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ES2720483T3 - Sistemas y procedimientos de anticuerpos anti p40 - Google Patents

Sistemas y procedimientos de anticuerpos anti p40 Download PDF

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ES2720483T3 ES14756627T ES14756627T ES2720483T3 ES 2720483 T3 ES2720483 T3 ES 2720483T3 ES 14756627 T ES14756627 T ES 14756627T ES 14756627 T ES14756627 T ES 14756627T ES 2720483 T3 ES2720483 T3 ES 2720483T3
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Biocare Medical LLC
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Abstract

Preparación aislada de anticuerpos que se unen específicamente a una proteína p40, en la que dichos anticuerpos se unen a un epítopo en un péptido que comprende una mezcla de la SEQ ID No. 3 y la SEQ ID No. 5; y en la que dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No. 2 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No. 1.

Description

DESCRIPCIÓN
Sistemas y procedimientos de anticuerpos anti-p40
SECTOR TÉCNICO
La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos anti-p40, a composiciones, cócteles y kits que comprenden los anticuerpos y a procedimientos para utilizar los anticuerpos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El examen microscópico de muestras de tejido, particularmente las obtenidas mediante biopsia, es un procedimiento común para el diagnóstico de enfermedades. En particular, la inmunohistoquímica (IHC), una técnica en la que se utilizan anticuerpos específicos para detectar la expresión de proteínas específicas en la muestra de tejido, puede ser una herramienta valiosa para el diagnóstico, en particular para la detección y diagnóstico del cáncer.
El p53 es un gen supresor de tumores que puede estar mutado en numerosos cánceres humanos (por ejemplo, véase el artículo “p53 Isoforms: An Intracellular Microprocessor?” Khoury MP, Bourdon JC. Genes Cancer. abril de 2011 ;2(4):453-65, y el artículo “p53/p63/p73 isoforms: an orchestra of isoforms to harmonise cell differentiation and response to stress.” Murray-Zmijewski F, Lane DP, Bourdon JC. Cell Death Differ. junio de 2006;13(6):962-72). La inactivación de p53 puede ser una de las alteraciones genéticas más comunes en los cánceres humanos e incluso puede estar presente en, aproximadamente, el 50% de todos los cánceres humanos. El p53 puede responder a una amplia variedad de tensiones celulares, entre las que se incluyen daños en el ADN, hipoxia y cambios metabólicos, activando posiblemente vías celulares que pueden dar como resultado la detención del ciclo celular o la apoptosis. El p73 se puede haber clonado e identificado como un miembro de la familia del p53, basándose en la homología de secuencia con regiones clave de p53. El p73 puede haber demostrado actividades transcripcionales similares a p53; sin embargo, p73 no puede exhibir actividades diferentes a p53 (por ejemplo, véase el artículo, “Monoallelically expressed gene related to p53 at 1p36, a region frequently deleted in neuroblastoma and other human cancers.” Kaghad M, Bonnet H, Yang A, Creancier L, Biscan JC, Valent A, Minty A, Chalon P, Lelias JM, Dumont X, Ferrara P, McKeon F, Caput D. Cell. 22 de agosto de 1997;90(4):809-19).
Utilizando cebadores de PCR basados en los dominios de unión al ADN de p53 y p73, se puede haber clonado un gen y la secuencia genética clonada puede incluso corresponder a una proteína de, aproximadamente, 40 kDa. Por lo tanto, este gen recién identificado, un miembro adicional de la familia p53, puede haber sido identificado como p40 (por ejemplo, véase el artículo, “A new human p53 homologue.” Trink B, Okami K, Wu L, Sriuranpong V, Jen J, Sidransky D. Nat Med. julio de 1998;4(7):747-8). Es posible que se hayan clonado otras isoformas del mismo gen y que sus productos se hayan denominado p51, p63 o p73L (por ejemplo, véanse los artículos, “Cloning and functional analysis of human p51, which structurally and functionally resembles p53.” Osada M, Ohba M, Kawahara C, Ishioka C, Kanamaru R, Katoh I, Ikawa Y, Nimura Y, Nakagawara A, Obinata M, Ikawa S. Nat Med. julio de 1998;4(7):839-43, y el artículo, “p63, a p53 homolog at 3q27-29, encodes multiple products with transactivating, death-inducing, and dominant-negative activities.” Yang A, Kaghad M, Wang Y, Gillett E, Fleming MD, Dotsch V, Andrews NC, Caput D, McKeon F. Mol Cell. septiembre de 1998; 2(3):305-16, y el artículo, “A second p53-related protein, p73L, with high homology to p73.” Senoo M, Seki N, Ohira M, Sugano S, Watanabe M, Inuzuka S, Okamoto T, Tachibana M, Tanaka T, Shinkai Y, Kato H. Biochem Biophys Res Commun. 30 de julio de 1998;248(3):603-7, y el artículo, “Cloning and functional analysis of human p51, which structurally and functionally resembles p53.” Osada M, Ohba M, Kawahara C, Ishioka C, Kanamaru R, Katoh I, Ikawa Y, Nimura Y, Nakagawara A, Obinata M, Ikawa S. Nat Med. julio de 1998;4(7):839-43). Cada una de estas isoformas puede diferir por la presencia o incluso la ausencia de un dominio de activación transcripcional N-terminal. p40, ANp63 y p73L pueden carecer de este dominio.
Se puede haber encontrado que el gen p40/p63/p51/p73L está sobreexpresado en líneas celulares de carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello y carcinomas primarios de células escamosas de pulmón (por ejemplo, véase el artículo “AIS is an oncogene amplified in squamous cell carcinoma.” Hibi K, Trink B, Patturajan M, Westra WH, Caballero OL, Hill DE, Ratovitski EA, Jen J, Sidransky D. Proc Natl Acad Sci U S A. 9 de mayo de 2000;97(10):5462-7). Debido a esta amplificación en los carcinomas de células escamosas, el gen p40/p63/p51/p73L puede denominarse ACE (amplificado en el carcinoma de células escamosas). Las isoformas más largas del gen p40/p63/p51/p73L, incluyendo posiblemente los dominios de activación transcripcional, pueden ser aquellas clonadas y nombradas como p63 (por ejemplo, véase el artículo, “p63, a p53 homolog at 3q27-29, encodes multiple products with transactivating, death-inducing, and dominant-negative activities.” Yang A, Kaghad M, Wang Y, Gillett E, Fleming MD, Dotsch V, Andrews NC, Caput D, McKeon F. Mol Cell. septiembre de 1998;2(3):305-16. Por lo tanto, por simplicidad, el gen p40/p63/p51/p73L puede denominarse frecuentemente como p63; sin embargo, se debe tener en cuenta que p40, p63, p51, p73L y ACE son términos para el mismo gen, que pueden producir transcripciones de varias longitudes, lo que da como resultado posiblemente isoformas de proteínas correspondientes de varias longitudes.
La longitud completa del gen p63 puede codificar un dominio de activación transcripcional N-terminal, un dominio de unión a ADN y un dominio de oligomerización de carboxilo. El p63 puede tener dos promotores, lo que posiblemente dé como resultado dos clases diferentes de proteínas, en las que una clase puede contener el dominio de transactivación (TA) (conocido posiblemente como p63 o TAp63) y la otra clase puede carecer del dominio de transactivación N-terminal (conocido posiblemente como p40 o ANp63) (por ejemplo, véase el artículo “p40: A p63 Isoform Useful for Lung Cancer Diagnosis - A Review of the Physiological and Pathological Role of p63.” Nobre AR, Albergaria A, Schmitt F. Acta Cytol. 2013;57(1):1-8). La proteína p40 puede actuar como un factor negativo dominante para la transcripción, ya sea compitiendo por los sitios de unión al ADN o uniéndose directamente a las isoformas p53, p63 o p73, inhibiendo posiblemente su capacidad para inducir la transcripción. Sin embargo, en algunos casos, p40 puede activar la transcripción de genes que posiblemente no estén activados por las formas TA de p53, p63 o p73. De alguna manera, se puede pensar que el gen p63 produce una familia de moléculas opuestas: posiblemente proteínas que contienen un dominio de transactivación N-terminal, con propiedades supresoras de tumores de tipo p53, y posiblemente proteínas que carecen de un dominio N-terminal, con propiedades oncogénicas.
En el tejido normal de los adultos, la expresión de las isoformas p63 puede estar restringida a los núcleos de las células basales de los epitelios normales, tales como la piel, el esófago y el urotelio o similares, y las células basales de las estructuras glandulares en la próstata, la mama y bronquios o similares. En estas células, se puede encontrar posiblemente que la expresión de p40 es, aproximadamente, 100 veces más elevada que la de TAp63. Aunque p40 y TAp63 pueden mostrar distribuciones de tejido superpuestas, el TAp63 puede expresarse más en células diferenciadas y posiblemente expresarse menos en células basales, en relación con la expresión de p40. Las diferencias en los patrones de expresión de las isoformas pueden indicar posiblemente diferentes roles para cada isoforma en el desarrollo y la enfermedad (por ejemplo, véase el artículo, “p40: A p63 Isoform Useful for Lung Cancer Diagnosis - A Review of the Physiological and Pathological Role of p63.” Nobre AR, Albergaria A, Schmitt F. Acta Cytol. 2013;57(1):1-8).
La determinación de los niveles de expresión de las isoformas TAp63 y p40 puede haber sido útil en el diagnóstico de cáncer. En particular, la IHC, que utiliza anticuerpos que se unen a las proteínas TAp63 y/o p40, puede haber sido útil para detectar la expresión de proteínas y posiblemente diagnosticar cáncer, particularmente cáncer de pulmón, próstata, mama y vejiga. Un anticuerpo anti-p40 policlonal de conejo (RP) se pudo haber producido y utilizado en un procedimiento de IHC para identificar la expresión de p40 en líneas celulares de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello y tumores primarios de pulmón de tipo carcinoma de células escamosas (por ejemplo, véase el artículo, “A new human p53 homologue.” Trink B, Okami K, Wu L, Sriuranpong V, Jen J, Sidransky D. Nat Med. julio de 1998;4(7):747-8). Un anticuerpo monoclonal de ratón anti-p63 (4A4) también puede haber sido producido y utilizado en un procedimiento de IHC para detectar isoformas de la proteína p63 (por ejemplo, véase el artículo, “p63, a p53 homolog at 3q27-29, encodes multiple products with transactivating, death-inducing, and dominant-negative activities.” Yang A, Kaghad M, Wang Y, Gillett E, Fleming MD, Dotsch V, Andrews NC, Caput D, McKeon F. Mol Cell. septiembre de 1998;2(3):305-16). Es importante destacar que el anticuerpo anti-p40 RP puede unirse a una secuencia de epítopo que es exclusiva de la isoforma p40, una secuencia que posiblemente no esté presente en TAp63. En contraste, el anticuerpo anti-p63 4A4 puede unirse a una secuencia de epítopo que puede ser común a las isoformas TA y p40, lo que posiblemente dé como resultado que el 4A4 exhiba propiedades de un marcador pan-p63 al reconocer ambas clases de proteínas derivadas del gen p63, mientras que el anticuerpo anti-p40 RP puede reconocer solo la isoforma p40 y posiblemente sea un marcador más selectivo.
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer tanto para hombres como para mujeres. Más personas mueren de cáncer de pulmón que de cáncer de colon, mama y próstata combinados. El carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) constituye, aproximadamente, el 80% de los cánceres de pulmón y puede clasificarse en varios tipos histológicos, de manera más habitual puede incluir adenocarcinoma (ADC) o incluso carcinoma de células escamosas (SCC). La clasificación de los carcinomas de pulmón en tipos histológicos se puede realizar mediante un examen morfológico con hematoxilina y eosina (H&E) o IHC, y en algunos casos incluso, tinciones de mucina; sin embargo, la clasificación precisa puede ser difícil con el carcinoma de pulmón poco diferenciado o incluso indiferenciado. El diagnóstico puede complicarse aún más mediante la utilización de biopsias con núcleo de aguja, que pueden proporcionar cantidades limitadas de tejido tanto para inmunohistoquímica como para pruebas moleculares, y pueden incluir artefactos de aplastamiento. Además, los especímenes de citología pueden carecer de las características morfológicas necesarias para el diagnóstico solo con H&E.
Aunque la mayoría de los cánceres de pulmón (particularmente los grados I y II) se pueden diagnosticar solo con tinción H&E, con la aparición de las terapias dirigidas, las necesidades de diagnóstico han cambiado y se necesita un procedimiento mejorado para clasificar un número mayor de casos de NSCLC. En el pasado, los subtipos histológicos de NSCLC tenían un valor diagnóstico limitado, debido al hecho de que el paciente podría haber recibido el mismo tratamiento, posiblemente sin importar el subtipo de NSCLC. Sin embargo, la disponibilidad de terapias dirigidas ha creado la necesidad de un subtipo preciso de NSCLC. Por ejemplo, bevacizumab, un anticuerpo monoclonal humanizado terapéutico que se dirige al factor de crecimiento endotelial vascular, puede ser un tratamiento común para los pacientes con NSCLC; sin embargo, los pacientes con el subtipo de SCC no deben recibir bevacizumab, posiblemente debido a una tasa de mortalidad de, aproximadamente, el 30% por hemorragia pulmonar mortal. Además, se puede haber demostrado una mayor eficacia con la adición de premextred a la quimioterapia convencional en carcinomas de células no escamosas, pero puede que no en SCC. Por lo tanto, los procedimientos precisos para clasificar los especímenes de NSCLC pueden ser útiles para la mejor atención al paciente, con una eficacia terapéutica óptima y efectos adversos mínimos.
La IHC se puede utilizar de manera habitual para ayudar a los patólogos a determinar el subtipo histológico de especímenes de NSCLC, discriminando posiblemente de manera particular el ADC del SCC, así como de los carcinomas de células pequeñas del pulmón. En particular, los anticuerpos de IHC para p40 pueden ser útiles en el diagnóstico de cáncer de pulmón, y posiblemente en discriminar subtipos histológicos, tales como ADC y SCC. Utilizando el anticuerpo anti-p40 RP, la expresión de la proteína p40 en el SqCC de pulmón primario puede haber sido identificada por IHC; mientras que, la proteína p40 puede no haber sido detectada en casos de adenocarcinoma de pulmón, (por ejemplo, véase el artículo, “AIS is an oncogene amplified in squamous cell carcinoma.” Hibi K, Trink B, Patturajan M, Westra WH, Caballero OL, Hill DE, Ratovitski EA, Jen J, Sidransky D. Proc Natl Acad Sci USA. 9 de mayo de 2000;97(10):5462-7).
Otros estudios pueden haber demostrado que el anticuerpo anti-p40 RP puede ser superior al anticuerpo pan-p63 4A4 para el diagnóstico de carcinoma de células escamosas, y que posiblemente el anticuerpo anti-p40 RP puede ser más específico. En un estudio, tanto el anticuerpo anti-p40 RP como el anticuerpo pan-p63 tiñeron los 81 casos de SCC que se evaluaron, lo que posiblemente indique que ambos anticuerpos exhiben la misma sensibilidad frente al SCC. En contraste, el anticuerpo pan-p63 tiñó 74/237 (aproximadamente, el 31%) de los casos de ADC, mientras que el anticuerpo anti-p40 RP tiñó solo 7/205 (aproximadamente, el 3%) de los casos de ADC, posiblemente indicando que el anticuerpo anti-p40 RP puede ser más específico que el pan-p63 4A4. Además, el anticuerpo pan-p63 4A4 tiñó 82/152 (aproximadamente, el 54%) de los casos analizados de linfoma de células grandes, mientras que el anticuerpo anti-p40 RP carecía de tinción en cualquiera de estos casos, lo que posiblemente dé como resultado una mejor especificidad para el anticuerpo anti-p40 RP. Este estudio puede haber demostrado que la detección por IHC de p40 en lugar de la detección de múltiples isoformas de p63 con 4A4 evita la mala interpretación de ADC o linfoma poco diferenciados como SCC (por ejemplo, véase el artículo, “p40 (ANp63) is superior to p63 for the diagnosis of pulmonary squamous cell carcinoma.” Bishop JA, Teruya-Feldstein J, Westra WH, Pelosi G, Travis WD, Rekhtman N. Mod Pathol. marzo de 2012;25(3):405-15 y el artículo, “A study of ANp63 expression in lung non-small cell carcinomas.” Nonaka D. Am J Surg Pathol. junio de 2012;36(6):895-9).
Otros estudios también pueden haber reportado la utilización del anticuerpo anti-p40 RP en la identificación de SCC, posiblemente en combinación con un anticuerpo anti-TTF-1, que puede ser un marcador para ADC. En uno de esos estudios, utilizando IHC de muestras de tejido pequeñas de especímenes de biopsia, se diagnosticaron 45/46 (aproximadamente, el 98%) casos de ADC y SCC, utilizando una combinación de anticuerpos RP anti-p40 y anti-TTF-1 (por ejemplo, véase el artículo, “ANp63 (p40) and thyroid transcription factor-1 immunoreactivity on small biopsies or cellblocks for typing non-small cell lung cancer: a novel two-hit, sparing-material approach.” Pelosi G, Fabbri A, Bianchi F, Maisonneuve P, Rossi G, Barbareschi M, Graziano P, Cavazza A, Rekhtman N, Pastorino U, Scanagatta P, Papotti M. Thorac Oncol. febrero de 2012;7(2):281-90).
En un estudio similar, un cóctel de anticuerpos que contenía el anticuerpo anti-p40 RP y un anticuerpo anti-TTF-1 dio como resultado una sensibilidad de, aproximadamente, el 92% y una especificidad de, aproximadamente, el 93% del anticuerpo anti-p40 RP para el SCC, y una sensibilidad de, aproximadamente, el 77% y, aproximadamente, el 100% de especificidad del anti-TTF-1 para el ADC (por ejemplo, véase el artículo “Tissue-Preserving Antibody Cocktails to Differentiate Primary Squamous Cell Carcinoma, Adenocarcinoma, and Small Cell Carcinoma of Lung.” Brown AF, Sirohi D, Fukuoka J, Cagle P, Policarpio-Nicolas M, Tacha D, Jagirdar J. Arch Pathol Lab Med. 4 de enero de 2013).
En el tejido vesical normal, TAp63 puede expresarse en células uroteliales basales e intermedias, mientras que el p40 puede no detectarse. Por el contrario, la expresión de p40 puede detectarse por la IHC en el carcinoma urotelial, posiblemente en 29/147 (aproximadamente, el 19,7%) de casos no invasivos, y posiblemente en 23/55 (aproximadamente el 41,8%) casos de carcinoma invasivo, (por ejemplo, véase el artículo “Distinct expression profiles of p63 variants during urothelial development and bladder cancer progression.” Karni-Schmidt O, Castillo-Martin M, Shen TH, Gladoun N, Domingo-Domenech J, Sanchez-Carbayo M, Li Y, Lowe S, Prives C, Cordon-Cardo C. Am J Pathol. marzo de 2011; 178(3): 1350-60). La expresión de p40 también puede ser un factor pronóstico en el carcinoma urotelial. Por ejemplo, los casos de carcinoma urotelial invasivo de músculo que demuestran la expresión de p40 pueden exhibir una supervivencia global media ± DE, aproximadamente, 11,6 ±, aproximadamente, 1,3 meses, lo que posiblemente indique que la expresión de p40 es un predictor de un mal pronóstico. En contraste, los casos de carcinoma urotelial invasivo que carecen de expresión de p40 pueden haber demostrado una mediana de supervivencia ± DE más larga, en general de, aproximadamente, 25 ±, aproximadamente, 6,4 meses, lo que posiblemente indique que la falta de expresión de p40 es un predictor de un mejor pronóstico. En particular, la expresión total de p63 puede no ser un indicador pronóstico en el carcinoma invasivo, posiblemente porque las isoformas TAp63 y p40 muestran actividades biológicas opuestas. Como resultado, un marcador que es específico para la isoforma p40 puede utilizarse para el carcinoma urotelial, en comparación con un marcador pan-p63.
La pérdida de expresión de p40, que normalmente se puede expresar en las células basales de las glándulas prostáticas, se puede utilizar de manera habitual como un indicador de adenocarcinoma de la próstata. Específicamente, la cantidad de transcripción del ARNm de p40 puede ser menor, posiblemente, 2000 veces menor, aproximadamente, o posiblemente incluso indetectable, en líneas celulares de cáncer de próstata en comparación con la cantidad de ARNm de TAp63. Por lo tanto, posiblemente p40 esté virtualmente ausente en las líneas celulares de cáncer de próstata, mientras que el ARNm de TAp63 es detectable en varios niveles. En el diagnóstico diferencial de tejido prostático benigno y maligno, puede ser preferente un procedimiento que pueda detectar la pérdida de p40 sobre un procedimiento que pueda detectar TAp63 (por ejemplo, véase el artículo, “p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.” Signoretti S, Waltregny D, Dilks J, Isaac B, Lin D, Garraway L, Yang A, Montironi R, McKeon F, Loda M. Am J Pathol. diciembre de 2000;157(6):1769-75, y el artículo, “Differential expression of p63 isoforms in normal tissues and neoplastic cells.” Nylander K, Vojtesek B, Nenutil R, Lindgren B, Roos G, Zhanxiang W, Sjóstróm B, Dahlqvist A, Coates PJ. J Pathol. diciembre de 2002;198(4):417-27, cada uno de los cuales se incorpora en el presente documento como referencia).
En los conductos mamarios normales, las células mioepiteliales pueden formar un borde basal continuo a lo largo de la estructura epitelial. La pérdida gradual de continuidad de este límite basal puede ser indicativa de carcinoma in situ, y se puede observar a menudo la pérdida total de células mioepiteliales en el carcinoma de mama invasivo. Las lesiones benignas pueden retener de manera normal su capa mioepitelial continua, mientras que se asemejan morfológicamente a una lesión maligna. La tinción nuclear de células mioepiteliales por IHC se puede observar utilizando un anticuerpo anti-p40. De esta manera, un anticuerpo anti-p40 puede ser útil para evaluar la continuidad de las células mioepiteliales en la capa basal y, por lo tanto, ayudar en el diagnóstico de las lesiones mamarias (por ejemplo, véase el artículo, “p63, a p53 homologue, is a selective nuclear marker of myoepithelial cells of the human breast.” Barbareschi M, Pecciarini L, Cangi MG, Macri E, Rizzo A, Viale G, Doglioni C. Am J Surg Pathol. Agosto de 2001 ;25(8): 1054-60).
La publicación “Anticuerpo de p40 (5-17)”, sacada de internet el 27 de septiembre del 2016 da a conocer una IgG policlonal desarrollada contra un péptido sintético que corresponde a los aminoácidos 5-17 del p40 humano. La publicación de Bishop y colaboradores examina la sensibilidad y selectividad de p40 para el carcinoma de células escamosas y da a conocer un anticuerpo p40 policlonal desarrollado contra los aminoácidos 5-17 de la proteína p40. El documento WO99/50287 se refiere a p40 como un oncogén y da a conocer un antisuero p40 policlonal desarrollado contra los aminoácidos 5-17 de la proteína p40.
Por lo tanto, existe una clara necesidad de un anticuerpo anti-p40 sensible e incluso específico para su utilización en el diagnóstico del cáncer. Las realizaciones de la presente invención dan a conocer un anticuerpo monoclonal de ratón anti-p40 [clon BC28] que puede ser altamente sensible e incluso puede ser altamente específico. Un ejemplo de la presente invención da a conocer un anticuerpo monoclonal de ratón anti-p40 que puede detectar la presencia o ausencia de la proteína p40 en ciertos cánceres, entre los que se incluyen, entre otros, SCC, cáncer de vejiga, de mama y de próstata o similares. En los casos de NSCLC, un ejemplo de la presente invención puede haber demostrado una excelente sensibilidad para el SCC pulmonar (aproximadamente 65/67, aproximadamente, el 97%) con posiblemente incluso una excelente especificidad en comparación con el ADC pulmonar (aproximadamente 0/71, aproximadamente, el 0%). Cuando se compara con el anticuerpo anti-p40 RP, el BC28 monoclonal de ratón anti-p40 puede haber mostrado de manera normal patrones de tinción más limpios, posiblemente con menos artefactos, así como una falta de tinción de macrófagos, a la vez que ofrece incluso las ventajas de un anticuerpo monoclonal. El BC28 tampoco puede teñir algunos especímenes de ADC pulmonar, que se pueden haber teñido por el anticuerpo anti-p40 RP, lo que posiblemente indique la especificidad superior de BC28 sobre las alternativas. Por lo tanto, un anticuerpo anti-p40 monoclonal, tal como BC28, puede ser preferente para el diagnóstico, en comparación con otros marcadores pan-p63 o anticuerpos anti-p40 alternativos.
El desarrollo de un anticuerpo anti-p40 puede ayudar en el diagnóstico de cánceres primarios e incluso metastásicos, en particular SCC de pulmón, carcinoma urotelial, adenocarcinoma de próstata y carcinoma de mama o similares, e incluso puede ayudar a distinguir la expresión de proteínas de p40 frente a TAp63. Se han dado a conocer en la presente invención nuevos anticuerpos anti-p40, tales como el anticuerpo anti-p40 [BC28] monoclonal de ratón, posiblemente con una sensibilidad de tinción igual o superior, y posiblemente incluso con una especificidad de tinción superior a la del marcador pan-p634A4 y el anticuerpo anti-p40 RP.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
La presente invención da a conocer preparaciones aisladas de anticuerpos que se unen específicamente a una proteína p40, en la que dichos anticuerpos se unen a un epítopo en un péptido que comprende una mezcla de la SEQ. ID No. 3 y SEQ ID No. 5; y en el que dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No. 2 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No. 1, según la reivindicación 1. Además, la presente invención da a conocer un anticuerpo o fragmento del mismo producido por el hibridoma depositado en la Colección americana de cultivos tipo (ATCC) bajo la Denominación de depósito de patente ATCC No. PTA-120163, según la reivindicación 3. Además, la presente invención da a conocer composiciones y kits que comprenden dicho anticuerpo, según las reivindicaciones 1 o 3.
Las realizaciones generales de la presente invención pueden incluir anticuerpos monoclonales para reconocer p40, procedimientos para su preparación, su utilización en inmunohistoquímica, o similares. En realizaciones, los clones de anticuerpos anti-p40, tales como el clon del anticuerpo anti-p40 BC28 pueden obtenerse inmunizando ratones Balb/C con uno o más péptidos correspondientes a un subconjunto de aminoácidos 1-17 de la proteína p40 humana. El péptido p40 se puede inyectar en los ratones BALB/c, con un adyuvante, a través de inyecciones intraperitoneales, posiblemente 5 veces, aproximadamente, a intervalos de tres semanas, aproximadamente. La reactividad inmune a p40 puede evaluarse mediante ELISA directo en la proteína p40 recombinante. Los ratones con el título más elevado pueden elegirse para desarrollar hibridomas mediante fusión celular. Se puede elegir un clon de hibridoma que demuestre la mejor reactividad frente a p40 en tejidos humanos y se puede designar como BC28. Puede ensayarse el isotipo del clon BC28 y puede identificarse como un IgG1 /kappa de ratón. El anticuerpo BC28 puede producirse por cultivo tisular a gran escala de las células de hibridoma y por ascitis en ratones BALB/c. El sobrenadante y la ascitis de anticuerpo pueden recogerse y el anticuerpo puede purificarse mediante la columna por afinidad de proteína A. El BC28 puede demostrar reactividad específica a la proteína p40 humana mediante ELISA, transferencia de Western e incluso tejidos humanos.
Los anticuerpos anti-p40, tales como el anticuerpo monoclonal de ratón anti-p40 BC28 pueden ser útiles para la detección de p40 en muestras de tejido, posiblemente con varias ventajas significativas, pero inesperadas, sobre los anticuerpos conocidos actualmente para las isoformas TAp63 y p40. Cuando se utilizan en procedimientos de inmunohistoquímica tradicionales, los anticuerpos anti-p40, tales como el anticuerpo anti-p40 BC28 de ratón pueden dar como resultado la tinción nuclear de p40 con una sensibilidad posiblemente similar a la de los anticuerpos anti-p63 y anti-p40 conocidos. Sin embargo, los anticuerpos anti-p40, tales como el BC28, pueden mostrar una mayor especificidad, posiblemente en comparación con los anticuerpos anti-p63 y otros anticuerpos conocidos anti-p40, lo que puede ofrecer mejoras significativas. Además de las posibles ventajas de estar derivados de una fuente monoclonal, los anticuerpos anti-p40, tales como el BC28, también pueden ofrecer una tinción más limpia, con menos artefactos y una mayor especificidad de tipo celular, por ejemplo, posiblemente la no tinción de macrófagos, en comparación con otros anticuerpos anti-p40 y anti-p63 conocidos. Con anticuerpos anti-p40, tales como el BC28, el análisis de la muestra puede simplificarse y la expresión de p40 en células tumorales puede ser fácilmente identificable, lo que permite el diagnóstico en casos en los que de otro modo podrían ser difíciles, ambiguos o incluso imposibles de diagnosticar.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe un caso de carcinoma de células escamosas de pulmón.
La figura 2 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe un caso de carcinoma de células escamosas de pulmón.
La figura 3 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de anticuerpo anti-p40 RP que tiñe el mismo caso de carcinoma de células escamosas de pulmón, tal como se muestra en la figura 2.
La figura 4 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo del anticuerpo anti-p40 BC28 en un caso de adenocarcinoma de pulmón, sin tinción por BC28.
La figura 5 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de anticuerpo anti-p40 RP que tiñe el mismo caso de adenocarcinoma de pulmón, tal como se muestra en la figura 4.
La figura 6 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo del anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe un caso de cáncer de vejiga.
La figura 7 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de anticuerpo anti-p63 4A4 que tiñe la misma muestra de cáncer de vejiga, tal como se muestra en la figura 6.
La figura 8 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe un caso de cáncer de vejiga.
La figura 9 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe las glándulas prostáticas normales.
La figura 10 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo del anticuerpo anti-p40 BC28 en un caso de adenocarcinoma de próstata, sin tinción por BC28.
La figura 11 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe los conductos mamarios normales.
La figura 12 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe un caso de carcinoma ductal de la mama in situ (DCIS).
La figura 13 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo del anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe un caso de carcinoma de células basales de la piel.
La figura 14 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo del anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe un caso de carcinoma de células escamosas de laringe.
La figura 15 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo del anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe un caso de carcinoma de células escamosas de la epiglotis.
La figura 16 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de tinción moderada de macrófagos intraalveolares en el mismo espécimen de pulmón en la figura 17, por el anticuerpo anti-p40 RP.
La figura 17 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo muy débil de tinción de macrófagos intraalveolares en el pulmón, o posiblemente la ausencia de la misma, por el anticuerpo anti-p40 BC28.
La figura 18 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe el intestino delgado, con una muy débil tinción de fondo, o posiblemente la ausencia de la misma.
La figura 19 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de anticuerpo anti-p634A4 que tiñe el mismo caso del intestino delgado, tal como se muestra en la figura 18, en la que está presente la tinción de fondo.
La figura 20 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de los núcleos de tinción del anticuerpo anti-p40 BC28 de células mioepiteliales de un conducto mamario, sin tinción citoplasmática.
La figura 21 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de anticuerpo anti-p63 4A4 que tiñe la misma muestra de mama de la figura 20; sin embargo, hay una fuerte tinción citoplásmica.
La figura 22 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de tejido de próstata con tinción del anticuerpo anti-p40 BC28, posiblemente un espécimen de neoplasia intraepitelial prostática (PIN), con una fuerte tinción nuclear de las células basales de la glándula. La tinción es ligeramente más intensa y más aguda que la de la figura 23. La figura 23 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de anticuerpo anti-p634A4 que tiñe el mismo espécimen de próstata de la figura 22, con una fuerte tinción nuclear de las células basales de la glándula. La tinción es ligeramente menos intensa y menos aguda que la de BC28 en la figura 22. Además, se tiñen menos células basales con 4A4 que con el BC28.
La figura 24 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de tejido de próstata con tinción del anticuerpo anti-p40 BC28, posiblemente un espécimen de neoplasia intraepitelial prostática (PIN), con fuerte tinción nuclear de las células basales de la glándula.
La figura 25 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de anticuerpo anti-p63 4A4 que tiñe el mismo espécimen de la figura 22, con una fuerte tinción nuclear de las células basales de la glándula.
La figura 26 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de DSG-3 CK5 p40 [BC28] napsina A que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de DSG-3 (marrón) es membranosa; la tinción de CK5 (marrón) es citoplásmica; la tinción de p40 (marrón) es nuclear. La tinción de napsina A puede ser reducida, o posiblemente restringirse al pulmón normal residual en este espécimen.
La figura 27 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de DSG-3 CK5 p40 [BC28] napsina A que tiñe un espécimen de adenocarcinoma de pulmón. La tinción de napsina A (roja) es citoplásmica. La tinción de DSG-3, CK5 y p40 (marrón) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente estar ausente en la misma.
La figura 28 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de DSG-3 CK5 p40 [BC28] que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de DSG-3 (marrón) es membranosa; la tinción de CK5 (marrón) es citoplásmica; la tinción de p40 (marrón) es nuclear.
La figura 29 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de DSG-3 CK5 p40 [BC28] que tiñe un espécimen de adenocarcinoma de pulmón. La tinción de DSG-3, CK5 y p40 (marrón) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente estar ausente en la misma.
La figura 30 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo del cóctel de anticuerpos DSG-3 p40 [BC28] napsina A que tiñe un espécimen de adenocarcinoma de pulmón. La tinción de napsina A (roja) es citoplásmica. La tinción de DSG-3 (marrón, membranosa) y p40 (marrón, nuclear) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente estar ausente en la misma.
La figura 31 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo del cóctel de anticuerpos DSG-3 p40 [BC28] napsina A que tiñe un espécimen de adenocarcinoma de pulmón. La tinción de napsina A (roja) es citoplásmica. La tinción de DSG-3 (marrón, membranosa) y p40 (marrón, nuclear) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente restringirse al tejido pulmonar normal.
La figura 32 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo del cóctel de anticuerpos DSG-3 p40 [BC28] napsina A que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de DSG-3 (marrón) es membranosa. La tinción de p40 (marrón, nuclear) y napsina A (roja, citoplasmática) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente estar ausente en la misma.
La figura 33 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo del cóctel de anticuerpos DSG-3 p40 [BC28] napsina A que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de DSG-3 (marrón) es membranosa y la tinción de p40 (marrón) es nuclear. La de napsina A (roja, citoplásmica) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente restringirse al tejido pulmonar normal.
La figura 34 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo del cóctel de anticuerpos DSG-3 p40 [BC28] napsina A que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de p40 (marrón) es nuclear. La tinción de DSG-3 (marrón, membranosa) y/o napsina A (roja, citoplasmática) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente estar ausente en la misma.
La figura 35 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo del cóctel de anticuerpos DSG-3 p40 [BC28] que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de DSG-3 (marrón) es membranosa y la tinción de p40 (marrón) es nuclear.
La figura 36 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo del cóctel de anticuerpos p40 [BC28] CK5 (RM) que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de p40 (marrón) es nuclear y la tinción de CK5 (roja) es citoplásmica.
La figura 37 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo del cóctel de anticuerpos p40 [BC28] CK5 (RM) que tiñe un espécimen de adenocarcinoma de pulmón. La tinción de p40 (marrón, nuclear) y CK5 (roja, citoplásmica) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente estar ausente en la misma.
La figura 38 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo del cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] napsina A que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de p40 (marrón) es nuclear. La de napsina A (roja, citoplásmica) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente restringirse al tejido pulmonar normal.
La figura 39 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo del cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] napsina A que tiñe un espécimen de adenocarcinoma de pulmón. La tinción de napsina A (roja) es citoplásmica. La tinción de p40 (marrón, nuclear) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente estar ausente en la misma. La figura 40 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de un cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] HMWCK P504S que tiñe un espécimen de próstata, que puede contener áreas de próstata posiblemente normal, posiblemente adenocarcinoma de próstata e incluso posiblemente neoplasia intraepitelial de próstata (PIN). La tinción de p40 (marrón) es nuclear. La tinción de HMWCK (marrón) es citoplásmica. La tinción de P504S (roja) es citoplásmica y posiblemente granular.
La figura 41 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de un cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] CK5/14 P504S que tiñe un espécimen de próstata, que posiblemente puede contener áreas de próstata normal, posiblemente adenocarcinoma de próstata e incluso posiblemente neoplasia intraepitelial de próstata. (PIN). La tinción de p40 (marrón) es nuclear. La tinción de CK5/14 (marrón) es citoplásmica. La tinción de P504S (roja) es citoplásmica y posiblemente granular.
La figura 42 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de un cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] CK5/14 CK7/18 que tiñe un espécimen de tejido mamario, posiblemente tejido anormal, o incluso posiblemente cáncer de mama. La tinción de p40 (marrón) es nuclear. La tinción de CK5/14 (marrón) es citoplásmica. La tinción de CK7/18 (roja) es citoplásmica.
La figura 43 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de un cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] CK5/14 CK7/18 que tiñe un espécimen de tejido mamario, posiblemente tejido anormal, o incluso posiblemente cáncer de mama. La tinción de p40 (marrón) es nuclear y posiblemente es reducida en esta muestra, o esté ausente en la misma. La tinción de CK5/14 (marrón) y CK7/18 (roja) es citoplásmica y membranosa. El patrón de tinción observado es posiblemente la tinción bimodal.
La figura 44 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de un cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] CK5/14 CK8/18 que tiñe un espécimen de tejido mamario, posiblemente tejido anormal, o incluso posiblemente cáncer de mama. La tinción de p40 (marrón) es nuclear y posiblemente es reducida en esta muestra, o esté ausente en la misma. La tinción de CK5/14 (marrón) y CK8/18 (roja) es citoplásmica.
La figura 45 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de un cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] uroplaquina II uroplaquina III que tiñe un espécimen de carcinoma urotelial. La tinción de p40 (marrón) es nuclear. La tinción de uroplaquina II (marrón) y uroplaquina III (marrón) es citoplásmica y membranosa.
La figura 46 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de un cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] uroplaquina II uroplaquina III GATA-3 que tiñe un espécimen de carcinoma urotelial. La tinción de p40 (marrón) y GATA-3 (roja) es nuclear. La tinción de uroplaquina II (marrón) y uroplaquina III (marrón) es citoplásmica y membranosa.
La figura 47 muestra una versión en blanco y negro de un ejemplo de un cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] CK5 que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de p40 (marrón) es nuclear y la tinción de CK5 (marrón) es citoplásmica.
La figura 48 muestra una versión en blanco y negro de la reactividad del anticuerpo anti-p40 BC28 con proteína p40 (panel izquierdo, carril 2) y proteína TAp63 (panel izquierdo, carril 3) por transferencia Western. El panel derecho muestra la reactividad del anticuerpo anti-p634A4 con la proteína p40 (panel derecho, carril 2) y la proteína TAp63 (panel derecho, carril 3) por transferencia de Western. El carril 1 es el lisado de control en ambos paneles.
La figura 49 muestra un ejemplo de un resumen esquemático de un kit según diversas realizaciones de la presente invención.
La figura 50 muestra un ejemplo de un resumen esquemático de un procedimiento de inmunoensayo, según diversas realizaciones de la presente invención.
La figura 51 muestra la versión en color de la figura 1, de un ejemplo del anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe un caso de carcinoma de células escamosas de pulmón.
La figura 52 muestra la versión en color de la figura 2, de un ejemplo de anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe un caso de carcinoma de células escamosas de pulmón.
La figura 53 muestra la versión en color de la figura 3, de un ejemplo de anticuerpo anti-p40 RP que tiñe el mismo caso de carcinoma de células escamosas de pulmón, tal como se muestra en la figura 52.
La figura 54 muestra la versión en color de la figura 4, de un ejemplo del anticuerpo anti-p40 BC28 en un caso de adenocarcinoma de pulmón, sin tinción por el BC28.
La figura 55 es la versión en color de la figura 5, de un ejemplo de anticuerpo anti-p40 RP que tiñe el mismo caso de adenocarcinoma de pulmón, tal como se muestra en la figura 54.
La figura 56 muestra la versión en color de la figura 6, de un ejemplo del anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe un caso de cáncer de vejiga.
La figura 57 muestra la versión en color de la figura 7, de un ejemplo de anticuerpo anti-p634A4 que tiñe el mismo espécimen de cáncer de vejiga, tal como se muestra en la figura 56.
La figura 58 muestra la versión en color de la figura 8, de un ejemplo del anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe un caso de cáncer de vejiga.
La figura 59 muestra la versión en color de la figura 9, de un ejemplo del anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe las glándulas prostáticas normales.
La figura 60 muestra la versión en color de la figura 10, de un ejemplo del anticuerpo anti-p40 BC28 en un caso de adenocarcinoma de próstata, sin tinción por BC28.
La figura 61 muestra la versión en color de la figura 11, de un ejemplo del anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe los conductos mamarios normales.
La figura 62 muestra la versión en color de la figura 12, de un ejemplo de anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe un caso de carcinoma ductal mamario in situ (CDIS).
La figura 63 muestra la versión en color de la figura 13, de un ejemplo del anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe un caso de carcinoma de células basales de la piel.
La figura 64 muestra la versión en color de la figura 14, de un ejemplo del anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe un caso de carcinoma de células escamosas de laringe.
La figura 65 muestra la versión en color de la figura 15, de un ejemplo del anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe un caso de carcinoma de células escamosas de la epiglotis.
La figura 66 muestra la versión en color de la figura 16, de un ejemplo de tinción moderada de macrófagos intraalveolares en la misma muestra de pulmón de la figura 67, por el anticuerpo anti-p40 RP.
La figura 67 muestra la versión en color de la figura 17, de un ejemplo de una tinción muy débil de macrófagos intraalveolares en el pulmón, o posiblemente la ausencia de la misma, por el anticuerpo anti-p40 BC28.
La figura 68 muestra la versión en color de la figura 18, de un ejemplo de anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe el intestino delgado, con una tinción de fondo muy débil, o posiblemente la ausencia de la misma.
La figura 69 muestra la versión en color de la figura 19, de un ejemplo del anticuerpo anti-p634A4 que tiñe el mismo caso del intestino delgado, tal como se muestra en la figura 18, en la que está presente la tinción de fondo.
La figura 70 muestra la versión en color de la figura 20, de un ejemplo de anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe núcleos de células mioepiteliales de un conducto mamario, sin tinción citoplasmática.
La figura 71 muestra la versión en color de la figura 21, de un ejemplo de anticuerpo anti-p634A4 que tiñe el mismo espécimen de mama de la figura 70; sin embargo, hay una fuerte tinción citoplásmica.
La figura 72 muestra la versión en color de la figura 22, de un ejemplo de anticuerpo anti-p40 BC28 que tiñe el tejido de la próstata, posiblemente un espécimen de neoplasia intraepitelial prostática (PIN), con una fuerte tinción nuclear de las células basales de la glándula. La tinción es ligeramente más intensa y más aguda que la de la figura 73. La figura 73 muestra la versión en color de la figura 23, de un ejemplo del anticuerpo anti-p634A4 que tiñe el mismo espécimen de próstata de la figura 72, con una fuerte tinción nuclear de las células basales de la glándula. La tinción es ligeramente menos intensa y menos aguda que la del BC28 en la figura 72. Además, se tiñen menos células basales con 4A4 que con el BC28.
La figura 74 muestra la versión en color de la figura 24, de un ejemplo del anticuerpo BC28 anti-p40 que tiñe el tejido de próstata, posiblemente un espécimen de neoplasia intraepitelial prostática (PIN), con una fuerte tinción nuclear de las células basales de la glándula.
La figura 75 muestra la versión en color de la figura 25, de un ejemplo de anticuerpo anti-p634A4 que tiñe el mismo espécimen de próstata de la figura 72, con una fuerte tinción nuclear de las células basales de la glándula.
La figura 76 muestra la versión en color de la figura 26, de un ejemplo de DSG-3 CK5 p40 [BC28] napsina A que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de DSG-3 (marrón) es membranosa; la tinción de CK5 (marrón) es citoplásmica; la tinción de p40 (marrón) es nuclear. La tinción de napsina A puede ser reducida, o posiblemente restringirse al pulmón normal residual en este espécimen.
La figura 77 muestra la versión en color de la figura 27, de un ejemplo de DSG-3 CK5 p40 [BC28] napsina A que tiñe un espécimen de adenocarcinoma de pulmón. La tinción de napsina A (roja) es citoplásmica. La tinción de DSG-3, CK5 y p40 (marrón) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente estar ausente en la misma.
La figura 78 muestra la versión en color de la figura 28, de un ejemplo de DSG-3 CK5 p40 [BC28] que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de DSG-3 (marrón) es membranosa; la tinción de CK5 (marrón) es citoplásmica; la tinción de p40 (marrón) es nuclear.
La figura 79 muestra la versión en color de la figura 29, de un ejemplo de DSG-3 CK5 p40 [BC28] que tiñe un espécimen de adenocarcinoma de pulmón. La tinción de DSG-3, CK5 y p40 (marrón) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente estar ausente en la misma.
La figura 80 muestra la versión en color de la figura 30, de un ejemplo del cóctel de anticuerpos DSG-3 p40 [BC28] napsina A, que tiñe un espécimen de adenocarcinoma de pulmón. La tinción de napsina A (roja) es citoplásmica. La tinción de DSG-3 (marrón, membranosa) y p40 (marrón, nuclear) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente estar ausente en la misma.
La figura 81 muestra la versión en color de la figura 31, de un ejemplo del cóctel de anticuerpos DSG-3 p40 [BC28] napsina A que tiñe un espécimen de adenocarcinoma de pulmón. La tinción de napsina A (roja) es citoplásmica. La tinción de DSG-3 (marrón, membranosa) y p40 (marrón, nuclear) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente restringirse al tejido pulmonar normal en la misma.
La figura 82 muestra la versión en color de la figura 32, de un ejemplo del cóctel de anticuerpos DSG-3 p40 [BC28] napsina A que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de DSG-3 (marrón) es membranosa. La tinción de p40 (marrón, nuclear) y napsina A (roja, citoplasmática) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente estar ausente en la misma.
La figura 83 muestra la versión en color de la figura 33, de un ejemplo del cóctel de anticuerpos DSG-3 p40 [BC28] napsina A que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de DSG-3 (marrón) es membranosa y la tinción de p40 (marrón) es nuclear. La napsina A (roja, citoplásmica) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente restringirse al tejido pulmonar normal.
La figura 84 muestra la versión en color de la figura 34, de un ejemplo del cóctel de anticuerpos DSG-3 p40 [BC28] napsina A que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de p40 (marrón) es nuclear. La tinción de DSG-3 (marrón, membranosa) y/o napsina A (roja, citoplasmática) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente estar ausente en la misma.
La figura 85 muestra la versión en color de la figura 35, de un ejemplo del cóctel de anticuerpos DSG-3 p40 [BC28] que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de DSG-3 (marrón) es membranosa y la tinción de p40 (marrón) es nuclear.
La figura 86 muestra la versión en color de la figura 36, de un ejemplo del cóctel de anticuerpos p40 [BC28] CK5 (RM) que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de p40 (marrón) es nuclear y la tinción de CK5 (roja) es citoplásmica.
La figura 87 muestra la versión en color de la figura 37, de un ejemplo del cóctel de anticuerpos p40 [BC28] CK5 (RM) que tiñe un espécimen de adenocarcinoma de pulmón. La tinción de p40 (marrón, nuclear) y CK5 (roja, citoplásmica) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente estar ausente en la misma.
La figura 88 muestra la versión en color de la figura 38, de un ejemplo del cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] napsina A que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de p40 (marrón) es nuclear. La de napsina A (roja, citoplásmica) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente restringirse al tejido pulmonar normal.
La figura 89 muestra la versión en color de la figura 39, de un ejemplo del cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] napsina A que tiñe un espécimen de adenocarcinoma de pulmón. La tinción de napsina A (roja) es citoplásmica. La tinción de p40 (marrón, nuclear) puede ser reducida en esta muestra, o posiblemente estar ausente en la misma. La figura 90 muestra la versión en color de la figura 40, de un ejemplo de un cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] HMWCK P504S que tiñe un espécimen de próstata, que puede contener áreas de próstata posiblemente normal, posiblemente adenocarcinoma de próstata e incluso posiblemente neoplasia intraepitelial de próstata (PIN). La tinción de p40 (marrón) es nuclear. La tinción de HMWCK (marrón) es citoplásmica. La tinción de P504S (roja) es citoplásmica y posiblemente granular.
La figura 91 muestra la versión en color de la figura 41, de un ejemplo de un cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] CK5/14 P504S que tiñe un espécimen de próstata, que puede contener áreas de próstata posiblemente normal, posiblemente adenocarcinoma de próstata e incluso posiblemente neoplasia intraepitelial prostática (PIN). La tinción de p40 (marrón) es nuclear. La tinción de CK5/14 (marrón) es citoplásmica. La tinción de P504S (roja) es citoplásmica y posiblemente granular.
La figura 92 muestra la versión en color de la figura 42, de un ejemplo de un cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] CK5/14 CK7/18 que tiñe una muestra de tejido mamario, posiblemente tejido anormal, o incluso posiblemente cáncer de mama. La tinción de p40 (marrón) es nuclear. La tinción de CK5/14 (marrón) es citoplásmica. La tinción de CK7/18 (roja) es citoplásmica.
La figura 93 muestra la versión en color de la figura 43, de un ejemplo de un cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] CK5/14 CK7/18 que tiñe un espécimen de tejido mamario, posiblemente tejido anormal, o incluso posiblemente cáncer de mama. La tinción de p40 (marrón) es nuclear y posiblemente se reduzca, o esté ausente, en esta muestra. La tinción de CK5/14 (marrón) y CK7/18 (roja) es citoplásmica y membranosa. El patrón de tinción observado es posiblemente la tinción bimodal.
La figura 94 muestra la versión en color de la figura 44, de un ejemplo de un cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] CK5/14 CK8/18 que tiñe un espécimen de tejido mamario, posiblemente tejido anormal, o incluso posiblemente cáncer de mama. La tinción de p40 (marrón) es nuclear y posiblemente sea reducida en esta muestra, o esté ausente en la misma. La tinción de CK5/14 (marrón) y CK8/18 (roja) es citoplásmica.
La figura 95 muestra la versión en color de la figura 45, de un ejemplo de un cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] uroplaquina II uroplaquina III que tiñe un espécimen de carcinoma urotelial. La tinción de p40 (marrón) es nuclear. La tinción de uroplaquina II (marrón) y uroplaquina III (marrón) es citoplásmica y membranosa.
La figura 96 muestra la versión en color de la figura 46, de un ejemplo de un cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] uroplaquina II uroplaquina III GATA-3 que tiñe un espécimen de carcinoma urotelial. La tinción de p40 (marrón) y GATA-3 (roja) es nuclear. La tinción de uroplaquina II (marrón) y uroplaquina III (marrón) es citoplásmica y membranosa.
La figura 97 muestra la versión en color de la figura 47, de un ejemplo de un cóctel de anticuerpos de p40 [BC28] CK5 que tiñe un espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón. La tinción de p40 (marrón) es nuclear y la tinción de CK5 (marrón) es citoplásmica.
La figura 98 muestra la versión en color de la figura 48, de la reactividad del anticuerpo anti-p40 BC28 frente a la proteína p40 (panel izquierdo, carril 2) y la proteína TAp63 (panel izquierdo, carril 3) mediante transferencia de Western. El panel derecho muestra la reactividad del anticuerpo anti-p63 4A4 frente a la proteína p40 (panel derecho, carril 2) y la proteína TAp63 (panel derecho, carril 3) por transferencia de Western. El carril 1 es el lisado de control en ambos paneles.
MODO O MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN
La presente invención da a conocer preparaciones aisladas de anticuerpos que se unen específicamente a una proteína p40, en la que dichos anticuerpos se unen a un epítopo en un péptido que comprende una mezcla de la SEQ. ID No. 3 y SEQ ID No. 5; y en las que dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No. 2 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No. 1, según la reivindicación 1. Además, la presente invención da a conocer un anticuerpo o fragmento del mismo producido por el hibridoma depositado en la Colección americana de cultivos tipo (ATCC) bajo la Denominación de depósito de patente ATCC No. PTA-120163, según la reivindicación 3. Además, la presente invención da a conocer composiciones y kits que comprenden dicho anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 3.
La presente invención da a conocer anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a p40, según las reivindicaciones. Estos pueden ser útiles para la detección de p40 en el diagnóstico de varios tipos de cánceres. El anticuerpo monoclonal puede ser un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo monoclonal de ratón, un anticuerpo monoclonal de conejo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal humanizado, un anticuerpo monoclonal humano, un anticuerpo marcado con una señal o tinción detectable, un anticuerpo marcado con una toxina, o similar. Los sistemas y procedimientos dados a conocer pueden relacionarse con el anticuerpo monoclonal o su parte de unión a antígeno capaz de unirse a p40.
Los anticuerpos monoclonales de ratón se pueden utilizar de manera habitual en procedimientos de inmunoensayo para identificar analitos específicos, incluso como anticuerpos primarios en procedimientos de inmunohistoquímica. Los anticuerpos monoclonales de ratón específicos para la proteína diana de interés se pueden producir utilizando procedimientos conocidos de manera general. En general, la exposición de un ratón al antígeno de interés (por ejemplo, un fragmento peptídico de la diana deseada o de la proteína de longitud completa) puede inducir una respuesta inmune en la que el ratón genera múltiples anticuerpos que se unen al antígeno, cada uno de los cuales puede producirse por una célula B particular. Estas células B pueden aislarse del bazo del ratón y los anticuerpos producidos pueden evaluarse para determinar su idoneidad como anticuerpos primarios en IHC. Después de seleccionar el anticuerpo óptimo, las células B asociadas pueden fusionarse con una célula tumoral utilizando procedimientos conocidos, lo que posiblemente dé como resultado un hibridoma, una nueva línea celular que puede replicarse sin cesar y puede producir continuamente el anticuerpo deseado.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser preferentes en ciertas realizaciones sobre los anticuerpos policlonales, por varias razones. En particular, los anticuerpos monoclonales pueden derivarse de una única célula B y, como tales, pueden reconocer un solo epítopo, lo que posiblemente dé como resultado una mayor especificidad. Los anticuerpos monoclonales también pueden generarse de manera conveniente y reproducible en cultivos celulares, lo que posiblemente provoque un suministro constante del anticuerpo deseado. Por supuesto, los anticuerpos policlonales se pueden utilizar en otras realizaciones.
Los anticuerpos anti-p40, como un anticuerpo monoclonal de ratón anti-p40 BC28, pueden producirse utilizando estos procedimientos generales y pueden evaluarse mediante inmunohistoquímica para determinar la sensibilidad y especificidad en una variedad de tejidos normales y neoplásicos, posiblemente en comparación, particularmente, con el anticuerpo anti-p40 RP y el anticuerpo anti-p63 [4A4] conocidos previamente.
Ejemplo de preparación de péptidos: se puede sintetizar un péptido p40 a partir de la secuencia de aminoácidos 1 a 17aa, correspondiente a la secuencia MLYLENNAQTQFSEPQY, en un sintetizador de péptidos semiautomático. De manera similar, se puede sintetizar un péptido p40 de la secuencia de aminoácidos 5 a 17aa, correspondiente a la secuencia ENNAQTQFSEPQY, en un sintetizador de péptidos semiautomático. El péptido puede conjugarse covalentemente con una molécula portadora. En una realización, se puede utilizar una molécula portadora de hemocianina de lapa californiana (KLH). El péptido también se puede conjugar con gamma globulina de cabra (GGG) para el inmunoensayo.
Ejemplo de inmunización del huésped: se pueden inmunizar ratones BALB/c hembra (de, aproximadamente, 6 a, aproximadamente, 8 semanas de edad) por vía intraperitoneal (ip) con, aproximadamente, 100 |¿g de péptido p40 humano por ratón en adyuvante completo de Freund. Los péptidos p40 utilizados para la inmunización pueden corresponder a la secuencia de aminoácidos de 1-17 de p40, la secuencia de aminoácidos de 1-9 de p40, una mezcla de las secuencias de aminoácidos 1-17 con 5-17 de p40, o cualquier parte de esta secuencia, y todas las permutaciones y combinaciones de las mismas. Se puede utilizar un solo péptido como el inmunógeno, o posiblemente una mezcla de péptidos derivados de la secuencia de aminoácidos de 1-17, 1-9, una mezcla de 1-17 con 5-17, o similares. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un inmunógeno que incluya el aminoácido en la posición 4, o incluya posiblemente los aminoácidos en la posición 1, 2 o 3, y puede producir anticuerpos con propiedades ventajosas, tales como las observadas con el BC28. Aproximadamente, tres semanas después, los ratones pueden recibir un refuerzo con otros aproximadamente 100 |¿g de p40 humano por ratón en adyuvante incompleto de Freund, aproximadamente, 4 veces más en intervalos de, aproximadamente, 3 semanas. Los ratones pueden sangrarse a partir de las colas y los sueros pueden recolectarse y almacenarse a, aproximadamente, -20°C para el análisis posterior de los títulos de anticuerpos mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Los anticuerpos basados en la secuencia de aminoácidos 5-17 de la proteína p40 no tuvieron éxito y pueden no haber permitido una buena fusión. Por lo tanto, puede que no sea deseable utilizar la secuencia de aminoácidos 5-17 de la proteína p40 para desarrollar un anticuerpo a partir de la misma.
Ejemplo de hibridomas: los hibridomas que producen anticuerpos contra el p40 pueden generarse mediante técnicas estándar a partir de esplenocitos de ratones BALB/c inmunizados con p40. Por ejemplo, los esplenocitos de ratones inmunizados con p40 pueden fusionarse con células de mieloma P3-X63-Ag 8.653 (células de mieloma no secretoras derivadas de ratón Balb/c) mediante incubación con polietilenglicol a, aproximadamente, el 50% en una proporción de, aproximadamente, 4:1. Después de la incubación, las células se pueden sedimentar por centrifugación, posiblemente a, aproximadamente, 300 x g durante, aproximadamente, 10 minutos, se lavan en, aproximadamente, 25 ml de PBS, se vuelven a centrifugar y el sedimento celular se puede volver a suspender en, aproximadamente, 100 ml de medio Dulbecco fresco que contiene, aproximadamente, el 20% de suero bovino fetal (Hyclone, Logan, Utah). Se pueden añadir alícuotas de, aproximadamente, 100 pl a cada pocilio de, aproximadamente, diez placas de microtitulación de 96 pocilios (Corning, Lowell, Massachussets). Aproximadamente, veinticuatro horas después, se pueden añadir a cada pocillo de microtitulación, aproximadamente, 100 pl de medio de cultivo DMEM suplementado con hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT). Los medios pueden reemplazarse posiblemente después de, aproximadamente, 4 días con medios completos (que contengan posiblemente hipoxantina-timidina (HT)). Durante los siguientes 10 días, los medios pueden retirarse y reemplazarse con medios nuevos con una reducción o posiblemente incluso sin la adición de HT. Los sobrenadantes de hibridoma pueden seleccionarse mediante ELISA para determinar la reactividad del anticuerpo frente a p40, y los clones de hibridoma pueden seleccionarse y estabilizarse posiblemente mediante clonación dos veces por dilución limitante.
Las células de hibridoma referidas como clon BC28 de hibridoma anti-p40 humano Lote:011713 se depositaron en la Colección americana de cultivos tipo (ATCC) en Manassas, Virginia, el 29 de enero de 2013 y recibieron la Designación de depósito de patente ATCC No. PTA-120163, tal como se muestra en la exposición adjunta titulada “Certificado de depósito restringido de Budapest” que se incorpora en el presente documento como referencia. Las realizaciones de la presente invención pueden dar a conocer un anticuerpo o fragmento del mismo producido por el hibridoma depositado en la ATCC e incluso puede incluir un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal mediante el cultivo de la célula de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal capaz de reconocer específicamente p40 e incluso permitir que el hibridoma produzca anticuerpos monoclonales.
ELISA: las respuestas inmunes antisuero del huésped frente a p40 pueden medirse por ELISA. Por ejemplo, se puede utilizar una solución de p40 (aproximadamente, 1 pg/ml) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para recubrir placas de poliestireno de fondo plano de, aproximadamente, 96 pocillos. A continuación, las placas pueden bloquearse con PBS con, aproximadamente, el 1% de albúmina de suero bovino (BSA). Se pueden añadir sueros inmunitarios diluidos o sobrenadantes de hibridoma e incubar a, aproximadamente, 37°C durante, aproximadamente, 1 hora. Después de lavar las placas con PBS, las placas se pueden incubar con reactivos anti-ratón-HRP de cabra (Jackson Labs). Las incubaciones se pueden realizar a, aproximadamente, 37°C durante, aproximadamente, 30 minutos. El sustrato ABTS se puede añadir para revelar el color y se puede medir la absorbancia a, aproximadamente, 405 nm (A405) en un lector de placas de microtitulación.
Isotipo de los anticuerpos monoclonales: los anticuerpos anti-p40, tales como el anticuerpo monoclonal BC28, pueden ser isotipados utilizando un kit de isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón (Invitrogen, Carlsbad, California). Por ejemplo, se pueden añadir, aproximadamente, 100 pl de sobrenadante a partir de células de anticuerpo monoclonal de ratón [BC28] a las cadenas pesadas y cadenas ligeras kappa y lambda de IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgM e IgA recubiertas en placa con anti-ratón de cabra. Después de, aproximadamente, 30 minutos de incubación, la placa se puede lavar, aproximadamente, 3 veces con PBS y se puede incubar con un reactivo de Ig-HRP anti-ratón de cabra. El sustrato ABTS se puede añadir para revelar el color y se puede medir la absorbancia a, aproximadamente, 405 nm (A405) en un lector de placas de microtitulación. Se puede ensayar el isotipo del clon BC28 y puede identificarse como un IgG1/kappa de ratón.
Producción y purificación de anticuerpos: las células de hibridoma seleccionadas del clon BC28 pueden cultivarse con medio de cultivo DMEM complementado con, aproximadamente, el 10% de FBS o cualquier medio sin suero. Los sobrenadantes de cultivo pueden purificarse adicionalmente mediante una columna de afinidad de proteína A. Las células de hibridoma también pueden inyectarse en ratones BALB/c cebados con pristano para producir ascitis por anticuerpos. La ascitis de anticuerpos puede purificarse adicionalmente mediante la columna de afinidad de proteína A. La concentración de IgG se puede medir espectrofotométricamente utilizando el coeficiente de extinción para la IgG humana de, aproximadamente, 1,4 a, aproximadamente, 280 nm. La pureza de la IgG se puede determinar mediante SDS-PAGE.
Reactividad cruzada ensayada mediante transferencia de Western: se puede caracterizar el anticuerpo monoclonal purificado [BC28] por transferencia de Western (figuras 48 y 98). Los lisados celulares transfectados con p40 o TAp63 de longitud completa (Origene, Rockville, Maryland) pueden someterse a electroforesis en gel de proteínas utilizando de, aproximadamente, el 4 a, aproximadamente, el 12% de SDS-PAGE con tampón de tris-glicina y pueden transferirse a filtros de nitrocelulosa en tampón de tris-glicina. Las proteínas en las transferencias se pueden visualizar incubando el anticuerpo monoclonal p63 4A4 o el anticuerpo BC28 durante, aproximadamente, 60 minutos a temperatura ambiente después de bloquear con el tampón de bloqueo, seguido posiblemente de incubación con inmunoglobulinas anti-ratón de cabra conjugadas con peroxidasa. Las transferencias se pueden detectar utilizando el cromógeno TMB.
Determinación de las secuencias VH y VL: se puede extraer el ARN total de los hibridomas utilizando el kit Qiagen (EE.UU., Gaithersburg, Maryland) según las instrucciones del fabricante. La primera ronda de RT-PCR se puede realizar con el kit QIAGEN® OneStep RT-PCR. La RT-PCR se puede realizar con conjuntos de cebadores específicos para las cadenas pesada y ligera. Para cada muestra de ARN, se pueden configurar, aproximadamente, 12 reacciones de RT-PCR de cadena pesada individual y, aproximadamente, 11 de cadena ligera utilizando mezclas de cebadores directos degenerados que cubren las secuencias líderes de las regiones variables. Los cebadores inversos pueden ubicarse en las regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras. Los sitios de restricción pueden no estar diseñados en los cebadores. Los productos de RT-PCR de las reacciones de primera ronda pueden amplificarse en la segunda ronda de PCR. Se pueden configurar, aproximadamente, 12 reacciones de RT-PCR de cadena pesada individual y, aproximadamente, 11 de cadena ligera utilizando conjuntos de cebadores semianidados específicos para las regiones variables de anticuerpos. Los ADNc amplificados se pueden purificar en gel y posteriormente se pueden secuenciar.
Los dominios variables de BC28 se secuenciaron para proporcionar polinucleótidos aislados que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos de una o más de las CDR de las regiones variables de la cadena ligera y/o pesada de un anticuerpo monoclonal, descrito en el presente documento, que se une al epítopo p40 MLYLENNa QtQfSEPQY, identificado como la SEQ ID No. 3 o MLYLENNAQ identificado como la SEQ ID No. 4. La secuencia de la región variable de la cadena pesada se identifica como la SEQ ID No. 1 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera se identifica como la SEQ ID No. 2. Un anticuerpo o fragmento del mismo puede incluir un polipéptido de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No. 1 y/o la SEQ ID No. 2. Un anticuerpo o fragmento del mismo puede incluir una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No. 2 e incluso puede incluir una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No. 1. Un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse específicamente a, como mínimo, un polipéptido de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 3 y/o la SEQ ID No. 4. Tal como se menciona en el presente documento, un fragmento del mismo puede incluir un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Mapeo de epítopos de la secuencia de unión del [BC28] anti-p40 de ratón: con el fin de determinar la secuencia peptídica de p40 que es reconocida por los anticuerpos anti-p40, tales como el BC28, el mapeo de epítopos puede llevarse a cabo utilizando dos ensayos: ELISA directo e incluso transferencia puntual. En un ensayo de ELISA, la sensibilidad y especificidad del anticuerpo anti-p40 [BC28] se puede determinar midiendo el título del anticuerpo a, aproximadamente, 1:500 y, aproximadamente, 1:1000. Se pueden utilizar péptidos superpuestos con una longitud de, aproximadamente, 15 aminoácidos cada uno, que cubren la secuencia de la proteína p40 humana de posiblemente 1 a 17 aminoácidos, para determinar una secuencia de unión a BC28.
Uno de los epítopos para el BC28 puede incluir los residuos de los aminoácidos 1-17 de p40, que son MLYLENNAQTQFSEPQY, identificados como la SEQ ID No. 3. Otro epítopo puede incluir los residuos de los aminoácidos 1-9 de p40, que son MLYLENNAQ, identificados como la SEQ ID No. 4. Otro epítopo más puede incluir una mezcla de la SEQ ID No. 4 y los residuos de los aminoácidos 5-17 de p40 que son ENNAQTQFSEPQY, identificados como la SEQ ID No. 5. Los anticuerpos pueden generarse utilizando como inmunógeno una secuencia peptídica de la SEQ ID No. 3, la SEQ ID No. 4, o posiblemente incluso una mezcla de la SEQ ID NO. 3 con la SEQ. ID No. 5. El epítopo del anticuerpo p40 [BC28] monoclonal de ratón, o una parte del mismo, puede ser un antígeno útil para la producción de nuevos anticuerpos monoclonales, incluida la producción en especies distintas del ratón (por ejemplo, conejo, cabra, caballo, pollo, etc.). Por supuesto, un anticuerpo policlonal puede unirse específicamente a un epítopo en la SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, o posiblemente incluso una mezcla de la SEQ ID No. 4 y la SEQ ID NO. 5, o cualquier combinación o permutación de las mismas.
Para el protocolo ELISA directo, las placas se pueden recubrir en primer lugar con, aproximadamente, 100 pl de péptidos p40 a, aproximadamente, 5 pg /ml en tampón de recubrimiento (pH, aproximadamente, 9,5) durante toda la noche a, aproximadamente, 4°C, seguido de bloqueo (BSA aproximadamente al 3%) a, aproximadamente, 200 pl/pocillo durante, aproximadamente, 1 hora a temperatura ambiente. Las placas pueden incubarse con anticuerpo p40 purificado a, aproximadamente, 100 ng/ml y, aproximadamente, 200 ng/ml por separado durante, aproximadamente, 1 hora a, aproximadamente, temperatura ambiente en un agitador de placas ELISA. Posteriormente, las placas se pueden lavar posiblemente cinco veces con PBST (aproximadamente 300 pl/pocillo) seguido de la adición de IgG-HRP anti-ratón de cabra a las placas y la incubación durante, aproximadamente, 1 hora en un agitador de placas. Posteriormente, las placas pueden lavarse con PBST (aproximadamente 300 pl/pocillo) y secarse, y se puede añadir TMB a, aproximadamente, 100 pl/pocillo, revelarse durante, aproximadamente, 5 minutos en un agitador, e incluso puede ir seguido de una solución de parada (aproximadamente 50 pl/pocillo). La absorbancia se puede medir a, aproximadamente, 450 nm en un lector de placas ELISA, posiblemente según las recomendaciones del fabricante.
Para el ensayo de transferencia puntual, una membrana de nitrocelulosa se puede transferir con, aproximadamente, 1 pl a una concentración de, aproximadamente, 1 mg/ml del péptido, cuadruplicados por péptido. Esta membrana puede incubarse durante, aproximadamente, 1 hora a temperatura ambiente hasta que esté completamente seca. La membrana se puede bloquear con, aproximadamente, 3% de BSA en TBST (por ejemplo, Tris aproximadamente, 50 mM, NaCl aproximadamente, 0,5 M, Tween-20 aproximadamente, al 0,05%, pH, aproximadamente, 7,4) durante, aproximadamente, 1 hora a temperatura ambiente, posteriormente el anticuerpo [BC28] anti p40 de ratón se puede añadir a, aproximadamente, 200 ng/ml durante, aproximadamente, 1 hora a temperatura ambiente en TBST. Posteriormente, la membrana se puede lavar, aproximadamente, 3 veces (aproximadamente 10 minutos cada una) en TBST en un agitador orbital, seguido de incubación con anticuerpo secundario IgG1-AP anti-ratón de cabra durante, aproximadamente, 1 hora a temperatura ambiente en TBST. La membrana se puede lavar, aproximadamente, 3 veces (aproximadamente 10 minutos cada una) en TBST en un agitador de balanceo. La unión puede detectarse agregando reactivos de detección quimioluminiscentes de Western Glo y exponiéndolos a la película.
Procedimiento de IHC con el BC28 anti-p40: se puede realizar inmunohistoquímica con anticuerpos anti-p40, tales como el anticuerpo anti-p40 BC28 monoclonal de ratón en muestras de tejido incluidas en parafina y fijadas con formalina (FFPE) utilizando procedimientos conocidos de manera general por los técnicos en la materia, tales como los ejemplificados en general por los siguientes ejemplos, que no constituyen limitación (por ejemplo, lavados con solución salina tamponada con Tris, pH alrededor de 7,6, entre etapas):
1) Las secciones (~5 pm) de tejidos incluidos en parafina fijados con formalina pueden montarse sobre portaobjetos de microscopio disponibles en el mercado, recubiertos posiblemente con polilisina.
2) Las secciones se pueden desparafinar (utilizando xilenos o un sustituto de xileno) y pueden rehidratarse posiblemente a través de una serie de soluciones de alcohol/agua, seguido posiblemente de un bloqueo de las peroxidasas endógenas, posiblemente con, aproximadamente, un 3% de solución de peróxido de hidrógeno. 3) Las muestras pueden someterse a la recuperación de antígenos inducida por calor utilizando un tampón de citrato en un dispositivo de calentamiento a presión (Diva, Decloaking Chamber; Biocare Medical) y pueden calentarse a, aproximadamente, 125°C durante, aproximadamente, 30 segundos. [Otros procedimientos de recuperación de antígenos conocidos por los técnicos en la materia (por ejemplo, vapor, horno de microondas, enzima o similares) también pueden ser aceptables]. Los tejidos pueden dejarse enfriar durante, aproximadamente, 10 minutos y posteriormente pueden enjuagarse con agua desionizada.
4) El anticuerpo p40 BC28 se puede aplicar en una solución tamponada con fosfato (pH de, aproximadamente, 6,0) con albúmina de suero bovino como proteína transportadora durante, aproximadamente, 30 minutos. El anticuerpo p40 BC28 puede diluirse posiblemente 1:500.
5) La detección del anticuerpo p40 posiblemente con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (MACH 4 Universal HRP-Polymer Detection, Biocare Medical) se puede realizar en dos etapas. Una aplicación inicial de un anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón durante, aproximadamente, 10 minutos se puede seguir mediante incubación con un conjugado de cabra anti-conejo-HRP durante, aproximadamente, 10 minutos.
6) Posiblemente en una etapa de detección final, se puede aplicar 3,3’-diaminobenzidina (DAB) en un tampón que contiene, posiblemente, aproximadamente, un 0,02% de peróxido de hidrógeno (Betazoid DAB, Biocare Medical). La oxidación de DAB a través de un mecanismo mediado por HRP puede dar como resultado la precipitación de un producto marrón cromogénico, lo que permite posiblemente la identificación de los sitios de expresión de p40.
7) Las secciones se pueden contrateñir brevemente, posiblemente en la hematoxilina de Mayer modificada.
Resultados de la tinción IHC con el anticuerpo anti-p40 BC28 monoclonal de ratón: utilizando el protocolo anterior, se evaluó una variedad de tejidos normales y neoplásicos para determinar la expresión de p40 utilizando BC28 y en algunos casos se compararon con los patrones de tinción utilizando un anticuerpo anti-p40 RP y un anticuerpo anti-p63 [4A4] monoclonal de ratón. Se optimizó el título de todos los anticuerpos (por ejemplo, la concentración) utilizando procedimientos bien conocidos por los técnicos en la materia. Por ejemplo, se evaluaron varios títulos de anticuerpos para maximizar la intensidad de la tinción, a la vez que posiblemente se minimiza o incluso se elimina la tinción de fondo. Para cada anticuerpo, se utilizó el título que proporcionó la intensidad de tinción máxima, posiblemente con la tinción de fondo mínima.
Las figuras 1 y 51 muestran la tinción de un espécimen FFPE de carcinoma escamoso de pulmón por el anticuerpo anti-p40 [BC28]. La tinción nuclear de p40 se observa, como se espera, sin tinción aparente de fondo. En la figura 2 y 52 se muestra un caso diferente de carcinoma de células escamosas de pulmón teñido con el BC28. La tinción de p40 con el BC28 puede ser especialmente fuerte, posiblemente incluso sin fondo aparente o tinción inespecífica. En contraste, la tinción del mismo caso con el anticuerpo anti-40 de RP puede dar como resultado una tinción menos intensa y una tinción de fondo especialmente clara en el tejido estromal (figura 3 y 53).
En las figuras 4 y 54, se aplicó BC28 a un caso de adenocarcinoma de pulmón, posiblemente sin tinción visible. Este puede ser un resultado útil, ya que no se puede esperar que p40 se exprese significativamente en el adenocarcinoma de pulmón, por lo que puede ser preferente una tinción negativa. La tinción del mismo caso de adenocarcinoma de pulmón con el anticuerpo anti-p40 RP puede dar como resultado una tinción citoplásmica positiva de intensidad moderada, un resultado potencialmente ambiguo que lo hace más difícil de interpretar (figuras 5 y 55).
Las figuras 6, 7, 56 y 57 muestran ejemplos de tinción por BC28 y anti-p40 RP en un caso de cáncer de vejiga (carcinoma de células de transición de vejiga o carcinoma urotelial). En las figuras 6 y 56, se puede observar una fuerte tinción nuclear de p40, posiblemente incluso con una tinción de fondo mínima o nula. En las figuras 7 y 57, se observa una tinción nuclear más clara de p63 con tinción citoplásmica de fondo. Las figuras 8 y 58 muestran un ejemplo de fuerte tinción con el BC28 en el carcinoma urotelial.
Puede esperarse la expresión de p40 en las células basales de las glándulas prostáticas, posiblemente en consonancia con la tinción observada en la próstata normal con el BC28 (figuras 9 y 59). La progresión de lesiones premalignas, tales como la neoplasia intraepitelial prostática (PIN) a un adenocarcinoma de próstata invasivo puede ocasionar la pérdida de expresión de p40 en las células basales. Como resultado, la falta de tinción con el BC28 puede ser un marcador útil para la ausencia de p40 en el cáncer de próstata, tal como se muestra en las figuras 10 y 60. En algunos casos de próstata, el BC28 puede proporcionar una tinción más intensa y con más contraste, y posiblemente tiña una mayor cantidad de células basales que los anticuerpos alternativos, tales como el 4A4 (figuras 22 y 72, y 23 y 73, respectivamente). Las figuras 24, 74, 25 y 75 muestran ejemplos de tejido prostático teñido con el BC28 y 4A4, respectivamente, a un aumento de baja potencia. En este caso, BC28 y 4A4 muestran patrones de tinción generales similares, posiblemente con tinciones más intensas y nítidas para el BC28.
De manera similar a la próstata, la expresión de p40 se puede observar en las células mioepiteliales de los conductos mamarios normales, con una pérdida gradual en las lesiones tempranas, y puede tener una ausencia definitiva en el carcinoma de mama invasivo. La tinción de p40 en células mioepiteliales de la capa basal de los conductos mamarios normales puede observarse con el BC28 (figuras 11 y 61). En los casos de carcinoma ductal in situ, la integridad de la capa basal puede verse comprometida y la tinción de p40 con el BC28 puede volverse discontinua (figura 12 y 62). En algunos casos, los anticuerpos alternativos, tales como el 4A4, pueden producir una tinción citoplásmica anómala en el tejido mamario, que está ausente con el BC28 (figuras 20, 70, 21 y 71). Esta tinción citoplasmática con el 4A4 puede estar muy extendida. La ausencia de tinción citoplásmica con el BC28 puede ser una ventaja.
En el carcinoma de células basales de la piel, la tinción con el BC28 puede ser un marcador útil para identificar células tumorales mediante la expresión de p40 (figuras 13 y 63). De manera similar, la tinción con el BC28 puede ser útil para identificar la expresión de p40 en carcinomas de células escamosas, posiblemente incluso como los de la laringe o la epiglotis (figuras 14 y 64 y 15 y 65, respectivamente).
Una desventaja de los anticuerpos anti-p40 distintos al BC28 puede ser la tinción de macrófagos intraalveolares en tejido pulmonar. La tinción positiva de los macrófagos puede llevar a un falso positivo o un diagnóstico incorrecto debido a una tinción errónea. Por ejemplo, se puede observar una tinción moderada de los macrófagos intraalveolares con el anticuerpo anti-p40 RP (figuras 16 y 66). Por el contrario, el BC28 no puede teñir macrófagos intraalveolares de la misma manera, posiblemente una clara ventaja (figuras 17 y 67). La falta de tinción de macrófagos intraalveolares por el BC28 puede simplificar una interpretación diagnóstica e incluso puede eliminar el error potencial de un diagnóstico de falso positivo o incorrecto, posiblemente debido a una tinción inexacta de los macrófagos.
El BC28 puede proporcionar una tinción similar o incluso superior a los anticuerpos alternativos. Por ejemplo, la tinción de las glándulas prostáticas con el BC28 puede ser posiblemente más fuerte e incluso posiblemente teñir más células en la capa basal que el anticuerpo anti-p634A4 (figuras 22, 72 y 23 y 73, y figuras 24 y 74 y 25 y 75). Cuando se tiñen marcadores nucleares, tales como p40 o p63, la tinción citoplasmática puede ser un factor de complicación para un diagnóstico preciso. En algunos casos, el BC28 puede tener la ventaja de proporcionar una tinción nuclear más limpia, posiblemente incluso sin tinción citoplásmica. Por ejemplo, el BC28 puede teñir un caso de cáncer de vejiga con tinción nuclear clara y sin tinción citoplasmática (figuras 6 y 56), en comparación con el 4A4 que puede teñir la misma muestra con tinción citoplásmica de débil a moderada (figuras 7 y 57). De manera similar, el BC28 puede ser negativo en un ejemplo de intestino delgado (figuras 18 y 68); mientras que el 4A4 puede mostrar una tinción citoplásmica distinta en el mismo caso (figuras 19 y 69). En un ejemplo, el BC28 puede también no producir tinción citoplásmica en el tejido mamario (figuras 21 y 71), mientras que se observa la tinción citoplasmática con el 4A4 (figuras 20 y 70). La ausencia de tinción citoplásmica en casos como estos puede ser una clara ventaja del BC28.
La tabla 1 muestra la sensibilidad del anticuerpo anti-p40 [BC28] en 67 casos de carcinoma de células escamosas de pulmón, utilizando una micromatriz de tejido (TMA) de tejido FFPE. Utilizando un límite de >5%, aproximadamente, de células tumorales teñidas como criterio para determinar un caso como “positivo” para p40, y a la inversa, aproximadamente, <5%, aproximadamente de células tumorales teñidas como criterio para determinar un caso “negativo”, se encontraron 65 de 67 (aproximadamente, el 97%) resultados positivos para p40 [BC28]. El diagnóstico de tumores de mayor grado a veces puede ser un desafío. En estas muestras, el anticuerpo anti-p40 [BC28] identificó 35 de 35 (aproximadamente, el 100%) de los tumores de grado II y 26 de 28 (aproximadamente, el 92,9%) de los tumores de grado III.
La tabla 2 muestra un ejemplo de la especificidad del anticuerpo anti-p40 [BC28] que tiñe 71 muestras de carcinoma de adenocarcinoma de pulmón, utilizando una micromatriz de tejido (TMA). Utilizando un límite de >5%, aproximadamente, de células tumorales teñidas como criterio para determinar un caso como “positivo” para p40, y a la inversa, aproximadamente, <5% de células tumorales teñidas como criterio para determinar un caso “negativo”, se encontraron 0 de 71 (aproximadamente, el 0%) resultados positivos para p40 [BC28].
T l 1: n i r n i- 4 B 2 iñ lm n r
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T l 2: n i r n i- 4 ^B 2 iñ AD lm n r
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T l : n i r n i- 4 B 2 iñ i n l i
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La tabla 3 muestra un ejemplo de la sensibilidad del anticuerpo anti-p40 [BC28] en varios otros tejidos neoplásicos. De los 59 casos de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello teñidos con el BC28, se encontró que 46 (aproximadamente, el 78%) eran positivos. El BC28 también fue altamente sensible en el carcinoma urotelial de vejiga, con tinción de 41/48 (aproximadamente, el 85,4%) casos positivos. Se puede esperar una pérdida de la expresión de p40 en el cáncer de mama y el cáncer de próstata. De los 65 casos de cáncer de mama teñidos con el BC28, 47 casos (aproximadamente, el 72,3%) fueron negativos para el p40. En el cáncer de próstata, ninguno de los 12 casos analizados fue positivo para el p40. Además, 15 casos de tejido prostático, que contienen glándulas benignas y neoplasia intraepitelial prostática, se tiñeron con el BC28 y se compararon con p63 [4A4]. Las áreas representativas se compararon para la misma muestra teñida con el BC28 y p63 por dos investigadores diferentes que encontraron que la BC28 era equivalente, o posiblemente superior a p63 en la intensidad de la tinción y la nitidez, con posiblemente menos fondo; sin embargo, el músculo estriado se tiñó con p63 y el BC28 fue negativo. Posiblemente la ausencia de tinción del músculo estriado con el BC28 sea una ventaja.
La sensibilidad del anticuerpo anti-p40 [BC28], en comparación con el anticuerpo anti-p40 RP y el anticuerpo anti-p63 [4A4], puede demostrarse tiñendo varios casos de carcinoma de células escamosas de pulmón con cada anticuerpo (tabla 4). Utilizando los mismos criterios, el anticuerpo anti-p40 [BC28] identificó 65/67 muestras como positivas (aproximadamente, el 97%). En comparación, el anti-p40 RP tiñó 34/41 (aproximadamente, el 83%) de los casos de carcinoma de células escamosas de pulmón como positivas y el anti-p63 [4A4] tiñó 35/41 (aproximadamente, el 85%) de los casos como positivos. Se puede observar una mayor especificidad para el BC28, en comparación con anti-p40 RP y 4A4 en casos de adenocarcinoma de pulmón. El BC28 no tiñó ninguno de los 71 casos de adenocarcinoma de pulmón que se evaluaron, por lo que posiblemente no haya falsos positivos. En comparación, la tinción con anti-p40 RP dio como resultado 1/50 (aproximadamente el 2%) de casos positivos y 5/50 (aproximadamente el 10%) de los casos resultaron positivos cuando se utilizó 4A4.
Tabla 4: m r i n l n i r n i- 4 B 2 RP n i- 4 n i- ^ [4A4]
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El anticuerpo anti-p40 [BC28] puede ser altamente específico cuando se evalúa posiblemente en una variedad de tejidos normales (tabla 5). La tinción de los tejidos normales con p40 se puede observar en los tejidos esperados en función de la presencia de epitelio escamoso (por ejemplo, piel, esófago y vejiga o similares) y tejidos glandulares (por ejemplo, mama y próstata o similares). Puede esperarse dicha tinción y el anticuerpo anti-p40 [BC28] puede no teñir ningún otro tejido normal o neoplásico, lo que puede demostrar su alta especificidad.
Los anticuerpos anti-p40, tales como el anticuerpo anti-p40 [BC28] monoclonal de ratón pueden ofrecer distintas ventajas con su sensibilidad, especificidad y propiedades de tinción mejoradas, posiblemente incluso en comparación con el anticuerpo anti-p40 RP y el anticuerpo anti-p63 [4A4] monoclonal de ratón. Las figuras 2, 52 y las figuras 3, 53 muestran una comparación de BC28 con las secciones seriadas de la tinción del anticuerpo anti-p40 RP del mismo espécimen de carcinoma de células escamosas de pulmón, lo que posiblemente demuestre la mayor intensidad y especificidad de la tinción de BC28. Por ejemplo, la muestra de las figuras 2 y 52 puede exhibir una fuerte tinción nuclear con el BC28 y ninguna tinción aparente en el tejido estromal, mientras que la tinción de la misma muestra con el anticuerpo anti-p40 RP en la figura 3 y 53 puede ser menos intensa y dar como resultado tinción débil en el tejido estromal. Una ventaja importante del BC28 puede ser la especificidad mejorada contra el adenocarcinoma de pulmón, incluso posiblemente en comparación con el anticuerpo anti-p40 RP o 4A4. Por ejemplo, las figuras 5 y 55 muestran un caso de adenocarcinoma de pulmón teñido con anticuerpo anti-p40 RP, que produce una tinción positiva; sin embargo, la tinción del mismo espécimen con el BC28 (figura 4 y 54) es completamente negativa, lo que posiblemente demuestre la especificidad superior de BC28. El anticuerpo anti-p40 BC28 también puede ofrecer una ventaja al no teñir macrófagos intraalveolares en tejido pulmonar. Por ejemplo, el anticuerpo anti-p40 RP puede teñir los macrófagos intraalveolares de manera moderada a fuerte (figuras 16 y 66). En contraste, el BC28 puede teñir los macrófagos de la misma muestra débilmente o posiblemente nada (figura 17 y 67), demostrando posiblemente una especificidad superior del BC28 e incluso un patrón de tinción más limpio. Estos ejemplos demuestran las ventajas de BC28 y muestran posiblemente que el BC28 tiene varias ventajas sobre los anticuerpos conocidos, incluida una sensibilidad o especificidad superior, lo que puede dar como resultado patrones de tinción más limpios, con menos tinción de fondo o citoplásmica indeseable.
T : in i n i n rm l n n i r n i- 4 B 2
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Resultados de transferencias de Western con anticuerpo anti-p40 BC28 monoclonal de ratón
La unión de BC28 a la proteína p40 se puede demostrar mediante transferencia de Western (figura 31, panel izquierdo, carril 2). La ausencia de unión similar de BC28 a la proteína TAp63 también puede mostrarse mediante transferencia de Western (figuras 48 y 98, panel izquierdo, carril 3). A la inversa, el anticuerpo anti-p634A4 puede unirse tanto a la proteína p40 como a la proteína TAp63 (figura 48 y 98, panel derecho, carriles 2 y 3). La mayor especificidad de BC28 (unión a p40, pero no a TAp63) puede ser una ventaja que contribuye a sus propiedades superiores.
En algunas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos anti-p40, tales como el anticuerpo anti-p40 BC28 monoclonal de ratón, pueden ser adecuados para su utilización en muchas variaciones de los protocolos anteriores y otros procedimientos conocidos por los técnicos en la materia. Las muestras teñidas con el BC28 se pueden archivar utilizando un medio de montaje permanente y un cubreobjetos. El anticuerpo BC28 también se puede utilizar en un instrumento de tinción automatizado, utilizando protocolos estándar. También se puede imaginar la utilización de muchos procedimientos de detección alternativos (por ejemplo, fluorescencia), enzimas de detección (por ejemplo, fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa o similares), y posiblemente incluso cromógenos (por ejemplo, Rojo fast, azul fast, 3-amino-9-etilcarbazol, 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato, 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glucurónido, o similares), conocidos de manera general por los técnicos en la materia.
Un epítopo de un anticuerpo anti-p40, tal como el anticuerpo anti-p40 monoclonal de ratón, o una parte del mismo, puede ser un antígeno útil para la producción de nuevos anticuerpos monoclonales, incluida la producción en especies distintas del ratón (por ejemplo, conejo, cabra, caballo, pollo, etc.) como entendería un experto en la materia.
Si bien la utilización de anticuerpos anti-p40, tales como el BC28 en la inmunohistoquímica de los tejidos incluidos en parafina fijados con formalina se puede describir en el presente documento, se puede imaginar fácilmente su utilidad en otros inmunoensayos. En particular, puede ser bien sabido que muchos de los mismos reactivos utilizados en IHC de FFPE también pueden utilizarse en IHC de secciones de tejido congelado. Los anticuerpos anti-p40, tales como el BC28, también pueden ser útiles en otros inmunoensayos, incluido el ELISA, posiblemente utilizando procedimientos conocidos de manera general.
En otro aspecto de la invención, posiblemente relacionado con la IHC, se puede utilizar un anticuerpo anti-p40 junto con uno o más anticuerpos primarios adicionales como parte de un cóctel, para realizar un procedimiento de “doble tinción” (descrito también como tinción múltiple o incluso multiplex). Dichos procedimientos de “doble tinción” pueden ser bien conocidos de manera general en la técnica; sin embargo, las mejores combinaciones de anticuerpos primarios para una aplicación de diagnóstico particular pueden no ser conocidas.
En el presente procedimiento, los anticuerpos anti-p40, tales como un anticuerpo anti-p40 BC28 monoclonal de ratón, podrían combinarse con uno o más anticuerpos en un solo cóctel primario de anticuerpos, adecuado posiblemente para la aplicación simultánea a una muestra. Los anticuerpos pueden derivarse de un huésped ratón o un huésped conejo o similar. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. En realizaciones, se puede utilizar un cóctel de anticuerpos en un procedimiento de IHC de doble tinción para producir dos o más tinciones de color que puedan identificar la presencia o ausencia de antígenos de proteínas diana en el espécimen de tejido. Por ejemplo, en realizaciones en las que un cóctel de anticuerpos puede comprender anticuerpos de ratón y conejo, un sistema de detección puede incluir un anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) y posiblemente incluso un anticuerpo anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina (AP) puede utilizarse para producir la tinción de dos colores. La 3,3’-diaminobencidina (DAB) se puede utilizar para producir una tinción marrón, posiblemente facilitada por la HRP, y puede identificar la presencia o ausencia, y/o la ubicación, de los anticuerpos de ratón unidos al espécimen; el Rojo fast puede utilizarse para producir una tinción fucsia/roja, facilitada posiblemente por AP, y puede identificar la presencia o ausencia, y/o ubicación, de anticuerpos de conejo en el espécimen. En otras realizaciones, un sistema de detección puede incluir un anticuerpo anti-ratón conjugado con AP y un anticuerpo anti-conejo conjugado con HRP que se puede utilizar para producir una tinción de dos colores, que puede identificar la presencia o ausencia y/o la ubicación de los anticuerpos de ratón con una tinción roja y los anticuerpos de conejo con una tinción marrón, posiblemente cuando el Rojo fast y la DAB se pueden utilizar como cromógenos. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ratón conjugado con HRP y posiblemente un anticuerpo anti-conejo conjugado con AP se pueden aplicar a la muestra como un cóctel, en una solución única, o se pueden aplicar en etapas secuenciales separadas.
Los anticuerpos anti-ratón o anti-conejo que comprenden los conjugados anticuerpo-enzima pueden derivarse de una especie diferente, entre las que se incluyen, sin que constituyan limitación, ratón, conejo, pollo, caballo, rata, cabra, oveja o similares. Un anticuerpo primario puede ser de una variedad de especies huésped, entre las que se incluyen, sin que constituyan limitación, ratones, conejos, pollos, caballos, ratas, cabras, ovejas o similares. En realizaciones, un anticuerpo puede incluir un conjugado anticuerpo-enzima y podría obtenerse un anticuerpo primario de dos especies huésped diferentes. También se pueden utilizar otros cromógenos que no sean DAB y/o Rojo fast.
Son posibles múltiples alternativas a un procedimiento de doble tinción, entre las que se incluyen, sin que constituyan limitación, la utilización de más de dos anticuerpos, la utilización de especies distintas del ratón y el conejo, otros cromógenos y sistemas de detección, un orden diferente de etapas de detección, y posiblemente incluso modificaciones que resultan en tres o más colores (que pueden requerir una etapa de desnaturalización). Las realizaciones de la presente invención pueden dar a conocer una composición que tiene, como mínimo, dos anticuerpos o fragmentos de los mismos, posiblemente como un cóctel, en la que, como mínimo, uno de los dos anticuerpos o fragmentos de los mismos comprende dicho anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 3 y se une específicamente a, como mínimo, p40. Esto puede dar a conocer un procedimiento para detectar, como mínimo, dos proteínas diferentes en una muestra biológica, al poner en contacto posiblemente una muestra biológica con una composición que comprende, como mínimo, dos anticuerpos o fragmentos de los mismos en los que, como mínimo, uno de los, como mínimo, dos anticuerpos o fragmentos de los mismos puede unirse específicamente a, como mínimo, p40, para formar un complejo antígeno-anticuerpo y puede detectarse un complejo antígeno-anticuerpo. Una composición puede tener, como mínimo, un primer anticuerpo primario y, como mínimo, un segundo anticuerpo primario.
Como mínimo, uno de los anticuerpos o fragmentos de los mismos puede unirse específicamente a, como mínimo, p40 e incluso puede tener un valor límite de indicación positiva de más del 1% de las células teñidas. Tal como se menciona en el presente documento, un valor límite de indicación positiva puede proporcionar un porcentaje de células teñidas necesarias para indicar un resultado de tinción positivo. Entre otros valores límite se pueden incluir, sin que constituyan limitación, aproximadamente, más del 1% de las células teñidas, aproximadamente, más del 2% de las células teñidas, aproximadamente, más del 3% de las células teñidas, aproximadamente, más del 4% de las células teñidas, aproximadamente, más del 5% de las células teñidas, aproximadamente, más del 6% de las células teñidas, aproximadamente, más del 7% de las células teñidas, aproximadamente, más del 8% de las células teñidas, aproximadamente, más del 9% de las células teñidas y posiblemente incluso, aproximadamente, más del 10% de células teñidas, o más, o similares.
En realizaciones, la presente invención puede dar a conocer una composición con, como mínimo, dos anticuerpos o fragmentos de los mismos que pueden ser capaces de proporcionar diferentes resultados de visualización, tales como diferentes resultados de color. Tal como se discute en otras realizaciones, a continuación, una composición puede dar a conocer que, como mínimo, otro de, como mínimo, dos anticuerpos o fragmentos de los mismos pueda unirse específicamente a DSG-3, CK4, napsina A, HMWCK, p504s, CK5/14, CK7/18 , CK8/18, uroplaquina II, uroplaquina III, GATA-3, y cualquier combinación de los mismos, o similares. Los anticuerpos, composiciones de los mismos, posiblemente con anticuerpos anti-p40 pueden dar a conocer un sistema de detección que incluya, sin que constituyan limitación, la composición de detección de carcinoma SCC, la composición de detección de vejiga, la composición de detección de carcinoma de mama, la composición de detección de carcinoma de próstata y cualquier combinación de las mismas, o similares.
En algunas realizaciones, se puede utilizar una tinción de un solo color para un cóctel de anticuerpos primario. En un ejemplo, si el cóctel de anticuerpos primario está compuesto por anticuerpos todos derivados de la misma especie huésped, se puede utilizar entonces un solo sistema de detección para teñir la presencia de todos los anticuerpos con un solo color. La presencia o ausencia de cada anticuerpo se puede determinar en función de la localización celular, o posiblemente dicha determinación no es necesaria y la tinción puede interpretarse de manera efectiva sin identificar la presencia o ausencia de cada anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo anti-p40 BC28 monoclonal de ratón se puede combinar con desmogleína-3 (DSG-3) [BC11] monoclonal de ratón en un cóctel de anticuerpos primario y se puede utilizar en un procedimiento de IHC con detección de anti-ratón conjugado con HRP y con DAB para visualización, para producir una tinción marrón. En otro aspecto, un cóctel de anticuerpos primario compuesto por dos o más anticuerpos de diferentes especies huésped se puede utilizar de una manera similar para producir una tinción de un solo color. Por ejemplo, el anticuerpo anti-p40 BC28 monoclonal de ratón se puede combinar con el anticuerpo anti-CK20 EPR1622Y monoclonal de conejo y utilizarse en un procedimiento de IHC con anti-ratón conjugado con HRP y anti-conejo conjugado con HRP, y Da B para visualización, para producir una tinción marrón. Ciertas etapas de un procedimiento de IHC se pueden realizar de forma secuencial o simultánea, utilizando posiblemente un cóctel de reactivos, como saben los técnicos en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos descritos en un cóctel de anticuerpos primario pueden aplicarse alternativamente en etapas secuenciales de uno o más anticuerpos. De manera similar, los reactivos de detección se pueden aplicar simultáneamente en un cóctel de reactivos o reactivos separados en etapas secuenciales.
En algunas realizaciones, se puede aplicar un primer anticuerpo primario, seguido de un primer conjugado anticuerpo-enzima y primer cromógeno, y posteriormente una etapa de desnaturalización, antes de proceder a la aplicación de un segundo anticuerpo primario, seguido de un segundo conjugado anticuerpo-enzima y un segundo cromógeno. De esta manera, se puede conseguir una doble tinción de dos colores diferentes utilizando anticuerpos primarios derivados de la misma especie.
Como es bien sabido por los técnicos en la materia, ciertas etapas de un procedimiento de IHC se pueden realizar de forma secuencial o simultánea, utilizando posiblemente un cóctel de reactivos, tal como es conocido por los técnicos en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos descritos en un cóctel de anticuerpos primario pueden aplicarse alternativamente en pasos secuenciales de uno o más anticuerpos. De manera similar, los reactivos de detección se pueden aplicar simultáneamente en un cóctel de reactivos o reactivos separados en etapas secuenciales.
Entre los anticuerpos que pueden ser útiles para el diagnóstico cuando se combinan con un anticuerpo anti-p40, tal como un anticuerpo anti-p40 BC28 monoclonal de ratón, en un cóctel de anticuerpos primario para su utilización en procedimientos de tinción múltiple se incluyen:
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Otros ejemplos de cócteles pueden darse a conocer en la solicitud de Patente PCT no. PCT/US2013/076203, archivada el 18 de diciembre de 2013, titulada “Sistemas de cócteles de anticuerpos y procedimientos para la clasificación de subtipos histológicos en cáncer de pulmón”.
Procedimiento de IHC de doble tinción con un cóctel de anticuerpos de DSG-3, CK5, p40 [BC28] y napsina A: la inmunohistoquímica, para producir posiblemente una “tinción doble” o un “procedimiento multiplex”, utilizando cócteles de anticuerpos, tales como el DSG-3 CK5 p40 [BC28] napsina A puede realizarse en muestras de tejido incluidas en parafina y fijadas con formalina (FFPE) utilizando procedimientos conocidos de manera general por los técnicos en la materia, tal como se ejemplifica de manera general con los siguientes ejemplos que no constituyen limitación (por ejemplo, lavados con solución salina tamponada con Tris, pH aproximadamente 7,6, entre etapas):
1) Las secciones (~ 5 pmi) de tejidos incluidos en parafina fijados con formalina se pueden montar en portaobjetos de microscopio disponibles en el mercado, posiblemente recubiertos con polilisina.
2) Las secciones se pueden desparafinar (utilizando xilenos o un sustituto de xileno) y pueden rehidratarse posiblemente a través de una serie de soluciones de alcohol/agua, posiblemente seguido de un bloqueo de las peroxidasas endógenas, posiblemente con, aproximadamente, una solución al 3% de peróxido de hidrógeno. 3) Las muestras pueden someterse a la recuperación de antígenos inducida por calor utilizando un tampón de citrato en un dispositivo de calentamiento a presión (Diva, Decloaking Chamber; Biocare Medical) y pueden calentarse a, aproximadamente, 125°C durante, aproximadamente, 30 segundos. [Otros procedimientos de recuperación de antígenos conocidos por los técnicos en la materia (por ejemplo, vapor, horno de microondas, enzima o similares) también pueden ser aceptables]. Los tejidos se pueden dejar enfriar durante, aproximadamente, 10 minutos y posteriormente pueden enjuagarse con agua desionizada.
4) El cóctel de anticuerpos de DSG-3 CK5 p40 [BC28] napsina A se puede aplicar en una solución tamponada con fosfato (pH de, aproximadamente, 6,0) con albúmina de suero bovino como proteína transportadora durante, aproximadamente, 30 minutos.
5) La detección de los anticuerpos posiblemente con un cóctel de anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) de cabra y anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina (AP) de cabra (MACH 2 Double Stain #2, Biocare Medical) con una incubación de, aproximadamente, 30 minutos.
6) Posiblemente, en una etapa de detección final, el cromógeno Rojo fast con sustrato de fosfato de naftol, posiblemente en un tampón de, aproximadamente, pH 8,3 (Vulcan Rojo fast, Biocare Medical) se puede aplicar durante, aproximadamente, 20 minutos, lo que puede producir un producto cromogénico fucsia/rojo como una tinción. Posteriormente, se puede aplicar 3,3’-diaminobencidina (DAB) en un tampón que contiene, posiblemente, aproximadamente, un 0,02% de peróxido de hidrógeno (Betazoid DAB, Biocare Medical). La oxidación de DAB a través de un mecanismo mediado por HRP puede dar como resultado la precipitación de un producto marrón cromogénico, lo que permite posiblemente la identificación de los sitios de expresión de antígeno para cada anticuerpo. La presencia de anticuerpos contra p40, DSG-3 y CK5 se puede determinar mediante tinción marrón. La presencia de anticuerpos contra napsina A se puede determinar por tinción roja.
7) Las secciones se pueden contrateñir brevemente, posiblemente en hematoxilina de Mayer modificada.
Procedimiento de IHC de tinción única con un cóctel de anticuerpos de DSG-3, CK5 y p40 [BC28]: La inmunohistoquímica que utiliza un cóctel de anticuerpos, tal como DSG-3 CK5 p40 [BC28] se puede realizar en muestras de tejido incluidas en parafina (FFPE) fijadas con formalina utilizando procedimientos conocidos de manera general por los técnicos en la materia, tal como se ejemplifica de manera general con los siguientes ejemplos (por ejemplo, lavados con solución salina tamponada con Tris, pH aproximadamente 7,6, entre etapas): 1) Las secciones (~ 5 pm) de tejidos incluidos en parafina fijados con formalina se pueden montar en portaobjetos de microscopio disponibles en el mercado, posiblemente recubiertos con polilisina.
2) Las secciones se pueden desparafinar (utilizando xilenos o un sustituto de xileno) y pueden rehidratarse posiblemente a través de una serie de soluciones de alcohol/agua, posiblemente seguido de un bloqueo de las peroxidasas endógenas, posiblemente con, aproximadamente, una solución al 3% de peróxido de hidrógeno.
3) Las muestras se pueden someter a la recuperación de antígenos inducida por calor utilizando un tampón de citrato en un dispositivo de calentamiento a presión (Diva, Decloaking Chamber; Biocare Medical) y pueden calentarse a, aproximadamente, 125°C durante, aproximadamente, 30 segundos. [Otros procedimientos de recuperación de antígenos conocidos por los técnicos en la materia (por ejemplo, vapor, horno de microondas, enzima o similares) también pueden ser aceptables]. Los tejidos pueden dejarse enfriar durante, aproximadamente, 10 minutos y posteriormente pueden enjuagarse con agua desionizada.
4) El cóctel de anticuerpos de DSG-3 CK5 p40 [BC28] se puede aplicar en una solución tamponada con fosfato (pH de, aproximadamente, 6,0) con albúmina de suero bovino como proteína portadora durante, aproximadamente, 30 minutos.
5) La detección de los anticuerpos posiblemente con un cóctel de anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante de cabra (MACH 2 Mouse-HRP Polymer Detection, Biocare Medical) con una incubación de, aproximadamente, 30 minutos. Alternativamente, la detección de los anticuerpos posiblemente con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (MACH 4 Universal HRP-Polymer Detection, Biocare Medical) se puede realizar en dos etapas. Una aplicación inicial de un anticuerpo IgG anti-ratón de conejo durante, aproximadamente, 10 minutos puede estar seguida por la incubación con un conjugado anti-conejo-HRP de cabra durante, aproximadamente, 10 minutos.
6) Posiblemente en una etapa de detección final, se puede aplicar 3,3’-diaminobenzidina (DAB) en un tampón que contiene, posiblemente, aproximadamente, un 0,02% de peróxido de hidrógeno (Betazoid DAB, Biocare Medical). La oxidación de DAB a través de un mecanismo mediado por HRP puede dar como resultado la precipitación de un producto marrón cromogénico, lo que permite posiblemente la identificación de los sitios de expresión de antígeno para cada anticuerpo. La presencia de anticuerpos contra p40, DSG-3 y CK5 se puede determinar mediante tinción marrón.
7) Las secciones se pueden contrateñir brevemente, posiblemente en la hematoxilina de Mayer modificada.
Resultados de la tinción IHC con DSG-3, CK5, p40 [BC28] y napsina A: utilizando el protocolo de tinción doble anterior, se pueden teñir los tejidos FFPE con un cóctel de DSG-3, p40 [BC28], CK5 y napsina A. Un ejemplo de la tinción de pulmón SCC se muestra en las figuras 26 y 76. La presencia de anticuerpos contra DSG-3, p40 y/o CK5 puede dar como resultado tinción marrón. La tinción con rojo de napsina A puede ser reducida o estar ausente, o posiblemente quedar restringida al tejido pulmonar normal residual. Un ejemplo de la tinción de ADC pulmonar se muestra en las figuras 27 y 77. La presencia de napsina A puede dar como resultado la tinción roja. La tinción marrón de p40, DSG-3 y/o CK5 puede ser reducida o estar ausente (por ejemplo, véanse las figuras 27 y 77).
Resultados de la tinción IHC con DSG-3, CK5 y p40 [BC28]: utilizando el protocolo de tinción única anterior, los tejidos FFPE se pueden teñir con un cóctel de DSG-3, p40 [BC28] y CK5. Un ejemplo de la tinción de SCC pulmonar se muestra en las figuras 28 y 78. La presencia de anticuerpos contra DSG-3, p40 y/o CK5 puede dar como resultado tinción marrón. En este ejemplo, la utilización de una tinción de un solo color para la detección, tal como el anti-ratón HRP de cabra, es aceptable porque la presencia de DSG-3, p40 o CK5 es indicativa de carcinoma de células escamosas. Un ejemplo de la tinción de ADC pulmonar se muestra en las figuras 29 y 79. La tinción marrón de DSG-3, p40 y/o CK5 puede ser reducida o estar ausente (por ejemplo, véanse las figuras 29 y 79), o incluso quedar restringida al tejido pulmonar normal residual.
Resultados de la tinción IHC con DSG-3, p40 (M) y napsina A: utilizando el protocolo de tinción doble anterior, los tejidos FFPE se pueden teñir con un cóctel de DSG-3, p40 (M) (por ejemplo, [BC28] monoclonal de ratón) y napsina A. Los ejemplos de tinción de ADC se muestran en las figuras 20A y 20B. La presencia de napsina A puede dar como resultado la tinción roja. La tinción marrón de p40 o DSG-3 puede ser reducida o estar ausente (por ejemplo, véanse las figuras 30, 80, 31 y 81), o incluso quedar restringida a tejido pulmonar normal residual (por ejemplo, véanse las figuras 31 y 81). Los ejemplos de tinción de SCC se muestran en las figuras 32, 82, 33, 83, 34 y 84. La presencia de anticuerpos contra DSG-3 o p40 puede dar como resultado tinción marrón. La tinción con rojo de napsina A puede ser reducida o estar ausente, o posiblemente quedar restringida al tejido pulmonar normal residual (por ejemplo, véanse las figuras 33 y 83).
Resultados de la tinción IHC con DSG-3 y p40 (M): utilizando el protocolo anterior de tinción única, con un sistema de detección de anti-ratón HRP de cabra, los tejidos FFPE se pueden teñir con un cóctel de DSG-3 y p40 (M). Un ejemplo de la tinción de SCC se muestra en las figuras 35 y 85. La presencia de anticuerpos contra DSG-3 y/o CK5 puede dar como resultado la tinción marrón.
Resultados de la tinción IHC con p40 (M) y CK5 (RM): utilizando el protocolo de tinción doble anterior, los tejidos FFPE se pueden teñir con un cóctel de p40 [BC28] y CK5 (RM) (por ejemplo, [EP1601Y] monoclonal de conejo). Un ejemplo de la tinción de SCC pulmonar se muestra en las figuras 36 y 86. La presencia de anticuerpos contra p40 (M) puede dar como resultado la tinción marrón y la presencia de anticuerpos contra CK5 (RM) la tinción roja. Un ejemplo de la tinción de ADC pulmonar se muestra en las figuras 37 y 87. No se pueden observar tinciones marrones o rojas, lo que posiblemente sugiere la ausencia de p40 y CK5.
Resultados de la tinción IHC con p40 (M) y napsina A: utilizando el protocolo de tinción doble anterior, los tejidos FFPE se pueden teñir con un cóctel de p40 (M) (por ejemplo, [BC28] monoclonal de ratón) y napsina A. Un ejemplo de la tinción de SCC se muestra en las figuras 38 y 88. La presencia de anticuerpos contra p40 puede dar lugar a tinción marrón. La tinción con rojo de napsina A puede ser reducida o estar ausente, o posiblemente quedar restringida al tejido pulmonar normal residual. Un ejemplo de la tinción de ADC se muestra en las figuras 39 y 89. La presencia de napsina A puede dar como resultado la tinción roja. La tinción marrón de p40 puede ser reducida o estar ausente.
Resultados de la tinción IHC con p40 [BC28], HMWCK y P504S: utilizando el protocolo de tinción doble anterior, los tejidos FFPE se pueden teñir con un cóctel de p40 [BC28], HMWCK (por ejemplo, clon 34PE12 monoclonal de ratón) y P504S (posiblemente también conocido como AMACR, por ejemplo, anti-AMACR [13H4] monoclonal de conejo, o un anticuerpo policlonal de conejo). En las figuras 40 y 90 se muestra un ejemplo de tinción del tejido de la próstata. La presencia de anticuerpos contra el p40 o el HMWCK puede dar como resultado tinción marrón. La presencia de anticuerpos contra P504S puede dar como resultado tinción roja. El tejido puede contener glándulas prostáticas normales, áreas de cáncer de próstata o posiblemente neoplasia intraepitelial prostática (PIN).
Resultados de la tinción IHC con p40 [BC28], CK5/14 y P504S: utilizando el protocolo de tinción doble anterior, los tejidos FFPE se pueden teñir con un cóctel de p40 [BC28], CK5/14 (por ejemplo, una combinación de clon [XM26] anti-CK5 y clon [LL002] anti-CK14 y P504S (posiblemente también conocido como AMACR, por ejemplo, anti-AMACR [13H4] monoclonal de conejo o un anticuerpo policlonal de conejo). Un ejemplo de la tinción del tejido de la próstata se muestra en la figuras 41 y 91. La presencia de anticuerpos contra p40 y/o CK5/14 puede dar como resultado tinción marrón. La presencia de anticuerpos contra P504S puede dar como resultado tinción roja. El tejido puede contener glándulas prostáticas normales, áreas de cáncer de próstata o posiblemente neoplasia intraepitelial prostática (PIN). Los ejemplos en las figuras 40, 90, 41 y 91 son representativos de casos en los que los marcadores de citoqueratina pueden ser intercambiables. En estos ejemplos, HMWCK y CK5/14 son marcadores de citoqueratina efectivos y pueden considerarse efectivamente equivalentes.
Resultados de la tinción IHC con p40 [BC28], CK5/14 y CK7/18: utilizando el protocolo de tinción doble anterior, los tejidos FFPE se pueden teñir con un cóctel de p40 [BC28], CK5/14 (por ejemplo, una combinación de clon [XM26] anti-CK5 y clon [LL002] anti-CK14), y CK7/18 (por ejemplo, una combinación de anticuerpo anti-CK7 [BC1] monoclonal de conejo y clon [E431-1] de anticuerpo anti-CK18 monoclonal de conejo). En las figuras 42, 92, 43 y 93 se muestra un ejemplo de tinción del tejido mamario, posiblemente cáncer de mama. La presencia de anticuerpos contra p40 y/o CK5/14 puede dar como resultado tinción marrón. La presencia de anticuerpos contra CK7/18 puede dar como resultado tinción roja. Las figuras 43 y 93 pueden ser un ejemplo de tinción bimodal. El cóctel de anticuerpos de p63 CK5/14 CK7/18 puede haber demostrado ser útil en el diagnóstico clínico, (por ejemplo, véase el artículo, “Atypical ductal hyperplasia: interobserver and intraobserver variability.” Jain RK, Mehta R, Dimitrov R, Larsson LG, Musto PM, Hodges Kb , Ulbright TM, Hattab EM, Agaram N, Idrees MT, Badve S. Mod Pathol. julio de 2011; 24 (7): 917-23). Un cóctel de anticuerpos que utiliza p40 en lugar de p63 (por ejemplo, p40 [BC28] CK5/14 CK7/18) puede ser igualmente útil para el diagnóstico, posiblemente ofreciendo incluso las ventajas del p40 [BC28].
Resultados de la tinción IHC con p40 [BC28], CK5/14 y CK8/18: utilizando el protocolo de tinción doble anterior, los tejidos FFPE se pueden teñir con un cóctel de p40 [BC28], CK5/14 (por ejemplo, una combinación de clon [XM26] anti-CK5 y clon [LL002] anti-CK14), y CK8/18 (por ejemplo, una combinación de anticuerpo anti-CK8 [EP17] monoclonal de conejo y clon [E431-1] de anticuerpo anti-CK18 monoclonal de conejo). Un ejemplo de la tinción del tejido mamario, posiblemente el cáncer de mama, se muestra en las figuras 44 y 94. La presencia de anticuerpos contra p40 y/o CK5/14 puede dar como resultado tinción marrón. La presencia de anticuerpos contra CK8/18 puede dar como resultado tinción roja.
Resultados de la tinción IHC con p40 [BC28], uroplaquina II y uroplaquina III: utilizando el protocolo anterior de tinción única, los tejidos de FFPE se pueden teñir con un cóctel de p40 [BC28], uroplaquina II [BC21] y uroplaquina III [BC17]. En las figuras 45 y 95 se muestra un ejemplo de tinción del tejido de la vejiga, posiblemente carcinoma urotelial. La presencia de anticuerpos contra p40, uroplaquina II y/o uroplaquina III puede dar lugar a tinción marrón. El ejemplo de las figuras 45 y 95 es un ejemplo en el que una tinción de un solo color, posiblemente utilizando anti-ratón HRP de cabra, es útil dado que p40, la uroplaquina II o la uroplaquina III son indicativas de carcinoma urotelial.
Resultados de la tinción IHC con p40 [BC28], uroplaquina II, uroplaquina III y GATA-3: utilizando el protocolo de tinción doble anterior, los tejidos FFPE se pueden teñir con un cóctel de p40 [BC28], uroplaquina II [BC21], uroplaquina III [BC17], y GATA-3 (por ejemplo, anticuerpo anti-GATA-3 de conejo). En las figuras 46 y 96 se muestra un ejemplo de tinción del tejido de la vejiga, posiblemente carcinoma urotelial. La presencia de anticuerpos contra p40, uroplaquina II y/o uroplaquina III puede dar lugar a tinción marrón. La presencia de GATA-3 puede dar como resultado tinción roja.
Resultados de la tinción IHC con p40 (M) y CK5 (M): utilizando el protocolo anterior de tinción única, los tejidos FFPE se pueden teñir con un cóctel de p40 [BC28] y CK5 (M) (por ejemplo, [XM26] monoclonal de ratón). Un ejemplo de la tinción de pulmón SCC se muestra en la figura 47 y 97. La presencia de anticuerpos contra p40 y/o CK5 puede dar como resultado la tinción marrón.
En muchas realizaciones, los anticuerpos que se unen a marcadores de citoqueratina pueden utilizarse en diferentes combinaciones y, en algunos casos, de manera intercambiable, como conocen los técnicos en la materia. Por ejemplo, CK5 puede ser intercambiable con CK5/6 o CK5/14. De manera similar, la HMWCK (citoqueratina de alto peso molecular) se puede utilizar de manera intercambiable con CK5/6 o CK5/14. En otro ejemplo, CK7 puede utilizarse de manera intercambiable con CK8.
Otras realizaciones pueden incluir cócteles de anticuerpos primarios que comprenden p40 [BC28] con otras combinaciones de anticuerpos, incluidas las variaciones sobre los cócteles de ejemplo. En algunas realizaciones, se pueden utilizar otras especies huésped. Las realizaciones que carecen de uno o más de los anticuerpos incluidos en los ejemplos enumerados también pueden ser útiles.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-p40 distintos de BC28 también pueden ser útiles. En algunas realizaciones, se pueden utilizar anticuerpos anti-p40 policlonales de conejo o anticuerpos monoclonales de conejo. En otras realizaciones, de manera similar un clon de anticuerpo anti-p40 monoclonal de ratón distinto de BC28 puede ser útil, y posiblemente de manera intercambiable con el BC28.
En muchos casos, pero posiblemente de manera particular en casos de cáncer de pulmón, el diagnóstico se puede realizar a menudo sobre muestras de tejido de citología o biopsia limitadas, y puede ser importante conservar el tejido para realizar más pruebas moleculares; por lo tanto, puede ser preferente un enfoque eficiente para el diagnóstico que consuma el mínimo tejido, pero que proporcione una especificidad y/o sensibilidad óptimas. Se puede utilizar un procedimiento que proporcione información diagnóstica útil, al tiempo que consuma un mínimo de tejido del espécimen, posiblemente mediante la aplicación de múltiples anticuerpos a la misma cantidad, posiblemente mediante la utilización de un cóctel de anticuerpos, o mediante la aplicación secuencial de anticuerpos, o posiblemente por las características de sensibilidad o especificidad mejoradas.
Un anticuerpo anti-p40, tal como un anticuerpo anti-p40 BC28 monoclonal de ratón, puede ser específico para la detección de p40 y puede ser útil en procedimientos inmunohistoquímicos para el diagnóstico de varios tipos de cáncer en muestras de tejido humano. En particular, el anticuerpo anti-p40, tal como el BC28 tiene ventajas sobre el anticuerpo anti-p40 RP y el anticuerpo anti-p63 [4A4], entre las que se incluyen, entre otras, una mayor especificidad y una tinción más limpia, incluyendo la ausencia de tinción en algunos casos de adenocarcinoma de pulmón, así como posiblemente la falta de tinción de macrófagos.
La determinación de los niveles de p40 puede ser un factor pronóstico útil e indicador de los resultados del paciente. La pérdida de la expresión de p40, según lo determinado por IHC, se ha asociado con el cáncer de vejiga agresivo y se ha demostrado que predice la supervivencia del paciente (véase Matsumoto K y otros, Urology, 2008;72:444-449, y Ohtsuka Y y otros BJU Int, 2006;97:1322-1326). Como tales, los diversos sistemas y procedimientos descritos en el presente documento pueden dar a conocer un sistema de detección tal como, sin que constituyan limitación, la detección de cáncer, diagnosticar o incluso pronosticar cáncer, predecir un resultado de cáncer, evaluar la eficacia del tratamiento del cáncer, predecir la recurrencia del cáncer, o similares. Tal como se menciona en el presente documento, la utilización de un anticuerpo o fragmento del mismo se puede realizar en un dispositivo de tinción automatizado. La detección se puede realizar de forma automática, manual, mediante análisis de imágenes o similares. La detección puede utilizar un procedimiento que incluye, sin que constituyan limitación, inmunohistoquímica (IHC), IHC de FFPE, IHC de secciones de tejido congelado, inmunocitoquímica, ELISA o similares.
Para un procedimiento de inmunoensayo, se debe obtener el tejido de un animal o humano a evaluar (6), lo que no queda incluido en la presente invención, se fija o congela dicho tejido (7), se trata dicho tejido fijo o congelado para desenmascarar epítopos frente al p40 (8), se pone en contacto dicho tejido tratado con un anticuerpo o fragmento del mismo, tal como se discute en el presente documento en una cantidad y en condiciones tales que un anticuerpo o fragmento del mismo se una a una proteína p40, si la proteína está presente en dicho tejido (9); y posiblemente incluso se detectan las presencias de dichos anticuerpos unidos (10), tal como se representa esquemáticamente en la figura 50.
La figura 49 muestra un resumen esquemático de diversas realizaciones de la presente invención que incluyen un kit (5) que puede proporcionar un anticuerpo, un fragmento del mismo, una parte del mismo, en una composición o incluso en un cóctel, posiblemente incluso provisto de un hibridoma, el anticuerpo (1) o similares pueden ponerse en contacto con una muestra biológica (2) para formar, como mínimo, un complejo antígeno-anticuerpo (3) que posteriormente se puede detectar con un detector (4).
La presente invención puede dar a conocer, en realizaciones, un kit de prueba de diagnóstico o incluso pronóstico que puede incluir un anticuerpo o fragmento del mismo, según las reivindicaciones 1-3 (tal como se describe en el presente documento) con un elemento de detección de anticuerpo del anticuerpo o fragmento del mismo, posiblemente cuando se une a un antígeno. Esto puede ser útil en un procedimiento para poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo o fragmento del mismo e incluso detectar la unión del anticuerpo o fragmento del mismo a una proteína, o incluso la presencia del anticuerpo o fragmento del mismo unido a una proteína o con un antígeno en la muestra biológica, posiblemente utilizando un elemento de detección de anticuerpos. Para un procedimiento de inmunoensayo para detectar la proteína p40 en un mamífero o humano, se debe obtener un tejido de un animal o humano para ser analizado, lo que no está incluido en la presente invención, poner en contacto el tejido con un anticuerpo o fragmento del mismo, según las diversas realizaciones presentadas en el presente documento, posiblemente en una cantidad y en condiciones tales que el anticuerpo o fragmento del mismo pueda unirse a una proteína p40 si la proteína está presente en el tejido; e incluso detectar la presencia de anticuerpos unidos. Entre las muestras biológicas se pueden incluir, sin que constituyan limitación, sangre, orina, tejido urotelial, tejido de células de transición, tejido de la vejiga, tejido normal, tejido neoplásico, tejido del riñón, tejido ovárico, tejido de la tiroides, tejido endometrial, tejido renal, tejido de las amígdalas, tejido pancreático, tejido del colon, tejido de los ganglios linfáticos, tejido pancreático neoplásico, tejido estomacal, tejido prostático, tejido pulmonar, tejido mamario, o similar, dependiendo posiblemente del anticuerpo o incluso del cóctel utilizado.
Se observa que de las numerosas aplicaciones y procedimientos que utilizan anticuerpos anti-p63 conocidos actualmente por los técnicos en la materia, el anticuerpo anti-p63 puede reemplazarse con un anticuerpo anti-p40 (por ejemplo, BC28), posiblemente con resultados equivalentes, o posiblemente incluso superiores.
Se observa que la utilización de términos tales como p40, anticuerpo p40, BC28 o similares puede relacionarse con anticuerpos anti-p40 o similares, según sea apropiado, como entendería un técnico en la materia.
Finalmente, se adjuntan en el presente documento todas las referencias enumeradas en la siguiente lista, o diferentes declaraciones de información archivadas con la presente solicitud.
I. DOCUMENTOS DE PATENTES DE EE.UU.
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II. DOCUMENTOS DE BIBLIOGRAFÍA NO DE PATENTES
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Preparación aislada de anticuerpos que se unen específicamente a una proteína p40, en la que dichos anticuerpos se unen a un epítopo en un péptido que comprende una mezcla de la SEQ ID No. 3 y la SEQ ID No. 5; y en la que dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No. 2 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No. 1.
2. Preparación aislada de anticuerpos, según la reivindicación 1, en la que dichos anticuerpos son monoclonales.
3. Anticuerpo o fragmento del mismo producido por el hibridoma depositado en la Colección americana de cultivos tipo (ATCC) bajo la Denominación de depósito de patente ATCC No. PTA-120163.
4. Composición que comprende, como mínimo, dos anticuerpos o fragmentos de los mismos, en la que, como mínimo, uno de dichos, como mínimo, dos anticuerpos o fragmentos de los mismos comprende dicho anticuerpo, según las reivindicaciones 1 o 3.
5. Composición, según la reivindicación 4, en la que dicha composición comprende un cóctel de anticuerpos primarios.
6. Composición, según la reivindicación 4, en la que dichos, como mínimo, dos anticuerpos o fragmentos de los mismos se derivan de, como mínimo, dos especies diferentes.
7. Composición, según la reivindicación 6, en la que dichas, como mínimo, dos especies diferentes se seleccionan entre un grupo que comprende ratón, conejo, cabra, caballo, pollo, humano y cualquier combinación de los mismos.
8. Composición, según la reivindicación 4, en la que dichos, como mínimo, dos anticuerpos o fragmentos de los mismos comprenden un procedimiento de doble tinción.
9. Composición, según la reivindicación 4, en la que dicho, como mínimo, otro de dichos, como mínimo, dos anticuerpos o fragmentos de los mismos se une específicamente a una proteína seleccionada entre un grupo que comprende DSG-3, CK4, CK5, napsina A, HMWCK, p504S, CK5/14, CK7/18, CK8/18, uroplaquina Il, uroplaquina Ill, GATA-3, y cualquier combinación de los mismos.
10. Una composición, según la reivindicación 4, en la que, como mínimo, dos anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen cada uno específicamente a proteínas seleccionadas entre un grupo que comprende:
- p40 y DSG-3 y CK5 y napsina A;
- p40 y DSG-3 y CK5;
- p40 y napsina A;
- p40 y HMWCK y p504s;
- p40 y p504s y CK5/14;
- p40 y CK5/14 y CK7/18;
- p40 y CK5/14 y CK8/18;
- p40 y uroplaquina Il y uroplaquina III; y
- p40 y uroplaquina Il y uroplaquina Ill y GATA-3.
11. Composición, según la reivindicación 4, en la que, como mínimo, dos anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen cada uno específicamente a proteínas seleccionadas entre un grupo que comprende:
- p40 y DSG-3 y napsina A;
- p40 y DSG-3; y
- p40 y CK5.
12. Composición, según la reivindicación 4, en la que dicha composición comprende una composición de detección seleccionada entre un grupo que comprende una composición de detección de carcinoma de células escamosas, una composición de detección de vejiga, una composición de detección de carcinoma de mama, una composición de detección de carcinoma de próstata y cualquier combinación de las mismas.
13. Kit de prueba de diagnóstico que comprende:
- un anticuerpo o fragmento del mismo, según la reivindicación 1 o 3; y
- un elemento de detección de anticuerpo de dicho anticuerpo o dicho fragmento del mismo, cuando se une a un antígeno.
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