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ES2633932B1 - Uso de un complejo GNP-LLO91-99 para el tratamiento y la prevención del cáncer. - Google Patents

Uso de un complejo GNP-LLO91-99 para el tratamiento y la prevención del cáncer. Download PDF

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ES2633932B1
ES2633932B1 ES201600160A ES201600160A ES2633932B1 ES 2633932 B1 ES2633932 B1 ES 2633932B1 ES 201600160 A ES201600160 A ES 201600160A ES 201600160 A ES201600160 A ES 201600160A ES 2633932 B1 ES2633932 B1 ES 2633932B1
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Ricardo CALDERÓN GONZÁLEZ
Elisabet FRANDE CABANES
Eva FERRÁNDEZ FERNÁNDEZ
Sonsoles YÁÑEZ DIAZ
Soledad PENADÉS ULLATE
Marco MARRADI
Isabel GARCÍA MARTÍN
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Servicio Cantabro de Salud
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Servicio Cantabro de Salud
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Abstract

Uso de un complejo GNP-LLO{sub,91-99} para el tratamiento y la prevención del cáncer.#La presente invención se refiere al uso de un complejo GNP-LLO{sub,91-99} para proporcionar respuestas inmunitarias para el tratamiento o profilaxis del cáncer.

Description

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“Uso de un complejo GNP-LLOq^m para el tratamiento v la prevention del
cancer”
DESCRIPCION
La presente invention se refiere al uso de un complejo GNP-LLO91-99 para proporcionar respuestas inmunitarias para el tratamiento o profilaxis del cancer.
ESTADO DE LA TECNICA
La capacidad natural del sistema inmunitario para detectar y destruir celulas anormales podria prevenir la formation de muchos tipos de cancer. No obstante, algunos canceres logran evitar ser detectados y destruidos por el sistema inmunitario, debido a la production de senales que reducen la capacidad del sistema inmunitario de detectar y destruir las celulas tumorales, 0 es posible que tengan modificaciones que hagan mas dificil que el sistema inmunitario los reconozca y los ataque.
En este sentido, las inmunoterapias son tratamientos que restauran o intensifican la capacidad del sistema inmunitario para combatir el cancer. En apenas pocos anos, el rapido avance de la disciplina de inmunologia del cancer ha producido varios metodos nuevos para tratarlo que aumentan la potencia de las respuestas inmunitarias contra los tumores. Estas terapias estimulan las actividades de componentes especificos del sistema inmunitario o contrarrestan las senales producidas por las celulas cancerosas que suprimen las respuestas inmunitarias.
Particularmente, las denominadas vacunas para el tratamiento del cancer o vacunas terapeuticas, estan disehadas con el fin de tratar canceres ya existentes mediante el fortalecimiento de las defensas naturales del organismo para combatir el cancer. Las vacunas para el tratamiento pueden actuar de varias maneras:
• demorar o detener el crecimiento de las celulas cancerosas;
• causar la reduction del tumor;
• prevenir que el cancer vuelva a formarse; o
• eliminar las celulas cancerosas que no han sido destruidas con otras formas de tratamiento.
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La formulacion de vacunas de tratamiento contra e! cancer eficaces requiere un conocimiento detallado de como interactuan las celulas del sistema inmunitario y las celulas cancerosas. Para ser eficaces, las vacunas de tratamiento contra el cancer deben estimular respuestas inmunitarias especificas dirigidas al bianco correcto. Las respuestas inmunitarias tambien deben tener la potencia suficiente para traspasar las barreras que usan las celulas cancerosas para protegerse de los ataques de las celulas B y las celulas T citollticas.
Por otro lado, la atencion de las nanoparticulas de oro (AuNPs) ha crecido recientemente, sobre todo en cuanto a sus aplicaciones en biomedicina, como el tratamiento del cancer y la inmunizacion por nano-vacunas. El interes para este tipo de nanoparticulas viene dado por su capacidad para penetrar los vasos sangutneos y las barreras de tejido y para ser dirigido a una celula especifica por medio de moleculas funcionalizadas especificamente (Cristina Popescu, R. et al. Current topics in medicinal chemistry, 2015, 15(15), 1532-1542.)
Recientemente, se han descrito gluconanoparticulas de oro (Au-GNP) cargadas con el peptido procedente Listeria monocytogenes listeriolisina O (LL091_99) con el objetivo de obtener una vacuna eficaz contra el patogeno humano de Listeria monocytogenes (Listeria). Adicionalmente, con el objetivo de mejorar la inmunogenicidad de la vacuna se hizo uso de un nuevo adyuvante Advax™, un polisacarido de origen vegetal natural que cuando se cristaliza en la forma polimorfica delta, se vuelve inmunologicamente activo (Rodriguez-Del Rio E. et al. Vaccine, 2015, 33, 1465-1473).
DESCRIPCION DE LA INVENCION
El objeto de la invencion es proporcionar una vacuna eficaz en el tratamiento y/o prevencion del cancer. Las vacunas terapeuticas de la presente invencion estan constituidas por nanoparticulas de oro que comprenden el peptido LL091.99. Estas nanoparticulas (GNP-LL091.99) logran una regresion tumoral significativa de un 90%, y evitan en mas de un 95% la formacibn de metastasis en los pulmones.
Se probaron varias terapias frente a melanoma murino con el fin de aportar datos comparativos que demuestran el efecto tecnico mejorado de la vacuna de la invencion frente a otras terapias antitumorales descritas con anterioridad.
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En este sentido, se han empleado distintos peptidos de Listeria monocytogenes, entre los que se encuentran el peptido 91-99 de la listeriolisina O (LLO91-99) y el peptido 1-22 de la gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH1.22), nanoparticulas (nanoparti'culas de oro sintetizadas con distintos peptidos de Listeria monocytogenes), o bien celulas dendriticas cargadas con un peptido de Listeria monocytogenes LL091_ 99)-
De esta manera, se ha encontrado que las nanoparticulas de oro por si solas no logran ningun efecto terapeutico sobre el melanoma. Tampoco el peptido LL091.99s6lo como terapia. Sin embargo, este peptido sintetizado en las nanoparticulas (GNP- LL09i-99) si logran una regreston tumoral significativa (Figura 1) y tambien evitan en la formacion de metastasis en los pulmones (Figura 2).
Por otro lado, este efecto terapeutico es especifico del peptido LL091.99 de la listeriolisina O de Listeria monocytogenes, porque otras nanoparticulas sintetizadas por conjugacion a otro peptido de otro factor de virulencia de Listeria monocytogenes como el peptido GAPDFI^, la gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa, no presenta esta actividad terapeutica frente al melanoma
Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invencion se refiere al uso de una nanoparticula que comprende un nucleo de atomos de oro al que se unen covalentemente al menos:
a. un primer ligando que comprende un peptido 91-99 de la listeriolisina O procedente de Listeria monocytogenes; y
b. un segundo ligando que comprende un grupo de hidratos de carbono, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento y/o prevencion del cancer.
En la presente invencion, el peptido LL091.99 es el epitopo restringido-FI2-Kd de listeriolisina O (LLO), y consta de los aminoacidos 91 a 99 (H-Gly-Tyr-Lys-Asp-Gly- Asn-Glu-Tyr-lle-OH).
En una realizacion preferida, los hidratos de carbono del segundo ligando se seleccionan de la lista que comprende N-acetilglucosamina (GIcNAc), glucosa, manosa, xilosa, o fructosa. En una realizacion mas preferida, este segundo ligando comprende glucosa.
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En otra realization preferida, las particulas pueden tener un numero medio de ligandos totales unidos al nucleo metalico de oro de al menos un ligando tipo peptido y un de ligando tipo hidrato de carbono, en total dos ligandos. Mas preferiblemente de 20 ligandos, mas preferiblemente de 50 ligandos, mas preferiblemente de 60 ligandos y, aun mas preferiblemente, de 70 ligandos (Rojo et al., ChemBiochem 2004, 5, 291297). En este sentido, el ratio glucosa: peptido puede estar comprendido entre 8:1 y 10:1 y mas preferentemente entre 9:1.
Este ratio glucosa/peptido de la nanoparticula de la invention se determina cuantitativamente a traves de espectros de RMN 1H de las soluciones de las nanoparticulas a 500 MHz para identificar senales inequivocamente pertenecientes a los componentes individuales de cada ligando confirmando que la intensidad de estas senales se corresponde con las previstas segun la proportion de los diferentes ligandos en la solution original.
En una realization preferida, las poblaciones de nanoparticulas pueden tener densidades diferentes de los ligandos unidos al nucleo.
En otra realization preferida, las nanoparticulas de oro cargadas con el peptido LLOgi. 9g presentan un tamano nanometrico, lo que permite su captation por las celulas y, por tanto, la presentation del antigeno en la superficie celular.
Preferiblemente, estas nanoparticulas tienen nucleos de oro con diametros medios de entre 1,5 y 2,5 nm, y mas preferiblemente de entre 1,8 y 2,0 nm (Rodriguez-Del Rio E. et al. Vaccine, 2015, 33, 1465-1473) (Figura 4). El diametro medio de los nucleos de oro puede medirse usando tecnicas bien conocidas en la materia como un microscopio electronico de transmision. Cuando se considera, ademas del nucleo de oro el ligando carbohidrato (gluconanoparticula, GNP), el diametro medio total de las particulas es de entre 4,5 y 5,5 nm, y finalmente el tamano de la nanoparticula al incorporar el ligando peptidico (GNP-LL09i.9g)aumenta el diametro medio entre 8 y 10 nm.
De esta manera, en una realization preferida, el tamano de la nanoparticula de la invention, que consiste en una gluconanoparticula de oro cargada con el peptido LLOg-i.gg (GNP-LL091.99), se encuentra en el rango de entre 12,5 y 15,5 nm.
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En otra realizacion preferida, las nanoparticulas de la invencion son solubles en agua. Esto puede usarse en su purification y, de manera importante, significa que pueden usarse en solution para presentar el ligando inmovilizado sobre la superficie de la particula. El hecho de que las nanoparticulas sean solubles tiene la ventaja de que los ligandos se presentan en una conformation natural. Para las aplicaciones terapeuticas, las nanoparticulas no son toxicas, son solubles y estables en condiciones fisiologicas.
En otra realizacion preferida, la nanoparticula tambien puede comprender un marcador, como un grupo fluorescente o fluoroforo, un radionucleido, un marcador magnetico, un colorante, un atomo activo en RMN o un atomo que es capaz de detectarse usando resonancia de plasmon superficial. Entre los marcadores magneticos preferidos se incluyen los grupos paramagneticos que comprenden Mn+2, Gd+3, Eu+2, Cu+2, V*2, Co+2, Ni+2, Fe+2, Fe+3 o lantanidos*3. Entre los atomos activos en RMN preferidos se incluyen Mn+2, Gd+3, Eu+2, Cu+2, V2, Co+2, Ni+2, Fe+2, Fe+3 o lantcinidos+3.
Se entiende por "fluoroforo" cualquier compuesto que puede emitir una serial luminosa o coloreada tras su excitation. Ejemplos de fluoroforos son, aunque sin limitamos: fluoresceina, rodamina, cumarina, cianina, y sus derivados, GFP, YFP y RFP, Oregon verde, eosina, rojo Texas, derivados de naftaleno, derivados de la cumarina, derivados de oxadiazol, derivados de pireno, derivados de oxacina (como rojo Nilo o azul Nilo), derivados de acridina, derivados de tetrapirrol, Alexa Fluor, DyLight Fluor, CY5, TAMRA, JOE o biotina.
Las nanoparticulas de la invencion se prepararon segun metodologia sintetica ya conocida en el estado de la tecnica (Rodriguez-Del Rio, E. et al. Vaccine, 2015, 33(12), 1465-1473), segun el cual se emplean nucleos que comprenden un atomo de oro en que se emplean ligandos derivatizados con enlazadores disulfuro que reaccionan con HAuCI4 (acido tetracloraurico), en presencia de agente reductor para producir las nanoparticulas (Ejemplo 1).
En una realizacion particular, se disefio una nanoparticula cargada con el peptido 9199 de la listeriolisina O (LL091.99) para la vacunacion profilactica y/o terapeutica frente a melanoma.
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En una realizacion preferida, la presente invencion se refiere al uso de las nanoparticulas de la invencion, segun se describen anteriormente, para la fabricacidn de un medicamento para el tratamiento y/o prevencion de melanoma.
En otra realizacion preferida, ese medicamento es una vacuna terapeutica y/ profilactica.
En la presente invencion, el termino “vacunacion” incluye una immunization activa, es decir, una induction de una respuesta inmunitaria especifica debido a la administracion, p. ej. por las vias subcutanea, intradermica, intramuscular, oral o nasal, de pequenas cantidades del peptido que es reconocido por el individuo vacunado como extrano y es, por tanto, inmunogenico en una formulation adecuada.
En otra realizacion preferida, las nanoparticulas de la invencion pueden unirse a un tercer tipo de ligando que consiste en un adyuvante, o bien este adyuvante puede formar parte de una composition farmaceutica junto con las nanoparticulas tal y como se han descrito anteriormente.
En la presente invencion, el termino "adyuvante" se refiere a un agente, mientras no posea un efecto antigenico por si mismo, que puede estimular el sistema inmune incrementando su respuesta a la vacuna. Por ejemplo, peptidos o hidratos de carbono estimuladores de c^lulas T colaboradoras que estimulan la red inmunitaria innata. Cuando se usan adyuvantes adicionales, la invencion permite el uso de un unico vehiculo de administracion para administrar tanto el antigeno como los adyuvantes, o multiples antigenos o adyuvantes.
En otra realizacion preferida, las nanoparticulas descritas en este documento pueden formularse en composiciones farmaceuticas utiles en el tratamiento y/ prevencion del cancer, preferiblemente de melanoma.
Las pautas de administracion de estas composiciones farmaceuticas incluyen las vias enteral o parenteral. La administracion parenteral incluye la administracion por las siguientes vias: intravenosa, cutanea o subcutanea, nasal, intramuscular, intraocular, transepitelial, intra peritonea I y topica (incluyendo dermico, ocular, rectal, nasal, inhalation y aerosol) y vias sistemicas rectales. Mas preferiblemente, las nanoparticulas de la invencion o las composiciones farmaceuticas que las
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comprenden se administran por via intravenosa, cutanea, subcutanea, o intraperitoneal.
En otra realizacion preferida, las composiciones farmaceuticas pueden estar en las formas de composiciones solidas o liquidas. Estas composiciones comprenden generalmente un vehicuio de determinado tipo, por ejemplo, un vehiculo solido como gelatina o un adyuvante o un diluyente inerte, o un vehiculo liquido como agua, petroleo, aceites animates o vegetates, aceite mineral o aceite sintetico. Puede incluirse solucion salina fisiologica, o giicoles como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglico. Estas composiciones y preparaciones generalmente contienen al menos el 0, 1% en peso del compuesto.
Para inyeccion intravenosa, cutanea o subcutanea, o inyeccion en el lugar de la dolencia, el principio activo estara en forma de una solucion acuosa aceptable por via parenteral que no contenga pirogenos y tenga el pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la materia estan bien capacitados para preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, soluciones de los compuestos o un derivado de los mismos, p. ej., en solucion salina fisiologica, una dispersion preparada con glicerol, polietilenglicol liquido o aceites.
Ademas de las nanoparticulas de la invention, las composiciones farmaceuticas pueden comprender uno o mas de entre un excipiente, vehiculo, tampon, estabilizador, agente isotonizante, conservante o antioxidante, u otros materiales farmaceuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la materia. Estos materiales deberan ser no ser toxicos y no interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza precisa del vehiculo u otro material puede depender de la via de administration.
Las composiciones farmaceuticas liquidas se formulan tipicamente para que tengan un pH de entre aproximadamente 3,0 y 9,0; mas preferiblemente entre aproximadamente 4,5 y 8,5 y, aun mas preferiblemente, entre aproximadamente 5,0 y 8,0. El pH de una composition puede mantenerse mediante el uso de un tampon como acetato, citrato, fosfato, succinato, Tris o histidina, empleando tipicamente en el intervalo de aproximadamente 1 mM a 50 mM. El pH de las composiciones puede ajustarse por otro lado usando acidos o bases fisiologicamente aceptables.
Generalmente, los conservantes se incluyen en las composiciones farmaceuticas para retrasar el crecimiento microbiano, extendiendo la vida de las composiciones y permitiendo el uso multiple de la presentacion. Entre los ejemplos de conservantes se incluyen fenol, metacresol, alcohol de bencilo, acido para-hidroxibenzoico y sus 5 esteres, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetronio. Tipicamente, los conservantes se emplean en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 1,0% (p/v).
Preferiblemente, las composiciones farmaceuticas se administran a un individuo en 10 una cantidad profilacticamente eficaz o una cantidad terapeuticamente efectiva (segun sea el caso, prevencion o tratamiento), siendo esto suficiente para que se muestre un beneficio para ei individuo.
En el sentido utilizado en esta description, la expresion “cantidad terapeuticamente 15 efectiva” se refiere a aquella cantidad del componente de la composition farmaceutica que cuando se administra a un mamifero, con preferencia un humano, es suficiente para producir la prevencion y/o el tratamiento, tal como se define mas adelante, de una enfermedad o condicion patologica de interes en el mamifero, con preferencia un humano. La cantidad terapeuticamente efectiva variara, por ejemplo, segun la edad, el 20 peso corporal, el estado general de salud, el sexo y la dieta del paciente; el modo y el tiempo de administration; la velocidad de excretion, la combination de farmacos; la gravedad del trastorno o la condicion patologica particulares; y el sujeto sometido a terapia, pero puede ser determinada por un especialista en la tecnica segun su propio conocimiento.
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El termino “excipiente” hace referenda a una sustancia que ayuda a la absorcion de cualquiera de los componentes del producto de la invention, estabiliza dichos componentes o ayuda a la preparation de la composicion farmaceutica en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan mas agradable. Asi pues, los 30 excipientes podrian tener la funcion de mantener los componentes unidos como por ejemplo almidones, azucares o celulosas, funcion de endulzar, funcion de colorante, funcion de protection del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, funcion de relleno de una pastilla, capsula o cualquier otra forma de presentacion como por ejemplo e! fosfato de calcio dibasico, funcion desintegradora 35 para facilitar la disolucion de los componentes y su absorcion en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este parrafo. Por tanto, el termino
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“excipiente” se define como aquella materia que, incluida en las formas galenicas, se anade a los principios activos o a sus asociaciones para posibilitar su preparacion y estabilidad, modificar sus propiedades organolepticas o determinar las propiedades fisico-quimicas de la composicion farmaceutica y su biodisponibilidad. El excipiente “farmaceuticamente aceptable” debe permitir la actividad de los compuestos de la composicion farmaceutica, es decir, que sea compatible con dichos componentes. Ejemplos de excipientes son aglutinantes, rellenos, desintegradores, lubricantes, recubridores, endulzantes, saborizantes y colorizantes. Ejemplos mas concretos no limitantes de excipientes aceptables son almidones, azucares, xilitol, sorbitol, fosfato de calcio, grasas esteroides, talco, silice o glicerina entre otros.
La “forma galenica o forma farmaceutica” es la disposition a que se adaptan los principios activos y excipientes para constituir un medicamento. Se define por la combination de la forma en la que la composicion farmaceutica es presentada por el fabricante y la forma en la que es administrada.
Un “vehlculo” o portador es preferiblemente una sustancia inerte. La funcion del vehiculo es facilitar la incorporation de otros compuestos, permitir una mejor dosificacion y administracion o dar consistencia y forma a la composicion farmaceutica. Por tanto, e! vehiculo es una sustancia que se emplea para diluir cualquiera de los componentes de la composicion farmaceutica de la presente invencion hasta un volumen o peso determinado; o bien que aun sin diluir dichos componentes es capaz de permitir una mejor dosificacion y administracion o dar consistencia y forma al medicamento. Es vehiculo es farmaceuticamente aceptable. Cuando la forma de presentacion es liquida, el vehiculo farmaceuticamente aceptable es el diluyente.
En cada caso la forma de presentacion del medicamento se adaptara al tipo de administracion utilizada, por ello, la composicion de la presente invencion se puede presentar bajo la forma de soluciones o cualquier otra forma de administracion clinicamente permitida y en una cantidad terapeuticamente efectiva. La composicion farmaceutica de la invencion se puede formular en formas solidas, semisolidas, liquidas o gaseosas, tales como comprimido, capsula, polvo, granulo, unguento, solucion, supositorio, inyectable, inhalante, gel, jarabe, nebulizador, microesfera o aerosol, preferiblemente en forma de comprimido, capsula, polvo, granulo, solucion, supositorio o jarabe.
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Las composiciones anteriormente mencionadas pueden ser preparadas usando metodos convencionales, como los descritos en las Farmacopeas de diferentes paises y en otros textos de referenda.
En una realizadon preferida, la composidon farmaceutica de la invendon puede comprender otra sustancia activa. Ademas del requerimiento de la eficacia terapeutica, donde dicha composidon farmaceutica puede necesitar el uso de otros agentes terapeuticos, pueden existir razones fundamentales adicionales que obligan o recomiendan en gran medida el uso de una combinacion de un compuesto de la invendon y otro agente terapeutico. El termino “principio activo” es toda materia, cualquiera que sea su origen, humano, animal, vegetal, quimico o de otro tipo, a la que se atribuye una actividad apropiada para constituir un medicamento.
En otra realizadon preferida, las nanoparticulas de invendon, o las composiciones farmaceuticas que las comprendan, pueden ser empleados junto con otros medicamentos en terapias combinadas. Los otros farmacos pueden formar parte de la misma composidon o de otra composidon diferente, para su administracion al mismo tiempo o en tiempos diferentes.
En una realizadon preferida, las composiciones de la invendon se administran preferiblemente a pacientes a una dosis comprendida de entre 0,25 mg y 5,0 mg de principio activo por kg de peso corporal y dia, y mas preferiblemente, de entre 0,5 mg y 2,5 mg/kg/dia.
Adicionalmente, las nanoparticulas de la invendon descritas pueden ser utilizados solas o en combinacion con las terapias actuates para el tratamiento del cancer, como ejemplo: cirugia, radiacion, quimioterapia. Igualmente, las GNP-LLO91.99 descritas administrados profilacticamente conllevan a una rapida respuesta inmune innata contra el tumor, con un subsiguiente desarrollo de una respuesta inmune adaptativa antigeno especifica, enfatizando su uso en vacunas profilacticas o terapeuticas contra cancer.
El termino "cancer", tal y como se utiliza en la presente descripcion, se refiere a la enfermedad neoplasica en la cual las celulas, de morfologia anormal, presentan un crecimiento descontrolado llegando a generar un tumor. Ejemplos de cancer incluyen,
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pero sin limitarse, cancer de higado o hepatocarcinoma, de prostata, de pulmon, pancreatico, de colon, de mama, canceres ginecoldgicos, como el de ovario, utero, cervix, vagina o vulva, cancer de piel, como el melanoma, cancer de esofago, cancer gastrico, cancer de vejiga, cancer del tracto urinario, cancer tiroideo, cancer renal, cancer de cerebro, sarcoma, linfoma o leucemia,
El termino "melanoma", segun se usa en la presente invencion, se refiere a cualquier tumor resultante de la proliferacion de melanocitos que aparecen de forma predominante en la piel pero tambien en el ojo o en el intestino e incluye, sin limitation, melanomas, melanomas metastaticos, melanocarcinomas, melanoepiteiiomas, melanosarcomas, melanoma in situ, melanoma que se extiende superficialmente, melanoma modular, melanoma lentigo maligno, melanoma lentiginoso acral, melanoma invasivo, lunar atipico familiar y sindrome melanoma. Preferiblemente melanoma cutaneo, melanoma in situ, melanoma que se extiende superficialmente, melanoma incasico y melanoma metastasico.
A lo largo de la descripcion y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Efecto comparative de distintas terapias frente al melanoma murino tras el establecimiento del tumor durante 7 dias de forma subcutanea en la zona ventral izquierda y posterior inoculation en el tumor con diferentes terapias durante 5 dias (1A). Tras estos tratamientos, se sacrificaron los ratones y recuperaron los tumores, midiendose su tarnaho con un calibre (1B).
FIG. 2. Metastasis en pulmon del melanoma murino. Tras ei tratamiento con diferentes terapias, se sacrificaron los ratones y se extrajeron los pulmones, que se lavan con PBS. Se contaron los nddulos tumorales bajo una lupa que se observan como puntos negros en los pulmones.
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FIG. 3. Esquema general de la GNP-LL091,99sintetizada (3A). Estructura quimica de la nanoparticula con el nucieo de oro y los dos ligandos, la p-D-glucosa y el peptido LL091.99 (3B).
FIG. 4. Imagen de microscopla de transmision electronica (100,000 x aumento) (4A). Histograma del tamano nanometrico del nucieo de oro de las GNP-LLOgi-9g (4B).
FIG. 5. Efecto comparative de distintas terapias en neonatos frente al melanoma murino tras el establecimiento del tumor durante 5 dias de forma subcutanea a ratones hembras de 9 dlas de edad de la cepa Balb/c y posterior inoculacion en el tumor con diferentes terapias durante 5 dias. Tras estos tratamientos, se sacrificaron los ratones y recuperaron los tumores, midiendose su tamano con un calibre.
EJEMPLOS
A continuacion se ilustrara la invencion mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invencion.
Ejemplo 1. Preparation de las nanoparticulas de oro sintetizadas con peotidos LLQch. QQfGNP-LLOai.oa') o GAPDHi-9? (GNP-GAPDHi.^1
Los peptidos LL091_99 y GAPDH^ con una cisteamida C-terminal, LL091. 99C(0)NHCH2CH2SH o GAPDHi.22C(0)NHCH2CH2SH (1 mg, 0,85 pmol, pureza 95%) se adquieren comercialmente de GenScript y junto con el 5-(mercapto)pentyl-a-D- glucopiranosido GlcC5SH (2,1 mg, 7,4 pmol) se disuelven en agua deuterada (750 pL). El analisis 1H NMR de la mezcla muestra un ratio Glc:LL09i_99 ~ 9:1 (e.g. 90% de Glc respecto a 10% de LL09i_99 o GAPDH1.22). Estas soluciones preparadas de los ligandos (0.011 M, 4 equivalencias) se anaden a una solucion acuosa de HAuCI4 (100 pL, 0,025 M, 1 equivalencia) seguido de una solucion acuosa de NaBH4 (67,5 pL, 1 M, 27 equivalencias) en cuatro porciones bajo una agitacion rapida {“foaming"). La dispersion oscura se agita por 2h y se filtra mediante membranas de 3 KDa MWCO mediante centrifugation de filtration. El coloide negro se recupera con agua y se liofiliza (0,482 mg). El residuo se redispersa en un volumen minimo de agua, cargada con una membrana de dialisis SnakeSkin (Pierce, 10KDa MWCO) y se dializa frente a 3 L de agua con agitacion suave y se recarga con agua fresca dializada cada 8 horas
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por un total de 72 horas. Tras liofilizacion, se obtienen 0.456 mg de GNP-LL091..9g (Figura 3) o de GNP-GAPDH^.
El ratio glucosa/peptido en la GNP se determina cuantitativamente por NMR (qNMR) en un espectrometro Bruker AVANCE 500 MHz: 0.456 mg de GNP-LL091.99 y de GNP- GAPDH^ se dispersan en D20 99,9% (200 pL). 80 pL de estas soluciones se anaden a 40 pL de 0,05% de solucion sal sodica del acido 3-(trimetilsilil)propi6nico- 2,2,3,3-d4 (TSP-d4) en D20 y 60 pL de D20. El analisis 1H-NMR de la mezcla permite el calculo de la cantidad de peptido en las GNP-GAPDH^ y GNP-LL09i_99: 8,9 pg (LLO91.99)/0,182 mg (nanoparticula) UVA/is (Beckman Coulter DU 800 espectrometro, H20, 0,1 mg/mL). Una banda tipica de plasmon superficial se observa a 520 nm. TEM (JEOL JEM-21 OOF funcionando a 200 kV): una unica gota (5 pL) de la dispersion acuosa (ca. 0,1 mg ml/1 en MilliQ water) de las GNPs se coloca en una rejilla de cobre cubierta con una pelicula de carbono ultrafina (Electron Microscopy Sciences). La rejilla se deja secar al aire durante 12 horas a temperatura ambiente.
Eiemplo 2. Estudio comparative de reduccion del tamano del tumor entre la terapia de la invention v terapias antitumorales conocidas
Para el estudio de la reduccion del tamano del tumor haciendo uso de diferentes terapias y su comparacion con la de la invencion, se inocularon de forma subcutanea 1 x 106 celulas del melanoma murino B16F10 en el flanco izquierdo ventral de ratones hembras de 8-12 semanas de edad de la cepa C57BL/6.
Tras 7 dias post-inoculacion, se inocularon en los tumores 50 pg/ml de las siguientes terapias durante 5 dias: LL091.99 (peptido solo de la listeriolisina O de Listeria monocytogenes, LL091.99), GNP (gluconanoparticulas vacias), GNP-LL091.99 (gluconanoparticulas sintetizadas con el peptido de la listeriolisina O de Listeria monocytogenes, LL09-|.99), GNP-GAPDH-i^nanoparticulas sintetizadas con el peptido de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Listeria monocytogenes, GAPDH^) o ninguna particula (NT). Tambien se incluyeron, como control, un vector utilizado anteriormente en terapia, celulas dendriticas cargadas con el peptido LL091_99 (1 x106 DC-LLOgi.gg).
Tras este tratamiento, se sacrificaron los ratones y recuperaron los tumores, midiendose su tamano con un calibre. Los resultados se muestran en la Figura 1.
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Conclusiones:
• Las nanoparticulas de oro de 10 nm por si mismas no logran ningun efecto terapeutico sobre el melanoma, tal y como se habla descrito previamente (ChemBioChem 2004, 5, 291-297)\
• El peptido LLO91.99S0I0 no logro ningun efecto terapeutico sobre el melanoma;
• El peptido LLOgi.gg sintetizado en las nanoparticulas, GNP-LL09i-9g, si logran una regresion tumoral significativa de un 90% (Figura 1);
• Otras nanoparticulas sintetizadas por conjugation a otro peptido de otro factor de virulencia de Listeria monocytogenes como el peptido GAPDI-L.22 la gliceraldehido- 3-fosfato-deshidrogenasa no presenta esta actividad terapeutica frente al melanoma.
Eiemplo 3. Estudio comparative de inhibition de metastasis entre la terapia de la
invencion v terapias antitumorales conocidas
Para el estudio de metastasis en pulmon del melanoma murino tras el uso de diferentes terapias y su comparacion con la de la invencion, se inocularon de forma subcutanea 1x10® celulas del melanoma murino B16F10 igual que en la Figura 1. Tras 7 dlas post-inoculacion, se inocularon en los tumores 50 pg/ml de las siguientes partlculas terapeuticas durante 5 dlas: GNP (gluconanopartlculas vaclas), GNP~LL091. 99 (gluconanopartlculas sintetizadas con el peptido de la listeriolisina O de Listeria monocytogenes, LL091.99), GNP'GAPDH^ (nanoparticulas sintetizadas con el peptido de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Listeria monocytogenes, GAPDH,^) o ninguna partlcula (NT). Tambien se incluyeron como control el vector utilizado anteriormente en terapia que consiste en celulas dendrlticas cargadas con el peptido LL09i.99 (1 x106 dc-llo91.99).
Tras este tratamiento, se sacrificaron los ratones y se extrajeron los pulmones, que se lavaron con PBS. Posteriormente, se contaron los nodulos tumorales bajo una lupa que se observan como puntos negros en los pulmones.
La Figura 2 muestra que peptido LL091_9g sintetizado en las nanoparticulas, GNP- LLOg-j-gg, evita en mas de un 95% la formacion de metastasis en los pulmones.
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Eiemplo 4.- Estudio comparative) de reduccion del tamano del tumor en neonatos entre la terapia de invencion v terapias anti-tumorales conocidas.
Para el estudio de la reduccion del tamano del tumor en neonatos haciendo uso de diferentes terapias y su comparacion con la de la invencion, se inocularon de forma subcutanea 5 x 105 celulas del melanoma murino B16F10 en la zona intra-escapular de ratones hembras de 9 dias de edad de la cepa Balb/c.
Tras 5 dias post-inoculacion, se inocularon en los tumores 50 pg/ml de las siguientes terapias durante 5 dias: LLOgvgg (peptido solo de la listeriolisina O de Listeria monocytogenes, LL091_99), GNP (gluconanopartlculas vaclas), GNP-LL091.g9 (gluconanoparticulas sintetizadas con el peptido de la listeriolisina O de Listeria monocytogenes, LL09i_9g), GNP-GAPDFL.^ (nanoparticulas sintetizadas con el peptido de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Listeria monocytogenes, GAPDFL.22). Tambien se incluyeron, como control, un vector utilizado anteriormente en terapia, celulas dendriticas cargadas con el peptido LL091.99 (1 x105 DC-LL091_99).
Tras este tratamiento, se sacrificaron los ratones y recuperaron los tumores, midiendose su tamano con un calibre. Los resultados se muestran en la Figura 5.
Conclusiones:
• Las nanoparticulas de oro de 10 nm por si mismas no logran ningun efecto terapeutico sobre el melanoma, tampoco en neonatos de otra cepa de raton como Balb/c,
• El peptido LLOg-i.gg solo no logro ningun efecto terapeutico sobre el melanoma;
• El peptido LL091.99 sintetizado en las nanoparticulas, GNP-LL091.99, si logran una regresion tumoral significativa en neonatos de un 95% (Figura 5);
• Otras nanoparticulas sintetizadas por conjugation a otro peptido de otro factor de virulencia de Listeria monocytogenes como el peptido GAPDFl!.^ la gliceraldehido- 3-fosfato-deshidrogenasa no presentan esta actividad terapeutica en neonatos frente al melanoma.

Claims (9)

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    ES 2 633 932 A1
    REIVINDICACIONES
    1. Uso de un complejo GNP-LL091.99 que comprende un nucleo de atomos de oro al que se unen covalentemente al menos:
    a. un ligando que consiste en un peptido 91-99 de ia listeriolisina O procedente de Listeria monocytogenes; y
    b. un segundo ligando que consiste en un grupo de hidratos de carbono, para la fabrication de un medicamento para el tratamiento y/o prevention del cancer.
  2. 2. Uso segun la reivindicacion 1 donde el complejo GNP-LL091.99 comprende ligandos de glucosa.
  3. 3. Uso segun la reivindicacion 2 donde el complejo GNP-LL091.99 comprende ligandos de p-D-glucosa.
  4. 4. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el medicamento es una vacuna terapeutica y/o profilactica.
  5. 5. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el cancer es melanoma.
  6. 6. Uso segun las reivindicaciones 1 a 5, donde el complejo GNP-LL091_99 se administra en una dosis comprendida de entre 0,25 y 5,0 mg/kg/dia.
  7. 7. Uso segun la reivindicacion 6, donde el complejo GNP-LLOgi.99 se administra en una dosis comprendida de entre 0,5 y 2,5 mg/kg/dia.
  8. 8. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el complejo GNP- LL09i-99 se encuentra en una forma adecuada para su administracion por una via seleccionada de entre intravenosa, cutanea, subcutanea, nasal, intramuscular, intraocular, transepitelial, intraperitoneal, topica, y vias sistemicas rectales.
  9. 9. Uso segun la reivindicacion 8, donde la via de administracion se selecciona de entre intravenosa, cutanea, subcutanea, o intraperitoneal.
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