ES2764079T3 - Vacunas genéticas contra el virus Hendra y el virus Nipah - Google Patents

Abstract

Composición para usar en un procedimiento de vacunación de un animal, comprendiendo dicha composición un vector de expresión, en la que el vector comprende un primer polinucleótido que codifica un polipéptido G del virus Hendra y un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido F del virus Hendra, en la que dicho vector es un vector de viruela del canario; además en la que el polipéptido G del virus Hendra es la SEQ ID NO: 3 y el polipéptido F del virus Hendra es la SEQ ID NO: 6, comprendiendo dicha composición además un portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacunas genéticas contra el virus Hendra y el virus Nipah

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

[0001] Esta Solicitud reivindica beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos N° de Serie 61/491.037 presentada el 27 de mayo, 2011.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0002] La presente invención se refiere a formulaciones para combatir el virus Hendra y virus Nipah en animales. Específicamente, la presente invención se refiere a vectores que contienen y expresan in vivo o in vitro antígenos F y G del virus Hendra que provocan una respuesta inmune en animales y humanos contra el virus Hendra y el virus Nipah, incluyendo composiciones que comprenden dichos vectores, y composiciones para su uso en procedimientos de vacunación contra el virus Hendra y el virus Nipah virus. La presente invención también se refiere a vectores que contienen y expresan in vivo o in vitro la proteína F o G de Hendra que provocan una respuesta inmune en animales contra el virus Hendra y Nipah, y composiciones que comprenden dichos vectores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0003] El virus Hendra es la fuente de una enfermedad que ha surgido recientemente en animales y humanos. El virus Hendra fue reconocido por primera vez en septiembre de 1994 después de un brote de la enfermedad respiratoria entre veinte caballos y dos seres humanos en Hendra, Queensland, Australia (Selvey LA, et al, Med J Australia 1.995, 162: 642-5). Trece caballos y un ser humano murieron. En 1995, se identificó un segundo brote no relacionado que se había producido en agosto de 1994 en Mackay, Queensland, en el que murieron dos caballos murieron y se infectó un ser humano (Hooper PT, et al, Vet Australian J 1996; 74. 244-5; Rogers. RJ, et al, Australia Vet J 1996; 74: 243-4). Cuatro de las siete personas que contrajeron el virus de caballos infectados han muerto desde que la enfermedad apareció por primera vez en 1994. La tasa de mortalidad se ha reportado en más del 70% en los caballos y el 50% en los seres humanos.

[0004] El virus Nipah es un miembro de la familia Paramyxoviridae y está relacionado con el virus Hendra (anteriormente llamado morbilivirus equino). El virus Nipah se aisló inicialmente en 1999 tras el examen de muestras de un brote de encefalitis y enfermedad respiratoria entre hombres adultos en Malasia y Singapur (véase, por ejemplo, Chua et al, Lancet 1999,354 (9186): 1257-9 y Paton. et al, Lancet 1999 Oct 9; 354 (9186): 1253-6). El huésped para el virus Nipah es aún desconocido, pero los zorros voladores (murciélagos del género Pteropus) se sospecha que es el huésped natural. La infección con virus Nipah en seres humanos se ha asociado a una encefalitis caracterizada por fiebre y somnolencia y una enfermedad más grave del sistema nervioso central, tal como coma, convulsiones e incapacidad para mantener la respiración (véase, por ejemplo, Lee et al., Ann Neurol.

1999 septiembre; 46 (3): 428-32). La enfermedad por el virus Nipah empieza con 3-14 días de fiebre y dolor de cabeza, seguido de somnolencia y desorientación caracterizada por confusión mental. Estos signos y síntomas pueden progresar hasta el coma el plazo de 24-48 horas. Algunos pacientes han tenido una enfermedad respiratoria durante la primera parte de sus infecciones. La enfermedad nerviosa grave con encefalitis por el virus Nipah se ha destacado por algunas secuelas, tales como convulsiones persistentes y cambios de personalidad. Durante el brote de la enfermedad por el virus Nipah en 1998-1999, alrededor del 40% de los pacientes con enfermedad nerviosa grave que ingresaron en los hospitales murieron de la enfermedad (véase, por ejemplo, Lam y Chua, Clin Infect Dis 2002 1 de mayo; 34 Suppl. 2: S48 -51).

[0005] El virus Hendra, como la mayoría de otros paramixovirus, poseen dos glicoproteínas de superficie, una proteína de fusión (F) y una proteína de unión (G), que están implicadas en la promoción de la fusión entre la membrana viral y la membrana de la célula huésped diana. El virus Hendra y el virus Nipah requieren sus proteínas de unión y de fusión para iniciar la fusión de membranas (Bossart et al, J Virol 2002; 76: 11186-98). Se llevaron a cabo varios estudios para comprender las funciones de las proteínas G y F en la infección por el virus. Se construyó una glicoproteína G soluble del virus Hendra y se mostró la capacidad de unirse a células permisivas por la infección del virus Hedra y el virus Nipah (Bossart et al, J Virol 2005; 79: 6690-6702). Se observó que los anticuerpos monoclonales específicos para la proteína de fusión del virus Nipah neutralizaba el virus Hedra in vitro y protegía los hamsters del virus Hendra (Guillaume et al, Virology 2009; 387: 459-465). Se evaluó una proteína G de Hendra soluble recombinante en adyuvante CpG en un modelo de gato (McEachern et al, Vaccine 2008; 26:. 3842-3852).

[0006] En la actualidad no hay una vacuna con licencia contra Hendra. Por lo tanto, existe una necesidad general de una vacuna Hendra para la protección contra la infección por el virus Hendra y el virus Nipah, la prevención de la enfermedad en animales y humanos y la prevención de la propagación del virus a animales o humanos no infectados.

[0007] La presente invención proporciona una solución para optimizar el efecto inmunológico y eficaz de la vacuna contra el virus Hendra al tiempo que conserva una alta seguridad para los animales vacunados.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

[0008] La presente invención proporciona una composición para usar en un procedimiento de vacunación de un animal, comprendiendo dicha composición un vector de expresión, en la que el vector comprende un primer polinucleótido que codifica un polipéptido G del virus Hendra y un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido F del virus Hendra, en la que dicho vector es un vector de viruela del canario; además en la que el polipéptido G del virus Hendra es la SEQ ID NO: 3 y el polipéptido F del virus Hendra es la SEQ ID NO: 6, comprendiendo dicha composición además un portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable. La presente invención proporciona además una composición para usar en un procedimiento de vacunación de un animal, comprendiendo dicha composición dos o más vectores de expresión, en la que la composición comprende un primer vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido G del virus Hendra y un segundo vector de expresión que comprende una polinucleótido que codifica un polipéptido F del virus Hendra, en la que dichos vectores son vectores de la viruela del canario; además en la que el polipéptido G del virus Hendra es la SEQ ID NO: 3 y el polipéptido F del virus Hendra es la SEQ ID NO: 6, comprendiendo dicha composición además un portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable.

[0009] Se describe en el presente documento un vector recombinante, tal como un virus recombinante, que contiene y expresa al menos una molécula de ácido nucleico exógeno y, la al menos una molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una molécula de ácido nucleico que codifica un inmunógeno o epítopo de interés de virus Hendra, tal como F o G o una combinación de las mismas.

[0010] Se describen en el presente documento composiciones o vacunas que comprenden un vector de expresión o el producto o productos de expresión de dicho vector de expresión. Las composiciones o vacunas pueden comprender dos o más de dichos vectores de expresión o el producto o productos de expresión de dichos vectores de expresión. La presente invención se refiere además a una vacuna o composición que puede comprender uno o más del vector recombinante o de expresión mencionado anteriormente, portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, y adicionalmente uno o más antígenos. El antígeno o antígenos adicionales pueden ser el antígeno o antígenos del virus Nipah.

[0011] Se describen en el presente documento procedimientos para inducir una respuesta inmunológica (o inmunogénica) o de protección contra virus Hendra o virus Nipah, así como procedimientos para prevenir o tratar el estado o estados de la enfermedad causados por el virus Hendra o virus Nipah, que comprende administrar el vector de expresión o un producto de expresión del vector de expresión, o una composición que comprende el vector de expresión, o una composición que comprende un producto de expresión del vector de expresión.

[0012] La descripción se refiere a productos de expresión del virus, así como anticuerpos generados a partir de los productos de expresión o la expresión de los mismos in vivo y usos para tales productos y anticuerpos, por ejemplo, en aplicaciones de diagnóstico. La descripción también se refiere a un procedimiento de hiperinmunización de caballos para inducir anticuerpos policlonales para seroterapia en animales y humanos que comprende al menos una administración de la composición o vector de la presente descripción.

[0013] Estas y otras realizaciones se describen o son evidentes a partir de, y abarcadas por, la siguiente descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0014] La siguiente descripción detallada, proporcionada a modo de ejemplo, pero que no pretende limitar la invención únicamente a las realizaciones específicas descritas, puede entenderse mejor en conjunción con los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 es la tabla que muestra la SEQ ID NO asignada a las respectivas secuencias de ADN y proteína.

La Figura 2 representa los mapas de plásmido de p362-Hendra G y p362-Hendra F.

La figura 3 muestra el resultado de transferencia Southern de vCP3004 (Hendra G).

La figura 4 muestra el resultado de transferencia Western de vCP3004 (Hendra G).

La figura 5 muestra el resultado de transferencia Southern de vCP3005 (Hendra F).

La figura 6 muestra el resultado de transferencia Western de vCP3005 (Hendra F).

La Figura 7 representa el ensayo de fusión de vCP3004, vCP3005 y vCP3004 vCP3005.

Las figuras 8A-8C muestran la unión del ELISA y ensayos de bloqueo y SNT contra Hendra.

Las figuras 9A-9C muestran la unión del ELISA y ensayos de bloqueo y SNT contra Nipah.

Las figuras 10A-10B muestran los datos de serología VN de caballos vacunados con vCP3004 vCP3005 contra Hendra y Nipah.

La figura 11 muestra las secuencias de ADN y proteínas.

La figura 12 muestra la alineación de secuencias de proteínas y ADN y los procentajes de identidad de secuencias.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0015] Se proporcionan composiciones que comprenden uno o más vectores de expresión que comprenden uno o más polinucleótidos que codifican uno o más antígenos, polipéptido o polipéptidos del virus Hendra y fragmentos y variantes de los mismos que provocan una respuesta inmunogénica en un animal o ser humano. El vector de expresión que comprende el polinucleótido que codifica el antígeno o antígenos o polipéptido o polipéptidos o fragmentos o variantes del vius Hendra se puede formular en vacunas o composiciones farmacéuticas y se usa para provocar o estimular una respuesta protectora en un animal o ser humano. En una realización, el antígeno o polipéptido del virus Hendra es una proteína de fusión (F) del virus Hendra, una proteína de unión (G) del virus Hendra, o un fragmento activo o variante de las mismas.

[0016] Se reconoce que los polipéptidos descritos en el presente documento pueden ser polipéptidos de longitud completa o fragmentos activos o variantes de los mismos. Por "fragmentos activos" o "variantes activas" se entiende que los fragmentos o variantes conservan la naturaleza antigénica del polipéptido. Por lo tanto, en el presente documento se describe cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno del virus Hendra que provoca una respuesta inmunogénica en un animal. El polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno del virus Hendra puede ser cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno del virus Hendra, tal como, pero no limitado a, una proteína, péptido o fragmento o variante de los mismos, que provoca, induce o estimula una respuesta en un animal.

[0017] Un polipéptido del virus Hendra particular de interés es la proteína de fusión (F) del virus Hendra y la proteína unión (G) del virus Hendra. Se reconoce además que puedne utilizarse los precursores de cualquiera de estos antígenos. Los polipéptidos antigénicos de la invención son capaces de proteger contra el virus Hendra. Es decir, son capaces de estimular una respuesta inmunitaria en un animal o ser humano.

[0018] El término "antígeno" o "inmunógeno" significa una sustancia que induce una respuesta inmune específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o parte de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunogénicas; un trozo o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmune tras la presentación a un animal huésped; un polipéptido, un epítopo, un hapteno, o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, el inmunógeno o antígeno puede comprender una toxina o antitoxina.

[0019] El términos "proteína", "péptido", "polipéptido" y "fragmento de polipéptido" se usan indistintamente en este documento para referirse a polímeros de residuos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, y puede estar interrumpido por restos químicos distintos de aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo la formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje o bioactivo.

[0020] El término "polipéptido o antígeno del virus Hendra" se refiere a cualquier antígeno o polipéptido identificado en cualquier cepa de virus Hendra. El antígeno o polipéptido puede ser nativo de la cepa del virus Hendra particular. El antígeno o polipéptido puede optimizarse a partir de su forma nativa. El polipéptido o antígeno del virus Hendra incluyen, por ejemplo, proteína de fusión (F), proteína de unión (G) y proteína de la nucleocápside (N).

[0021] El término "polipéptido inmunogénico o antigénico", como se usa en el presente documento, incluye polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido de que una vez que se administra al huésped, es capaz de evocar una respuesta inmune de tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. Preferiblemente, el fragmento de proteína es tal que tiene sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total. Por lo tanto, un fragmento de proteína descrito en el presente documento comprende o consiste esencialmente en o consiste en al menos un epítopo o determinante antigénico. Una proteína o polipéptido "inmunogénico", como se usa en el presente documento, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de la misma, o fragmentos inmunogénicos de la misma. Por "fragmento inmunogénico" se entiende un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y de este modo provoca la respuesta inmunológica descrita anteriormente. Tales fragmentos pueden ser identificados usando cualquier técnica de mapeo de epítopos, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse, por ejemplo, sintetizando simultáneamente gran cantidad de péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos correspondientes a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos están todavía unidos a los soportes. Tales técnicas se conocen en el sector y se describen en, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos. No.

4.708.871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. De manera similar, los epítopos conformacionales son fácilmente identificados mediante la determinación de la conformación espacial de aminoácidos, tales como mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear de 2 dimensiones. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra.

[0022] Tal como se discute en el presente documento, la invención abarca fragmentos activos y variantes del polipéptido antigénico. Por lo tanto, el término "polipéptido inmunogénico o antigénico" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones a la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica tal como se define en este documento. El término "variación conservativa" se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal manera que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos - aspartato y glutamato; (2) básicos - lisina, arginina, histidina; (3) no polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga - glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Los ejemplos de variaciones conservativas incluyen la sustitución de un resto hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrófobo, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y similares; o una sustitución conservativa similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado que no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína están, por lo tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en el presente documento. El término "variación conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental no sustituido siempre que los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido.

[0023] El término "epítopo" se refiere al sitio en un antígeno o hapteno al cual responden células B y/o células T específicas. El término también se usa indistintamente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.

[0024] Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a una composición o vacuna de interés. Normalmente, una "respuesta inmunológica" incluye, pero no se limita a, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares, y/o células T citotóxicas, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el huésped mostrará tanto una respuesta inmunológica terapéutica o protectora, tal que la resistencia a una nueva infección se verá aumentada y/o la gravedad clínica de la enfermedad se verá reducida. Dicha protección se demostrará por una reducción o ausencia de síntomas normalmente mostradas por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título viral disminuido en el huésped infectado.

[0025] Por "animal" se entienden mamíferos, aves, y similares. Animal o huésped tal como se usa en el presente documento incluye mamíferos y humanos. El animal puede seleccionarse del grupo que consiste en equino (por ejemplo, caballos), caninos (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felino (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros gatos grandes, y otros felinos incluyendo guepardos y lince), ovino (por ejemplo, ovejas), bovino (por ejemplo, ganado), porcino (por ejemplo, cerdo), aves (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisán, loro, pinzones, halcón, cuervo, avestruz, emu y casuario), primate (por ejemplo, prosimio, tarsero, mono, gibón, mono), hurones, focas, y pescado. El término "animal" también incluye un animal individual en todas las etapas de desarrollo, incluyendo etapas embrionaria y fetal.

[0026] A menos que se explique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Los términos singulares "un", "una", y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0027] Cabe indicar que en esta descripción y particularmente en las reivindicaciones y/o párrafos, los términos tales como "comprende" "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado que se le atribuye en la ley de Patentes de Estados Unidos; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye", y similares; y que términos tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de Estados Unidos, por ejemplo, permiten elementos no citados de manera explícita, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan una característica básica o novedosa de la invención.

Composiciones

[0028] La presente invención se refiere a una vacuna recombinante o composición de virus Hendra que puede comprender al menos un recombinante o vector de expresión que comprende uno o más polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos, antígeno, epítopo o inmunógeno del virus Hendra. La vacuna o composición puede comprender además un portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable. El polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno del virus Hendra puede ser cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno del virus Hendra, tal como, pero no limitado a, una proteína, péptido o fragmento de la misma, que provoca, induce o estimula una respuesta en un animal.

[0029] En otra realización, el portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, puede ser una emulsión de agua-en-aceite. En aún otra realización, la emulsión de agua-en-aceite puede ser una emulsión triple de agua/aceite/agua (W/O/W). En aún otra realización, el portador, excipiente, adyuvante, o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una emulsión de aceite-en-agua. En otra realización, el portador, excipiente, adyuvante, o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable pueden ser polímeros de ácido acrílico o metacrílico, anhídrido maleico y polímeros derivados de alquenilo.

[0030] Tal como se describe en el presente documento, el polipéptido, antígeno o fragmento o variante del mismo del virus Hendra puede ser un polipéptido F o un fragmento o variante del mismo del virus Hendra. También se describe en este documento, el polipéptido F o un fragmento o variante del mismo del virsu Hendra es un polipéptido recombinante producido por un gen F del virus Hendra. De acuerdo con la invención, el gen F del virus Hendra puede tener al menos 70% de identidad con la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 4 o 5. De acuerdo con la invención, el polipéptido F del virus Hendra es la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 6.

[0031] Tal como se describe en el presente documento, el polipéptido, antígeno o fragmento o variante del mismo del virus Hendra puede ser un polipéptido G o fragmento o variante del mismo del virus Hendra. Tal como se describe en el presente documento, el polipéptido G o fragmento o variante del mismo del virus Hendra es un polipéptido recombinante producido por un gen G del virus Hendra. De acuerdo con la invención, el gen G del virus Hendra puede tener al menos 70% de identidad con la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 1 o 2. De acuerdo con la invención, el polipéptido G del virus Hendra es la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 3.

[0032] Los antígenos sintéticos también se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, poliepítopos, epítopos flanqueantes, y otros antígenos recombinantes o derivados sintéticamente. Los fragmentos inmunogénicos, para los propósitos de la presente descripción, por lo general, incluirán al menos aproximadamente 3 aminoácidos, al menos aproximadamente 5 aminoácidos, al menos aproximadamente 10-15 aminoácidos, o aproximadamente 15-25 aminoácidos o más aminoácidos, de la molécula. No hay un límite superior crítico para la longitud del fragmento, que podría comprender casi la longitud completa de la secuencia de la proteína, o incluso una proteína de fusión que comprende al menos un epítopo de la proteína.

[0033] Por consiguiente, una estructura mínima de un polinucleótido que expresa un epítopo es el que comprende o consiste esencialmente en o consiste en nucleótidos que codifican un epítopo o determinante antigénico de un polipéptido del virus Hendra. Un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido del virus Hendra puede comprender o consistir esencialmente en o consistir en un mínimo de 15 nucleótidos, aproximadamente 30-45 nucleótidos, aproximadamente 45-75, o al menos 75, 87 o 150 nucleótidos consecutivos o contiguos de la secuencia que codifica el polipéptido. Los procedimientos de determinación de epítopo, tales como, la generación de bibliotecas de péptidos que se solapan, Pepscan (Geysen et al, 1984 (Hemmer et al., 1998); Geysen y col., 1985; Van der Zee. R. et al, 1989; Geysen., 1990; Multipin.RTM Peptide Synthesis Kits de Chiron) y algoritmos (de Groot et al, 1999; PCT/US2004/022605) se pueden utilizar en la práctica de la invención.

[0034] El término "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refiere a ARN o ADN que es lineal o ramificado, monocatenario o bicatenario, o un híbrido de los mismos. El término también abarca híbridos de ARN/ADN. Los siguientes son ejemplos no limitativos de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleicos y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de unión, tales como fluororibosa y tiolato, y ramas de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos se puede modificar adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación, con un componente de marcaje. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son los agentes de bloqueo, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo, y la introducción de medios para unir el polinucleótido a proteínas, iones metálicos, componentes de marcaje, otros polinucleótidos o soporte sólido. Los polinucleótidos se pueden obtener por síntesis química o derivados de un microorganismo.

[0035] El término "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleótido asociado con una función biológica. Por lo tanto, los genes incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica, o sólo las secuencias de codificación como en ADNc y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Por ejemplo, el gen también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.

[0036] Un componente biológico "aislado" (tal como un ácido nucleico o proteína u orgánulo) se refiere a un componente que se ha separado sustancialmente o purificado de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el que se produce naturalmente el componente, por ejemplo, otro de ADN y ARN, proteínas y orgánulos cromosómicos y extracromosómicos. Los ácidos nucleicos y proteínas que han sido "aislados" incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante procedimientos de purificación estándar. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparados por tecnología recombinante, así como síntesis química.

[0037] El término "purificado" como se usa en el presente documento no requiere pureza absoluta; más bien, se pretende como un término relativo. Así, por ejemplo, una preparación de polipéptido parcialmente purificado es una en la que el polipéptido está más enriquecido que el polipéptido está en su medio natural. Es decir el polipéptido se separa de los componentes celulares. Por "sustancialmente purificado" se entiende que al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98%, o más de los componentes o materiales celulares se han eliminado. Del mismo modo, un polipéptido puede estar parcialmente purificado. Por "parcialmente purificado" se entiende que se elimina menos del 60% de los componentes o materiales celulares. Lo mismo se aplica a los polinucleótidos. Los polipéptidos descritos en este documento se pueden purificar por cualquiera de los medios conocidos en la técnica.

[0038] Además, los homólogos de los polipéptidos F o G del virus Hendra se pretende que estén dentro del alcance de la presente descripción. Tal como se usa en el presente documento, el término "homólogos" incluye ortólogos, análogos y parálogos. El término "análogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que tienen la misma función o similar, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. El término "ortólogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos de diferentes especies, pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican polipéptidos que tienen las mismas funciones o similares. El término "parálogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos normalmente tienen diferentes funciones, pero estas funciones pueden estar relacionadas. Por ejemplo, los análogos, ortólogos, y parálogos de un polipéptido del virus Hendra de tipo salvaje pueden diferir del polipéptido del virus Hendra de tipo salvaje en modificaciones posteriores a la traducción, en diferencias en la secuencia de aminoácidos, o en ambos. En particular, los homólogos de la descripción mostrarán generalmente al menos el 80-85%, 85-90%, 90-95%, o 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia, con la totalidad o parte de las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos de virus Hendra de tipo salvaje, y mostrarán una función similar.

[0039] Se describe en el presente documento, la presente descripción proporciona un vector de expresión que comprende uno o más polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos que tienen al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3 o 6. Se describe en el presente documento, la presente descripción proporciona fragmentos y variantes de los polipéptidos F o G del virus Hendra identificados anteriormente (SEQ ID NO: 3,6), que fácilmente pueden ser preparados por un experto en la técnica usando técnicas de biología molecular bien conocidas. Las variantes son polipép1 tidos homólogos que tienen secuencias de aminoácidos con al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con las secuencias de aminoácidos como se exponen en SEQ ID NO : 3 o 6.

[0040] Las variantes incluyen variantes alélicas. El término "variante alélica" se refiere a un polinucleótido o un polipéptido que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de una proteína y que existen dentro de una población natural (por ejemplo, una especie o variedad de virus). Tales variaciones alélicas naturales pueden dar lugar típicamente al 1-5% de la variación en un polinucleótido o un polipéptido. Las variantes alélicas pueden identificarse por secuenciación de la secuencia de ácido nucleico de interés en un conjunto de diferentes especies, que puede llevarse a cabo fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el locus genético del mismo gen en estas especies. Cualquiera y todas de dichas variaciones de ácido nucleico y los polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional del gen de interés, se pretende que estén dentro del alcance de la descri pción.

[0041] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "derivado" o "variante" se refiere a un polipéptido, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que tiene una o más variaciones conservativas de aminoácidos u otras modificaciones menores, tales que (1) el polipéptido correspondiente tiene una función sustancialmente equivalente en comparación con el polipéptido de tipo salvaje o (2) un anticuerpo generado contra el polipéptido es inmunorreactivo con el polipéptido de tipo salvaje. Estas variantes o derivados incluyen polipéptidos que tienen modificaciones menores de las secuencias de aminoácidos primarias del polipéptido del virus Hendra que pueden dar lugar a péptidos que tienen una actividad sustancialmente equivalente en comparación con el polipéptido homólogo sin modificar. Tales modificaciones pueden ser deliberadas, como mediante mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser espontáneas. El término "variante" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica tal como se define en este documento.

[0042] Un fragmento inmunogénico de un polipéptido de virus Hendra incluye al menos 8, 10, 13, 14, 15, o 20 aminoácidos consecutivos, al menos 21 aminoácidos, al menos 23 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos, o al menos 30 aminoácidos de un polipéptido de virus Hendra que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 3, 6, o variantes de las mismas.

[0043] También se describe en el presente documento un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido F de virus Hendra, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 6. En aún otro aspecto, la presente descripción proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 6, o una variante conservativa, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos.

[0044] También se describe en el presente documento un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido G de virus Hendra, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3. En aún otro aspecto, la presente descripción proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 3, o una variante conservativa, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos.

[0045] También se describe en el presente documento un vector de expresión

que comprende dos polinucleótidos que codifican un polipéptido F de virus Hendra, tales como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 6 y un polipéptido G del virus Hendra, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3.

[0046] En una realización, el polinucleótido de la presente invención incluye un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, o una variante de la misma. En otra realización, el polinucleótido de la presente invención incluye un polinucleótido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 95%, 96 %, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una de un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, o una variante de la misma.

[0047] Los polinucleótidos de la descripción incluyen secuencias que son degeneradas como resultado del código genético, por ejemplo, el uso de codones optimizados para un huésped específico. Tal como se usa en el presente documento, "optimizado" se refiere a un polinucleótido que se modifica mediante ingeniería genética para incrementar su expresión en una especie determinada. Para proporcionar polinucleótidos optimizados que codifican polipéptidos del virus Hendra, la secuencia de ADN del gen del virus Hendra se puede modificar para 1) comprender codones preferidos por genes altamente expresados en una especie particular; 2) comprender un contenido de A T o G C en la composición de bases de nucleótidos con el hallado sustancialmente en dicha especie; 3) formar una secuencia de iniciación de dicha especie; o 4) eliminar secuencias que causan la desestabilización, la poliadenilación inapropiada, la degradación y la terminación de ARN, o que forman horquillas de estructura secundaria o sitios de empalme de ARN. El aumento de la expresión de la proteína del virus Hendra en dicha especie se puede lograr mediante la utilización de la frecuencia de distribución del uso de codones en eucariotas y procariotas, o en una especie particular. El término "frecuencia de uso de codones preferida" se refiere a la preferencia exhibida por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido determinado. Hay 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales son especificados por más de un codón. Por lo tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas están incluidas en la descripción, siempre que la secuencia de aminoácidos del polipéptido del virus Hendra codificada por la secuencia de nucleótidos esté funcionalmente inalterada.

[0048] La identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos puede establecerse por el “blas” por parejas del NCBI (Centro Nacional de Información sobre Biotecnología) y la matriz BLOSUM62, utilizando los parámetros estándar (véase, por ejemplo, el algoritmo BLAST o BLASTX disponible en el servidor del "Centro Nacional de Información sobre Biotecnología" (NCBI, Bethesda, Md., EE.UU.), así como en Altschul et al.

[0049] La "identidad" con respecto a secuencias puede referirse al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias en las que la alineación de las dos secuencias puede determinarse según el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman), por ejemplo, usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos, y una penalización por hueco de 4, y el análisis asistido por ordenador y la interpretación de los datos de secuencia que incluye la alineación se pueden realizar convenientemente utilizando programas disponibles comercialmente (por ejemplo, Intelligenetics® Suite, Intelligenetics Inc. CA). Cuando las secuencias de ARN se dice que son similares o tienen un grado de identidad u homología de secuencia con secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN. Por lo tanto, las secuencias de ARN están dentro del alcance de la invención y pueden derivarse de secuencias de ADN, considerando la timidina (T) en la secuencia de ADN igual a uracilo (U) en las secuencias de ARN.

[0050] La identidad de secuencia o similitud de secuencia de dos secuencias de aminoácidos, o la identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar utilizando el paquete de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).

[0051] Los siguientes documentos proporcionan algoritmos para comparar la identidad u homología relativa de secuencias, y adicionalmente o alternativamente con respecto a lo anterior, las enseñanzas de estas referencias pueden utilizarse para determinar el porcentaje de homología o identidad: Needleman SB y Wunsch CD; Smith TF y Waterman MS; Smith TF, Waterman MS y Sadler JR; Feng DF y Dolittle RF; Higgins DG y Sharp PM; Thompson JD, Higgins DG y Gibson TJ; y, Devereux J, Haeberlie P y Smithies O. Y, sin demasiada experimentación, el experto puede consultar muchos otros programas o referencias para determinar el porcentaje de homología.

[0052] Las reacciones de hibridación se pueden realizar bajo condiciones de diferente "rigurosidad". Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son bien conocidos. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al, 1989).

[0053] La presente invención abarca el polinucleótido o polinucléotidos del virus Hendra contenido en una molécula de vector o un vector de expresión y unido operativamente a un elemento promotor y opcionalmente a un potenciador.

[0054] La presente invención abarca además una vacuna o composición que puede comprender uno o más vectores recombinantes mencionados anteriormente que comprenden uno o más polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos o antígenos del virus Hendra, un portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable. La presente invención se refiere además a una vacuna o composición que puede comprender uno o más vectores de expresión o recombinantes mencionados anteriormente y adicionalmente uno o más antígenos. El antígeno o antígenos adicionales puede ser un antígeno o antígenos del virus Nipah. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o parte de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunogénicas; una pieza o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmune tras la presentación a un animal huésped; un polipéptido, un epítopo, un hapteno, o cualquier combinación de los mismos.

[0055] Un "vector" se refiere a un ADN recombinante o plásmido de ARN o virus que comprende un polinucleótido heterólogo para liberarse a una célula diana, ya sea in vitro o in vivo. El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés para los fines de prevención o terapia, y opcionalmente puede estar en forma de un casete de expresión. Tal como se usa en este documento, un vector no necesita ser capaz de replicación en la última célula diana o sujeto. El término incluye vectores de clonación y vectores virales.

[0056] El término "recombinante" significa un polinucleótido de origen semisintético o sintético que, o bien no se produce en la naturaleza o está ligado a otro polinucleótido en una disposición no encontrada en la naturaleza.

[0057] "Heterólogo" significa derivado de una entidad genéticamente distinta del resto de la entidad a la que se está comparando. Por ejemplo, un polinucleótido puede colocarse mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una fuente diferente, y es un polinucleótido heterólogo. Un promotor eliminado de su secuencia codificante nativa y unido operativamente a una secuencia codificante distinta de la secuencia nativa es un promotor heterólogo.

[0058] Los polinucleótidos de la presente invención pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias adicionales de codificación dentro de la misma unidad de transcripción, elementos de control, tales como promotores, sitios de unión a ribosomas, 5'UTR, 3'UTR, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, unidades de transcripción adicionales bajo el control del mismo promotor o diferente, secuencias que permiten la clonación, expresión, recombinación homóloga y transformación de una célula huésped, y cualquier constructo, tal como pueda ser deseable para proporcionar realizaciones de esta invención.

[0059] Los elementos para la expresión de un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno del virus Hendra están presentes en un vector de la invención. De una manera mínima, éste comprende un codón de iniciación (ATG), un codón de terminación y un promotor, y opcionalmente también una secuencia de poliadenilación para ciertos vectores tales como vectores plásmidos y ciertos vectores virales, por ejemplo, vectores virales distintos del virus de los poxvirus. Cuando el polinucleótido codifica un fragmento de polipéptido, por ejemplo, un polipéptido de vrus Hendra, en el vector, un ATG se coloca en 5' del marco de lectura y un codón de parada se coloca en 3'. Pueden estar presentes otros elementos de control de la expresión, tales como secuencias potenciadoras, secuencias estabilizantes, tales como secuencias de intrones y secuencias señal que permiten la secreción de la proteína.

[0060] La presente invención también se refiere a composiciones o vacunas que comprenden los vectores. La composición o vacuna puede comprender uno o más vectores, por ejemplo, vectores de expresión, tales como vectores de expresión in vivo, que comprenden y expresan uno o más polipéptidos, antígenos, epítopos o inmunógenos del virus Hendra. En una realización, el vector contiene y expresa uno o más polinucleótidos que comprenden uno o más polinucleótidos que codifican y/o expresan uno o más antígenos, polipéptidos, epítopos o inmunógenos del virus Hendra, en un portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable.

[0061] De acuerdo con otra realización, el vector o vectores en la composición o vacuna comprenden, o consisten esencialmente en, o consisten en un polinucleótido o polinucleótidos que codifican una o más proteínas o fragmento o fragmentos de un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de virus Hendra. En otra realización, la composición o vacuna comprende uno, dos, o más vectores que comprenden polinucleótidos que codifican y expresan, ventajosamente, in vivo, un polipéptido, antígeno, proteína de fusión del virus Hendra o un epítopo del mismo. La invención también está dirigida a mezclas de vectores que comprenden polinucleótidos que codifican y expresan diferentes polipéptidos antígenos, epítopos, proteína de fusión o inmunógenos del virus Hendra, por ejemplo, un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno F y/o G del virus Hendra, de patógenos que causan enfermedad en diferentes especies, tales como, pero no limitado a, seres humanos, caballos, cerdos, vacas o ganado, perros y gatos.

[0062] En la presente invención se utiliza un vector viral recombinante para expresar una o más secuencias codificantes o fragmentos de las mismas que codifican uno o más polipéptidos del virus Hendra o fragmento o variante del mismo. Específicamente, el vector viral puede expresar una o más secuencias del virus Hendra, más específicamente uno o más genes del virus Hendra o fragmentos del mismo que codifican los polipéptidos F o G del virus Hendra. El vector viral contemplado en este documento incluye, pero no limitado a, virus de la viruela [por ejemplo, virus vaccinia o virus vaccinia atenuado, virus de la viruela aviar o virus de la viruela aviar atenuado (por ejemplo, viruela del canario, viruela aviar, viruela de tórtola, viruela de la paloma, viruela de codorniz, ALVAC, TROVAC; véase, por ejemplo, US 5,505,941, US 5,494,8070), virus de la viruela del mapache, virus de la viruela porcina, etc.], adenovirus (por ejemplo, adenovirus humano, adenovirus canino), virus del herpes (por ejemplo, virus del herpes canino,virus del herpes felino, virus del herpes bovino, virus del herpes de cerdo, virus del herpes equino), baculovirus, retrovirus, etc. En otra realización, el vector de expresión de la viruela aviar puede ser un vector de viruela del canario, tal como, ALVAC. En el presente documento se describe que el vector de expresión de la viruela aviar puede ser un vector de la viruela aviar, tal como, TROVAC. El polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno del virus Hendra, puede ser una proteína F o G del virus Hendra. El uno o más polinucleótidos que codifican el polipéptido F del virus Hendra o polipéptido G del virus Hendra, o ambas proteínas F y G, se insertan bajo el control de un promotor de virus de la viruela específico, por ejemplo, el promotor de vaccinia 7,5 kDa (Cochran et al., 1985), el promotor de vaccinia I3L (Riviere et al., 1992), el promotor de vaccinia HA (Shida, 1986), el promotor de la viruela vacuna ATI (Funahashi et al., 1988), el promotor de vaccinia H6 (Taylor et al, 1988b; Guo et al, 1989; Perkus et al, 1989), entre otros.

[0063] Según una realización adicional de la invención, el vector de expresión es un vector plásmido, en particular un vector de expresión in vivo. En un ejemplo específico, no limitativo, se pueden utilizar el plásmido pVR1020 o 1012 (VICAL Inc.; Luke et al, 1997; Hartikka et al, 1996, véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.846.946 y 6.451.769) como vector para la inserción de una secuencia de polinucleótidos. El plásmido pVR1020 se deriva de pVR1012 y contiene la secuencia de señal de tPA humano. En una realización, la señal de tPA humana comprende del aminoácido M (1) al aminoácido S (23) del número de acceso GenBank HUMTPA14. En otro ejemplo específico, no limitativo, el plásmido utilizado como vector para la inserción de una secuencia de polinucleótidos puede contener la secuencia de péptido señal de IGF1 equino del aminoácido M (24) al aminoácido A (48) del número de acceso GenBank U28070. Información adicional sobre plásmidos de ADN que pueden consultarse o emplearse en la práctica se encuentran, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos No.

6.852.705.; 6.818.628; 6.586.412; 6.576.243; 6.558.674; 6.464.984; 6.451.770; 6.376.473 y 6.221.362.

[0064] El término plásmido cubre cualquier unidad de transcripción de ADN que comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención y los elementos necesarios para su expresión in vivo en una célula o células del huésped o diana deseados; y, en este sentido, cabe indicar que un plásmido circular, superenrollado o no superenrollado, así como una forma lineal, se pretende que estén dentro del alcance de la invención.

[0065] Cada plásmido comprende o incluye o consiste esencialmente en, además del polinucleótido o polinucleótidos que codifican el polipéptido o polipéptidos, antígeno o antígenos, epítopos o inmunógenos del virus Hendra, opcionalmente fusionado con una secuencia de péptido heterólogo, variante, análogo o fragmento, unidos operativamente a un promotor o bajo el control de un promotor o dependientes de un promotor. En general, es ventajoso emplear un promotor fuerte funcional en células eucariotas. El promotor fuerte puede ser, pero no limitado a, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV-IE) de origen humano o murino, o que tiene opcionalmente otro origen, tal como la rata o cobaya.

[0066] En términos más generales, el promotor tiene un origen viral o un origen celular. Un promotor fuerte viral distinto del CMV-IE que puede emplearse útilmente en la práctica de la invención es el promotor temprano/tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Un promotor fuerte celular que puede emplearse útilmente en la práctica de la invención es el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como, por ejemplo, el promotor de desmina (Kwissa et al., 2000), o el promotor de actina (Miyazaki et al., 1989).

[0067] En cuanto a la señal de poliadenilación (poliA) para los plásmidos y vectores virales distintos de poxvirus, puede utilizarse la señal de poli (A) del gen de la hormona de crecimiento bovino (bGH) (véase el documento US 5.122.458), o la señal de poli (A) del gen de la p-globina de conejo o la señal de poli (A) del virus SV40.

[0068] Una "célula huésped" indica una célula procariota o eucariota que ha sido alterada genéticamente, o es capaz de ser alterada genéticamente mediante la administración de un polinucleótido exógeno, tal como un plásmido o vector recombinante. Cuando se hace referencia a células genéticamente modificadas, el término se refiere tanto a la célula originalmente alterada como a la progenie de la misma.

Procedimientos de uso y artículo de fabricación

[0069] En el presente documento se describen las siguientes realizaciones de procedimiento. Se describe en el presente documento un procedimiento de vacunación de un animal que comprende administrar la composición que comprende un vector que comprende uno o más polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos del virus Hendra o fragmentos o variantes de los mismos y un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, a un animal y ser humano. En un aspecto, el animal es un equino, un canino, un felino o un porcino.

[0070] También se describe en el presente documento un procedimiento de vacunación de un animal que comprende una composición que comprende uno o más vectores que comprenden uno o más polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos del virus Hendra y opcionalmente un portador, excipiente, vehículo, o adyuvante farmacéuticamente o veterinariamente aceptable, y opcionalmente una o más composiciones que comprenden antígenos adicionales.

[0071] En una realización de la invención, puede utilizarse un régimen de sensibilización-refuerzo, que se compone de al menos una administración primaria y al menos una administración de refuerzo usando al menos un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno común. La administración puede comprender una, dos, o más vacunas o composiciones que comprenden antígenos iguales o diferentes. Típicamente, la composición o composiciones inmunológicas o vacuna o vacunas utilizadas en la administración primaria son de naturaleza diferente de las utilizadas como refuerzo. Sin embargo, se observa que la misma composición o composiciones se pueden utilizar como administración primaria y administración de refuerzo. Este protocolo de administración se llama "sensibilización-refuerzo".

[0072] Un régimen de sensibilización-refuerzo comprende al menos una administración de sensibilización y al menos una administración de refuerzo usando al menos un polipéptido común y/o variantes o fragmentos del mismo. La vacuna utilizada en la administración de sensibilización puede ser de naturaleza diferente a la utilizada como vacuna de refuerzo posterior. La administración de sensibilización puede comprender una o más administraciones. Del mismo modo, la administración de refuerzo puede comprender una o más administraciones. La administración de sensibilización puede comprender uno o más antígenos y la administración de refuerzo puede comprender uno o más antígenos.

[0073] En un aspecto del protocolo o régimen de sensibilización-refuerzo de la invención, un protocolo de sensibilización-refuerzo puede comprender la administración de una composición que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa uno o más polipéptidos antígenos y/o variantes o fragmentos de los mismos del virus Hendra in vivo, seguido por la administración de uno o más polipéptidos o antígenos del virus Hendra recombinantes, o una composición o vacuna viral inactivada que comprende los polipéptidos o antígenos del virus Hendra, o una composición o vacuna basada en un plásmido de ADN que expresa uno o más polipéptidos o antígenos del virus Hendra. Del mismo modo, un protocolo de sensibilización-refuerzo puede comprender la administración de una composición que comprende uno o más antígenos del virus Hendra recombinantes, o una composición o vacuna viral inactivada que comprende los polipéptidos o antígenos del virus Hendra, o una composición o vacuna basada en un plásmido de ADN que expresa el polipéptido o antígeno del virus Hendra, seguido de la administración de un vector viral recombinante que contiene y expresa uno o más polipéptidos o antígenos del virus Hendra y/o variantes o fragmentos de los mismos in vivo. Se observa además que tanto la primaria como la administración secundaria puede comprender el vector viral recombinante que contiene y expresa uno o más polipéptidos del virus Hendra de la invención. Por lo tanto, el vector vira1Hendra recombinante de la invención puede administrarse en cualquier orden con uno o más antígenos del virus Hendra recombinante, una composición o vacuna viral inactivada que comprende los antígenos del virus Hendra, o una composición o vacuna basada en un plásmido de ADN que expresa uno o más antígenos del virus Hendra, o alternativamente se pueden usar solos como las composiciones primarias y secundarias.

[0074] El volumen de dosis de composiciones para especies diana que son mamíferos, por ejemplo, el volumen de dosis de composiciones de perro, basado en vectores virales, por ejemplo, composiciones basadas en vectores virales no poxvirus es generalmente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,0 ml, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0 ml, y de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 1,0 ml.

[0075] La eficacia de las vacunas puede probarse aproximadamente de 2 a 4 semanas después de la última inmunización mediante la estimulación de los animales, tales como caballos, gatos, perros, cerdos, o animales experimentales de laboratorio (tales como hurones y cobayas) con una cepa virulenta de la cepa del virus Hendra. Ambas cepas homólogas y heterólogas se utilizan para la estimulación para probar la eficacia de la vacuna. El animal puede ser estimulado por pulverización, por vía intranasal, por vía intraocular, por vía intratraqueal y/o por vía oral. La estimulación viral puede ser de aproximadamente 10^5-8 EID⁵⁰ en un volumen dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, si la administración es por pulverización, una suspensión de virus se pulveriza para generar gotas de aproximadamente 1 a 100 pm, si la administración es intranasal, intratraqueal u oral, el volumen del virus de estimulación es de aproximadamente 0,5 ml, 1-2 ml, y 5-10 ml, respectivamente. Los animales pueden ser observados diariamente durante 14 días después de la estimulación para detectar signos clínicos, por ejemplo, deshidratación y fiebre. Además, los grupos de animales pueden ser sometidos a eutanasia y se evaluar hallazgos patológicos de hemorragia pulmonar y pleural, traqueítis, bronquitis, bronquiolitis, bronconeumonía y los órganos internos. Se pueden recoger hisopos orofaríngeos de todos los animales después de la estimulación para aislar el virus. La presencia o ausencia de antígenos virales en los tejidos respiratorios puede evaluarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Las muestras de sangre pueden recogerse antes y después de la estimulación y pueden ser analizados por la presencia de anticuerpo específico del virus Hendra.

[0076] Las diversas administraciones se realizan preferiblemente con de 1 a 6 semanas de diferencia. El intervalo de tiempo preferido es de 3 a 5 semanas, y óptimamente 4 semanas. Según una realización, también se prevé un intervalo de refuerzo de seis meses o un intervalo de refuerzo anual. Los animales, por ejemplo, caballos, pueden tener al menos 4 semanas de vida en el momento de la primera administración.

[0077] Se debe entender por un experto en la técnica que la presente descripción se proporciona a modo de ejemplo y la presente invención no se limita a ello. A partir de la descripción de este documento y el conocimiento en la técnica, el experto en la materia puede determinar el número de administraciones, la vía de administración, y las dosis a utilizar para cada protocolo de inyección, sin gran experimentación.

[0078] La presente invención contempla al menos una administración a un animal de una cantidad eficaz de la composición terapéutica fabricada de acuerdo con la invención. El animal puede ser macho, hembra, hembra embarazada y recién nacido. Esta administración puede ser a través de diversas rutas que incluyen, pero no limitado a, intramuscular (IM), intradérmica (ID) o subcutánea (SC) o mediante administración intranasal o por vía oral. La composición terapéutica de acuerdo con la invención también se puede administrar mediante un aparato sin aguja (como, por ejemplo, con un aparato Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, GA, EE.UU.), Vetjet o Vitajet (Bioject, Oregon, EE.UU.)). Otro enfoque para la administración de composiciones de plásmido es usar electroporación (véase, por ejemplo Tollefsen et al, 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al, 2002; solicitud PCT No. WO99/01158). En otra realización, la composición terapéutica se administra al animal mediante pistola de genes o bombardeo de partículas de oro.

[0079] La composición o vacuna recombinante se puede administrar a un animal o infectarse o transfectarse en células en una cantidad de aproximadamente 1,0 log10 TCID50 (o CCID50) a aproximadamente 20,0 log10 TCID50 (o CCID50), de aproximadamente 1,0 log10 TCID50 (o CCID50) a aproximadamente 15,0 log10 TCID50 (o CCID50), de aproximadamente 2,0 log10 TCID50 (o CCID50) a aproximadamente 10,0 log10 TCID50 (o CCID50), o de aproximadamente 4,0 log10 TCID50 (o CCID50) a aproximadamente 8,0 log10 TCID50 (o CCID50).

[0080] En una realización, la invención proporciona la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación para el suministro y expresión de un antígeno o epítopo del virus Hendra en una célula diana. La determinación de la cantidad terapéuticamente eficaz es experimentación rutinaria para un experto en la técnica. En una realización, la formulación comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que expresa uno o más antígenos o epítopos del virus Hendra y un portador, vehículo, adyuvante o excipiente farmacéuticamente o veterinariamente aceptable.

[0081] Los portadores o vehículos o excipientes o adyuvantes farmacéutica o veterinariamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, un portador o vehículo o excipiente o adyuvante farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una solución de NaCl al 0,9% (por ejemplo, solución salina) o un tampón fosfato. Otro portador o vehículo o excipiente o adyuvante farmacéutica o veterinariamente aceptable que se puede utilizar para los procedimientos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, poli-(L-glutamato) o polivinilpirrolidona. El portador o vehículo o excipiente o adyuvante farmacéuticamente o veterinariamente aceptable puede ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que faciliten la administración del vector (o proteína expresada a partir de un vector de la invención in vitro) y la transfección o infección y/o mejoren la conservación del vector o proteína en un huésped. Las dosis y volúmenes de dosis se describen en el presente documento en la descripción general y también se pueden determinar por el experto en la materia a partir de esta descripción en relación con el conocimiento en la técnica, sin gran experimentación.

[0082] Los lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario que son ventajosamente, pero no exclusivamente, adecuados para plásmidos, son aquellos que tienen la siguiente fórmula:

en la que R1 es un radical alifático de cadena lineal saturado o insaturado que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático que contiene 2 o 3 átomos de carbono y X es un grupo amina o hidroxilo, por ejemplo, DMRIE. En otra realización, el lípido catiónico puede estar asociado con un lípido neutro, por ejemplo DOPE.

[0083] Entre estos lípidos catiónicos, se da preferencia a DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propano amonio; WO96/34109), ventajosamente asociado con un lípido neutro, ventajosamente DOPE (dioleoilfosfatidil-etanolamina; Behr, 1994), para formar DMRIE-DOPE.

[0084] Cuando DOPE está presente, la relación molar de DMRIE:DOPE es ventajosamente aproximadamente 95:aproximadamente 5 a aproximadamente 5:aproximadamente 95, más ventajosamente aproximadamente 1:aproximadamente 1, por ejemplo, 1:1.

[0085] En otra realización, el portador, excipiente o vehículo o adyuvante farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una emulsión de agua-en-aceite. Ejemplos de emulsiones de agua-en-aceite adecuados incluyen emulsiones de agua-en-aceite vacunales de base aecite que son estables y fluidas a 4°C que contienen: de 6 a 50% v/v de una fase acuosa que contiene el antígeno, preferiblemente de 12 a 25% v/v, de 50 a 94% v/v de una fase aceite que contiene en total o en parte un aceite no metabolizable (por ejemplo, aceite mineral, tal como aceite de parafina) y/o aceite metabolizable (por ejemplo, aceite vegetal, o ácido graso, un poliol o ésteres de alcohol), de 0,2 a 20% p/v de tensioactivos, preferiblemente de 3 a 8% p/v, estando el último en total o en parte, o en una mezcla, ya sea de ésteres de poliglicerol ésteres, siendo dichos ésteres de poliglicerol preferiblemente (poli)ricinoleatos de poliglicerol, o aceites de ricino polioxietilenados u otros aceites de ricino polioxietilenados hidrogenados. Ejemplos de tensioactivos que pueden usarse en una emulsión de agua-en-aceite incluyen ésteres de sorbitán etoxilados (por ejemplo, monooleato de sorbitán polioxietilenado (20) (TWEEN 80®), disponible de AppliChem, Inc., Cheshire, CT) y ésteres de sorbitán (por ejemplo, monooleato de sorbitán (SPAN 80®, disponible de Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Además, con respecto a una emulsión de agua-en-aceite, véase también el documento US 6.919.084. En algunas realizaciones, la fase acuosa que contiene antígeno comprende una solución salina que comprende uno o más agentes tamponantes. Un ejemplo de una solución tampón adecuada es solución salina tamponada con fosfato. En una realización, la emulsión de agua-en-aceite puede ser una emulsión triple agua/aceite/agua (W/O/W) (US 6.358.500). Ejemplos de otras emulsiones adecuadas se describen en US 7.371.395.

[0086] Las composiciones y vacunas inmunológicas según la invención puede comprender o consistir esencialmente en uno o más portadores, excipientes, vehículos o adyuvantes farmacéuticamente o veterinariamente aceptables. Los adyuvantes adecuados para uso en la práctica de la presente invención son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, anhídrido maleico y polímeros derivados con alquenilo, (2) secuencias inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen una o más unidades CpG no metiladas (Klinman et al, 1996;. WO98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como la emulsión SPT descrita en la página 147 de "Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach", publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 de la misma obra, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, por ejemplo, DDA (5) citoquinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7 ) saponina u (8) otros adyuvantes tratados en cualquier documento citado o (9) cualquier combinación o mezclas de los mismos.

[0087] La emulsión de aceite en agua (3), que es especialmente apropiada para vectores virales, puede basarse en: aceite de parafina líquido ligero (tipo farmacopea europea), aceite de isoprenoide, tal como escualano, escualeno, aceite resultante de la oligomerización de alquenos, por ejemplo, isobuteno o deceno, ésteres de ácidos o alcoholes que tienen un grupo alquilo de cadena lineal, tales como aceites vegetales, oleato de etilo, propilenglicol, di(caprilato/caprato), tri(caprilato/caprato) de glicerol y dioleato de propilenglicol, o ésteres de alcoholes grasos o ácidos ramificados, especialmente ésteres de ácido isoesteárico.

[0088] El aceite se utiliza en combinación con emulsionantes para formar una emulsión. Los emulsionantes pueden ser tensioactivos no iónicos, tales como: ésteres de, por una parte, sorbitán, manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), glicerol, poliglicerol o propilenglicol y, por otra parte, ácidos oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, estando dichos ésteres opcionalmente etoxilados, o bloques de copolímero de polioxipropilenopolioxietileno, tal como Pluronic, por ejemplo, L121.

[0089] Entre los polímeros adyuvantes de tipo (1), se da preferencia a polímeros de ácido acrílico o metacrílico reticulado, especialmente reticulado por polialquenil éteres de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos son conocidos bajo el nombre de carbómero (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, junio de 1996). Un experto en la técnica también puede hacer referencia a US 2909462, que proporciona tales polímeros acrílicos reticulados por un compuesto polihidroxílico que tiene al menos tres grupos hidroxilo, preferiblemente no más de ocho de tales grupos, estando los átomos de hidrógeno de al menos tres grupos hidroxilo sustituidos por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos dos átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados también pueden contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos vendidos bajo el nombre Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son especialmente adecuados. Se reticulan por alil sacarosa o por alilpentaeritritol. Entre ellos, se hace referencia a Carbopol 974P, 934P y 971P.

[0090] En cuanto a los copolímeros derivados de anhídrido maleico-alquenilo, se da preferencia a EMA (Monsanto), que son copolímeros de etileno-anhídrido maleico de cadena lineal o reticulados y están, por ejemplo, reticulados por divinil éter. .

[0091] Con respecto a la estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y EMA están formados preferentemente por unidades básicas que tienen la siguiente fórmula:

en la que:

- R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan H o CH3

- x = 0 o 1, preferiblemente x = 1

- y = 1 o 2, con x y = 2.

Para EMA, x = 0 e y = 2 y para carbómeros x = y = 1.

[0092] Estos polímeros son solubles en agua o solución salina fisiológica (20 g/1 NaCl) y el pH se puede ajustar a de 7,3 a 7,4, por ejemplo, mediante sosa (NaOH), para proporcionar la solución adyuvante en la que se puede incorporar el vector o vectores de expresión. La concentración de polímero en la composición inmunológica o de vacuna final puede oscilar entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1,5% p/v, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1% p/v, y de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,4% p/v.

[0093] La citoquina o citoquinas (5) pueden estar en forma de proteína en la composición inmunológica o de vacuna, o pueden coexpresarse en el huésped con el inmunógeno o inmunógenos o epítopo o epítopos de los mismos. Se da preferencia a la coexpresión de la citoquina o citoquinas, ya sea por el mismo vector que expresa el inmunógeno o inmunógenos o epítopo epítopos del mismo, o por un vector separado de la misma.

[0094] La invención comprende la preparación de tales composiciones de combinación; por ejemplo mezclando los componentes activos, de forma ventajosa entre sí y con un adyuvante, portador, citoquina, y/o diluyente.

[0095] Las citoquinas que se pueden usar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), interferón a (IFNa), interferón b (IFN-b), interferón g (IFN-g), interleuquina-1a (IL-1 a), interleuquina-1 b (IL-1 b), interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-3 (IL-3), interleuquina-4 (IL-4), interleuquina-5 (IL-5), interleuquina-6 (IL-6), interleuquina-7 (IL-7), interleuquina-8 (IL-8), interleuquina-9 (IL-9) , interleuquina-10 (IL-10), interleuquina-11 (IL-11), interleuquina-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral a (TNF-a), factor de necrosis tumoral b (TNF-b), y factor de crecimiento transformante b (TGF-b). Se entiende que las citoquinas se pueden coadministrar y/o administrar secuencialmente con la composición inmunológica o de vacuna de la presente invención. Así, por ejemplo, la vacuna de la presente invención puede también contener una molécula de ácido nucleico exógena que expresa in vivo una citoquina adecuada, por ejemplo, una citoquina emparejada a este huésped a vacunar o en el que debe provocarse una respuesta inmunológica (por ejemplo, una citoquina canina para las preparaciones a administrar a canino).

[0096] La invención se describirá a continuación adicionalmente a modo de los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS

[0097] Sin más elaboración, se cree que un experto en la técnica puede, usando las descripciones anteriores, poner en práctica la presente invención en su extensión más completa. Los ejemplos siguientes detallados se deben interpretar como meramente ilustrativos, y sin limitaciones de la descripción precedente en modo alguno. Los expertos en la técnica reconocerán rápidamente las variaciones apropiadas de los procedimientos en cuanto a los reactivos y a las condiciones y técnicas de reacción.

[0098] La construcción de insertos de ADN, plásmidos y vectores virales o vegetales recombinantes se llevó a cabo utilizando las técnicas estándar de biología molecular descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).

Ejemplo 1 Construcción del plásmido que contiene el gen G del virus Hendra - pC5 H6p, el plásmido p362-Hendra G [0099] El polipéptido G del virus Hendra sintético (SEQ ID NO: 2) optimizado para la expresión en Equus caballus se clonó en el vector pUC57 (GenScript Corporation, New Jersey, EE.UU.). El fragmento EcoRV/Kpnl que contiene el fragmento G del virus Hendra del vector pUC57 se clonó en pCXL-148-2 (material patentado por Merial Limited) que contiene el promotor H6 de vaccinia que da como resultado el plásmido p362-Hendra G (véase el mapa de plásmido de la figura 2).

Ejemplo 2 Construcción del plásmido que contiene el gen F del virus Hendra - pC5 H6p, el plásmido p362-Hendra F [0100] El polipéptido F del virus Hendra sintético (SEQ ID NO: 5) optimizado para la expresión en Equus caballus se clonó en el vector pUC57. El fragmento EcoRV/Kpnl que contiene el fragmento F del virus Hendra del vector pUC57 se clonó en pCXL-148-2 (material patentado por Merial Limited) que contiene el promotor H6 de vaccinia que da como resultado el plásmido p362-Hendra F (véase el mapa de plásmido de la figura 2).

Ejemplo 3 Generación y caracterización de ALVAC recombinante que contiene gen G del virus Hendra en loci C5 de ALVAC (vCP3004)

A. Generación de vCP3004

[0101] El RIV (recombinante in vitro) se realizó mediante transfección de células de fibroblastos de embriones de pollo primarias (1° CEF) con plásmido donante linealizado con Notl p362-Hendra G. Las células transfectadas se infectaron posteriormente con ALVAC parental como virus de rescate a MOI (multiplicidad de infección) de 10. Después de 24 horas, se recogieron las células transfectadas/infectadas, se sonicaron y se utilizaron para el cribado de virus recombinante. Las placas recombinantes se cribaron basándose en el procedimiento de hibridación por elevación de placa utilizando una sonda específica de G de Hendra que se marcó con peroxidasa de rábano picante de acuerdo con el protocolo del fabricante (GE Healthcare, Cat # RPN3001). Después de cuatro rondas secuenciales de purificación en placa, se generaron los recombinantes designados como vCP3004.1.1.1.1. y vCP3004.5.3.2.2 y se confirmó por hibridación como 100% positivo para el inserto G de Hendra y 100% negativo para el ORF C5.

B. Análisis genómico

[0102] Se extrajo ADN genómico de vCP3004.1.1.1.1 y se digirió con BamHI, HindIII y PstI, se separó por electroforesis en agarosa y después se transfirió a una membrana de nylon. Se realizó una transferencia Southern mediante el sondeo con una sonda de G de Hendra. Los cebadores usados para generar la sonda de G de Hendra son:

HenG.1F GGCTCTGACCGACAAAATCG (SEQ ID NO: 13)

HenG.1R GAACTGCAGGATGATGTCCC (SEQ ID NO: 14)

[0103] Se observaron 704 pb y 903 pb de bandas de digestión BamHI, 12293 pb de banda digestión HindIII, 614 pb, 309 pb y 94 pb de bandas de digestión PstI a los tamaños esperados, lo que indica la correcta inserción de G de Hendra en el locus C5 (véase la Figura 3).

C. Análisis de la expresión

[0104] Las células de CEF primarias se infectaron con vCP3004.1.1.1.1 a MOI de 10 y se incubaron a 37 °C durante 24 horas. A continuación, se recogieron las células y el sobrenadante de cultivo. Las proteínas de la muestra se separaron en un gel SDS-PAGE al 10%, se transfirieron a una membrana de PVDF. Un suero desarrollado en cobayas reaccionó fuertemente con la proteína G con un tamaño molecular aparente de aproximadamente 70 kDa. El resultado se muestra en la Figura 4.

D. Análisis de Secuencia

[0105] Se realizó un análisis más detallado del ADN genómico del conjunto de P3 mediante amplificación por PCR y el análisis de la secuencia de los brazos flanqueantes del locus C5 y el inserto G de Hendra. Se utilizaron los cebadores C5R.1F y C5L.2R situados en el extremo de los brazos del locus C5 en el plásmido donante para amplificar el fragmento completo C5R-Hendra G inserto-C5L.

C5R.1F ATTCTATCGGAAGATAGGATACCAG (SEQ ID NO: 15)

C5L.2R GGAGATACCTTTAGATATGGATCTG (SEQ ID NO: 16)

[0106] Los resultados mostraron que las secuencias del inserto de Hendra G y los brazos izquierdo y derecho C5 alrededor del inserto de G en vCP3004.1.1.1.1 eran correctas.

Ejemplo 4 Generación y caracterización de ALVAC recombinante que contiene gen F del virus Hendra en el loci C5 de ALVAC (vCP3005)

A. Generación de vCP3005

[0107] El RIV (recombinante in vitro) se realizó mediante transfección de células de fibroblastos de embriones de pollo primarias (1° CEF) con plásmido donante linealizado con Notl p362-Hendra F. Las células transfectadas se infectaron posteriormente con ALVAC parental como virus de rescate a MOI (multiplicidad de infección) de 10. Después de 24 horas, se recogieron las células transfectadas/infectadas, se sonicaron y se utilizaron para el cribado de virus recombinante. Las placas recombinantes se cribaron basándose en el procedimiento de hibridación por elevación de placa utilizando una sonda específica de F de Hendra que se marcó con peroxidasa de rábano picante de acuerdo con el protocolo del fabricante (GE Healthcare, Cat # RPN3001). Después de cuatro rondas secuenciales de purificación en placa, se generaron los recombinantes designados como vCP3005.3.4.1. y vCP3005.5.3.2 y se confirmó por hibridación como 100% positivo para el inserto F de Hendra y 100% negativo para el ORF C5.

B. Análisis genómico

[0108] Se extrajo ADN genómico de vCP3005.3.4.1 y se digirió con BamHI, HindIII y PstI, se separó por electroforesis en agarosa y después se transfirió a una membrana de nylon. Se realizó una transferencia Southern mediante el sondeo con una sonda de F de Hendra. Los cebadores usados para generar la sonda de F de Hendra son:

HenF.1F CCATCGAACTGTATAACAAT (SEQ ID NO: 17)

HenF.1R GGAGATGATGATGTTGCCCA (SEQ ID NO: 18)

[0109] Se observaron 704 pb y 903 pb de bandas de digestión BamHI, 12293 pb de banda digestión HindIII, 614 pb, 309 pb y 94 pb de bandas de digestión PstI a los tamaños esperados, lo que indica la correcta inserción de F de Hendra en el locus C5 (véase la Figura 5).

C. Análisis de la expresión

[0110] Las células CEF primarias se infectaron con vCP3005.3.4.1 a MOI de 10 y se incubaron a 37 °C durante 24 horas. A continuación, se recogieron las células y el sobrenadante de cultivo. Las proteínas de la muestra se separaron en un gel SDS-PAGE al 10%, se transfirieron a una membrana de PVDF. Cuando un suero desarrollado en cobayas se utilizó en la transferencia Western, se reconoció una banda apenas visible correspondiente a la proteína F⁰ no escindida a aproximadamente 60 kDa. El resultado se muestra en la Figura 6.

D. Análisis de Secuencia

[0111] Se realizó un análisis más detallado del ADN genómico del conjunto de P3 mediante amplificación por PCR y el análisis de la secuencia de los brazos flanqueantes del locus C5 y el inserto F de Hendra. Se utilizaron los cebadores C5R.1F (SEQ ID NO: 15) y C5L.2R (SEQ ID NO: 16) situados en el extremo de los brazos del locus C5 en el plásmido donante para amplificar el fragmento completo C5R-Hendra F inserto-C5L.

Ejemplo 5 Ensayo de Fusión

[0112] La co-infección simultánea de células HEK293 con el ALVAC-Hendra G (vCP3004) y ALVAC Hendra F (vCP3005) a una MOI de 10 10 dio como resultado la formación de sincitios, mientras que las infecciones individuales de los virus recombinantes ALVAC Hendra F (vCP3005) o ALVAC Hendra G (vCP3004) a una MOI de 20 no dio como resultado la formación de sincitios, lo que demuestra la funcionalidad de ambas proteínas (véase la Figura 7).

Ejemplo 6 Estudio de serología de caballos vacunados con ALVAC-Hendra F o G y ALVAC-Nipah F o G

[0113] Se construyeron vectores la viruela del canario (ALVAC) que contenían polinucleótidos (SEQ ID NO: 19 y 21) que codificaban la proteína de Nipah F (SEQ ID NO: 20) y la proteína de Nipah G (SEQ ID NO: 22), tal como se describe en la solicitud de patente de EE.u U. Estados Unidos 2007/0031455.

[0114] En este estudio, dos grupos de caballos fueron vacunados IM con la mezcla de vector vCP-Hendra G (vCP3004) y vector vCP-Nipah F (vector de ALVAC que contiene Nipah F) en D0 y D28. El grupo 1 recibió la mezcla de vectores en Carbomer a 5,8 log10 TCID50/dosis. El grupo 2 recibió la mezcla de vectores en Carbomer a 6,8 log10 TCID50/dosis. Los sueros se titularon para anticuerpos contra proteínas G y F de Hendra y proteínas G y F de Nipah en prueba de titulación de seroneutralización (SNT). Los sueros también se ensayaron en ensayos de bloqueo y unión de ELISA ue utilizaban anticuerpos contra la proteína G de Hendra y la proteína G de Nipah, respectivamente.

[0115] Las Figuras 8A-C muestran el ensayo de unión de ELISA y ensayo de bloqueo usando anticuerpos contra la proteína G de Hendra, y la prueba de SNT contra proteínas G y F de Hendra. Las figuras 9A-C muestran el ensayo de unión y el ensayo de bloqueo utilizando anticuerpos contra la proteína G de Nipah G, y la prueba de SNT contra las proteínas G y F de Nipah.

[0116] Los resultados mostraron que la vacunación de los caballos con vector vCP-Hendra G y vector vCP-Nipah F indujo respuestas anti-Hendra y anti-Nipah incluso tan tarde como D70.

Ejemplo 8 Estudio clínico y de Serología de caballos y canarios vacunados

[0117] Las vacunas de caballos y canarios utilizando vCP3004 (ALVAC-Hendra G) vCP3005 (ALVAC-Hendra F), vCP3004 (ALVAC-Hendra G) solo y vCP3005 (ALVAC-Hendra f) solo se realizaron en el Día 0, Día 28 y D183. Se recogieron hisopos de sangre, orina, nasal/oral/rectal y ocular y se probaron para la evaluación de propagación/diseminación. El diseño del experimento con vCP3004 (ALVAC-Hendra G) vCP3005 (ALVAC-Hendra F) se muestra en la Tabla 1 a continuación.

Tabla 1 Vacunación con vCP3 04 ALVAC-Hendra G vCP3005 ALVAC-Hendra F ensa o clínico en caballos

[0118] El resultado clínico demostró que las vacunas son seguras para ambos grupos. No hay ninguna diferencia entre los grupos 1 y 2. Los datos de biodifusibilidad mostraron que ningún virus se detectó en ninguna de las muestras.

[0119] La Figura 10A muestra el ensayo la neutralización del virus (VN) contra Hendra. Ambos grupos se mostraron por encima del umbral de protección teórico (título 64) desde D70 en adelante hasta D155. Después de la tercera inyección en D183, ambos grupos mostraron un efecto de refuerzo claro.

[0120] La Figura 10B muestra la prueba de VN contra Nipah. Los resultados mostraron una buena reactividad cruzada contra Nipah. La mayoría de los caballos se mostraron por encima del umbral de protección (título 60) después de la tercera inyección en D183, y algunos caballos mostraron alguna protección incluso después de la segunda inyección en D28.

[0121] El diseño del experimento con vCP3004 (ALVAC-Hendra G) se muestra en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2 Vacunación con vCP3004 (ALVAC-Hendra G) y prueba clínica en canarios

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Composición para usar en un procedimiento de vacunación de un animal, comprendiendo dicha composición un vector de expresión, en la que el vector comprende un primer polinucleótido que codifica un polipéptido G del virus Hendra y un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido F del virus Hendra, en la que dicho vector es un vector de viruela del canario; además en la que el polipéptido G del virus Hendra es la SEQ ID NO: 3 y el polipéptido F del virus Hendra es la SEQ ID NO: 6, comprendiendo dicha composición además un portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable.

2. Composición para usar en un procedimiento de vacunación de un animal, comprendiendo dicha composición dos o más vectores de expresión, en la que la composición comprende un primer vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido G del virus Hendra y un segundo vector de expresión que comprende una polinucleótido que codifica un polipéptido F del virus Hendra, en la que dichos vectores son vectores de la viruela del canario; además en la que el polipéptido G del virus Hendra es la SEQ ID NO: 3 y el polipéptido F del virus Hendra es la SEQ ID NO: 6, comprendiendo dicha composición además un portador, excipiente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable.

3. Composición para usar, según la reivindicación 1 o 2, en la que dicho adyuvante es un carbómero.

4. Composición para usar, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además uno o más antígenos adicionales.

5. Composición para usar, según la reivindicación 4, en la que el uno o más antígenos adicionales son antígenos de Nipah.

6. Composición para usar, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el polinucleótido que codifica un polipéptido G del virus Hendra tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 1 o 2, y el polinucleótido que codifica un polipéptido F del virus Hendra tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 4, o 5.

7. Composición para usar, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho animal es un equino, en la que dicho procedimiento comprende un régimen de administración de sensibilización-refuerzo.