ES2712997T3 - Selección como diana de neovasculatura de médula ósea - Google Patents

Abstract

Anticuerpo que se une al dominio A1 de la isoforma grande de tenascina-C para su uso en un método de tratamiento de leucemia mieloide aguda (LMA) que comprende seleccionar como diana la neovasculatura de médula ósea en pacientes con LMA.

Description

DESCRIPCION

Seleccion como diana de neovasculatura de medula osea

La presente invencion se refiere al uso de anticuerpos que seleccionan como diana un antfgeno expresado en la neovasculatura de medula osea, en particular al uso de tales anticuerpos para tratar o diagnosticar leucemia mieloide aguda (LMA).

Las estructuras neovasculares de medula osea son rasgo caractenstico de varias enfermedades, incluyendo leucemias, smdromes mielodisplasicos (en ocasiones denominados preleucemias) y mieloma multiple.

La leucemia es un cancer de la sangre y la medula osea que se caracteriza por una proliferacion anomala de celulas sangumeas. Las celulas sangumeas se producen en la medula osea donde se desarrollan a partir de celulas madre. La primera fase en el desarrollo de las celulas sangumeas es la diferenciacion de las celulas madre para dar celulas madre mieloides o celulas madre linfoides. En los individuos sanos, las celulas madre mieloides continuan entonces diferenciandose en uno de tres tipos de celulas sangumeas maduras: globulos rojos, globulos blancos y plaquetas, mientras que las celulas madre linfoides se diferencian en otro tipo de globulos blancos, denominados linfocitos. Cualquiera de estos dos linajes celulares puede resultar afectado por la leucemia. Dependiendo del linaje celular afectado, las leucemias se denominan o bien como leucemia mieloide (o alternativamente como mielocftica, mielogena, mieloblastica o no linfodtica) o bien como leucemia linfodtica (o alternativamente como linfoblastica o linfogena).

Ademas, las leucemias tambien se diferencian basandose en si la enfermedad es aguda o cronica. Como su nombre implica, las leucemias agudas avanzan rapidamente mientras que la leucemia cronica avanza lentamente y se desarrolla a lo largo de muchos anos. En las formas agudas de la enfermedad, la medula osea afectada libera grandes numeros de globulos blancos inmaduros, denominados blastocitos, que no pueden llevar a cabo las funciones normales de los globulos blancos. Si no se tratan, las leucemias agudas conducen a muerte en un plazo de semanas.

La forma mas comun de leucemia aguda en adultos, y la segunda leucemia mas comun en ninos, es la leucemia mieloide aguda (LMA). La LMA, como su nombre implica, afecta a los globulos blancos mieloides en lugar de a los linfodticos y por tanto en ocasiones se denomina leucemia no linfodtica (LNLA).

Las leucemias difieren de la mayona de otros canceres en que normalmente no forman tumores estaticos. Las raras excepciones incluyen tumores solidos compuestos por blastocitos que se producen fuera de la medula osea en pacientes con LMA. Estos tumores se denominan tumores mieloides extramedulares (o alternativamente cloroma, sarcoma granulocftico o sarcoma mieloide) y la enfermedad se denomina entonces LMA extramedular.

Las formas agudas de leucemia se tratan habitualmente usando quimioterapia. Por ejemplo, los regfmenes de tratamiento comunes para la LMA incluyen citarabina administrada o bien sola o, mas comunmente, en combinacion con una antraciclina tal como daunorubicina o idarubicina. Sin embargo, pese a la disponibilidad de regfmenes de quimioterapia de multiples agentes agresivos, solo el 20-30% de los pacientes con LMA se curan actualmente. El motivo de esta baja tasa de exito es la aparicion de subclones de celulas de leucemia resistentes a la radiacion y a multiples farmacos, dominantes. La naturaleza insidiosa de la LMA tambien esta relacionada con el hecho de que, aunque todos los blastocitos circulantes en la sangre y la mayona de los blastocitos en regiones de la medula osea de facil acceso se eliminan rapidamente por regfmenes quimioterapicos basados en citarabina, algunos blastocitos en zonas resguardadas de la medula osea sobreviven a la quimioterapia y crecen de nuevo al final del tratamiento, produciendo recidiva. Cualquier tratamiento que permita que se erradiquen estos blastocitos resistentes, preferiblemente sin producir toxicidad adicional importante a la medula osea, representana un avance importante en el tratamiento de la leucemia.

Los presentes inventores han descubierto que determinados antfgenos se expresan en la neovasculatura de medula osea, tal como la neovasculatura encontrada en la medula osea de pacientes con leucemia.

Espedficamente, los presentes inventores han demostrado que tenascina-C y la isoforma con dominio extra A (ED-A) de fibronectina, se expresan en estructuras neovasculares presentes en biopsias de medula osea obtenidas de pacientes con LMA.

Se ha notificado previamente que se produce un aumento en la angiogenesis en la medula osea de pacientes con LMA (Padro et al., 2000). Sin embargo, se desconoda que existen antfgenos que se expresan espedficamente en las estructuras neovasculares en la medula osea de estos pacientes.

El descubrimiento de estos antfgenos abre nuevas vfas para el tratamiento y el diagnostico de enfermedades caracterizadas por la presencia de neovasculatura de medula osea, incluyendo todas las mencionadas en el presente documento, tal como leucemia, smdromes mielodisplasicos y mieloma multiple.

Por ejemplo, los tratamientos quimioterapicos convencionales para la leucemia no discriminan entre tejidos enfermos y sanos. Por consiguiente, tienen que administrate grandes dosis de farmacos al paciente para alcanzar concentraciones terapeuticamente relevantes, lo que conduce a efectos secundarios tales como toxicidades en tejidos sanos. En contraposicion, anticuerpos que se unen a la neovasculatura de medula osea en pacientes con leucemia permiten que los agentes terapeuticos se administren directamente a los tejidos afectados, evitando o reduciendo asf las desventajas asociadas con los tratamientos quimioterapicos convencionales. Ademas, perfiles de toxicidad favorables de agentes terapeuticos espedficos de sitio tambien pueden abrir nuevas vfas en la terapia de enfermedades caracterizadas por la presencia de neovasculatura de medula osea, permitiendo la administracion sistemica de agentes altamente potentes y prometedores, que actualmente o bien se administran a dosis suboptimas o cuya aplicacion clmica se ha impedido hasta la fecha por toxicidades inaceptables cuando se aplican de forma no modificada.

Por tanto un aspecto de la invencion proporciona un anticuerpo para su uso en un metodo de tratamiento de una enfermedad caracterizada por neovasculatura de medula osea, concretamente LMA, en el que el anticuerpo se une a un antigeno de la neovasculatura de medula osea en pacientes que padecen dicha enfermedad, en el que el antigeno es el dominio A1 de la isoforma grande de tenascina-C. Los individuos o pacientes a los que se hace referencia en el presente documento son preferiblemente humanos.

El metodo puede comprender administrar el anticuerpo y un compuesto anticanceroso a un individuo que lo necesita.

Otro aspecto de la presente invencion proporciona un anticuerpo que se une al dominio A1 de la isoforma grande de tenascina-C en pacientes que padecen ^lM^a , para su uso en un metodo de diagnostico de dicha enfermedad, en el que el metodo comprende:

administrar el anticuerpo al individuo; y

detectar la union del anticuerpo a la neovasculatura de medula osea en el individuo.

Otro aspecto de la presente invencion proporciona el uso de un anticuerpo que se une al dominio A1 de la isoforma grande de tenascina-C en la neovasculatura de medula osea en pacientes con LMA, para la deteccion o el diagnostico in vitro de LMA.

Las enfermedades caracterizadas por la presencia de estructuras neovasculares en la medula osea incluyen leucemia, smdromes mielodisplasicos (tambien denominados preleucemias) y mieloma multiple. Las leucemias a modo de ejemplo incluyen leucemias agudas y cronicas. Por ejemplo, una leucemia tal como se hace referencia en el presente documento puede ser una leucemia mieloide o una linfodtica. Preferiblemente, una leucemia tal como se hace referencia en el presente documento es la leucemia mieloide aguda (LMA).

Los smdromes mielodisplasicos son trastornos de celulas madre de medula osea caracterizados por produccion ineficaz (o displasia) de celulas sangumeas mieloides y riesgo de transformacion en leucemia mielogena aguda (LMA).

El mieloma multiple tambien se conoce como mieloma, mieloma de celulas plasmaticas o enfermedad de Kahler y es un cancer que afecta a las celulas plasmaticas en la medula osea. Se sabe que todas las enfermedades anteriores se caracterizan por neovasos, o angiogenesis, en la medula osea.

La neovasculatura de medula osea, tal como se hace referencia en el presente documento, puede ser estructuras vasculares encontradas en la medula osea de pacientes que padecen una enfermedad caracterizada por angiogenesis de medula osea, tal como leucemia, smdromes mielodisplasicos o mieloma multiple. Estas estructuras vasculares pueden no encontrarse en la medula osea de individuos sanos, o pueden encontrarse en la medula osea de individuos sanos pero en un grado menor que en individuos que padecen una enfermedad de este tipo. Por tanto, la enfermedad puede ser una enfermedad caracterizada por neovasculatura aumentada de medula osea.

Los anticuerpos para su uso en la presente divulgacion pueden unirse a un antfgeno expresado en neovasculatura de medula osea. La neovasculatura de medula osea puede ser la neovasculatura presente en la medula osea de un paciente que padece una enfermedad caracterizada por angiogenesis de medula osea, por ejemplo leucemia, smdromes mielodisplasicos o mieloma multiple. Preferiblemente, un anticuerpo para su uso en la presente divulgacion se une a un antfgeno de la neovasculatura de medula osea en pacientes con leucemia. Lo mas preferido para su uso en la presente divulgacion son anticuerpos que se unen a un antfgeno de la neovasculatura de medula osea en pacientes con leucemia mieloide aguda (LMA).

El antfgeno se expresa de manera diferencial en neovasculatura de medula osea en comparacion con tejido normal. Por ejemplo, el antfgeno puede ser una isoforma de una protema, en el que la isoforma se expresa de manera diferencial en neovasculatura de medula osea en comparacion con tejido normal. El tejido normal en este contexto puede ser tejidos sanos, es decir tejidos no afectados por enfermedad. Cuando el antfgeno es un antfgeno de la neovasculatura de medula osea en pacientes que padecen una enfermedad caracterizada por angiogenesis de medula osea, es decir pacientes con leucemia mieloide aguda, el antigeno puede expresarse de manera diferencial en la neovasculatura de medula osea de estos pacientes en comparacion con otros tejidos de estos pacientes. Por ejemplo, el antfgeno puede expresarse de manera diferencial en la neovasculatura de medula osea de estos pacientes en comparacion con otros tejidos de medula osea de estos pacientes, tales como otros vasos sangumeos de medula osea.

El antigeno puede ser un antigeno (por ejemplo, una isoforma de una protema) que se expresa de manera diferencial en la neovasculatura de medula osea de pacientes que padecen una enfermedad caracterizada por angiogenesis de medula osea, es decir pacientes con leucemia mieloide aguda, en comparacion con tejidos normales, por ejemplo, tejidos de medula osea de individuos sanos. Tejido normal en este contexto son tejidos sanos, es decir, tejidos no afectados por la enfermedad. Por ejemplo, el antigeno puede ser un antigeno que se expresa de manera diferencial en la neovasculatura de medula osea de pacientes con LMA en comparacion con los vasos sangumeos de medula osea encontrados en individuos sanos.

Expresion diferencial en este contexto puede significar que el antigeno se expresa en neovasculatura de medula osea y no se expresa, o no se expresa significativamente, en tejido normal. Alternativamente, expresion diferencial puede significar que la expresion del antigeno en neovasculatura de medula osea es mayor, por ejemplo significativamente mayor, que en tejido normal. El nivel de expresion de un antfgeno en un tejido relevante puede medirse usando, por ejemplo, ELISA, inmunotransferencia de tipo Western o espectrometna de masas. Todos estos metodos estan bien establecidos en la tecnica. “Significativamente” en el contexto de expresion de antfgenos puede significar estadfsticamente significativo, por ejemplo cuando se mide usando la prueba de la t de Student. Cuando se usa una prueba de la t de Student, un valor de p menor de por ejemplo 0,1, 0,05 o 0,01 (dependiendo del umbral elegido para la significacion estadfstica), indica que el nivel de expresion del antfgeno en cuestion es significativamente diferente en los tejidos que estan comparandose. Por tanto, cuando se compara el nivel de expresion de un antfgeno en neovasculatura de medula osea y tejido normal usando la prueba de la t de Student, un valor de p menor de por ejemplo 0,1, 0,05, o 0,01 indica que el nivel de expresion del antfgeno difiere significativamente entre los dos tejidos. De manera similar, un antfgeno no se expresa significativamente en un tejido si el nivel de expresion del antfgeno en dicho tejido no es estadfsticamente diferente de un control negativo. Cuando se usa una prueba de la t de Student para comparar el nivel de expresion en un tejido con un control negativo, un valor de p de 0,1 o mayor, 0,05 o mayor, o 0,01 o mayor (de nuevo dependiendo del umbral elegido para la significacion estadfstica), indica que el nivel de expresion del antfgeno en el tejido en cuestion no difiere significativamente del control negativo, y por tanto no se expresa significativamente en dicho tejido.

El antfgeno puede ser un antfgeno de la matriz extracelular, por ejemplo la matriz extracelular subendotelial, de neovasculatura de medula osea. El antfgeno puede expresarse en celulas de la neovasculatura de medula osea. En la invencion reivindicada, el antfgeno es el dominio A1 de la isoforma grande de tenascina-C.

Un anticuerpo para su uso tal como se da a conocer se une a una isoforma de tenascina C que se expresa de manera diferencial en la neovasculatura de medula osea en pacientes que padecen LMA tal como se describio anteriormente. Por ejemplo, un anticuerpo para su uso tal como se da a conocer puede unirse a la isoforma grande de tenascina-C. El anticuerpo puede unirse preferiblemente a la isoforma grande de tenascina-C en relacion con la isoforma pequena de tenascina-C. Los anticuerpos para su uso tal como se da a conocer pueden unirse a un dominio de tenascina-C que esta sujeto a corte y empalme alternativo y se expresa solamente en la isoforma grande, es decir, el dominio A1 de la isoforma grande de tenascina-C.

Se describen fragmentos de anticuerpos monoclonales humanos espedficos para tenascina-C, por ejemplo, en el documento WO2006/050834.

En algunas realizaciones, un anticuerpo para su uso en la presente invencion compite para unirse a tenascina-C con un anticuerpo que comprende el dominio VH de 4A1-F16 de SEQ ID NO: 2 y el dominio VL de 4A1-F16 de SEQ ID NO: 4.

La competicion entre anticuerpos puede evaluarse facilmente in vitro, por ejemplo, usando ELISA y/o marcando una molecula notificadora espedfica a un anticuerpo que puede detectarse en presencia de otro(s) anticuerpo(s) sin marcar, para permitir la identificacion de anticuerpos que se unen al mismo epftopo o un epftopo solapante.

En un ejemplo, el anticuerpo para su uso en la invencion puede unirse al dominio A1 de la isoforma grande de tenascina-C con un valor de K^d de al menos 1 |iM, 100 nM, 50 nM o 25 nM, cuando se mide usando resonancia de plasmon superficial, por ejemplo usando un instrumento BIAcore3000. Cuando se mide la afinidad, el anticuerpo puede estar en cualquier formato conveniente incluyendo inmunoprotema pequena (SIP), scFv o formato de IgG completa. Un metodo adecuado para determinar la afinidad de un anticuerpo se describe, por ejemplo, en Brack et al. (2006).

Por ejemplo, un anticuerpo para su uso en la presente invencion puede unirse al dominio A1 de la isoforma grande de tenascina-C con la misma afinidad que el anticuerpo 4A1-F16-SIP cuando se mide usando un instrumento BIAcore3000, o con una afinidad que es mejor.

El anticuerpo 4A1-F16 tiene secuencias de aminoacidos de dominio VH y VL y CDR tal como se muestra en la lista de secuencias adjunta.

Un anticuerpo adecuado para su uso en la presente invencion puede comprender un sitio de union anticuerpoantigeno que comprende un dominio VH y un dominio VL,

comprendiendo el dominio VH una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 5, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 7;

comprendiendo el dominio VL una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 8, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 9 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 10.

En algunas realizaciones preferidas, un anticuerpo para su uso en la presente invencion puede comprender un sitio de union anticuerpo-antigeno que comprende el dominio VH de 4A1-F16 de SEQ ID NO: 2 y el dominio VL de 4A1-F16 de SEQ ID NO: 4.

Se conocen varios formatos de molecula de anticuerpo y puede usarse cualquier formato adecuado para un anticuerpo para su uso en la invencion.

En algunas realizaciones, un anticuerpo para su uso en la invencion puede ser o puede comprender un FV de cadena sencilla (scFv), que comprende un dominio VH y un dominio VL unidos a traves de un ligador peptidico. El experto puede seleccionar una longitud y secuencia de ligador apropiadas, por ejemplo desde al menos 5 o al menos 10 aminoacidos de longitud, hasta aproximadamente 15, hasta aproximadamente 20 o hasta aproximadamente 25 aminoacidos de longitud. Por ejemplo, el ligador puede tener la secuencia de aminoacidos mostrada en SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 22.

En algunas realizaciones, un anticuerpo para su uso en la presente invencion puede ser una mini-inmunoglobulina o inmunoprotema pequena (SIP) que comprende un Fv de cadena sencilla (scFv), por ejemplo tal como se describe en (Li et al., 1997). Una SIP puede comprender una molecula de scFv fusionada al dominio CH4 de la isoforma secretora de IgE humana, IgE-S2 (bs2-CH4; Batista et al., 1996) formando una molecula de anticuerpo de miniinmunoglobulina homodimerica. El dominio CH4 puede tener la secuencia de aminoacidos mostrada en SEQ ID NO: 24 y puede unirse al dominio VL a traves de un ligador peptidico. Un ligador peptfdico adecuado se muestra en SEQ ID NO: 23.

En algunas realizaciones, un anticuerpo para su uso en la presente invencion puede ser una molecula de anticuerpo IgG completa, por ejemplo una molecula de anticuerpo IgG1 completa.

Tambien pueden emplearse variantes de los dominios VH y VL y CDR descritos en el presente documento en anticuerpos para su uso en la presente invencion. Pueden obtenerse variantes adecuadas por medio de metodos de alteracion o mutacion de secuencia y examen.

Las variantes particulares para su uso tal como se describe en el presente documento pueden incluir una o mas alteraciones de secuencia de aminoacidos (adicion, delecion, sustitucion y/o insercion de un residuo de aminoacido), que pueden ser menos de aproximadamente 20 alteraciones, menos de aproximadamente 15 alteraciones, menos de aproximadamente 10 alteraciones o menos de aproximadamente 5 alteraciones, 4, 3, 2 o 1. Las alteraciones pueden realizarse en una o mas regiones de entramado y/o una o mas CDR. En particular, las alteraciones pueden realizarse en CDR1 de VH, CDR2 de VH y/o CDR3 de VH, especialmente en CDR3 de VH.

En algunas realizaciones, el dominio VL de 4A1-F16 de SEQ ID NO: 4 puede carecer de serina en la posicion 1. Un anticuerpo para su uso tal como se da a conocer puede conjugarse con una molecula bioactiva, tal como una citocina (por ejemplo IL2), un agente citotoxico, un fotosensibilizador o un radioisotopo terapeutico.

Se ha demostrado previamente que las inmunocitocinas que contienen IL-2 pueden erradicar tumores y linfomas en modelos de cancer de raton cuando se usan solas o en combinacion con otros agentes terapeuticos tales como quimioterapia o anticuerpos intactos (Schliemann et al., 2009; Marlind, et al., 2008; Menrad et al., 2005; y Carnemolla et al., 2002).

Por tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo para su uso en la presente invencion puede conjugarse con una citocina, por ejemplo interleucina 2 (IL2), para formar un conjugado anticuerpo-citocina. El principal atractivo de usar tales inmunocitocinas es la activacion de las celulas inmunitarias (por ejemplo, linfocitos citolfticos naturales [NK]) lo que puede permitir que se erradiquen los ultimos blastocitos supervivientes, marcando asf la diferencia entre un paciente que padece recidivas tras el tratamiento y una cura.

Puesto que las celulas NK son responsables principalmente de la accion terapeutica de los conjugados anticuerpo-IL2, puede estudiarse la actividad de tales moleculas en ratones inmunocomprometidos que portan tumores. Por ejemplo, pueden usarse modelos de raton de leucemia humana para estudiar el potencial de la seleccion como diana in vivo y la actividad terapeutica de los conjugados anticuerpo-IL2 en el tratamiento de la leucemia. Un modelo de raton adecuado para la leucemia humana emplea la lmea celular de leucemia HL-60 en ratones atfmicos, tal como se da a conocer en Potter et al. (1984).

La interleucina-2 (IL2) es una citocina secretada que esta implicada en la inmunorregulacion y la proliferacion de linfocitos T y B. Se ha demostrado que la IL2 tiene un efecto citotoxico sobre celulas tumorales y que la IL2 humana recombinante (aldesleucina: Proleukin™) tiene la aprobacion de la FDA para el tratamiento del carcinoma renal metastasico y el melanoma metastasico. La secuencia de la IL2 humana se expone en SEQ ID NO: 27 y esta disponible al publico con la referencia NP_000577.2 GI: 28178861 de la base de datos de secuencias.

En alguna divulgacion preferida en el presente documento, el resto de IL2 del conjugado anticuerpo-IL2 comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, una identidad de secuencia de al menos el 95% o una identidad de secuencia de al menos el 98% con la secuencia de IL2 humana madura expuesta en SEQ ID NO: 27.

La identidad de secuencia se define comunmente con referencia al algoritmo GAP (paquete Wisconsin GCG, Accelerys Inc., San Diego, EE.UU.). GAP usa el algoritmo Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias completas que maximiza el numero de apareamientos y minimiza el numero de huecos. Generalmente, se usan parametros por defecto, con una penalizacion por creacion de hueco = 12 y una penalizacion por extension de hueco = 4. Puede preferirse el uso de GAP, pero pueden usarse otros algoritmos, por ejemplo BLAST (que usa el metodo de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410), FASTA (que usa el metodo de Pearson y Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448), o el algoritmo de Smith-Waterman (Smith y Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197), o el programa TBLASTN de Altschul et al. (1990) citado anteriormente, que emplea generalmente parametros por defecto. En particular, puede usarse el algoritmo psi-Blast (Nucl. Acids Res. (1997) 253389-3402).

En algunas realizaciones especialmente preferidas, el resto de IL2 del conjugado anticuerpo-IL2 comprende la secuencia de IL2 humana madura expuesta en SEQ ID NO: 27.

El resto de IL2 puede fusionarse en el sentido de 5' (extremo N-terminal) o en el sentido de 3' (extremo C-terminal) del anticuerpo o componente polipeptfdico del mismo.

El resto de IL2 puede conectarse o unirse al resto de anticuerpo del conjugado anticuerpo-IL2 mediante cualquier medio covalente o no covalente adecuado. En realizaciones preferidas, el conjugado anticuerpo-IL2 puede ser una protema de fusion que comprende IL2 y el anticuerpo o un componente polipeptfdico del mismo (por ejemplo, una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de cadena multiple, tal como un Fab. Por tanto, por ejemplo, el resto de IL2 puede fusionarse a un dominio VH o dominio VL del anticuerpo. Normalmente, el anticuerpo, o componente del mismo, y el resto de IL2 se unen a traves de un ligador peptfdico, por ejemplo un peptido de aproximadamente 5-25 residuos, por ejemplo 10-20 residuos, de manera preferible aproximadamente 15 residuos. Se conocen bien en la tecnica ejemplos adecuados de ligadores peptfdicos. En algunas realizaciones, un ligador puede tener una secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ ID NO: 28. Normalmente, el ligador tiene una secuencia de aminoacidos que comprende una o mas repeticiones en tandem de un motivo. Normalmente, el motivo es una secuencia de cinco residuos, y preferiblemente al menos 4 de los residuos son Gly o Ser. Cuando cuatro de los cinco residuos son Gly o Ser, el otro residuo puede ser Ala. Mas preferiblemente cada uno de los cinco residuos es Gly o Ser. Motivos preferidos son GGGGS (SEQ ID NO: 33), SSSSG (SEQ ID NO: 34), GSGSA (SEQ ID NO: 35) y GGSGG (SEQ ID NO: 36). Preferiblemente, los motivos son adyacentes en la secuencia, sin nucleotidos intermedios entre las repeticiones. La secuencia del ligador puede comprender o consistir en entre una y cinco, preferiblemente tres o cuatro, repeticiones del motivo. Por ejemplo, un ligador con tres repeticiones en tandem puede tener una de las secuencias de aminoacidos mostradas en SEQ ID NOs. 29 a 32.

Se sabe que los conjugados anticuerpo-farmaco son utiles para administrar selectivamente un agente citotoxico a una diana tal como un antfgeno asociado con tumor (Carter et al., 2008). Tales conjugados permiten la administracion de agentes citotoxicos directamente a los tejidos afectados, evitando de ese modo las desventajas asociadas con la quimioterapia convencional. Por ejemplo, se ha demostrado previamente que anticuerpos tales como F16 o F8 pueden acoplarse a farmacos citotoxicos y pueden localizar con eficacia y selectividad extraordinarias alrededor de vasos sangumeos tumorales. Por tanto, en algunas realizaciones, puede conjugarse un anticuerpo para su uso en la invencion con un agente citotoxico. Los agentes citotoxicos a modo de ejemplo incluyen agentes citotoxicos que son adecuados para tratar el cancer. Por ejemplo, un agente citotoxico puede ser adecuado para tratar una enfermedad caracterizada por neovasculatura de medula osea, tal como smdromes mielodisplasicos de leucemia o mieloma multiple, por ejemplo LMA.

Un agente citotoxico preferido incluye un agente citotoxico potente de estructura qmmica relativamente sencilla para facilitar la fabricacion. Se prefiere el uso de agentes citotoxicos potentes debido a la diferencia en el peso molecular entre anticuerpos y agentes citotoxicos (Carter et al., 2008). Un agente citotoxico potente puede ser un agente citotoxico que puede eliminar celulas tumorales a concentraciones sub-nanomolares. Los agentes citotoxicos adecuados que pueden conjugarse con un anticuerpo para su uso en la presente invencion incluyen dolastatinas, vinblastinas, epotilonas, tubulisinas, y derivados y analogos de las mismas.

Las dolastatinas son una familia de peptidos antiproliferativos que inhiben el crecimiento y la reproduccion de celulas diana e inducen apoptosis en una variedad de tipos de celulas malignas. Las dolastatinas a modo de ejemplo incluyen dolastatina-10 y dolastatina-15, y sus derivados, que se ha demostrado que tienen actividad antiproliferativa particularmente fuerte (de Arruda et al., 1995). Un derivado de dolastatina preferido es cemadotina que es un analogo de dolastatina-15. En realizaciones preferidas, el conjugado anticuerpo-dolastatina puede ser una protema de fusion que comprende la dolastatina y el anticuerpo o un componente polipeptfdico del mismo (por ejemplo, una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de cadena multiple, tal como un Fab. Por tanto, por ejemplo, el resto de dolastatina puede fusionarse a un dominio VH o dominio VL del anticuerpo. La vinblastina es un analogo qrnmico de la vincristina que se usa en varios regfmenes quimioterapicos incluyendo el tratamiento para el linfoma de Hodgkin. Se describen analogos potentes de vinblastina en Barnett et al. (1978) e incluyen monohidrazida de 4-desacetil-3-vinblastina.

Tanto la monohidrazida de 4-desacetil-3-vinblastina como la cemadotina actuan sobre los microtubulos con un mecanismo de accion similar y pueden eliminar celulas endoteliales y celulas tumorales diana en el intervalo de concentracion picomolar (de Arruda et al., 1995; Barnett et al., 1978; Reddy et al., 2007; Ray et al., 2007; y Leamon et al., 2007).

Las epotilonas son una clase de moleculas citotoxicas que han demostrado tener actividad antitumoral. Las epotilonas a modo de ejemplo incluyen ixabepilona, epotilona B y epotilona D.

Las tubulisinas son otra familia de agentes antiproliferativos que son candidatos principales para el desarrollo de agentes anticancerosos. Las tubulisinas a modo de ejemplo incluyen tubulisina A y tubulisina D. Se describen derivados de tubulisina a modo de ejemplo en Neri et al. (2006), Sani et al. (2007) y Patterson et al. (2007).

En algunas realizaciones, el anticuerpo para su uso en la invencion puede conjugarse con un agente citotoxico que comprende un grupo maleimido terminal. Los grupos maleimido pueden usarse para la conjugacion de farmacos espedfica de sitio con residuos de cistema reactivos unicos presentes en los anticuerpos descritos en el presente documento (Borsi et al., 2002; Berndorff et al., 2006). Lo mas preferiblemente, esta presente un ligador escindible entre el agente citotoxico y el resto maleimido.

Se ha demostrado previamente como la coagulacion sangumea intraluminal en neovasculatura tumoral, producida por la administracion mediada por anticuerpos de factores procoagulantes tales como una version truncada de factor tisular, puede conducir a una muerte de celulas tumorales rapida. Por tanto, en algunas realizaciones, puede conjugarse un anticuerpo para su uso en la invencion con un factor procoagulante tal como una version truncada de factor tisular. Tales conjugados se han descrito previamente en Nilsson et al. (2001).

Tambien se ha demostrado previamente que anticuerpos de direccionamiento vascular son adecuados para depositar fotosensibilizadores alrededor de la neovasculatura de tumores in vivo, mediando asf el dano de celulas endoteliales y la coagulacion sangumea intraluminal tras la irradiacion, seguido por muerte de celulas tumorales (Birchler et al., 1999; Fabbrini et al., 2006). Espedficamente, se ha demostrado que los fotosensibilizadores pueden generar eficazmente oxfgeno singlete fuera de las celulas endoteliales y eliminar las celulas tumorales indirectamente. Antes de estos experimentos, se crefa generalmente que era necesario que las celulas diana internalizaran los conjugados anticuerpo-fotosensibilizador con el fin de mediar un efecto toxico tras la irradiacion. Por tanto, en alguna divulgacion en el presente documento, puede conjugarse un anticuerpo para su uso tal como se da a conocer con un fotosensibilizador. Se describen en detalle fotosensibilizadores a modo de ejemplo que pueden conjugarse con un anticuerpo para su uso tal como se da a conocer en el documento WO01/62800 e incluyen cloruro de estano (IV) e6 y derivados del mismo.

Tambien se ha demostrado previamente que los anticuerpos conjugados con radionuclidos terapeuticos son eficaces en el tratamiento del cancer (Tijink et al., J Nucl Med. 47(7):1070-4, 2006). Por tanto, en algunas realizaciones, puede conjugarse un anticuerpo para su uso en la presente invencion con un radionuclido terapeutico. Los radionuclidos terapeuticos a modo de ejemplo incluyen 131I, 90Y 124I, 211At, 77Br y 76Br. Preferiblemente, el radionuclido terapeutico es 131I o 90Y.

La molecula bioactiva puede conectarse o unirse al resto de anticuerpo mediante cualquier medio covalente o no covalente. En una divulgacion preferida en el presente documento, la molecula bioactiva se conjuga con el anticuerpo mediante un ligador escindible, permitiendo de ese modo que se libere molecula bioactiva. Por ejemplo, el ligador puede permitir la liberacion de la molecula bioactiva al interior de la matriz extracelular subendotelial presente en la medula osea de un paciente que padece una enfermedad caracterizada por neovasculatura de medula osea, permitiendo de ese modo que el farmaco difunda a la neovasculatura de medula osea y, cuando la enfermedad es leucemia, potencialmente tambien a sus blastocitos proximos.

Los ligadores escindibles adecuados incluyen bases de Schiff, ligadores peptidicos escindibles por proteasas y esteres estabilizados. Todos estos ligadores se conocen bien en la tecnica. Se describen ligadores de bases de Schiff a modo de ejemplo, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5633351. Los ligadores escindibles preferidos muestran semividas de reaccion en el intervalo de 5-20 horas.

Un anticuerpo o conjugado de anticuerpo para su uso tal como se da a conocer puede administrarse a un individuo que lo necesita junto con un compuesto anticanceroso, por ejemplo un compuesto anti-leucemia.

Los compuestos anticancerosos son compuestos citotoxicos que inhiben el crecimiento, la division y/o la proliferacion de celulas cancerosas. Los compuestos anticancerosos pueden tener, en algunas circunstancias, un efecto sobre celulas no cancerosas normales en un paciente. Un compuesto anticanceroso puede ser, por ejemplo, un compuesto adecuado para tratar la leucemia. Cuando el paciente es un paciente con leucemia mieloide aguda, el compuesto puede ser un compuesto adecuado para tratar la leucemia mieloide aguda.

En algunas realizaciones de la invencion, el compuesto anticanceroso puede seleccionarse del grupo de: agentes alquilantes, antimetabolitos, terpenoides y alcaloides de plantas, inhibidores de topoisomerasa, antibioticos antitumorales, anticuerpos monoclonales y corticosteroides. Los ejemplos de agentes alquilantes incluyen ciclofosfamida, cisplatino, clorambucilo, carboplatino y oxaliplatino. Los ejemplos de antimetabolitos incluyen metotrexato, analogos de purina tales como cladribina, fludarabina, tioguanina y pentostatina, y analogos de pirimidina tales como citarabina, 5-fluorouracilo y floxuridina. Los ejemplos de terpenoides y alcaloides de plantas incluyen alcaloides de la vinca, tales como vincristina, vinblastina, vinorelbina y vindesina; agentes quimioterapicos derivados de podofilotoxina tales como fosfato de etoposido y teniposido-taxanos; y taxanos, que incluyen paclitaxel y docetaxel. Los ejemplos de inhibidores de topoisomerasa incluyen inhibidores de topoisomerasa de tipo I tales como camptotecinas e inhibidores de topoisomerasa de tipo II tales como amsacrina, etoposido, fosfato de etoposido y teniposido. Los ejemplos de antibioticos antitumorales incluyen antraciclinas, tales como doxorubicina y epirubicina, actinomicinas y bleomicina. Los ejemplos de anticuerpos monoclonales incluyen rituximab, y los ejemplos de corticosteroides incluyen prednisona y prednisolona.

Los compuestos anticancerosos a modo de ejemplo adecuados para tratar la leucemia incluyen: antraciclinas, citarabina, vincristina, L-asparaginasa, ciclofosfamida, metotrexato y 6-mercaptopurina, clorambucilo, ciclofosfamida, corticosteroides, tales como prednisona y prednisolona, imatinib, cladribina, pentostatina, rituximab, clorambucilo y doxorubicina.

Los compuestos anticancerosos preferidos incluyen antraciclinas y citarabina. Estos compuestos anticancerosos son adecuados para tratar la LMA.

Por ejemplo, en algunas realizaciones de la invencion, puede administrarse un anticuerpo o conjugado de anticuerpo (por ejemplo un conjugado anticuerpo-citocina) a un individuo que lo necesita en combinacion con quimioterapia o inmunoterapia basada en IgG. Por ejemplo, actualmente estan investigandose los anticuerpos anti-CD33 para el tratamiento de la LMA en ensayos clmicos de fase IIb. Se describen anticuerpos anti-CD33 adecuados, por ejemplo en Feldman et al. (2003), Feldman et al. (2005) y Kobayashi et al. (2009). Ademas, tambien estan investigandose los anticuerpos anti-CD123 basados en IgG en el tratamiento de la LMA (Jin et al., 2009). Por tanto, en un ejemplo, la inmunoterapia basada en IgG puede implicar el tratamiento con un anticuerpo anti-CD33 o anti-CD123.

En algunas realizaciones, puede marcarse un anticuerpo para su uso tal como se da a conocer con un marcador detectable o funcional. Los anticuerpos marcados con un marcador detectable pueden usarse para el diagnostico in vivo, ex vivo o in vitro, y/o para la terapia.

Un marcador detectable puede ser cualquier molecula que produzca o que pueda inducirse a producir una senal, incluyendo pero no limitandose a agentes que fluorescen, radiomarcadores, enzimas, agentes quimioluminiscentes o fotosensibilizadores. Por tanto, la union puede detectarse y/o medirse detectando fluorescencia o luminiscencia, radioactividad, actividad enzimatica o absorbancia de luz. Los marcadores detectables pueden unirse a anticuerpos para su uso en la divulgacion usando qmmica convencional conocida en la tecnica.

Hay numerosos metodos por los que el marcador puede producir una senal detectable por medios externos, por ejemplo, mediante examen visual, radiacion electromagnetica, calor y reactivos qmmicos. El marcador tambien puede unirse a otro elemento de union espedfico que se une al anticuerpo para su uso tal como se da a conocer, o a un soporte.

La administracion de un anticuerpo, conjugado de anticuerpo, compuesto anticanceroso y composiciones que comprenden una o mas de estas moleculas es preferiblemente en una “cantidad terapeuticamente eficaz”, siendo esta suficiente para mostrar beneficio en un paciente. Tal beneficio puede ser al menos la mejora de al menos un smtoma. La cantidad real administrada y la tasa y el transcurso de tiempo de administracion, dependeran de la naturaleza y la gravedad de lo que va a tratarse. La prescripcion del tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre la dosificacion, etc., esta dentro de la responsabilidad de los medicos de familia y otros medicos.

La dosis precisa dependera de varios factores, del tamano y de la ubicacion de la zona que va a tratarse, de la naturaleza precisa del anticuerpo (por ejemplo anticuerpo completo, fragmento o diacuerpo). Una dosis tfpica de anticuerpo, o conjugado de anticuerpo, estara en el intervalo de 0,5 mg a 100 g para aplicaciones sistemicas, y de 10 |ig a 1 mg para aplicaciones locales. El anticuerpo, o resto de anticuerpo del conjugado, puede ser un scFv, SIP o anticuerpo completo. Cuando el anticuerpo o resto de anticuerpo es un anticuerpo completo, es preferiblemente el isotipo IgG, por ejemplo IgG1. Se trata de una dosis para un tratamiento individual de un paciente adulto, que puede ajustarse proporcionalmente para ninos y lactantes, y tambien puede ajustarse para otros formatos de anticuerpo en proporcion al peso molecular. Se conocen bien en la tecnica las dosis y los regfmenes apropiados para compuestos anticancerosos.

Los tratamientos pueden repetirse a intervalos diarios, de dos veces por semana, semanales o mensuales, segun el criterio del medico.

Cuando un anticuerpo (o conjugado de anticuerpo) y un compuesto anticanceroso se administran a un paciente, pueden administrarse de manera secuencial o simultanea segun cualquier regimen adecuado.

Un anticuerpo, conjugado de anticuerpo o compuesto anticanceroso puede administrarse a un individuo en forma de una composicion farmaceutica, que puede comprender al menos un componente ademas del compuesto activo. Cuando se administra a un paciente tanto un anticuerpo (o conjugado de anticuerpo) como un compuesto anticanceroso, estos pueden formularse en composiciones farmaceuticas independientes o, cuando sea apropiado, en la misma composicion farmaceutica.

Los componentes adecuados incluyen un excipiente, portador, tampon, estabilizador u otros materiales farmaceuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la tecnica. Tales materiales deben ser no toxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza precisa del portador u otro material dependera de la via de administracion, que puede ser oral, o mediante inyeccion, por ejemplo intravenosa.

Terminologia

Anticuerpo

Esto describe una inmunoglobulina ya este producida de manera natural o parcial o completamente sintetica. El termino tambien abarca cualquier polipeptido o protema que comprende un sitio de union anticuerpo-antfgeno. Los fragmentos de anticuerpo que comprenden un sitio de union anticuerpo-antfgeno incluyen, pero no se limitan a, moleculas tales como Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb y Fd. Se han obtenido mediante ingeniena genetica otras moleculas de anticuerpo diversas incluyendo uno o mas sitios de union anticuerpo-antfgeno, incluyendo por ejemplo Fab2, Fab3, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos e inmunoprotemas pequenas (SIP). Las moleculas de anticuerpo y los metodos para su construccion y uso se describen en Holliger & Hudson, Nature Biotechnology 23(9):1126-11362005.

Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros y usar tecnicas de tecnologfa de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moleculas quimericas que se unen al antfgeno diana. Tales tecnicas pueden implicar introducir ADN que codifica para la region variable de la inmunoglobulina, o las CDR, de un anticuerpo en las regiones constantes, o regiones constantes mas regiones de entramado, de una inmunoglobulina diferente. Vease, por ejemplo, los documentos EP-A-184187, GB 2188638A o EPA-239400, y una gran cantidad de bibliograffa posterior. Un hibridoma u otra celula que produce un anticuerpo puede someterse a mutacion genetica u otros cambios, que pueden alterar o no la especificidad de union de los anticuerpos producidos.

Puesto que los anticuerpos pueden modificarse en diversas formas, debe interpretarse que el termino “molecula de anticuerpo” abarca cualquier sustancia o elemento de union que tenga un sitio de union anticuerpo-antfgeno con la especificidad y/o union requerida al antfgeno. Por tanto, este termino abarca fragmentos y derivados de anticuerpo, incluyendo cualquier polipeptido que comprenda un sitio de union anticuerpo-antfgeno, ya sea natural o parcial o completamente sintetico. Por tanto se incluyen moleculas quimericas que comprenden un sitio de union anticuerpoantfgeno, o equivalente, fusionado a otro polipeptido (por ejemplo derivado de otra especie o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo). La clonacion y expresion de anticuerpos quimericos se describe en los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023 y en una gran cantidad de bibliograffa posterior.

Preferiblemente, las moleculas de anticuerpo usadas en la divulgacion son moleculas de anticuerpo humanas o humanizadas.

Se ha demostrado que fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la funcion de unir antfgenos. Ejemplos de fragmentos de union son (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un unico anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989); McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554; Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490), que consiste en un dominio VH o uno VL; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos (vii) moleculas Fv de cadena sencilla (scFv), donde un dominio VH y un dominio VL estan unidos mediante un ligador peptidico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de union a antigeno (Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) dfmeros Fv de cadena sencilla biespedficos (documento PCT/US92/09965) y (ix) “diacuerpos”, fragmentos multivalentes o multiespedficos construidos mediante fusion genica (documento WO94/13804; Holliger, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 906444­ 6448, 1993). Las moleculas de Fv, scFv o diacuerpo pueden estabilizarse mediante la incorporacion de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL (Reiter, Y. et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). Un Fv de cadena sencilla (scFv) puede estar comprendido dentro de una mini-inmunoglobulina o inmunoprotema pequena (SIP), por ejemplo tal como se describe en (Li et al., 1997). Una SIP puede comprender una molecula de scFv fusionada al dominio CH4 de la isoforma secretora de IgE humana, IgE-S2 ((^bs2-CH4; Batista et al., 1996) formando una molecula de anticuerpo de mini-inmunoglobulina homodimerica. Ademas, tambien pueden obtenerse minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 (Hu, S. et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996). Otros ejemplos de fragmentos de union son Fab', que difiere de los fragmentos Fab por la adicion de algunos residuos en el extremo carboxilo terminal del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o mas cistemas de la region bisagra del anticuerpo, y Fab'-SH, que es un fragmento Fab' en el que el(los) residuo(s) de cistema del dominio constante porta(n) un grupo tiol libre.

Qui et al., Nat. Biotechnol. 25:921-929 (2007) describieron moleculas de anticuerpo que conteman solo dos CDR unidas mediante una region de entramado. La CDR3 del dominio VH o VL se unio al bucle de CDR1 o CDR2 del otro dominio. La union se realizo a traves del extremo C-terminal de la CDR1 o CDR2 seleccionada al extremo N-terminal de la CDR3, a traves de una region FR. Qui et al. seleccionaron la region FR que tema la menor cantidad de parches hidrofobos. Se encontro que la mejor combinacion para el anticuerpo sometido a prueba era CDR1 de VL unida mediante FR2 de VH a CDR3 de VH (CDR1 de VH-FR2 de VH-CDR3 de VL). A un peso molecular de aproximadamente 3 kDa, estas moleculas de anticuerpo ofrecen ventajas en lo que se refiere a penetracion tisular mejorada en comparacion con inmunoglobulinas completas (aproximadamente 150 kDa) o scFv (aproximadamente 28 kDa).

Los fragmentos de anticuerpo de la divulgacion pueden obtenerse partiendo de una molecula de anticuerpo parental mediante metodos tales como digestion por enzimas por ejemplo, pepsina o papama y/o mediante escision de los puentes disulfuro por reduccion qmmica. De otro modo, los fragmentos de anticuerpo comprendidos en la presente divulgacion pueden obtenerse mediante tecnicas de recombinacion genetica, conocidas asimismo por el experto en la tecnica o tambien mediante smtesis de peptidos por medio de, por ejemplo, sintetizadores de peptidos automaticos, tales como los suministrados por la empresa Applied Biosystems, etc., o mediante smtesis y expresion de acidos nucleicos. Los fragmentos de anticuerpo funcionales segun la presente divulgacion incluyen cualquier fragmento funcional cuya semivida se aumente mediante una modificacion qmmica, especialmente mediante pegilacion, o mediante la incorporacion en un liposoma.

Un dAb (anticuerpo con un solo dominio) es un fragmento de union a antfgeno monomerico pequeno de un anticuerpo, concretamente la region variable de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo (Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490). Los dAb de VH se producen de manera natural en camelidos (por ejemplo camello, llama) y pueden producirse inmunizando un camelido con un antfgeno diana, aislando las celulas B espedficas de antfgeno y clonando directamente genes de dAb procedentes de celulas B individuales. Los dAb tambien pueden producirse en cultivo celular. Su pequeno tamano, buena solubilidad y estabilidad frente a la temperatura los hacen particularmente utiles desde el punto de vista fisiologico y adecuados para la seleccion y maduracion de la afinidad. Se han desarrollado dAb de VH de camelidos para uso terapeutico con el nombre “nanobodies™”. Una molecula de anticuerpo de la presente divulgacion puede ser un dAb. La molecula de anticuerpo comprende un dominio VH o VL sustancialmente tal como se expone en el presente documento, o un dominio VH o VL que comprende un conjunto de CDR sustancialmente tal como se expone en el presente documento.

Los anticuerpos biespedficos o bifuncionales forman una segunda generacion de anticuerpos monoclonales en los que se combinan dos regiones variables diferentes en la misma molecula (Holliger y Bohlen, Cancer and metastasis rev. 18: 411-419, 1999). Se ha demostrado su uso tanto en el campo diagnostico como en el campo terapeutico a partir de su capacidad para reclutar nuevas funciones efectoras o para seleccionar como diana varias moleculas sobre la superficie de celulas tumorales. Cuando van a usarse anticuerpos biespedficos, estos pueden ser anticuerpos biespedficos convencionales, que pueden fabricarse en una diversidad de formas (Holliger, P. y Winter G. Current Opinion Biotechnol 4, 446-449, 1993), por ejemplo pueden prepararse qmmicamente o a partir de hibridomas Idbridos, o pueden ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpo biespedfico mencionados anteriormente. Estos anticuerpos pueden obtenerse mediante metodos qmmicos (Glennie M J et al., 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. et al., 1995 J. Hemat. 377-382) o metodos somaticos (Staerz U. D. y Bevan M. J.

1986 PNAS 83; Suresh M. R. et al., 1986 Method Enzymol. 121: 210-228) pero tambien y preferiblemente mediante tecnicas de ingeniena genetica que permiten que se fuerce la heterodimerizacion y por tanto facilitan el procedimiento de purificacion del anticuerpo buscado (Merchand et al., 1998 Nature Biotech. 16:677-681). Los ejemplos de anticuerpos biespedficos incluyen los de la tecnolog^a BiTE™ en la que pueden usarse los dominios de union de dos anticuerpos con especificidad diferente y unirse directamente a traves de peptidos flexibles cortos. Esto combina dos anticuerpos en una sola cadena polipeptidica corta. Pueden construirse diacuerpos y scFv sin una region Fc usando solo dominios variables, reduciendo potencialmente los efectos de una reaccion antiidiotipica. Pueden construirse anticuerpos biespedficos como IgG entera, como Fab'2 biespedfico, como Fab'PEG, como diacuerpos o tambien como scFv biespedfico. Ademas, pueden unirse dos anticuerpos biespedficos usando metodos de rutina conocidos en la tecnica para formar anticuerpos tetravalentes.

Los diacuerpos biespedficos, al contrario que los anticuerpos completos biespedficos, tambien pueden ser particularmente utiles porque pueden construirse y expresarse facilmente en E. coli. Pueden seleccionarse facilmente diacuerpos (y cualquier otro polipeptido, tal como fragmentos de anticuerpo) con especificidades de union apropiadas usando presentacion en fagos (documento WO94/13804) a partir de bibliotecas. Si va a mantenerse constante un brazo del diacuerpo, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra el antigeno de la neovasculatura tumoral, entonces puede obtenerse una biblioteca donde se vana el otro brazo y se selecciona un anticuerpo de especificidad apropiada. Los anticuerpos completos biespedficos pueden obtenerse mediante metodos de ingeniena genetica alternativos tal como se describe en Ridgeway et al., 1996 (Ridgeway, J. B. B. et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996).

Se dispone en la tecnica de diversos metodos para obtener anticuerpos contra un antfgeno diana. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, especialmente de origen humano, murino, quimerico o humanizado, que pueden obtenerse segun los metodos convencionales bien conocidos por el experto en la tecnica.

En general, para la preparacion de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen murino, es posible hacer referencia a tecnicas que se describen en particular en el manual “Antibodies” (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) o a la tecnica de preparacion de hibridomas descrita por Kohler y Milstein (Kohler y Milstein, Nature, 256:495-497, 1975).

Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales, por ejemplo, a partir de una celula animal inmunizada contra el antfgeno diana o uno de sus fragmentos que contienen el epttopo reconocido por los anticuerpos monoclonales. En el presente documento se describen fragmentos y peptidos o polipeptidos adecuados que los comprenden, y pueden usarse para inmunizar animales para generar anticuerpos contra un antfgeno diana. Dicho antfgeno, o uno de sus fragmentos, puede producirse especialmente segun los metodos de trabajo habituales, mediante recombinacion genetica partiendo de una secuencia de acido nucleico contenida en la secuencia de ADNc que codifica para el antfgeno o fragmento del mismo, mediante smtesis de peptidos partiendo de una secuencia de aminoacidos comprendida en la secuencia peptfdica del antfgeno y/o fragmento del mismo.

Los anticuerpos monoclonales pueden purificarse, por ejemplo, en una columna de afinidad en la que el antfgeno o uno de sus fragmentos que contiene el epftopo reconocido por dichos anticuerpos monoclonales se ha inmovilizado previamente. Mas particularmente, los anticuerpos monoclonales pueden purificarse mediante cromatograffa en protema A y/o G, seguido o no seguido por cromatograffa de intercambio ionico dirigida a eliminar los contaminantes proteicos residuales asf como el ADN y los LPS, por sf mismos, seguido o no seguido por cromatograffa de exclusion en gel de Sepharose con el fin de eliminar posibles agregados debido a la presencia de dfmeros o de otros multimeros. En una realizacion, puede usarse la totalidad de estas tecnicas de manera simultanea o sucesiva. Ademas de secuencias de anticuerpo y/o un sitio de union a antfgeno, un anticuerpo para su uso en la presente invencion puede comprender otros aminoacidos, por ejemplo formando un peptido o polipeptido, tal como un dominio plegado, o para conferir a la molecula otra caractenstica funcional ademas de la capacidad para unirse al antfgeno. Los anticuerpos para su uso en la invencion pueden portar un marcador detectable, o pueden conjugarse con una toxina o un resto de direccionamiento o enzima (por ejemplo, a traves de un enlace peptidilo o ligador). Por ejemplo, un anticuerpo puede comprender un sitio catalftico (por ejemplo, en un dominio enzimatico) asf como un sitio de union a antfgeno, en el que el sitio de union a antfgeno se une al antfgeno y por tanto selecciona como diana el sitio catalftico para el antfgeno. El sitio catalftico puede inhibir la funcion biologica del antfgeno, por ejemplo mediante escision.

Regiones determinates de complementariedad

Las estructuras y ubicaciones de dominios variables de inmunoglobulina pueden determinarse haciendo referencia a Kabat 1987, y actualizaciones del mismo. Se dispone de varios recursos academicos y comerciales en lmea para consultar esta base de datos. Por ejemplo, vease Martin (1996) y el recurso en lmea asociado, actualmente en la direccion web de http://www.bioinf. org.uk/abs/simkab.html.

Mediante region CDR o CDR, pretende indicarse las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina tal como se define por Kabat et al. (1987), (Kabat 1991a, y ediciones posteriores). Un anticuerpo normalmente contiene 3 CDR de cadena pesada y 3 CDR de cadena ligera. El termino CDR (en singular o plural) se usa en el presente documento para indicar, segun el caso, una de estas regiones o varias, o incluso la totalidad de estas regiones que contienen la mayona de los residuos de aminoacido responsables de la union por afinidad del anticuerpo para el antigeno o el epftopo que reconoce.

Entre las seis secuencias de CDR cortas, la tercera CDR de la cadena pesada (HCDR3) tiene mayor variabilidad de tamano (mayor diversidad debido esencialmente a los mecanismos de disposicion de los genes que dan lugar a ella). Puede ser de tan solo 2 aminoacidos, aunque el tamano mas largo conocido es de 26. La longitud de la CDR tambien puede variar segun la longitud que puede albergar la region de entramado subyacente particular. Desde el punto de vista funcional, HCDR3 desempena un papel en parte de la determinacion de la especificidad del anticuerpo (Segal 1974; Amit 1986; Chothia 1987; chothia 1989; Caton 1990; Sharon 1990a; Sharon 1990b; Kabat et al., 1991b).

Dominio de union a antigeno

Esto describe la parte de una molecula que se une a y es complementaria a todo o parte del antfgeno diana. En una molecula de anticuerpo se denomina el sitio de union anticuerpo-antfgeno, y comprende la parte del anticuerpo que se une a y es complementaria a todo o parte del antfgeno diana. Cuando un antfgeno es grande, un anticuerpo solo puede unirse a una parte particular del antfgeno, parte que se denomina epftopo. Puede proporcionarse un sitio de union anticuerpo-antfgeno por uno o mas dominios variables de anticuerpo. Un sitio de union anticuerpo-antfgeno puede comprender una region variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y una region variable de cadena pesada de anticuerpo (VH).

El documento WO2006/072620 describe la obtencion por ingeniena genetica de sitios de union a antfgeno en bucles estructurales (distintos de CDR) que se extienden entre hebras beta de dominios de inmunoglobulina. Un sitio de union a antfgeno puede obtenerse mediante ingeniena genetica en una region de una molecula de anticuerpo separada de la ubicacion natural de las CDR, por ejemplo en una region de entramado de un dominio VH o VL, o en un dominio constante de anticuerpo por ejemplo CH1 y/o CH3. Un sitio de union a antfgeno obtenido mediante ingeniena genetica en una region estructural puede ser adicional a, o estar en lugar de, un sitio de union a antfgeno formado por conjuntos de CDR de un dominio VH y VL. Cuando estan presentes multiples sitios de union a antfgeno en una molecula de anticuerpo, pueden unirse al mismo antfgeno (antfgeno diana), aumentando de ese modo la valencia de la molecula de anticuerpo. Alternativamente, multiples sitios de union a antfgeno pueden unirse a antfgenos diferentes (el antfgeno diana y uno o mas de otro antfgeno), y esto puede usarse para anadir funciones efectoras, prolongar la semivida o mejorar la administracion in vivo de la molecula de anticuerpo.

Espedfico

Esto puede usarse para hacer referencia a la situacion en la que un miembro de un par de union espedfico no mostrara ninguna union significativa a moleculas distintas de su(s) pareja(s) de union espedfica(s). Por ejemplo, un anticuerpo espedfico para la isoforma grande de tenascina-C puede mostrar poca o ninguna union a otras isoformas de tenascina-C. El termino tambien puede aplicarse cuando, por ejemplo, un dominio de union a antfgeno es espedfico para un epftopo particular que es portado por varios antfgenos, en cuyo caso el elemento de union espedfico que porta el dominio de union a antfgeno podra unirse a los diversos antfgenos que portan el epftopo. Comprender

Esto se usa generalmente en el sentido de incluir, es decir, permitir la presencia de una o mas caractensticas o componentes.

Por “sustancialmente tal como se expone” quiere decirse que la CDR o el dominio VH o VL relevante de la divulgacion sera o bien identico o altamente similar a las regiones especificadas cuya secuencia se expone en el presente documento. Por “altamente similar” se contempla que pueden realizarse desde 1 hasta 5, preferiblemente desde 1 hasta 4 tal como de 1 a 3, o 1 o 2, o 3 o 4, sustituciones en la CDR y/o el dominio VH y/o VL.

La estructura para llevar a cabo una CDR de la divulgacion sera generalmente la de la secuencia de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o parte sustancial de la misma en que se ubica la CDR en una ubicacion correspondiente a la CDR de los dominios variables de anticuerpo VH y VL que se producen de manera natural codificados por los genes de inmunoglobulina reordenados. Las estructuras y las ubicaciones de las CDR y los dominios variables de inmunoglobulina pueden determinarse haciendo referencia a (Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4.a Edicion. Departamento de salud y servicios humanos de los EE.UU., 1987, y actualizaciones del mismo, disponible ahora en Internet (http://immuno.bme.nwu.edu)).

Tenascina-C

La tenascina-C es una glicoprotema hexamerica grande de la matriz extracelular que modula la adhesion celular. Esta implicada en procesos tales como proliferacion celular y migracion celular y esta asociada con cambios en la arquitectura del tejido tal como se produce durante morfogenesis y embriogenesis asf como bajo tumorigenesis o angiogenesis. Se muestra una representacion esquematica de la isoforma de tenascina-C pequena (A) y grande (B) en la figura 1.

Hay disponible informacion adicional sobre la estructura de tenascina-C en la base de datos UniProt con el numero de registro P24821, incluyendo la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 40 para la isoforma grande de tenascina-C. Una secuencia de aminoacidos del dominio A1 de tenascina-C se muestra como SEQ ID NO: 42, codificada por SEQ ID NO: 41.

Se ha comunicado una fuerte sobreexpresion de la isoforma grande de tenascina-C para un numero de tumores, y se han caracterizado ampliamente anticuerpos monoclonales espedficos para los dominios A1 y D, respectivamente, en la clmica (Riva et al., 1992; Riva et al., 1995; Paganelli et al., 1994; Reardon et al., 2002; Bigner et al., 1998).

“Y/o”, cuando se usa en el presente documento, ha de considerarse como la divulgacion espedfica de cada una de las dos caractensticas o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo “A y/o B” ha de considerarse como la divulgacion espedfica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si se expone cada uno individualmente en el presente documento.

A menos que el contexto indique otra cosa, las descripciones y definiciones de las caractensticas expuestas anteriormente no se limitan a ningun aspecto o realizacion particular de la invencion y se aplican por igual a todos los aspectos y realizaciones que se describen.

Ahora se mostraran determinados aspectos y realizaciones de la invencion a modo de ejemplo.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra una representacion esquematica de la isoforma de tenascina-C pequena (A) y grande (B). Varios dominios de tipo III de fibronectina se someten a corte y empalme alternativo, o bien incluyendose (B) u omitiendose (A) en la molecula. La secuencia de aminoacidos y secuencia de nucleotidos codificante de tenascina-C estan disponibles al publico con las referencias de base de datos de secuencia NP_002151.1 GI:4504549 (SEQ ID NO: 37) y NM_002160.1 GI:4504548 (SEQ ID NO: 38), respectivamente.

Las figuras 2A y B muestran los resultados de analisis inmunohistoqmmicos de biopsias de medula osea de un paciente con LMA, tenidas con el anticuerpo o bien F8-SIP (V5L/K18R) (F8) o bien 4A1-F16-SIP (F16), tal como se indica. El control negativo en cada caso es una biopsia de medula osea del mismo paciente tenida solo con complejo estreptavidina-fosfatasa alcalina biotinilada. 4A1-F16-SIP tino fuertemente los vasos sangumeos presentes en la biopsia de medula osea. La tincion con F8-SIP (V5L/K18R) tambien fue visible, aunque el nivel de tincion fue mas debil que el observado con 4A1-F16-SIP. No se observo tincion en el control negativo. El tamano de la barra de escala mostrada en la figura 1A es de 100 |im.

Las figuras 3A y B muestran analisis inmunohistoqmmicos de biopsias de medula osea de dos pacientes con LMA extramedular, tenidas con el anticuerpo o bien F8-SIP (V5L/K18R) (F8) o bien 4A1-F16-SIP (F16), tal como se indica. El control negativo en cada caso es una biopsia de medula osea del mismo paciente tenida solo con complejo estreptavidina-fosfatasa alcalina biotinilada. 4A1-F16-SIP tino fuertemente los vasos sangumeos presentes en las biopsias de medula osea. La tincion con F8-SIP (V5L/K18R) tambien fue visible y fue o bien similar o bien ligeramente mas debil que el nivel de tincion observado con 4A1-F16-SIP. No se observo tincion en el control negativo.

La figura 4A muestra analisis inmunohistoqmmicos de tumores HL-60 obtenidos de un modelo de raton de leucemia humana tenidos con el anticuerpo o bien F8-SIP (V5L/K18R) (F8) o bien 4A1-F16-SIP (F16), tal como se indica. La figura 3B muestra analisis inmunohistoqmmicos de biopsias de medula osea obtenidas de los mismos ratones que en A y tambien tenidas con el anticuerpo o bien F8-SIP (V5L/K18R) (F8) o bien 4A1-F16-SIP (F16), tal como se indica. Ambos anticuerpos tineron fuertemente los vasos de los cortes de tumor HL-60, mientras que no fue visible tincion con ningun anticuerpo en los cortes de medula osea sana. El tamano de la barra de escala mostrada en las figuras 4A y B es de 100 |im.

Experimentos

Los experimentos a continuacion muestran que antfgenos espedficos, tales como tenascina-C y la isoforma con ED-A de fibronectina, se expresan en neovasculatura de medula osea, por ejemplo la neovasculatura presente en la medula osea de pacientes con leucemia, en particular aquellos con LMA.

Materiales y metodos

Anticuerpos

4A1-F16-SIP es una mini-inmunoglobulina monoclonal humana espedfica para el dominio A1 de tenascina-C. La secuencia del anticuerpo 4A1-F16-SIP se muestra en SEQ ID NO: 25.

F8-SIP (V5L/K18R) es una mini-inmunoglobulina monoclonal humana espedfica para el dominio EDA de fibronectina sometido a corte y empalme alternativamente. La secuencia del anticuerpo F8-SIP (V5L/K18R) se muestra en SEQ ID NO: 26.

Biopsias de medula osea

Se realizaron analisis de inmunohistoqmmica e inmunofluorescencia en biopsias recien congeladas de medula osea de pacientes con leucemia mieloide aguda.

Inmunohistoqumica

Para la inmunohistoqmmica, se usaron anticuerpos biotinilados en formato de inmunoprotema pequena (SIP) en condiciones identicas (2 |ig/ml). Se prepararon almuotas de un solo lote de anticuerpos, se congelaron y se usaron solo una vez para garantizar la reproducibilidad de las tinciones inmunohistoqmmicas. Las muestras de tejido congelado se almacenaron a -80°C. Se fijaron cortes de 10 |im de grosor en acetona helada, se rehidrataron en tampon TBS (Tris 50 mM, NacL 100 mM, aprotinina al 0,001%, pH 7,4) y se bloquearon con suero bovino fetal al 20% en TBS. Se anadieron los anticuerpos sobre los cortes en una concentracion final de 2 |ig/ml en disolucion al 3% de albumina serica bobina (BSA)/TBS y se incubaron durante una hora. Tras lavar en TBS, se detectaron los anticuerpos unidos con complejo estreptavidina-fosfatasa alcalina biotinilada (Biospa, Milan, Italia) en TBS-BSA al 3% MgCl22 mM. Se uso el sustrato Fast Red (Sigma) para la deteccion de la actividad fosfatasa. Se contratineron los cortes con hematoxilina de Gill n.° 2 (Sigma) y se montaron con medio de montaje Glycergel (Dako, Glostrup, Dinamarca).

Estudios de inmunofluorescencia multicolor

Se usaron anticuerpos biotinilados en un formato de inmunoprotema pequena (SIP) en condiciones identicas (2 |ig/ml). Se prepararon almuotas a partir de un solo lote de anticuerpos, se congelaron y se usaron solo una vez para garantizar la reproducibilidad de las tinciones inmunohistoqmmicas.

Se fijaron cortes de 10 |im de grosor en acetona helada y se bloquearon con suero bovino fetal al 20% en PBS. Se anadieron F8-SIP (V5L/K18R) y 4A1-F16-SIP biotinilados sobre los cortes en una concentracion final de 2 |ig/ml en disolucion al 3% de albumina serica bovina (BSA)/PBS y se incubaron durante una hora. Se uso anticuerpo de raton anti-vWF (factor de von Willebrandt factor) humano para perfilar las celulas endoteliales. Tras lavar en PBS, se detectaron anticuerpos primarios unidos con estreptavidina-Alexa Fluor 488 y se usaron anticuerpos anti-IgG de raton-Alexa Fluor 594 (Invitrogen) como anticuerpos secundarios. Se contratineron los nucleos con DAPI y se capturaron las imagenes en un microscopio Axioskop 2 Mot plus equipado con una camara AxioCam MRc (Zeiss). Modelo de raton de leucemia humana

El modelo de raton para leucemia humana usado en este caso se describio previamente en Potter et al. (1984). Espedficamente, se sometieron a xenoinjerto ratones atfmicos con celulas de la lmea celular de leucemia HL-60 y, tras el desarrollo de tumores HL-60 (sarcomas granulodticos), se obtuvieron muestras tanto de dichos tumores como de la medula osea de los ratones. Entonces se realizaron estudios de inmunohistoqmmica tal como se describe en “inmunohistoqmmica” anteriormente.

Resultados

El analisis de inmunohistoqmmica mostro que el anticuerpo 4A1-F16-SIP podfa tenir la inmensa mayona de los vasos sangmneos en la medula osea de pacientes con LMA. El anticuerpo F8-SIP (V5L/K18R) tambien tino una gran proporcion de estos vasos sangmneos pero menos de los observados con el anticuerpo 4A1-F16-SIP. Estos resultados se muestran en las figuras 2A y B.

Se obtuvieron resultados similares cuando se sometieron biopsias de medula osea de dos pacientes con LMA extramedular a analisis de inmunohistoqmmica. El anticuerpo 4A1-F16-SIP tino fuertemente los vasos sangmneos presentes en las biopsias de medula osea en ambos casos. El nivel de tincion observado con el anticuerpo F8-SIP (V5L/K18R) fue similar al observado usando el anticuerpo 4A1-F16-SIP en una biopsia (figura 3B) pero mas debil en el otro (figura 3A).

Las diferencias en el nivel de tincion observado con los anticuerpos F8-SIP (V5L/K18R) y 4A1-F16-SIP puede deberse a diferencias en el nivel de expresion del dominio A1 de tenascina-C en relacion con la isoforma con ED-A de fibronectina en los vasos sangmneos de medula osea de pacientes con LMA.

Estudios de inmunofluorescencia multicolor de zonas de medula osea de pacientes con LMA con altas densidades de blastocitos mostraron adicionalmente una co-ubicacion excelente del anticuerpo 4A1-F16-SIP con anticuerpos espedficos para el factor de von Willebrand (vWF).

Los anticuerpos 4A1-F16 SIP y F8-SIP (V5L/K18R) tambien tineron cortes de tumores HL-60 obtenidos de un modelo de raton de leucemia humana. Espedficamente, ambos anticuerpos tineron fuertemente los vasos presentes en los cortes de tumor HL-60 (sarcoma granulodtico), mientras que no fue visible ninguna tincion en los cortes de medula osea sana obtenidos de los mismos ratones (figura 4).

Estos resultados muestran por primera vez que existen antfgenos que se expresan de manera diferencial en la neovasculatura de medula osea, en particular, la neovasculatura de medula osea de pacientes con leucemia, en comparacion con tejidos normales. Los resultados tambien muestran que los mismos antigenos tambien se expresan de manera diferencial en la neovasculatura de tumores formados por celulas leucemicas, tales como sarcomas granulocfticos, en comparacion con tejidos normales. Por tanto, estos antigenos representan dianas atractivas para el desarrollo de estrategias de administracion farmacologica selectivas y eficaces en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por neovasculatura de medula osea, tales como leucemia. En particular, como los agentes administrados por via sistemica tienen a menudo un acceso mas facil a las dianas presentes en la vasculatura desde el torrente circulatorio, se supera el problema del acceso y se permite una administracion eficaz del compuesto al sitio de enfermedad.

Por ejemplo, los antigenos expresados en neovasculatura de medula osea, tal como la neovasculatura de medula osea de pacientes con leucemia, pueden seleccionarse como diana usando anticuerpos que pueden unirse a dichos antigenos. Conjugando agentes bioactivos con dichos anticuerpos, los agentes bioactivos pueden administrarse directamente a la neovasculatura de medula osea. La seleccion como diana selectiva del agente bioactivo al sitio de enfermedad dara como resultado en ultima instancia un aumento de la concentracion local en su sitio de accion, reduciendo o eliminando asf la exposicion de tejidos normales a cualquier efecto toxico del agente bioactivo usado. Una administracion dirigida puede mejorar el mdice terapeutico del agente bioactivo administrado proporcionando una mayor eficacia con efectos secundarios minimizados. Ademas, el perfil de toxicidad favorable de agentes terapeuticos espedficos de sitio puede abrir nuevas vfas en la terapia de enfermedades caracterizadas por neovasculatura de medula osea, tales como leucemia, permitiendo la administracion sistemica de agentes altamente potentes y prometedores, que actualmente o bien se administran a dosis suboptimas o cuya aplicacion clmica se ha impedido hasta la fecha por toxicidades inaceptables cuando se aplican en forma no modificada.

Secuencias - Anticuerpo 4A1-F16

SEQ ID NO: 1. secuencia de nucleotidos del dominio VH de 4A1-F16

GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC CGG TAT GGT ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC TCA GCT ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG AAA GCG CAT AAT GCT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTG TCG AGA SEQ ID NO: 2 secuencia de aminoacidos del dominio VH de 4A1-F16

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYGMSWVRQA PGKGLEWVSA ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKAH NAFDYWGQGT LVTVSR SEQ ID NO: 3 secuencia de nucleotidos del dominio VL de 4A1-F16

TCT TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT GTT TAT ACT ATG CCG CCC GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA SEQ ID NO: 4 secuencia de aminoacidos del dominio VL de 4A1-F16

SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDR FSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPWFGGGTKLTVL

SEQ ID NO: 5 secuencia de aminoacidos de CDR1 de VH de 4A1- F16

RYGMS SEQ ID NO: 6 secuencia de aminoacidos de CDR2 de VH de 4A1-F16

AISGSGGSTYYADSVKG SEQ ID NO: 7 secuencia de aminoacidos de CDR3 de VH de 4A1-F16

AHNAFDY SEQ ID NO: 8 secuencia de aminoacidos de CDR1 de VL de 4A1-F16

QGDSLRSYYAS SEQ ID NO: 9 secuencia de aminoacidos de CDR2 de VL de 4A1-F16

GKNNRPS SEQ ID NO: 10 secuencia de aminoacidos de CDR3 de VL de 4A1-F16

NSSVYTMPPVV SEQ ID NO: 11 secuencia de aminoacidos del ligador pept^dico de los dominios VH y VL de 4A1-F16 GGGSGGGSGG

Secuencias - Anticuerpo F8 (V5L/K18R)

SEQ ID NO: 12 secuencia de nucleotidos del dominio VH de F8 (V5L) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGA CTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCCTGTTTACGATGAGCTGGGTCCGCCA GGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCAC ATACT ACGCAGACT CCGTG AAGGGCCGGTT CACCAT CTCCAGAGACAATT CCAAGAAC ACGCT GT AT CT GCAAAT GAACAGCCT GAGAGCCG AGG ACACGGC SEQ ID NO: 13 secuencia de aminoacidos del dominio VH de F8 (V5L)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSVWRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 14 secuencia de nucleotidos del dominio VL de F8 (K18R) GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCA CCCTCTCCTGCAGGG CC AGTCAGAGTGTTAG CATGCCGTTTTTAG CCTG GTACCAG CA GAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGG CATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGC AGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGATGCGTGGTCGGCCGC CGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA SEQ ID NO: 15 secuencia de aminoacidos del dominio VL de F8 (K18R)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIK

SEQ ID NO: 16 secuencia de aminoacidos de CDR1 de VH de F8 (V5L)

LFT

SEQ ID NO: 17 secuencia de aminoacidos de CDR2 de VH de F8 (V5L)

SGSGGS

SEQ ID NO: 18 secuencia de aminoacidos de CDR3 de VH de F8 (V5L)

STHLYL

SEQ ID NO: 19 secuencia de aminoacidos de CDR1 de VL de F8 (K18R)

MPF

SEQ ID NO: 20 secuencia de aminoacidos de CDR2 de VL de F8 (K18R)

GASSRAT

SEQ ID NO: 21 secuencia de aminoacidos de CDR3 de VL de F8 (K18R)

MRGRPP

SEQ ID NO: 22 secuencia de aminoacidos del ligador pepddico de los dominios VH y VL de F8 (V5L/K18R)

GGGGSGGGSGGGGG

SEQ ID NO: 23 secuencia de aminoacidos del ligador pepddico de los dominios VL y CH4 de 4A1-F16-SIP y F8-SIP (V5L/K18R)

SG

SEQ ID NO: 24 secuencia de aminoacidos del dominio de dimerizacion CH4 de 4A1-F16-SIP y F8-SIP (V5L/K18R)

GSGGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQ PRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPESSRRGGC

SEQ ID NO: 25 secuencia de aminoacidos de 4A1-F16-SIP

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSVWRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGG SGGGSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNR PSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPWFGGGTKLTVLSGGSGG PRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKT KGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPESSRRGGC SEQ ID NO: 26 secuencia de aminoacidos de F8-SIP (V5L/K18R) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGG GGSGGGSGGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRL LIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKS GGSGGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTT QPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPESSRRGGC

Secuencias - Interleucina 2

SEQ ID NO: 27 secuencia del precursor de hIL2 (hIL2 madura: residuos 7-150)

MYRMQLLSCI ALSLALVTNS APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT SEQ ID NO: 28 secuencia del ligador de IL-2

GGGGSGGGGSGGGG

SEQ ID NO: 29 secuencia del ligador de IL-2

GGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO: 30 secuencia del ligador de IL-2

SSSSGSSSSGSSSSG

SEQ ID NO: 31 secuencia del ligador de IL-2

GSGSAGSGSAGSGSA

SEQ ID NO: 32 secuencia del ligador de IL-2

GGSGGGGSGGGGSGG

Bibliograffa

Am it et al. (1986), Science, 233:747-753.

Barnett, C.J., et al., J Med Chem, 1978. 21(1): pags. 88-96.

Berndorff, D., et al, J Nucl Med, 2006. 47(10): pags. 1707-16.

Birchler, M., et al., Nat Biotechnol, 1999. 17(10): pags. 984-8.

Borsi et al., J. Cell. Biol., 1987. 104, 595-600.

Borsi, L., et al., Int J Cancer, 2002. 102(1): pags. 75-85.

Brack et al. Clin Cancer Res, 2006. 12(10): 3200-3208.

Carnemolla, B., et al., Blood, 2002. 99(5): pags. 1659-65.

Carter, P.J. y P.D. Senter,. Cancer J, 2008. 14(3): pags. 154-69.

Caton et al. (1990), J. Immunol., 144:1965-1968.

Chothia et al. (1987), J. Mol. Biol., 196:901-917.

Chothia et al. (1989), Nature, 342:877- 883.

de Arruda, M., et al., Cancer Res, 1995. 55(14): pags. 3085-92.

Fabbrini, M., et al., Int J Cancer, 2006. 118(7): pags. 1805-13.

Feldman et al, 2003, Leukemia, 17, 314-318.

Feldman et al, 2005, J Clin Oncol, 23, 4110-4116.

Haan et al. (2004), BioCentury, 12(5): A1-A6.

Jin et al., Cell Stem cell, 2 de julio de 2009;5(1):31-42.

Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4.a Edicion. Departamento de salud y servicios humanos de los EE.UU.

Kabat et al. (1991a), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Edicion. Departamento de salud y servicios humanos de los EE.UU., Public Service, NIH, Washington.

Kabat et al. (1991b), J. Immunol., 147:1709-1719.

Kobayashi et al, Int. J Hematol, 2009, 89, 460-469.

Koide et al. (1998), Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151.

Leamon, C.P., et al., Int J Cancer, 2007. 121(7): pags. 1585-92.

Marlind, et al., Clin Cancer Res, 2008. 14(20): pags. 6515-24.

Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133

Menrad, A. y H.D. Menssen, 2005. 9(3): pags. 491-500.

Neri, D., G. Fossati, y M. Zanda, ChemMedChem, 2006. 1(2): pags. 175-80.

Nilsson, F., et al., Cancer Res, 2001. 61(2): pags. 711-6.

Nygren et al. (1997), Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469.

Padro, T., et al, Blood, 2000. 95(8): pags. 2637-44.

Paganelli G et al, Eur J Nucl Med 21:314-321 1994

Patterson, A.W. et al., Chemistry, 2007. 13(34): pags. 9534-41.

Potter et al, Am J Pathol., 1984, 114, 360-366

Ray, A., et al., Cancer Res, 2007. 67(8): pags. 3767-76.

Reardon DA et al. J Clin Oncol 20:1389-13972002

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo que se une al dominio A1 de la isoforma grande de tenascina-C para su uso en un metodo de tratamiento de leucemia mieloide aguda (LMA) que comprende seleccionar como diana la neovasculatura de medula osea en pacientes con LMA.

2. Uso de un anticuerpo que se une al dominio A1 de la isoforma grande de tenascina-C en la fabricacion de un medicamento para su uso en un metodo de tratamiento de LMA que comprende seleccionar como diana la neovasculatura de medula osea en pacientes con LMA.

3. Anticuerpo para su uso o uso segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el anticuerpo se conjuga con una citocina, un agente citotoxico o un radioisotopo terapeutico.

4. Anticuerpo para su uso o uso segun la reivindicacion 3, en el que el anticuerpo se conjuga con la citocina, el agente citotoxico o un radioisotopo terapeutico a traves de un ligador escindible.

5. Anticuerpo para su uso o uso segun la reivindicacion 3 o la reivindicacion 4, en el que el anticuerpo se conjuga con interleucina 2 (IL2).

6. Anticuerpo para su uso o uso segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el metodo comprende administrar el anticuerpo y un compuesto anticanceroso a un individuo que lo necesita.

7. Anticuerpo para su uso o uso segun la reivindicacion 6, en el que el compuesto anticanceroso es citarabina.

8. Anticuerpo para su uso o uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el metodo comprende administrar el anticuerpo y una inmunoterapia basada en IgG a un individuo que lo necesita.

9. Anticuerpo para su uso o uso segun la reivindicacion 8, en el que la inmunoterapia basada en IgG es un anticuerpo anti-CD33..

10. Anticuerpo que se une al dominio A1 de la isoforma grande de tenascina-C para su uso en un metodo de diagnostico de LMA, en el que el metodo comprende:

administrar el anticuerpo a un individuo; y

detectar la union del anticuerpo a la neovasculatura de medula osea en el individuo.

11. Uso de un anticuerpo que se une al dominio A1 de la isoforma grande de tenascina-C en la fabricacion de un medicamento para su uso en un metodo de diagnostico de LMA, en el que el metodo comprende: administrar el anticuerpo a un individuo; y

detectar la union del anticuerpo a la neovasculatura de medula osea en el individuo.

12. Anticuerpo para su uso segun la reivindicacion 10 o uso segun la reivindicacion 11, en el que el anticuerpo se conjuga con un marcador detectable.

13. Anticuerpo para su uso o uso segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo compite por unirse a tenascina-C con un anticuerpo que comprende el dominio VH de 4A1-F16 de SEQ ID NO: 2 y el dominio VL de 4A1-F16 de SEQ ID NO: 4.

14. Anticuerpo para su uso o uso segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo comprende un sitio de union anticuerpo-antfgeno que comprende un dominio VH y un dominio VL,

comprendiendo el dominio VH una CDR1 de VH de SEQ ID NO: 5, una CDR2 de VH de SEQ ID NO: 6 y una CDR3 de VH de SEQ ID NO: 7, y

comprendiendo el dominio VL una CDR1 de VL de SEQ ID NO: 8, una CDR2 de VL de SEQ ID NO: 9 y una CDR3 de VL de SEQ ID NO: 10.

15. Anticuerpo para su uso o uso segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo comprende un sitio de union anticuerpo-antfgeno que comprende un dominio VH y un dominio VL, en el que

el dominio VH es el dominio VH de 4A1-F16 de SEQ ID NO: 2 y el dominio VL es el dominio VL de 4A1-F16 de SEQ ID NO: 4.

16. Anticuerpo para su uso o uso segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es una inmunoprotema pequena (SIP), scFv, diacuerpo o molecula de IgG completa.

17. Uso de un anticuerpo que se une al dominio A1 de la isoforma grande de tenascina-C en la neovasculatura de medula osea en pacientes con LMA para la deteccion o el diagnostico in vitro de LMA.

18. Uso segun la reivindicacion 17, en el que el anticuerpo es un anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16.