipiente.

La presente invención proporciona además un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método para tratar un tumor en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo al sujeto.

Realizaciones específicas y detalles técnicos

La divulgación técnica que se expone a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de las reivindicaciones. Los elementos de la divulgación que no están dentro del alcance de las reivindicaciones se proporcionan a título informativo.

Se proporcionan moléculas de unión a Siglec-15. Las moléculas son típicamente un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une inmunoespecíficamente a Siglec-15. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la molécula de unión a Siglec-15 incluye seis regiones determinantes de complementariedad (CDR), en donde las CDR incluyen las tres CDR de cadena ligera de un polipéptido de SEQ ID NO:7, y las tres CDR de cadena pesada de un polipéptido de SEQ ID NO: 18, en donde la molécula de unión a Siglec-15 se une a Siglec-15. En algunas realizaciones, la molécula de unión a Siglec-15 incluye las CDR de cadena ligera y pesada del anticuerpo monoclonal anti humano de ratón denominado en el presente documento 5G12. También se divulga la molécula de unión a Siglec-15 que incluye las CDR de cadena ligera y pesada del anticuerpo monoclonal anti humano de ratón denominado en el presente documento 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B o 105A.

En algunas realizaciones, la molécula de unión a Siglec-15 incluye una región variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y/o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, la molécula de unión a Siglec-15 incluye la una o más regiones variables de cadena ligera y/o pesada de uno de los anticuerpos monoclonales anti humanos de ratón denominados en el presente documento 5G12. También se divulgan la molécula de unión a Siglec-15 que incluye la una o más regiones variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo monoclonal anti humano de ratón denominado en el presente documento 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B o 105A.

En algunas realizaciones, la molécula de unión a Siglec-15 se une a Siglec-15

(I) dispuesta sobre la superficie de una célula (preferentemente una célula viva);

(II) dispuesta sobre la superficie de una célula (preferentemente una célula viva) en una concentración endógena; (III) dispuesta sobre la superficie de una célula viva, y modula la unión entre Siglec-15 (por ejemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, etc.) y Neu5Aca2-6GalNAca, LRRC4C, un contrarreceptor de Siglec-15 (S15-CR), o una combinación de los mismos;

(IV) dispuesta sobre la superficie de una célula viva y reduce, previene o inhibe la secreción de TGF-p;

(V) dispuesta sobre la superficie de una célula viva; o

(IV) una combinación de los mismos.

Las células que expresan de manera endógena Siglec-15 incluyen macrófagos, células dendríticas y células cancerosas.

La molécula de unión a Siglec-15 puede incluir uno o más dominios constantes de una región constante de inmunoglobulina (Fc). Los dominios constantes pueden ser dominios constantes humanos, por ejemplo, dominios de IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. En realizaciones particulares, los dominios constantes de IgG humana son dominios de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La molécula de unión a Siglec-15 se puede marcar de manera detectable o comprende una toxina, fármaco, receptor, enzima o ligando del receptor conjugados. La molécula de unión a Siglec-15 proporcionada es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo, también puede ser un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoespecífico, biespecífico, triespecífico o multiespecífico.

En una realización, el anticuerpo anti SIGLEC-15 humanizado proporcionado tiene una o más cadenas ligeras variables que tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195, 197, 199, 201 o 209.

En otra realización, el anticuerpo anti SIGLEC-15 humanizado proporcionado tiene una o más cadenas pesadas variables que tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 203, 206 o 207.

En otra realización, el anticuerpo anti SIGLEC-15 humanizado proporcionado tiene una o más cadenas ligeras variables que tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 195, 197, 199, 201 o 209 y una o más cadenas pesadas variables que tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:203, 206 y 207.

En otra realización, el anticuerpo proporcionado tiene una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO:209.

En algunas realizaciones, la molécula de unión a Siglec-15 se modifica de manera que la molécula exhibirá actividad de unión al receptor Fc (FcR) disminuida o nula. En algunas realizaciones, la molécula de unión a Siglec-15 se modifica para exhibir actividades mejoradas de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés).

También se divulga una proteína de fusión que es al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % idéntica a las SEQ ID NO: 193 o 194.

También se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen un anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención y un portador o excipiente fisiológicamente aceptable. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal contra Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo reduce o previene la unión de Siglec-15 a un ligando y/o contrarreceptor del mismo, reduce o previene la transducción de señal mediada por Siglec-15, o una combinación de los mismos. El ligando puede ser una glucoproteína sialilada. El ligando se puede expresar en la superficie de una célula tumoral. Los Ejemplos a continuación muestran que la proteína 4C que contiene repeticiones rica en leucina (LRRC4C) es un ligando para Siglec-15 y puede expresarse por células cancerosas. También puede expresarse un contrarreceptor de Siglec-15 en la superficie de células inmunitarias tales como los linfocitos T, que cuando se activa con Siglec-15, conduce a la inhibición de los linfocitos T.

También se proporciona un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención para su uso en un método para tratar un tumor en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo al sujeto. Típicamente, los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, en una composición farmacéutica. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 antagonista o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención aumenta una respuesta inmunitaria, retrasa o previene el crecimiento tumoral, inhibe la supresión inmunitaria mediada por tumores, elimina tumores, agota o bloquea la actividad de los macrófagos asociados a tumores (TAM, por sus siglas en inglés) para alterar su actividad, disminuye la supresión inmunitaria mediada por TAM, reduce o revierte la supresión de linfocitos T, aumenta la proliferación de linfocitos T o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el cáncer o tumor incluye macrófagos que expresan Siglec-15. El anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención se puede administrar al sujeto en una cantidad eficaz para reducir la expresión y/o secreción de TGF-p por los macrófagos. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer o una enfermedad infecciosa. El cáncer puede incluir células que expresan o sobreexpresan un ligando de Siglec-15.

En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 agonista o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención sirve para su uso en un método donde disminuye una respuesta inmunitaria, aumenta o mejora la supresión de linfocitos T, aumenta la proliferación de linfocitos T o una combinación de los mismos. La molécula de unión a Siglec-15 se puede administrar al sujeto en una cantidad eficaz para aumentar la expresión y/o secreción de TGF-p por los macrófagos. En algunas realizaciones, el sujeto tiene inflamación, una enfermedad autoinmunitaria o es un receptor de trasplante.

Algunas realizaciones incluyen un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo de la invención preestablecida para su uso en un método que comprende además administrar al sujeto un segundo agente terapéutico.

También se proporcionan métodos de detección y diagnóstico. Cualquiera de los métodos de detección y diagnóstico puede acoplarse a un método de tratamiento. Por ejemplo, se proporciona un métodoin vitrode detección o diagnóstico de una enfermedad, trastorno o infección que puede incluir (a) ensayar la expresión de Siglec-15 en células o en una muestra de tejido de un sujeto usando el anticuerpo monoclonal contra Siglec-15 divulgado o fragmento de unión a antígeno del mismo y (b) comparar el nivel de Siglec-15 con un nivel de control, en donde un aumento en el nivel ensayado de Siglec-15 en comparación con el nivel de control es indicativo de la enfermedad, trastorno o infección.

Un métodoin vitropara controlar la progresión de una enfermedad, trastorno o infección puede incluir (a) ensayar la expresión de Siglec-15 en células o en una muestra de tejido de un sujeto obtenida en un primer punto temporal y en un punto temporal posterior usando el anticuerpo monoclonal Siglec-15 divulgado o un fragmento de unión a antígeno del mismo; y (b) comparar el nivel de expresión de Siglec-15 en las células o en la muestra de tejido del sujeto en el primer y último puntos temporales, en donde un aumento en el nivel ensayado de Siglec-15 en el último punto temporal en comparación con el primer punto temporal es indicativo de la progresión de la enfermedad, trastorno o infección.

Se proporciona un métodoin vitropara controlar una respuesta a un tratamiento que incluye (a) ensayar la expresión de Siglec-15 en células o en una muestra de tejido de un sujeto antes y después del tratamiento usando las moléculas de unión a Siglec-15 divulgadas; y (b) comparar el nivel de Siglec-15 en el tiempo, mediante lo cual una disminución en el nivel ensayado de Siglec-15 después del tratamiento en comparación con el nivel de Siglec-15 antes del tratamiento es indicativo de una respuesta favorable al tratamiento.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una curva que muestra el valor de anticuerpos en plasma de dos ratones inactivados para Siglec-15 inmunizados y dos no inmunizados.

Las figuras 2A-2C son alineaciones que muestran las secuencias de la región variable de cadena ligera de 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B y 105A y que resaltan la primera (2A), la segunda (2B) y la tercera (2C) regiones determinantes de complementariedad (CDR).

Las figuras 3A-3C son alineaciones que muestran las secuencias de la región variable de cadena pesada de 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B y 105A y que resaltan la primera (3A), la segunda (3B) y la tercera (3C) regiones determinantes de complementariedad (CDR).

La figura 4A es un diagrama de un ensayo para medir la unión directa de anticuerpos anti Siglec-15 a células que expresan Siglec-15 humana o de ratón. La figura 4B (1B2, 1C3, 1C12, 1H3, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5 y 10G9) y la figura 8C (6A (NC6), 28A (NC28), 63A (NC63), 77A (NC77), 80A (NC80), 82B (NC82), 83B (NC83), 92A (NC92), 93B (NC93), 99B (NC99), 104B (NC104) y 105A (NC105)) son gráficos de barras que muestran la unión de anticuerpos anti Siglec-15 (% de células positivas) a células que expresan Siglec-15 en el ensayo ilustrado en la figura 4A. La figura 4C es un gráfico de barras que muestra la unión de anticuerpos anti Siglec-15 (1B2, 1C3, 1C12, 1H3, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A (NC6), 28A (NC28), 63A (NC63), 77A (NC77), 80A (NC80), 82B (NC82), 83B (NC83), 92A (NC92), 93B (NC93), 99B (NC99), 104B (NC104) y 105A (NC105)) (% de células positivas) a células que expresan Siglec-15 fijadas en formalina.

Las figuras 5A-5B son gráficos de líneas que muestran la unión de Ab 1C12, 8H8, 5G12, 3H10, 9A5, 6F8, 8C8, 1H3, 10G9, 1B2 y 1C3 purificados a células K562.hS15 (9A, unión de fondo restada) y 293T.mS15 (9B) (intensidad de fluorescencia media (MFI, por sus siglas en inglés) en función de la concentración de anticuerpos primaria (pg/ml)). La figura 5C es un diagrama de puntos de la unión (MFI) de Ab 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5g 12, 6F8, 8<c>8, 8H8, 9A5 y 10G9 a células K562.hS15 con respecto a 293T.mS15.

La 6A es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de células hS15+ U87 detectadas por cada uno de los Ab 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8<c>8, 8H8 y 10G9. La figura 6B es un gráfico de barras que muestra la MFI de células hS15+ U87 detectadas por cada uno de los Ab 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8 y 10G9. La figura 6C es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de células S15+ U87 detectadas por cada uno de los Ab 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5 y 10G9.

La figura 7A es un dibujo que ilustra un ensayo de bloqueo de anticuerpos. Las células 293T que expresan el ligando LRRC4C se tratan con un receptor soluble (hS15.hG1) y un anticuerpo anti S15, y posteriormente se detecta el receptor unido con un anticuerpo PE-anti hFc. La figura 7B es un gráfico de barras que muestra el % de hS15.G1 de unión para el hS15.hG1-1 y los anticuerpos 10G9, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 1C3, 1C12, 1H3, 3H10, 1B2, NC1, NC5, NC728A (NC28), NC38, NC41, NC53, 63A (NC63), NC73, NC74, NC76, 77A (NC77), 82B (NC82), NC84, NC87, NC90, 92A (NC92), CI3-33, CI1-33). La figura 7C es un gráfico de barras que muestra el bloqueo de S15/LRRC4C (%) para el mAb de control y los anticuerpos 1B2, 1C3, 1H3, 8H8, 6F8, 8C8, 9A5, 1C12, 3H10, 10G9 y 5G12. La figura 7D es un gráfico de barras que muestra el bloqueo de S15/LRRC4C (%) para 1B2, 1C3, 1C12 1H3, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5 y 10g 9. La figura 7E es un gráfico de barras que muestra el bloqueo de S15/LRRC4C (%) para 6A (NC6), 28A (NC28), 63A (NC63), 77A (NC77), 80A (NC80), 82B (NC82), 83B (NC83), 92A (NC92), 93B (NC93), 99B (NC99), 104B (NC104) y 105A (NC105)).

La figura 8A es un diagrama de un ensayo de supresión de linfocitos T. Las figuras 8B y 8C son gráficos de barras que muestran la reversión del mAb S15 de la supresión de linfocitos T humanos mediada por hS15.hG1 con el % dividido de linfocitos T CD8+ (12B) y linfocitos T CD4+ (12C) y en comparación con ensayos realizados con (por ejemplo, hS15.hG1) (barra de la izquierda en cada par) y sin (por ejemplo, -hS15.hG1) (barra de la derecha en cada par) hS15.hG1 para los anticuerpos 1B2, 1C3, 1C12 1H3, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5 y 10G9. Las figuras 8D-8G son gráficos de barras que muestran la reversión del mAb S15 de la supresión de linfocitos T humanos mediada por hS15.hG1 como el % dividido de linfocitos T CD8+ (figuras 8D y 8F) y linfocitos T CD4+ (figuras 8E y 8G) para ensayos realizados con hS15.hG1, para los anticuerpos 1B2, 1C3, 1c 121H3, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5 y 10G9 (figuras 8D y 12E) y 6A (NC6), 28A (NC28), 63A (NC63), 77A (NC77), 80A (NC80), 82B (NC82), 83B (NC83), 92A (NC92), 93B (NC93), 99B (NC99), 104B (NC104) y 105A (NC105) (figuras 8F y 8G). Las figuras 8H y 8I son diagramas de puntos que muestran la proliferación de linfocitos T CD8 en función del % de actividad bloqueante de hS15_LRRc4c.

La figura 9A es un diagrama de un ensayo para medir la alteración en la secreción de INE<y>. La figura 9B es un gráfico de barras que muestra los resultados del ensayo en diagrama de la figura 13A, para los anticuerpos 1B2, 1C3, 1C12 1H3, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5 y 10G9.

La figura 10 es un gráfico de barras que muestra la TRAP (fosfatasa ácida resistente a tartrato) (Abs 540 nm) en presencia de los anticuerpos 1C12, 8H8, 5G12, 3H10, 9a 5, 6F8, 8C8, 1H3, 10G9, 1B2 y 1C3 en un ensayo de formación de osteoclastos de PBMC frescas aisladas y enriquecidas para monocitos de 2 maneras: clasificación en columnas MACS (panel izquierdo) o unión a plástico en medios sin suero (panel derecho).

La figura 11 es un diagrama que ilustra un modelo para la regulación negativa de la inmunidad de Siglec-15 en el microambiente tumoral (TME) que incluye Siglec-15 (S15):contrarreceptor de Siglec-15 (S15-CR) >>> Inhibición de proliferación dirigida por linfocitos T y citocinas, y/o Siglec-15:LRRC4C >>> Producción de macrófagos de TGF-p y supresión inmunitaria en el TME. El diagrama muestra la expresión de Siglec-15 y ligandos de la misma en células mieloides, linfocitos T y células cancerosas, y la señalización a partir de la misma, así como las interacciones entre las moléculas anti Siglec-15 (bloqueantes y dirigidas) y los anticuerpos LRRC4C y las proteínas de fusión de Siglec-15 (no reticulantes/bloqueantes).

La figura 12A es una tabla que muestra la secuencia de aminoácidos de las cadenas ligeras variables de 5G12 humanizado L1-L5. La figura 12B es una tabla que muestra la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesadas variables de 5G12 humanizado H1-H3.

La figura 13A muestra la alineación de secuencias de las cadenas ligeras variables de 5G12 humanizado VL1-V15 frente a VL murina. La figura 13B muestra la alineación de secuencias de las cadenas pesadas variables de 5G12 humanizado VH1-VH3.

La figura 14A es un gráfico de líneas del % de proliferación de linfocitos T frente a S15 Fc humana (pg/ml) que muestra que el % de proliferación de linfocitos T se reduce a medida que aumenta la concentración de S15 Fc. La figura 14B es un gráfico de barras de pg/ml de IFN-y en sobrenadantes condicionados de células tratadas con 0 o 5 pg/ml de S15 Fc. La figura 14C es un gráfico de barras de pg/ml de TNF-a en sobrenadantes condicionados de células tratadas con 0 o 5 pg/ml de S15 Fc. La figura 14D es un gráfico de barras de pg/ml de IL-6 en sobrenadantes condicionados de células tratadas con 0 o 5 pg/ml de S15 Fc.

Las figuras 15A y 15B son gráficos de barras que muestran el porcentaje de células positivas para la unión de mAb S15 purificado a partir de hibridoma a células que expresan S15 humana o S15 de ratón.

Las figuras 16A y 16B son gráficos de barras del porcentaje de linfocitos T CD8+ divididos tratados con los anticuerpos indicados. Las figuras 16C y 16D son gráficos de barras del porcentaje de linfocitos T CD4+ divididos tratados con los anticuerpos indicados.

Las figuras 17A y 17B son gráficos de líneas que muestran el porcentaje de supervivencia frente a los días posteriores a la inoculación de células tumorales en animales tratados con 5G12. La figura 17C es un gráfico de líneas del porcentaje de aumento de peso frente a los días posteriores a la inoculación de ID8.OVA.

La figura 18 es un gráfico de líneas del porcentaje de aumento de peso frente a los días posteriores a la inoculación de ID8.OVA.

La figura 19A es un diagrama esquemático que muestra monocitos CD14+ humanos recogidos de PBMC humanas usando perlas magnéticas de monocitos Mitenyi seguido de siembra en placas de 96 pocillos en presencia de M-CSF humano y RANKL humano junto con los anticuerpos indicados. La figura 19B es una micrografía que muestra osteoclastos tratados como se indica con 1H3. La figura 19C es un gráfico de barras de la absorbancia a 540 nm del sobrenadante recogido después de 7 días para el análisis de la fosfatasa ácida resistente a tartrato.

La figura 20 es un gráfico de barras que muestra las citocinas (pg/ml) para INF-y, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A y TNF-a.

La figura 21 es un gráfico de barras de la absorbancia a 540 nm de células de macrófagos RAW 264.7 cultivadas en presencia de RANKL junto con los anticuerpos indicados.

La figura 22 muestra una comparación de secuencias de aminoácidos humanizadas de ejemplo de cadenas ligeras variables de 1H3.

La figura 23 muestra una comparación de secuencias de aminoácidos humanizadas de ejemplo de cadenas pesadas variables de 1H3.

La figura 24 es una ilustración de un modo de acción propuesto para Siglec-15.

La figura 25A es un histograma FACS del recuento frente a Siglec-15 PE que muestra que los macrófagos M2 expresan Siglec-15. La figura 25B es un histograma FACS del recuento frente a Siglec-15 PE para macrófagos M1. La figura 25C es un histograma FACS del recuento frente a Siglec-15 PE para células mieloides procedentes de médula ósea de ratón tratadas con factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). La figura 25D es un histograma FACS del recuento frente a Siglec-15 PE para células mieloides procedentes de médula ósea de ratón tratadas con M-CSF e interleucina-10 (IL-10). La figura 25E es un gráfico de barras de MFI-PE para células mieloides procedentes de médula ósea de ratón tratadas con M-CSF o M-CSF IL10 y teñidas con isotipo-PE (recuadro de color gris) o PE anti Siglec-15.

La figura 26A es un gráfico de barras de la absorbancia a 450 nm para sobrenadantes de monocitos CD14+ humanos del donante n.° 1603 sembrados en placas recubiertas con Siglec-15 Fc (columna izquierda de punto de concentración) o Siglec-15 soluble (columna derecha de cada punto de concentración). La figura 26B es un gráfico de barras de la absorbancia a 450 nm para sobrenadantes de monocitos CD14+ humanos del donante n.° 1704 sembrados en placas recubiertas con Siglec-15 Fc (columna izquierda de punto de concentración) o Siglec-15 soluble (columna derecha de cada punto de concentración). La figura 26C es un gráfico de barras de TNF-a (pg/ml) frente a Siglec-15 Fc (pg/ml) para células del donante n.° 1603. La figura 26D es un gráfico de barras de IL-6 (pg/ml) frente a Siglec-15 Fc (pg/ml) para células del donante n.° 1603. La figura 26E es un gráfico de barras de IL-1p (pg/ml) frente a Siglec-15 Fc (pg/ml) para células del donante n.° 1603. La figura 26F es un gráfico de barras de TNF-a (pg/ml) frente a Siglec-15 Fc (pg/ml) para células del donante n.° 1704. La figura 26G es un gráfico de barras de lL-6 (pg/ml) frente a Siglec-15 Fc (pg/ml) para células del donante n.° 1704. La figura 26H es un gráfico de barras de IL-1 p (pg/ml) frente a Siglec-15 Fc (pg/ml) para células del donante n.° 1704.

La figura 27A es un diagrama de un protocolo experimental para el Ejemplo 19. La figura 27B es un gráfico de barras de % de proliferación de CD8 de células mieloides humanas pretratadas con S15 Fc; M2$, M1$ y DC inmaduras cultivadas conjuntamente con linfocitos pan-T autólogos seleccionados negativamente marcados con CFSE en una relación celular de 1 célula mieloide: 2 linfocitos T junto con perlas anti CD3/CD28 (1 linfocito pan-T: 2 perlas). Las columnas de izquierda a derecha son: linfocitos T solos, linfocitos T perlas, tratadas con S15 Fc, M2$, M1$ e imDC para las figuras 27C a 27G. La figura 27C es un gráfico de barras de IFN-<y>(pg/ml) para las células tratadas anteriormente. La figura 27D es un gráfico de barras de TNF-a (pg/ml) para las células tratadas anteriormente. La figura 27E es el porcentaje de proliferación de CD4 para las células tratadas anteriormente. La figura 27F es un gráfico de barras de IL-6 (pg/ml) para las células tratadas anteriormente. La figura 27G es un gráfico de barras de IL-10 (pg/ml) para la célula tratada anteriormente.

La figura 28A es un gráfico de líneas de la absorbancia a 450 nm frente al mAb (pg/ml) para células del donante 1709. La línea superior es un mAb de control y la línea inferior es mAb S15. La figura 28B es la misma que la figura 28A pero para células del donante 1713.

La figura 29 es un diagrama que ilustra la función que desempeña Siglec-15 en la formación de osteoclastos. La figura 30A es un histograma FACS de monocitos CD14+ humanos tratados con S15 Fc y teñidos con mAb de integrina anti avp3 el día 0. La figura 30B es un histograma FACS de monocitos CD14+ humanos tratados con S15 Fc y teñidos con mAb de integrina anti avp3 el día 6.

Descripción detallada de la invención

La divulgación técnica que se expone a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de las reivindicaciones. Los elementos de la divulgación que no están dentro del alcance de las reivindicaciones se proporcionan a título informativo.

I. Definiciones

Como se usa en el presente documento, se dice que una molécula es capaz de "unirse inmunoespecíficamente" a una segunda molécula si dicha unión exhibe la especificidad y afinidad de un anticuerpo por su antígeno afín. Se dice que los anticuerpos son capaces de unirse inmunoespecíficamente a una región o conformación diana ("epítopo") de un antígeno si dicha unión implica el sitio de reconocimiento de antígeno de la molécula de inmunoglobulina. Un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un antígeno particular puede unirse a otros antígenos con menor afinidad si el otro antígeno tiene alguna secuencia o similitud conformacional que es reconocida por el sitio de reconocimiento de antígeno como se determina, por ejemplo, por inmunoensayos, ensayos BIACORE® u otros ensayos conocidos en la técnica, pero no se uniría a un antígeno no relacionado en absoluto. Preferentemente, sin embargo, los anticuerpos (y sus fragmentos de unión a antígeno) no reaccionarán de forma cruzada con otros antígenos. Los anticuerpos también pueden unirse a otras moléculas de una manera que no es inmunoespecífica, tal como a los receptores FcR, en virtud de dominios de unión en otras regiones/dominios de la molécula que no implican el sitio de reconocimiento de antígeno, tal como la región Fc.

Como se usa en el presente documento, se dice que una molécula "se une fisioespecíficamente" a una segunda molécula si dicha unión muestra la especificidad y afinidad de un receptor por su ligando de unión afín. Una molécula puede ser capaz de unirse fisioespecíficamente a más de una molécula diferente.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" pretende representar una molécula de inmunoglobulina que posee un sitio de reconocimiento de antígeno de "región variable". La expresión "región variable" pretende distinguir dicho dominio de la inmunoglobulina de dominios que son ampliamente compartidos por anticuerpos (tales como un dominio Fc de anticuerpo). La región variable incluye una "región hipervariable" cuyos restos son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable incluye restos de aminoácido de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (es decir, típicamente en aproximadamente los restos 24-34 (L1), 50 56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y en aproximadamente los restos 27-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los restos de un "bucle hipervariable" (es decir, los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917). Los restos de la "región estructural" o "FR" son los restos de dominio variable distintos de los restos de región hipervariable como se define en el presente documento. El término anticuerpo incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos sintéticos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos camelizados (véanse, por ejemplo, Muyldermanset al.,2001, Trends Biochem. Sci. 26:230; Nuttallet al.,2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253; Reichmann y Muyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231:25; Publicaciones Internacionales N.°WO 94/04678 y WO 94/25591; Patente de EE.UU. N.° 6.005.079), Fv monocatenarios (scFv) (véase, por ejemplo, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.

113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994)), anticuerpos monocatenarios, Fv unidos por enlaces disulfuro (sdFv), intracuerpos y anticuerpos antiidiotípicos (anti Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti Id y anti anti Id contra anticuerpos). En particular, tales anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.

Como se usa en el presente documento, la expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo se refiere a una o más porciones de un anticuerpo que contiene las regiones determinantes de complementariedad ("CDR") del anticuerpo y opcionalmente los restos estructurales que incluyen el sitio de reconocimiento de antígeno de la "región variable" del anticuerpo y exhiben la capacidad de unirse inmunoespecíficamente al antígeno. Dichos fragmentos incluyen Fab', F(ab')2, Fv, monocatenario (ScFv) y mutantes de los mismos, variantes de origen natural y proteínas de fusión que incluyen el sitio de reconocimiento de antígeno de la "región variable" del anticuerpo y una proteína heteróloga (por ejemplo, una toxina, un sitio de reconocimiento de antígeno para un antígeno diferente, una enzima, un receptor o ligando de receptor,etc.).

Como se usa en el presente documento, el término "fragmento" se refiere a un péptido o polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos de al menos 5 restos de aminoácidos contiguos, al menos 10 restos de aminoácidos contiguos, al menos 15 restos de aminoácidos contiguos, al menos 20 restos de aminoácidos contiguos, al menos 25 restos de aminoácidos contiguos, al menos 40 restos de aminoácidos contiguos, al menos 50 restos de aminoácidos contiguos, al menos 60 restos de aminoácidos contiguos, al menos 70 restos de aminoácidos contiguos, al menos 80 restos de aminoácidos contiguos, al menos 90 restos de aminoácidos contiguos, al menos 100 restos de aminoácidos contiguos, al menos 125 restos de aminoácidos contiguos, al menos 150 restos de aminoácidos contiguos, al menos 175 restos de aminoácidos contiguos, al menos 200 restos de aminoácidos contiguos, o al menos 250 restos de aminoácidos contiguos.

Como se usa en el presente documento, el término "modular" se refiere a una capacidad para alterar un efecto, resultado o actividad (por ejemplo, transducción de señales). Dicha modulación puede ser agonista o antagonista. La modulación antagonista puede ser parcial (es decir, atenuante, pero no abolidora) o puede abolir completamente dicha actividad (por ejemplo, neutralizante). La modulación puede incluir la internalización de un receptor después de la unión de un anticuerpo o una reducción en la expresión de un receptor en la célula diana. La modulación agonista puede potenciar o aumentar o potenciar de otro modo una actividad (por ejemplo, transducción de señales). En aún una realización adicional, dicha modulación puede alterar la naturaleza de la interacción entre un ligando y su receptor afín para alterar la naturaleza de la transducción de señales provocada. Por ejemplo, las moléculas pueden, uniéndose al ligando o receptor, alterar la capacidad de dichas moléculas para unirse a otros ligandos o receptores y alterar de este modo su actividad general. Preferentemente, tal modulación proporcionará al menos un cambio del 10 % en una actividad medible del sistema inmunitario, más preferentemente, al menos un cambio del 50 % en dicha actividad, o al menos un cambio de 2 veces, 5 veces, 10 veces o, aún más preferentemente, al menos un cambio de 100 veces en dicha actividad.

El término "sustancialmente", como se usa en el contexto de unión o efecto exhibido, pretende indicar que el efecto observado es fisiológica o terapéuticamente relevante. Por lo tanto, por ejemplo, una molécula es capaz de bloquear sustancialmente una actividad de un ligando o receptor si el grado de bloqueo es fisiológica o terapéuticamente relevante (por ejemplo, si dicho grado está completo en más del 60 %, completo en más del 70 %, completo en más del 75 %, completo en más del 80 %, completo en más del 85 %, completo en más del 90 %, completo en más del 95 % o completo en más del 97 %). De manera similar, se dice que una molécula tiene sustancialmente la misma inmunoespecificidad y/o característica que otra molécula, si dichas inmunoespecificidades y características son idénticas en más del 60 %, idénticas en más del 70 %, idénticas en más del 75 %, idénticas en más del 80 %, idénticas en más del 85 %, idénticas en más del 90 %, idénticas en más del 95 % o idénticas en más del 97 %).

Como se usan en el presente documento, las señales "coestimuladoras" abarcan señales coestimuladoras positivas (por ejemplo, señales que dan como resultado la mejora de una actividad) y señales coestimuladoras negativas (por ejemplo, señales que dan como resultado la inhibición de una actividad).

Como se usa en el presente documento, el término "derivado" se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une inmunoespecíficamente a la misma diana de un anticuerpo precursor o de referencia pero que difiere en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo precursor o de referencia o fragmento de unión a antígeno del mismo incluyendo una, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones, adiciones, deleciones o modificaciones de aminoácidos con respecto al anticuerpo precursor o de referencia o fragmento de unión a antígeno del mismo. Preferentemente, dichos derivados tendrán sustancialmente la misma inmunoespecificidad y/o características, o la misma inmunoespecificidad y características que el anticuerpo precursor o de referencia o fragmento de unión a antígeno del mismo. Las sustituciones o adiciones de aminoácidos de dichos derivados pueden incluir restos de aminoácidos de origen natural (es decir, codificados por ADN) o de origen sintético. El término "derivado" abarca, por ejemplo, variantes quiméricas o humanizadas, así como variantes que tienen regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 o CH4 alteradas, para formar, por ejemplo, anticuerpos,etc.,que tienen regiones Fc variantes que exhiben características efectoras o de unión mejoradas o deterioradas.

Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo quimérico" es una molécula en la que diferentes partes del anticuerpo se obtienen a partir de diferentes moléculas de inmunoglobulina tal como anticuerpos que tengan una región variable procedente de un anticuerpo no humano y una región constante de inmunoglobulina humana.

Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a una inmunoglobulina que incluye una región estructural humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (normalmente de ratón o rata). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina "donante" y la inmunoglobulina humana que proporciona la región estructural se denomina "aceptor". No es necesario que estén presentes las regiones constantes, pero en caso de haberlas, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente un 85-99 %, preferentemente aproximadamente un 95 % idénticas o más. Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de secuencias de inmunoglobulinas humanas naturales. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que incluye una inmunoglobulina de cadena ligera humanizada y cadena pesada humanizada. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado no abarcaría un anticuerpo quimérico típico porque, por ejemplo, la totalidad de la región variable de un anticuerpo quimérico no es humana.

Como se usa en el presente documento, la expresión "concentración endógena" se refiere al nivel al que una molécula se expresa de forma nativa (es decir, en ausencia de vectores de expresión o promotores recombinantes) por una célula (célula que puede ser una célula normal, una célula cancerosa o una célula infectada).

Como se usan en el presente documento, los términos "tratar", "que trata", "tratamiento" y "uso terapéutico" se refieren a la eliminación, reducción o mejora de uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno exacerbado por Siglec-15 o un ligando de la misma.

Como se usa en el presente documento, una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a esa cantidad de un agente terapéutico suficiente para mediar en una eliminación, reducción o mejora clínicamente relevante de tales síntomas. Un efecto es clínicamente relevante si su magnitud es suficiente para afectar a la salud o el pronóstico de un sujeto receptor. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede referirse a la cantidad de agente terapéutico suficiente para retrasar o minimizar el inicio de la enfermedad, por ejemplo, retrasar o minimizar la propagación del cáncer. Una cantidad terapéuticamente eficaz también puede referirse a la cantidad de agente terapéutico que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o control de una enfermedad.

Como se usa en el presente documento, el término "agente profiláctico" se refiere a un agente que se puede usar en la prevención de un trastorno o enfermedad antes de la detección de cualquier síntoma de dicho trastorno o enfermedad. Una cantidad "profilácticamente eficaz" es la cantidad de agente profiláctico suficiente para mediar dicha protección. Una cantidad profilácticamente eficaz también puede referirse a la cantidad del agente profiláctico que proporcione un beneficio profiláctico para la prevención de una enfermedad.

Como se usa en el presente documento, el término "cáncer" se refiere a una neoplasia o a un tumor resultante del crecimiento no controlado, anómalo, de las células. Como se usa en el presente documento, el cáncer incluye explícitamente leucemias y linfomas. El término "cáncer" se refiere a una enfermedad que implica células que tienen el potencial de metastatizarse en sitios distales y exhiben rasgos fenotípicos que difieren de aquellos de células no cancerosas, por ejemplo, formación de colonias en un sustrato tridimensional tal como agar blando, o la formación de redes tubulares o matrices en forma de red en una membrana basal tridimensional o preparación de matriz extracelular. Las células no cancerosas no forman colonias en agar blando y forman estructuras distintas en forma de esferas en preparaciones de membrana basal tridimensional o de matriz extracelular.

Como se usa en el presente documento, una "célula inmunitaria" se refiere a cualquier célula de origen hematopoyético que incluye, pero sin limitación, linfocitos T, linfocitos B, monocitos, células dendríticas y macrófagos.

Como se usa en el presente documento, "valencia" se refiere al número de sitios de unión disponibles por molécula.

Como se usan en el presente documento, las expresiones respuesta "inmunológica" o "inmunitaria" son el desarrollo de una respuesta humoral (mediada por anticuerpos) y/o celular (mediada por linfocitos T específicos de antígeno o sus productos de secreción) beneficiosa dirigida contra un péptido en un paciente receptor. Tal respuesta puede ser una respuesta activa inducida por la administración de inmunógeno o una respuesta pasiva inducida por la administración de anticuerpos o linfocitos T cebados. Se provoca una respuesta inmunitaria celular mediante la presentación de epítopos polipeptídicos en asociación con moléculas MHC de Clase I o Clase II para activar linfocitos T auxiliares CD4+ específicos de antígeno y/o linfocitos T citotóxicos CD8+. La respuesta también puede implicar la activación de monocitos, macrófagos, linfocitos NK, basófilos, células dendríticas, astrocitos, células de la microglía, eosinófilos, la activación o reclutamiento de neutrófilos u otros componentes de la inmunidad innata. La presencia de una respuesta inmunitaria mediada por células se puede determinar mediante ensayos de proliferación (linfocitos T CD4+) o ensayos de CTL (linfocitos T citotóxicos). Las contribuciones relativas de las respuestas humorales y celulares al efecto protector o terapéutico de un inmunógeno se pueden distinguir aislando por separado anticuerpos y linfocitos T de un animal singénico inmunizado y midiendo el efecto protector o terapéutico en un segundo sujeto.

Como se usa en el presente documento, un "agente inmunogénico" o "inmunógeno" es capaz de inducir una respuesta inmunitaria contra sí mismo tras la administración a un mamífero, opcionalmente junto con un adyuvante.

Como se usan en el presente documento, los términos "individuo", "hospedador", "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un mamífero, incluyendo, pero sin limitación, seres humanos, roedores, tales como ratones y ratas, y otros animales de laboratorio.

Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" se refiere a una cadena de aminoácidos de cualquier longitud, independientemente de la modificación (por ejemplo, fosforilación o glucosilación). El término polipéptido incluye proteínas y fragmentos de las mismas. Los polipéptidos pueden ser "exógenos", lo que significa que son "heterólogos", es decir, ajenos a la célula hospedadora que se utiliza, tal como el polipéptido humano producido por una célula bacteriana. Los polipéptidos se divulgan en el presente documento como secuencias de restos de aminoácidos. Estas secuencias se escriben de izquierda a derecha en la dirección del extremo amino al carboxi. De acuerdo con la nomenclatura estándar, las secuencias de restos de aminoácidos se denominan mediante un código de tres letras o de una sola letra, como se indica a continuación: alanina (Ala, A), arginina (Arg, R), asparagina (Asn, N), ácido aspártico (Asp, D), cisteína (Cys, C), glutamina (Gln, Q), ácido glutámico (Glu, E), glicina (Gly, G), histidina (His, H), isoleucina (Ile, I), leucina (Leu, L), lisina (Lys, K), metionina (Met, M), fenilalanina (Phe, F), prolina (Pro, P), serina (Ser, S), treonina (Thr, T), triptófano (Trp, W), tirosina (Tyr, Y) y valina (Val, V).

Como se usa en el presente documento, el término "variante" se refiere a un polipéptido o polinucleótido que difiere de un polipéptido o polinucleótido de referencia, pero que conserva propiedades esenciales. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias son limitadas de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son muy similares en general y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más modificaciones (por ejemplo, sustituciones, adiciones y/o deleciones). Un resto de aminoácido sustituido o insertado puede o no estar codificado por el código genético. Una variante de un polipéptido puede existir de forma natural, tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se sabe que se produzca de forma natural. Se pueden hacer modificaciones y cambios en la estructura de los polipéptidos de la divulgación y aún obtener una molécula que tenga características similares al polipéptido (por ejemplo, una sustitución de aminoácidos conservadora). Por ejemplo, determinados aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos en una secuencia sin pérdida apreciable de actividad. Debido a que es la capacidad interactiva y la naturaleza de un polipéptido lo que define la actividad funcional biológica de ese polipéptido, determinadas sustituciones de la secuencia de aminoácidos se pueden realizar en una secuencia de polipéptidos y, sin embargo, obtener un polipéptido con propiedades similares.

Al realizar dichos cambios, puede tenerse en consideración el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice de aminoácidos hidropáticos para conferir una función biológica interactiva a un polipéptido se entiende generalmente en la técnica. Se sabe que determinados aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y aún dan como resultado un polipéptido con una actividad biológica similar. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobia y carga. Estos índices son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina ( 1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina ( 4,5).

Se cree que el carácter hidropático relativo del aminoácido determina la estructura secundaria del polipéptido resultante, lo que, a su vez, define la interacción del polipéptido con otras moléculas, tales como enzimas, sustratos, receptores, anticuerpos, antígenos y cofactores. Se sabe en la técnica que un aminoácido puede estar sustituido por otro aminoácido que tenga un índice hidropático similar y todavía obtener un polipéptido funcionalmente equivalente.

En dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén en un intervalo de ±2, se prefieren en particular los que estén en un intervalo de ±1 e incluso se prefieren más particularmente los que estén en un intervalo de ±0,5.

La sustitución de aminoácidos similares también se puede hacer basándose en la hidrofilia, particularmente cuando el polipéptido o péptido equivalente funcional biológico creado de este modo está destinado para su uso en realizaciones inmunológicas. Se han asignado a los restos de aminoácido los siguientes valores de hidrofilia: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); prolina (-0,5 ± 1); treonina (-0,4); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido se puede sustituir por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y todavía obtener un polipéptido biológicamente equivalente y, en particular, un polipéptido inmunológicamente equivalente. En dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilia se encuentren a razón de ±2, se prefieren en particular los que estén en un intervalo de ±1 e incluso se prefieren más particularmente los que estén en un intervalo de ±0,5.

Como se ha descrito anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilia, carga, tamaño y similares. Las sustituciones de ejemplo que toman en consideración diversas características anteriores se conocen bien por los expertos en la técnica e incluyen (resto original: sustitución de ejemplo): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe) y (Val: Ile, Leu). En particular, las realizaciones de los polipéptidos pueden incluir variantes que tienen aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con el polipéptido de interés.

La expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia" se define como el porcentaje de nucleótidos o aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos o aminoácidos en una secuencia de ácido nucleico de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia puede lograrse de varias maneras que se encuentran dentro de las capacidades de la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles públicamente tales como el software BLAST, BLAST-2, ALIG<n>, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los parámetros adecuados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima sobre toda la longitud de las secuencias que se comparan, se pueden determinar mediante métodos conocidos.

A efectos del presente documento, el % de identidad de secuencia de una determinada secuencia de nucleótidos o aminoácidos C con, o contra una determinada secuencia de ácido nucleico D (que, como alternativa, puede expresarse como una determinada secuencia C que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia con, o en contra de una determinada secuencia D) se calcula de la siguiente manera:

100 veces la fracción W/Z,

donde W es el número de nucleótidos o aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias en la alineación de C y D de ese programa, y donde Z es el número total de nucleótidos o aminoácidos en D. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia C no es igual a la longitud de la secuencia D, el % de identidad de secuencia de C con respecto a D no será igual que el % de identidad de secuencia de D con respecto a C.

Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención es uno que se une específicamente a SIGLEC-15, en donde el anticuerpo comprende las tres CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) seleccionadas del grupo que consiste en:

i. SYWIS (SEQ ID NO:208; HCDR1); DIYSGSDTTHYAEKFQG (SEQ ID NO:374; HCDR2); WWDYGSSYDYFDY (SEQ ID NO:71; HCDR3),

ii. SYWIT (SEQ ID NO:204; HCDR1); DIYSGSDTMHYAEKFQG (SEQ ID NO:205; HCDR2); WWDYGSSYDYFD (SEQ ID NO:71; HCDR3);

iii. SYWIT (SEQ ID NO:204; HCDR1); DIYSGSDTTHYAEKFQG (SEQ ID NO:374; HCDR2); WWDYGSSYDYFD (SEQ ID NO:71; HCDR3); y

y un conjunto de tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) seleccionadas del grupo que consiste en

i. KASQDINVYLS (SEQ ID NO: 198; LCDR1); RANRLTS (SEQ ID NO:202; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3).

ii. KASQDINSYLS (SEQ ID NO:28; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPY (SEQ ID NO:43; LCDR3);

iii. KASQDINTYLS (SEQ ID NO: 196; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3);

iv. KASQDINVYL (SEQ ID NO: 198; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3); y

v. KASQDIQSYLS (SEQ ID NO:200; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3).

Como se usa en el presente documento, la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" abarca cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar, tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua y emulsiones (tales como una emulsión de aceite/agua o de agua/aceite) y diversos tipos de agentes humectantes.

Como se usan en el presente documento, la expresión "determinante antigénico" y el término "epítopo" se usan indistintamente y se refieren a la estructura reconocida por un anticuerpo.

Como se usa en el presente documento, un "epítopo conformacional" es un epítopo que incluye secciones discontinuas de la secuencia de aminoácidos del antígeno. Los anticuerpos se unen a un epítopo conformacional basado en las características superficiales tridimensionales, la forma o la estructura terciaria del antígeno.

Como se usa en el presente documento, un "epítopo lineal" es un epítopo que se formó mediante una secuencia continua de aminoácidos del antígeno. Los epítopos lineales típicamente incluyen de 5 a 10 restos de aminoácidos continuos. Los anticuerpos se unen a un epítopo lineal basado en la secuencia primaria del antígeno.

Como se usa en el presente documento, un "parátopo", también denominado "sitio de unión a antígeno", es una parte de un anticuerpo que reconoce y se une a un antígeno.

II. Composiciones

A. Secuencias de Siglec-15

La lectina 15 similar a Ig de unión a ácido siálico ("Siglec-15", también denominada CD33 similar al antígeno 3 y CD33L3) es una proteína transmembrana de tipo 1 expresada en macrófagos y/o células dendríticas de bazo humano y ganglios linfáticos (Angata,et al.,Glycobiology, 17(8):838-46 (2007)). El dominio extracelular de Siglec-15 se une a glucoproteínas sialiladas y reconoce preferentemente la estructura Neu5Aca2-6GalNAca-.

Siglec-15 se asocia con las proteínas adaptadoras activadoras, la proteína de activación de DNAX (DAP)12 y DAP10 a través de su resto de lisina (resto K274) en el dominio transmembrana, lo que indica que funciona como una molécula de señalización activadora. Los ortólogos de Siglec-15 están presentes no solo en mamíferos sino también en otras ramas de vertebrados, y se cree que desempeñan una función reguladora conservada en el sistema inmunitario de los vertebrados.

Siglec-15 regula directamente la función de los linfocitos T inhibiendo la proliferación de linfocitos T y la producción de citocinas proinflamatorias. Siglec-15 afecta indirectamente a la función de los linfocitos T a través de las células mieloides. Siglec-15 expresada en células tumorales o macrófagos M2 interactúa con su compañero de unión en las células mieloides proporcionando señales de supervivencia y diferenciación, lo que da como resultado una población de células mieloides única que produce TNF-a, IL-6 e IL-1 p. Las citocinas secretadas promueven aún más el crecimiento tumoral. Este subconjunto de células mieloides puede afectar a la función de los linfocitos T al reducir la producción de IFN-<y>en los linfocitos T.

Las secuencias de aminoácidos para Siglec-15 humana se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo,

MEKSIW L LAC LAWVL PTGSFVRTKIDTTENLLNTEVHSSPAQRWSMQVPPEVS

AEAGDAAVLPCTFTHPHRHYDGPLTAIWRAGEPYAGPQVFRCAAARGSELCQT

ALSLHGRFRLLGNPRRNDLSLRVERLALADDRRYFCRVEFAGDVHDRYESRHG

VRLHVTAAPRIVNISVLPSPAHAFRALCTAEGEPPPALAWSGPALGNSLAAVR

SPREGHGHL VTAELPAL THDGR YTCTAANSL GRSEASVYLFRFHGASGASTVA

LLLGALGFKALLLLGVLAARAARRRPEHLDTPDTPPRSQAQESNYENLSQMNP

RSPPATMCSP

(SEQ ID NO:1), UniProtKB - Q6ZMC9 (SIG15_HUMANA).

La Siglec-15 humana incluye una secuencia de péptido señal de los aminoácidos 1-19 de SEQ ID NO:1, un dominio extracelular de los aminoácidos 20-263 de SEQ<i>D NO:1 (ilustrada con letras en negrita y en cursiva), un dominio transmembrana de los aminoácidos 264-284 de SEQ ID NO:1, y un dominio citoplasmático de los aminoácidos 285328 de SEQ ID NO:1. Se predice que el dominio tipo V similar a Ig será de los aminoácidos 40-158 de SEQ ID NO:1 (ilustrada con un subrayado simple) y se predice que el dominio tipo C2 similar a Ig será de los aminoácidos 168-251 de SEQ ID NO:1 (ilustrada con doble subrayado). Se cree que se forman enlaces disulfuro entre los restos 64 y 142; 95 y 104; y 187 y 237, y se predice la glucosilación en el resto 172. Se ha hecho referencia a los aminoácidos 276 279 como dominio de polileucina. Una variante conocida es una variante de la sustitución F273L.

Las secuencias de aminoácidos para Siglec-15 de ratón se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo,

MEGSLQLLACLACVLQMGSLVKT.RRDASGPLXyTEAHSAPAQKR7SM2VPAEVy

AKAGDAAVLPCTFTHPHRHYDGPLTAIWRSGEPYAGPQVFRCTAAPGSELCQT

ALSLHGRFRLLGNPRPNDLSLRVERLALADSGRYFCRVEFTGDAHDRYESRHG

VRLRVTAAAPRIVNISVLPGPAHAFRALCTAEGEPPPALAWSGPAPGNSSAAL

OGOGHGYOVTAELPALTRDGRYTCTAANSLGRAKASVYLFRFHGAPGTSTLAL

LLGALGLKALLLLGILGARATRRRLDHLVPQDTPPRSQAQESNYENLSQMSPP

GHQLPRVCCEELLSHHHLVIHHEK

(SEQ ID NO:2), UniProtKB - A7E1W8 (A7E1W8_RATÓN.

La Siglec-15 de ratón incluye una secuencia de péptido señal de los aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO:2, un dominio extracelular de los aminoácidos 24-262 de SEQ ID NO:2 (ilustrada con letras en negrita y en cursiva), un dominio transmembrana de los aminoácidos 263-283 de SEQ ID NO:2, y un dominio citoplasmático de los aminoácidos 284 342 de SEQ ID NO:2. Se predice que el dominio tipo V similar a Ig será de los aminoácidos 40-145 de SEQ ID NO:2 (ilustrada con un subrayado simple) y se predice que el dominio tipo C2 similar a Ig será de los aminoácidos 169-250 de SEQ ID NO:2 (ilustrada con doble subrayado).

B. Moléculas de unión a Siglec-15

Se proporcionan moléculas de unión a Siglec-15, tales como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos y otros polipéptidos que se unen a Siglec-15. En particular, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a SIGLEC-15, en donde el anticuerpo comprende las tres CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) seleccionadas del grupo que consiste en:

i. SYWIS (SEQ ID NO:208; HCDR1); DIYSGSDTTHYAEKFQG (SEQ ID NO:374; HCDR2); WWDYGSSYDYFDY (SEQ ID NO:71; HCDR3),

ii. SYWIT (SEQ ID NO:204; HCDR1); DIYSGSDTMHYAEKFQG (SEQ ID NO:205; HCDR2); WWDYGSSYDYFD (SEQ ID NO:71; HCDR3);

iii. SYWIT (SEQ ID NO:204; HCDR1); DIYSGSDTTHYAEKFQG (SEQ ID NO:374; HCDR2); WWDYGSSYDYFD (SEQ ID NO:71; HCDR3); y

y un conjunto de tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) seleccionadas del grupo que consiste en

i. KASQDINVYLS (SEQ ID NO: 198; LCDR1); RANRLTS (SEQ ID NO:202; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3).

ii. KASQDINSYLS (SEQ ID NO:28; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPY (SEQ ID NO:43; LCDR3);

iii. KASQDINTYLS (SEQ ID NO: 196; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3);

iv. KASQDINVYL (SEQ ID NO: 198; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3); y

v. KASQDIQSYLS (SEQ ID NO:200; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3).

Por ejemplo, las moléculas divulgadas pueden unirse inmunoespecíficamente a Siglec-15 (por ejemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, etc.). Por ejemplo, se proporcionan moléculas que pueden unirse inmunoespecíficamente a Siglec-15 humana:

(I) dispuesta sobre la superficie de una célula (preferentemente una célula viva);

(II) dispuesta sobre la superficie de una célula (preferentemente una célula viva) en una concentración endógena; (III) dispuesta sobre la superficie de una célula viva, y modula la unión entre Siglec-15 (por ejemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, etc.) y Neu5Aca2-6GalNAca, LRRC4C, un contrarreceptor de Siglec-15 (S15-CR), o una combinación de los mismos;

(IV) dispuesta sobre la superficie de una célula viva y reduce, previene o inhibe la secreción de TGF-P;

(V) dispuesta sobre la superficie de una célula viva, en donde la célula es una célula mieloide tal como un macrófago o una célula dendrítica, o una célula cancerosa (por ejemplo, célula de cáncer de cerebro, célula de carcinoma de células renales (RCC), célula de sarcoma Ewing, célula de cáncer de mama o célula de cáncer de ovario);

(VI) combinaciones de los mismos.

1. Secuencias de anticuerpos anti Siglec-15 humana de ratón

Como se describe en los ejemplos a continuación, se inmunizaron ratones inactivados con Siglec-15 (n = 2) con hS15.mIg (dominio extracelular [ECD] de Siglec 15 humana fusionado con IgG2a de ratón) emulsionado con CFA (adyuvante completo de Freund) para generar un panel de mAb anti Siglec-15 humana de ratón.

Las secuencias de regiones variables de cadena ligera y pesada para los anticuerpos monoclonales producidos por veinticuatro hibridomas, denominados en el presente documento 1B2, 1C3, 1H3, 1 C12 , 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A (también NC6 y #6), 28A (también NC28 y #28), 63A (también denominado NC63 y #63), 71A (también denominado n C71 y #71), 77A (también denominado NC77 y #77), 80A (también denominado NC80 y #80), 82B (también denominado NC82 y #82), 83B (también denominado NC83 y #83), 92A (también denominado NC92 y #92), 93B (también denominado NC93 y #93), 99B (también denominado NC99 y #99), 104B (también denominado NC104 y #104), y 105A (también denominado NC105 y #105) se proporcionan a continuación. Las CDR están subrayadas y en negrita en el contexto de las secuencias de cadena ligera y pesada. Las secuencias y las CDR también se ilustran en las alineaciones de las figuras 2A-3C.

También se divulgan los siguientes anticuerpos: 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A (también NC6 y #6), 28A (también NC28 y #28), 63A (también denominado<n>C63 y #63), 71A (también denominado NC71 y #71), 77A (también denominado NC77 y #77), 80A (también denominado NC80 y #80), 82B (también denominado NC82 y #82), 83B (también denominado n C83 y #83), 92A (también denominado NC92 y #92), 93B (también denominado NC93 y #93), 99B (también denominado n C99 y #99), 104B (también denominado NC104 y #104), y 105A (también denominado NC105 y #105) se proporcionan a continuación.

a. SECUENCIAS DE 1B2:

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 1B2 es:

con

CDR1 de cadena ligera de 1B2 RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:24)

CDR2 de cadena ligera de 1B2 KVSNRFS (SEQ ID NO:32)

CDR3 de cadena ligera de 1B2 FQGSHVPWT (SEQ ID NO:39).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 1B2 es:

GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCA

AGC C T C CAT C T C T TGCAGATC TAGT CAGAGCATT GTACATAGTAAT GGAAACA

CCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATC

TACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T CAAGAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT C T G G

GAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGC

ACCAAGCTGGAAATCAAG

(SEQ ID NO:74).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 1B2 es:

EVQLVES GGGFVKPGGS LKL S CAASGFTFSDYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISS

GSSIIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQM TSLRSEDTAM YYCARDHYHGNGS

DYWGQGTTLTVSS

(SEQ ID NO: 13),

CDR1 de cadena pesada de 1B2: GFTFSDYGMH (SEQ ID NO:46)

CDR2 de cadena pesada de 1B2: YISSGSSIIYYADTVKG (SEQ ID NO:56)

CDR3 de cadena pesada de 1B2: DHYHGNGSDY (SEQ ID NO:67).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 1B2 es:

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTCGTGAAGCCTGGAGGGTCCCT

GAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATGGAATGCACT

GGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGCATACATTAGTAGT

G G CAG TAGTATCATCTACTATG CAGACACAG T GAAGGG C C GAT T CAC CAT C T C

CAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGT C T GAGGT C T G

AGGACAC GGC CAT G TAT TAC T G T GCAAGGGAC CAC TAC CAT GG TAAC GGG T C C

GAC TACTGGGGC CAAG GCACCACTCTCACAGTCTCCTCA

(SEQ ID NO:85).

b. SECUENCIAS DE 1C3:

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 1C3 es:

D IV M TQ A A PSV PV TPG ESV SISC R SSK SLLH SN G N TY LY W FLQ R PG Q SPQ LLI

YRM SNLASGVPDRFGGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGFYYCM QHLEYPYTFGGG

T R L E IK

(SEQ ID NO:4),

CDR1 de cadena ligera de 1C3: RSSKSLLHSNGNTYLY (SEQ ID NO:25)

CDR2 de cadena ligera de 1C3: RMSNLAS (SEQ ID NO:33)

CDR3 de cadena ligera de 1C3: MQHLEYPYT (SEQ ID NO:40).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 1C3 es:

GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTC

AG TATCCATCTCCTG CAG G T C TAG TAAGAG T C T C C T G CATAG TAAT G G CAACA

CTTACTTATATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATA

TATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCGGTGGCAGTGG

G T CAG GAAC T G C T T T CACAC T GAGAAT CAG TAGAG T G GAG G C T GAG GAT G T G G

g t t t t t a t t a c t g t a t g c a a c a t c t a g a a t a t c c g t a c a c g t t c g g a g g g g g g AC CAG G C T G GAAATAAAA

(SEQ ID NO:75).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 1C3 es:

QVQLKQSGAELVKPGASVKISCKASGYIFTDYYVNWVKQRPGQGLEWIGK IG P

G SV SIY Y N EK FK G KATLTA DK SSSTAY M Q LSSLTSED SA VY FCA SYYYGFAYW

GQGTLVTVSA

(SEQ ID NO: 14),con

CDR1 de cadena pesada de 1C3: GYIFTDYYVN (SEQ ID NO:47)

CDR2 de cadena pesada de 1C3: KIGPGSVSIYYNEKFKG (SEQ ID NO:57)

CDR3 de cadena pesada de 1C3: YYYGFAY (SEQ ID NO:68).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 1C3 es:

CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGATAT CC T GCAAGGC T T C T GGC TACAT C T T CAC T GAC TAT TATGTAAACT

GGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAAAGATTGGTCCT

G GAAGT GT TAGTAT T TACTACAAT GAGAAGT T CAAGGGCAAGGC CACAC T GAC

TGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTG

AGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGTTATTACTACGGGTTTGCTTACTGG

GGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

(SEQ ID NO:86).

c. SECUENCIAS DE 1H3:

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 1H3 es:

DIQM TQASSSLSVSLGGRVTITCKASDHINNW LAW YQQKPGNAPRLLISGATS

LETG V PSR FSG SG SG K D Y TLSITSLQ TED V A TY Y C QQYW SSPLTFGAGTKLEL

K

(SEQ ID NO:5),con

CDR1 de cadena ligera de 1H3: KASDHINNWLA (SEQ ID NO:26)

CDR2 de cadena ligera de 1H3: GATSLET (SEQ ID NO:34)

CDR3 de cadena ligera de 1H3: QQYWSSPLT (SEQ ID NO:41).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 1H3 es:

GACAT C CAGATGACACAGGCT T CAT CCTCCTTGTCTGTAT C T C TAGGAGGCAG

AG T CAC CAT TAC T T G CAAG G CAAG T GAC CACAT TAATAAT TGGTTGGCCTGGT

ATCAGCAGAAACCAGGAAATGCTCCTAGGCTCTTAATATCTGGTGCAACCAGT

TTGGAAACTGGGGTTCCTTCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAAAGGATTA

CAC T C T CAG CAT TAC CAG T C T T CAGACT GAAGAT GTTGCTACTTATTACTGTC

AACAGTATTGGAGTTCTCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTG

AAA

(SEQ ID NO:76).

ii. Cadena ligera humanizada

También se divulga un anticuerpo anti SIGLEC-15 humanizado que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable de

D1QMTQSPSSLS AS VGDRVT1TCKASPHINN WLAVV YQQKPGK APKLLIS

GATSL.ETGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSSPLTFG

GGTKVEIK (SEQ ID NO:209)

con

CDR1 de cadena ligera de 1H3:KASDHINNWLA(SEQ ID NO:26)

CDR2 de cadena ligera de 1H3:GATSLET(SEQ ID NO:34)

CDR3 de cadena ligera de 1H3:QQYWSSPLT(SEQ ID NO:41).

Los aminoácidos subrayados se cambian con respecto a la secuencia precursora.

También se divulga un anticuerpo anti SIGLEC-15 humanizado que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable de

DIQMT Q SPSSLS A SVGDR VTIT C KA SD HINN VV LA W YQQKPGKVPKLLIS

GATSLETGWSRFSGSGSGIDYTLIISSLQPEDVATYYCQQYWSSPLTF

GGGTKVEJK (SEQ ID NO 210)

con

CDR1 de cadena ligera de 1H3:KASDHINNWLA(SEQ ID NO:26)

CDR2 de cadena ligera de 1H3:GATSLET(SEQ ID NO:34)

CDR3 de cadena ligera de 1H3:QQYWSSPLT(SEQ ID NO:41).

Los aminoácidos subrayados se cambian con respecto a la secuencia precursora.

También se divulga un anticuerpo anti SIGLEC-15 humanizado que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable de

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTnCKASDHINNWLAW YQQKPGK APKLLIS GATSLETGVPSRFSGSGSGIDYTl/TISSLQPEDVATYYCQQYWSSPLTF GGGTKVEJK (SEQ ID NO 211)

con

CDR1 de cadena ligera de 1H3:KASDHINNWLA(SEQ ID NO:26)

CDR2 de cadena ligera de 1H3:GATSLET(SEQ ID NO:34)

CDR3 de cadena ligera de 1H3:QQYWSSPLT(SEQ ID NO:41).

Los aminoácidos subrayados se cambian con respecto a la secuencia precursora.

iii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 1H3 es:

Q V Q LK E SG PG L V A PSQ SL SIT C T V SG FSL SNYGVHWVRQPPGKGLEWLVL IW S

DGSTTYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTGDTAMYYCARHPYDDYSGY

YYTMDYWGQGTSVTVSS

(SEQ ID NO: 15),

con la CDR1 de cadena pesada de 1H3: NYGVH (SEQ ID NO:48)

CDR2 de cadena pesada de 1H3: LIWSDGSTTYNSALKS (SEQ ID NO:58)

CDR3 de cadena pesada de 1H3: HPYDDYSGYYYTMDY (SEQ ID NO:69).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 1H3 es:

CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCT

G T C CAT CACAT G CAC C G T C T CAG GGTTCTCATTAAGCAATTAT GG T GTACAC T

GGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGTACTGATATGGAGT

GAT G GAAG C AC AAC C T AT AAT T C AG C T C T CAAAT C CAGAC T GAG C AT C AG CAA

GGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTCCAAACTGGTG

ACACAG CCATGTACTACTGTGCCAGACAT CCC TAT GAT GAT TATTCCGGCTAT

TACTATACTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

(SEQ ID NO:87).

iv. Cadenas pesadas humanizadas

También se divulga un anticuerpo anti SIGLEC15 humanizado que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable de

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSNYGVHWVRQPPGKGLEWIV

LIWS DGSTT Y N S A L KSR VTIS K DTS K NQ V S LK LS SVTAA DT A V Y Y CAR

HPYDDYSGYYYTMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N 0 212)

con

CDR1 de cadena pesada de 1H3 NYGVH (SEQ ID NO:48)

CDR2 de cadena pesada de 1H3 LIWSDGSTTYNSALKS (SEQ ID NO:58)

CDR3 de cadena pesada de 1H3 HPYDDYSGYYYTMDY (SEQ ID NO:69).

Los aminoácidos subrayados se cambian con respecto a la secuencia precursora.

También se divulga un anticuerpo anti SIGLEC15 humanizado que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable de

Q VQLQESGPGL V K PSETLSLTCT VSGFSLSN YG V11W VRQPPGKGLE W]G

LIWSDGSTTYASALKSRVTISKDTSKNOVSLKLSSVTAADTAVYYCAR

HPYDDYSGYYYTMDYWGQGTLVTVS (SEQ ID NO:213)

con

CDR1 de cadena pesada de 1H3: NYGVH (SEQ ID NO:48)

CDR2 de cadena pesada de 1H3: LIWSDGSTTYASALKS (SEQ ID NO:214)

CDR3 de cadena pesada de 1H3: HPYDDYSGYYYTMDY (SEQ ID NO:69).

Los aminoácidos subrayados se cambian con respecto a la secuencia precursora.

También se divulga un anticuerpo anti SIGLEC15 humanizado que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable de

QVQLQESGPGLVKPSULSLTCTVSGFSLSNYGVHWVRQPPGKGLEW'IG

LIWSDGSTTYNPSLKSRVTISKDTSKNOVSLKLSSVTAADTAVYYCAR

HPYDDYSGYYYTMDYWGQGTLVTVS (SEQ ID N 0 215)

con

CDR1 de cadena pesada de 1H3: NYGVH (SEQ ID NO:48)

CDR2 de cadena pesada de 1H3: LIWSDGSTTYNPSLKS (SEQ ID NO:218)

CDR3 de cadena pesada de 1H3: HPYDDYSGYYYTMDY (SEQ ID NO:69).

Los aminoácidos subrayados se cambian con respecto a la secuencia precursora.

También se divulga un anticuerpo anti SIGLEC15 humanizado que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable de

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSNYGVHWVRQPPGKGLEW1G

LIWSEGSTTYASALKSRVTISKDTSKNOVSLKLSSVTAADTAVYYCAR

HPYDDYSGYYYTMDY WGQGTLVTVS (SEQ ID N 0 216)

con

CDR1 de cadena pesada de 1H3: NYGVH (SEQ ID NO:48)

CDR2 de cadena pesada de 1H3: LIWSEGSTTYASALKS (SEQ ID NO:217)

CDR3 de cadena pesada de 1H3: HPYDDYSGYYYTMDY (SEQ ID NO:69).

d. SECUENCIAS DE 1C12:

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 1C12 es:

D V LM TQ TPLSLPV SLG D Q A SI5C R SSQ SIV H SN G N T Y LE W YLQKPGQ5PKLLI

YK V SN RFSG V PD RF5G SG SG TD FTLK ISRV EA ED LG V Y Y CFQGSHVPWTFGGG

T K L E IK

(SEQ ID NO:3),conCDR1 de cadena ligera de 1C12: RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:24)

CDR2 de cadena ligera de 1C12: KVSNRFS (SEQ ID NO:32)

CDR3 de cadena ligera de 1C12: FQGSHVPWT (SEQ ID NO:39).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 1C12 es:

GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCA

AGC C T C CAT C T C T TGCAGATC TAGT CAGAGCATT GTACATAGTAAT GGAAACA

CCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATC

TACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T CAAGAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT C T G G

GAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGC

ACCAAGCTGGAAATCAA

(SEQ ID NO:77).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 1C12 es:

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFSFSDYGMHWVRQAPEKGLEWVA Y IS S

GSSILYYADIVKGRFTISRDNAKNTLFLQM TSLRSEDTAM YYCARDHYHGNGS

DYWGQGTTLTVSS

(SEQ ID NO: 16),

con la CDR1 de cadena pesada de 1C12: GFSFSDYGMH (SEQ ID NO:49)

CDR2 de cadena pesada de 1C12: YISSGSSILYYADIVK (SEQ ID NO:59)

CDR3 de cadena pesada de 1C12: DHYHGNGSDY (SEQ ID NO:67).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 1C12 es:

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCT

GAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGTTTCTCTTTCAGTGACTATGGAATGCACT

GGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGCATACATTAGTAGT

GGCAGTAGTATCCTCTACTATG CAGACATAG T GAAGGGC C GAT T CAC CAT C T C

CAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTGAGGTCTG

AGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGGGACCACTACCATGGTAACGGGTCC

GACTACTGGGGC CAAG GCACCACTCTCACAGTCTCCTCA

(SEQ ID NO:88).

e. SECUENCIAS DE 3H10:

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 3H10 es:

Q IIL T Q S P A IM S A S P G E K V T M T C SA SSST SFM H W YQQKPGTSPKRW IFD TSK L

A SG V PG R FIG SG SG TSY SL TISTM EA E D A A T Y Y C HQRSAYPWTFG G G TK LEIK

(SEQ ID NO:6),

con la CDR1 de cadena ligera de 3H10: SASSSTSFMH (SEQ ID NO:27)

CDR2 de cadena ligera de 3H10: DTSKLA (SEQ ID NO:35)

CDR3 de cadena ligera de 3H10: HQRSAYPWT (SEQ ID NO:42).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 3H10 es:

CAAATTAT T C T CACCCAG T C TCCAGCAATCAT GT C TGCATC T C CAGGGGAGAA

G G T CAC CAT GAC C T GCAG T GC CAGC T CAAG TACAAG T T T CAT G CAC T GG TAC C

AG CAGAAGC CAGGCAC C T C C C C CAAAAGATGGAT T T T T GACACAT CCAAACT G

GCTTCTGGAGTCCCTGGTCGCTTCATTGGTAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTC

T C T CACAAT CAGCACCATG GAG G C T GAAGA TGCTGCCACTTATTACTGCCATC

AGCGGAGTGCTTACCCATGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA

(SEQ ID NO:78).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 3H10 es:

con la CDR1 de cadena pesada de 3H10: GFNIKDYYMH (SEQ ID NO:50)

CDR2 de cadena pesada de 3H10: RIDPEDGDIEYDPKFQG (SEQ ID NO: 60)

CDR3 de cadena pesada de 3H10: DYDYDGGWFAY (SEQ ID NO:70).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 3H10 es:

GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGT

CAAGT T GT CC T GCACAGC T TCTGGCTT CAACAT TAAAGAC TAC TATAT GCAC T

GGGTGAAAGAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCT

GAG GAT G G T GATAT T GAATAT GAC C C GAAG T T C CAG G G CAAG G C CAC TAT GAC

T G CAGATACAT C C T C CAACACAG CCTACCTGCAGTTCAGCAGCC T GACAT C T G

AGGACACTGCCGTCTATTATTGTGTCACGGACTATGATTACGACGGAGGCTGG

TTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

(SEQ ID NO:89).

f. SECUENCIAS DE 5G12:

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 5G12 es:

DIKM TQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSW FQQKPGKSPKTLIYRANR

LVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDM GIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEI

KR

(SEQ ID NO:7),

con la CDR1 de cadena ligera de 5G12: KASQDINSYLS (SEQ ID NO:28)

CDR2 de cadena ligera de 5G12: RANRLVD (SEQ ID NO:36)

CDR3 de cadena ligera de 5G12: LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 5G12 es:

GACAT CAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAG

AG T CAC TAT CAC T T G CAAG G C GAG T CAG GACAT TAATAG C TAT T TAAG C T G G T

T C CAG CAGAAACCAGGGAAATC T CC TAAGACCCTGATCTATCGTGCAAACAGA

TTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTA

T T C T C T CACCAT CAGCAGCCTGGAGTAT GAAGATAT GGGAAT T TAT TAT T G T C

TACAGTATGATGAGTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATA

AAA

(SEQ ID NO:79).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 5G12 es:

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWITWVIQRPGQGLEWIGDIYC

GSD TMHYNEKFKNKAT L TVD T S S S TAYMQL S S L T S E D SAVYY CARWWDYGS SY

DYFDYWGQGTTLTVSS

(SEQ ID NO: 18),

con la CDR1 de cadena pesada de 5G12: GYTFTSYWIT (SEQ ID NO:51)

CDR2 de cadena pesada de 5G12: DIYCGSDTMHYNEKFKN (SEQ ID NO:61)

CDR3 de cadena pesada de 5G12: WWDYGSSYDYFDY (SEQ ID NO:71).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 5G12 es:

CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATAACCT

GGGTGATACAGAGGCCGGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTTATTGT

G G TAG T GATAC TATGCACTACAATGAGAAGT T CAAGAACAAGGC CACAC T GAC

T G T AGAC AC AT C C T C C AGC AC AG C C T AC AT G CAGC T C AG CAGCC T GAC AT C T G

AGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATGGTGGGACTACGGTAGTAGCTAC

GACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA

(SEQ ID NO:90).

g. SECUENCIAS DE 6F8:

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 6F8 es:

D IV M T Q A A PSV PV T PG E SV SISC R SSK SLLH SN G N TY LY W FLQ RPG Q SPQ LLI

YRMSNLASGVPDRFGGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGG

T K L E IK R

CDR1 de cadena ligera de 6F8: RSSKSLLHSNGNTYLY (SEQ ID NO:25)

CDR2 de cadena ligera de 6F8: RMSNLAS (SEQ ID NO:33)

CDR3 de cadena ligera de 6F8: MQHLEYPYT (SEQ ID NO:40).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 6F8 es:

GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTC

AGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACA

CTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATA

TATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCGGTGGCAGTGG

G T CAG GAACT GC T T T CACAC T GAGAAT CAG TAGAG T GGAGGC T GAGGAT G T GG

GTGTTTATTATTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTACACGTTCGGAGGGGGG

ACCAAGCTGGAAATAAAA

(SEQ ID NO:80).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 6F8 es:

Q V Q L K Q SG PE L V R PG A SV K ISC E A SGYTFTDYYVNW VKQRPGRGLEW IGK IG P

G SV S IY Y N E KFKDKAT L T A D K SSS TAYM Q LSG LTSED SAVY FC A SYYYGFAYW

GQG TLV TV SA

(SEQ ID NO: 19),conCDR1 de cadena pesada de 6F8: GYTFTDYYVN (SEQ ID NO:52)

CDR2 de cadena pesada de 6F8: KIGPGSVSIYYNEKFKD (SEQ ID NO:62)

CDR3 de cadena pesada de 6F8: YYYGFAY (SEQ ID NO:68).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 6F8 es:

CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGATAT CC T GC GAGGC T T C T GGC TACACCTT CAC T GAC TAT TAT GTAAAC T

GGGTGAAGCAGAGGCCTGGACGGGGCCTTGAGTGGATTGGAAAGATTGGTCCT

G GAAG TGTTAGTATTTAC T AC AAT GAGAAG T T CAAG GAC AAG G C C AC AC T GAC

TGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCGGCCTGACATCTG

AGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGTTATTACTACGGTTTTGCTTACTGG

GGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

(SEQ ID NO 91).

h. SECUENCIAS DE 8C8:

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 8C8 es:

D IV M T Q A A P S V P V T P G E S V S IS C R SSK SL L H SN G N T Y L Y W FL Q R PG Q SPQ L L I

YRM SN LA SG V PD R FG G SG SG T A FTL R ISR V E A ED V G V Y Y C M Q HLEYPY TFGGG

T K L E IK

(SEQ ID NON),conCDR1 de cadena ligera de 8C8: RSSKSLLHSNGNTYLY (SEQ ID NO:25)

CDR2 de cadena ligera de 8C8: RMSNLAS (SEQ ID NO:33)

CDR3 de cadena ligera de 8C8: MQHLEYPYT (SEQ ID NO:40).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 8C8 es:

GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTC

AG TATCCATCTCCTG CAG G T C TAG TAAGAG T C T C C T G CATAG TAAT G G CAACA

CTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATA

TATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCGGTGGCAGTGG

G T CAG GAAC T G C T T T CACAC T GAGAAT CAG TAGAG T G GAG G C T GAG GAT G T G G

GTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTACACGTTCGGAGGGGGG

AC CAAG C T G GAAATAAAA

(SEQ ID NO:81).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 8C8 es:

QVQLKQSGAELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYVNWVKQRPGQGLEWIGK IG P

E S V SIY Y SE KFKAKAT L TADKSS S TAYMQLSS L T S E DSAVYFCASYYYGFAYW

GQGTLVTVSA

CDR1 de cadena pesada de 8C8: GYTFTDYYVN (SEQ ID NO:52)

CDR2 de cadena pesada de 8C8: KIGPESVSIYYSEKFKA (SEQ ID NO:63)

CDR3 de cadena pesada de 8C8: YYYGFAY (SEQ ID NO:68).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 8C8 es:

CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGATAT CC T GCAAGGC T T C T GGC TACACCTT CAC T GAC TAT TATGTAAACT

GGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAAAGATTGGTCCT

GAAAGT GT TAGTAT T TATTACAGT GAGAAGT T CAAGGC CAAGGC CACAC T GAC

T G C AGAC AAAT C C T C C AG C AC AG C C T AC AT G C AAC T C AG C AG C C T GAC AT C T G

AGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGTTATTACTACGGGTTTGCTTACTGG

GGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

(SEQ ID NO:92).

i. SECUENCIAS DE 8H8:

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 8H8 es:

Q AW TQESA LTTSPGETVTLTCRSSSGAVTTGNFANWVQEKPDHLFTGLIGGT

NNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKL

TVL

(SEQ ID NO: 10),

con la CDR1 de cadena ligera de 8H8: RSSSGAVTTGNFAN (SEQ ID NO:29)

CDR2 de cadena ligera de 8H8: GTNNRAP (SEQ ID NO:37)

CDR3 de cadena ligera de 8H8: ALWYSNHWV (SEQ ID NO:44).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 8H8 es:

CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGT

CACACTCACTTGTCGCTCAAGTTCTGGGGCTGTTACAACTGGTAACTTTGCCA

AC T G G G T C CAAGAAAAACCAGATCAT T TAT T CAC TGGTCTAATAGGTGGTACC

AACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGA

CAAG GCTGCCCT CAC C AT C AC AG G G G CAC AGAC T GAG GAT GAG G C AAT AT AT T

TCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTG

ACTGTCCTA

(SEQ ID NO:82).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 8H8 es:

EVQLLETGGGLVQPGGSRGLSCEGSGFTFSGFWMSWVRQTPGKTLEWIGDINS

DGSAINYAPSIKDRFTIFRDNDKNTLYLQMNNVRSEDTATYFCVRYDDYGYFD

VWGTGTTVTVSS

(SEQ ID NO:21),

con la CDR1 de cadena pesada de 8H8: GFTFSGFWMS (SEQ ID NO:53)

CDR2 de cadena pesada de 8H8: DINSDGSAINYAPSIKD (SEQ ID NO: 64)

CDR3 de cadena pesada de 8H8: YDDYGYFDV (SEQ ID NO:72).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 8H8 es:

GAAGTGCAGCTGTTGGAGACTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCGGGGGGGTCACG

GGGACTCTCTTGTGAAGGCTCAGGGTTCACTTTTAGTGGCTTCTGGATGAGCT

G G G T T C GACAGACAC C T G G GAAGACC C T GGAG T GGAT T GGAGACAT TAAT T C T

GAT G G C AG T GCAAT AAAC TAC G C AC C AT C C AT AAAG GAT C G AT T C AC T AT C T T

C AGAGAC AAT GAC AAGAAC AC CCTGTACCTG CAGAT GAACAAT GTGCGATCGG

AGGAC AC AG C C AC G T AT TTCTGTGT G AGAT AT GAT GAT TAC GGGTACTTCGAT

GTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

(SEQ ID NO:93).

j. SECUENCIAS de 9A5:

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 9A5 es:

D W M T Q T P L T L S V T IG Q S A S IS C K SSQSLLDSDGKTYLNW LLQRPGQSPKRLI

YLV SK LD SGVPDRFTG SGSG TD FTLK ISRVEA EDLGV YY CW QGTHFPFTFGSG

T K L E IK

(SEQ ID NO: 11), con

CDR1 de cadena ligera de 9A5: KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:30)

CDR2 de cadena ligera de 9A5: LVSKLDS (SEQ ID NO:38)

CDR3 de cadena ligera de 9A5: WQGTHFPFT (SEQ ID NO:45).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 9A5 es:

GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAGTC

AGCCT CCAT C T C T T GCAAGT CAAGT CAGAGCCT C T TAGATAG T GAT GGAAAGA

CATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATC

TATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGATT T CACAC T GAAAATCAGCAGAGT GGAGGC TGAGGAT T T GG

GAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGG

ACAAAG T T G GAAATAAAA

(SEQ ID NO:83).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 9A5 es:

HVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASG Y T F T S Y G L IWVKQRTGQGLEWIGE IY P

RSGNTYYNEKFKGK A T L TA D ISSSTA Y M ELR SLTSED SA V Y FC A SSSPHGDYW

GQGTTLTVSS

(SEQ ID NO:22), con

CDR1 de cadena pesada de 9A5: GYTFTSYGLI (SEQ ID NO:54)

CDR2 de cadena pesada de 9A5: EIYPRSGNTYYNEKFKG (SEQ ID NO:65)

CDR3 de cadena pesada de 9A5: SSPHGDY (SEQ ID NO:73).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 9A5 es:

CACGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGTTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTATGGTTTAATCT

GGGT GAAGCAGAGAAC TGGACAGGGCCT T GAG TGGATT GGAGAGATT TAT C C T

AGAAGT GGTAATAC T TAC TACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGC CACACT GAC

TGCAGACATATCCTCCAGCACAGCGTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTG

AGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGTTCCTCTCCTCACGGGGACTACTGG

G G C CAAGGCAC CAC T C T CACAG T C T C C T C A

(SEQ ID NO:94).

k. SECUENCIAS de 10G9:

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 10G9 es:

Q A W T Q E SA L T T SPG E T V T L T C RSSTGA.VTTSNYANW VQEKPDHLFTGLIGGT

NNRAPG V PA R FSG SLIG D K A A LTITG A Q TED EA IY FC ALWYSNHWVFGGGTKL

TVL

(SEQ ID NO: 12),

con la CDR1 de cadena ligera de 10G9: RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:31)

CDR2 de cadena ligera de 10G9: GTNNRAP (SEQ ID NO:37)

CDR3 de cadena ligera de 10G9: ALWYSNHWV (SEQ ID NO:44).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 10G9 es:

CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGT

CACAC T CAC TTGTCGCTCAAG TAC TGGGGCTGTTACAAC TAGTAACTAT GC CA

AC T G G G T C CAAGAAAAACCAGATCAT T TAT T CAC TGGTCTAATAGGTGGTACC

AACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGA

CAAG GCTGCCCT CAC C AT C AC AG G G G C AC AG AC T GAG GAT GAG G C AAT AT AT T

TCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTG

ACTGTCCTA

(SEQ ID NO:84).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 10G9 es:

EVQ LLETGG GLV QPG GSRG LSCEGSGFTFSDFW M SW VRQTPGKTLEWIGD IN S

D GSA V N Y A PSIK D Q FTIFRD ND KRTLHLQM IN VRSEDTATY FCV RYDDYGYFD

VWGTGTTVTVSS

(SEO ID NO:23),

con la CDR1 de cadena pesada de 10G9: GFTFSDFWMS (SEQ ID NO:55)

CDR2 de cadena pesada de 10G9: DINSDGSAVNYAPSIKD (SEQ ID NO:66)

CDR3 de cadena pesada de 10G9: YDDYGYFDV (SEQ ID NO:72).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 10G9 es:

GAAGTGCAGCTGTTGGAGACTGGAGGAGGCTTAGTGCAACCTGGGGGGTCACG

GGGACTCTCTTGTGAAGGCTCAGGGTTCACTTTTAGTGACTTCTGGATGAGCT

GGGTTCGACAGACACC T GGGAAGAC C C TGGAGTGGATT GGAGACATTAATT C T

GAT GGCAGT GCAG T TAACTACGCACCAT CCATAAAGGAT CAATT CAC TAT C T T

CAGAGACAATGACAAGAGGACCCTGCACCTGCAGATGAT CAAT GTTCGATCGG

AG GACACAG C CAC GTATTTCTGTGTGAGATATGAT GAT TACGGG TAC T T C GAT

GTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

(SEQ ID NO:95).

l. SECUENCIAS DE 6A

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 6A es:

D V LM TQ TPLSLPV SLG D Q A SISC R SSQ SIV H SN G N T Y L E W YLQKPGQSPKLLI

YK V SN R FSG VPD RFSG SG SG TD FTLRISRV EA ED LG V Y Y C FQ G SH V PLTFGAG

TKLELK

(SEQ ID NO:96),

con la CDR1 de cadena ligera de 6A: RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:24)

CDR2 de cadena ligera 6A: KVSNRFS (SEQ ID NO:32)

CDR3 de cadena ligera 6A: FQGSHVPLT (SEQ ID NO:157).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 6A es:

GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCA

AGCCTCCATCTCTTGCAGAT C TAG T CAGAGTAT T GTACATAGTAATGGAAACA

CCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATC

TACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T CAG GAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT C T G G

GAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGG

ACCAAGCTGGAGCTGAAA

(SEQ ID NO: 120).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 6A es:

EVQ LQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGC ID P

ENGDTEYASKFQDK A TITTD TSSN TA Y LQ LSSLTSED TA V Y Y C TTYVGFAYWG

QGTLVTVST

(SEQ ID NO: 108),

con la CDR1 de cadena pesada de 6A: DDYMH (SEQ ID NO:162)

CDR2 de cadena pesada 6A: CIDPENGDTEYASKFQD (SEQ ID NO: 170)

CDR3 de cadena pesada 6A: YVGFAY (SEQ ID NO:182).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 6A es:

GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGT

CAAGT T GT CC T GCACAGC T TCTGGCTT TAACAT TAAAGACGAC TATAT GCAC T

GGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGCATTGATCCT

GAGAAT GGT GAT AC T GAATATGCCT C GAAAT T CCAGGACAAGGC CAC TATAAC

AACAGACACAT C C T C C AAC AC AG CCTACCTGCAGCT C AG C AG C C T GAC AT C T G

AGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTACATACGTTGGATTTGCTTACTGGGGC

CAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTACA

(SEQ ID NO: 133).

m. SECUENCIAS DE 28A

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 28A es:

D W M T Q T P L T L S IP IG Q P A S IS C K SSQ SL L D SD G K T Y L N W L LQ R PG Q SPK R L I

YL V S E L D S G V PD R FT G SG SG T D FT L K ISR V E A E D L G V Y Y C W Q G T H FPFT FGSG

T K L E IK

(SEQ ID NO:97),

con la CDR1 de cadena ligera de 28A: KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:30)

CDR2 de cadena ligera 28A: LVSELDS (SEQ ID NO:153)

CDR3 de cadena ligera 28A: WQGTHFPFT (SEQ ID NO:45).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 28A es:

GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGATTCCCATTGGACAACC

AGCCTCCATCTCTTGTAAGT CAAGT CAGAGCC T C T TAGATAGT GAT GGAAAGA

CATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTCATC

TATCTGGTGTCTGAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGG

AT CAGGGACAGATT T CACAC T GAAAATCAGCAGAGT GGAGGC TGAAGATT T GG

GAGTTTATTATTGTTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGG

ACAAAGTTGGAAATAAAA

(SEQ ID NO: 121).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 28A es:

QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFIS Y G IT WVKQRTGQGLEWIGE IH P

RSGNTYYNENFKDRASLTADKSSSTAYM EVRSLTSEDSAVYFCARGGPGDYWG

QGTTLTVSS

(SEQ ID NO: 109),

con la CDR1 de cadena pesada de 28A: SYGIT (SEQ ID NO:163)

CDR2 de cadena pesada 28A: EIHPRSGNTYYNENFKD (SEQ ID NO:171)

CDR3 de cadena pesada 28A: GGPGDY (SEQ ID NO:183).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 28A es:

CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCATAAGCTATGGTATAACCT

GGGT GAAGCAGAGAAC TGGACAGGGCCT T GAG TGGATT GGAGAGATT CAT C C T

AGAAGT GGTAAT AC T TAC TACAAT GAGAAT T T CAAGGACAGGGC C T CAC T GAC

T G CAGACAAAT C C T C CAG CACAG C G TACAT G GAG G T C C G CAG C C T GACAT C T G

AGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGGGGTGGGCCGGGGGACTACTGGGGC

CAAGGCAC CAC T C T CACAG TCTCCTCA

(SEQ ID NO: 134).

n. SECUENCIAS DE 63A

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 63A es:

D W M T Q T P L T L S V T IG Q P A S IS C K SSQSLLDSDGKTYLNW LLQRPGQSPKRLI

YLV SK LD SGVPDRFTG SGSG TD FTLK ISRVEA EDLGV YY CW Q GTHFPFTFGSG

T K L E IK

(SEQ ID NO:98),

con la CDR1 de cadena ligera de 63A: KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:30)

CDR2 de cadena ligera 63A: LVSKLDS (SEQ ID NO:38)

CDR3 de cadena ligera 63A: WQGTHFPFT (SEQ ID NO:45).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 63A es:

GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACC

AGC C T C CAT C T C T TGCAAGT CAAGT CAGAGCCT C T TAGATAGT GAT GGAAAGA

CATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATC

TATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T GAAAAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT T T G G

GAGTTTATTATTGTTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGG

ACAAAGTTGGAAATAAAA

(SEQ ID NO: 122).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 63A es:

Q V Q LQ Q SG A ELA RPG A SV K LSC K A SG Y TFTS Y G IS W VKQRTGQGLEWIGQ IY P

RS DN TYYNE RFKGKATL TA D K SSS TAYMAL R S L T S E D SAVY FCARE GGPDYW G

Q G T T LT V SS

(SEQ ID NO: 110),

con la CDR1 de cadena pesada de 63A: SYGIS (SEQ ID NO:164)

CDR2 de cadena pesada 63A: QIYPRSDNTYYNERFKGK (SEQ ID NO: 172)

CDR3 de cadena pesada 63A: EGGPDY (SEQ ID NO: 184).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 63A es:

CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTATGGTATAAGCT

G G G T GAAG CAGAGAAC T G GACAG G G C C T T GAG T G GAT T G GACAGAT T TAT C C T

AGAAGT GACAAT AC T TAC TACAAT GAGAGGTT CAAGGGCAAGGC CACAC T GAC

T G CAGACAAAT C C T C CAG CACAG C G TACAT GGCGCTCCG CAG C C T GACAT C T G

AGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGAGGGGGGTCCCGACTACTGGGGC

CAAGGCAC CAC T C T CACAG TCTCCTCA

(SEQ ID NO: 135).

0. SECUENCIAS DE 71A

1. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 71A es:

D V LM TQ TPLSLPV SLG D Q A SISC R SSQ SIV H SN G N T Y LE W YLQKPGQSPKLLI

YK V SN RFSG V PD RFSG SGSG TDFTLKISRV EA EDLG VY YCFQ G SH V PLTFGAG

TKLELK

(SEQ ID NO:99),

con la CDR1 de cadena ligera de 71A: RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:24)

CDR2 de cadena ligera 71A: KVSNRFS (SEQ ID NO:32)

CDR3 de cadena ligera 71A: FQGSHVPLT (SEQ ID NO:157).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 71A es:

GACGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCA

AGCCTCCATCTCTTGCAGAT C TAG T CAGAGTAT T GTACATAGTAATGGAAACA

C C TAT T TAGAATGGTACC TACAGAAACCAGGC CAGT C T C CAAAGCTCCTGATC

TACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T CAAGAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT C T G G

GAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGG

ACCAAGCTGGAGCTGAAA

(SEQ ID NO: 123).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 71A es:

EVQLQQ SGA ELV RPG A SVK LSCTASG FNIK DDYMHWVKQRPEQGLEWIGC ID P

EN G D IEY A SR FQ G KATM TADTSSNTAYLQLTSLTSADTAVYYCTTYVGFGYWG

QGTLVTVSA

(SEQ ID NO: 111), con

CDR1 de cadena pesada 71A: DDYMH (SEQ ID NO:162)

CDR2 de cadena pesada 71A: CIDPENGDIEYASRFQG (SEQ ID NO: 173)

CDR3 de cadena pesada 71A: YVGFGY (SEQ ID NO: 185).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 71A es:

GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGT

CAAGT T GT CC T GCACAGC T TCTGGCTT TAACAT TAAAGACGAC TATAT GCAC T

GGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGCATTGATCCT

GAGAAT G G T GATAT T GAATAT G C C T C GAG G T T C CAG G G CAAG G C CAC TAT GAC

AG CAGACACATCC T CCAACACAGCCTACCTGCAGCTCACCAGCC T GACAT C T G

CGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTACATACGTTGGATTTGGTTACTGGGGC

CAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

(SEQ ID NO: 136).

p. SECUENCIAS DE 77A

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 77A es:

D V LM TQ SPLSLPV SLG D Q A SISC R SSQ N IV H SN G N TY LEW Y LK K PG Q SPK LLI

YK V SN RFSGVPDRFSG SGSG TDFTLKISRV EA EDLG M YY CFQ G SH V PLTFGAG

TKLELK

(SEQ ID NO: 100), con

CDR1 de cadena ligera 77A: RSSQNIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 146)

CDR2 de cadena ligera 77A: KVSNRFS (SEQ ID NO:32)

CDR3 de cadena ligera 77A: FQGSHVPLT (SEQ ID NO:157).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 77A es:

GATGTTTTGATGACCCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCA

AGCCTCCATCTCTTGCAGATC TAGT CAGAACATAGTACATAGTAAT GGTAACA

CCTATTTAGAATGGTACCTGAAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATC

TACAAAGTCTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T CAAGAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT C T G G

GAATGTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGAGCTGGG

ACCAAGCTGGAGCTGAAA

(SEQ ID NO: 124).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 77A es:

EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYM HW VKQRPEQGLEW IGCIDP

ENGDTEYASKFQGKATITADTSSNTVYLQLSSLTSEDTAVYYCTTYVGFGYW G

QGTLVTVSA

(SEQ ID NO:112), con

CDR1 de cadena pesada 77A: DDYMH (SEQ ID NO:162)

CDR2 de cadena pesada 77A: CIDPENGDTEYASKFQG (SEQ ID NO: 174)

CDR3 de cadena pesada 77A: YVGFGY (SEQ ID NO:185).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 77A es:

GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGT

CAAGT T GT CC T GCACAGC T TCTGGCTT TAACAT TAAAGACGAC TATAT GCAC T

GGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGTATTGATCCT

GAGAAT G G T GATAC T GAATAT G C C T C GAAG T T C CAG G G CAAG G C CAC TATAAC

AG CAGACACATCC T CCAACACAGTCTACCTGCAGCTCAGCAGCC T GACAT C T G

AGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTACATACGTTGGATTTGGTTACTGGGGC

CAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

(SEQIDNO: 137).

q. SECUENCIAS DE 80A

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 80A es:

D IVM TQSPSSLTVTAGEKVTM SCKSNQSLLNSGDQKNYLTWYQQKPGQPPKLL

IY W ASTRESG V PD R FT G SG SG TD FT LT ISSV Q A E D L A IY Y C QND YSY PLTFGA

GTKLELK

(SEQ ID NO: 101), con

CDR1 de cadena ligera 80A: KSNQSLLNSGDQKNYLT (SEQ ID NO: 147)

CDR2 de cadena ligera 80A: WASTRES (SEQ ID NO:154)

CDR3 de cadena ligera 80A: QNDYSYPLT (SEQ ID NO:158).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 80A es:

GAC AT T G T GAT GAC AC AG TCTCCATCCTCCCT GAC T G T GAC AG C AG GAGAGAA

G G T CAC TAT GAG C T G CAAG T C CAATCAGAGT C T GT TAAACAGT GGAGATCAAA

AGAAC TAC T T GAC C TGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGC CT CC TAAAC TAT T G

ATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAG

T GGATC T GGAACAGATT T CAC T C T CACCAT CAGCAGTGT GCAGGCTGAAGACC

T G G CAAT TTATTACTGT CAGAAT GAT T AT AG T TAT C CAC T CAC GTTCGGTGCT

GGGACCAAGCTGGAGCTGAAA

(SEQIDNO: 125).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 80A es:

QVQLKQSGAELVRPGASVKLSCRASGYTFTD F Y IN WVKQRPGQGLEWIAR IY P

GSDETYYNEKFKDKVTL TAEKSS S TAYMQLSS L T S E DSAVYFCALWFFDVWGT

GTTVTVSS

(SEQ ID NO:113), con

CDR1 de cadena pesada 80A: DFYIN (SEQ ID NO:165)

CDR2 de cadena pesada 80A: RIYPGSDETYYNEKFKD (SEQ ID NO: 175)

CDR3 de cadena pesada 80A: WFFDV (SEQ ID NO:186).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 80A es:

CAGGTCCAACTGAAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGCTGTCCTGCAGGGCTTCTGGCTACACTTTCACTGACTTCTACATAAACT

GGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGCAAGGATTTATCCT

G GAAGT GAT GAGAC T TAC TACAAT GAGAAGT T TAAGGACAAGGT CACAC T GAC

T G CAGAAAAAT C C T C CAG CAC T G C C TACAT G CAG C T CAG CAG C C T GACAT C T G

AGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCCCTCTGGTTCTTCGATGTCTGGGGCACA

GGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

(SEQ ID NO: 138).

r. SECUENCIAS DE 82B

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 82B es:

DWMTQTPLTLSVTIGQSASISCKSSQSLLDSDGNTYLNWLLQRPGQSPKRLI

YLVSELDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPFTFGSG

TKLEIK

(SEQ ID NO: 102), con

CDR1 de cadena ligera de 82B: KSSQSLLDSDGNTYLN (SEQ ID NO: 148)

CDR2 de cadena ligera de 82B: LVSELDS (SEQ ID NO:153)

CDR3 de cadena ligera de 82B: WQGTHFPFT (SEQ ID NO:45).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 82B es:

GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACTATTGGACAATC

AGCCTCCATCTCTTGCAAG T CAAG T CAGAGC C T C C TAGATAG T GAT GGAAACA

CATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATC

TATTTGGTGTCTGAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T GAAAAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT T T G G

GAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGG

ACAAAGTTGGAAATAAAA

(SEQ ID NO: 126).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 82B es:

QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTS D G IT WVKQRTGQGLEWIGQ IH P

RSGNTYYNGKFKGKATLTADRSSSTTYM ELRSLTSEDSAVYFCAKTGTGDYWG

QGTTLTVSS

(SEQ ID NO:114), con

CDR1 de cadena pesada de 82B: SDGIT (SEQ ID NO:166)

CDR2 de cadena pesada de 82B: QIHPRSGNTYYNGKFKG (SEQ ID NO: 176)

CDR3 de cadena pesada de 82B: TGTGDY (SEQ ID NO:187).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 82B es:

CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGTTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACACCTTCACAAGCGATGGTATTACCT

GGGT GAAGCAGAGAAC TGGACAGGGCCT T GAG TGGATT GGACAGATT CAT C C T

AGAAG T G G TAATAC C TAC TACAAT G G GAAG T T CAAG G G CAAG G C CACAC T GAC

T G CAGACAGATCC T CCAGCACAACG TACAT GGAACT CC GCAGCC T GACAT C T G

AGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAAAACTGGGACGGGGGACTACTGGGGC

CAAG G CAC CAC T C T CACAG TCTCCTCA

(SEQ ID NO: 139).

s. SECUENCIAS DE 83B

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 83B es:

EIQMTQSPSSMSASLGDRITITCQATQDIVKNLNWYQQKPGKPPSFLIYYATE

LAEGVPSRFSGSGSGSDYSLTISNLESEDFADYYCLQFYEFPYTFGGGTKLEI

K

(SEQ ID NO: 103), con

CDR1 de cadena ligera de 83B: QATQDIVKNLN (SEQ ID NO:149)

CDR2 de cadena ligera de 83B: YATELAE (SEQ ID NO:155)

CDR3 de cadena ligera de 83B: LQFYEFPYT (SEQ ID NO:159).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 83B es:

GAAATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTATGTCTGCATCTCTGGGAGACAG

AATAAC CAT CAC T T G C CAG G CAAC T CAAGACAT T G T TAAGAATT TAAACT GGT

AT CAG CAGAAACCAGGGAAACCCCCTTCATTCCTGATCTATTATGCAAC T GAA

CTGGCAGAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGTCAGACTA

TTCTCTGACAATCAGCAACCTGGAGTCTGAAGATTTTGCAGACTATTACTGTC

TACAGTTTTATGAATTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATA

AAA

(SEQ ID NO: 127).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 83B es:

E V Q L Q Q S G P E L V K P G A S V K M S C K A S G Y T F T DYNMHW V KQ SHG KSLEW IGY I N P

NNGGTSYNQKFKDKATL TVNKS S S TAFME L R S LAS E DSAVYYCARSDWEDCWG

Q G T T L T V S S

(SEQ ID NO:115), con

CDR1 de cadena pesada de 83B: DYNMH (SEQ ID NO:167)

CDR2 de cadena pesada de 83B: YINPNNGGTSYNQKFKD (SEQ ID NO: 177)

CDR3 de cadena pesada de 83B: SDWEDC (SEQ ID NO: 188).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 83B es:

GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGAT GT CC T GCAAGGC T T C T GGATACACAT T CAC T GAC TACAACAT GCAC T

G G G T GAAG CAGAG C CAT G GAAAGAG C C T T GAG T G GAT T G GATATAT TAAC C C T

AACAAT GGTGGTAC T AG C TAC AAC C AGAAG T T CAAGGACAAGGC CACAT T GAC

TGTAAACAAGTCCTCCAGCACAGCCTTCATGGAGCTCCGCAGCCTGGCATCGG

AGGATTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGGTCTGACTGGGAAGACTGCTGGGGC

CAAGGCAC CAC T C T CACAG TCTCCTCA

(SEQ ID NO: 140).

t. SECUENCIAS DE 92A

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 92A es:

Q I V L T Q S P A I M S A S L G E E I T L ICSASSSVSYMHWY Q Q K S G T S P K L L IYRTSNL

A S G V P S R F S G S G S G T F Y S L T IS S V E A E D A A D Y Y C HQWSSWTFG GG TQ LEIK

(SEQ ID NO: 104), con

CDR1 de cadena ligera 92A: SASSSVSYMH (SEQ ID NO:150)

CDR2 de cadena ligera 92A: RTSNLAS (SEQ ID NO:156)

CDR3 de cadena ligera 92A: HQWSSWT (SEQ ID NO:160).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 92A es:

CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAGGA

GAT CAC C C TAAT T T G CAG T G C CAG C T C GAG T G TAAG T TACAT G CAC T G G TAC C

AGCAGAAGTCAGGCACTTCTCCCAAACTCTTGATTTATCGCACATCCAACCTG

GCTTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTTTTATTC

T C T TACAAT CAG CAG T G T G GAG G C T GAAGAT G C T G C C GAT TAT TAC T G C CAT C

AGTGGAGTAGTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCCAGCTGGAAATCAAA

(SEQ ID NO: 128).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 92A es:

D V Q LQ E SG PG LV K FSQ SL SL TC SV T G Y SIT SGYYWNWIRQFPGNKLEWMGY I R

HDGSNNYNPSLKNR ISITR D T SK N Q FFLK L N SV IT ED T A T Y Y C V R EIYDGSSG

YFDVWGTGTTVTVSS

(SEQ ID NO:116), con

CDR1 de cadena pesada 92A: SGYYWN (SEQ ID NO: 168)

CDR2 de cadena pesada 92A: YIRHDGSNNYNPSLKN (SEQ ID NO: 178)

CDR3 de cadena pesada 92A: EIYDGSSGYFDVWGT (SEQ ID NO: 189).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 92A es:

GATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAATTTTCTCAGTCTCT

GTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATTACTGGA

AC T G GAT C C G G CAG T T T C CAG GAAACAAAC T G GAAT G GAT G G G C TACATAAGA

CAC GAT G G TAG CAATAACTACAACCCGTCTCT CAAAAATCGAAT C T CCAT CAC

TCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGATTACTG

AG GACACAG C CACATAT TAC T G T G TAAGAGAGATCTATGATGGTTCCTCCGGG

TACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

(SEQID N O :141).

u. SECUENCIAS DE 93B

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 93B es:

DIVM TQSPSSLTVTAGEKVTM SCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLL

IY WASTRESGVPDRFTG SGSG TD FTLTISN V QPEDLA VY YCQ N D Y S F P F T FGS

GTELEMK

(SEQ ID NO: 105), con

CDR1 de cadena ligera de 93B: KSSQSLLNSGNQKNYLT (SEQ ID NO:151)

CDR2 de cadena ligera de 93B: WASTRES (SEQ ID NO:154)

CDR3 de cadena ligera de 93B: QNDYSFPFT (SEQ ID NO:161).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 93B es:

GACAT T G T GAT GACACAG TCTCCATCCTCCCT GAC T G T GACAG CAG GAGAGAA

G G T CAC TAT GAG C T G CAAGT CCAGT CAGAGT C T GT TAAACAGT GGAAATCAAA

AGAATTAC T T GAC C T GGTAC CAGCAGAAACCAGGACAGC C T CC TAAAC T GT T G

ATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAG

T GGATC T GGAACAGATT T CAC T C T CACCAT TAGCAATG T GCAGCCT GAAGACC

TGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTTTCCATTCACGTTCGGCTCG

G G GACAGAG T T G GAAAT GAAA

(SEQID N O : 129).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 93B es:

QVQLKQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYY IN WVKQRPGQGLEWIAR I Y P

GNGNTDYNEKFKDK A T L TA E K SST T A Y IQ L SSL T SED SA V Y FC C L WYFDVWGT

GTTVTVSS

(SEQ ID NO:117), con

CDR1 de cadena pesada de 93B: DYYIN (SEQ ID NO:169)

CDR2 de cadena pesada de 93B: RIYPGNGNTDYNEKFKD (SEQ ID NO: 179)

CDR3 de cadena pesada de 93B: WYFDV (SEQ ID NO:190).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 93B es:

CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACTTTCACTGACTACTATATAAACT

GGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGCAAGGATTTATCCT

G GAAATGGTAATAC T GAC TACAAT GAGAAGT T CAAGGACAAGGC CACAC T GAC

T G CAGAAAAAT C C T C C AC C AC T G C C T AC AT AC AAC T C AG C AG T C T GAC AT C T G

AGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTTGCCTCTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACA

GGAACCACGGTCACCGTCTCCTCA

(SEQ ID NO: 142).

v. SECUENCIAS DE 99B

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 99B es:

D W M T Q T P L T L S V T IG Q P A S IS C KSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLI

YLVSK LDSG VPD RFTG SG SG TD FTLK ISR V EA ED LG IY Y C WQGTHFPFTFGSG

T K L E IK

(SEQ ID NO: 106), con

CDR1 de cadena ligera de 99B: KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO:30)

CDR2 de cadena ligera de 99B: LVSKLDS (SEQ ID NO:38)

CDR3 de cadena ligera de 99B: WQGTHFPFT (SEQ ID NO:45).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 99B es:

GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACC

AGC C T C CAT C T C T TGCAAGT CAAGT CAGAGCCT C T TAGATAGT GAT GGAAAGA

CATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATC

TATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T GAAAAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT T T G G

GAATTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGG

ACAAAGTTGGAAATAAAA

(SEQ ID NO: 130).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 99B es:

QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTS D G IT WLKQRTGQGLEWIGQ IH P

RSGNTYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCAKTGTGDYWG

QGTTLTVSS

(SEQ ID NO:118), con

CDR1 de cadena pesada de 99B: SDGIT (SEQ ID NO:166)

CDR2 de cadena pesada de 99B: QIHPRSGNTYYNEKFKG (SEQ ID NO: 180)

CDR3 de cadena pesada de 99B: TGTGDY (SEQ ID NO:187).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 99B es:

CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACACCTTCACAAGCGACGGTATAACCT

GGCTGAAACAGAGAACTGGACAGGGCCT T GAG TGGATT GGACAGATT CAT C C T

AGAAG T G G TAATAC C TAC TACAAT GAGAAG T T CAAG G G CAAG G C CACAC T GAC

TGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCGTACATGGAACTCCGCAGCCTGACATCTG

AGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAAAACTGGGACGGGGGACTACTGGGGC

CAAG G CAC CAC T C T CACAG TCTCCTCA

(SEQ ID NO: 143).

w. SECUENCIAS DE 104B

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 104B es:

D W M T Q T P L T L S V T IG Q P A S IS C KSSLSLLDSD GK TYLN WLLQRPGQSPKRLI

YLVSK LDSG V P D R F T G S G S G TD F T LK IIR V E A E D L G IY Y C WQGTHFPFTFGSG

TKLEVK

(SEQ ID NO: 107), con

CDR1 de cadena ligera de 104B: KSSLSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO: 152)

CDR2 de cadena ligera de 104B: LVSKLDS (SEQ ID NO:38)

CDR3 de cadena ligera de 104B: WQGTHFPFT (SEQ ID NO:45).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 104B es:

GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACC

AGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCTGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGA

CATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATC

TATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGG

AT CAGGGACAGATT T CACAC T GAAAATCAT CAGAGT GGAGGC TGAGGATT T GG

GAATTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGG

ACAAAGTTGGAAGTAAAA

(SEQ ID NO: 131).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 104B es:

QVQLQQSGPELARPGASVKLSCKASGYTFTSYGISWVKQRTGQGLEWIGQIHP

RSGNTYYNE NFKGKAT L TAAK S S S TAY L E L R S L T S E D SAVY FCARE GGPDYW G

QGTTLTVSS

(SEQ ID NO: 119),

con

CDR1 de cadena pesada de 104B: SYGIS (SEQ ID NO:164)

CDR2 de cadena pesada de 104B: QIHPRSGNTYYNENFKG (SEQ ID NO:181)

CDR3 de cadena pesada de 104B: EGGPDY (SEQ ID NO:184).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 104B es:

CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGCCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCCTCAGT

GAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTATGGTATAAGCT

G G G T GAAG CAAAGAAC T G GACAG G G C C T T GAG T G GAT T G GACAGAT T CAT C C T

AGAAGT GGTAATAC T TAC TACAATGAGAAC T T CAAGGGCAAGGC CACACT GAC

TGCAGCCAAATCCTCCAGCACAGCGTACCTGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTG

AGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGAGGGGGGTCCCGACTACTGGGGC

CAAGGCAC CAC T C T CACAG TCTCCTCA

(SEQ ID NO: 144).

x. SECUENCIAS DE 105A

i. Cadena ligera

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de 105A es:

D V L M T Q T PL SL PV SL G D Q A SISC R S S Q S IV H S N G N T Y L E WYLQKPGQSPKLLI

YK V SN R FSG VPD RFSG SGSG TDFTLKISRV EA EDLG VY YCFQ G SH V PL T FGAG

TKLELK

(SEQ ID NO:99),

con

CDR1 de cadena ligera 105A: RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:24)

CDR2 de cadena ligera 105A: KVSNRFS (SEQ ID NO:32)

CDR3 de cadena ligera 105A: FQGSHVPLT (SEQ ID NO:157).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera de 105A es:

GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCA

AGCCTCCATCTCTTGCAGAT C TAG T CAGAGTAT T GTACATAGTAATGGAAACA

C C TAT T TAGAATGGTACC TACAGAAACCAGGC CAGT C T C CAAAGCTCCTGATC

TACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T CAAGAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT C T G G

GAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGG

ACCAAGCTGGAGCTGAAA

(SEQ ID NO: 132).

ii. Cadena pesada

La secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de 105A es:

EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGC I D P

ENG DIEY ASR FQ G KATMTADTSSNTAYLQLTSLTSADTAVYYCTTYVGFGYWG

QGTLVTVSA

(SEQ ID NO: 111),

con

CDR1 de cadena pesada 105A: DDYMH (SEQ ID NO:162)

CDR2 de cadena pesada 105A: CIDPENGDIEYASRFQG (SEQ ID NO: 173)

CDR3 de cadena pesada 105A: YVGFGY (SEQ ID NO:185).

Una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada de 105A es:

GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGT

CAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTTAACAT TAAAGACGAC TATAT GCAC T

GGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGCATTGATCCT

GAGAAT GG T GAT AT T GAAT AT GC C T C GAG G T T C CAGG GCAAGGC CAC T AT GAC

AG CAGACACAT C C T C CAACACAG C C TAC C T G CAG C T CAC CAG C C T GACAT C T G

CGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTACATACGTTGGATTTGGTTACTGGGGC

CAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

(SEQ ID NO: 145).

2. Anticuerpos anti Siglec-15 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos

Se divulgan moléculas de unión a Siglec-15, incluyendo anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a uno o más polipéptidos Siglec-15 o proteínas de fusión, o fragmentos o variantes de los mismos. La molécula de unión de la presente invención es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a SIGLEC-15. En particular, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a SIGLEC-15, en donde el anticuerpo comprende las tres CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) seleccionadas del grupo que consiste en:

i. SYWIS (SEQ ID NO:208; HCDR1); DIYSGSDTTHYAEKFQG (SEQ ID NO:374; HCDR2); WWDYGSSYDYFDY (SEQ ID NO:71; HCDR3),

ii. SYWIT (SEQ ID NO:204; HCDR1); DIYSGSDTMHYAEKFQG (SEQ ID NO:205; HCDR2); WWDYGSSYDYFD (SEQ ID NO:71; HCDR3);

iii. SYWIT (SEQ ID NO:204; HCDR1); DIYSGSDTTHYAEKFQG (SEQ ID NO:374; HCDR2); WWDYGSSYDYFD (SEQ ID NO:71; HCDR3); y

y un conjunto de tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) seleccionadas del grupo que consiste en

i. KASQDINVYLS (SEQ ID NO: 198; LCDR1); RANRLTS (SEQ ID NO:202; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3).

ii. KASQDINSYLS (SEQ ID NO:28; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPY (SEQ ID NO:43; LCDR3);

iii. KASQDINTYLS (SEQ ID NO:196; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3);

iv. KASQDINVYL (SEQ ID NO:198; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3); y

v. KASQDIQSYLS (SEQ ID NO:200; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3).

Los anticuerpos divulgados en el presente documento son anticuerpos monoclonales, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a un epítopo presente en un polipéptido Siglec-15, o fragmento o fusión del mismo, en particular, se unen específicamente a S iGl EC-15. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un epítopo conformacional. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un epítopo lineal. Un epítopo lineal puede tener 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o más aminoácidos continuos de longitud. El epítopo puede incluir uno o más elementos no aminoacídicos, modificaciones postraduccionales o una combinación de los mismos. Los ejemplos de modificaciones postraduccionales incluyen, pero sin limitación, glucosilación, fosforilación, acetilación, citrulinación y ubiquitinación. Por ejemplo, los anticuerpos pueden unirse a un epítopo que está formado, al menos en parte, por uno o más grupos de azúcar.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede unir a un epítopo que está presente en un polipéptido Siglec-15 endógeno, o un polipéptido Siglec-15 recombinante, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une al dominio extracelular, o un fragmento del mismo, o un epítopo formado a partir del mismo de Siglec-15. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo bloqueador de función que reduce o evita que Siglec-15 se una a uno o más de sus ligandos, reduce la señalización intracelular modulada por Siglec-15 o una combinación de los mismos.

Como se ha analizado anteriormente, Siglec-15 sialila las glucoproteínas y reconoce preferentemente la estructura Neu5Aca2-6GalNAca-. Los Ejemplos experimentales a continuación ilustran que Siglec-15 se une a la proteína 4C que contiene repeticiones rica en leucina (LRRC4C) (también conocida como ligando Netrina-GI y NGL-1), que puede depender o ser independiente de una estructura Neu5Aca2-6GalNAca-. Las secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos para LRRC4C se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo,

M LN KM T L H PQ Q IM IG PR FN R A L FD PLL W L L A L Q L L W A G L V R A Q T CPSV C SC

S N Q F S K V IC V R K N L R E V P D G IS T N T R L L N L H E N Q IQ IIK V N S F K H L R H L E IL Q

LSRN H IR TIEIG A FN G LA N LN T LE L FD N R LT T IPN G A FV Y L SK L K E L W L RN N P

IE S IP S Y A F N R IP S L R R L D L G E L K R L S Y IS E G A F E G L S N L R Y L N L A M C N L R E I

PN LT PLIK LD ELD LSGN HLSAIRPG SFQ GLM H LQ KLW M IQSQ IQ VIER NA FD N

LQSLVEINLAHNNLTLLPHDLFTPLHHLERIHLHHNPWNCNCDILWLSWWIKD

MAPSNTACCARCNTPPNLKGRYIGELDQNYFTCYAPVIVEPPADLNVTEGMAA

ELKCRASTSLTSVSWITPNGTVMTHGAYKVRIAVLSDGTLNFTNVTVQDTGMY

TCMVSNSVGNTTASATLNVTAATTTPFSYFSTVTVETMEPSQDEARTTDNNVG

P T P W D W E T T N V T T S L T P Q S T R S T E K T F T IP V T D IN S G IP G ID E V M K T T K II I

GCFVAITLMAAVMLVIFYKMRKQHHRQNHHAPTRTVEIINVDDEITGDTPMES

H LPM PA IE H EH LNH YN SYK SPFNH TTTV NTIN SIH SSVH EPLLIR M N SKD NV Q

ETQI (SEQ ID NO: 192), UniProtKB - Q9HCJ2 LRC4C_HUMANA).

Siglec-15 también puede unirse a un contrarreceptor (S15-CR) en células inmunitarias tales como linfocitos T.

Por lo tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo monoclonal Siglec-15 que bloqueador de la función (antagonista) o un fragmento de unión a antígeno del mismo reduce, inhibe o previene la interacción entre Siglec-15 y un ligando de la misma, tal como una glucoproteína que tiene la estructura Neu5Aca2-6GalNAca-, LRRC4C o un contrarreceptor de Siglec-15.

En algunas realizaciones, la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo a Siglec-15 puede aumentar la activación inmunitaria, reducir la supresión inmunitaria o una combinación de los mismos. Por ejemplo, en realizaciones particulares, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une al dominio tipo V similar a Ig o al dominio tipo C2 similar a Ig de Siglec-15. En algunas realizaciones, el epítopo incluye el sitio de unión a ácido siálico de Siglec-15 (por ejemplo, el epítopo incluye el resto 143 de SEQ ID NO: 1).

En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a parte o a la totalidad del mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 5G12. El epítopo puede ser un epítopo lineal o un epítopo conformacional. En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene la misma especificidad de epítopo que el anticuerpo monoclonal 5G12. Esto se puede lograr produciendo un anticuerpo recombinante que contenga el parátopo del anticuerpo monoclonal 5G12. En algunas realizaciones, la molécula de unión a Siglec-15 incluye la totalidad de la región variable de cadena ligera, la totalidad de la región variable de cadena pesada o una combinación de las mismas de cualquiera de los anticuerpos anti Siglec-15 humana de ratón 5G12.

Las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera, CDR2 de cadena ligera, CDR3 de cadena ligera en donde la CDR1 de cadena ligera, la CDR2 de cadena ligera de varios de los anticuerpos divulgados en el presente documento se exponen a continuación, incluyendo las de un anticuerpo de la presente invención 5G12:

LCDR1 LCDR2 LCDR3

SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:

1B2 24 32 y 39

1C3 25 33 y 40

1H3 26 34 y 41

1C12 24 32 y 39

3H10 27 35 y 42

5G12 28 36 y 43

(continuación)

LCDR1 LCDR2 LCDR3

SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO

6F8 25 33 y 40

8C8 25 33 y 40

8H8 29 37 y 44

9A5 30 38 y 45

10G9 31 37 y 44

#6 24 32 y 157

#28 30 153 y 45

#63 30 38 y 45

#71 24 32 y 157

#77 146 32 y 157

#80 147 154 y 158

#82 148 153 y 45

#83 149 155 y 159

#92 150 156 y 160

#93 151 154 y 161

#99 30 38 y 45

#104 152 38 y 45; o

#105 24 32 y 157

Las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de cadena pesada, CDR2 de cadena pesada y CDR3 de cadena pesada, en donde la CDR1 de cadena pesada, la CDR2 de cadena pesada y la CDR3 de cadena pesada de varios de los anticuerpos divulgados en el presente documento se exponen a continuación, incluyendo las de un anticuerpo de la presente invención 5G12:

HCDR1 HCDR2 HCDR3

SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO

1B2 46 56 y 67;

1C3 47 57 y 68;

1H3 48 58 y 69;

1C12 49 59 y 67;

3H10 50 60 y 70;

5G12 51 61 y 71;

6F8 52 62 y 68;

8C8 52 63 y 68;

8H8 53 64 y 72;

9A5 54 65 y 73;

10G9 55 66 y 72;

#6 162 170 y 182;

#28 163 171 y 183;

#63 164 172 y 184;

#71 162 173 y 185;

#77 162 174 y 185;

#80 165 175 y 186;

#82 166 176 y 187;

#83 167 177 y 188;

#92 168 178 y 189;

#93 169 179 y 190;

#99 166 180 y 187;

#104 164 181 y 184 o

#105 162 173 y 185.

El anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede incluir una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada variable y/o una cadena ligera variable que es al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable y/o la cadena ligera del anticuerpo producido por los clones 5G12 anteriores, y que exhibe una unión inmunoespecífica a Siglec-15 humana.

Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 divulgado o fragmento de unión a antígeno del mismo puede incluir una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, o una variante de la misma que comprende al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7, y que exhibe una unión inmunoespecífica a Siglec-15.

Adicionalmente, o como alternativa, las moléculas de unión a Siglec-15 divulgadas pueden incluir una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, o una variante de la misma que comprende al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 18, y que exhibe una unión inmunoespecífica a Siglec-15.

3. Composiciones de anticuerpo

La molécula de unión a Siglec-15 proporcionada es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos incluyen inmunoglobulina completa (es decir, un anticuerpo intacto) de cualquier clase, fragmentos de la misma y proteínas sintéticas que contienen al menos el dominio variable de unión a antígeno de un anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo contiene tanto una cadena ligera de anticuerpo, así como al menos el dominio variable de una cadena pesada de anticuerpo. En otras realizaciones, tales moléculas pueden incluir además una o más de las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada (especialmente, las regiones CH1 y bisagra, o las regiones CH1, bisagra y CH2, o las regiones CH1, bisagra, CH2 y CH3). El anticuerpo se puede seleccionar de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE y cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En algunas realizaciones, el dominio constante es un dominio constante de fijación del complemento donde se desea que el anticuerpo presente actividad citotóxica, y la clase es típicamente IgG1. En otras realizaciones, cuando dicha actividad citotóxica no es deseable, el dominio constante puede ser de la clase IgG2 o IgG4. El anticuerpo puede incluir secuencias de más de una clase o isotipo, y la selección de dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas está dentro de los conocimientos habituales en la técnica.

Los dominios variables difieren en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad normalmente no está distribuida uniformemente en todos los dominios variables de anticuerpos. Típicamente, se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables, tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones estructurales (FR). Cada uno de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden cuatro regiones FR, que adoptan en gran parte una configuración de lámina beta, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de, la estructura de lámina beta. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas muy cerca de las regiones F<r>y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos.

También se divulgan fragmentos de anticuerpos que tienen bioactividad. Los fragmentos, ya sea que estén unidos a otras secuencias o no, incluyen inserciones, deleciones, sustituciones u otras modificaciones seleccionadas de regiones particulares o restos de aminoácidos específicos, siempre que la actividad del fragmento no se altere o se deteriore significativamente en comparación con el anticuerpo no modificado o fragmento de anticuerpo, siempre que en general el fragmento de unión al antígeno se una específicamente a SIGLEC-15, y en donde el fragmento comprende las tres CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) seleccionadas del grupo que consiste en:

i. SYWIS (SEQ ID NO:208; HCDR1); DIYSGSDTTHYAEKFQG (SEQ ID NO:374; HCDR2); WWDYGSSYDYFDY (SEQ ID NO:71; HCDR3),

ii. SYWIT (SEQ ID NO:204; HCDR1); DIYSGSDTMHYAEKFQG (SEQ ID NO:205; HCDR2); WWDYGSSYDYFD (SEQ ID NO:71; HCDR3);

iii. SYWIT (SEQ ID NO:204; HCDR1); DIYSGSDTTHYAEKFQG (SEQ ID NO:374; HCDR2); WWDYGSSYDYFD (SEQ ID NO:71; HCDR3); y

y un conjunto de tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) seleccionadas del grupo que consiste en

i. KASQDINVYLS (SEQ ID NO: 198; LCDR1); RANRLTS (SEQ ID NO:202; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3).

ii. KASQDINSYLS (SEQ ID NO:28; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPY (SEQ ID NO:43; LCDR3);

iii. KASQDINTYLS (SEQ ID NO:196; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3);

iv. KASQDINVYL (SEQ ID NO:198; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3); y

v. KASQDIQSYLS (SEQ ID NO:200; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3).

También se pueden adaptar técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios específicos de una proteína antigénica de la presente divulgación. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para la producción de anticuerpos monocatenarios. Se puede crear un anticuerpo monocatenario fusionando los dominios variables de las cadenas pesada y ligera usando un enlazador peptídico corto, reconstituyendo así un sitio de unión a antígeno en una única molécula. Se han desarrollado fragmentos variables de anticuerpos monocatenarios (scFv) en los que el extremo C de un dominio variable está unido al extremo N del otro dominio variable mediante un péptido o enlazador de 15 a 25 aminoácidos sin alterar significativamente la unión a antígeno o especificidad de la unión. El enlazador se elige para permitir que la cadena pesada y la cadena ligera se unan en su orientación conformacional adecuada.

Se pueden genomanipular fragmentos variables monocatenarios divalentes (di-scFv) uniendo dos scFv. Esto se puede hacer produciendo una sola cadena peptídica con dos regiones VH y dos VL, produciendo scFv en tándem. Los scFv también se pueden diseñar con péptidos enlazadores que son demasiado cortos para que las dos regiones variables se plieguen juntas (aproximadamente cinco aminoácidos), lo que obliga a los scFv a dimerizarse. Este tipo se conoce como diacuerpos. Se ha demostrado que los diacuerpos tienen constantes de disociación hasta 40 veces más bajas que scFv correspondientes, lo que significa que tienen una afinidad mucho mayor por su diana. Los enlazadores aún más cortos (uno o dos aminoácidos) conducen a la formación de trímeros (triacuerpos o tricuerpos). También se han producido tetracuerpos. Exhiben una afinidad aún mayor por sus dianas que los diacuerpos.

Un anticuerpo monoclonal se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales dentro de la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se producen de manera natural que pueden estar presentes en un pequeño subconjunto de las moléculas de anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos procedentes de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas son idénticas a u homólogas a secuencias correspondientes en anticuerpos procedentes de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad antagonista deseada y tengan las CDR requeridas.

a. Anticuerpos quiméricos y humanizados

El anticuerpo monoclonal proporcionado puede ser un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Se conocen en la técnica los métodos para producir anticuerpos quiméricos. Véanse, por ejemplo, Morrison, 1985, Science 229:1202; Oiet al.,1986, BioTechniques 4:214; Gillieset al.,1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; y las Patentes de EE.UU. N.° 6.311.415, 5.807.715, 4.816.567 y 4.816.397. Se pueden producir anticuerpos quiméricos que incluyen una o más CDR de una especie no humana y regiones estructurales de una molécula de inmunoglobulina humana usando una diversidad de técnicas conocidas en la técnica incluyendo, por ejemplo, injerto de CDR (documento EP 239.400; Publicación Internacional N.° WO 91/09967; y Patentes de EE.UU. N.° 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), revestimiento o acondicionamiento de la superficie (documentos EP 592.106; EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnickaet al.,1994, Protein Engineering 7:805; y Roguskaet al.,1994, Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa 91:969) y barajado de cadenas (Patente de EE.UU. N.° 5.565.332).

Las moléculas divulgadas pueden ser anticuerpos humanos o humanizados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Muchos anticuerpos no humanos (por ejemplo, los procedentes de ratones, ratas o conejos) son naturalmente antigénicos en los seres humanos y, por lo tanto, pueden dar lugar a respuestas inmunitarias no deseadas cuando se administran a seres humanos. Por lo tanto, el uso de anticuerpos humanos o humanizados en los métodos sirve para disminuir la posibilidad de que un anticuerpo administrado a un ser humano provoque una respuesta inmunitaria no deseada.

Se pueden emplear animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión de cadena pesada (J(H)) del anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y de la línea germinal, da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en dichos ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno.

Opcionalmente, los anticuerpos se generan en otras especies y se "humanizan" para su administración en seres humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) que contienen una secuencia mínima procedente de una inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una región determinante de complementariedad (CDR) del anticuerpo receptor se reemplazan por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tales como ratón, rata o conejo con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunas ocasiones, los restos estructurales de Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes restos no humanos. Los anticuerpos humanizados también pueden contener restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de la CDR o estructurales importadas. En general, el anticuerpo humanizado contendrá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado contendrá también óptimamente al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana.

En la técnica se conocen métodos para humanizar anticuerpos no humanos, véanse, por ejemplo, Patentes Europeas N.° EP 239.400, EP 592.106 y EP 519.596; Publicaciones Internacionales N.° WO 91/09967 y WO 93/17105; Patentes de EE.UU. N.° 5.225.539, 5.530.101, 5.565.332, 5.585.089, 5.766.886 y 6.407.213; y Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnickaet al.,1994, Protein Engineering 7(6):805-814; Roguskaet al.,1994, PNAS 91:969-973; Tanet al.,2002, J. Immunol. 169:1119-1125; Caldaset al.,2000, Protein Eng. 13:353-360; Moreaet al.,2000, Methods 20:267-79; Bacaet al.,1997, J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Roguskaet al.,1996, Protein Eng.

9:895-904; Coutoet al.,1995, Cancer Res. 55 (23 Sup):5973s-5977s; Coutoet al.,1995, Cancer Res. 55:1717-22; Sandhu, 1994, Gene 150:409-10; Pedersenet al.,1994, J. Mol. Biol. 235:959-973; Joneset al.,1986, Nature 321:522-525; Reichmannet al.,1988, Nature 332:323-329; y Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596).

Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácido introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoácido no humanos se citan a menudo como restos "importados", que se toman normalmente de un dominio variable "importado". Las técnicas de humanización de anticuerpos generalmente implican el uso de tecnología de ADN recombinante para manipular la secuencia de ADN que codifica una o más cadenas polipeptídicas de una molécula de anticuerpo. La humanización se puede realizar básicamente sustituyendo CDR de roedor o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, una forma humanizada de un anticuerpo no humano (o un fragmento del mismo) es un anticuerpo o fragmento quimérico, en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos restos de la CDR y posiblemente algunos restos de la FR están sustituidos por restos procedentes de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a usar para producir los anticuerpos humanizados puede ser muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se explora frente a la toda la biblioteca de secuencias conocidas de dominio variable humano. La secuencia humana que es la más cercana a la del roedor se acepta a continuación como la región estructural (FR) humana para el anticuerpo humanizado. Otro método usa una región estructural particular procedente de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligera o pesada. Se puede usar la misma estructura para diferentes anticuerpos humanizados.

Además, es importante que los anticuerpos se humanicen conservando una afinidad alta por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, se pueden preparar anticuerpos humanizados mediante un proceso de análisis de las secuencias precursoras y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas están comúnmente disponibles y son familiares para aquellos expertos en la técnica. Se dispone de programas informáticos que ilustran y exponen posibles estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias seleccionadas de la inmunoglobulina candidata. La inspección de estas presentaciones permite analizar el papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De este modo, los restos de FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias consenso e importadas de tal manera que se logra la característica deseada del anticuerpo, de tal manera que se consigue una afinidad aumentada por el antígeno (o antígenos) diana. En general, los restos de la CDR están directamente y más sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión al antígeno.

Un derivado de anticuerpo humano, humanizado o quimérico puede incluir sustancialmente todos los de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables en los que todas o esencialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donante) y todas o esencialmente todas las regiones estructurales son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Tales anticuerpos también pueden incluir al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Los dominios constantes de tales anticuerpos se pueden seleccionar con respecto a la función propuesta del anticuerpo, en particular la función efectora que puede ser necesaria. En algunas realizaciones, los dominios constantes de dichos anticuerpos son o pueden incluir dominios IgA, IgD, IgE, IgG o IgM humanos. En una realización específica, se usan dominios constantes de IgG humana, especialmente de los isotipos IgG1 e IgG3, cuando el derivado de anticuerpo humanizado está destinado a un uso terapéutico y son necesarias funciones efectoras del anticuerpo tal como la actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En realizaciones alternativas, los isotipos IgG2 e IgG4 se usan utilizarse cuando el anticuerpo está destinado a fines terapéuticos y no se requieren las funciones efectoras del anticuerpo. Dominios constantes Fc que incluyen una o más modificaciones de aminoácidos que alteran las funciones efectoras de los anticuerpos, como las divulgadas en las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2005/0037000 y 2005/0064514.

No es necesario que las regiones estructurales y las CDR de un anticuerpo humanizado correspondan exactamente a las secuencias precursoras, por ejemplo, la CDR donante o la región estructural consenso pueden mutagenizarse mediante la sustitución, inserción o deleción de al menos un resto para que la CDR o resto estructural de ese sitio no corresponda a la secuencia consenso o al anticuerpo donante. En algunas realizaciones, tales mutaciones no son extensas. Normalmente, al menos el 75 % de los restos de los anticuerpos humanizados corresponderán con los de la región estructural (FR) precursora y las secuencias CDR, más a menudo el 90 %, o más del 95 %. Los anticuerpos humanizados pueden ser producidos usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, el injerto de CDR (Patente Europea N.° EP 239400; Publicación Internacional N.° WO 91/09967; y Patentes de EE.UU. N.° 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), revestimiento o acondicionamiento de la superficie (Patentes Europeas N.° EP 592.106 y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnickaet al.,1994, Protein Engineering 7(6):805-814; y Roguskaet al.,1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973), barajado de cadenas (Patente de EE.UU. N.° 5.565.332), y las técnicas divulgadas en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 6.407.213, 5.766.886, 5.585.089, Publicación Internacional N.° WO 9317105, Tanet al.,2002, J. Immunol. 169:1119-25, Caldaset al.,2000, Protein Eng. 13:353-60, Moreaet al.,2000, Methods 20:267-79, Bacaet al.,1997, J. Biol. Chem.

272:10678-84, Roguskaet al.,1996, Protein Eng. 9:895-904, Coutoet al.,1995, Cancer Res. 55 (23 Sup):5973s-5977s, Coutoet al.,1995, Cancer Res. 55:1717-22, Sandhu, 1994, Gene 150:409-10, Pedersenet al.,1994, J. Mol. Biol. 235:959-73, Joneset al.,1986, Nature 321: 522-525, Riechmannet al.,1988, Nature 332:323, y Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.

Con frecuencia, los restos estructurales de las regiones estructurales serán sustituidos por el resto correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, por ejemplo, mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones de la región estructural se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el modelado de las interacciones de la CDR y los restos estructurales para identificar los restos estructurales importantes para la unión al antígeno y la comparación de secuencias para identificar los restos estructurales poco habituales en posiciones particulares. (Véase, por ejemplo, Queenet al.,Patente de EE.UU. N.° 5.585.089; Publicaciones de EE.UU. N.° 2004/0049014 y 2003/0229208; Patentes de EE.UU. N.° 6.350.861; 6.180.370; 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; y 5.530.101 y Riechmannet al.,1988, Nature 332:323).

Se pueden usar derivados humanos, quiméricos o humanizados de los anticuerpos murinos anti Siglec-15 humana divulgados para métodosin vivoen seres humanos. Se pueden emplear ventajosamente anticuerpos murinos o anticuerpos de otras especies para muchos usos (por ejemplo, ensayos de detecciónin vitrooin situ,uso agudoin vivo, etc.).Tal anticuerpo humano o humanizado puede incluir sustituciones, deleciones o adiciones de restos de aminoácidos en una o más CDR no humanas. El derivado de anticuerpo humanizado puede tener sustancialmente la misma unión, una unión más fuerte o una unión más débil en comparación con un anticuerpo humanizado no derivado. En realizaciones específicas, uno, dos, tres, cuatro o cinco restos de aminoácidos de la CDR se han sustituidos, eliminado o añadido (es decir, se han mutado). Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de sujetos humanos.

Dichos anticuerpos humanos se pueden preparar mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica, incluidos métodos de presentación en fagos usando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana (véanse las Patentes de EE.UU. N.° 4.444.887 y 4.716.111; y Publicaciones Internacionales N.° WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741). Tales anticuerpos humanos se pueden producir usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana.

Por ejemplo, los complejos de genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada humanos pueden introducirse aleatoriamente o mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. Como alternativa, la región variable humana, la región constante y la región de diversidad pueden introducirse en células madre embrionarias de ratón además de los genes humanos de cadena pesada y ligera. Los genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada de ratón pueden volverse no funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de locus de inmunoglobulina humana mediante recombinación homóloga. En particular, la deleción homocigótica de la región J<h>impide la producción de anticuerpos endógena. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y se microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. A continuación, los ratones quiméricos se cruzan para producir una descendencia homocigota que expresa anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan mediante metodologías convencionales con un antígeno seleccionado, por ejemplo, la totalidad o una porción de un polipéptido. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno se pueden obtener de los ratones inmunizados y transgénicos usando tecnología de hibridoma convencional (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 5.916.771). Los transgenes de inmunoglobulina humana portados por los ratones transgénicos se transponen durante la diferenciación de los linfocitos B y experimentan posteriormente un cambio de clase y una mutación somática. Por lo tanto, usando tal técnica, es posible producir anticuerpos de IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véanse Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para un análisis detallado sobre esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y los protocolos para producir dichos anticuerpos, véanse, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales N.° WO 98/24893, WO 96/34096 y WO 96/33735; y las Patentes de EE.UU. N.° 5.413.923, 5.625.126, 5.633.425, 5.569.825, 5.661.016, 5.545.806, 5.814.318 y 5.939.598. Además, empresas tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) y Medarex (Princeton, NJ) pueden participar para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando una tecnología similar a la descrita anteriormente.

Las secuencias de ADN que codifican secuencias estructurales del aceptor humano incluyen, pero sin limitación, segmentos FR del segmento VH de la línea germinal humana VH1-18 y JH6 y el segmento VL de la línea germinal humana VK-A26 y JK4. En una realización específica, una o más de las CDR se insertan dentro de regiones estructurales usando técnicas de ADN recombinante rutinarias. Las regiones estructurales pueden ser regiones estructurales de origen natural o de consenso, y regiones estructurales humanas (véase, por ejemplo, Chothiaet al.,1998, "Structural Determinants In The Sequences Of Immunoglobulin Variable Domain", J. Mol. Biol. 278: 457-479 para una lista de regiones estructurales humanas).

i. 5G12 humanizado

Una realización proporciona un anticuerpo 5G12 humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

b. Anticuerpos monocatenarios

Las moléculas de unión a Siglec-15 pueden ser anticuerpos monocatenarios. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para la producción de anticuerpos monocatenarios. Se crea un anticuerpo monocatenario fusionando los dominios variables de las cadenas pesada y ligera usando un enlazador peptídico corto, reconstituyendo así un sitio de unión a antígeno en una única molécula. Se han desarrollado fragmentos variables de anticuerpos monocatenarios (scFv) en los que el extremo C de un dominio variable está unido al extremo N del otro dominio variable mediante un péptido o enlazador de 15 a 25 aminoácidos sin alterar significativamente la unión a antígeno o especificidad de la unión. El enlazador se elige para permitir que la cadena pesada y la cadena ligera se unan en su orientación conformacional adecuada. Estos Fv carecen de las regiones constantes (Fc) presentes en las cadenas pesada y ligera del anticuerpo nativo.

c. Anticuerpos monovalentes

También son adecuados métodosin vitropara preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente, fragmentos Fab, se puede realizar usando técnicas habituales conocidas en la técnica. Por ejemplo, la digestión se puede realizar usando papaína. La digestión con papaína de los anticuerpos típicamente produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos Fab, cada uno con un solo sitio de unión a antígeno y un fragmento Fc residual. El tratamiento con pepsina produce un fragmento, llamado fragmento F(ab')2, que tiene dos sitios de combinación de antígenos y aún es capaz de entrecruzar el antígeno.

Los fragmentos Fab producidos en la digestión del anticuerpo también contienen los dominios constantes de la cadena ligera y el primer dominio constante de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos restos en el extremo carboxi del dominio de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. El fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab' unidos mediante un puente disulfuro en la región bisagra. Fab'-SH es la denominación en el presente documento para Fab' en el que el uno o más restos de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

d. Conjugados o fusiones de fragmentos de anticuerpos

La función de direccionamiento del anticuerpo se puede usar terapéuticamente acoplando el anticuerpo o un fragmento del mismo con un agente terapéutico. Tal acoplamiento del anticuerpo o fragmento (por ejemplo, al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc)) con el agente terapéutico se puede lograr preparando un inmunoconjugado o elaborando una proteína de fusión, que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y el agente terapéutico.

Tal acoplamiento del anticuerpo o fragmento con el agente terapéutico se puede lograr elaborando un inmunoconjugado o elaborando una proteína de fusión, o uniendo el anticuerpo o fragmento a un ácido nucleico tal como un ARNip, que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y el agente terapéutico.

En algunas realizaciones, el anticuerpo se modifica para alterar su semivida. En algunas realizaciones, es deseable aumentar la semivida del anticuerpo para que esté presente en la circulación o en el sitio de tratamiento durante períodos de tiempo más prolongados. Por ejemplo, puede ser deseable mantener los valores del anticuerpo en la circulación o en el lugar a tratar durante períodos de tiempo prolongados. Los anticuerpos se pueden genomanipular con variantes de Fc que extienden la semivida, por ejemplo, usando la tecnología de prolongación de la semivida de anticuerpos Xtend™ (Xencor, Monrovia, CA). En otras realizaciones, la semivida del anticuerpo anti ADN disminuye para reducir los posibles efectos secundarios. Los conjugados divulgados se pueden usar para modificar una respuesta biológica dada. No ha de interpretarse que el resto terapéutico esté limitado a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto farmacológico puede ser una proteína o un polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina diftérica.

e. Anticuerpos monoespecíficos y multiespecíficos

En algunas realizaciones, los anticuerpos divulgados son monoespecíficos y se unen solo a Siglec-15. También se proporcionan derivados biespecíficos de tales anticuerpos, derivados triespecíficos de tales anticuerpos o anticuerpos derivados de mayor multiespecificidad, que exhiben especificidad para diferentes dianas del sistema inmunitario además de su especificidad para Siglec-15 humana. Por ejemplo, tales anticuerpos se pueden unir tanto a Siglec-15 humana como a un antígeno que es importante para dirigir el anticuerpo a un tipo de célula o tejido particular (por ejemplo, a un antígeno asociado con un antígeno de cáncer de un tumor que se está tratando). En otra realización, dicho anticuerpo multiespecífico se une a moléculas (receptores o ligandos) implicadas en las vías inmunomoduladoras alternativas, tales como B7-H1, PD-1, CTLA4, TIM3, TIM4, OX40, CD40, GITR, 4-1-BB, LIGHT o LAG3, para mejorar los efectos inmunomoduladores y combinar múltiples mecanismos de acción, tales como el bloqueo de ligandos, la activación de células inmunitarias y la focalización directa en tumores, en una molécula.

f. Derivados

También se divulga la producción y el uso de "derivados" de cualquiera de las moléculas de unión a Siglec-15 divulgadas, siempre que el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo sea uno que todavía se une específicamente a SIGLEC-15, en donde el anticuerpo comprende las tres CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) seleccionadas del grupo que consiste en:

i. SYWIS (SEQ ID NO:208; HCDR1); DIYSGSDTTHYAEKFQG (SEQ ID NO:374; HCDR2); WWDYGSSYDYFDY (SEQ ID NO:71; HCDR3),

ii. SYWIT (SEQ ID NO:204; HCDR1); DIYSGSDTMHYAEKFQG (SEQ ID NO:205; HCDR2); WWDYGSSYDYFD (SEQ ID NO:71; HCDR3);

iii. SYWIT (SEQ ID NO:204; HCDR1); DIYSGSDTTHYAEKFQG (SEQ ID NO:374; HCDR2); WWDYGSSYDYFD (SEQ ID NO:71; HCDR3); y

y un conjunto de tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) seleccionadas del grupo que consiste en

i. KASQDINVYLS (SEQ ID NO: 198; LCDR1); RANRLTS (SEQ ID NO:202; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3).

ii. KASQDINSYLS (SEQ ID NO:28; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPY (SEQ ID NO:43; LCDR3);

iii. KASQDINTYLS (SEQ ID NO: 196; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3);

iv. KASQDINVYL (SEQ ID NO: 198; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3); y

v. KASQDIQSYLS (SEQ ID NO:200; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43; LCDR3).

Una molécula de derivado, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, se puede modificar mediante modificaciones químicas usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, escisión química específica, acetilación, formulación, síntesis metabólica de tunicamicina,etc.El término derivado abarca modificaciones no aminoacídicas, por ejemplo, aminoácidos que pueden estar glucosilados (por ejemplo, tienen un contenido alterado de manosa, 2-N-acetilglucosamina, galactosa, fucosa, glucosa, ácido siálico, ácido 5-N-acetilneuramínico, ácido 5-glicolneuramínico,etc.),acetilados, pegilados, fosforilados, amidados, derivatizados por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unidos a un ligando celular u otra proteína,etc.En algunas realizaciones, las modificaciones de carbohidratos alteradas modulan uno o más de los siguientes: solubilización del anticuerpo, facilitación del transporte subcelular y secreción del anticuerpo, promoción del ensamblaje del anticuerpo, integridad conformacional y función efectora mediada por anticuerpos.

En una realización específica, las modificaciones de carbohidratos alteradas mejoran la función efectora mediada por anticuerpos en relación con el anticuerpo que carece de la modificación de carbohidratos. Las modificaciones de carbohidratos que conducen a una función efectora mediada por anticuerpos alterada se conocen bien en la técnica (por ejemplo, véanse Shields, R.L.et al.(2002) "Lack Of Fucose On Human IgG N Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity", J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740; Davies J.et al.(2001) "Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHo Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In ADCC Through Higher Affinity For FC Gamma RIII", Biotechnology & Bioengineering 74(4): 288-294). Los expertos en la técnica conocen métodos para alterar el contenido de carbohidratos, véanse, por ejemplo, Wallick, S.C.et al.(1988) "Glycosylation Of A VH Residue Of A Monoclonal Antibody Against Alpha (1— 6) Dextran Increases Its Affinity For Antigen", J. Exp. Med. 168(3): 1099-1109; Tao, M.H.et al.(1989) "Studies Of Aglycosylated Chimeric Mouse-Human IgG. Role Of Carbohydrate In The Structure And Effector Functions Mediated By The Human IgG Constant Region", J. Immunol. 143(8): 2595-2601; Routledge, E.G.et al.(1995) "The Effect Of Aglycosylation On The Immunogenicity Of A Humanized Therapeutic CD3 Monoclonal Antibody", Transplantation 60(8):847-53; Elliott, S.et al.(2003) "Enhancement Of Therapeutic ProteinIn VivoActivities Through Glycoengineering", Nature Biotechnol. 21:414-21; Shields, R.L.et al.(2002) "Lack Of Fucose On Human IgG N Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity", J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740).

Los anticuerpos divulgados se pueden modificar por medios recombinantes para aumentar una mayor eficacia del anticuerpo en la mediación de la función deseada. Por lo tanto, los anticuerpos se pueden modificar mediante sustituciones usando medios recombinantes. Típicamente, las sustituciones serán sustituciones conservadoras. Por ejemplo, al menos un aminoácido en la región constante del anticuerpo puede reemplazarse por un resto diferente. Véanse, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 5.624.821, la Pat. de EE.UU. N.° 6.194.551, la Solicitud N.° WO 9958572; y Angal,et al.,Mol. Immunol. 30:105-08 (1993). La modificación en aminoácidos incluye deleciones, adiciones, sustituciones de aminoácidos. En algunos casos, tales cambios se realizan para reducir las actividades no deseadas, por ejemplo, citotoxicidad dependiente del complemento. Con frecuencia, los anticuerpos se marcan uniendo, ya sea de manera covalente o no covalente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce una amplia diversidad de marcadores y técnicas de conjugación y se informan extensamente en la bibliografía científica y de patentes. Estos anticuerpos se pueden cribar para determinar su unión a polipéptidos Siglec-15, o fragmentos o fusiones de los mismos. Véase, por ejemplo, Antibody Engineering: A Practical Approach (Oxford University Press, 1996).

En algunas realizaciones, un derivado de anticuerpo poseerá una función similar o idéntica a la del anticuerpo precursor. En otra realización, un derivado de anticuerpo exhibirá una actividad alterada con respecto al anticuerpo precursor. Por ejemplo, un anticuerpo derivado (o fragmento del mismo) se puede unir a su epítopo más estrechamente o ser más resistente a la proteólisis que el anticuerpo precursor. Las sustituciones, adiciones o deleciones en los anticuerpos derivatizados pueden realizarse en la región Fc del anticuerpo y de este modo pueden servir para modificar la afinidad de unión del anticuerpo a uno o más FcyR. Se conocen en la técnica métodos para modificar anticuerpos con unión modificada a uno o más FcyR, véanse, por ejemplo, las Publicaciones PCT N.° WO 04/029207, WO 04/029092, WO 04/028564, WO 99/58572, WO 99/51642, WO 98/23289, WO 89/07142, WO 88/07089 y las Patentes de EE.UU. N.° 5.843.597 y 5.642.821.

En algunas realizaciones, los anticuerpos cuya región Fc se ha eliminado (por ejemplo, un Fab o F(ab)2, etc.) o se han modificado de manera que la molécula exhiba actividad de unión al receptor Fc (FcR) disminuida o nula, o exhiba actividades mejoradas de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En algunas realizaciones, los anticuerpos tienen afinidad alterada por un FcyR activador, por ejemplo, F<cy>RIIIA. Tales modificaciones también pueden tener una función efectora mediada por Fc alterada. Las modificaciones que afectan la función efectora mediada por Fc se conocen bien en la técnica (véanse las Patentes de EE.UU. N.° 6.194.551 y el documento WO 00/42072). En una realización particular, la modificación de la región Fc da como resultado un anticuerpo con una función efectora mediada por anticuerpos alterada, una unión alterada a otros receptores de Fc (por ejemplo, receptores de activación de Fc), una actividad alterada de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), una actividad alterada de unión de C1q, una actividad alterada de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), una actividad fagocítica o cualquier combinación de las mismas.

Se pueden usar anticuerpos derivatizados para alterar las semividas (por ejemplo, semividas séricas) de anticuerpos precursores en un mamífero, tal como un ser humano. Por ejemplo, dicha alteración puede dar como resultado una semivida superior a 15 días, superior a 20 días, superior a 25 días, superior a 30 días, superior a 35 días, superior a 40 días, superior a 45 días, superior a 2 meses, superior a 3 meses, superior a 4 meses o superior a 5 meses. El aumento de las semividas de los anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos en un mamífero, tal como un ser humano, da como resultado un valor sérico más alto de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en el mamífero y, por lo tanto, reduce la frecuencia de la administración de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos y/o reduce la concentración de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos a administrar. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos que tienen semividasin vivoaumentadas se pueden generar mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos o fragmentos de los mismos con semividasin vivoaumentadas modificando (por ejemplo, sustituyendo, eliminando o añadiendo) restos de aminoácidos identificados como implicados en la interacción entre el dominio Fc y el receptor FcRn. Los anticuerpos humanizados se pueden genomanipular para aumentar las semividas biológicas (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 6.277.375). Por ejemplo, se pueden genomanipular anticuerpos humanizados en el dominio Fc-bisagra para que tengan semividas séricas oin vivoaumentadas.

Se pueden generar anticuerpos o fragmentos de los mismos con un aumento de las semividasin vivouniendo a dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos a moléculas poliméricas tales como polietilenglicol (PEG) de alto peso molecular. El PEG se puede unir a dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con o sin un enlazador multifuncional ya sea mediante conjugación específica del sitio del PEG al extremo N o C de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos o mediante grupos épsilon-amino presentes en los restos de lisina. Se usará derivación de polímero lineal o ramificado que tiene como resultado una pérdida mínima de actividad biológica. El grado de conjugación se monitorizará estrechamente mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas para garantizar una conjugación adecuada de las moléculas de PEG a los anticuerpos. El PEG sin reaccionar se puede separar de los conjugados anticuerpo-PEG mediante, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño o de intercambio iónico.

Los anticuerpos también se pueden modificar mediante los métodos y agentes de acoplamiento descritos por Daviset al.(véase la Patente de<e>E.UU. N.° 4.179.337) con el fin de proporcionar composiciones que puedan inyectarse en el sistema circulatorio de los mamíferos sustancialmente sin respuesta inmunitaria.

Los restos estructurales de los anticuerpos humanizados se pueden modificar. Los restos en las regiones estructurales serán sustituidos por el resto correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, por ejemplo, mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones estructurales se pueden identificar mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el modelado de las interacciones de la CDR y los restos estructurales para identificar los restos estructurales importantes para la unión al antígeno y la comparación de secuencias para identificar los restos estructurales poco habituales en posiciones particulares. (Véanse, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 5.585.089; y Riechmann, L.et al.(1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy", Nature 332:323-327). Las moléculas de unión a Siglec-15 divulgadas pueden fusionarse de forma recombinante o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) con una molécula heteróloga (es decir, una molécula no relacionada). No es necesario que la fusión sea directa, puede producirse mediante secuencias enlazadoras.

En algunas realizaciones, tales moléculas heterólogas son polipéptidos que tienen al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos. Tales moléculas heterólogas pueden ser, como alternativa, enzimas, hormonas, receptores de la superficie celular, restos farmacológicos, tales como: reactivos de direccionamiento específicos de macrófagos (tales como la carboxilesterasa intracelular, hCE1 (Needham, L.A.et al.(2011) "Drug Targeting To Monocytes And Macrophages Using Esterase-Sensitive Chemical Motif', J. Pharmacol. Exp. Ther. DOI: 10.1124/jpet.111.183640), quitina y quitosano (Muzzarelli, R.A. (2010) "Chitins And Chitosans As Immunoadjuvants AndNon-Allergenic Drug Carriers", Mar Drugs 8(2):292-312), lipoproteína de baja densidad galactosilada (Wu, F.et al.(009) "Galactosylated LDL Nanoparticles: A Novel Targeting Delivery System To Deliver Antigen To Macrophages And Enhance Antigen Specific T Cell Responses", Molec. Pharm. 6(5):1506-1517), N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF), un quimioatrayente específico de macrófagos (Wan, L.et al.(2008) "Optimizing Size And Copy Number For PEG-Fmlf (N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine) Nanocarrier Uptake By Macrophages", Bioconjug. Chem. 19(1):28-38), proteína maleilada o manosilada, tal como albúmina maleilada (Anatelli, F.et al.(2006) "Macrophage-Targeted Photosensitizer Conjugate Delivered By Intratumoral Injection", Mol Pharm. 3(6):654-664; Bansal, P.et al.(1999) "MHC Class I-Restricted Presentation Of Maleylated Protein Binding To Scavenger Receptors", J. Immunol. 162(8):4430-4437); véase también Mukhopadhyay, A.et al.(2003) "Intracellular Delivery Of Drugs To Macrophages", Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.

84:183-209), toxinas (tales como abrina, ricina A, exotoxina dePseudomonas(es decir, PE-40), toxina diftérica, ricina, gelonina o proteína antivírica de hierba carmín), proteínas (tales como factor de necrosis tumoral, interferón (por ejemplo, interferón a, interferón p), factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento procedente de plaquetas, activador del plasminógeno tisular o un agente apoptótico (por ejemplo, factor de necrosis tumoral a, factor de necrosis tumoral p)), modificadores de la respuesta biológica (tales como, por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6")), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos ("GM-CSF"), factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF") o factor estimulante de colonias de macrófagos, ("M-CSF"), o factores de crecimiento (por ejemplo, hormona de crecimiento ("GH"))), citotoxinas (por ejemplo, un agente citostático o citocida, tal como paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos), antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, BiCNU® (carmustina; BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y c/s-diclorodiamina-platino (II) (D<d>P) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) o agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).

En otra realización, las moléculas se conjugan con un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpos como se describe por Segal en la Patente de EE.UU. N.° 4.676.980. Dichos anticuerpos heteroconjugados pueden unirse adicionalmente a haptenos (tales como fluoresceína, etc.) o a marcadores celulares (por ejemplo, 4-1-BB, B7-H1, PD-1, CD4, CD8, CD14, CD25, CD27, CD40, CD68, CD163, CTLA4, GITR, LAG-3, OX40, TIM3, TIM4, TLR2, LIGHT, etc.) o a citocinas (por ejemplo, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, TGF beta, IFNg, Flt3, BLys) o quimiocinas (por ejemplo, CCL21),etc.

La porción Fc de la proteína de fusión puede variarse por isotipo o subclase, puede ser quimérica o híbrida, y/o se puede modificar, por ejemplo, para mejorar las funciones efectoras, controlar de la semivida, la accesibilidad tisular, aumentar las características biofísicas, tales como la estabilidad, y mejorar la eficiencia de la producción (y menos costosa). En la técnica se conocen muchas modificaciones útiles en la construcción de proteínas de fusión descritas y métodos para prepararlas, véanse, por ejemplo, Mueller, J.P.et al.(1997) "Humanized Porcine VCAM-Specific Monoclonal Antibodies With Chimeric IgG2/G4 Constant Regions Block Human Leukocyte Binding To Porcine Endothelial Cells", Mol. Immun. 34(6):441-452, Swann, P.G. (2008) "Considerations For The Development Of Therapeutic Monoclonal Antibodies", Curr. Opin. Immun. 20:493-499 (2008), y Presta, L.G. (2008) "Molecular Engineering And Design Of Therapeutic Antibodies", Curr. Opin. Immun. 20:460-470. En algunas realizaciones, la región Fc es la región Fc de IgG1, IgG2 o IgG4 nativa. En algunas realizaciones, la región Fc es un híbrido, por ejemplo, una quimérica que consiste en regiones constantes Fc de IgG2/IgG4. Las modificaciones a la región Fc incluyen, pero sin limitación, IgG4 modificada para evitar la unión a receptores Fc gamma y el complemento, IgG1 modificada para mejorar la unión a uno o más receptores Fc gamma, IgG1 modificada para minimizar la función efectora (cambios de aminoácidos), IgG1 con glucano alterado/sin glucano (típicamente al cambiar el hospedador de expresión) e IgG1 con unión alterada dependiente del pH a FcRn. La región Fc puede incluir la totalidad de la región bisagra, o menos que la totalidad de la región bisagra.

El resultado terapéutico en pacientes tratados con rituximab (un anticuerpo monoclonal de IgG1 de ratón/humano quimérico contra CD20) para el linfoma no Hodgkin o la macroglobulinemia de Waldenstrom se correlacionó con la expresión individual de variantes alélicas de los receptores Fcy con distintas afinidades intrínsecas por el dominio Fc de la IgG1 humana. En particular, los pacientes con alelos de alta afinidad del receptor Fc activador de baja afinidad CD16A (FcyRIIIA) mostraron tasas de respuesta más altas y, en los casos de linfoma no Hodgkin, una mejor supervivencia libre de progresión. Por lo tanto, el dominio Fc de los anticuerpos y fragmentos divulgados puede contener una o más inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos que reducen la unión al receptor Fc inhibidor de baja afinidad CD32B (FcyRIIB) y conservar los niveles de unión de tipo natural a o mejorar la unión al receptor Fc activador de baja afinidad CD16A (FcyRIIIA).

Otra realización incluye híbridos de IgG2-4 y mutantes de IgG4 que tienen unión reducida a F<cy>R, lo que aumenta su semivida. Se describen híbridos de IgG2-4 y mutantes de IgG4 representativos en Angal, S.et al.(1993) "A Single Amino Acid Substitution Abolishes The Heterogeneity Of Chimeric Mouse/Human (Igg4) Antibody", Molec. Immunol.

30(1): 105-108; Mueller, J.P.et al.(1997) "Humanized Porcine VCAM-Specific Monoclonal Antibodies With Chimeric IgG2/G4 Constant Regions Block Human Leukocyte Binding To Porcine Endothelial Cells", Mol. Immun. 34(6):441-452; y la Patente de EE.UU. N.° 6.982.323. En algunas realizaciones, el dominio IgG1 y/o IgG2 está modificado; por ejemplo, Angal, S.et al.(1993) describen variantes de IgG1 e IgG2 en las que la serina 241 se reemplaza por prolina.

En algunas realizaciones, el dominio Fc de dichas moléculas contiene inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos que mejoran la unión a CD16A. En la técnica se conoce un gran número de sustituciones en el dominio Fc de la IgG1 humana que aumentan la unión a CD16A y reducen la unión a CD32B y se describen en Stavenhagen, J.B.et al.(2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor CellsIn VitroAnd Controls Tumor ExpansionIn VivoVia Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors", Cancer Res. 57(18):8882-8890. Las variantes de ejemplo de los dominios Fc de IgG1 humana con unión reducida a CD32B y/o aumento de la unión a CD16A contienen las sustituciones F243L, R929P, Y300L, V305I o P296L. Estas sustituciones de aminoácidos pueden estar presentes en un dominio Fc de IgG1 humana en cualquier combinación. En una realización, la variante del dominio Fc de IgG1 humana contiene una sustitución F243L, R929P y Y300L. En otra realización, la variante del dominio Fc de IgG1 humana contiene una sustitución F243L, R929P, Y300L, V305I y P296L. En otra realización, la variante del dominio Fc de IgG1 humana contiene una sustitución N297Q, ya que esta mutación anula la unión de FcR.

Las técnicas para conjugar dichos restos terapéuticos a anticuerpos se conocen bien; véanse, por ejemplo, Arnonet al.,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldet al.(eds.), 1985, págs. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstromet al.,"Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2.a Ed.), Robinsonet al.(eds.), 1987, págs. 623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A RevieW', en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraet al.(eds.), 1985, págs. 475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinet al.(eds.), 1985, págs. 303-16, Academic Press; y Thorpeet al.(1982) "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-158.

Cualquiera de las moléculas divulgadas se puede fusionar a secuencias marcadoras, tales como un péptido, para facilitar la purificación. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de marcador es un péptido de hexahistidina, el marcador de hemaglutinina "HA", que corresponde a un epítopo procedente de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson, I.A.et al.(1984) "The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protein", Cell, 37:767-778) y el marcador "flag" (Knappik, A.et al.(1994) "An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The Detection And Purification Of Recombinant Antibody Fragments", Biotechniques 17(4):754-761).

Las moléculas de unión a Siglec-15 divulgadas se pueden conjugar con un agente de diagnóstico o terapéutico, u otra molécula para la que se desea aumentar la semivida sérica. Los anticuerpos se pueden usar para diagnóstico(in vivo, in situoin vitro)para, por ejemplo, controlar el desarrollo o la progresión de una enfermedad, trastorno o infección como parte de un procedimiento de ensayo clínico para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento determinado o seleccionar pacientes con mayor probabilidad de responder a una terapia particular (tales como aquellos que expresan niveles altos de Siglec-15).

La detección se puede facilitar acoplando la molécula, tal como un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. La sustancia detectable se puede acoplar o conjugar ya sea directamente al polipéptido o indirectamente, a través de un intermedio (tal como, por ejemplo, un enlazador conocido en la técnica) usando técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 4.741.900 para iones metálicos que se pueden conjugar con anticuerpos para su uso como diagnóstico. Dicho diagnóstico y detección se puede lograr acoplando el anticuerpo a sustancias detectables que incluyen, pero sin limitación, diversas enzimas, enzimas que incluyen, pero sin limitación, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; complejos de grupos prostéticos tales como, pero sin limitación, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes tales como, pero sin limitación, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; material luminiscente tal como, pero sin limitación, luminol; materiales bioluminiscentes tales como, pero sin limitación, luciferasa, luciferina y aecuorina; material radiactivo tal como, pero sin limitación, bismuto (213Bi), carbono (14C), cromo (51Cr), cobalto (57Co), flúor (18F), gadolinio (153Gd, 159Gd), galio (68Ga, 67Ga), germanio (68Ge), holmio (166Ho), indio (115In, 113In, 112In, 111ln), yodo (131I, 125I, 123I, 121I), lantano (140La), lutecio (177Lu), manganeso (54Mn), molibdeno (99Mo), paladio (103Pd), fósforo (32P), praseodimio (142Pr), prometio (149Pm), renio (186Re, 188Re), rodio (105Rh), rutemio (97Ru), samario (153Sm), escandio (47Sc), selenio (75Se), estroncio (85Sr), azufre (35S), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), estaño (113Sn, 117Sn), tritio (3H), xenón (133Xe), iterbio (169Yb, 175Yb), itrio (90Y), cinc (65Zn); metales emisores de positrones usando diversas tomografías de emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Las moléculas divulgadas se pueden unir a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación del antígeno diana o de otras moléculas que son capaces de unirse al antígeno diana que se ha inmovilizado al soporte mediante unión a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno. Dichos soportes sólidos incluyen, pero sin limitación, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. También se divulgan moléculas de ácido nucleico (ADN o ARN) que codifican dichos anticuerpos, proteínas de fusión o fragmentos, así como moléculas vectoriales (tales como plásmidos) que son capaces de transmitir o replicar dichas moléculas de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios, bicatenarios, y pueden contener porciones tanto monocatenarias como bicatenarias.

3. Método de elaboración

Las moléculas de unión a Siglec-15 se pueden producir mediante cualquier método conocido en la técnica útil para la producción de polipéptidos, por ejemplo, síntesisin vitro,producción de ADN recombinante y similares. Los anticuerpos humanizados típicamente se producen mediante tecnología de ADN recombinante. Los anticuerpos se pueden producir usando tecnología de expresión de inmunoglobulinas recombinantes. La producción recombinante de moléculas de inmunoglobulina, incluidos anticuerpos humanizados, se describe en la Patente de EE.UU. N.° 4.816.397 (Bosset al.),Patentes de EE.UU. N.° 6.331.415 y 4.816.567 (ambas de Cabillyet al.),Patente del R.U. GB 2.188.638 (Winteret al.)y Patente del R.U. GB 2.209.757. También se pueden encontrar técnicas para la expresión recombinante de inmunoglobulinas, incluidas inmunoglobulinas humanizadas, en Goeddelet al.,Gene Expression Technology Methods in Enzymology Vol. 185 Academic Press (1991), and Borreback, Antibody Engineering, W. H. Freeman (1992). Se puede encontrar información adicional relativa a la generación, diseño y expresión de anticuerpos recombinantes en Mayforth, Designing Antibodies, Academic Press, San Diego (1993).

Un proceso de ejemplo para la producción de los anticuerpos quiméricos recombinantes puede incluir lo siguiente: a) construir, mediante métodos de biología molecular convencionales, un vector de expresión que codifica y expresa una cadena pesada de anticuerpo en la que las CDR y la región variable de un anticuerpo anti Siglec-15 se fusiona con una región Fc derivada de una inmunoglobulina humana, produciendo así un vector para la expresión de una cadena pesada de anticuerpo quimérico; b) construir, mediante métodos de biología molecular convencionales, un vector de expresión que codifica y expresa una cadena ligera de anticuerpo del anticuerpo monoclonal murino anti Siglec-15 humana, produciendo así un vector para la expresión de una cadena ligera de anticuerpo quimérico; c) transferir los vectores de expresión a una célula hospedadora mediante métodos de biología molecular convencionales para producir una célula hospedadora transfectada para la expresión de anticuerpos quiméricos; y d) cultivar la célula transfectada mediante técnicas de cultivo celular convencionales para producir anticuerpos quiméricos.

Un proceso de ejemplo para la producción de los anticuerpos humanizados recombinantes puede incluir lo siguiente: a) construir, mediante métodos de biología molecular convencionales, un vector de expresión que codifica y expresa una cadena pesada anti Siglec-15 humana en la que las CDR y una porción mínima de la región estructural de región variable que se requiere para conservar la especificidad de unión del anticuerpo donante se obtiene de las variantes humanizadas del uno o más anticuerpos anti Siglec-15 humana, y el resto del anticuerpo se obtiene de una inmunoglobulina humana, produciendo así un vector para la expresión de una cadena pesada de anticuerpo humanizado; b) construir, mediante métodos de biología molecular convencionales, un vector de expresión que codifica y expresa una cadena ligera de anticuerpo en la que las CDR y una porción mínima de la región estructural de región variable que se requieren para conservar la especificidad de unión del anticuerpo donante se obtienen de una inmunoglobulina no humana, tal como los anticuerpos murinos anti Siglec-15 humana divulgados, y el resto del anticuerpo se obtiene de una inmunoglobulina humana, produciendo así un vector para la expresión de una cadena ligera de anticuerpo humanizado; c) transferir los vectores de expresión a una célula hospedadora mediante métodos de biología molecular convencionales para producir una célula hospedadora transfectada para la expresión de anticuerpos humanizados; y d) cultivar la célula transfectada mediante técnicas de cultivo celular convencionales para producir anticuerpos humanizados.

Con respecto a cualquier método de ejemplo, las células hospedadoras se pueden transfectar conjuntamente con dichos vectores de expresión, que pueden contener diferentes marcadores seleccionables pero, con la excepción de las secuencias codificantes de cadena pesada y ligera, pueden ser idénticos. Este procedimiento proporciona la expresión equivalente de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Como alternativa, se puede usar un único vector que codifica los polipéptidos tanto de cadena pesada como ligera. Las secuencias de codificación de las cadenas pesada y ligera pueden incluir ADNc o ADN genómico o ambos. La célula huésped usada para expresar el anticuerpo recombinante puede ser una célula bacteriana tal comoEscherichia colio una célula eucariota (por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula HEK-293). La elección del vector de expresión depende de la elección de la célula hospedadora, y se puede seleccionar de modo que tenga la expresión deseada y las características reguladoras en la célula hospedadora seleccionada. Otras líneas celulares que se pueden usar incluyen, pero sin limitación, CHO-K1, NSO y PER.C6 (Crucell, Leiden, Países Bajos).

Cualquiera de los anticuerpos divulgados se puede usar para generar anticuerpos anti idiotipo usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, Greenspan, N.S.et al.(1989) "Idiotypes: Structure And Immunogenicity",<f>A<s>EB J. 7:437-444; y Nisinoff, A. (1991) "Idiotypes: Concepts And Applications", J. Immunol.

147(8):2429-2438).

C. Moléculas de unión a ligando de Siglec-15

También se divulgan moléculas que se unen a ligandos de Siglec-15, tales como proteínas Siglec-15, proteínas de fusión Siglec-15 y fragmentos y variantes de las mismas. La molécula de unión a ligando de Siglec-15 se puede unir a un ligando de Siglec-15 tal como una glucoproteína sialilada, LRRC4C, un contrarreceptor de Siglec-15, etc. En algunas ocasiones, la molécula de unión a ligando de Siglec-15 puede inducir la transducción de señales a través del ligando de Siglec-15. En algunas ocasiones, la molécula de unión a ligando de Siglec-15 bloquea o reduce de otro modo la interacción entre Siglec-15 y su ligando, sin inducir la transducción de señales a través de Siglec-15 o su ligando. Las moléculas de unión a ligando de Siglec-15 se pueden usar para modular la actividad de Siglec-15 como se analiza con más detalle a continuación y se ilustra en los Ejemplos, y se pueden usar para tratar terapéuticamente a un sujeto que lo necesite.

1. Polipéptidos Siglec-15

También se divulga una molécula de unión a ligando de Siglec-15 que es Siglec-15, o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, en algunos casos, las moléculas de unión a ligando de Siglec-15 incluyen un polipéptido al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % idéntico a la SEQ ID NO: 1 o 2, o un fragmento del mismo tal como el dominio extracelular, o un subdominio del mismo tal como el dominio IgV, el dominio IgC o la combinación de los mismos. En algunos casos, el polipéptido Siglec-15 es soluble o acelular. Por ejemplo, en algunos casos, la Siglec-15 carece de uno o más del dominio transmembrana, el dominio citoplasmático o la secuencia líder.

2. Proteínas de fusión Siglec-15

También se divulga una molécula de unión a ligando de Siglec-15 que es una proteína de fusión Siglec-15. Proteínas de fusión que contienen polipéptidos Siglec-15 acoplados a otros polipéptidos para formar la fusión. Los polipéptidos de fusión Siglec-15 pueden tener un primer compañero de fusión que comprende la totalidad o una parte de una proteína Siglec-15 fusionada (i) directamente a un segundo polipéptido u, (ii) opcionalmente, fusionada a una secuencia peptídica enlazadora que está fusionada al segundo polipéptido. Las proteínas de fusión contienen opcionalmente un dominio que funciona para dimerizar o multimerizar dos o más proteínas de fusión. En algunos casos, la proteína de fusión no se dimeriza ni se multimeriza. El dominio enlazador peptídico/polipeptídico puede ser un dominio separado o, como alternativa, puede estar contenido dentro de uno de los otros dominios (polipéptido Siglec-15 o segundo polipéptido) de la proteína de fusión. De manera similar, el dominio que funciona para dimerizar o multimerizar las proteínas de fusión puede ser un dominio separado o, como alternativa, puede estar contenido dentro de uno de los otros dominios (polipéptido Siglec-15, segundo polipéptido o dominio enlazador peptídico/polipeptídico) de la proteína de fusión. En algunas ocasiones, el dominio de dimerización/multimerización y el dominio enlazador peptídico/polipeptídico son los mismos.

Las proteínas de fusión divulgadas en el presente documento son de fórmula I:

N-R1-R2-R3-C

en donde "N" representa el extremo N de la proteína de fusión, "C" representa el extremo C de la proteína de fusión, "R1" es un polipéptido Siglec-15, "R2" es un dominio enlazador peptídico/polipeptídico opcional, y "R3" es un segundo polipéptido. Como alternativa, R3 puede ser el polipéptido Siglec-15 y Ri puede ser el segundo polipéptido.

Las proteínas de fusión se pueden dimerizar o multimerizar. La dimerización o multimerización puede producirse entre dos o más proteínas de fusión a través de dominios de dimerización o multimerización. Como alternativa, la dimerización o multimerización de proteínas de fusión puede producirse mediante reticulación química. Los dímeros o multímeros que se forman pueden ser homodiméricos/homomultiméricos o heterodiméricos/heteromultiméricos. Como se ha analizado anteriormente, en algunos casos, la proteína de fusión no se dimeriza ni se multimeriza.

En algunas ocasiones, el segundo polipéptido contiene uno o más dominios de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos correspondiente a las regiones bisagra, C<h>2 y/o C<h>3 de una cadena Cy1 de inmunoglobulina humana, las regiones bisagra, C<h>2 y/o C<h>3 de una cadena CY2a de inmunoglobulina murina, las regiones C<h>2 y/o C<h>3 de Cy1 de inmunoglobulina humana, etc.

La porción Fc de la proteína de fusión puede variarse por isotipo o subclase, puede ser quimérica o híbrida, y/o puede modificarse, por ejemplo, para mejorar las funciones efectoras, controlar de la semivida, la accesibilidad tisular, aumentar las características biofísicas, tales como la estabilidad, y mejorar la eficiencia de la producción (y menos costosa). En la técnica se conocen muchas modificaciones útiles en la construcción de proteínas de fusión descritas y métodos para prepararlas, véanse, por ejemplo, Mueller,et al.,Mol. Immun., 34(6):441-452 (1997), Swann,et al.,Cur. Opin. Immun., 20:493-499 (2008), y Presta, Cur. Opin. Immun. 20:460-470 (2008). En algunas realizaciones, la región Fc es la región Fc de IgG1, IgG2 o IgG4 nativa. En algunas realizaciones, la región Fc es un híbrido, por ejemplo, una quimérica que consiste en regiones constantes Fc de IgG2/IgG4. Las modificaciones a la región Fc incluyen, pero sin limitación, IgG4 modificada para evitar la unión a receptores Fc gamma y el complemento, IgG1 modificada para mejorar la unión a uno o más receptores Fc gamma, IgG1 modificada para minimizar la función efectora (cambios de aminoácidos), IgG1 con glucano alterado/sin glucano (típicamente al cambiar el hospedador de expresión) e IgG1 con unión alterada dependiente del pH a FcRn. La región Fc puede incluir la totalidad de la región bisagra, o menos que la totalidad de la región bisagra.

El resultado terapéutico en pacientes tratados con rituximab (un anticuerpo monoclonal de IgG1 de ratón/humano quimérico contra CD20) para el linfoma no Hodgkin o la macroglobulinemia de Waldenstrom se correlacionó con la expresión individual de variantes alélicas de los receptores F<cy>con distintas afinidades intrínsecas por el dominio Fc de la IgG1 humana. En particular, los pacientes con alelos de alta afinidad del receptor Fc activador de baja afinidad CD16A (FcyRIIIA) mostraron tasas de respuesta más altas y, en los casos de linfoma no Hodgkin, una mejor supervivencia libre de progresión. En otro caso, el dominio Fc puede contener una o más inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos que reducen la unión al receptor Fc inhibidor de baja afinidad CD32B (FcyRIIB) y conservan los niveles de unión de tipo natural a o mejoran la unión al receptor Fc activador de baja afinidad CD16A (F<cy>RIIIA).

Otro ejemplo incluye híbridos de IgG2-4 y mutantes de IgG4 que tienen una unión reducida a FcR que aumenta su semivida. Se describen híbridos de IG2-4 y mutantes de IgG4 representativos en Angal, S.et al.,Molecular Immunology, 30(1): 105-108 (1993); Mueller, J.et al.,Molecular Immonology, 34(6): 441-452 (1997); y la Patente de EE.UU. N.° 6.982.323 de Wanget al.En algunas realizaciones, el dominio IgG1 y/o IgG2 está eliminado, por ejemplo, Angalet al.describen IgG1 e IgG2 que tienen la serina 241 reemplazada por una prolina.

En algunas ocasiones, el dominio Fc contiene inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos que mejoran la unión a CD16A. En la técnica se conoce un gran número de sustituciones en el dominio Fc de la IgG1 humana que aumentan la unión a CD16A y reducen la unión a CD32B y se describen en Stavenhagen,et al.,Cancer Res., 57(18):8882-90 (2007). Las variantes de ejemplo de los dominios Fc de IgG1 humana con unión reducida a CD32B y/o aumento de la unión a CD16A contienen las sustituciones F243L, R929P, Y300L, V305I o P296L. Estas sustituciones de aminoácidos pueden estar presentes en un dominio Fc de IgG1 humana en cualquier combinación. En un caso, la variante del dominio Fc de IgG1 humana contiene una sustitución F243L, R929P y Y300L. En otro caso, la variante del dominio Fc de IgG1 humana contiene una sustitución F243L, R929P, Y300L, V305I y P296L. En otro caso, la variante del dominio Fc de IgG1 humana contiene una sustitución N297Q, ya que esta mutación anula la unión de FcR.

Las proteínas de fusión divulgadas contienen opcionalmente un dominio enlazador peptídico o polipeptídico que separa el polipéptido Siglec-15 del segundo polipéptido. En algunos casos, el dominio enlazador contiene la región bisagra de una inmunoglobulina. En un caso preferido, la región bisagra se obtiene de una inmunoglobulina humana. Las inmunoglobulinas humanas adecuadas de las que se puede obtener la bisagra incluyen IgG, IgD e IgA. En un caso preferido, la región bisagra se obtiene de IgG humana. Las secuencias de aminoácidos de regiones bisagra de inmunoglobulina y otros dominios se conocen bien en la técnica.

Una proteína de fusión de ejemplo es la proteína de fusión ECD de Siglec15-Fc de IgG1 (L234F/L235E/P331 S).

ME WS W VFL F FL S VT T GVHS FVRTKIDTTENLLNTEVHSSPAQRWSMQVPPEVS

AEAGDAAVLPCTFTHPHRHYDGPLTAIWRAGEPYAGPQVFRCAAARGSELCQT

ALSLHGRFRLLGNPRRNDLSLRVERLALADDRRYFCRVEFAGDVHDRYESRHG

VRLHVTAAPRIVNISVLPSPAHAFRALCTAEGEPPPALAWSGPALGNSLAAVR

SPREGHGHLVTAELPALTHDGRYTCTAANSLGRSEASVYLFRFHGASGDKTUT

CPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWY

VDGVE VHNAKTKPREE QYNS T YRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAS

IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT

QKSLSLSPG (SEQ ID NO: 193).

Una secuencia líder murina se ilustra subrayada. Un dominio extracelular (ECD) de Siglec-15 está en cursiva. Una región bisagra está doblemente subrayada. La secuencia restante se obtiene de Fc de IgG1. Las mutaciones L234F/L235E/P331S en el dominio Fc de IgG1 están en negrita y subrayadas con puntos.

En algunas ocasiones, la secuencia líder está escindida o de otro modo falta en la proteína de fusión. Por ejemplo, la proteína de fusión puede tener la secuencia:

FVR TKIDTTENLLNTEVHSSPAQRWSMQVPPEVSAEAGDAA VLPCTFTHPHRH

YDGPLTAIWRAGEPYAGPQVFRCAAARGSELCQTALSLHGRFRLLGNPRRNDL

SLR VERLALADDRRYFCRVEFAGDVHDRYESRHGVRLHVTAAPRIVNISVLPS

PAHAFRAL CTAEGEPPPALAWSGPALGNSLAA VRSPREGHGHL VTAELPAL TH

DGRYTCTAANSLGRSEASVYLFRFHGASGDKTHTCPPCPAPE FE GGPSVFL FP

PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN

STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYT

LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS

FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID

NO: 194).

En algunas ocasiones, la proteína de fusión es al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 % idéntica a la SEQ ID NO:193 o 194.

En algunos casos, la secuencia líder, el enlazador (por ejemplo, la región bisagra), el segundo compañero de fusión (por ejemplo, dominio Fc de IgG1), o una combinación de los mismos, son sustitutos de otra u otras secuencias (por ejemplo, una secuencia líder alternativa, bisagra, dominio Fc, etc.). En la técnica se conocen bien sustituidos adecuados. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 9.005.616.

3. Ácidos nucleicos y células Siglec-15

También se describen vectores que codifican polipéptidos Siglec-15, fragmentos y fusiones de los mismos. Los ácidos nucleicos, tales como los descritos anteriormente, se pueden insertar en vectores para su expresión en células. Por lo tanto, también se divulgan células que contienen y expresan polipéptidos Siglec-15, fragmentos y fusiones de los mismos. Como se usa en el presente documento, un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago, virus o cósmido, en el que se puede insertar otro segmento de ADN para lograr la replicación del segmento insertado. Los vectores pueden ser vectores de expresión. Un "vector de expresión" es un vector que incluye una o más secuencias de control de expresión, y una "secuencia de control de expresión" es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y/o traducción de otra secuencia de ADN.

Los ácidos nucleicos en vectores pueden unirse operativamente a una o más secuencias de control de expresión. Como se usa en el presente documento, "unido operativamente" significa incorporado en una construcción genética de modo que las secuencias de control de expresión controlen eficazmente la expresión de una secuencia codificante de interés. Los ejemplos de las secuencias de control de expresión incluyen promotores, potenciadores y regiones de terminación de la transcripción. Un promotor es una secuencia de control de expresión compuesta por una región de una molécula de ADN, típicamente dentro de los 100 nucleótidos cadena arriba del punto en el que comienza la transcripción (generalmente cerca del sitio de inicio de la ARN polimerasa II). Para poner una secuencia codificante bajo el control de un promotor, es necesario posicionar el sitio de inicio de la traducción del marco de lectura traduccional del polipéptido entre uno y aproximadamente cincuenta nucleótidos cadena abajo del promotor. Los potenciadores proporcionan especificidad de expresión en términos de tiempo, ubicación y nivel. A diferencia de los promotores, los potenciadores pueden funcionar cuando se encuentran a diversas distancias del sitio de transcripción. También se puede localizar un potenciador cadena abajo del sitio de inicio de la transcripción. Una secuencia codificante está "unida operativamente" y "bajo el control" de secuencias de control de expresión en una célula cuando la ARN polimerasa es capaz de transcribir la secuencia codificante en ARNm, que a continuación se puede traducir en la proteína codificada por la secuencia codificante.

Los vectores de expresión adecuados incluyen, sin limitación, plásmidos y vectores víricos procedentes de, por ejemplo, bacteriófago, baculovirus, virus del mosaico del tabaco, virus del herpes, citomegalovirus, retrovirus, virus vaccinia, adenovirus y virus adenoasociados. Hay numerosos vectores y sistemas de expresión disponibles en el mercado de empresas tales como Novagen (Madison, WI), Clontech (Palo Alto, CA), Stratagene (La Jolla, CA) e Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA).

Un vector de expresión puede incluir una secuencia marcadora. Las secuencias marcadoras, se expresan típicamente como una fusión con el polipéptido codificado. Dichos marcadores pueden insertarse en cualquier parte dentro del polipéptido, incluyendo en uno cualquiera de los extremos carboxilo o amino. Los ejemplos de marcadores útiles incluyen, pero sin limitación, proteína verde fluorescente (GFP), glutatión S-transferasa (GST), polihistidina, c-myc, hemaglutinina, marcador Flag™ (Kodak, New Haven, CT), proteína de unión a maltosa E y proteína A. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión Siglec-15 está presente en un vector que contiene ácidos nucleicos que codifican uno o más dominios de una región constante de cadena pesada de Ig, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos correspondiente a las regiones bisagra, C<h>2 y C<h>3 de una cadena Cy1 de inmunoglobulina humana.

Los vectores que contienen ácidos nucleicos a expresar se pueden transferir a células hospedadoras. Se pretende que la expresión "célula hospedadora" incluya células procariotas y eucariotas en las que se puede introducir un vector de expresión recombinante. Como se usan en el presente documento, "transformada" y "transfectada" abarcan la introducción de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un vector) en una célula mediante una de varias técnicas. Aunque no se limitan a una técnica particular, varias de estas técnicas están bien establecidas en la técnica. Las células procariotas se pueden transformar con ácidos nucleicos mediante, por ejemplo, electroporación o transformación mediada por cloruro de calcio. Los ácidos nucleicos se pueden transfectar en células de mamífero mediante técnicas que incluyen, por ejemplo, coprecipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, electroporación o microinyección. Se pueden usar células hospedadoras (por ejemplo, una célula procariota o una célula eucariota, tal como una célula c Ho ) para, por ejemplo, producir los polipéptidos de fusión Siglec-15 descritos en el presente documento.

Los vectores descritos se pueden usar para expresar Siglec-15 en las células. Un vector de ejemplo incluye, pero sin limitación, un vector adenovírico. Un enfoque incluye la transferencia de ácido nucleico a células primarias en cultivo seguida de un trasplante autólogo de las células transformadasex vivoen el hospedador, ya sea sistémicamente o en un órgano o tejido particular. Los métodosex vivopueden incluir, por ejemplo, las etapas de recoger células de un sujeto, cultivar las células, transducirlas con un vector de expresión y mantener las células en condiciones adecuadas para la expresión de los polipéptidos codificados. Estos métodos se conocen en la técnica de la biología molecular. La etapa de transducción se puede realizar mediante cualquier medio estándar usado para la terapia génicaex vivo,incluyendo, por ejemplo, fosfato de calcio, lipofección, electroporación, infección vírica y transferencia biolística de genes. Como alternativa, se pueden usar liposomas o micropartículas poliméricas. A continuación, las células que se han transducido con éxito pueden seleccionarse, por ejemplo, para la expresión de la secuencia codificante o de un gen de resistencia a fármacos. A continuación, las células pueden irradiarse letalmente (si se desea) e inyectarse o implantarse en el sujeto. En una realización, los vectores de expresión que contienen ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión se transfectan en células que se administran a un sujeto que lo necesita.

La terapia con ácidos nucleicosin vivose puede lograr mediante la transferencia directa de un ADN funcionalmente activo en tejido u órgano somático de mamíferoin vivo.Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos divulgados en el presente documento se pueden administrar directamente a tejidos linfoides o tumores. Como alternativa, la orientación específica del tejido linfoide se puede lograr usando elementos reguladores transcripcionales (TRE, por sus siglas en inglés) específicos del tejido linfoide, tales como un TRE específico de linfocitos B, linfocitos T o células dendríticas. Se conocen en la técnica TRE específicos de tejido linfoide.

Los ácidos nucleicos también pueden administrarsein vivopor medios víricos. Las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión pueden empaquetarse en vectores de retrovirus usando líneas celulares de empaquetamiento que producen retrovirus con replicación defectuosa, como se sabe bien en la técnica. También pueden usarse otros vectores víricos, incluidos adenovirus recombinantes y virus vaccinia, que pueden volverse no replicativos. Además del ADN o ARN desnudo, o de los vectores víricos, pueden usarse como vectores bacterias genomanipuladas.

Los ácidos nucleicos también pueden suministrarse mediante otros portadores, incluyendo liposomas, micropartículas y nanopartículas poliméricas y policationes tales como asialoglucoproteína/polilisina.

Además de la transferencia génica mediada por virus y portadoresin vivo,se pueden usar medios físicos bien conocidos en la técnica para la transferencia directa de ADN, incluida la administración de ADN plasmídico y la transferencia génica mediada por bombardeo de partículas.

D. Composiciones farmacéuticas

Se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen el anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas que contienen un anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención pueden servir para administración por las vías de administración parenteral (inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o subcutánea), transdérmica (ya sea de forma pasiva o usando iontoforesis o electroporación) o transmucosa (nasal, vaginal, rectal o sublingual) o usando insertos bioerosionables y se pueden formular en formas farmacéuticas apropiadas para cada vía de administración.

En algunos enfoquesin vivo,las composiciones de la presente invención sirven para su uso en un método donde se administran a un sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una dosis suficiente para tratar, inhibir o aliviar uno o más síntomas del trastorno que se está tratando o para proporcionar de otro modo un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. La dosificación precisa variará de acuerdo con una diversidad de factores, tales como variables dependientes del sujeto (por ejemplo, edad, salud del sistema inmunitario, etc.), la enfermedad y el tratamiento que se esté realizando.

Para el anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado, a medida que se realicen estudios adicionales, surgirá información sobre los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento de diversas afecciones en diversos pacientes, y el trabajador experto, considerando el contexto terapéutico, la edad y la salud general del receptor, podrá determinar la dosificación adecuada. La dosis seleccionada depende del efecto terapéutico deseado, de la vía de administración y de la duración del tratamiento deseado. Generalmente, para la inyección o infusión intravenosa, la dosificación puede ser menor.

La dosificación administrada a un paciente típicamente es de 0,01 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal del paciente. La dosificación administrada a un paciente puede ser, por ejemplo, entre 0,01 mg/kg y 20 mg/kg, 0,01 mg/kg y 10 mg/kg, 0,01 mg/kg y 5 mg/kg, 0,01 y 2 mg/kg, 0,01 y 1 mg/kg, 0,01 mg/kg y 0,75 mg/kg, 0,01 mg/kg y 0,5 mg/kg, de 0,01 mg/kg a 0,25 mg/kg, de 0,01 a 0,15 mg/kg, de 0,01 a 0,10 mg/kg, de 0,01 a 0,05 mg/kg o de 0,01 a 0,025 mg/kg de peso corporal del paciente. Las dosificaciones específicas de ejemplo incluyen, pero sin limitación, 0,2 mg/kg, 0. 3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg o 10 mg/kg. Se cree que una dosis tan baja como 0,01 mg/kg es adecuada para tener efectos farmacodinámicos apreciables. Se prevé que los niveles de dosis de 0,10-1 mg/kg serán los más apropiados. También se esperaría que dosis más altas (por ejemplo, 1-30 mg/kg) fueran activas.

Generalmente, los anticuerpos humanos tienen una semivida más larga dentro del cuerpo humano que los anticuerpos de otras especies debido a la respuesta inmunitaria frente a los polipéptidos extraños. Por lo tanto, a menudo son posibles dosis más bajas de anticuerpos humanos y una administración menos frecuente. Además, la dosificación y frecuencia de administración de los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos pueden reducirse mejorando la absorción y la penetración tisular de los anticuerpos mediante modificaciones tales como, por ejemplo, lipidación.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención sirve para su uso en un método donde se administra localmente, por ejemplo, mediante inyección directamente en un sitio a tratar. Típicamente, la inyección provoca un aumento de la concentración localizada de la composición de la molécula de unión a Siglec-15 que es mayor que la que se puede lograr mediante administración sistémica. Las composiciones de moléculas de unión a Siglec-15 se pueden combinar con una matriz como se describe a continuación para ayudar a crear una mayor concentración localizada de las composiciones de polipéptidos reduciendo la difusión pasiva de los polipéptidos fuera del sitio a tratar.

1. Formulaciones para administración parenteral

En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención, sirven para su uso en métodos donde se administran en una solución acuosa, mediante inyección parenteral o infusión. La formulación también puede estar en forma de suspensión o emulsión. En general, se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen cantidades eficaces de un anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, y opcionalmente incluyen diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables. Dichas composiciones incluyen opcionalmente uno o más de los siguientes: diluyentes, agua estéril, solución salina tamponada con diverso contenido de tampón (por ejemplo, TrisHCl, acetato y fosfato), pH y fuerza iónica; y aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo, TWEEN 20 (polisorbato 20), TWEEN 80 (polisorbato 80)), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio) y conservantes (por ejemplo, timersol, alcohol bencílico) y sustancias voluminizadoras (por ejemplo, lactosa, manitol). Los ejemplos de disolventes o vehículos no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y aceite de maíz, gelatina y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Las formulaciones pueden liofilizarse y redisolverse/resuspenderse inmediatamente antes de su uso. La formulación puede esterilizarse mediante, por ejemplo, filtración a través de un filtro de retención de bacterias, la incorporación de agentes esterilizantes en las composiciones, la irradiación de las composiciones o el calentamiento de las composiciones.

2. Matrices poliméricas de suministro controlado

El anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado también puede servir para su uso en métodos donde se administra en formulaciones de liberación controlada. Se pueden fabricar dispositivos poliméricos de liberación controlada para una liberación sistémica a largo plazo después de la implantación de un dispositivo polimérico (barra, cilindro, película, disco) o inyección (micropartícuias). La matriz puede estar en forma de micropartículas tales como microesferas, donde el agente está disperso dentro de una matriz polimérica sólida o microcápsulas, donde el núcleo es de un material diferente al de la cubierta polimérica, y el péptido está dispersado o suspendido en el núcleo, que puede ser de naturaleza líquida o sólida. Salvo que se defina específicamente en el presente documento, las micropartículas, microesferas y microcápsulas se usan indistintamente. Como alternativa, el polímero se puede moldear como una losa o película delgada, que varía de nanómetros a cuatro centímetros, un polvo producido mediante molienda u otras técnicas estándar, o incluso un gel tal como un hidrogel.

Se pueden usar matrices biodegradables o no biodegradables para el suministro de polipéptidos de fusión o ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de fusión. Estos pueden ser polímeros naturales o sintéticos. Los polímeros sintéticos típicamente tienen una mejor caracterización de los perfiles de degradación y liberación. El polímero se selecciona basándose en el período durante el cual se desea la liberación. En algunos casos, la liberación lineal puede ser más útil, aunque en otros, una liberación por impulsos o una "liberación masiva" puede proporcionar resultados más eficaces. El polímero puede estar en forma de hidrogel (típicamente absorbiendo hasta aproximadamente el 90 % en peso de agua) y, opcionalmente, se puede reticular con iones o polímeros multivalentes.

Las matrices pueden formarse mediante evaporación de disolvente, secado por pulverización, extracción con disolvente y otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se pueden preparar microesferas bioerosionables usando cualquiera de los métodos desarrollados para fabricar microesferas para el suministro de fármacos, por ejemplo, como se describe por Mathiowitz y Langer, J. Controlled Release, 5:13-22 (1987); Mathiowitz,et al.,Reactive Polymers, 6:275-283 (1987); y Mathiowitz,et al.,J. Appl. Polymer Sci., 35:755-774 (1988).

Los dispositivos se pueden formular para liberación local para tratar el área de implante o inyección, que típicamente suministrará una dosis que es mucho menor que la dosis para el tratamiento de todo el cuerpo, o suministro sistémico. Estos pueden implantarse o inyectarse por vía subcutánea, en el músculo, la grasa o tragarse.

III. Método de uso

También se divulgan métodos de uso de las moléculas de unión a Siglec-15 y de unión a ligando de Siglec-15 divulgadas. La presente invención proporciona el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención para su uso en métodos para aumentar las respuestas inmunitarias, retardar o prevenir el crecimiento tumoral, inhibir la supresión inmunitaria mediada por tumores, eliminar tumores y/o agotar o bloquear la actividad de macrófagos asociados a tumores (TAM) para alterar su actividad, disminuir la supresión inmunitaria mediada por TAM, reducir o revertir la supresión de linfocitos T. También se proporcionan tales moléculas para su uso en métodos para el diagnóstico y tratamiento del cáncer y otras enfermedades.

Los TAM proporcionan un vínculo entre la inflamación y el cáncer. Los macrófagos son células del sistema inmunitario procedentes de monocitos sanguíneos activados. Se reconoce principalmente que participan en respuestas inflamatorias inducidas por patógenos o daño tisular al actuar para eliminar (es decir, fagocitar) patógenos, células muertas, desechos celulares y diversos componentes de la matriz extracelular (MEC). Se ha descubierto que los macrófagos constituyen un constituyente importante en el microambiente tumoral y representan hasta el 50 % de la masa tumoral.

Además de mediar en la fagocitosis, los macrófagos secretan factores de crecimiento proangiogénicos y proteasas de remodelación de la matriz y, por lo tanto, desempeñan un papel en el desarrollo de la infraestructura vascular (es decir, angiogénesis) necesaria para el desarrollo y crecimiento del tumor (Pollard, J.W. (2009), Nat. Rev. Immunol. 9:259-270). La presencia de macrófagos dentro de un tumor parece ayudar al crecimiento del tumor. Varios estudios proporcionan evidencia de que la presencia de macrófagos asociados a tumores dentro del tumor es un factor de pronóstico negativo de supervivencia (Farinha, P.et al.(2005), Blood 106:2169-2174; Dave, S.S.et al.(2004), N. Engl. J. Med. 351:2159-2169; Solinas, G.et al.(2009), J. Leukoc. Biol. 86(5):1065-1073). Los TAM, así como los neutrófilos, los fibroblastos y otras células cooperan con las células tumorales para facilitar la angiogénesis en los tumores (Nucera, S.et al.(2011), Int. J. Dev. Biol. doi: 10.1387/ijdb.103227sn; Zamarron, B.F.et al.(2011), Int. J. Biol. Sci.

7(5):651-658; Liu, J.et al.(2011), PLoS One. 6(4):e19495; Rigo, A.et al.(2010), Molec. Cancer 9(273): 1-13; Lin, J.Y.et al.(2011), Chin. J. Cancer 30(4):280-286; Vergati, M. (2011), J. Biomed. Biotechnol. 2011:182413).

Los estudios muestran que Siglec-15 se expresa de manera inducible en los TAM y mejora la secreción de TGF-p acoplando el reconocimiento de células tumorales con la vía de transducción de señales DAP12-Syk (Takamiya,et al.,Glycobiology, 23(2):178-87 (2013). En un modelo específico propuesto por Takamiya, el M-CSF secretado por las células tumorales induce la diferenciación de monocitos en macrófagos, acompañada de la expresión de Siglec-15. La interacción entre el antígeno sialil-Tn y Siglec-15 mejora la producción de TGF-p a partir de macrófagos a través de la vía DAP12-Syk, inclinando el microambiente tumoral en la dirección de la supresión inmunitaria y, por lo tanto, la progresión del tumor e incluso la metástasis.

La unión de anticuerpos anti Siglec-15 que bloquean o reducen la función a Siglec-15 puede dar como resultado reducir, bloquear, antagonizar, atenuar o abolir completamente la capacidad de Siglec-15 para unirse a uno o más de sus ligandos y, por lo tanto, disminuir o prevenir la señalización inmunitaria inhibidora, incluyendo, pero sin limitación, la secreción de TGF-p, mediada por Siglec-15. El aumento de la expresión de TGF-p a menudo se correlaciona con la malignidad de muchos cánceres y un defecto en la respuesta de inhibición del crecimiento celular al TGF-p y conduce a una oncogénesis basada en inmunosupresión. Reducir la secreción de TGF-p mediada por Siglec-15 y conducir a un aumento general de las respuestas inmunitarias y una disminución directa o indirecta de la progresión tumoral en el sujeto.

Los Ejemplos a continuación muestran que la función que reduce y bloquea los anticuerpos anti Siglec-15, incluidos los divulgados en el presente documento, puede revertir la supresión mediada por Siglec-15 de la proliferación de linfocitos T CD4+ y CD8+ en un ensayo de proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC).

Por lo tanto, se proporciona un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención que puede servir para su uso en métodos para reducir la supresión inmunitaria y/o aumentar una respuesta inmunitaria, más típicamente administrando a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz del anticuerpo de bloqueo de la función anti Siglec-15.

En el presente documento se divulgan anticuerpos, polipéptidos y proteínas de fusión adecuados y se pueden seleccionar además mediante ensayosin vitroque incluyen, pero sin limitación: proliferación, migración, adhesión, crecimiento en agar blando, angiogénesis, comunicación célula-célula, apoptosis, transporte, transducción de señales y ensayosin vivotales como la inhibición del crecimiento tumoral. En los Ejemplos a continuación se proporcionan ensayos de ejemplo para ensayar la función de los anticuerpos divulgados.

Los anticuerpos proporcionados en el presente documento también pueden ser útiles en aplicaciones de diagnóstico e investigación. Por ejemplo, los anticuerpos no neutralizantes se pueden unir al antígeno específico sin inhibir la unión al receptor o la actividad biológica del antígeno, y se pueden usar en ensayos de captura y otros métodos de precipitación (por ejemplo, ELISA). Los anticuerpos neutralizantes (por ejemplo, bloqueadores de función) pueden ser útiles en ensayos de unión competitiva.

También se pueden usar anticuerpos para cuantificar los polipéptidos Siglec-15 o su ligando.

A. Moléculas que aumentan la respuesta inmunitaria

1. Usos terapéuticos y profilácticos

El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención también se proporciona para su uso en métodos terapéuticos y/o profilácticos, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une inmunoespecíficamente a Siglec-15 humana.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención reduce o previene la unión entre Siglec-15 y un ligando de glucoproteína sialilada, por ejemplo, glucoproteínas sialiladas expresadas endógenamente por las células de un sujeto, y reduce o previene la transducción de señales mediada por Siglec-15. Adicionalmente, o como alternativa, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención puede reducir o prevenir la unión entre Siglec-15 y un contrarreceptor del misma, y reducir o prevenir la transducción de señales mediada por Siglec-15 y/o la transducción de señales a través del contrarreceptor. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede unirse a antígenos en uno o más sitios en Siglec-15 disruptivos del sitio de unión a ácido siálico (por ejemplo, un epítopo que incluye el resto 143 de SEQ ID NO: 1) y/o un sitio de unión importante para la unión a un contrarreceptor de Siglec-15. Se ilustran composiciones de ejemplo en los Ejemplos a continuación. 5G12, 6F8, 8C8, 1C3, 1 C12 , 3H10 y 1B2 son ("bloqueadores fuertes") y 10G9, 8H8 y 9A5 ("bloqueadores parciales"). Por lo tanto, en algunas realizaciones, las moléculas usadas para modular positivamente una respuesta inmunitaria incluyen las seis CDR de 5G12. En algunas realizaciones, las moléculas incluyen la región variable de cadena ligera y/o la región variable de cadena pesada de SG12. En algunas realizaciones, se emplea el 5G12 anti humano murino, o una variante quimérica o humanizada del mismo.

Como se ha analizado anteriormente, las interacciones entre Siglec-15 y ligandos de glucoproteína sialilada y/o contrarreceptores de Siglec-15 pueden inhibir la proliferación de linfocitos T y aumentar la producción de citocinas tales como TGF-p. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la administración a un sujeto de las moléculas de unión a Siglec-15 divulgadas modula positivamente el sistema inmunitario del sujeto bloqueando o antagonizando de otro modo la unión/interacción del ligando de Siglec-15 y/o el contrarreceptor. En otra realización, la avidez y/o afinidad del anticuerpo anti Siglec-15 puede ser tal que solo se una a células que expresan niveles muy altos de Siglec-15, que son, por ejemplo, macrófagos asociados a tumores (TAM) o células cancerosas y, por lo tanto, permiten un direccionamiento específico a esta población de células. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las moléculas reducen la producción de TGF-p, por ejemplo, en un microambiente tumoral. En algunas realizaciones, las células que expresan Siglec-15 son monocitos. En realizaciones más específicas, las células que expresan Siglec-15 son macrófagos, por ejemplo, TAM.

Como se ha indicado anteriormente, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno divulgados se pueden unir y bloquear sustancialmente los TAM para modular su actividad inmunosupresora. Además, dichos anticuerpos se pueden usar para agotar los TAM de Siglec-15 dentro del microambiente tumoral o agotar su concentración de TAM en la sangre periférica. En una realización, dicha modulación o agotamiento se logra usando anticuerpos Siglec-15 que se unen a un sitio para deteriorar o interrumpir la función normal de Siglec-15. Como consecuencia de dicha interrupción, la actividad de los TAM disminuye (se modula) y/o se agota la concentración real o eficaz (funcional) de macrófagos en el tumor. Como alternativa, dicha modulación o agotamiento se logra usando anticuerpos anti Siglec-15 que se conjugan con una toxina, de modo que su unión a un TAM conduce a la muerte del macrófago.

Además, las moléculas antagonistas divulgadas se pueden usar para inducir, aumentar o mejorar la proliferación de linfocitos T. En algunas realizaciones, la respuesta de los linfocitos T se induce reduciendo o impidiendo que Siglec-15 se una a un contrarreceptor en el linfocito T. La modulación positiva del sistema inmunitario es particularmente deseable en el tratamiento de cánceres e infecciones crónicas y, por lo tanto, las composiciones divulgadas se pueden usar en el tratamiento de dichos trastornos.

2. Sujetos a tratar

a. Tratamiento del cáncer

El anticuerpo monoclonal reductor de la función o fragmento de unión a antígeno del mismo se proporciona para su uso en métodos para tratar el cáncer. Generalmente, los métodos incluyen estimular o mejorar una respuesta inmunitaria al cáncer, reducir o prevenir el crecimiento o la progresión del tumor, o una combinación de los mismos en el sujeto mediante la administración al sujeto de una cantidad de unión a Siglec-15. El método puede reducir uno o más síntomas del cáncer.

Las células cancerosas adquieren un conjunto característico de capacidades funcionales durante su desarrollo, aunque a través de diversos mecanismos. Tales capacidades incluyen evadir la apoptosis, autosuficiencia en señales de crecimiento, insensibilidad a las señales anticrecimiento, invasión/metástasis tisular, potencial explicativo ilimitado y angiogénesis sostenida. La expresión "célula cancerosa" pretende abarcar células cancerosas tanto preneoplásicas como neoplásicas. En algunas realizaciones, cáncer se refiere a un tumor benigno, que ha permanecido localizado. En otras realizaciones, cáncer se refiere a un tumor maligno, que ha invadido y destruido estructuras corporales adyacentes y se dispersa a lugares distantes. En aún otras realizaciones, el cáncer está asociado con un antígeno de cáncer específico (por ejemplo, antígeno de pancarcinoma (KS 1/4), antígeno de carcinoma de ovario (CA125), antígeno específico de próstata (PSA), antígeno carcinoembrionario (CEA), CD19, CD20, HER2/neu, etc.).

El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo y las composiciones proporcionadas son útiles en métodos para el tratamiento o prevención de una diversidad de cánceres u otras enfermedades proliferativas anómalas, incluyendo (pero sin limitación) las siguientes: carcinoma, incluyendo el de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cuello del útero, tiroides y piel; incluyendo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma de Berkett; tumores hematopoyéticos del linaje mieloide, incluyendo leucemias mielógenas agudas y crónicas y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimatoso, incluyendo fibrosarcoma y rabdomioscarcoma; otros tumores, incluyendo melanoma, seminoma, tetratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimatoso, incluyendo fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y osteosarcoma; y otros tumores, incluyendo melanoma, xenoderma pigmentoso, queratoactantoma, seminoma, cáncer folicular de tiroides y teratocarcinoma.

Los cánceres causados por aberraciones en la apoptosis también se pueden tratar mediante el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo y las composiciones proporcionadas. Dichos cánceres pueden incluir, pero sin limitación, linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones de p53, tumores dependientes de hormonas de mama, próstata y ovario, y lesiones precancerosas tales como poliposis adenomatosa familiar y síndromes mielodisplásicos. En realizaciones específicas, el tumor maligno o los cambios disproliferativos (tales como metaplasias y displasias) o trastornos hiperproliferativos, se tratan y se previenen mediante los métodos y composiciones en el ovario, vejiga, mama, colon, pulmón, piel, páncreas o útero. En otras realizaciones específicas, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo sirve para su uso en un método para tratar o prevenir sarcoma, melanoma o leucemia.

El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo y las composiciones proporcionadas son particularmente útiles para el tratamiento de cánceres que están asociados con células que expresan niveles anormalmente altos de la propia Siglec-15 o ligandos de glucoproteína de Siglec-15, cánceres con altos números de macrófagos asociados a tumores, especialmente si los macrófagos expresan Siglec-15, y/o un cáncer en el que otro u otros tipos de células expresan niveles elevados de Siglec-15 o ligandos de Siglec-15.

Los cánceres específicos y trastornos relacionados que se pueden tratar o prevenir mediante métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluyen, pero sin limitación, leucemias incluyendo, pero sin limitación, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemias mielocíticas agudas, tales como leucemia mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocíctica, eritroleucemia y síndrome mielodisplásico, leucemias crónicas tales como, pero sin limitación, leucemia mielocítica (granulocítica) crónica, leucemia linfocítica crónica, tricoleucemia; policitemia vera; linfomas tales como, pero sin limitación, enfermedad de Hodgkin o no Hodgkin (por ejemplo, linfoma anaplásico difuso (ALK) cinasa negativo, linfoma de linfocitos B grandes (DLBCL); linfoma anaplásico difuso (ALK) cinasa positivo, linfoma de linfocitos B grandes (DLBCL); linfoma anaplásico (ALK) cinasa positivo, linfoma de células grandes anaplásicas (ALCL) ALK+, linfoma mieloide agudo (AML)); mielomas múltiples tales como, pero sin limitación, mieloma múltiple latente, mieloma no secretor, mieloma osteosclerótico, leucemia de células plasmáticas, plasmacitoma solitario y plasmacitoma extramedular; macroglobulinemia de Waldenstrom; gammapatía monoclonal de significado indeterminado; gammapatía monoclonal benigna; enfermedad de la cadena pesada; sarcomas de hueso y tejido conectivo tales como, pero sin limitación, sarcoma óseo, osteosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, tumor maligno de células gigantes, fibrosarcoma óseo, cordoma, sarcoma del periostio, sarcomas de tejidos blandos, angiosarcoma (hemangiosarcoma), fibrosarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, liposarcoma, linfangiosarcoma, neurilemoma, rabdomiosarcoma, sarcoma sinovial; tumores cerebrales incluyendo, pero sin limitación, glioma, astrocitoma, glioma del tronco encefálico, ependimoma, oligodendroglioma, tumor no glial, neurinoma acústico, craneofaringioma, meduloblastoma, meningioma, pineocitoma, pineoblastoma, linfoma de cerebro primario; cáncer de mama, incluyendo, pero sin limitación, adenocarcinoma, carcinoma lobular (de células pequeñas), carcinoma intraductal, cáncer de mama medular, cáncer de mama mucinoso, cáncer de mama tubular, cáncer de mama papilar, enfermedad de Paget y cáncer de mama inflamatorio; cáncer suprarrenal, incluyendo, pero sin limitación, feocromocitoma y carcinoma corticosuprarrenal; cáncer de tiroides, tal como, pero sin limitación, cáncer de tiroides papilar o folicular, cáncer de tiroides medular y cáncer de tiroides anaplásico; cáncer de páncreas, incluyendo, pero sin limitación, insulinoma, gastrinoma, glucagonoma, vipoma, tumor secretor de somatostatina y tumor de células de los islotes o carcinoide; cáncer hipofisario incluyendo, pero sin limitación, enfermedad de Cushing, tumor secretor de prolactina, acromegalia y diabetes insípida; cánceres oculares, incluyendo, pero sin limitación, melanoma ocular tal como melanoma del iris, melanoma coroideo y melanoma del cuerpo ciliar, y retinoblastoma; cánceres de vagina, incluyendo, pero sin limitación, carcinoma escamocelular, adenocarcinoma y melanoma; cáncer de vulva, incluyendo, pero sin limitación, carcinoma escamocelular, melanoma, adenocarcinoma, carcinoma basocelular, sarcoma y enfermedad de Paget; cánceres de cuello del útero, incluyendo, pero sin limitación, carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma; cánceres de útero, incluyendo, pero sin limitación, carcinoma endometrial y sarcoma de útero; cánceres de ovario, incluyendo, pero sin limitación, carcinoma epitelial de ovario, tumor limítrofe, tumor de células germinales y tumor estromal; cánceres de esófago, incluyendo, pero sin limitación, cáncer escamoso, adenocarcinoma, carcinoma cítico adenoide, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma adenoescamoso, sarcoma, melanoma, plasmacitoma, carcinoma verrucoso y carcinoma de células de avena (células pequeñas); cánceres de estómago, incluyendo, pero sin limitación, adenocarcinoma, fungoso (polipoide), ulcerante, de diseminación superficial, de diseminación difusa, linfoma maligno, liposarcoma, fibrosarcoma y carcinosarcoma; cánceres de colon; cánceres rectales; cánceres de hígado, incluyendo, pero sin limitación, carcinoma hepatocelular y hepatoblastoma, cánceres de vesícula biliar, incluyendo, pero sin limitación, adenocarcinoma; colangiocarcinomas, incluyendo, pero sin limitación, papilar, nodular y difuso; cánceres de pulmón, incluyendo, pero sin limitación, cáncer de pulmón no microcítico, carcinoma de células escamosas (carcinoma epidermoide), adenocarcinoma, carcinoma macrocítico y cáncer de pulmón microcítico; cánceres testiculares, incluyendo, pero sin limitación, tumor germinal, seminoma, anaplásico, clásico (típico), espermatocítico, no seminoma, carcinoma embrionario, carcinoma teratómico, coriocarcinoma (tumor del saco vitelino), cánceres de próstata, incluyendo, pero sin limitación, adenocarcinoma, leiomiosarcoma y rabdomiosarcoma; cánceres del pene; cánceres orales, incluyendo, pero sin limitación, carcinoma escamocelular; cánceres basales; cánceres de glándulas salivales, incluyendo, pero sin limitación, adenocarcinoma, carcinoma mucoepidermoide y carcinoma adenoidquístico; cánceres de faringe, incluyendo, pero sin limitación, cáncer escamocelular y verrugoso; cánceres de piel, incluyendo, pero sin limitación, carcinoma basocelular, carcinoma escamocelular y melanoma, melanoma de diseminación superficial, melanoma nodular, melanoma maligno lentigo, melanoma acral lentiginoso; cánceres de riñón, incluyendo, pero sin limitación, cáncer de células renales, adenocarcinoma, hipernefroma, fibrosarcoma, cáncer de células transicionales (pelvis renal y/u uréter); tumor de Wilms; cánceres de vejiga, incluyendo, pero sin limitación, carcinoma de células transicionales, cáncer escamocelular, adenocarcinoma, carcinosarcoma. Además, los cánceres incluyen mixosarcoma, sarcoma osteogénico, endoteliosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, mesotelioma, sinovioma, hemangioblastoma, carcinoma epitelial, cistadenocarcinoma, carcinoma broncogénico, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar y adenocarcinomas papilares (para más información sobre dichos trastornos, véase, Fishmanet al.,1985, Medicine, 2.a Ed., J.B. Lippincott Co., Filadelfia y Murphyet al.,1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cáncer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books EE.UU., Inc., Estados Unidos de América).

b. Tratamiento de infecciones

El anticuerpo monoclonal reductor de la función o fragmento de unión a antígeno del mismo y las composiciones proporcionadas también se proporcionan para su uso en un método para tratar infecciones y enfermedades infecciosas. Generalmente, los métodos incluyen estimular o mejorar una respuesta inmunitaria a un agente causante de infección, reducir o prevenir la progresión de una enfermedad infecciosa, o una combinación de los mismos en el sujeto mediante la administración al sujeto de una cantidad de una molécula de unión a Siglec-15. El método puede reducir uno o más síntomas de la infección.

La infección o enfermedad puede ser causada por una bacteria, virus, protozoo, helminto u otro patógeno microbiano que ingresa intracelularmente y es atacado, es decir, por los linfocitos T citotóxicos.

La infección o enfermedad puede ser aguda o crónica. Típicamente, una infección aguda es una infección de corta duración. Durante una infección microbiana aguda, las células inmunitarias comienzan a expresar receptores inmunomoduladores. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el método incluye aumentar una respuesta inmunoestimuladora contra una infección aguda.

La infección puede estar causada por, por ejemplo, pero sin limitación,Candida albicans, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa o Mycobacterium.

En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas sirven para su uso en métodos para tratar infecciones crónicas, por ejemplo, infecciones en las que se ha producido el agotamiento de los linfocitos T o la anergia de los linfocitos T provocando que la infección permanezca en el hospedador durante un período de tiempo prolongado.

Las infecciones de ejemplo a tratar son infecciones crónicas causadas por un virus de la hepatitis, un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), un virus linfotrófico T humano (HTLV), un virus del herpes, un virus de Epstein-Barr o un virus del papiloma humano.

Debido a que las infecciones víricas se eliminan principalmente mediante los linfocitos T, un aumento en la actividad de los linfocitos T sería terapéuticamente útil en situaciones donde una eliminación más rápida o completa de un agente vírico infeccioso sería beneficiosa para un sujeto animal o humano. Por lo tanto, las composiciones divulgadas se pueden administrar para el tratamiento de infecciones víricas locales o sistémicas, incluyendo, pero sin limitación, inmunodeficiencia (por ejemplo, VIH), papiloma (por ejemplo, VPH), herpes (por ejemplo, HSV), encefalitis, gripe (por ejemplo, virus de la gripe humana A), y resfriado común (por ejemplo, rinovirus humano) y otras infecciones víricas, causadas por, por ejemplo, HTLV, virus de la hepatitis, virus sincitial respiratorio, virus vaccinia y virus de la rabia. Las moléculas se pueden administrar por vía tópica para tratar enfermedades víricas de la piel, tales como lesiones de herpes o culebrilla, o verrugas genitales. Las moléculas también se pueden administrar por vía sistémica para tratar enfermedades víricas sistémicas, incluyendo, pero sin limitación, SIDA, gripe, resfriado común o encefalitis.

Las infecciones representativas que se pueden tratar incluyen, pero sin limitación, infecciones causadas por microorganismos que incluyen, pero sin limitación,Actinomyces, Anabaena, Bacillus, Bacteroides, Bdellovibrio, Bordetella, Borrelia, Campylobacter, Caulobacter, Chlamydia, Chlorobium, Chromatium, Clostridium, Corynebacterium, Cytophaga, Deinococcus, Escherichia, Francisella, Halobacterium, Heliobacter, Haemophilus, Hemophilus influenza tipo B (HIB), Hyphomicrobium, Legionella, Leptspirosis, Listeria, Meningococcus A, B y C, Methanobacterium, Micrococcus, Myobacterium, Mycoplasma, Myxococcus, Neisseria, Nitrobacter, Oscillatoria, Prochloron, Proteus, Pseudomonas, Phodospirillum, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Spirillum, Spirochaeta, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Sulfolobus, Thermoplasma, Thiobacillus y Treponema, Vibrio, Yersinia, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroides, Rickettsia ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalisySchistosoma mansoni.

Otros microorganismos que se pueden tratar usando las composiciones y métodos divulgados incluyen bacterias, tales como las deKlebsiella, Serratia, Pasteurella;patógenos asociados con el cólera, tétanos, botulismo, carbunco, peste y enfermedad de Lyme; o patógenos fúngicos o parásitos, tales comoCandida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Genus Mucorales (mucor, absidia, rhizophus), Sporothrix (schenkii), Blastomyces (dermatitidis), Paracoccidioides (brasiliensis), Coccidioides (immitis) e Histoplasma (capsulatuma), Entamoeba, histolytica, Balantidium coli, Naegleria fowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruz', Toxoplasma gondi, etc.), Sporothrix, Blastomyces, Paracoccidioides, Coccidioides, Histoplasma, Entamoeba, Histolytica, Balantidium, Naegleria, Acanthamoeba, Giardia, Cryptosporidium, Pneumocystis, Plasmodium, Babesia oTrypanosoma,etc.

B. Moléculas reductoras de la respuesta inmunitaria

1. Usos terapéuticos y profilácticos

Se proporcionan los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno proporcionados que se unen a Siglec-15 humana o a un ligando de la misma, y que son capaces de aumentar o mejorar la unión entre Siglec-15 y uno o más de sus ligandos y/o contrarreceptores (por ejemplo, moléculas agonistas) o que aumentan directamente o mejoran la transducción de señales mediada por Siglec-15 o contrarreceptor de Siglec-15 para métodos terapéuticos y/o profilácticos.

Como se ha analizado anteriormente, las interacciones entre Siglec-15 y ligandos de glucoproteína sialilada y/o contrarreceptores de Siglec-15 pueden inhibir la proliferación de linfocitos T y aumentar la producción de citocinas tales como TGF-p. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la función que activa el anticuerpo monoclonal Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención sirve para su uso en un método donde se administra a un sujeto que modula negativamente el sistema inmunitario del sujeto induciendo o agonizando de otro modo la unión/interacción del ligando de Siglec-15 y/o del contrarreceptor o simulando directamente la transducción de señales de Siglec-15 o del contrarreceptor de Siglec-15. En algunas realizaciones, las moléculas aumentan la producción de TGF-p y/o su secreción del mismo a partir de, por ejemplo, monocitos tales como macrófagos.

Además, el anticuerpo monoclonal t Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede servir para su uso en un método para reducir o disminuir la proliferación de linfocitos T. En algunas realizaciones, la respuesta de los linfocitos T se induce aumentando o mejorando la unión de Siglec-15 a un contrarreceptor en el linfocito T. La modulación negativa del sistema inmunitario es particularmente deseable en el tratamiento de enfermedades y trastornos inflamatorios y autoinmunitarios y para tratar o prevenir el rechazo del injerto y/o la enfermedad del injerto contra el hospedador y, por lo tanto, las composiciones y el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo se pueden usar en métodos para el tratamiento de tales trastornos.

a. Respuestas inflamatorias

En algunas realizaciones, el anticuerpo agonista Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo sirve para su uso en un método para tratar o aliviar uno o más síntomas de inflamación, por ejemplo, inflamación aguda, crónica o persistente.

Una respuesta inmunitaria que incluye inflamación se puede inhibir o reducir en un sujeto, preferentemente un ser humano, administrando una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo para inhibir o reducir la actividad biológica de una célula inmunitaria (por ejemplo, linfocitos T o linfocitos B) o para reducir las cantidades de moléculas proinflamatorias en un sitio de inflamación. Las moléculas proinflamatorias de ejemplo incluyen, pero sin limitación, IL-1p, TNF-a, IFN-<y>, IL-18, IL-17, IL-6, IL-23, IL-22, IL-21 y MMP.

b. Respuesta hiperinflamatoria

En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo ralentiza el sistema inmunitario. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede servir para su uso en un método para controlar una respuesta inmunoestimuladora a una infección que está causando daño a los tejidos sanos a través de una respuesta hiperinflamatoria. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los agentes sirven para su uso en métodos donde se administran a un sujeto con una infección que también está experimentando una respuesta hiperinflamatoria. En tales casos, controlar las respuestas inmunitarias excesivas puede resultar beneficioso para el sujeto.

c. Enfermedades/trastornos inflamatorios y autoinmunitarios

El anticuerpo monoclonal divulgado o fragmento de unión a antígeno del mismo también se proporciona para su uso en métodos para tratar enfermedades y trastornos inflamatorios o autoinmunitarios. Las enfermedades/trastornos inflamatorios o autoinmunitarios representativos que se pueden tratar incluyen, pero sin limitación, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, enfermedad autoinmunitaria de Addison, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria del oído interno, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (alps), púrpura trombocitopénica autoinmunitaria (ATP, por sus siglas en inglés), enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, miocardiopatía, esprúe celiaco-dermatitis, síndrome de fatiga crónica, síndrome de inmunodeficiencia (CFIDS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, penfigoide cicatricial, enfermedad por crioaglutininas, síndrome de Crest, enfermedad de Crohn, enfermedad de Dego, dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia -fibromiositis, enfermedad de Graves, enfermedad de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP, por sus siglas en inglés), nefropatía por IgA, diabetes insulinodependiente (tipo I), artritis juvenil, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerosis múltiple, miastenia grave, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome del hombre rígido, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis, vitíligo y granulomatosis de Wegener.

En algunas realizaciones, la inflamación o enfermedad autoinmunitaria es causada por un patógeno o es el resultado de una infección.

d. Trasplantes

El anticuerpo monoclonal Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo también se proporciona para su uso en métodos para reducir o inhibir el rechazo de trasplantes en un sujeto, preferentemente un sujeto humano. El rechazo de trasplantes se puede inhibir o reducir en un sujeto administrando una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal agonista de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo para inhibir o reducir la actividad biológica de una célula inmunitaria o para reducir las cantidades de citocinas proinflamatorias u otras moléculas asociadas con o que promueven la inflamación en un sitio de trasplante.

El material trasplantado pueden ser células, tejidos, órganos, extremidades, dedos o una parte del cuerpo, preferentemente el cuerpo humano. Típicamente, los trasplantes son alogénicos o xenogénicos. Típicamente se administra a un sujeto una molécula agonista de Siglec-15 en una cantidad eficaz para reducir o inhibir el rechazo al trasplante. La molécula se puede administrar por vía sistémica o local mediante cualquier vía de administración aceptable. En algunas realizaciones, las moléculas se administran a un sitio de trasplante antes, en el momento de o después del trasplante.

Las moléculas se pueden administrar directamente a células, tejidos u órganos a trasplantarex vivo.En una realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo sirve para su uso en un método donde el material de trasplante se pone en contacto con una molécula de unión a Siglec-15 antes del trasplante, después del trasplante o ambos.

En otras realizaciones, un anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo sirve para su uso en un método donde se administra a tejidos u órganos inmunitarios, tales como ganglios linfáticos o el bazo.

i. Células

Se pueden trasplantar poblaciones de cualquier tipo de células a un sujeto. Las células pueden ser homogéneas o heterogéneas. Heterogéneas significa que la población celular contiene más de un tipo de célula. Las células de ejemplo incluyen células progenitoras tales como células madre y células pluripotentes que pueden recogerse de un donante y trasplantarse a un sujeto. Opcionalmente, las células se tratanex vivoantes del trasplante. Las células pueden ser células autólogas o heterólogas.

ii. Tejidos

Cualquier tejido se puede usar como trasplante. Los tejidos de ejemplo incluyen piel, tejido adiposo, tejido cardiovascular tal como venas, arterias, capilares, válvulas; tejido neuronal, médula ósea, tejido pulmonar, tejido ocular tal como córneas y cristalino, cartílago, hueso y tejido mucoso. El tejido se puede modificar como se ha analizado anteriormente.

iii. Órganos

Los órganos de ejemplo que se pueden usar para trasplante incluyen, pero sin limitación, riñón, hígado, corazón, bazo, vejiga, pulmón, estómago, ojo, lengua, páncreas, intestino, etc. El órgano a trasplantar también puede ser modificado antes del trasplante como se ha analizado anteriormente.

También se proporciona un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método para inhibir o reducir el rechazo crónico al trasplante en un sujeto mediante la administración de una cantidad eficaz de una molécula de unión a Siglec-15 para inhibir o reducir el rechazo crónico al trasplante en relación con un control.

e. Enfermedad de injerto contra el hospedador (EICH)

También se proporciona un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención para su uso en un método de tratamiento de la enfermedad de injerto contra hospedador (EICH) mediante la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno para aliviar uno o más síntomas asociados con la EICH. La EICH es una complicación importante asociada con el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas en el que las células inmunitarias funcionales de la médula trasplantada reconocen al receptor como "extraño" y organizan un ataque inmunitario. También puede tener lugar en una transfusión de sangre en determinadas circunstancias. Los síntomas de la EICH incluyen erupción cutánea o cambios en el color o la textura de la piel, diarrea, náuseas, función hepática anómala, coloración amarillenta de la piel, mayor susceptibilidad a las infecciones, ojos secos e irritados y boca sensible o seca.

f. Diabetes

También se proporciona un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención para su uso en un método para tratar la diabetes. El método incluye trasplantar células productoras de insulina en un sujeto y administrar al sujeto una cantidad eficaz de una molécula para reducir o inhibir el rechazo al trasplante. Preferentemente, las células productoras de insulina son células beta o células de los islotes. En determinadas realizaciones, las células productoras de insulina son células recombinantes genomanipuladas para producir insulina.

Las células productoras de insulina se pueden encapsular dentro de una matriz, tal como una matriz polimérica, usando polímeros adecuados, incluyendo, pero sin limitación, alginato, agarosa, ácido hialurónico, colágeno, monómeros sintéticos, albúmina, fibrinógeno, fibronectina, vitronectina, laminina, dextrano, sulfato de dextrano, sulfato de condroitina, dermatán sulfato, queratán sulfato, quitina, quitosano, heparano, sulfato de heparano o una combinación de los mismos.

C. Inhibición terapéutica de la resorción ósea osteoclástica

Los estudios muestran que la expresión y función de Siglec-15 son importantes en la osteoclastogénesis (Stuible,et al.,J. Biol Chem., 289(10): 6498-6512 (2014), Ishida-Kitagawa, J. Biol. Chem., 287, 17493-17502 (2012)). Aunque la proteína Siglec-15 está muy regulada durante la diferenciación de los osteoclastos, la proteína es indetectable en células no diferenciadas. Los resultados indican que Siglec-15 y DAP12 forman un complejo en niveles de expresión endógena en los osteoclastos. Los ratones inactivados para Siglec-15(-/-) son levemente osteoporóticos.

Los estudiosin vivotambién muestran que el anticuerpo Siglec-15 puede inhibir la actividad de los osteoclastos en un contexto fisiológico y proporcionar una estrategia terapéutica para reducir la pérdida ósea. Aunque la activación de los receptores en la superficie celular y su regulación negativa endocítica a menudo se combinan como un medio para limitar la intensidad y duración de la señalización, para la señalización de Siglec-15 y la endocitosis parecen tener lugar exclusivamente entre sí, dependiendo de si la ligadura de anticuerpos induce la agrupación de receptores o simplemente dimerización.

Siglec-15 es un receptor intrínseco de osteoclastos con un patrón de expresión muy restringido y, por lo tanto, las terapias dirigidas a Siglec-15 son selectivas. Los anticuerpos Siglec-15 inhiben la diferenciación de los osteoclastos en una etapa relativamente tardía, conservando así la comunicación acoplada entre los osteoclastos y los osteoblastos y evitando complicaciones de las terapias dirigidas a los osteoclastos existentes que pueden inducir la muerte celular de los osteoclastos (bisfosfonatos) o prevenir su diferenciación en una etapa temprana (denosumab), lo que lleva a efectos secundarios no deseados que incluyen osteonecrosis de la mandíbula y fracturas atípicas del fémur.

Por lo tanto, en algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo siempre que se una inmunoespecíficamente a Siglec-15 humana, y que sea capaz de reducir o bloquear la unión entre Siglec-15 y uno o más de sus ligandos y/o contrarreceptores (por ejemplo, moléculas agonistas) sirve para su uso en un método donde se administra a un sujeto que lo necesita en una cantidad eficaz para reducir o inhibir la diferenciación, la función de los osteoclastos o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, las moléculas se administran en una cantidad eficaz para reducir la pérdida ósea, aumentar la formación ósea, aumentar la densidad mineral ósea o una combinación de los mismos.

D. Direccionamiento y detección

El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado, independientemente de su efecto sobre la función de Siglec-15, se puede usar en un método para suministrar carga terapéutica y/o detectar la presencia de Siglec-15 o un ligando de la misma, respectivamente, en células o tejidos. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede conjugar con una molécula biológica de interés para formar un conjugado. La carga que incluye moléculas farmacológicamente activas tales como moléculas inorgánicas y orgánicas, agentes farmacéuticos, fármacos, péptidos, proteínas, material genético, etc., se puede conjugar con el anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo, que a continuación puede dirigirse la carga a células o tejidos que expresan Siglec-15 o un ligando de la misma, respectivamente. Las moléculas de Siglec-15 se pueden unir químicamente a un polipéptido mediante un enlace peptídico o mediante una molécula enlazadora química o peptídica. Los métodos para unir un fármaco u otra molécula farmacéutica pequeña a un fragmento de anticuerpo se conocen bien e incluyen enlazadores químicos bifuncionales tales como (4-yodoacetil)-aminobenzoato de N-succinimidilo; (4-yodoacetil)aminobenzoato de sulfosuccinimidilo; 4succinimidil-oxicarbonil-A-invertida-(2-piridilditio)tolueno; 6-[.alfa.-metil-.A-invertida.-(piridilditiol)-toluamido]hexanoato de sulfosuccinimidilo; 3-(-2-piridilditio)-proprionato de N-succinimidilo; 6-[3(-(-2-piridilditio)-proprionamido]hexanoato de succinimidilo; 6-[3(-(-2-piridilditio)-propionamido]hexanoato de sulfosuccinimidilo; 3-(2-piridilditio)-propionilhidrazida, reactivo de Ellman, ácido diclorotriazínico, S-(2-tiopiridil)-L-cisteína y similares.

Se pueden diseñar proteínas de fusión para colocar la proteína de interés en el extremo amino o carboxi de la cadena pesada o ligera del anticuerpo, aunque es posible que no se requiera toda la cadena pesada. Las configuraciones potenciales incluyen el uso de porciones truncadas de la cadena pesada y ligera con o sin secuencias espaciadoras, según sea necesario, para mantener la integridad funcional de la proteína unida.

Como alternativa, se puede idear un sistema de portador universal. Por ejemplo, se pueden conjugar diversas proteínas o ADN con un portador común tal como proteína A, poli-L-lisina, hex-histidina y similares. A continuación, el portador conjugado formará un complejo con moléculas de unión a Siglec-15 o de unión a ligando de Siglec-15. Podría usarse como portador una pequeña porción de la molécula portadora que es responsable de unir la inmunoglobulina. Otras configuraciones similares incluyen el diseño de portadores que interactúan con proteínas genomanipuladas en la cadena pesada o ligera del anticuerpo.

En algunas realizaciones, un anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o un fragmento de unión a antígeno del mismo se conjuga o se incorpora de otro modo en o sobre un nanoportador para dirigir el nanoportador a las células Siglec-15 o positivas para el ligando de Siglec-15. El nanoportador, por ejemplo, partículas micropoliméricas o nanopoliméricas, liposomas, nanotubos, etc., puede incluir un agente activo para el suministro a las células Siglec-15 o positivas para el ligando de Siglec-15 o su microambiente.

De manera análoga, el anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede conjugar con un marcador detectable o se puede desconjugar y detectar con un reactivo secundario para detectar la expresión de Siglec-15, respectivamente,in vitrooin vivo.Por lo tanto, las moléculas se pueden usar para ensayos de imagen, inmunohistoquímica y otros.

IV. Politerapias

El anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 divulgado o fragmento de unión a antígeno también se proporciona para su uso en métodos donde se administra a un sujeto que lo necesita solo o junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo y el agente terapéutico adicional se administran por separado, pero simultáneamente. El anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo y el agente terapéutico adicional también se puede administrar como parte de la misma composición. En otras realizaciones, el anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo y el segundo agente terapéutico se administran por separado y en momentos diferentes, pero como parte del mismo régimen de tratamiento.

Al sujeto se le puede administrar un primer agente terapéutico 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más horas, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más días antes de la administración de un segundo agente terapéutico. En algunas realizaciones, al sujeto se le pueden administrar una o más dosis del primer agente cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 28, 35 o 48 días antes de una primera administración del segundo agente. El anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede ser el primer o el segundo agente terapéutico. En algunas realizaciones, se administran en combinación uno o más anticuerpos monoclonales de unión a Siglec-15 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos y una o más moléculas de unión a ligando de Siglec-15.

El anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno y el agente terapéutico adicional pueden servir para su uso en un método donde se administran como parte de un régimen terapéutico. Por ejemplo, si se puede administrar un primer agente terapéutico a un sujeto cada cuatro días, el segundo agente terapéutico se puede administrar el primer, segundo, tercer o cuarto día, o combinaciones de los mismos. El primer agente terapéutico o el segundo agente terapéutico pueden administrarse repetidamente durante todo el régimen de tratamiento.

Las moléculas de ejemplo incluyen, pero sin limitación, citocinas, agentes antineoplásicos, radionúclidos, otros agentes inmunoterapéuticos, enzimas, antibióticos, antivíricos (especialmente inhibidores de proteasa solos o junto con nucleósidos para el tratamiento del VIH o la hepatitis B o C), antiparasitarios (helmintos, protozoos), factores de crecimiento, inhibidores del crecimiento, hormonas, antagonistas de hormonas, anticuerpos y fragmentos bioactivos de los mismos (incluidos anticuerpos humanizados, monocatenarios y quiméricos), formulaciones de antígenos y vacunas (incluidos adyuvantes), fármacos peptídicos, antiinflamatorios, ligandos que se unen a receptores tipo Toll (incluyendo, pero sin limitación, ácido poliinosínico: policitidílico (poliFC) y oligonucleótidos CpG) para activar el sistema inmunitario innato, moléculas que movilizan y optimizan el sistema inmunitario adaptativo, otras moléculas que activan o regulan positivamente la acción de los linfocitos T citotóxicos, los linfocitos citolíticos naturales y los linfocitos T auxiliares, y otras moléculas que desactivan o regulan negativamente los linfocitos T supresores o reguladores.

Los agentes terapéuticos adicionales se seleccionan basándose en la afección, trastorno o enfermedad a tratar. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo puede servir para su uso en un método donde se administra conjuntamente con uno o más agentes adicionales que funcionan para potenciar o promover una respuesta inmunitaria o reducir o inhibir una respuesta inmunitaria.

A. Agentes antineoplásicos

El anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede combinar con uno o más agentes antineoplásicos y agentes proapoptóticos. Los agentes antineoplásicos representativos incluyen, pero sin limitación, amsacrina, bleomicina, busulfán, capecitabina, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cisplatino, cladribina, clofarabina, crisantaspasa, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, docetaxel, doxorrubicina, epirrubicina, etopósido, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxicarbamida, idarrubicina, ifosfamida, irinotecán, leucovorina, doxorrubicina liposómica, daunorrubicina liposómica, lomustina, melfalán, mercaptopurina, mesna, metotrexato, mitomicina, mitoxantrona, oxaliplatino, paclitaxel, pemetrexed, pentostatina, procarbazina, raltitrexed, satraplatino, estreptozocina, tegafur-uracilo, temozolomida, tenipósido, tiotepa, tioguanina, topotecán, treosulfano, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina o una combinación de los mismos. Los agentes proapoptóticos representativos incluyen, pero sin limitación, fludarabinetaurosporina, cicloheximida, actinomicina D, lactosilceramida, 15d-PGJ(2) y combinaciones de los mismos.

B. Otros inmunomoduladores

1. Antagonistas de PD-1

En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno sirven para su uso en un método donde se administran conjuntamente con un antagonista de PD-1. La muerte programada-1 (PD-1) es un miembro de la familia de receptores CD28 que genera una respuesta inmunitaria negativa cuando se induce en los linfocitos T. El contacto entre PD-1 y uno de sus ligandos (B7-H1 o B7-DC) induce una respuesta inhibidora que disminuye la multiplicación de linfocitos T y/o la fuerza y/o duración de una respuesta de linfocitos T. Los antagonistas de PD-1 adecuados se describen en las Patentes de EE.UU. N.° 8.114.845, 8.609.089 y 8.709.416, que incluyen compuestos o agentes que se unen a y bloquean un ligando de PD-1 para interferir con o inhibir la unión del ligando al receptor PD-1, o se unen directamente a y bloquean el receptor PD-1 sin inducir la transducción de señales inhibidoras a través del receptor PD-1.

En algunas realizaciones, el antagonista del receptor PD-1 se une directamente al receptor PD-1 sin desencadenar la transducción de señales inhibidoras y también se une a un ligando del receptor PD-1 para reducir o inhibir que el ligando desencadene la transducción de señales a través del receptor PD-1. Al reducir el número y/o la cantidad de ligandos que se unen al receptor PD-1 y desencadenan la transducción de una señal inhibidora, la señal negativa suministrada por la transducción de la señal de PD-1 atenúa menos células y se puede lograr una respuesta inmunitaria más sólida.

Se cree que la señalización de PD-1 está impulsada por la unión a un ligando de PD-1 (tal como B7-H1 o B7-DC) en estrecha proximidad a un antígeno peptídico presentado por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (véase, por ejemplo, Freeman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A, 105:10275-10276 (2008)). Por lo tanto, las proteínas, anticuerpos 0 moléculas pequeñas que previenen la ligadura conjunta de PD-1 y TCR en la membrana de los linfocitos T también son antagonistas de PD-1 útiles.

En algunas realizaciones, los antagonistas del receptor PD-1 son antagonistas de molécula pequeña o anticuerpos que reducen o interfieren con la transducción de señales del receptor PD-1 mediante la unión a ligandos de PD-1 o al propio PD-1, especialmente cuando la ligadura conjunta de PD-1 con TCR no sigue dicha unión, por lo que no desencadena la transducción de señales inhibidoras a través del receptor PD-1.

Otros antagonistas de PD-1 contemplados por los métodos de esta invención incluyen anticuerpos que se unen a PD-1 o ligandos de PD-1 y otros anticuerpos.

Los anticuerpos anti PD-1 adecuados incluyen, pero sin limitación, los descritos en las siguientes Patentes de EE.UU. N.°: 7332582, 7488802, 7521051, 7524498, 7563869, 7981416, 8088905, 8287856, 8580247, 8728474, 8779105, 9067999, 9073994, 9084776, 9205148, 9358289, 9387247, 9492539, 9492540.

Véase también Bergeret al.,Clin. Cancer Res., 14:30443051 (2008).

Los anticuerpos anti B7-H1 (también denominados anti PD-L1) de ejemplo incluyen, pero sin limitación, los descritos en las siguientes Pat. de EE.UU. N.°: 8383796, 9102725, 9273135, 9393301 y 9580507.

Para anticuerpos anti B7-DC (también denominados anti PD-L2), véanse las Pat. de EE.UU. N.°: 7.411.051,7.052.694, 7.390.888, 8188238 y 9255147.

Otros antagonistas del receptor PD-1 de ejemplo incluyen, pero sin limitación, polipéptidos B7-DC, incluidos homólogos y variantes de estos, así como fragmentos activos de cualquiera de los anteriores, y proteínas de fusión que incorporan cualquiera de estos. En algunas realizaciones, la proteína de fusión incluye la porción soluble de B7-DC acoplada a la porción Fc de un anticuerpo, tal como IgG humana, y no incorpora toda o parte de la porción transmembrana de B7-DC humana.

El antagonista de PD-1 también puede ser un fragmento de B7-H1 de mamífero, por ejemplo, de ratón o primate, tal como un ser humano, en donde el fragmento se une a y bloquea PD-1 pero no da como resultado una transducción de señales inhibidoras a través de PD-1. Los fragmentos también pueden formar parte de una proteína de fusión, por ejemplo, una proteína de fusión de Ig.

Otros polipéptidos antagonistas de PD-1 útiles incluyen aquellos que se unen a los ligandos del receptor PD-1. Estos incluyen la proteína del receptor PD-1, o fragmentos solubles de la misma, que pueden unirse a los ligandos de PD-1. tal como B7-H1 o B7-DC, y evitar la unión al receptor PD-1 endógeno, evitando así la transducción de señales inhibidoras. También se ha demostrado que B7-H1 se une a la proteína B7.1 (Butteet al.,Immunity, Vol. 27, págs.

111-122, (2007)). Dichos fragmentos también incluyen la porción ECD soluble de la proteína PD-1 que incluye mutaciones, tales como la mutación A99L, que aumenta la unión a los ligandos naturales (Molnaret al.,PNAS, 105:10483-10488 (2008)). También son útiles B7-1 o fragmentos solubles de la misma, que pueden unirse al ligando de B7-H1 y evitar la unión al receptor PD-1 endógeno, evitando así la transducción de señales inhibidoras.

Los ácidos nucleicos no codificantes PD-1 y B7-H1, tanto ADN como ARN, así como moléculas de ARNip, también pueden ser antagonistas de PD-1. Dichas moléculas no codificantes previenen la expresión de PD-1 en linfocitos T, así como la producción de ligandos de linfocitos T, tales como B7-H1, PD-L1 y/o PD-L2. Por ejemplo, el ARNip (por ejemplo, de aproximadamente 21 nucleótidos de longitud, que es específico para el gen que codifica PD-1, o que codifica un ligando de PD-1, y cuyos oligonucleótidos pueden adquirirse fácilmente comercialmente) forma complejos con portadores, tales como polietilenimina (véase Cubillos-Ruizet al.,J. Clin. Invest. 119(8): 2231-2244 (2009), son fácilmente absorbidos por las células que expresan PD-1, así como ligandos de PD-1, y reducen la expresión de estos receptores y ligandos para lograr una disminución en la transducción de señales inhibidoras en los linfocitos T, activando así los linfocitos T.

2. Antagonistas de CTLA4

También se contemplan como agentes terapéuticos adicionales otras moléculas útiles para mediar en los efectos de los linfocitos T en una respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, la molécula es un antagonista de CTLA4, por ejemplo, un anticuerpo anti CTLA4 antagonista. Un ejemplo de un anticuerpo anti CTLA4 contemplado para su uso en los métodos de la invención incluye un anticuerpo como se describe en el documento PCT/US2006/043690 (Fischkoffet a l,WO/2007/056539).

Las dosis para los anticuerpos anti PD-1, anti B7-H1 y anti CTLA4 se conocen en la técnica y pueden estar en el intervalo de, por ejemplo, de 0,1 a 100 mg/kg, o con intervalos más cortos de 1 a 50 mg/kg, o de 10 a 20 mg/kg. Una dosis apropiada para un sujeto humano puede estar entre 5 y 15 mg/kg, siendo 10 mg/kg de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo humano anti PD-1) una realización específica.

Los ejemplos específicos de un anticuerpo anti CTLA4 útil en la invención son Ipilimumab, un anticuerpo anti CTLA4 humano, administrado a una dosis de, por ejemplo, aproximadamente 10 mg/kg, y Tremelimumab, un anticuerpo anti CTLA4 humano, administrado a una dosis de, por ejemplo, aproximadamente 15 mg/kg. Véase también Sammartino,et al.,Clinical Kidney Journal, 3(2): 135-137 (2010), publicado en línea en diciembre de 2009.

En otras realizaciones, el antagonista es una molécula pequeña. Se ha demostrado que una serie de compuestos orgánicos pequeños se unen al ligando de B7-1 para evitar la unión a CTLA4 (véase Erbeet al.,J. Biol. Chem., 277:7363-7368 (2002). Estos compuestos orgánicos pequeños podrían administrarse solos o junto con un anticuerpo anti CTLA4 para reducir la transducción de señales inhibidoras de los linfocitos T.

3. Agentes potenciadores

En algunas realizaciones, los agentes terapéuticos adicionales incluyen un agente potenciador. El agente potenciador actúa para aumentar la eficacia del regulador positivo de la respuesta inmunitaria, posiblemente mediante más de un mecanismo, aunque el mecanismo de acción preciso no es esencial para la extensa práctica de la presente invención.

En algunas realizaciones, el agente potenciador es ciclofosfamida. La ciclofosfamida (CTX, Cytoxan® o Neosar®) es un fármaco de oxazahosforina y sus análogos incluyen ifosfamida (IFO, Ifex), perfosfamida, trofosfamida (trofosfamida; Ixoten) y sales, solvatos, profármacos y metabolitos farmacéuticamente aceptables de los mismos (Solicitud de Patente de EE.UU. 20070202077). La ifosfamida (MITOXANA®) es un análogo estructural de la ciclofosfamida y su mecanismo de acción se considera idéntico o sustancialmente similar al de la ciclofosfamida. La perfosfamida (4-hidroperoxiciclofosfamida) y la trofosfamida también son agentes alquilantes, que están estructuralmente relacionados con la ciclofosfamida. Por ejemplo, la perfosfamida alquila el ADN, inhibiendo así la replicación del ADN y la síntesis de ARN y proteínas. Se han diseñado y evaluado nuevos derivados de oxazafosforinas en un intento de mejorar la selectividad y la respuesta con una toxicidad reducida para el hospedador (Liang J, Huang M, Duan W, Yu<x>Q, Zhou S. Design of new oxazaphosphorine anticancer drugs. Curr Pharm Des. 2007;13(9):963-78. Review). Estos incluyen mafosfamida (NSC 345842), glufosfamida (D19575, mostaza beta-D-glucosilisofosforamida), S-(-)-bromofosfamida (CBM-11), NSC 612567 (aldofosfamida perhidrotiazina) y NSC 613060 (aldofosfamida tiazolidina). La mafosfamida es un análogo de oxazafosforina que es una sal químicamente estable del ácido 4-tioetanosulfónico de 4-hidroxi-CPA. La glufosfamida es un derivado de IFO en el que la mostaza isofosforamida, el metabolito alquilante de IFO, está unida glucosídicamente a una molécula de beta-D-glucosa. Se describen análogos de ciclofosfamida adicionales en la Patente de EE.UU. 5.190.929, titulada "Cyclophosphamide analogs useful as anti-tumor agents".

Si bien la CTX en sí no es tóxica, algunos de sus metabolitos son agentes alquilantes citotóxicos que inducen la reticulación del ADN y, a dosis más altas, la cadena se rompe. Muchas células son resistentes a la CTX porque expresan altos niveles de la enzima desintoxicante aldehído deshidrogenasa (ALDH). La CTX se dirige a los linfocitos en proliferación, ya que los linfocitos (pero no las células madre hematopoyéticas) expresan sólo niveles bajos de ALDH, y las células en ciclo son más sensibles a los agentes alquilantes del ADN.

Las dosis bajas de CTX (<200 mg/kg) pueden tener efectos inmunoestimulantes, incluida la estimulación de respuestas inmunitarias antitumorales en seres humanos y modelos de cáncer en ratones (Brode y Cooke Crit Rev. Immunol. 28:109-126 (2008)). Estas dosis bajas son subterapéuticas y no tienen actividad antitumoral directa. Por el contrario, dosis elevadas de CTX inhiben la respuesta antitumoral. Varios mecanismos pueden explicar el papel de la CTX en la potenciación de la respuesta inmunitaria antitumoral: (a) agotamiento de Treg CD4+CD25+FoxP3+ (y específicamente Treg proliferantes, que pueden ser especialmente supresores), (b) agotamiento de linfocitos B; (c) inducción de óxido nítrico (NO), que da como resultado la supresión del crecimiento de células tumorales; (d) movilización y expansión de CD11b+Gr-1+ MDSC. Estos efectos primarios tienen numerosos efectos secundarios; por ejemplo, después del agotamiento de Treg, los macrófagos producen más IFN-<y>y menos IL-10. También se ha demostrado que la CTX induce la expresión de tipo IIFN y promueve la proliferación homeostática de linfocitos.

El agotamiento de Treg se cita con mayor frecuencia como el mecanismo por el cual la CTX potencia la respuesta inmunitaria antitumoral. Esta conclusión se basa en parte en los resultados de experimentos de transferencia adoptiva. En el modelo de tumor AB1-HA, el tratamiento con CTX el Día 9 proporciona una tasa de curación del 75 %. La transferencia de Treg purificada el Día 12 inhibió casi por completo la respuesta de CTX (van der Mostet al.Cancer Immunol. Immunother. 58:1219-1228 (2009). Se observó un resultado similar en el modelo de tumor HHD2: La transferencia adoptiva de CD4+ CD25+ Treg después del pretratamiento con CTX eliminó la respuesta terapéutica a la vacuna (Taieb, J. J. Immunol. 176:2722-2729 (2006)).

Numerosos ensayos clínicos en seres humanos han demostrado que dosis bajas de CTX es un agente seguro, bien tolerado y eficaz para promover respuestas inmunitarias antitumorales (Bas, & Mastrangelo Cancer Immunol. Immunother. 47:1-12 (1998)).

La dosis óptima de CTX para potenciar una respuesta inmunitaria antitumoral es aquella que reduce los recuentos generales de linfocitos T reduciendo los niveles de T reg por debajo del intervalo normal, pero es subterapéutica (véase Machielset al.Cancer Res. 61:3689-3697 (2001)).

En ensayos clínicos en seres humanos donde se ha usado CTX como agente inmunopotenciador, normalmente se ha usado una dosis de 300 mg/m2 Para un hombre promedio (6 pies, 170 libras (78 kg) con una superficie corporal de 1,98 m2), 300 mg/m2 son 8 mg/kg, o 624 mg de proteína total. En modelos de cáncer en ratones, se ha observado eficacia en dosis que varían de 15-150 mg/kg, lo que se relaciona con 0,45-4,5 mg de proteína total en un ratón de 30 g (Machielset al.Cancer Res. 61:3689-3697 (2001), Hengstet al.Cancer Res. 41:2163-2167 (1981), Hengst Cancer Res. 40:2135-2141 (1980)).

Para mamíferos más grandes, tal como un primate, tal como un paciente humano, pueden usarse tales dosis de mg/m2, pero también se pueden usar dosis unitarias administradas durante un intervalo de tiempo finito. Dichas dosis unitarias pueden administrarse diariamente durante un período de tiempo finito, tal como hasta 3 días, o hasta 5 días, o hasta 7 días, o hasta 10 días, o hasta 15 días o hasta 20 días o hasta 25 días, y están todas específicamente contempladas por la invención. Se puede aplicar el mismo régimen para los demás agentes potenciadores mencionados en el presente documento.

En otras realizaciones, el agente potenciador es un agente que reduce la actividad y/o el número de linfocitos T reguladores (T-reg), tales como Sunitinib (SUTENT®), anti TGFp o Imatinib (GLEEVAC®). El régimen de tratamiento mencionado también puede incluir la administración de un adyuvante.

Los agentes potenciadores útiles también incluyen inhibidores de la mitosis, tal como paclitaxol, inhibidores de la aromatasa (por ejemplo, letrozol) e inhibidores de la angiogénesis (inhibidores de VEGF, por ejemplo, Avastin, trampa de VEGF) (véase, por ejemplo, Liet al.,Clin Cancer Res. 15 de noviembre de 2006; 12(22):6808-16), antraciclinas, oxaliplatino, doxorrubicina, antagonistas de TLR4 y antagonistas de IL-18.

C. Agentes antimicrobianos

En una realización, el anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede usar en un método donde tiene un papel preventivo o profiláctico en el tratamiento y prevención de enfermedades como se ha analizado anteriormente, y también en el contexto de lesiones traumáticas graves, como quemaduras graves, fracturas de huesos abiertas, amputaciones accidentales u otras heridas. Por lo tanto, el anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno puede servir para su uso en un método donde se administra al sujeto junto con un agente antimicrobiano tal como un antibiótico, un antifúngico, un antivírico, un antiparasitario o un aceite esencial.

En algunas realizaciones, al sujeto se le administran las moléculas de unión a Siglec-15 y/o el agente antimicrobiano en el momento de la admisión al hospital para prevenir complicaciones bacterianas, fúngicas o víricas adicionales. El antibiótico puede dirigirse a patógenos y la molécula de unión a Siglec-15 o de unión a ligando de Siglec-15 puede estimular el sistema inmunitario para proporcionar una respuesta mejorada para tratar o prevenir una infección o enfermedad adicional.

D. Agentes inmunosupresores

En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria, o enfermedad/trastorno inflamatorio/autoinmunitario se trata administrando al sujeto una molécula de unión a Siglec-15 o de unión a ligando y un segundo agente que es un inmunosupresor. Los agentes inmunosupresores incluyen, pero sin limitación, anticuerpos contra otros marcadores de superficie de linfocitos (por ejemplo, CD40, integrina alfa-4) o contra citocinas), proteínas de fusión (por ejemplo, CTLA-4-Ig (Orencia®), TNFR-Ig (Enbrel®)), bloqueadores de TNF-a tales como Enbrel, Remicade, Cimzia y Humira, ciclofosfamida (CTX) (es decir, Endoxan®, Cytoxan®, Neosar®, Procytox®, Revimmune™), metotrexato (MTX) (es decir, Rheumatrex®, Trexall®), belimumab (es decir, Benlysta®), u otros fármacos inmunosupresores (por ejemplo, ciclosporina A, compuestos similares a FK506, compuestos de rapamicina o esteroides), antiproliferativos, agentes citotóxicos u otros compuestos que pueden facilitar la inmunosupresión.

El agente terapéutico puede ser una proteína de fusión CTLA-4, tal como CTLA-4-Ig (abatacept). Las proteínas de fusión CTLA-4-Ig compiten con el receptor coestimulador, CD28, en los linfocitos T para unirse a CD80/CD86 (B7-1/B7-2) en las células presentadoras de antígenos y, por lo tanto, funcionan para inhibir la activación de los linfocitos T. En otra realización, el agente terapéutico es una proteína de fusión CTLA-4-Ig conocida como belatacept. Belatacept contiene dos sustituciones de aminoácidos (L104E y A29Y) que aumentan notablemente su avidez por CD86in vivo.En otra realización, el agente terapéutico es Maxy-4.

En otra realización, el agente terapéutico es ciclofosfamida (CTX). La ciclofosfamida (el nombre genérico de Endoxan®, Cytoxan®, Neosar®, Procytox®, Revimmune™), también conocida como citofosfano, es un agente alquilante de mostaza nitrogenada del grupo de las oxazoforinas. Se usa para tratar diversos tipos de cáncer y algunos trastornos autoinmunitarios. La ciclofosfamida (CTX) es el fármaco principal usado para la glomerulonefritis proliferativa difusa en pacientes con lupus renal.

El agente terapéutico se puede administrar en una cantidad eficaz para reducir los niveles en sangre o suero de autoanticuerpos anti ADN bicatenario (anti ADN bc) y/o para reducir la proteinuria en un paciente que lo necesita.

En otra realización, el agente terapéutico aumenta la cantidad de adenosina en el suero, véase, por ejemplo, el documento WO 08/147482. Por ejemplo, el segundo agente terapéutico puede ser CD73-Ig, CD73 recombinante u otro agente (por ejemplo, una citocina o anticuerpo monoclonal o molécula pequeña) que aumente la expresión de CD73, véase, por ejemplo, el documento WO 04/084933. En otra realización, el agente terapéutico es interferón-beta.

El agente terapéutico puede ser Tysabri u otro agente terapéutico para la EM. En otra realización, el segundo agente terapéutico trata preferentemente la inflamación crónica, por lo que el régimen de tratamiento se dirige tanto a la inflamación aguda como a la crónica. En una realización preferida, el segundo agente terapéutico es un bloqueador de TNF-a.

El agente terapéutico puede ser una molécula pequeña que inhibe o reduce la diferenciación, proliferación, actividad y/o producción y/o secreción de citocinas por Th1, Th 17, Th22 y/u otras células que secretan, o hacen que otras células secreten moléculas inflamatorias, incluyendo, pero sin limitación, IL-1p, TNF-a, IFN-<y>, IL-18 IL-17, IL-6, IL-23, IL-22, IL-21 y MMP. En otra realización, el agente terapéutico es una molécula pequeña que interactúa con los Treg, mejora la actividad de los Treg, promueve o mejora la secreción de IL-10 por los Treg, aumenta el número de Treg, aumenta la capacidad supresora de los Treg o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la composición aumenta la actividad o producción de Treg. Los agentes potenciadores de Treg de ejemplo incluyen, pero sin limitación, glucocorticoides fluticasona, salmeteroal, anticuerpos contra IL-12, IFN-Y e IL-4; vitamina D3 y dexametasona, y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo de bloqueo de funciones contra una molécula proinflamatoria tal como IL-6, IL-23, IL-22 o IL-21.

Como se usa en el presente documento, la expresión "compuesto de rapamicina" incluye el compuesto tricíclico neutro rapamicina, derivados de rapamicina, análogos de rapamicina y otros compuestos macrólidos que se cree que tienen el mismo mecanismo de acción que la rapamicina (por ejemplo, inhibición de la función de citocinas). La expresión "compuestos de rapamicina" incluye compuestos con similitud estructural con la rapamicina, por ejemplo, compuestos con una estructura macrocíclica similar, que se han modificado para mejorar su eficacia terapéutica. Se conocen en la técnica compuestos de rapamicina de ejemplo (véanse, por ejemplo, los documento WO95122972, WO 95116691, WO 95104738, las Patentes de EE.UU. N.° 6.015.809; 5.989.591; las Patentes de EE.UU. N.° 5.567.709; 5.559.112; 5.530.006; 5.484.790; 5.385.908; 5.202.332; 5.162.333; 5.780.462; 5.120.727).

La expresión "compuestos similares a FK506" incluye FK506 y derivados y análogos de FK506, por ejemplo, compuestos con similitud estructural con FK506, por ejemplo, compuestos con una estructura macrocíclica similar que se han modificado para mejorar su eficacia terapéutica. Los ejemplos de compuestos similares a FK506 incluyen, por ejemplo, los descritos en el documento WO 00101385. Preferentemente, la expresión "compuesto de rapamicina", como se usa en el presente documento, no incluye compuestos similares a FK506.

E. Antiinflamatorios

Otros agentes terapéuticos adecuados incluyen, pero sin limitación, agentes antiinflamatorios. El agente antiinflamatorio puede ser no esteroideo, esteroideo o una combinación de los mismos. Una realización proporciona composiciones orales que contienen de aproximadamente el 1 % (p/p) a aproximadamente el 5 % (p/p), típicamente aproximadamente el 2,5 % (p/p) de un agente antiinflamatorio. Los ejemplos representativos de agentes antiinflamatorios no esteroideos incluyen, sin limitación, oxicams, tales como piroxicam, isoxicam, tenoxicam, sudoxicam; salicilatos, tales como aspirina, disalcid, benorilato, trilisato, safaprina, solprin, diflunisal y fendosal; derivados de ácido acético, tales como diclofenaco, fenclofenaco, indometacina, sulindaco, tolmetina, isoxepac, furofenaco, tiopinaco, zidometacina, acematacina, fentiazaco, zomepiraco, clindanaco, oxepinaco, felbinaco y ketorolaco; fenamatos, tales como ácido mefenámico, meclofenámico, flufenámico, niflúmico y tolfenámico; derivados de ácido propiónico, tales como ibuprofeno, naproxeno, benoxaprofeno, flurbiprofeno, cetoprofeno, fenoprofeno, fenbufeno, indoprofeno, pirprofeno, carprofeno, oxaprocina, pranoprofeno, miroprofeno, tioxaprofeno, suprofeno, alminoprofeno y tiaprofénico; pirazoles, tales como fenilbutazona, oxifenbutazona, feprazona, azapropazona y trimetazona. También pueden emplearse mezclas de estos agentes antiinflamatorios no esteroideos.

Los ejemplos representativos de fármacos antiinflamatorios esteroideos incluyen, sin limitación, corticosteroides tales como hidrocortisona, hidroxil-triamcinolona, alfa-metil-dexametasona, fosfato de dexametasona, dipropionatos de beclometasona, valerato de clobetasol, desonida, desoximetasona, acetato de desoxicorticosterona, dexametasona, diclorisona, diacetato de diflorasona, valerato de diflucortolona, fluadrenolona, acetónido de fluclorolona, fludrocortisona, pivalato de flumetasona, acetónida de fluosinolona, fluocinonida, butilésteres de flucortina, fluocortolona, acetato de fluprednideno (fluprednilideno), flurandrenolona, halcinonida, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, metilprednisolona, acetónido de triamcinolona, cortisona, cortodoxona, flucetonida, fludrocortisona, diacetato de difluorosona, fluradrenolona, fludrocortisona, diacetato de diflurosona, acetónido de fluradrenolona, medrisona, amcinafel, amcinafida, betametasona y el equilibrio de sus ésteres, cloroprednisona, acetato de clorprednisona, clocortelona, clescinolona, diclorisona, diflurprednato, flucloronida, flunisolida, fluorometalona, fluperolona, fluprednisolona, valerato de hidrocortisona, ciclopentilpropionato de hidrocortisona, hidrocortamato, meprednisona, parametasona, prednisolona, prednisona, dipropionato de beclometasona, triamcinolona y mezclas de los mismos.

V. Métodos de diagnóstico

El anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede usar con fines de diagnóstico, tales como para detectar, diagnosticar o controlar enfermedades, trastornos o infecciones asociadas con la expresión de Siglec-15, o para determinar o ayudar en la determinación o identificación de poblaciones o perfiles de pacientes adecuados. Cualquiera de los métodos puede combinarse con un método para tratar al sujeto, por ejemplo, administrando al sujeto una cantidad eficaz de una o más moléculas terapéuticas de unión a Siglec-15.

La detección o diagnóstico de una enfermedad, trastorno o infección, incluyendo, pero sin limitación, cáncer, puede incluir: (a) ensayar la expresión de Siglec-15 o derivados de la misma en células, suero, plasma, sangre o en un muestra de tejido (por ejemplo, una muestra de tumor) de un sujeto que usa uno o más anticuerpos (o fragmentos de los mismos) que se unen inmunoespecíficamente a dichos antígenos; y (b) comparar el nivel del antígeno con un nivel de control, por ejemplo, niveles en muestras de tejido normal, por lo que un aumento en el nivel ensayado de antígeno en comparación con el nivel de control del antígeno es indicativo de la enfermedad, trastorno o infección. Dichos anticuerpos y fragmentos se pueden emplear en inmunoensayos, tales como ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos se usan para análisis IHC en células de una muestra de tejidoin vitrooin situo en otras realizaciones se proporcionan para su usoin vivo.Por lo tanto, los anticuerpos y fragmentos se pueden usar en la detección y diagnóstico de una enfermedad, trastorno o infección en un ser humano. En una realización, se proporciona un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de la presente invención para su uso en un método de dicho diagnóstico que incluye: a) administrar a un sujeto (por ejemplo, por vía parenteral, subcutánea o intraperitoneal) una cantidad eficaz de dicho anticuerpo marcado o fragmento de unión a antígeno; b) esperar un intervalo de tiempo después de la administración para permitir que la molécula marcada se concentre preferentemente en sitios del sujeto donde se expresa Siglec-15 (y para que la molécula marcada no unida se elimine hasta el nivel de fondo); c) determinar el nivel de fondo; y d) detectar el anticuerpo marcado en el sujeto, de modo que la detección localizada del anticuerpo marcado por encima o por debajo del nivel de fondo indique que el sujeto tiene la enfermedad, trastorno o infección y/o muestre la ubicación y el nivel de expresión relativo del tejido Siglec-15+. De acuerdo con esta realización, el anticuerpo se puede marcar con un resto de diagnóstico por imagen que sea detectablein vivousando un sistema de imágenes conocido por un experto en la técnica. El nivel de fondo se puede determinar mediante diversos métodos que incluyen comparar la cantidad de molécula marcada detectada con un valor estándar determinado previamente para un sistema particular.

Otros métodos incluyen, por ejemplo, controlar la progresión de una enfermedad, trastorno o infección, (a) ensayando la expresión de Siglec-15 en células o en una muestra de tejido de un sujeto obtenida en un primer punto temporal y un punto temporal posterior usando una molécula de unión a Siglec-15 y (b) comparando el nivel de expresión de Siglec-15 en las células o en la muestra de tejido del sujeto en el primer y posterior puntos temporales, en donde un aumento en el nivel ensayado de Siglec-15 en el último punto temporal en comparación con el primer punto temporal es indicativo de la progresión de la enfermedad, trastorno o infección.

Un método para controlar una respuesta a un tratamiento puede incluir, (a) ensayar la expresión de Siglec-15 en células o en una muestra de tejido de un sujeto antes y después del tratamiento usando una molécula de unión a Siglec-15; y (b) comparar el nivel de Siglec-15 en el tiempo, mediante lo cual una disminución en el nivel ensayado de Siglec-15 después del tratamiento en comparación con el nivel de Siglec-15 antes del tratamiento es indicativo de una respuesta favorable al tratamiento.

Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de diagnóstico por imágenes usado determinarán la cantidad del resto de imágenes necesarias para producir imágenes diagnósticas.

Dependiendo de varias variables, incluyendo el tipo de marcador usado y el modo de administración, el intervalo de tiempo después de la administración para permitir que la molécula marcada se concentre preferentemente en sitios en el sujeto y para que la molécula marcada no unida se elimine con respecto al nivel de fondo es de 6 a 48 horas o de 6 a 24 horas o de 6 a 12 horas. En otra realización, el intervalo de tiempo después de la administración es de 5 a 20 días o de 5 a 10 días.

En una realización, el control de una enfermedad, trastorno o infección se realiza repitiendo el método para diagnosticar la enfermedad, trastorno o infección, por ejemplo, un mes después del diagnóstico inicial, seis meses después del diagnóstico inicial, un año después del diagnóstico inicial, etc.

La presencia de la molécula marcada se puede detectar en el sujeto mediante métodos conocidos en la técnica para la exploraciónin vivo.Estos métodos dependen del tipo de marcador usado. Los expertos serán capaces de determinar el método apropiado para detectar un marcador en particular. Los métodos y dispositivos que se pueden usar en los métodos de diagnóstico incluyen, pero sin limitación, tomografía computarizada (TC), exploración de cuerpo entero tal como tomografía por emisión de positrones (PET), resonancia magnética nuclear (RMN) y ecografía.

En una realización específica, la molécula se marca con un radioisótopo y se detecta en el paciente usando un instrumento quirúrgico sensible a la radiación (Thurstonet al.,Patente de EE.UU. N.° 5.441.050). En otra realización, la molécula se marca con un compuesto fluorescente y se detecta en el paciente usando un instrumento de exploración sensible a la fluorescencia. En otra realización, la molécula se marca con un metal emisor de positrones y se detecta en el paciente usando tomografía por emisión de positrones. En otra realización más, la molécula se marca con un marcador paramagnético y se detecta en un paciente mediante resonancia magnética nuclear (RMN).

VI. Kits

El anticuerpo monoclonal de unión a Siglec-15 divulgado o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede envasar en un recipiente cerrado herméticamente, tal como una ampolla o bolsita, indicando la cantidad. Las moléculas se pueden suministrar en forma de polvo liofilizado esterilizado en seco o concentrado libre de agua en un recipiente cerrado herméticamente, y se pueden reconstituir, por ejemplo, con agua o solución salina a la concentración apropiada para su administración a un sujeto. Por ejemplo, las moléculas se pueden suministrar como un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente cerrado herméticamente en una dosificación unitaria de al menos 5 mg, o al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos 25 mg, al menos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, o al menos 75 mg. Las moléculas liofilizadas se pueden almacenar entre 2 y 8 °C en su recipiente original y, típicamente, se administran dentro del intervalo de 12 horas, 6 horas, 5 horas, 3 horas o 1 hora después de ser reconstituidas.

En una realización alternativa, las moléculas se suministran en forma líquida en un recipiente cerrado herméticamente que indica la cantidad y concentración. En algunas realizaciones, la forma líquida de las moléculas se suministra en un recipiente cerrado herméticamente que incluye al menos 1 mg/ml, o al menos 2,5 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/ml, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 100 mg/ml, al menos 150 mg/ml, al menos 200 mg/ml de las moléculas.

También se proporcionan paquetes y kits farmacéuticos que incluyen uno o más recipientes llenos de moléculas de unión a Siglec-15 o de unión a ligando de Siglec-15. Además, también se puede incluir uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento de una enfermedad en el paquete o kit farmacéutico. El paquete o kit farmacéutico también puede incluir uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas divulgadas. Opcionalmente asociado con dicho o dichos recipientes puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, reflejando dicho aviso la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para administración a seres humanos.

También se proporcionan kits diseñados para los métodos descritos anteriormente. Las realizaciones incluyen típicamente una o más moléculas de unión a Siglec-15 o de unión a ligando de Siglec-15. En realizaciones particulares, un kit también incluye uno o más agentes profilácticos o terapéuticos diferentes útiles para el tratamiento del cáncer, en uno o más recipientes.

Ejemplos

Los siguientes Ejemplos proporcionan ilustraciones no limitantes de la divulgación. En la medida en que los ejemplos no se refieran al anticuerpo 5G12, se proporcionan únicamente a título informativo.

Ejemplo 1: Anticuerpos SIGLEC-15 y secuencias de cadena pesada y ligera de los mismos

Materiales y métodos

Anticuerpos monoclonales anti Siglec-15 humana de ratón

Se inmunizaron ratones inactivados con Siglec-15 (n = 2) con hS15.mIg (dominio extracelular [ECD] de Siglec 15 humana fusionado con IgG2a de ratón) emulsionado con CFA (adyuvante completo de Freund). Los ratones también recibieron una inyección de GM-CSF y anti CD40. Los ratones se expusieron al mismo inmunógeno 2 semanas más tarde. El valor de antisuero se evaluó analizando el suero recogido del sangrado de la cola en una placa ELISA recubierta con hS15.h!g (ECD de Siglec 15 humana fusionado con IgG1 humana) en diversas diluciones, de 1:1000 hasta 1:100.000.000. La figura 1 muestra que se detectaron anticuerpos anti hS15 en una dilución >1:100.000. Los ratones recibieron una tercera dosis de antígeno dos semanas después. Tres días después del refuerzo final, se recogieron esplenocitos de ratón y se suspendieron de nuevo en RPMI complementado con FBS al 10 % y glutamina y, a continuación, se fusionaron para formar hibridomas.

Electrofusión de esplenocitos inactivados de Siglec-15 (S15 KO)

Se sembraron en placas células fusionadas en gel/medio de metilcelulosa; las células fusionadas sobrantes se criopreservaron y se pueden descongelar para otro lote de clonación. Se recogieron clones individuales y se colocaron en placas de 10 x 96 pocillos (960 clones). El sobrenadante se recogió 2 semanas después.

RACE

La identificación RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc) de las cadenas pesada y ligera se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo: (1) desnaturalización de ARNm, (2) síntesis de ADNc, (3) reacción 5'RACE, (4) resultados de la PCR analizados (en un gel de agarosa para visualizar el fragmento de ADN amplificado; los fragmentos de ADN de la región variable del anticuerpo correctos deberían tener un tamaño entre 500-700 pares de bases, (5) bandas positivas de PCR clonadas con TOPO; (6) clones de TOPO amplificados por PCR, seguido de electroforesis en gel y recuperación en gel de agarosa, (7) 218 clones secuenciados en total, (8) análisis de CDR realizados usando datos de secuenciación (las regiones CDR se definieron usando VBASE2 disponible a través de vbase2.org).

Resultados

Se clonaron anticuerpos usando métodos RACE. Después de secuenciar 218 fragmentos de ADN clonados, el análisis de secuencia de anticuerpos identificó una cadena pesada y una cadena ligera para 24 muestras de anticuerpos denominadas en el presente documento 1B2, 1C3, 1<h>3, 1<c>12, 3H10, SG12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9, 6A, 28A, 63A, 71A, 77A, 80A, 82B, 83B, 92A, 93B, 99B, 104B y 105A. Las secuencias se proporcionan a continuación y anteriormente. Las secuencias de cadena pesada y ligera y las CDR se proporcionan anteriormente, a continuación y se ilustran en las figuras 2A-3C.

SECUENCIAS de 1B2:

Secuencia de aminoácidos VL de 1B2 en formato FASTA

D V LM TQ TPLSLPV SLG D Q A SISC R SSQ SIV H SN G N TY LEW Y LQ K PG Q SPK LLI

YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGG

T K L E IK(SEQ ID NO:3)

Secuencia de nucleótidos VL de 1B2 en formato FASTA

GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCA

AGCCTCCATCTCTTGCAGATC TAGT CAGAGCAT T GTACATAGTAATGGAAACA

CCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATC

TACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T CAAGAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT C T G G

GAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGC

ACCAAGCTGGAAATCAAG(SEQ ID NO:74)

Secuencia de aminoácidos VH de 1B2 en formato FASTA

EVQLVES GGG FVKPGGS LKL S CAAS G FT FSDYGMHWVRQAPEKGLEWVAYIS S

GSSIIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARDHYHGNGS

DYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO: 13)

Secuencia de nucleótidos VH de 1B2 en formato FASTA

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTCGTGAAGCCTGGAGGGTCCCT

GAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATGGAATGCACT

GGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGCATACATTAGTAGT

G G C AG T AG T AT C AT C TAC T AT G C AGAC AC AG T GAAG G G C C GAT T C AC C AT C T C

C AGAGAC AAT G C C AAGAAC AC C C T G T T C C T G C AAAT GAC C AG T C T GAG G T C T G

AG GACAC G G C CAT G TAT TAC T G T G CAAG G GAC CAC TAC CAT G G TAAC G G G T C C

GACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:85)

SECUENCIAS de 1C3:

Secuencia de aminoácidos VL de 1C3 en formato FASTA

D IV M TQ A A PSV PV T PG E SV SISC RSSK SL LH SN G N T Y LY W FL Q R PG Q SPQ LL I

YRMSNLASGVPDRFGGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGFYYCMQHLEYPYTFGGG

T R L E IK(SEQ ID NON)

Secuencia de nucleótidos VL de 1C3 en formato FASTA

GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTC

AGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACA

CTTACTTATATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATA

TATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCGGTGGCAGTGG

G T CAG GAAC T G C T T T CACAC T GAGAAT CAG TAGAG T G GAG G C T GAG GAT G T G G

GTTTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTACACGTTCGGAGGGGGG

ACCAGGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO:75)

Secuencia de aminoácidos VH de 1C3 en formato FASTA

QVQLKQSGAELVKPGASVKISCKASGYIFTDYYVNWVKQRPGQGLEWIGKIGP

GSVSIYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCASYYYGFAYW

GQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 14)

Secuencia de nucleótidos VH de 1C3 en formato FASTA

CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGATAT CC T GCAAGGC T T C T GGC TACAT C T T CAC T GAC TAT TATGTAAACT

GGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAAAGATTGGTCCT

G GAAG T G T TAG TAT T TAC TACAAT GAGAAG T T CAAG G G CAAG G C CACAC T GAC

T G CAGACAAAT C C T C CAG CACAG C C TACAT G CAG C T CAG CAG C C T GACAT C T G

AGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGTTATTACTACGGGTTTGCTTACTGG

GGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO:86)

SECUENCIAS de 1H3:

Secuencia de aminoácidos VL de 1H3 en formato FASTA

DIQMT QAS S S L SVS LG G R V TIT CKAS DHINNWLAWYQQKPGNAPRLLIS GAT S

LETG VPSRFSG SG SG KD YTLSITSLQ TED V ATYY CQQ YW SSPLTFGA GTK LEL

K (SEQ ID N O :5)

Secuencia de nucleótidos VL de 1H3 en formato FASTA

GACATCCAGATGACACAGGCTTCATCCTCCTTGTCTGTATCTCTAGGAGGCAG

AG T CAC CAT TAC T T G CAAG G CAAG T GAC CACAT TAATAAT TGGTTGGCCTGGT

ATCAGCAGAAACCAGGAAATGCTCCTAGGCTCTTAATATCTGGTGCAACCAGT

TTGGAAACTGGGGTTCCTTCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAAAGGATTA

CAC T C T CAG CAT TAC CAG T C T T CAGACT GAAGATGTTGCTACTTATTACTGTC

AACAGTATTGGAGTTCTCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTG

AAA (SEQ ID NO:76)

Secuencia de aminoácidos VH de 1H3 en formato FASTA

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSNYGVHWVRQPPGKGLEWLVLIWS

DGSTTYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTGDTAMYYCARHPYDDYSGY

YYTMDYWGQGTSVTVSS (S E Q ID N O :15)

Secuencia de nucleótidos VH de 1H3 en formato FASTA

CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCT

GTCCATCACATGCACCGTCTCAGGGTTCTCATTAAGCAATTATGGTGTACACT

GGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGTACTGATATGGAGT

GAT GGAAGCACAACC TATAAT T CAGCTC T CAAAT CCAGAC T GAGCATCAGCAA

GGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTCCAAACTGGTG

ACACAG CCATGTACTACTGTGCCAGACATCCC TAT GAT GAT TATTCCGGCTAT

TACTATACTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

(SEQ ID NO:87)

SECUENCIAS de 1C12:

Secuencia de aminoácidos VL de 1C12 en formato FASTA

D V LM TQ TPLSLPV SLG D Q A SISC R SSQ SIV H SN G N TY LEW Y LQ K PG Q SPK LLI

YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGG

T K L E IK (SEQ ID N 0 :3 )

Secuencia de nucleótidos VL de 1C12 en formato FASTA

GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCA

AGCCTCCATCTCTTGCAGATC TAGT CAGAGCAT T GTACATAGTAATGGAAACA

CCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATC

TACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T CAAGAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT C T G G

GAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGC

ACCAAGCTGGAAATCAA (SEQ ID NO:77)

Secuencia de aminoácidos VH de 1C12 en formato FASTA

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFSFSDYGMHWVRQAPEKGLEWVAYISS

GSSILYYADIVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARDHYHGNGS

DYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 16)

Secuencia de nucleótidos VH de 1C12 en formato FASTA

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCT

GAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGTTTCTCTTTCAGTGACTATGGAATGCACT

GGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTTGCATACATTAGTAGT

G G CAG TAG TAT C C T C TAC TAT G CAGACATAG T GAAG G G C C GAT T CAC CAT C T C

CAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTGAGGTCTG

AG GACAC G G C CAT G TAT TAC T G T G CAAG G GAC CAC TAC CAT G G TAAC G G G T C C

GACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO:88)SECUENCIAS de 3H10:

Secuencia de aminoácidos VL de 3H10 en formato FASTA

Q IIL T Q SPA IM SA SPGEK VTM TC SASSSTSFM H W YQ QK PGTSPK RW IFDTSKL

ASGVPGRFIG SGSG TSY SLTISTM EA EDA ATY YCHQ RSAY PW TFGG GTKLEIK

(SEQIDNO:6)

Secuencia de nucleótidos VL de 3H10 en formato FASTA

CAAAT T AT T C T C AC C C AG T C T C C AG CAATCATGTCTGCATCTC C AG G G GAGAA

G G T CAC CAT GAC C T G CAG T G C CAG C T CAAG TACAAG T T T CAT G CAC T G G TAC C

AG CAGAAGC CAGG CAC C T C C C C CAAAAGATGGAT T T T T GACACAT CCAAACT G

GCTTCTGGAGTCCCTGGTCGCTTCATTGGTAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTC

T C T CACAAT CAG CAC CAT G GAG G C T GAAGAT G C T G C CAC T TAT TAC T G C CAT C

AGCGGAGTGCTTACCCATGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA

(SEQIDNO 78)

Secuencia de aminoácidos VH de 3H10 en formato FASTA

EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKERPEQGLEWIGRIDP

EDGDIEYDPKFQGKATMTADTSSNTAYLQFSSLTSEDTAVYYCVTDYDYDGGW

FAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO: 17)

Secuencia de nucleótidos VH de 3H10 en formato FASTA

GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGT

CAAGT T GT CC T GCACAGC T TCTGGCTT CAACAT TAAAGAC TAC TATAT GCAC T

GGGTGAAAGAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCT

GAG GAT G G T GATAT T GAATAT GAC C C GAAG T T C CAG G G CAAG G C CAC TAT GAC

T G C AGAT AC AT C C T C C AAC AC AG CCTACCTGCAGTT C AG C AG C C T GAC AT C T G

AGGACACTGCCGTCTATTATTGTGTCACGGACTATGATTACGACGGAGGCTGG

TTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQID

NO: 89)

SECUENCIAS de 5G12:

Secuencia de aminoácidos VL de 5G12 en formato FASTA

DIKM TQ SPSSM Y ASLGERVTITCK ASQ DIN SYLSW FQ QK PGK SPKTLIY RA N R

LVD GV PSR FSG SG SG Q D Y SLTISSLEY ED M G IY Y C LQ Y D EFPY TFG G G TK LEI

KR(SEQ ID NO:7)

Secuencia de nucleótidos VL de 5G12 en formato FASTA

GAC AT C AAGAT GAC C C AG TCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAG GAGAGAG

AG T CAC TAT CAC T T G CAAG G C GAG T CAG GACAT TAATAG C TAT T TAAG C T G G T

T C CAG CAGAAACCAGGGAAATC T CC TAAGACCCTGATCTATCGTGCAAACAGA

TTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTA

T T C T C T CAC CAT CAGCAGCCT GGAGTAT GAAGATATGGGAATT TAT TAT T GT C

TACAG TAT GAT GAG T T T C C G TACAC G T T C G GAG G G G G GAC CAAG C T G GAAATA

AAA(SEQ ID NO:79)

Secuencia de aminoácidos VH de 5G12 en formato FASTA

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWITWVIQRPGQGLEWIGDIYC

GSDTMHYNEKFKNKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWWDYGSSY

DYFDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNO:18)

Secuencia de nucleótidos VH de 5G12 en formato FASTA

CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATAACCT

GGGTGATACAGAGGCCGGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTTATTGT

G G T AG T GAT AC T AT G CAC T AC AAT GAGAAG T T C AAGAAC AAG G C C AC AC T GAC

T GTAGACACAT C C T C C AG C AC AG C C T AC AT G C AG C T CAGCAGCC T GACAT C T G

AGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATGGTGGGACTACGGTAGTAGCTAC

GAC TAC T T T GAC TAC T GGGGC CAAGGCAC CAC T C T CACAGTCT CC T CA(SEQ

IDNO:90)

SECUENCIAS de 6F8:

Secuencia de aminoácidos VL de 6F8 en formato FASTA

D IV M TQ A A PSV PV T PG E SV SISC RSSK SL LH SN G N T Y LY W FL Q R PG Q SPQ LL I

YRMSNLASGVPDRFGGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGG

T K L E IK R(SEQ ID NO:8)

Secuencia de nucleótidos VL de 6F8 en formato FASTA

GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTC

AGTATCCATCTCCTGCAGG T C TAG TAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACA

CTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATA

TATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCGGTGGCAGTGG

G T CAGGAACT GC T T T CACAC T GAGAAT CAGTAGAGT GGAGGC T GAGGATG T GG

GTGTTTATTATTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTACACGTTCGGAGGGGGG

ACCAAGCTGGAAATAAAA(SEQIDNO:80)

Secuencia de aminoácidos VH de 6F8 en formato FASTA

QVQLKQSGPELVRPGASVKISCEASGYTFTDYYVNWVKQRPGRGLEWIGKIGP

GSVSIYYNEKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCASYYYGFAYW

GQGTLVTVSA(SEQ ID NO: 19)

Secuencia de nucleótidos VH de 6F8 en formato FASTA

CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGATATCCTGCGAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTGACTATTATGTAAACT

GGGTGAAGCAGAGGCCTGGACGGGGCCTTGAGTGGATTGGAAAGATTGGTCCT

G GAAGTGTTAGTATTTAC TACAAT GAGAAGT T CAAGGACAAGGCCACAC T GAC

TGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCGGCCTGACATCTG

AGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGTTATTACTACGGTTTTGCTTACTGG

GGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID N 0:91)

SECUENCIAS de 8C8:

Secuencia de aminoácidos VL de 8C8 en formato FASTA

D IV M TQ A A PSV PV T PG E SV SISC RSSK SL LH SN G N T Y LY W FL Q R PG Q SPQ LL I

YRMSNLASGVPDRFGGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGG

T K L E IK (SEQ ID NO:9)

Secuencia de nucleótidos VL de 8C8 en formato FASTA

GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTC

AGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACA

CTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATA

TATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCGGTGGCAGTGG

G T CAG GAAC T G C T T T CACAC T GAGAAT CAG TAGAG T G GAG G C T GAG GAT G T G G

GTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTACACGTTCGGAGGGGGG

AC CAAG C T G GAAAT AAAA (SEQ ID NO:81)

Secuencia de aminoácidos VH de 8C8 en formato FASTA

QVQLKQSGAELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYVNWVKQRPGQGLEWIGKIGP

ESVSIYYSEKFKAKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCASYYYGFAYW

GQGTLVTVSA (SEQ ID N O :20)

Secuencia de nucleótidos VH de 8C8 en formato FASTA

CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGATAT CC T GCAAGGC T T C TGGCTACACCTT CAC T GAC TAT TATGTAAACT

GGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAAAGATTGGTCCT

GAAAGTGTTAGTATTTAT TACAGT GAGAAGT T CAAGGCCAAGGCCACAC T GAC

T GCAGACAAAT CC T CCAGCACAGCC TACAT GCAAC T CAGCAGCCT GACAT C T G

AGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGTTATTACTACGGGTTTGCTTACTGG

GGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO:92)

Secuencia de aminoácidos VL de 8H8 en formato FASTA

Q AW TQESA LTTSPGETVTLTCR SSSG AV TTG NFA NW V QEK PDH LFTG LIGG T

NNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKL

TVL(SEQ ID NO: 10)

Secuencia de nucleótidos VL de 8H8 en formato FASTA

CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGT

CACACTCACTTGTCGCTCAAGTTCTGGGGCTGTTACAACTGGTAACTTTGCCA

AC T G G G T C CAAGAAAAAC CAGAT CAT T TAT T CAC T G G T C TAATAG G T G G TAC C

AACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGA

C AAG GCTGCCCT C AC C AT C AC AG G G G C AC AGAC T GAG GAT GAG G C AAT AT AT T

TCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTG

ACTGTCCTA(SEQIDNO:82)

Secuencia de aminoácidos VH de 8H8 en formato FASTA

EVQLLETGGGLVQPGGSRGLSCEGSGFTFSGFWMSWVRQTPGKTLEWIGDINS

DGSAINYAPSIKDRFTIFRDNDKNTLYLQMNNVRSEDTATYFCVRYDDYGYFD

VWGTGTTVTVSS(SEQIDNO:21)

Secuencia de nucleótidos VH de 8H8 en formato FASTA

GAAGTGCAGCTGTTGGAGACTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCGGGGGGGTCACG

GGGACTCTCTTGTGAAGGCTCAGGGTTCACTTTTAGTGGCTTCTGGATGAGCT

G G G T T C GACAGACAC C T G G GAAGAC C C T G GAG T G GAT T G GAGACAT TAAT T C T

GAT G G C AG T G C AAT AAAC TAC G C AC C AT C C AT AAAG GAT C GAT T C AC T AT C T T

C AGAGAC AAT GAC AAGAAC AC CCTGTACCTG C AGAT GAAC AAT GTGCGATCGG

AG GACACAG C CAC GTATTTCTGTGTGAGATAT GAT GAT TACGGGTAC T T CGAT

GTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:93)

SECUENCIAS de 9A5:

Secuencia de aminoácidos VL de 9A5 en formato FASTA

D W M T Q T P L T L S V T IG Q S A S IS C K S S Q S L L D S D G K T Y L N W L L Q R P G Q S P K R L I

YLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCW QGTHFPFTFGSG

T K L E IK(SEQ ID NO: 11)

Secuencia de nucleótidos VL de 9A5 en formato FASTA

GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAGTC

AGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGA

CATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATC

TATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T GAAAAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT T T G G

GAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGG

AC AAAG T T G GAAAT AAAA(SEQ ID NO:83)

Secuencia de aminoácidos VH de 9A5 en formato FASTA

HVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYGLIWVKQRTGQGLEWIGEIYP

RSGNTYYNEKFKGKATLTADISSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCASSSPHGDYW

GQGTTLTVSS(SEQIDNO:22)

Secuencia de nucleótidos VH de 9A5 en formato FASTA

CACGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGTTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTATGGTTTAATCT

G G G T GAAG CAGAGAAC T G GACAG G G C C T T GAG T G GAT T G GAGAGAT T TAT C C T

AGAAGT GGTAATAC T TAC TACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACAC T GAC

T G C AGAC AT AT C C T C C AG C AC AG C G T AC AT G GAG C T C C G C AG C C T GAC AT C T G

AGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGTTCCTCTCCTCACGGGGACTACTGG

GGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQIDNO:94)

SECUENCIAS de 10G9:

Secuencia de aminoácidos VL de 10G9 en formato FASTA

QAW TQESALTTSPGETVTLTCRSSTGA VTTSNY AN W V QEKPD HLFTGLIGG T

NNRAPGVPARFSGS LIGDKAALTITGAQTEDEAIYECALWYSNHWVEGGGTKL

TVL(SEQIDNO: 12)

Secuencia de nucleótidos VL de 10G9 en formato FASTA

CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGT

CACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCA

AC T G G G T C CAAGAAAAAC CAGAT CAT T TAT T CAC T G G T C TAATAG G T G G TAC C

AACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGA

CAAG GCTGCCCT CAC CAT CACAG G G G CACAGAC T GAG GAT GAG G CAATATAT T

TCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTG

ACTGTCCTA(SEQIDNO:84)

Secuencia de aminoácidos VH de 10G9 en formato FASTA

EVQLLETGGGLVQPGGSRGLSCEGSGFTFSDFWMSWVRQTPGKTLEWIGDINS

DGSAVNYAPSIKDQFTIFRDNDKRTLHLQMINVRSEDTATYFCVRYDDYGYFD

VWGTGTTVTVSS(SEQIDNO:23)

Secuencia de nucleótidos VH de 10G9 en formato FASTA

GAAGTGCAGCTGTTGGAGACTGGAGGAGGCTTAGTGCAACCTGGGGGGTCACG

GGGACTCTCTTGTGAAGGCTCAGGGTTCACTTTTAGTGACTTCTGGATGAGCT

G G G T T C GACAGACAC C T G G GAAGAC C C T G GAG T G GAT T G GAGACAT TAAT T C T

GAT G G CAG T G CAGT TAACTACGCACCAT CCATAAAGGATCAATT CAC TAT C T T

CAGAGACAAT GACAAGAG GAC C C T G CAC C T G CAGAT GAT CAAT GTTCGATCGG

AG GAC AC AG C CAC GTATTTCTGTGT G AG AT AT GAT GAT T AC G G G T AC T T C GAT

GTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQIDNO:95)SECUENCIAS DE 6A:

Secuencia de aminoácidos VL de 6A en formato FASTA

D V LM TQ TPLSLPV SLG D Q A SISC R SSQ SIV H SN G N TY LEW Y LQ K PG Q SPK LLI

Y KV SNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAG

TKLELK(SEQ ID NO:96)

Secuencia de nucleótidos VL de 6A en formato FASTA

GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCA

AGCCTCCATCTCTTGCAGATC TAGT CAGAGTAT T GTACATAGTAATGGAAACA

CCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATC

TACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T CAG GAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT C T G G

GAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGG

ACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID NO: 120)

Secuencia de aminoácidos VH de 6A en formato FASTA

EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGCIDP

ENGDTEYASKFQDKATITTDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTTYVGFAYWG

QGTLVTVST(SEQ ID NO: 108)

Secuencia de nucleótidos VH de 6A en formato FASTA

GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGT

CAAGT T GT CC T GCACAGC T TCTGGCTTTAACATTAAAGACGACTATAT GCAC T

GGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGCATTGATCCT

GAGAAT G G T GATAC T GAATAT G C C T C GAAAT T C CAG GACAAG G C CAC TATAAC

AACAGACACAT C C T C CAACACAG C C TAC C T G CAG C T CAG CAG C C T GACAT C T G

AGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTACATACGTTGGATTTGCTTACTGGGGC

CAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTACA(SEQ ID NO: 133) SECUENCIAS DE 28A:

Secuencia de aminoácidos VL de 28A en formato FASTA

D W M T Q T P L T L S IP IG Q P A S IS C K S S Q S L L D S D G K T Y L N W L L Q R P G Q S P K R L I

YLVSELDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCW QGTHFPFTFGSG

T K L E IK(SEQ ID NO:97)

Secuencia de nucleótidos VL de 28A en formato FASTA

GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGATTCCCATTGGACAACC

AGCCTCCATCTCTTGTAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGA

CATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTCATC

TATCTGGTGTCTGAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGG

AT CAGGGACAGAT T T CACAC T GAAAATCAGCAGAGT GGAGGC T GAAGATT T GG

GAGTTTATTATTGTTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGG

ACAAAGTTGGAAATAAAA(SEQ ID NO: 121)

Secuencia de aminoácidos VH de 28A en formato FASTA

QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFISYGITW VKQRTGQGLEW IGEIHP

RSGNTYYNENFKDRASLTADKSSSTAYMEVRSLTSEDSAVYFCARGGPGDYWG

QGTTLTVSS(SEQ ID NO: 109)

Secuencia de nucleótidos VH de 28A en formato FASTA

CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCATAAGCTATGGTATAACCT

G G G T GAAG C AGAGAAC T G GAC AG G G C C T T GAG T G GAT T G GAGAGAT T C AT C C T

AGAAGT GGTAATAC T TAC TACAATGAGAATT T CAAGGACAGGGCC T CAC T GAC

T G CAGACAAAT C C T C CAG CACAG C G TACAT G GAG G T C C G CAG C C T GACAT C T G

AGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGGGGTGGGCCGGGGGACTACTGGGGC

CAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO: 134)

SECUENCIAS DE 63A:

Secuencia de aminoácidos VL de 63A en formato FASTA

D W M T Q T P L T L S V T IG Q P A S IS C K S S Q S L L D S D G K T Y L N W L L Q R P G Q S P K R L I

YLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCW QGTHFPFTFGSG

T K L E IK(SEQ ID NO:98)

Secuencia de nucleótidos VL de 63A en formato FASTA

GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACC

AGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGA

CATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATC

TATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T GAAAAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT T T G G

GAGTTTATTATTGTTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGG

AC AAAG T T G GAAAT AAAA(SEQ ID NO: 122)

Secuencia de aminoácidos VH de 63A en formato FASTA

QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYGISWVKQRTGQGLEWIGQIYP

RSDNTYYNERFKGKATLTADKSSSTAYMALRSLTSEDSAVYFCAREGGPDYWG

QGTTLTVSS(SEQ ID NO: 110)

Secuencia de nucleótidos VH de 63A en formato FASTA

CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTATGGTATAAGCT

G G G T GAAG CAGAGAAC T G GACAG G G C C T T GAG T G GAT T G GACAGAT T TAT C C T

AGAAGT GACAATAC T TAC TACAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGGCCACAC T GAC

TGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCGTACATGGCGCTCCGCAGCCTGACATCTG

AGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGAGGGGGGTCCCGACTACTGGGGC

CAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO: 135)

SECUENCIAS DE 71A:

Secuencia de aminoácidos VL de 71A en formato FASTA

D V LM TQ TPLSLPV SLG D Q A SISC R SSQ SIV H SN G N TY LEW Y LQ K PG Q SPK LLI

Y KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAG

TKLELK(SEQ ID NO:99)

Secuencia de nucleótidos VL de 71A en formato FASTA

GACGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCA

AGCCTCCATCTCTTGCAGAT C TAG T CAGAGTAT T GTACATAGTAATGGAAACA

C C TAT T TAGAATGGTACC TACAGAAACCAGGCCAGT C T CCAAAGCTCCTGATC

TACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T CAAGAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT C T G G

GAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGG

ACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID NO: 123)

Secuencia de aminoácidos VH de 71A en formato FASTA

EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGCIDP

ENGDIEYASRFQGKATMTADTSSNTAYLQLTSLTSADTAVYYCTTYVGFGYWG

QGTLVTVSA(SEQ ID NO: 111)

Secuencia de nucleótidos VH de 71A en formato FASTA

GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGT

CAAGT T GT CC T GCACAGC T TCTGGCTTTAACATTAAAGACGACTATAT GCAC T

GGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGCATTGATCCT

GAGAAT G G T GATAT T GAATAT G C C T C GAG G T T C CAG G G CAAG G C CAC TAT GAC

AG CAGACACAT C C T C CAACACAG C C TAC C T G CAG C T CAC CAG C C T GACAT C T G

CGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTACATACGTTGGATTTGGTTACTGGGGC

CAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO: 136)

Secuencia de aminoácidos VL de 77A en formato FASTA

D V L M TQSPLSLPVSLG DQ ASISC R SSQN IV HSN GN TYLEW YLK KPG QSPK LLI

YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGM YYCFQGSHVPLTFGAG

TKLELK(SEQ ID NO: 100)

Secuencia de nucleótidos VL de 77A en formato FASTA

GATGTTTTGATGACCCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCA

AGCCTCCATCTCTTGCAGATC TAGT CAGAACATAGTACATAGTAAT GGTAACA

CCTATTTAGAATGGTACCTGAAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATC

TACAAAGTCTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T CAAGAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT C T G G

GAATGTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGAGCTGGG

ACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID NO: 124)

Secuencia de aminoácidos VH de 77A en formato FASTA

EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGCIDP

ENGDTEYASKFQGKATITADTSSNTVYLQLSSLTSEDTAVYYCTTYVGFGYWG

QGTLVTVSA(SEQ ID NO: 112)

Secuencia de nucleótidos VH de 77A en formato FASTA

GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGT

CAAGT T GT CC T GCACAGC T TCTGGCTTTAACATTAAAGACGACTATAT GCAC T

GGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGTATTGATCCT

GAGAAT G G T GATAC T GAATAT G C C T C GAAG T T C CAG G G CAAG G C CAC TATAAC

AG CAGACACAT C C T C CAACACAG T C TAC C T G CAG C T CAG CAG C C T GACAT C T G

AGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTACATACGTTGGATTTGGTTACTGGGGC

CAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO: 137) SECUENCIAS DE 80A:

Secuencia de aminoácidos VL de 80A en formato FASTA

DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSNQSLLNSGDQKNYLTWYQQKPGQPPKLL

IY W ASTR ESG V PD R FTG SG SG TD FTLTISSV Q A ED LA IY Y CQ N D Y SY PLTFG A

GTKLELK(SEQ ID NO: 101)

Secuencia de nucleótidos VL de 80A en formato FASTA

GACAT T G T GAT GACACAG TCTCCATCCTCCCT GAC T G T GACAG CAG GAGAGAA

G G T CAC TAT GAG C T G CAAG T C CAAT CAGAG T C T G T TAAACAG T G GAGATCAAA

AGAAC TAC T T GAC C T G G TAC CAG CAGAAAC CAG G G CAG C C T C C TAAAC TAT T G

ATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAG

T GGATC TGGAACAGATT T CAC T C T CACCAT CAGCAGT GT GCAGGC T GAAGACC

T G G CAAT TTATTACTGTCAGAATGAT TATAGT TAT CCAC T CACGTTCGGTGCT

GGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID NO: 125)

Secuencia de aminoácidos VH de 80A en formato FASTA

QVQLKQSGAELVRPGASVKLSCRASGYTFTDFYINWVKQRPGQGLEWIARIYP

GSDETYYNEKFKDKVTLTAEKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCALWFFDVWGT

GTTVTVSS(SEQ ID NO: 113)

Secuencia de nucleótidos VH de 80A en formato FASTA

CAGGTCCAACTGAAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGCTGTCCTGCAGGGCTTCTGGCTACACTTTCACTGACTTCTACATAAACT

GGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGCAAGGATTTATCCT

G GAAGT GAT GAGACT TAC TACAAT GAGAAGT T TAAGGACAAGGT CACAC T GAC

T G CAGAAAAAT CCTCCAGCACTGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCT GACAT C T G

AGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCCCTCTGGTTCTTCGATGTCTGGGGCACA

GGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO: 138)

SECUENCIAS DE 82B:

Secuencia de aminoácidos VL de 82B en formato FASTA

D W M T Q T P L T L S V T IG Q S A S IS C K S S Q S L L D S D G N T Y L N W L L Q R P G Q S P K R L I

YLVSELDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCW QGTHFPFTFGSG

T K L E IK(SEQ ID NO: 102)

Secuencia de nucleótidos VL de 82B en formato FASTA

GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACTATTGGACAATC

AGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCCTAGATAGTGATGGAAACA

CATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATC

TATTTGGTGTCTGAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T GAAAAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT T T G G

GAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGG

ACAAAGTTGGAAATAAAA(SEQ ID NO: 126)

Secuencia de aminoácidos VH de 82B en formato FASTA

QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSDGITWVKQRTGQGLEWIGQIHP

RSGNTYYNGKFKGKATLTADRSSSTTYMELRSLTSEDSAVYFCAKTGTGDYWG

QGTTLTVSS(SEQ ID NO: 114)

Secuencia de nucleótidos VH de 82B en formato FASTA

CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGTTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACACCTTCACAAGCGATGGTATTACCT

G G G T GAAG CAGAGAAC T G GACAG G G C C T T GAG T G GAT T G GACAGAT T CAT C C T

AGAAG T G G TAATAC C TAC TACAAT G G GAAG T T CAAG G G CAAG G C CACAC T GAC

T G CAGACAGAT C C T C CAG CACAAC G TACAT G GAAC T C C G CAG C C T GACAT C T G

AGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAAAACTGGGACGGGGGACTACTGGGGC

CAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO: 139)SECUENCIAS DE 83B:

Secuencia de aminoácidos VL de 83B en formato FASTA

EIQ M T Q SPSSM SA SL G D RITITC Q A T Q D IV K N L N W Y Q Q K PG K PPSFL IY Y A T E

L A E G V P S R F S G S G S G S D Y S L T IS N L E S E D F A D Y Y C L Q F Y E F P Y T F G G G T K L E I

K(SEQ ID NO: 103)

Secuencia de nucleótidos VL de 83B en formato FASTA

GAAATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTATGTCTGCATCTCTGGGAGACAG

AATAACCAT CAC T TGCCAGGCAACT CAAGACAT T GT TAAGAATT TAAACT GGT

AT CAG CAGAAACCAGGGAAACCCCCTTCATTCCTGATCTATTATGCAACT GAA

CTGGCAGAAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGTCAGACTA

TTCTCTGACAATCAGCAACCTGGAGTCTGAAGATTTTGCAGACTATTACTGTC

TACAGTTTTATGAATTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATA

AAA(SEQ ID NO: 127)

Secuencia de aminoácidos VH de 83B en formato FASTA

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYINP

NNGGTSYNQKFKDKATLTVNKSSSTAFMELRSLASEDSAVYYCARSDWEDCWG

QGTTLTVSS(SEQ ID NO:115)

Secuencia de nucleótidos VH de 82B en formato FASTA

GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGAT GT CC T GCAAGGC T T C T GGATACACAT T CAC T GAC TACAACAT GCAC T

G G G T GAAG CAGAG C CAT G GAAAGAG C C T T GAG T G GAT T G GATATAT TAAC C C T

AACAAT G G T G G TAC TAG C TACAAC CAGAAG T T CAAG GACAAG G C CACAT T GAC

TGTAAACAAGTCCTCCAGCACAGCCTTCATGGAGCTCCGCAGCCTGGCATCGG

AGGATTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGGTCTGACTGGGAAGACTGCTGGGGC

CAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO: 140)

SECUENCIAS DE 92A:

Secuencia de aminoácidos VL de 92A en formato FASTA

Q IV L T Q S P A IM S A S L G E E IT L IC S A S S S V SY M H W Y Q Q K S G T S P K L L IY R T S N L

A SGV PSRFSG SGSG TFYSLTISSVEAEDAADYYCHQW SSW TFGGGTQLEIK

(SEQ ID NO: 104)

Secuencia de nucleótidos VL de 92A en formato FASTA

CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAGGA

GAT CAC CCTAATTTGCAG T G C CAGC T C GAG T G TAAGT TACAT GCAC T GGTACC

AG CAGAAGT CAGGCAC T T C T CCCAAACTCTTGATTTATCGCACAT CCAACC T G

GCTTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTTTTATTC

TCTTACAATCAGCAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCGATTATTACTGCCATC

AGTGGAGTAGTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCCAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID

NO: 128)

Secuencia de aminoácidos VH de 92A en formato FASTA

DVQLQESGPGLVKFSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYIR

H D G SN N Y N PSL K N R ISIT R D T SK N Q FFL K L N SV ITE D TA T Y Y C V R EIY D G SSG

YFDVWGTGTTVTVSS(SEQ ID NO: 116)

Secuencia de nucleótidos VH de 92A en formato FASTA

GATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAATTTTCTCAGTCTCT

GTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATTACTGGA

AC T G GAT C C G G CAG T T T C CAG GAAACAAAC T G GAAT G GAT G G G C TACATAAGA

CAC GAT G G TAG CAATAACTACAACCCGTCTCT CAAAAATCGAAT C T CCAT CAC

TCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGATTACTG

AG GACACAG C CACATAT TAC T G T G TAAGAGAGATCTATGATGGTTCCTCCGGG

TACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID

NO:141)

SECUENCIAS DE 93B:

Secuencia de aminoácidos VL de 93B en formato FASTA

DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLL

IY W A ST R E SG V PDR FTGSG SGTD FTLTISN VQ PED LAV YY C QN DY SFPFTFG S

GTELEMK(SEQ ID NO: 105)

Secuencia de nucleótidos VL de 93B en formato FASTA

GACAT T G T GAT GACACAG TCTCCATCCTCCCT GAC T G T GACAG CAG GAGAGAA

G G T CAC TAT GAG C T G CAAGT CCAGT CAGAGT C T GT TAAACAGT GGAAATCAAA

AGAATTAC T T GAC C T GGTAC CAGCAGAAACCAGGACAGC C T CC TAAAC T GT T G

ATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAG

T GGATC T GGAACAGATT T CAC T C T CACCAT TAGCAATG T GCAGCCT GAAGACC

TGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTTTCCATTCACGTTCGGCTCG

G G GAC AG AG T T G GAAAT GAAA(SEQ ID NO: 129)

Secuencia de aminoácidos VH de 93B en formato FASTA

QVQLKQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYYINWVKQRPGQGLEWIARIYP

GNGNTDYNEKFKDKATLTAEKSSTTAYIQLSSLTSEDSAVYFCCLWYFDVWGT

GTTVTVSS(SEQ ID NO: 117)

Secuencia de nucleótidos VH de 93B en formato FASTA

CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACTTTCACTGACTACTATATAAACT

GGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGCAAGGATTTATCCT

G GAAATGGTAATACT GAC TACAAT GAGAAGT T CAAGGACAAGGCCACAC T GAC

T G CAGAAAAATCC T C CACCAC T GCC TACATACAACT CAGCAGT C T GACAT C T G

AGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTTGCCTCTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACA

GGAACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO: 142)

SECUENCIAS DE 99B:

Secuencia de aminoácidos VL de 99B en formato FASTA

D W M T Q T P L T L S V T IG Q P A S IS C K S S Q S L L D S D G K T Y L N W L L Q R P G Q S P K R L I

YLVSKLD SGV PDRFTGSG SGTD FTLK ISRVEAED LG IY YCW Q GTHFPFTFG SG

<T K L E IK>(SEQ ID NO: 106)

Secuencia de nucleótidos VL de 99B en formato FASTA

GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACC

AGCCTCCATCTCTTGCAAGT CAAGT CAGAGCC T C T TAGATAGT GAT GGAAAGA

CATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATC

TATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGG

AT CAGGGACAGATT T CACAC T GAAAATCAGCAGAGT GGAGGC T GAGGATT T GG

GAATTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGG

ACAAAGTTGGAAATAAAA(SEQ ID NO: 130)

Secuencia de aminoácidos VH de 99B en formato FASTA

QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSDGITWLKQRTGQGLEWIGQIHP

RSGNTYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCAKTGTGDYWG

QGTTLTVSS(SEQ ID NO: 118)

Secuencia de nucleótidos VH de 99B en formato FASTA

CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGT

GAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACACCTTCACAAGCGACGGTATAACCT

G GC TGAAACAGAGAAC TGGACAGGGCCTT GAGTGGATTGGACAGATT CAT CC T

AGAAGT GGTAATAC C TAC TACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACAC T GAC

T G CAGACAAAT C C T C CAG CACAG C G TACAT G GAAC T C C G CAG C C T GACAT C T G

AGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAAAACTGGGACGGGGGACTACTGGGGC

CAAG G CAC CAC T C T C AC AG T C T C C T C A(SEQ ID NO: 143)

Secuencia de aminoácidos VL de 104B en formato FASTA

D W M T Q T P L T L S V T IG Q P A S IS C K S S L S L L D S D G K T Y L N W L L Q R P G Q S P K R L I

Y LV SKLD SG V PD R FTG SG SG TD FTLK IIR V EA ED LG IY Y CW Q G TH FPFTFG SG

TKLEVK(SEQ ID NO: 107)

Secuencia de nucleótidos VL de 104B en formato FASTA

GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACC

AGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCTGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGA

CATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATC

TATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGG

AT C AG G GAC AGAT T T C AC AC T GAAAAT C AT C AGAG T G GAG G C T GAG GAT T T G G

GAATTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGG

ACAAAGTTGGAAGTAAAA(SEQ ID NO: 131)

Secuencia de aminoácidos VH de 104B en formato FASTA

QVQLQQSGPELARPGASVKLSCKASGYTFTSYGISWVKQRTGQGLEWIGQIHP

RSGNTYYNENFKGKATLTAAKSSSTAYLELRSLTSEDSAVYFCAREGGPDYWG

QGTTLTVSS(SEQ ID NO: 119)

Secuencia de nucleótidos VH de 104B en formato FASTA

CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGCCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCCTCAGT

GAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGCTATGGTATAAGCT

G G G T GAAG CAAAGAAC T G GACAG G G C C T T GAG T G GAT T G GACAGAT T CAT C C T

AGAAGT GGTAATAC T TAC TACAATGAGAAC T T CAAGGGCAAGGCCACACT GAC

TGCAGCCAAATCCTCCAGCACAGCGTACCTGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTG

AGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGAGGGGGGTCCCGACTACTGGGGC

CAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO: 144) SECUENCIAS DE 105A:

Secuencia de aminoácidos VL de 105A en formato FASTA

D V LM TQ TPLSLPV SLG D Q A SISC R SSQ SIV H SN G N TY LEW Y LQ K PG Q SPK LLI

Y KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAG

TKLELK(SEQ ID NO:99)

Secuencia de nucleótidos VL de 105A en formato FASTA

GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCA

AGCCTCCATCTCTTGCAGAT C TAG T CAGAG TAT T G TACATAG TAATGGAAACA

C C TAT T TAGAATGGTACC TACAGAAACCAGGCCAGT C T CCAAAGCTCCTGATC

TACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGG

AT CAG G GACAGAT T T CACAC T CAAGAT CAG CAGAG T G GAG G C T GAG GAT C T G G

GAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGG

ACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID NO: 132)

Secuencia de aminoácidos VH de 105A en formato FASTA

EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGCIDP

ENGDIEYASRFQGKATMTADTSSNTAYLQLTSLTSADTAVYYCTTYVGFGYWG

QGTLVTVSA(SEQ ID NO: 111)

Secuencia de nucleótidos VH de 105A en formato FASTA

GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGT

CAAGT T GT CC T GCACAGC T TCTGGCTTTAACATTAAAGACGAC TATAT GCAC T

GGGTGAAACAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGCATTGATCCT

GAGAAT G G T GATAT T GAATAT G C C T C GAG G T T C CAG G G CAAG G C CAC TAT GAC

AG CAGACACAT C C T C CAACACAG C C TAC C T G CAG C T CAC CAG C C T GACAT C T G

CGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTACATACGTTGGATTTGGTTACTGGGGC

CAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO: 145)

Ejemplo 2: Los anticuerpos anti huS15 se unen a células que expresan S15 humana o S15 de ratón Materiales y métodos

Se transdujeron líneas celulares tumorales 293T humanas y CRC MC38 de ratón con un lentivector que portaba Siglec 15 humana o Siglec 15 de ratón. Las células se clasificaron para establecer líneas celulares estables de S15 humana y S15 de ratón. Se suspendieron de nuevo células estables 293T.hS15 y MC38.mS15 en tampón FACS y se bloquearon los receptores Fc antes de la incubación con mAb Siglec-15 purificados. Se dividieron en alícuotas 1E05 células en 100 pl de tampón FACS en tubos separados y se añadió 1 pg de mAb purificado. Las células se incubaron a 4 grados C durante 30 minutos, a continuación se lavaron dos veces con exceso de tampón FACS. Las células se suspendieron de nuevo en 100 pl de tampón FACS y se añadieron a las muestras 0,005 pg de anticuerpo secundario anti IgG de ratón-PE, se incubaron durante 30 minutos y se lavaron dos veces con exceso de tampón FACS. Las células se fijaron en tampón de fijación y posteriormente se analizaron mediante citometría de flujo. El ensayo se ilustra en la figura 4A.

Resultados

Los anticuerpos anti huS15 que incluían 1B2, 1C3, 1C12, 1H3, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9 (figura 4B) y 6A (NC6), 28A (NC28), 63A (NC63), 71A (NC71), NC74, 77A (NC77), 80A (NC80), 82B (NC82), 83B (NC83), NC87, 92A (NC92), 93B (NC93), 99B (NC99), 104B (NC104), 105A (NC105) (figura 4C) se ensayaron para determinar la unión a células que expresan S15 humana o s 15 de ratón. Los resultados se ilustran en las figuras 4B-4C.

Los anticuerpos anti huS15 que incluían 1B2, 1C3, 1C12, 1H3, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9 y 6A (NC6), 28A (NC28), 63A (NC63), 77A (NC77), 80A (NC80), 82B (NC82), 83B (NC83), 92A (NC92), 93B (NC93), 99B (NC99), 104B (NC104) o 105A (NC105), también se ensayaron para determinar la unión a células fijadas en formalina. Los resultados se muestran en la figura 4D.

Ejemplo 3: Los anticuerpos purificados se unen a Siglec-15 de ratón y humana

Materiales y métodos

• Células 293T transfectadas de manera transitoria con S15-TM (Operetta)

• Células K562 transfectadas de manera transitoria con S15-TM (<f>A<c>S)

Se transfectaron de manera transitoria células 293T con ADN de plásmido Siglec-15 murino usando el sistema Lipofectamine, y se transfectaron células K562 con ADN de plásmido Siglec-15 humana mediante electroporación. Se dividieron en alícuotas de 1e5 células transfectadas en 100 ul de tampón FACS (PBS que contenía suero al 0,5 %) en tubos separados y se añadió 1 ug de mAb purificado. Las células se incubaron a 4 grados C durante 30 minutos, a continuación se lavaron dos veces con exceso de tampón FACS. Las células se suspendieron de nuevo en 100 ul de tampón FACS y se añadieron a las muestras 0,005 ug de anticuerpo secundario anti IgG de ratón-PE, se incubaron durante 30 minutos y se lavaron dos veces con exceso de tampón FACS. Las células se fijaron en tampón de fijación (formaldehído al 2 % en PBS) y posteriormente se analizaron mediante citometría de flujo.

Se suspendieron de nuevo células U87 en tampón FACS y se bloquearon los receptores Fc antes de la incubación con mAb Siglec-15 purificados. Se dividieron en alícuotas de células 1e5 en 100 ul de tampón FACS en tubos separados y se añadió 1 ug de mAb purificado. Las células se incubaron a 4 grados C durante 30 minutos, a continuación se lavaron dos veces con exceso de tampón FACS. Las células se suspendieron de nuevo en 100 ul de tampón FACS y se añadieron a las muestras 0,005 ug de anticuerpo secundario anti IgG de ratón-PE, se incubaron durante 30 minutos y se lavaron dos veces con exceso de tampón FACS. Las células se fijaron en tampón de fijación y posteriormente se analizaron mediante citometría de flujo.

Resultados

Se ensayó la unión de los anticuerpos purificados 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5 y 10G9 a Siglec-15 de ratón (mS15) expresada por células 293T (un derivado altamente transfectable de células de riñón embrionario 293) y a Siglec-15 humana (hS15) expresada por células K-562 (el derrame pleural de una mujer de 53 años con leucemia mielógena crónica en crisis blásticas terminales). Los resultados se ilustran en las figuras 5A-5C.

También se ensayaron los anticuerpos purificados 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5, 10G9 y 5F10 para determinar la unión a células de glioma U87 humano, que expresan de forma endógena Siglec-15 humana (hS15). Los resultados se ilustran en las figuras 6A-6C, que muestran el porcentaje de células hS15+ (figuras 6A y 6C) y la intensidad de fluorescencia media (MFI) (figura 6B), respectivamente para cada anticuerpo.

Ejemplo 4: Los anticuerpos anti Siglec-15 pueden bloquear la función de Siglec-15

Materiales y métodos

Fabricación de hS15.hG1

Se preparó una proteína de fusión monomérica S15 que incluía un dominio extracelular S15 completo fusionado a la cadena principal de IgG para los análisis de afinidad y competencia. Se subclonó un ADNc de hS15.hFc escindible con trombina en pEE17.4. Se observan proteínas de fusión fragmentadas en células CHO transfectadas de manera transitoria pero no en células 293 a 37 °C. La proteína de fusión intacta se expresa más eficientemente a 31 °C.

La proteína de fusión tiene la secuencia:

KEiÑSVIVF'LFFLSVVTGVHSFVRTKIDTTENLLNTEVHSSPAQRWSMQVPPEVS

AEAGDAAVLPCTFTHPHRHYDGPLTAIWRAGEPYAGPQVFRCAAARGSELCQT

ALSLHGRFRLLGNPRRNDLSLRVERLALADDRRYFCRVEFAGDVHDRYESRHG

VRLHVTAAPRIVNISVLPSPAHAFRALCTAEGEPPPALAWSGPALGNSLAAVR

SPREGHGHLVTAELPALTHDGRYTCTAANSLGRSEASVYLFRFHGASCF'\THT

CPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWY

VDGVE VHNAKTKPREE QYNS T YRWS VL TVLHQDW LNGKE YKCKVSNKAL PAS

IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT

QKSLSLSPG (SEQ ID NO: 193).

Una proteína de fusión madura, con la secuencia de señal escindida, es:

FVRTKIDTTENLLNTEVHSSPAQKWSMQVPPEVSAEAGDAAVLPCTFTHPHRH

YDGPLTAIWRAGEPYAGPQVFRCAAARGSELCQTALSLHGRFRLLGNPRRNDL

SLRVERLALADDRRYFCRVEFAGDVHDRYESRHGVRLHVTAAPRIVNISVLPS

PAHAFRALCTAEGEPPPALAWSGPALGNSLAAVRSPREGHGHLVTAELPALTH

DGR YTCTAANSL GRSEASVYLFRFHGASGDKTHJCPPCPA'PEFEGGPSVFL FP

PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN

STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAglEKTISKAKGQPREPQVYT

LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS

FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID

NO: 194)

Una secuencia líder murina se ilustra subrayada. Un dominio extracelular (ECD) de Siglec-15 está en cursiva. Una región bisagra está doblemente subrayada. La secuencia restante se obtiene de Fc de IgG1. Las mutaciones L234F/L235E/P331S en el dominio Fc de IgG1 están en negrita y subrayadas con puntos.

Análisis de bloqueo

Se establecieron células 293T.LRRC4C mediante 2 rondas de transducción Lenti-LRRC4C.

Se suspendieron de nuevo células estables 293T.LRRC4C en tampón FACS y se bloquearon los receptores Fc antes de la incubación. Se dividieron en alícuotas 1E05 células en 100 pl de tampón FACS en tubos separados y primero se añadieron 2 pg de mAb purificado, seguido de la adición de 0,2 ug de hSiglec-15hFc. Las células se incubaron a 4 grados C durante 30 minutos, a continuación se lavaron dos veces con exceso de tampón FACS. Las células se suspendieron de nuevo en 100 pl de tampón FACS y se añadieron a las muestras 0,005 pg de anticuerpo secundario anti IgG humana-PE, se incubaron durante 30 minutos y se lavaron dos veces con exceso de tampón FACS. Las células se fijaron en tampón de fijación y posteriormente se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la unión de Siglec-15 a LRRC4C.

1 pg/ml de hS15.hG1 100 pl de sup o 33 pg/ml de Cl#3, #1

El ensayo se ilustra en la figura 7A.

Resultados

Los resultados se ilustran en la figura 7B-7E.

•Los bloqueadores completos de la interacción S15/LRRC4C incluyen, pero sin limitación:

° 5G12, 6F8, 8C8, 1C3, 1C12, 3H10, 1B2

•Los bloqueadores parciales incluyen, pero sin limitación:

° 10G9, 8H8, 9A5

Ejemplo 5: mAb S15 invierte la supresión de linfocitos T humanos mediada por hS15.hG1

Materiales y métodos

Ensayo de proliferación de PBMC

• Anti CD3 recubierto a razón de 0,05 pg/ml

• PBMC humanas totales /- 5 pg/ml de hS15.hFc y12 ua/ml demAb Siglec-15, o controles como se indica Se recubrió anti CD3 humano (clon OKT3) a razón de 0,03 pg/ml en 100 pl de PBS por pocillo de una placa de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos durante la noche a 4 grados C. Se aspiraron PBS y CD3 no unido inmediatamente antes de la adición de componentes para el ensayo. Se marcaron PBMC totales de un donante humano sano con CFSE 5 pM durante 10 minutos en medio completo RPMI (que contenía FBS al 10 %) a 37 grados C y se lavaron 2 veces antes de la resuspensión para su adición a los pocillos a una concentración de 2,5E05 células/pocillo. Se añadió hSiglec-15hFc soluble o controles a los pocillos a una concentración final de 5 pg/ml, mientras que se agregaron mAb Siglec-15 purificados o controles a los pocillos a una concentración final de 12 pg/ml. Las placas se incubaron en una incubadora de CO2 a 37 grados C durante 72 horas. Después de retirar una pequeña cantidad de sobrenadante para el análisis de citocinas, las células se transfirieron a una placa de fondo redondo, los receptores Fc se bloquearon y las células se tiñeron con mAb fluorescentes CD4 y CD8 durante 30 minutos a 4 grados C. Las células se lavaron dos veces en tampón FACS, seguida de fijación para el análisis por citometría de flujo. Los niveles de IFNgamma en el sobrenadante acondicionado se evaluaron mediante el kit MSD ELISA.

Los ensayos se ilustran en las figuras 8A y 9A.

Resultados

Los anticuerpos purificados 1B2, 1C3, 1H3, 1C12, 3H10, 5G12, 6F8, 8C8, 8H8, 9A5 y 10G9 se ensayaron en un ensayo de proliferación de PBMC (figuras 8B, 8C, 8D y 8E), y 6A (NC6), 28A (NC28), 63A (NC63), 77A (NC77), 80A (NC80), 82B (NC82), 83B (NC83), 92A (NC92), 93B (NC93), 99B (NC99), 104B (NC104), 105A (NC105) (figuras 8F y 8G). Los linfocitos T CD4+ y CD8+ se seleccionaron y s analizaron para determinar la dilución de CFSE como medida de la división celular (proliferación). Una mayor dilución indicó una mayor proliferación celular. Los resultados muestran que determinados mAb S15 pueden revertir la supresión de linfocitos T humanos mediada por hS15.hG1.

Sin embargo, el bloqueo de la interacción hS15 y LRRC4C no se correlaciona con la mejora de la función de los linfocitos T. Los resultados se muestran en las figuras 8H y 8I.

También se identificaron mAb S15 que invierten la reducción mediada por hS15.hG1 de la producción de IFN<y>en linfocitos T humanos. Los resultados se ilustran en la figura 9B.

Ejemplo 6: Los mAb S15 pueden bloquear la formación de osteoclastos

Materiales y métodos

Se aislaron PBMC frescas y se enriquecieron para monocitos de 2 maneras:

Clasificación de columnas MACS (figura 10, panel izquierdo); o

Fijación al plástico en medios sin suero (figura 10, panel derecho).

Las células se cultivaron con M-CSF y RANKL durante 8 días con mAb 25E9 o S15 y se ensayaron para determinar TRAP (fosfatasa ácida resistente a tartrato)

Resultados

Los resultados, ilustrados en la figura 15, muestran que los mAb S15 pueden bloquear la formación de osteoclastos.

Ejemplo 7: Anticuerpos 5G12 humanizados

El clon 5G12 se humanizó proporcionando tres cadenas pesadas humanizadas y cinco cadenas ligeras humanizadas (figuras 12A y 12B).

5G12 hVL1

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYR

ANRLVDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGG

GTKVEIK (SEQ ID NO 219)

CDR1 de 5G12 hVL1

KASQDINSYLS (SEQ ID NO:28)

CDR2 de 5G12 hVL1

RANRLVD (SEQ ID NO:36)

CDR3 de 5G12 hVL1

LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43)

5G12 hVL2

d iq m t q s p s s l s a s v g d r v t it c k a s q d in t y l s w f q q k p g k a p k t l iy r

ANRLVDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGG

GTKVEIK (SEQ ID NO 195)

CDR1 de 5G12 hVL2

KASQDINTYLS (SEQ ID NO:196)

CDR2 de 5G12 hVL2

RANRLVD (SEQ ID NO:36)

CDR3 de 5G12 hVL2

LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43)

5G12 hVL3

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINVYLSWFQQKPGKAPKTLIYR

ANRLVDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGG

GTKVEIK (SEQ ID NO: 197)

CDR1 de 5G12hVL3

KASQDINVYLS (SEQ ID NO:198)

CDR2 de 5G12 hVL3

RANRLVD (SEQ ID NO:36)

CDR3 de 5G12 hVL3

LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43)

5G12 hVL4

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDIQSYLSWFQQKPGKAPKTLIYR

ANRLVDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGG

GTKVEIK (SEQ ID NO 199)

CDR1 de 5G12 hVL4

KASQDIQSYLS (SEQ ID NO:200)

CDR2 de 5G12 hVL4

RANRLVD (SEQ ID NO:36)

CDR3 de 5G12 hVL4

LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43)

5G12 hVL5

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINVYLSWFQQKPGKAPKTLIYR

ANRLTSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGG

GTKVEIK (SEQ ID NO 201)

CDR1 de 5G12hVL5

KASQDINVYLS (SEQ ID NO:198)

CDR2 de 5G12 hVL5

RANRLTS (SEQ ID NO:202)

CDR3 de 5G12 hVL5

LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43)

5G12hVH1

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQAPGQGLEW

MGDIYSGSDTMHYAEKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSLDTAVYY

CARWWDYGSSYDYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 203)

CDR1 de 5G12hVH1

SYWIT (SEQ ID NO:204)

CDR2de 5G12 hVH1

DIYSGSDTMHYAEKFQG (SEQ ID NO:205)

CDR3de 5G12 hVH1

WWDYGSSYDYFDY (SEQ ID NO:71)

5G12hVH2

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ARWWDYGSSYDYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 206)

CDR1 de hVH2

SYWIT (SEQ ID NO:204)

CDR2de hVH2

DIYSGSDTTHYAEKFQG (SEQ ID NO:371)

CDR3de hVH2

WWDYGSSYDYFDY (SEQ ID NO:71)

5G12hVH3

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MGDIYSGSDTTHYAEKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC

ARWWDYGSSYDYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 207)

CDR1de 5G12hVH3

SYWIS (SEQ ID NO:208)

CDR2de 5G12 hVH3

DIYSGSDTTHYAEKFQG (SEQ ID NO:374)

CDR3de 5G12 hVH3

WWDYGSSYDYFDY (SEQ ID NO:71)

Ejemplo 8: La S15 unida a membrana es inmunosupresora.

Materiales y métodos

Método para el ensayo de supresión de linfocitos T de PMBCin vitro:

Se recogieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de productos ricos en leucocitos derivados de aféresis de donantes sanos (KeyBiologics, Memphis, TN) usando un procedimiento de gradiente de ficoll estándar seguido de criopreservación. El día del ensayo, las PBMC congeladas se descongelaron, se lavaron con medio completo RPMI (RPMI-C, RPMI [ThermoFisher] suero FetalClone III al 10 % [HyClone]) y se contaron. Las células se marcaron con CFSE 5 pM (ThermoFisher) en RPMI-C durante 10 minutos a 37 °C, seguido de dos lavados con RPMI-C. Las PMBC totales (3E05 células/pocillo) se sembraron en placas Corning Costar de fondo plano de 96 pocillos que se recubrieron previamente con anti CD3 humano (OKT3, 50 ng/ml; eBioScience) durante una noche a 4 °C. Se añadió la proteína de fusión Siglec-15 hG1 Fc a los pocillos en las concentraciones finales como se indica. Las células se cultivaron durante 72 horas a 37 °C. A las 72 horas, se recogieron 50 pl de sobrenadante de los pocillos y se congelaron inmediatamente para el análisis de los niveles de citocinas. A continuación, las células se recogieron de cada pocillo mediante pipeteo y se transfirieron a una placa de fondo redondo para su tinción y análisis por citometría de flujo. Los receptores Fc se bloquearon con T ruStain FcX (2 pl/pocillo; Biolegend), seguido de tinción con anticuerpos contra CD4 APC-eFluor 780 (2 pl/pocillo; ThermoFisher) y CD8 eFluor 450 (2 pl/pocillo; ThermoFisher) durante una hora a 4 °C. Después de la incubación, las placas se lavaron dos veces con tampón FACS (PBS que contenía suero FetalClone III al 1 %). Las células se suspendieron de nuevo en 150 pl de tampón fijador (formaldehído al 3 % en PBS) y se analizaron con un citómetro de flujo YETI (Propel Labs). Los datos se analizaron con FlowJo. Los datos se muestran como porcentaje de células que se dividen según la dilución de CFSE en comparación con los linfocitos T CD4+ y CD8+ no estimulados. Los sobrenadantes se analizaron con el kit U-PLEX (Meso Scale Diagnostics [MSD)]) para determinar IFN-y, TNF-a e IL-6 según las instrucciones. U-PLEX se leyó usando un instrumento Meso QuickPlex SQ 120.

Resultados

La S15 unida a membrana es inmunosupresora. La figura 14A es un gráfico de líneas del % de proliferación de linfocitos T frente a S15 Fc humano (pg/ml) que muestra que el % de proliferación de linfocitos T se reduce a medida que aumenta la concentración de S15 Fc. Se marcaron PBMA humanas con CFSE, se añadieron a placas de 96 pocillos recubiertas con anti CD3 (OKT3) y se cultivaron durante 3 días con proteína de fusión S15 Fc humana a las concentraciones indicadas. La figura 14B es un gráfico de barras de pg/ml de IFN-y en sobrenadantes condicionados de células tratadas con 0 o 5 pg/ml de S15 Fc. La figura 14C es un gráfico de barras de pg/ml de TNF-a en sobrenadantes condicionados de células tratadas con 0 o 5 pg/ml de S15 Fc. La figura 14D es un gráfico de barras de pg/ml de IL-6 en sobrenadantes condicionados de células tratadas con 0 o 5 pg/ml de S15 Fc.

Ejemplo 9: Unión de mAb s15 purificado a partir de hibridoma a células que expresan S15 humana o s15 de ratón.

Materiales y métodos

Se recogieron células 293T que expresaban de manera estable S15 humana (293T.hS15) y células MC38 de ratón que expresaban de manera estable S15 de ratón (MC38.mS15) a partir de cultivo tisular. Después de un lavado con PBS, las células se sembraron en una placa con fondo en U de 96 pocillos (5E04 células/pocillo) para su tinción. Las células se mezclaron primero con 1 pg de los anticuerpos indicados purificados a partir de hibridomas de ratón en tampón de tinción FACs (PBS que contenía suero FetalClone III al 1 %) y se incubaron durante 30 min en hielo. A continuación, las células se lavaron una vez con tampón FACS seguido de una incubación con anticuerpo anti Ig de ratón conjugado con PE (eBioscience) durante 30 min en hielo. Las células se lavaron una vez con tampón FACS y se suspendieron de nuevo en 100 pl de tampón FACS antes de analizarlas con un citómetro de flujo YETI (Propel Labs). Los datos se analizaron con FlowJo. Los datos se muestran como porcentaje de células que son positivas para PE en una población celular total seleccionada por dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC).

Resultados

Las figuras 15A y 15B muestran el porcentaje de células positivas para la unión de mAb S15 purificado a partir de hibridoma a células que expresan S15 humana o S15 de ratón. La unión se evaluó mediante análisis FACS de células incubadas con los anticuerpos indicados seguido de incubación con anticuerpo anti Ig de ratón conjugado con PE. Las células se analizaron para determinar las poblaciones de PE+ mediante FACS.

E jem p lo 10: L o s m A b S 15 p u r if ic a d o s d e h ib r id o m a s in v ie rten la s u p r e s ió n m e d ia d a p o r S 15 u n id a a m e m b ra n a .

Materiales y métodos

Método para ensayar la reversión de la supresión mediada por Siglec-15 Fc con mAb Siglec-15 en el ensayo de proliferación de linfocitos T de PBMC totales:

Igual que la figura 14 anterior, con cambios menores:

Se recogieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de productos ricos en leucocitos derivados de aféresis de donantes sanos (KeyBiologics, Memphis, TN) usando un procedimiento de gradiente de ficoll estándar seguido de criopreservación. El día del ensayo, las PBMC congeladas se descongelaron, se lavaron con medio completo RPMI (RPMI-C, RPMI [ThermoFisher] suero FetalClone III al 10 % [HyClone]) y se contaron. Las células se marcaron con CFSE 5 pM (ThermoFisher) en RPMI-C durante 10 minutos a 37 °C, seguido de dos lavados con RPMI-C. Las PMBC totales (3E05 células/pocillo) se sembraron en placas Corning Costar de fondo plano de 96 pocillos que se recubrieron previamente con anti CD3 humano (OKT3, 50 ng/ml; eBioScience) durante una noche a 4 °C. Se añadió proteína de fusión Siglec-15 hG1 a los pocillos a razón de 5 pg/ml (concentración final). A continuación se añadieron los mAb Siglec-15 indicados a los pocillos indicados a razón de 12 pg/ml (concentración final). Las células se cultivaron durante 72 horas a 37 °C. A las 72 horas, se recogieron 50 pl de sobrenadante de los pocillos y se congelaron inmediatamente para el análisis de los niveles de citocinas. A continuación, las células se recogieron de cada pocillo mediante pipeteo y se transfirieron a una placa de fondo redondo para su tinción y análisis por citometría de flujo. Los receptores Fc se bloquearon con TruStain FcX (2 pl/pocillo; Biolegend), seguido de tinción con anticuerpos contra CD4 APC-eFluor 780 (2 pl/pocillo; ThermoFisher) y CD8 eFluor 450 (2 pl/pocillo; ThermoFisher) durante una hora a 4 °C. Después de la incubación, las placas se lavaron dos veces con tampón FACS (PBS que contenía suero FetalClone III al 1 %). Las células se suspendieron de nuevo en 150 pl de tampón fijador (formaldehído al 3 % en PBS) y se analizaron con un citómetro de flujo YETI (Propel Labs). Los datos se analizaron con FlowJo. Los datos se muestran como porcentaje de células que se dividen según la dilución de CFSE en comparación con los linfocitos T CD4+ y CD8+ no estimulados. Los sobrenadantes se analizaron con el kit U-PLEX (Meso Scale Diagnostics [MSD)]) para determinar IFN-y, TNF-a e IL-6 según las instrucciones. U-PLEX se leyó usando un instrumento Meso QuickPlex SQ 120.

Resultados

Las figuras 16A y 16B son gráficos de barras del porcentaje de linfocitos T CD8+ divididos tratados con los anticuerpos indicados. Las figuras 16C y 16D son gráficos de barras del porcentaje de linfocitos T CD4+ divididos tratados con los anticuerpos indicados.

E jem p lo 11: B io ac tiv id adin vivod e 5G 12 p u rif ic a d o e n t r e s m o d e lo s d e tu m o r.

Materiales y métodos

Métodos para modelos de tumorin vivo:

Modelo de tumor colorrectal

Figura 17A: Se inyectaron por vía subcutánea células tumorales MC38 (ATCC) transducidas y clasificadas para la sobreexpresión de Siglec-15 a razón de 2E05 células en 100 pl en el costado derecho afeitado de ratones C57BL/6N (Charles River). A cinco ratones/grupo de tratamiento se les administraron 200 pg de IgG de control (Innovative Research) o el clon 5G12 anti Siglec-15 sin endotoxinas purificado comenzando seis días después de la inyección del tumor. Los tratamientos continuaron cada cuatro días hasta un total de cuatro dosis. Los tumores se midieron 3 veces por semana. El volumen tumoral se calculó como (largo x anchoA2)*0,5. Los ratones se sacrificaron cuando el tumor alcanzó 2000 mm3. ;;Modelo de tumor de linfoma;;Figura 17B: Las células tumorales EG7 (ATCC) son células tumorales EL4 transfectadas para expresar ovoalbúmina de huevo de gallina (OVA). Las células se cultivaron durante 10 días antes de la inyección subcutánea de 2E05 células tumorales en el costado derecho afeitado de ratones C57BL/6N (Charles River). Se trataron diez ratones/grupo de tratamiento con 200 pg de IgG de control o el clon 5G12 anti Siglec-15 sin endotoxinas purificado. Los tratamientos comenzaron ocho días después de la inyección de EG7 y los ratones se trataron cada cuatro días hasta un total de cuatro dosis. El volumen tumoral se calculó como (largo x anchoA2)*0,5. Los ratones se sacrificaron cuando el tumor alcanzó 2000 mm3 o cuando los tumores alcanzaron un diámetro promedio de 15 cm.

Modelo de cáncer de ovario

Figura 17C: Las células tumorales ID8-OVA son una línea celular de cáncer de ovario ID8 murino transfectadas de manera estable para expresar ovoalbúmina de huevo de gallina (OVA). Las células se cultivaron durante 10 días antes de la inyección intraperitoneal de 5E06 células. Tres semanas después, los ratones se transfirieron de forma adoptiva mediante inyección intraperitoneal con linfocitos T 5E05 OT-I Tg/Rag2'/' que se aislaron mediante selección negativa de linfocitos T CD8+ (Miltenyi Biotec). El tratamiento se inició un día después (día 22; n = 10/grupo). Los ratones recibieron 200 pg cada cuatro días para un total de 5 dosis de IgG de control o el clon 5G12 anti Siglec-15 sin endotoxinas purificado. Se pesaron los ratones comenzando 30 días después de la inyección del tumor y se analizó la carga tumoral mediante el aumento de peso. Los datos se muestran como porcentaje de aumento de peso por ratón desde el peso inicial a los 30 días. Los ratones se sacrificaron cuando el peso alcanzó un 150 % de aumento de peso o más de 30 gramos.

Resultados

5G12 mostró un aumento en el porcentaje de supervivencia en el modelo colorrectal (figura 17A) y el modelo de linfoma (figura 17B). 5G12 también mostró una reducción en la carga tumoral (figura 17C). La figura 18 muestra el porcentaje de supervivencia frente a los días posteriores a la inoculación de ID8/OVA.

Ejemplo 12: Evaluación de la afinidad de mAb recombinantes con la proteína monomérica S15

Se realizaron experimentos de Kdoptimizados en un instrumento ForteBio Octet RED96 usando sensores de captura de anti Fc humano (AHC, 18-5060; ForteBio). El tampón de ensayo fue PBS que contenía Tween-20 al 0,05 % y el tampón de regeneración fue glicina 10 mM (pH 1,5). Primero, los anticuerpos se cargaron a razón de 1 pg/ml durante 600 segundos. A esto le siguió una etapa inicial de 60 segundos, una etapa de asociación de 300 segundos en el monómero del dominio extracelular (ECD) de S15 y, finalmente, una etapa de disociación de 1200 segundos. Las concentraciones de monómero variaron de 100 nM a 1,56 nM en una serie de diluciones dobles y se incluyó un pocillo en blanco. Los datos se procesaron usando el software de análisis de datos 7.0 de ForteBio; se usó un ajuste global, junto con la resta de pocillos de referencia. Los valores informados son el promedio de al menos tres análisis de octetos independientes.

Los resultados se encuentran en la Tabla 1.

T abl 1: Ev l i n l fini mA r m in n n l r ín m n m ri 1 n = - iclos)

continuación

E jem p lo 13: C la s if ic a c ió n d e e p í to p o s d e m A b S 15

Los experimentos de clasificación de epítopos se realizaron en un instrumento ForteBio Octet RED96 usando sensores de estreptavidina (SA, 18-5019; ForteBio). Después de una etapa inicial de 30 segundos, se cargó la proteína de fusión S15-mG1 marcada con biotina en los sensores a razón de 10 pg/ml durante 600 segundos. A esto le siguió una etapa de asociación de 600 segundos en el primer anticuerpo (30 pg/ml), una etapa inicial de 30 segundos y una etapa de asociación de 400 segundos en el segundo anticuerpo (15 pg/ml). El tampón de ensayo fue PBS y la regeneración fue glicina 10 mM (pH 3,0). Los datos se procesaron usando el software de análisis de datos 7.0 de ForteBio y las segundas curvas de anticuerpos se evaluaron individualmente para determinar la unión competitiva. Una curva durante la segunda etapa de asociación que es distinta de la de la primera etapa de asociación indica la unión a un epítopo desocupado. La falta de unión adicional indica bloqueo del epítopo.

Los resultados se encuentran en la Tabla 2.

Tabla 2: Clases de e íto os de S15

E jem p lo 14: El c lo n 1H3 an ti S 15 h u m a n a in h ib e la fo rm a c ió n d e o s te o c la s to s h u m a n o sin vitro.

Materiales y métodos

Se aislaron PBMC a partir de un producto rico en leucocitos derivado de aféresis, adquirido en Key Biologics, LLC. El producto rico en leucocitos se estratificó sobre una capa de Ficoll y se centrifugó durante 30 minutos a 400 RCF. Las células en la interfase de Ficoll se eliminaron, se lavaron 3 veces en PBS y a continuación se congelaron en FBS con DMSO al 10 %. El día del experimento, se retiró un vial de PBMC congeladas del almacenamiento de nitrógeno líquido y se descongeló. Los monocitos se aislaron usando un kit de aislamiento de monocitos MACS (130-096-537; Miltenyi Biotec) según las instrucciones del fabricante. Las células aisladas eran viables en un 99 %. Las células se sembraron en placas de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos a una densidad de 3E05 células/cm2, 1E05 células en 100 pl de medio de ensayo por pocilio. Los medios de ensayo consistieron en medio a-MEM (Gibco 32571-036), complementado con FBS al 10 %, piruvato de sodio 1 mM, 25 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos humanos (Miltenyi, 103-096-491) y 30 ng/ml de RANKL humano (Miltenyi, 130-093-988). Las células se adhirieron a la placa durante 3,5 horas antes de añadir 10 pl de 50 pg/ml de anticuerpo S15, concentración final de 4,55 pg/ml. Se evaluaron pocillos por triplicado para cada anticuerpo. Después de tres días de incubación, se cambió el medio y se añadieron anticuerpos nuevos. El día siete, los sobrenadantes se transfirieron de las placas originales a placas de 96 pocilios de fondo redondo y se centrifugaron para eliminar los desechos celulares. Los monocitos/osteoclastos se tiñeron con el kit de tinción TRAP de B-Bridge International, Inc. (PMC-AK04F-COS) según las instrucciones del fabricante y las imágenes se tomaron con un Invitrogen EVOS FL Color. Para evaluar los niveles de TRAP (fosfatasa ácida resistente a tartrato) en el sobrenadante, se combinaron 50 pl del tampón del kit de tinción TRAP con 9 pl de sobrenadante y se incubaron a 37 °C durante tres horas. Se registró la absorbancia de cada pocillo a 540 nM. El sobrenadante restante se congeló a -80 °C para el posterior análisis de citocinas.

Resultados

La figura 19A es un diagrama esquemático que muestra monocitos CD14+ humanos recogidos de PBMC humanas usando perlas magnéticas de monocitos Mitenyi seguido de siembra en placas de 96 pocillos en presencia de M-CSF humano y RANKL humano junto con los anticuerpos indicados. La figura 19B es una micrografía que muestra osteoclastos. La figura 19C es un gráfico de barras de la absorbancia a 540 nm del sobrenadante recogido después de 7 días para el análisis de la fosfatasa ácida resistente a tartrato.

E jem p lo 15: 1H3 re d u c e la p ro d u c c ió n d e IL-6 y T N F-a m e d ia d a p o r M-CSF y RANKL e n m o n o c ito s h u m a n o s . Materiales y métodos

Se recogieron los sobrenadantes de los pocillos Sin RANKL (M-CSF solo), mAb de control (M-SCF RANKL mAb de control) y 1H3 (M-CSF RANKL 1H3) del experimento anterior y se ensayaron para el análisis de citocinas. Resultados

La figura 20 es un gráfico de barras que muestra las citocinas (pg/ml) para INF-<y>, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A y TNF-a.

E jem p lo 16: El m A b an ti S 15 h u m a n a 1H3 p re v ie n e la fo rm a c ió n d e o s te o c la s to s d e ra tó nin vitroMateriales y métodos

Se sembraron células de macrófagos RAW 264.7 de ratón en una placa de 96 pocillos de fondo plano a una densidad de 1,5E04 células/cm2, 4800 células en 90 pl de medio por pocillo. Los medios consistieron en DMEM con FBS al 10 %, piruvato de sodio 1 mM y 50 ng/ml de RANKL de ratón (eBioscience, 14-8612-80). Se dejó que las células se adhirieran durante dos horas antes de añadir 10 pl del anticuerpo indicado (50 pg/ml) a los pocillos, produciendo una concentración final de 5 pg/ml; los anticuerpos se evaluaron en pocillos por triplicado. Las células se diferenciaron durante cinco días, momento en el que se tiñeron las células y se evaluó el contenido de TRAP en el sobrenadante como anteriormente.

Resultados

La figura 21 es un gráfico de barras de la absorbancia a 540 nm de células de macrófagos RAW 264.7 cultivadas en presencia de RANKL junto con los anticuerpos indicados.

E jem p lo 17: La e x p re s ió n d e S ig lec -15 e s t á re g u la d a p o s i t iv a m e n te e n m a c ró fa g o s M2 h u m a n o s .

M ate ria le s y m é to d o s

Expresión de Siglec-15

Se aislaron monocitos CD14+ humanos de PBMC humanas mediante un kit de selección negativa de perlas magnéticas (Miltenyi Biotec) y se trataron con M-CSF durante 3 días, a continuación las células se cultivaron en presencia de IL-10 (polarización de macrófagos M2) o IFN-Y/LipiA (polarización de macrófagos M1) durante 3 días más. La expresión de Siglec-15 en la superficie celular se detectó mediante tinción con anticuerpo anti Siglec-15 seguida de análisis FACS.

Inducción de la expresión de Siglec-15

Se recogieron células de médula ósea de ratón de ratones Balb/C. Las células adherentes se eliminaron uniéndolas a una placa de cultivo de plástico. Las células hematopoyéticas flotantes de ratón se recogieron y se trataron con M-CSF durante 3 días, seguido de un tratamiento con M-CSF puro o un tratamiento con M-CSF IL-10 durante 4 días más. Las células tratadas se recogieron y se tiñeron con marcadores de células mieloides (CD11 b y F4/80) y anti S15 marcado con PE seguido de análisis FACS. La intensidad media de fluorescencia de la PE se representa gráficamente en el panel inferior. M-CSF aumentó ligeramente la expresión de S15.

Resultados

La expresión de Siglec-15 se observa en macrófagos M2 humanos (figura 25A) pero no en macrófagos M1 humanos (figura 25B).

M-CSF e IL-10 aumentan la expresión de S15 en células mieloides derivadas de médula ósea de ratón (figuras 25C a 25E).

Ejemplo 18: Siglec-15 promueve la supervivencia de las células mieloides humanas y aumenta la producción de citocinas proinflamatorias.

Materiales y métodos

Se aislaron primero monocitos CD14+ humanos a partir de PBMC humanas (de 2 donantes sanos) mediante un kit de selección negativa de perlas magnéticas (Miltenyi Biotec) y se sembraron en una placa de 96 pocillos recubierta con proteína de fusión Siglec-15 (Siglec-15 recubierta) o sin recubrimiento pero con proteína de fusión Siglec-15 añadida en medios de cultivo (Siglec-15 soluble) a la concentración que se muestra en la figura. Seis días después, se recogió el sobrenadante acondicionado para el análisis de citocinas mediante el kit MSD. La viabilidad celular se evaluó añadiendo XTT (ThermoFisher) a la placa. Después de 2 horas de cultivo, se midió el metabolismo/viabilidad celular mediante lectura de absorbancia a 450 nm.

Resultados

Se detectó una absorbancia mayor en los pocillos con Siglec-15 Fc recubierta con placa y con Siglec-15 Fc soluble. El análisis de citocinas mostró que la dosis de S15 aumentó de manera dependiente la producción de TNF-a, IL-6 e IL-1p en los pocillos tratados (datos de los pocillos S15 solubles presentados aquí).

Ejemplo 19: Las células mieloides humanas tratadas con Siglec-15 Fc afectan la función de los linfocitos T humanos

Material y métodos

La figura 27A es un diagrama esquemático para el siguiente experimento. Se aislaron monocitos CD14+ humanos a partir de PBMC humanas (de 2 donantes sanos) mediante un kit de selección negativa de perlas magnéticas (Miltenyi Biotec) y se trataron con Siglec-15 Fc durante 6 días como se ha descrito anteriormente o se polarizaron en macrófagos M2 o M1, o se trataron con GM-CSF e IL-4 para diferenciar las células en células dendríticas inmaduras (imDC). Las células se recogieron raspando suavemente de la placa de cultivo. Después de la centrifugación, las células se suspendieron de nuevo y se cultivaron conjuntamente con linfocitos pan-T autólogos seleccionados negativamente marcados con CFSE en una relación celular de 1 célula mieloide: 2 linfocitos T junto con perlas anti CD3/CD28 (1 linfocito pan-T: 2 perlas). Cinco días después, el sobrenadante acondicionado se recogió para el análisis de citocinas usando el kit MSD multiplex de MSD. Las células se recogieron y se tiñeron con anticuerpos anti CD4 y anti CD8. La proliferación de linfocitos T se analizó mediante análisis FACS para medir la población de células diluidas en CFSE.

Resultados

Los datos mostraron que las células mieloides tratadas con Siglec-15 Fc redujeron la proliferación de linfocitos T CD4 y CD8 mediada por perlas anti CD3/CD28 usando células de este donante particular (Donante n.° 1707) y la supresión no fue tan profunda como la de los macrófagos M2 (figuras 27B-27G). El análisis de citocinas reveló que las células mieloides tratadas con S15 alteraron significativamente la producción de IFN-y, TNF-a, IL-6 e IL-10 mediada por perlas anti CD3/CD28. Los datos de otros donantes ensayados mostraron que las células tratadas con S15 tuvieron una supresión limitada de la proliferación de linfocitos T, pero en la mayoría de los casos, una supresión notable de la producción de citocinas.

Ejemplo 20: La dosis de mAb Siglec-15 bloqueó de forma dependiente el efecto de supervivencia mediado por S15 en células mieloides humanas.

Materiales y métodos

Se aislaron monocitos CD14+ humanos a partir de PBMC humanas (de 2 donantes sanos) mediante un kit de selección negativa de perlas magnéticas (Miltenyi Biotec) y se sembraron en una placa de 96 pocillos con 5 pg/ml de proteína de fusión S15 Fc junto con un mAb para Siglec-15, diluido 1:2 en serie a partir de 20 pg/ml. Las células se cultivaron durante 7 días. La viabilidad/metabolismo celular se evaluó añadiendo XTT (ThermoFisher) a la placa. Después de 2 horas de cultivo, se midió el metabolismo/viabilidad celular mediante lectura de absorbancia a 450 nm. Se detectó una alta absorbancia en los pocillos con la proteína de fusión S15 Fc sin ningún anticuerpo (sin mAb). Se obtuvo una absorbancia baja en los pocillos sin proteína de fusión S15 Fc (sin S15 Fc).

Resultados

La dosis de mAb Siglec-15 disminuyó de forma dependiente la absorbancia (línea inferior). El anticuerpo de control (línea superior) no tuvo ningún efecto sobre la supervivencia y el metabolismo celular. Las figuras 28A (donante 1709) y 28B (donante 1713) muestran que la dosis de mAb anti S15 bloqueó de forma dependiente el efecto de supervivencia mediado por S15 en células mieloides humanas.

Ejemplo 21: Siglec-15 desempeña un papel fundamental en la formación de osteoclastos.

M-CSF expresado en osteoblastos y células estromales induce la expresión de Siglec-15 en células mieloides, que interactúa con un compañero de unión de Siglec-15 ya sea enciso entransy estimula las células mieloides que producen citocinas proinflamatorias tales como TNF-a, IL-6 e IL-1p y que regulan positivamente la expresión de la integrina avp3. Junto con la señalización de RANKL, las células precursoras de los osteoclastos se fusionan y forman osteoclastos multinucleados (figura 29).

Ejemplo 22: Siglec-15 induce la expresión de integrina OvP3 en monocitos CD14+ humanos.

Materiales y métodos

Se aislaron monocitos CD14+ humanos de PBMC humanas mediante un kit de selección negativa de perlas magnéticas (Miltenyi Biotec) y se trataron con 5 pg/ml de proteína de fusión S15 Fc durante 6 días. Seis días después, se recogieron células mieloides tratadas con S15 Fc y se tiñeron con integrina anti avp3 (clon 23C6).

Resultados

En comparación con la tinción de anticuerpos de control de isotipo y también la tinción de células antes del tratamiento con S15 Fc el día 0, la expresión de la integrina avp3 se reguló positivamente en las células mieloides del tratamiento con S15 Fc (figuras 30A y 30B).

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la invención divulgada.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a SIGLEC-15, en donde el anticuerpo comprende las tres CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) seleccionadas del grupo que consiste en: i. SYWIS (SEQ ID NO:208; HCDR1); DIYSGSDTTHYAEKFQG (SEQ ID NO:374; HCDR2); WWDYGSSYDYFDY (SEQ ID NO:71; HCDR3), ii. SYWIT (SEQ ID NO:204; HCDR1); DIYSGSDTMHYAEKFQG (SEQ ID NO:205; HCDR2); WWDYGSSYDYFD (SEQ ID NO:71; HCDR3); iii. SYWIT (SEQ ID NO:204; HCDR1); DIYSGSDTTHYAEKFQG (SEQ ID NO:374; HCDR2); WWDYGSSYDYFD (SEQ ID NO:71; HCDR3); y y un conjunto de tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) seleccionadas del grupo que consiste en i. KASQDINVYLS (SEQ ID NO: 198; LCDR1); RANRLTS (SEQ ID NO:202; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43 LCDR3). ii. KASQDINSYLS (SEQ ID NO:28; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPY (SEQ ID NO:43 LCDR3); iii. KASQDINTYLS (SEQ ID NO: 196; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43 LCDR3); iv. KASQDINVYL (SEQ ID NO: 198; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43 LCDR3); y v. KASQDIQSYLS (SEQ ID NO:200; LCDR1); RANRLVD (SEQ ID NO:36; LCDR2); LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43 LCDR3).
2. 2. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de longitud completa seleccionada del grupo que consiste en i. QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWISWVRQAPGQGLEYVMGDIYSG SDTTHYAEKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWWDYGSSYDY FDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 207)

   y iii QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWITWVRQAPGQGLEW MGDIYSGSDTTHYAEKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWWD YGSSYDYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 206), y una región variable de cadena ligera de longitud completa seleccionada del grupo que consiste en i DIQMTQSPSSLS AS VGDRVTITCK ASQDINV YLS WFQQKPGKAPKTLIYR ANRLTSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO201); ii DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDÍNSYLSWFQQKPGKAPKTL1YR ANRLVDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEI K (SEQ ID NO209); iii TLIYR ANRLVDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEI K (SEQ ID NO: 195); i. DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINVYLSWFQQKPGKAPKTLIYR ANRLVDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEI K (SEQ ID NO 197); y v DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDIQSYLSWFQQKPGKAPKTLIYR ANRLVDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEI K (SEQ ID NO; 199).
3. 3. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo comprende HCDR1 de acuerdo con SYWIS (SEQ ID NO:208), HCDR2 de acuerdo con DIYSGSDTTHYAEKFQG (SEQ ID NO:374), y HCR3 de acuerdo con WWDYGSSYDYFDY (SEQ ID NO:71), y LCDR1 de acuerdo con KASQDINVYLS (SEQ ID NO: 198), LCDR2 de acuerdo con RANRLTS (SEQ ID NO:202), y LCR3 de acuerdo con LQYDEFPYT (SEQ ID NO:43).
4. 4. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada (HCVR) de longitud completa que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYVISWVRQAPGQGLEWMGDIYSG SDTTHYAEKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWWDYGSSYDY FDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 207), y una región variable de cadena ligera de longitud completa que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con DIQMTQ SP S SLS AS YGDRYTIT CK ASQDINYYLS WFQQKPGKAPKTLIYRANRLT S GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:201).
5. 5. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores junto con un excipiente.
6. 6. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en un método para tratar un tumor en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo al sujeto.
7. 7. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el método de la reivindicación 6, en donde el tumor es un tumor colorrectal.
8. 8. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el método de la reivindicación 6, en donde el tumor es un linfoma.
9. 9. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el método de la reivindicación 6, en donde el tumor es un tumor de ovario.
10. 10. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el método de la reivindicación 6, en donde el método promueve una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesita, y comprende administrar una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo en una cantidad eficaz para promover una respuesta inmunitaria en el sujeto.
11. 11. Un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el método de la reivindicación 10, en donde la respuesta inmunitaria promovida retarda o previene el crecimiento tumoral, inhibe la supresión inmunitaria mediada por tumores, elimina tumores, agota o bloquea la actividad de macrófagos asociados a tumores (TAM), disminuye la supresión inmunitaria mediada por TAM, reduce o revierte la supresión de linfocitos T, aumenta la proliferación de linfocitos T o una combinación de los mismos.