ES2620427T3 - Compuestos rodamina y su uso como marcadores fluorescentes - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de la fórmula (I) y mesómeros del mismo:**Fórmula** En el que M+/- es un contraión común, k es un entero desde 0 hasta 6, q es un entero desde 1 hasta 6, R1 es H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido, R2 es H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halógeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi- o alcoxi, o R2 junto con R1 o R5 es una cadena de carbonos o heterosustituida que forma un anillo, R3 es H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halógeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi- o alcoxi o R3 junto con R4 o R6 es una cadena de carbonos o heterosustituida que forma un anillo, R4 es H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido, R5 y R6 son H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halógeno, grupo hidroxi- o alcoxi, R8 es H, halógeno, grupo hidroxi- o alcoxi, grupo alquilo o alquilo sustituido o junto con R1 es un carbono o cadena de carbono heterosustituidos que forman un anillo, R9 es H, halógeno, grupo hidroxi- o alcoxi, grupo alquilo o alquilo sustituido o junto con R4 es un carbono o cadena de carbono heterosustituidos que forman un anillo, R7 es OR11 o NR11R12 en el que R11 y R12 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido, R13 es OR14 o NR14R15 en el que R14 y R15 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido; arilo o un arilo sustituido, y R16 y R17 son independientemente H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido.
Description
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DESCRIPCION
Compuestos rodamina y su uso como marcadores fluorescentes
La presente invencion se refiere a compuestos rodamina novedosos y su uso como marcadores fluorescentes. Los compuestos se pueden utilizar como marcadores fluorescentes, particularmente para marcar nucleotidos en aplicaciones de secuencias de acidos nucleicos.
Antecedentes
En esta solicitud hace referencia a diversas publicaciones y documentos de patentes con el fin de describir mas completamente el estado de la tecnica a la que pertenece esta invencion. La divulgacion de cada una de estas publicaciones y documentos se incorpora aqu por referencia.
La deteccion de acidos nucleicos no radiactivos que utilizan marcadores fluorescentes es una tecnologfa importante en la biologfa molecular. Muchos procedimientos empleados en la tecnologfa de ADN recombinante se basan en gran medida previamente en el uso de nucleotidos o polinucleotidos marcados radioactivamente con, por ejemplo 32P. Los compuestos radiactivos permiten la deteccion sensible de acidos nucleicos y otras moleculas de interes. Sin embargo, existen serias limitaciones en el uso de isotopos radioactivos como su costo, vida util limitada y mas importante, consideraciones de seguridad. Eliminar la necesidad de marcadores radioactivos mejora la seguridad mientras reduce el impacto ambiental y los costos asociados con, por ejemplo, desechos de reactivos. Metodos aceptables para la deteccion fluorescente no radiactiva incluyen, por via de ejemplos no limitantes, secuenciamiento de ADN automatizado, metodos de hibridacion, deteccion en tiempo real de productos de reaccion de cadena de polimerasa e inmunoensayos.
Para muchas aplicaciones es deseable emplear multiples marcadores fluorescentes distinguibles espectralmente con el fin de alcanzar deteccion independiente de una pluralidad de analitos que se sobreponen espacialmente. En dichos metodos multiples se puede reducir el numero de recipientes de reaccion simplificando protocolos experimentales y facilitando la produccion de kits de reactivos espedficos de aplicaciones. En el secuenciamiento de ADN automatizado multicolor, por ejemplo, la deteccion fluorescente multiple permite el analisis de multiples bases de nucleotidos en una unica lmea de electroforesis, aumentando por lo tanto el rendimiento sobre un color y reduciendo la incertidumbre asociada con las variaciones de movilidad electroforetica interlinea.
Sin embargo, la deteccion fluorescente multiple puede ser problematica y existe una serie de factores importantes que restringen la seleccion de marcadores fluorescentes. En primer lugar, es diffcil encontrar compuestos de tinte cuyo espectro de emision se resuelve espectralmente de forma adecuada. Adicionalmente, cuando se utilizan diversos tintes fluorescentes juntos, puede ser diffcil la excitacion simultanea debido a que las bandas de absorcion de los tintes frecuentemente se separan ampliamente. Muchos metodos de excitacion utilizan laseres de alta energfa y por lo tanto el tinte puede tener suficiente fotoestabilidad para soportar dicha excitacion laser. Una consideracion final de importancia particular en los metodos de biologfa molecular es que los tintes fluorescentes deben ser compatibles con la qrnmica de reactivos utilizados tal como por ejemplo reactivos y disolventes sintetica de ADN, reguladores, enzimas de polimerasa y enzimas ligasa.
A medida que avanza la tecnologfa de secuenciamiento se ha desarrollado la necesidad de compuestos de tintes fluorescentes, sus conjugados de acidos nucleicos y grupos de tintes que satisfagan todas las restricciones anteriores y que sean particularmente compatibles con los metodos moleculares de alto rendimiento tal como el secuenciamiento de fase solida y similares.
La solicitud WO2007135368 describe una clase de compuestos rodamina adecuados para uso como marcadores fluorescentes. Los compuestos descritos alff son adecuados para su uso en protocolos de secuenciamiento de acidos nucleicos de fase solida. Los avances en la tecnologfa y rendimiento de secuenciamiento de acidos nucleicos de fase solida han conducido a desarrollos y mejoras adicionales al diseno molecular de marcadores fluorescentes, particularmente en el contexto de la interaccion entre reactivos fluorescentes y secuencias de acidos nucleicos particulares.
La publicacion European Journal of Organic Chemistry 2002, (7), 1149-1162 describe compuestos rodaminas similares con un acido carboxflico y un amino sustituido como sustituyentes del anillo fenilo, que se utilizan como marcadores fluorescentes.
Las moleculas de tintes fluorescentes con propiedades fluorescentes mejoradas (tal como intensidad de fluorescencia, posicion de maxima de fluorescencia y forma de la banda de fluorescencia) pueden mejorar la velocidad y precision del secuenciamiento de acido nucleico. La intensidad de senal de fluorescencia es especialmente importante cuando se hacen mediciones en agua basadas en reguladores biologicos y/o a temperaturas de fluorescencia mayores de la mayona de tintes lo que es significativamente menor en dichas condiciones. Mas aun, la naturaleza de la base en la que se une un tinte tambien afecta la fluorescencia maxima, la intensidad de fluorescencia y otras propiedades espectrales del tinte. Las interacciones espedficas de secuencia entre el tinte fluorescente y la nucleobase se pueden adaptar mediante diseno espedfico de tintes fluorescentes. La optimizacion de la estructura de los tintes fluorescentes puede
mejorar sus propiedades fluorescentes y tambien mejorar la eficiencia de la incorporacion de nucleotidos, reducir el nivel de errores de secuenciamiento y reducir el uso de reactivos en, y por lo tanto los costos del secuenciamiento de acidos nucleicos.
5 Se describen aqu construcciones de rodamina mejoradas y su uso como marcadores de biomoleculas, particularmente como marcadores para nucleotidos utilizados en secuenciamiento de acidos nucleicos. Se pueden observar mejoras en mayores intensidades de fluorescencia de dichos tintes cuando se preparan como conjugados de biomoleculas y en la longitud y calidad de la lectura de secuenciamiento que se puede obtener utilizando las nuevas construcciones fluorescentes.
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Resumen
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De acuerdo con un primer aspecto la invencion proporciona compuestos tintes de rodamina de la formula (I) y mesomeros del mismo:
Los mesomeros de la invencion pueden incluir las formulas representadas por 1a, 1b o forma cfclica 1c:
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En las formulas I, la, Ib o Ic,
M+/- es un contraion comun, k es un entero desde 0 hasta 6, q es un entero desde 1 hasta 6,
Y = O, NR11,
R1 es H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido,
R2 es H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi- o alcoxi, o R2 junto con Ri o R5 es una cadena de carbonos o heterosustituida que forma un anillo,
R3 es H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi- o alcoxi o R3 junto con R4 o R6 es una cadena de carbonos o heterosustituida que forma un anillo,
R4 es H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido,
R5 y R6 son H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi,
R8 es H, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi, grupo alquilo o alquilo sustituido o junto con Ri es un carbono o cadena de carbono heterosustituidos que forman un anillo,
Rg es H, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi, grupo alquilo o alquilo sustituido o junto con R4 es un carbono o cadena de carbono heterosustituidos que forman un anillo,
R7 es OR11 o NR11R12 en el que R11 y R12 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido,
R13 es OR14 o NR14R15 en el que R14 y R15 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido; arilo o un arilo sustituido, y
Ri6 y R17 son independientemente H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido.
En otra realizacion los compuestos de la presente invencion se pueden conjugar con una variedad de grupos funcionales de sustrato tal como, por ejemplo, nucleosidos, nucleotidos, polinucleotidos, polipeptidos, carbohidratos, ligandos, partfculas y superficies.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invencion por lo tanto, se proporcionan compuestos tintes que comprenden grupos enlazadores para permitir, por ejemplo, union covalente a dichos grupos funcionales de sustrato.
De acuerdo con un aspecto adicional la invencion proporciona un compuesto de nucleosido o nucleotido definido por la formula: N-L-Dye, en la que N es un nucleotido, L es un grupo funcional enlazador opcional y Dye es un compuesto fluorescente de acuerdo con la presente invencion.
En un aspecto adicional la invencion incluye metodos de secuenciacion utilizando los compuestos tintes de la presente invencion.
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De acuerdo con un aspecto adicional la invencion tambien proporciona kits que comprenden compuestos tintes de la invencion (libres o en forma conjugada) que se pueden utilizar en diversos ensayos inmunologicos, marcado de oligonucleotidos y acidos nucleicos y para secuenciacion de ADN mediante smtesis. En aun otro aspecto la invencion proporciona kits que comprenden 'grupos' de tintes particularmente adecuados a ciclos de secuenciacion mediante smtesis sobre una plataforma de instrumentos automatizada.
Un aspecto adicional de la invencion es la preparacion qrnmica de compuestos de la invencion.
Descripcion de Figuras
La figura 1 muestra la menor reduccion de temperatura de los tintes como describe aqm en comparacion con los tintes de la tecnica anterior. Las intensidades de fluorescencia normalizadas de soluciones1.10-6M de tintes (I-1) y (I-3) se compararon con tintes comercialmente disponibles Atto532 para la misma region espectral a diferente temperatura. Se mide la intensidad de los tintes en 20, 40 y 60°C. La figura 1 muestra la intensidad relativa de los tintes en cada temperatura. Los tintes comerciales Atto532 muestran una mayor perdida de intensidad de fluorescencia a mayores temperaturas con relacion a los tintes I-1 e I-3.La figura 1 demuestra que la fluorescencia de los nuevos tintes en soluciones a base de agua es menos variable con la temperatura.
La figura 2 demuestra que la fluorescencia de conjugados de nucleobase basados en estos nuevos tintes en soluciones a base de agua es mayor que los tintes comercialmente disponibles cuando se excitan mediante luz a 532 nm. Se comparo el espectro de Fluorescencia Normalizado de 1.10-6 M de conjugados de tinte-nucleobases (1-13) -T y (I-11) -T con analogos estructurales cuando se conjuga pppT con el tinte Atto532 disponible comercialmente. El tinte I-3 es mas brillante que el Atto 532 en la misma concentracion de nucleotidos. El tinte I-1 se desplaza en rojo en comparacion con el tinte Atto532.
La figura 3 demuestra que la fluorescencia de nuevos tintes en soluciones a base de agua depende menos de la temperatura. Soluciones 1.10‘6M de Intensidades de Fluorescencia Normalizada de tintes cuando se conjuga con nucleobase, T-(I-11) y T-(I-13), cuando se comparan con tinte Atto532 disponible comercialmente conjugado con la mismo T-nucleobase. Tanto los tintes I-1 como I-3 muestran mayor intensidad de fluorescencia a temperaturas elevadas en comparacion con Atto-532.
La figura 4 demuestra mejor distincion senales de fluorescencia cuando se marca una nucleobase con un nuevo tinte de acuerdo con la invencion (I-3) (fila 6) en comparacion con fluoroforo estandar fijados cuando la misma nucleobase ha conjugado con el tinte Atto532 disponible comercialmente (control 1). La figura 4 muestra una grafica de intensidad rojo versus intensidad verde en una serie de secuenciamiento de 4 colores Illumina. La mayor distancia entre los grupos de tintes senala menores oportunidades de llamadas fallidas, y por lo tanto aumenta la precision del secuenciamiento. El aumento del brillo del tinte I-3 comparado con los tintes comerciales significa que se mejoran los datos de secuenciamiento.
Descripcion detallada
La invencion se relaciona con compuestos tintes de rodamina novedosos particularmente adecuados para metodos de deteccion de fluorescencia y secuenciacion mediante smtesis. De acuerdo con un primer aspecto la invencion proporciona compuestos tintes de rodamina de la formula (I):
en la que
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M+/- es un contraion comun, k es un entero desde 0 hasta 6, q es un entero desde 1 hasta 6,
Ri es H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido,
R2 es H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi- o alcoxi, o R2 junto con Ri o R5 es un carbono o cadena heterosustituida que forma un anillo,
R3 es H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi- o alcoxi o R3 junto con R4 o R6 es un carbono o cadena heterosustituida que forma un anillo,
R4 es H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido,
R5 y R6 son H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi,
R8 es H, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi, grupo alquilo o alquilo sustituido o junto con Ri es un carbono o cadena de carbono heterosustituidos que forman un anillo,
Rg es H, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi, grupo alquilo o alquilo sustituido o junto con R4 es un carbono o cadena de carbono heterosustituidos que forman un anillo,
R7 es OR11 o NR11R12 en el que R11 y R12 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido,
R13 es OR14 o NR14R15 en el que R14 y R15 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido; arilo o un arilo sustituido, y
Ri6 y R17 son independientemente H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido.
Ri6 y R17 puede ser independientemente H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido. El grupo alquilo se puede sustituir con SO3'. En el que Ri6 o R17 es un alquilo sustituido con SO3', el grupo SO3 se puede coordinar con un contraion, por ejemplo iones de metal o iones de amonio. Ri6 y R17 pueden ser H. Los compuestos de la invencion
M+/_ es un contraion comun, k es un entero desde 0 hasta 6, q es un entero desde 1 hasta 6,
Ri es H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido,
R2 es H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi- o alcoxi, o R2 junto con Ri o
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R3 es H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi- o alcoxi o R3 junto con R4 o R6 es un carbono o cadena heterosustituida que forma un anillo,
R4 es H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido,
R5 y R6 son H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi,
R8 es H, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi, grupo alquilo o alquilo sustituido o junto con R1 es un carbono o cadena de carbono heterosustituidos que forman un anillo,
Rg es H, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi, grupo alquilo o alquilo sustituido o junto con R4 es un carbono o cadena de carbono heterosustituidos que forman un anillo,
R7 es OR11 o NR11R12 en el que R11 y R12 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido, y
R13 es OR14 o NR14R15 en el que R14 y R15 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido; arilo o un arilo sustituido.
Cuando R16 y/o R17 es alquilo no sustituido -(CH2)nH o - (CH2)mH, n y m pueden ser 1 a 6. Los compuestos de la invencion por lo tanto incluyen compuestos de la formula (IIa):
en la que M' es un contraion comun,
k, n, y m son independientemente enteros desde 0 hasta 6,
q es un entero desde 1 hasta 6,
R1 es H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido,
R2 es H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi- o alcoxi, o R2 junto con R1 o R5 es una cadena de carbonos o heterosustituida que forma un anillo,
R3 es H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi- o alcoxi o R3 junto con R4 o R6 es una cadena de carbonos o heterosustituida que forma un anillo,
R4 es H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido,
R5 y R6 son H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi,
R8 es H, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi, grupo alquilo o alquilo sustituido o junto con R1 es un carbono o cadena de carbono heterosustituidos que forman un anillo,
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R7 es OR11 o NR11R12 en el que R11 y R12 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido, y
R13 es OR14 o NR14R15 en el que R14 y R15 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido; arilo o un arilo sustituido.
n y m pueden ser los mismos o diferentes. n puede ser 1, 2, 3, 4, 5 o 6. m puede ser 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El -(CH2) n-H o - CH2)m-H puede ser grupos alquilo C1-6, por ejemplo metilo, etilo o propilo, y se puede sustituir opcionalmente.
q puede ser 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Adicionalmente al enlazador (CH2)q, el enlazador puede contener sustituyentes en cualesquier atomos de carbono o heteroatomos adicionales. Por ejemplo el enlazador puede contener atomos de oxfgeno adicionales en la forma de separadores del tipo etilenglicol -(CH2CH2OV. El enlazador esta presente para unir la biomolecula a traves de residuo de COR13 en la forma de un grupo acido, ester o amida al resto de la construccion responsable para fluorescencia y para separar la biomolecula de la molecula de tinte.
R1 puede ser H o un grupo alquilo o alquilo sustituido. R1 se puede escoger de tal manera que R1 puede no ser H cuando n es cero. R1 puede ser metilo o etilo. R1, se puede unir a R2 y/o R8 para formar una estructura de anillo. El anillo puede tener un anillo de 5 o 6 miembros. El anillo puede tener un anillo todo de carbono, o puede contener heteroatomos adicionales.
R2 puede ser H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi- o alcoxi. Opcionalmente, R2 junto con R1 o R5 es una cadena de carbonos o heterosustituida que forma un anillo.
R3 puede ser H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi o alcoxi. Opcionalmente R3 junto con R4 o R6 es un carbono o cadena heterosustituida que forma un anillo.
R4 puede ser H o un grupo alquilo o alquilo sustituido. R4 no es H cuando m es cero. R4 puede ser metilo o etilo. R4 se puede unir a R3 y/o Rg para formar una estructura de anillo. El anillo puede ser un anillo de 5 o 6 miembros. El anillo puede ser un anillo todo de carbono en, o puede contener heteroatomos adicionales.
R5 y R6 puede ser H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, grupo hidroxi o alcoxi. Opcionalmente R5 se puede unir a R2, y R6 se puede unir a R3.
R8 puede ser H, halogeno, grupo hidroxi o alcoxi, grupo alquilo o alquilo sustituido. Opcionalmente R8 se puede unir junto con R1 para formar un carbono o cadena de carbono heterosustituidos que forman un anillo.
Rg puede ser H, halogeno, grupo hidroxi o alcoxi, grupo alquilo o alquilo sustituido. Opcionalmente R4 se puede unir junto con R4 para formar un carbono o cadena de carbono heterosustituidos que forman un anillo.
R7 junto con el C=O forma un grupo acido, ester o amida. En particular R7 puede ser OR11 o NR11R12 en el que R11 y R12 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido, arilo o un arilo sustituido. Cuando R11 y R12 son H R7 puede ser OH o NH2. R7 puede ser un grupo alcoxi o un grupo amina primario o secundario con uno o dos grupos alquilo y/o arilo. El ester o amida COR7 adicionalmente se puede sustituir.
R13 junto con el C=O forma un grupo acido, ester o amida. En particular R13 puede ser OR14 o NR14R15 en el que R14 y R15 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido. R13 puede ser OH o NH2. R13 puede ser un alcoxi o una amina primaria o secundaria con uno o dos grupos alquilo/arilo. El ester o amida adicionalmente se puede sustituir. R13 puede ser NR14R15 en el que R14 es H o alquilo y R15 es alquilo o un alquilo sustituido. La sustitucion puede permitir la conjugacion a biomoleculas. Las moleculas se pueden unir a fragmento estructural de nucleo de tinte de rodamina a traves de R13 para uso adicional.
Los compuestos de la invencion pueden incluir el compuesto en el que R16 y R17 son alquilo no sustituido -(CH2)nH y - (CH2)mH en el que n es 1 a 3, R1, R4, R5, R6, R8 y Rg todos son H, R2 y R3 son H o CH3. Dichos compuestos se muestran en la formula (III) adelante:
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en la que k, n, m son independientemente enteros desde 1 hasta 3, q es un entero desde 1 hasta 6,
R2 y R3 son independientemente H o CH3,
R7 es OR11 o NR11R12 en el que R11 y R12 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido, y
R13 es OR14 o NR14R15 en el que R14 y R15 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido; arilo o un arilo sustituido.
Los compuestos de la invencion pueden incluir el compuesto en el que R16 y R17 son H, R1 se une a R2 o R8 a traves de una cadena de grupos CH2 para formar un anillo, y R4 se une a R3 o Rg a traves de una cadena de grupos CH2 para formar un anillo.
Los compuestos de la invencion pueden incluir el compuesto en el que R16 y R17 son H, R1 se une a R2 a traves de una cadena de grupos CH2 para formar un anillo de 6 miembros, y R4 se une a R3 a traves de una cadena de grupos CH2 para formar un anillo de 6 miembros. Dichos compuestos se muestran en la formula (IV) adelante:
en la que k, n, m son independientemente enteros desde 1 hasta 3, en la que q es un entero desde 1 hasta 6,
R7 es OR11 o NR11R12 en el que R11 y R12 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido, y
R13 es OR14 o NR14R15 en el que R14 y R15 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido; arilo o un arilo sustituido.
Los tintes de la invencion pueden incluir los compuestos en los que cualquiera de R1, R4, R16 o R17 son H o alquilo. El alquilo se puede sustituir con SO3- compuestos de la invencion pueden incluir el compuesto en el que R1 y R4 son H y
R16 y/o R17 es SO3-.
El grupo Ri3CO-(CH2)q- se une al fragmento estructural de nucleo de tinte de rodamina a traves de un heteroatomo, por ejemplo un atomo de oxfgeno. Este heteroatomo, se puede unir a cualquiera de los atomos de carbono del anillo fenilo 5 del fragmento estructural de nucleo de tinte de rodamina. Los compuestos se pueden preparar y utilizar como mezclas de isomeros posicionales en las que el heteroatomo o atomo de oxfgeno esta presente en diferentes posiciones del anillo benceno, o los compuestos pueden preparados y usados como isomeros individuales: Opcionalmente el anillo benceno de tales nuevos colorantes de rodamina pueden contener sustituyentes adicionales para una sintonizacion adicional fina de sus parametros espectrales.
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Los compuestos de la invencion incluyen compuestos de acuerdo con la formula (Va) y (Vb), y mezclas de los mismos:
en la que M+/- es un contraion comun,
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k es un entero desde 0 hasta 6, q es un entero desde 1 hasta 6,
20 Ri es H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido,
R2 es H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi- o alcoxi, o R2 junto con Ri o R5 es una cadena de carbonos o heterosustituida que forma un anillo,
R3 es H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi- o alcoxi o R3 junto con R4 o R6
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R4 es H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido,
R5 y R6 son H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi,
R8 es H, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi, grupo alquilo o alquilo sustituido o junto con R1 es un carbono o cadena de carbono heterosustituidos que forman un anillo,
Rg es H, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi, grupo alquilo o alquilo sustituido o junto con R4 es un carbono o cadena de carbono heterosustituidos que forman un anillo,
R7 es OR11 o NR11R12 en el que R11 y R12 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido,
R13 es OR14 o NR14R15 en el que R14 y R15 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido; arilo o un arilo sustituido, y
R16 y R17 son independientemente H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido.
Los compuestos de la invencion se pueden unir a biomoleculas. Los compuestos de la invencion se pueden unir a oligonucleotidos. Los compuestos de la invencion se pueden unir a nucleotidos. Los compuestos se pueden unir a oligonucleotidos o nucleotidos a traves del nucleotido base.
La union a las biomoleculas puede ser a traves de un grupo de COR7 y/o R13CO(CH2)q-O- o a traves de ambos de estos. El grupo R7 y/o R13 ser un grupo alquil-, aril-, o heteril-oxi, amina primaria o secundaria con un grupo R15 sustituido, que se puede utilizar para union. En particular un grupo de COR7 y/o R13CO(CH2)q-O- puede ser el residuo de ester activado mas adecuado para formacion de enlace de amida/peptido adicional.
Por ejemplo, R7 y/o R13 pueden ser:
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en el que q es un entero desde 1 hasta 6,
R7 es OR11 o NR11R12 en el que R11 y R12 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido, y
R13 es OR14 o NR14R15 en el que R14 y R15 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido; arilo o un arilo sustituido.
Ejemplos adicionales incluyen
Un aspecto de la invencion es un nucleotido u oligonucleotido marcado con un compuesto fluorescente como se describe aqrn. El nucleotido u oligonucleotido marcado puede tener el marcador unido a traves de un grupo alquilo 15 sustituido R15. El nucleotido u oligonucleotido marcado puede tener el marcador unido a la posicion C5 de una base de
pirimidina o la posicion C7 de una base de 7-deaza purina a traves de un grupo funcional enlazador.
El nucleotido u oligonucleotido marcado tambien puede tener un grupo de bloqueo 3'OH unido covalentemente al azucar de ribosa o desoxirribosa del nucleotido.
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Se describen aqrn kits que comprenden dos o mas nucleotidos en los que por lo menos un nucleotido es un nucleotido marcado con un compuesto de la presente invencion. El kit puede comprender dos o mas nucleotido marcados. Los nucleotidos se pueden marcar con dos o mas marcadores fluorescentes. Dos o mas de los marcadores se pueden excitar utilizando una fuente de excitacion unica, que puede ser un laser.
El kit puede contener cuatro nucleotidos marcados, en los que el primero de cuatro nucleotidos se marca con un compuesto como se divulga aqrn, y el segundo, tercero, y cuarto nucleotidos cada uno se marca con un compuesto diferente, en el que cada compuesto tiene un maximo de absorbancia distinto y cada uno de los compuestos se puede distinguir de los otros tres compuestos. El kit puede ser de tal manera que dos o mas de los compuestos tienen un maximo de absorbancia distinto por encima de 600 nm.
Los compuestos de la invencion, nucleotidos o kits se pueden utilizar en secuenciacion, analisis de expresion, analisis de hibridacion, analisis genetico, analisis de ARN o ensayos de union de protema. El uso puede ser sobre un instrumento de secuenciacion automatizado. El instrumento de secuenciacion puede contener dos laseres que operan a diferentes longitudes de onda.
Se describe aqrn nuevos compuestos de la formula (Xa, b) como materiales de partida para smtesis de tintes de la formula (I) de acuerdo con la invencion.
en la que q es 1 a 6.
Se describe aqrn un metodo para sintetizar compuestos de la invencion. Un compuesto de la formula (Xa, b) se puede utilizar en una reaccion de condensacion con un derivado de 3-amino fenol sustituido o no sustituido o derivado heterodclico que contiene este fragmento estructural.
Se han sintetizado los tintes de la formula (I) mediante una condensacion de derivados de acido ftalico (Xa, b) con derivados de 3- amino-fenol, preferiblemente a alta temperatura, con o sin catalizadores de acido de Lewis. La reaccion tambien se puede cumplir al utilizar acido fosforico o acidos poli-fosforicos como solvente y/o un catalizador. Se puede lograr la reaccion de condensacion con o sin catalizadores en lfquidos ionicos. La reaccion de condensacion se puede lograr con o sin catalizadores en lfquidos ionicos o solventes organicos polares de alto punto de ebullicion como DMF, DMA, sulfolano o 1,2-diclorobenceno.
Como se utiliza aqrn, el termino “alquilo” se refiere a hidrocarburo C1-C20 y puede incluir anillos carbodclicos no aromaticos C3-C10. En realizaciones particulares los grupos alquilo son alquilo C1-C6 que se refiere a radicales hidrocarburo de cadena lineal o ramificada, saturado que contiene entre uno y seis atomos de carbono, respectivamente.
El termino “halogeno” como se utiliza aqrn se refiere a fluor (en lo sucesivo designado como F), cloro (en lo sucesivo designado como Cl), bromo (en lo sucesivo designado como Br) o yodo (en lo sucesivo designado como I), y usualmente se relaciona con la sustitucion de un atomo de hidrogeno en un compuesto organico, esta sustitucion es opcionalmente una sustitucion completa para el hidrogeno.
El termino “alquilo sustituido”, se refiere a grupos alquilo, alquenilo o alquinilo como se definio anteriormente en el que pueden estar opcionalmente sustituidos adicionalmente con, pero no limitado a, halo, ciano, SO3- SRa, ORa, NRbRc, oxo, CONRbRc, COOH y COORb. Ra, Rb y Rc se pueden seleccionar cada uno independientemente de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. Adicionalmente, dicho alquilo sustituido, alquenilo sustituido y alquinilo sustituido se puede interrumpir opcionalmente por lo menos mediante un heteroatomo o grupo seleccionado entre O, NRb, S(O)t, en el que t es 0 a 2, y similares. El alquilo sustituido tambien cubre grupos tal como bencilo donde los grupos alquilo comprenden un arilo adicional o un grupo funcional arilo sustituido.
Los tintes de acuerdo con la presente invencion se pueden sintetizar a partir de una variedad de diferentes materiales de partida, que derivados sustituidos de N y/o C de 3-aminofenol, 5-hidroxi- y/o 7-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroquinolina y
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otros materiales de partida aromaticos o heterodclicos similares que contienen fragmento estructural de m-aminofenol. La condensacion de estos compuestos con derivados de acido ftalico adicionalmente sustituidos o no sustituidos, formula Xa, b da los tintes como se describe. La reaccion de condensacion normalmente se lleva a cabo a alta temperature con o sin solvente adecuado, y es asistida por el uso de irradiacion de microondas. El uso de lfquidos ionicos como solvente en dichas reacciones de condensacion es especialmente ventajoso. La reaccion se puede catalizar por acidos de Lewis.
Se pueden sintetizar los tintes de acuerdo con la invencion tambien mediante metodos de alquilacion convencional a
k es un entero desde 0 hasta 6,
Ri es H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido,
R2 es H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi- o alcoxi, o R2 junto con Ri o R5 es una cadena de carbonos o heterosustituida que forma un anillo,
R3 es H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi- o alcoxi o R3 junto con R4 o R6 es una cadena de carbonos o heterosustituida que forma un anillo,
R4 es H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido,
R5 y R6 son H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi,
R8 es H, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi, grupo alquilo o alquilo sustituido o junto con Ri es un carbono o cadena de carbono heterosustituidos que forman un anillo,
Rg es H, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi, grupo alquilo o alquilo sustituido o junto con R4 es un carbono o cadena de carbono heterosustituidos que forman un anillo,
R7 es OR11 o NR11R12 en el que R11 y R12 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido, y
Ri6 y R17 son independientemente H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido.
Se pueden preparar tintes de formula (XI) mediante condensacion de derivados 3-aminofenol con derivados de acido hidroxilo-ftalico como se describe adelante.
Se puede llevar a cabo preparacion de N-alquil-5-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidro-quinolina o N-sulfonatoalquil-7-hidroxi- 1,2,3,4-tetrahidro-quinolina utilizando hidrogenacion qmmica o catalttica, por ejemplo utilizando Nfquel Raney como catalizador. La adicion de una base organica o inorganica, por ejemplo trietilamina, mejora en gran medida el mdice de reaccion.
Se puede llevar a cabo mono N-alquilacion de 3-aminofenoles con alquilsulfinatos utilizando un equivalente o mas del aminofenol. La di-alquilacion del 3-amino fenol se puede lograr utilizando mas equivalentes de alquilsufona. Ambos derivados fenolicos resultantes se pueden condensar con anhfdrido ftalico para hacer fluoroforos como se describe.
De acuerdo con un aspecto de la invencion, se proporcionan compuestos de tinte adecuados para union a grupos funcionales de sustratos, que comprenden particularmente grupos ligadores que permiten la adhesion a los grupos
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funcionales de sustratos. Los grupos funcionales de sustratos pueden ser virtualmente cualquier molecula o sustancia a la que se puede conjugar los tintes de la invencion y, por via de ejemplo no limitante, pueden incluir nucleosidos, nucleotidos, polinucleotidos, carbohidratos, ligandos, partfculas, superficies solidas, poKmeros organicos e inorganicos y combinaciones o ensambles de los mismos, tal como cromosomas, nucleos, celulas vivas y similares. Los tintes se pueden conjugar mediante un ligador opcional mediante una variedad de medios, que incluyen atraccion hidrofoba, atraccion ionica y union covalente. Particularmente los tintes se conjugan con el sustrato mediante adhesion covalente. Mas particularmente, la adhesion covalente se hace por medio de un grupo ligador.
Los tintes de acuerdo con la invencion pueden incluir un grupo ligador reactivo en una de las posiciones sustituyentes para union covalente del tinte a otra molecula. Los grupos ligadores reactivos son grupos funcionales capaces de formar un enlace covalente. En una realizacion particular, el ligador puede ser un ligador divisible. El uso del termino “ligador divisible” no significa que implica que se tenga que retirar el ligador completo. El sitio de division se puede ubicar en una posicion sobre el ligador que asegura que parte del ligador permanece unido al tinte y/o grupo funcional de sustrato despues de division. Los ligadores divisibles pueden ser, por via de ejemplo no limitante, ligadores que se pueden dividir electrofflicamente, ligadores que se pueden dividir nucleofilamente, ligadores fotodivisibles, divisible bajo condiciones de reduccion (por ejemplo ligadores que contienen azida o disulfuro), condiciones de oxidacion, divisible a traves del uso de ligadores de enganche de seguridad y divisibles mediante mecanismos de eliminacion. El uso de un ligador divisible para unir el compuesto de tinte a un grupo funcional de sustrato asegura que el marcador puede, si se requiere, ser retirado despues de deteccion, evitando cualquier serial de interferencia en etapas descendentes.
Grupos ligadores particulares se pueden encontrar en la solicitud de patente en tramite No WO2004/018493 (incorporada aqrn mediante referencia) en el que los presentes inventores han encontrado que determinador ligadores que conectan las bases de los nucleotidos a los marcadores tal como, por ejemplo, los tintes de acuerdo con la presente invencion, se pueden separar utilizando fosfinos solubles en agua o catalizadores de metales de transicion solubles en agua formados a partir de un metal de transicion y por lo menos ligandos parcialmente solubles en agua. En soluciones acuosas la ultima forma por lo menos parcialmente complejos de metales de transicion solubles en agua.
Se pueden encontrar ligadores particulares en las solicitantes internacionales en tramite WO2004/018493 (incorporada aqui mediante referencia) y puede comprender los grupos funcionales de la formula:
(En el que X se selecciona del grupo que comprende O, S, NH y NQ en el Q es un grupo alquilo C1-10 sustituido o no sustituido, Y se selecciona del grupo que comprende O, S, nH y N (alilo), T es hidrogeno o un grupo alquilo C1-10 sustituido o no sustituido y * indica en donde se conecta el grupo funcional al resto del nucleotido o nucleosido).
Aun mas particularmente los inventores han determinado en la solicitud de patente GB en tramite No 0517097.2, publicada como el documento WO07020457, que al alterar, y en particularmente aumentar la longitud del ligador entre un tinte fluorescente (fluoroforo) y la base guanina, al introducir un grupo separador polietilenglicol, es posible aumentar la intensidad de fluorescencia en comparacion con el mismo fluoroforo unido a la base guanina a traves de otros
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enlaces conocidos en la tecnica. El diseno de los ligadores, y especialmente su aumento de longitud, tambien permite mejoras en el brillo de los fluoroforos unidos a bases guanina de nucleotidos guanosina cuando se incorpora en polinucleotidos tales como ADN. De esta manera, cuando el tinte es para uso en cualquier metodo de analisis que requiere deteccion de una etiqueta de tinte fluorescente unida a un nucleotido que contiene guanina, es ventajoso si el ligador comprende un grupo separador de la formula -((CH2)2O)n - en el que n es un entero entre 2 y 50, como se describe en las solicitudes en tramite No GB0517097.2 (WO07020457).
La presente invencion proporciona adicionalmente conjugados de nucleosidos y nucleotidos marcados con tintes de acuerdo con la invencion (nucleotidos modificados). Los nucleotidos y nucleosidos marcados son utiles para marcar polinucleotidos formados mediante smtesis enzimatica, tal como, por via de ejemplo no limitante, en amplificacion PCR, amplificacion isotermica o amplificacion de fase solida, secuenciamiento de polinucleotidos que incluyen secuenciamiento de fase solida, reacciones de traduccion de muesca y similares.
Los nucleosidos y nucleotidos se pueden marcar en sitios en azucar o nucleobase. Como se conoce en la tecnica, un “nucleotido” consiste de una base nitrogenada, un azucar, y uno o mas grupos fosfato. En ARN el azucar es ribosa y en ADN es una desoxirribosa, es decir, un azucar que carece de un grupo hidroxilo que esta presente en la ribosa. La base nitrogenada es un derivado de purina o pirimidina. Las purinas son adenina (A) y guanina (G), y las pirimidinas son citosina (C) y timina (T) o en el contexto del ARN, uracilo (U). El atomo C-1 de desoxirribosa se une a N-1 de una pirimidina o N-9 de una purina. Tambien es posible un nucleotido un fosfato ester de un nucleosido, con esterificacion que ocurre en el grupo hidroxilo unido al C-3 o C-5 del azucar. Los nucleotidos son mono, di o trifosfato usualmente.
Un “nucleosido” es estructuralmente similar al nucleotido, pero carece de los grupos funcional fosfato. Un ejemplo de un analogo nucleosido sena uno en el que el marcador se liga a la base y no hay un grupo fosfato unido a la molecula de azucar.
Aunque la base se denomina usualmente como una purina o pirimidina, el experto apreciara que estan disponibles derivados y analogos que no alteran la capacidad del nucleotido o nucleosido para experimentar el emparejamiento base Watson-Crick. “Derivado” o “analogo” significa un compuesto o molecula cuya estructura central es la misma que, o se asemeja cercanamente a aquella de un compuesto pariente, pero que tiene una modificacion ffsica o qmmica, tal como, por ejemplo, un grupo colateral adicional o diferente, que permite que el derivado nucleotido o nucleosido se ligue a otra molecula. Por ejemplo, la base puede ser una desazapurina. Los derivados deben ser capaces de experimentar un emparejamiento Watson-Crick. El “derivado” y “analogo” tambien significa un nucleotido o nucleosido sintetico derivado que tiene grupos funcionales base modificados y/o grupos funcionales de azucar modificados. Dichos derivados y analogos se discuten en, por ejemplo, Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) and Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Los analogos de nucleotidos tambien pueden comprender enlaces fosfodiester modificados que incluyen fosforotioato, fosforoditioato, alquil-fosfonato, fosforanilidato, fosforamidato y similares.
El tinte se puede unir a cualquier posicion en la base de nucleotido, a traves de un ligador, siempre que se lleve a cabo el emparejamiento base Watson-Crick. Los sitios de marcado de nucleobase particulares incluyen la posicion C5 de una base pirimidina o la posicion C7 de una base 7-desaza purina. Como se describio anteriormente se puede utilizar un grupo ligador para unir covalentemente un tinte al nucleosido o nucleotido.
En realizaciones particulares, el nucleosido o nucleotido marcado se puede incorporar enzimaticamente y extender enzimaticamente. De acuerdo con lo anterior un grupo funcional ligador puede tener una longitud suficiente para conectar el nucleotido al compuesto de tal manera que el compuesto no interfiere significativamente con la union general y reconocimiento del nucleotido mediante una enzima de replicacion de acido nucleico. De esta manera, el ligador tambien puede comprender una unidad separadora. El separador separa, por ejemplo, la base de nucleotido de un marcador o sitio de division.
Los nucleosidos o nucleotidos etiquetados con tintes de la invencion pueden tener la formula:
Cuando el tinte es un compuesto de tinte de acuerdo con la presente invencion, B es una nucleobase, tal como, por ejemplo uracilo, timina, citosina, adenina, guanina y similares, y L es un grupo ligador opcional que puede estar presente o no. R' puede ser H, monofosfato, difosfato, trifosfato, tiofosfato, un analogo de ester fosfato, -O- unido a un grupo que contiene fosforo reactivo u -O- protegido mediante un grupo de bloqueo. R” puede ser H, OH, una fosforoamidita o un grupo de bloqueo 3' OH y R”' es H u OH.
Cuando R“ es fosforoamidita, R' es un grupo protector hidroxilo divisible por acido que permite el acoplamiento posterior de monomero bajo condiciones sintetica automatizada. En una realizacion particular, el grupo de bloqueo se separa y es
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independiente del compuesto de tinte, es decir, no se une a este. En una realizacion alternativa, el tinte puede comprender todo o parte del grupo de bloqueo 3' OH. De esta manera R“ puede ser un grupo de bloqueo 3' OH que puede o no comprender el compuesto de tinte.
En aun otra realizacion alternativa no existe un grupo de bloqueo en el carbono 3' del azucar pentosa y el tinte (o tinte y construccion ligadora) unido a la base, por ejemplo, puede tener un tamano o estructura suficiente para actuar como un bloque a la incorporacion de un nucleotido adicional desde un punto diferente al sitio 3'. De esta manera, el bloque se puede deber al impedimento esterico o se puede deber a una combinacion de tamano, carga y estructura.
El uso de un grupo de bloqueo permite la polimerizacion que se va a controlar, tal como al detener la extension cuando se incorpora un nucleotido modificado. Si el efecto de bloqueo es reversible, por ejemplo por via de un ejemplo no limitante, al cambiar las condiciones qmmicas o al remover un bloqueo qmmico, la extension se puede detener en determinados puntos y luego se puede permitir continuar.
En otra realizacion particular, un grupo de bloqueo 3' OH comprendera grupos funcionales divulgados en el documento WO2004/018497 (incorporado aqm mediante referencia). Por ejemplo, el grupo de bloqueo puede ser azidometilo (CH2 N3) o alilo.
En una realizacion particular los grupos ligadores y de bloqueo estan presentes y son grupos funcionales separados, que se pueden dividir bajo condiciones sustancialmente similares. De esta manera los procesos de desproteccion y desbloqueo pueden ser mas eficientes en razon a que solo se requerira un unico tratamiento para retirar el compuesto de tinte y el bloque.
La invencion tambien abarca polinucleotidos que incorporan compuestos de tintes de acuerdo con la presente invencion. Dichos polinucleotidos pueden ser ADN o ARN que comprenden, respectivamente, desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos unidos con enlaces fosfodiester. Los polinucleotidos de acuerdo con la invencion pueden comprender nucleotidos que se presentan en la naturaleza, nucleotidos que no se presentan en la naturaleza (o modificado) diferente de los nucleotidos modificados de la invencion o cualquier combinacion de los mismos, siempre que por lo menos un nucleotido modificado, es decir, marcado con un compuesto de tinte, de acuerdo con la invencion esta presente. Los polinucleotidos de acuerdo con la invencion tambien pueden incluir enlaces de estructura principal no natural y/o modificaciones qmmicas de no nucleotidos. Tambien se contemplan estructuras quimericas comprendidas de mezclas de ribonucleotidos y desoxirribonucleotidos que comprenden por lo menos uno de los nucleotidos modificados de acuerdo con la presente invencion.
Los nucleotidos modificados (o nucleosidos) que comprenden un compuesto de tinte de acuerdo con la invencion se puede utilizar en cualquier metodo de analisis que requiere la deteccion de un marcador fluorescente unido a un nucleotido o nucleosido, ya sea sobre sf mismo o incorporado en o asociado con un conjugado o estructura molecular mayor. En este contexto, el termino “incorporado en un polinucleotido” requiere que el fosfato 5' se una en un enlace fosfodiester al grupo 3' hidroxilo de un segundo nucleotido (modificado o no modificado), que puede en sf mismo hacer parte de una cadena de polinucleotidos mayor. El extremo 3' del nucleotido modificado de la invencion puede o no puede estar unido a un enlace fosfodiester al fosfato 5' de un nucleotido adicional (modificado o no modificado). De esta manera, en una realizacion no limitante, la invencion proporciona un metodo de detectar un nucleotido modificado incorporado en un polinucleotido que comprende: (a) incorporar por lo menos un nucleotido modificado de acuerdo con el tercer aspecto de la invencion en un polinucleotido y (b) detectar los nucleotidos modificados incorporados en el polinucleotido a detectar la senal fluorescente del compuesto de tinte unido a dicho nucleotidos modificados.
Este metodo requiere dos etapas esenciales: una etapa de sintetica (a) en la que uno o mas nucleotidos modificados de acuerdo con la invencion se incorporan en un polinucleotido y una etapa de deteccion (b) en la que se detecta uno o mas nucleotidos modificados incorporados en el polinucleotido al detectar o medir cuantitativamente su fluorescencia.
En una realizacion de la invencion, por lo menos un nucleotido modificado se incorpora en un polinucleotido en la etapa sintetica mediante la accion de una enzima de polimerasa. Sin embargo, otros metodos para unir los nucleotidos modificados a los polinucleotidos, tal como, por ejemplo, la smtesis qmmica de oligonucleotidos o ligado de oligonucleotidos marcados a un oligonucleotido marcado, no se excluyen. Por lo tanto, en el contexto espedfico de este metodo de la invencion, el termino “que incorpora” un nucleotido en un polinucleotido abarca la smtesis de polinucleotidos mediante metodos qmmicos, asf como metodos enzimaticos.
En una realizacion espedfica la etapa sintetica puede comprender incubar una cadena de polinucleotido plantilla con una mezcla de reaccion que comprende nucleotidos modificados marcados fluorescentemente de la invencion y polimerasas bajo condiciones que permitan la formacion de un enlace fosfodiester entre un grupo hidroxilo 3' libre sobre una cadena de polinucleotido hibridada a dicha cadena de polinucleotidos plantilla y un grupo fosfato 5' sobre dicho nucleotido modificado. Esta realizacion comprende una etapa sintetica en la que la formacion de una cadena de polinucleotido se dirige mediante emparejamiento base complementario de nucleotidos a una cadena plantilla.
En todas las realizaciones del metodo, la etapa de deteccion se puede llevar a cabo mientras que la cadena de polinucleotidos en el que se incorporan los nucleotidos modificados se hibrida a una cadena plantilla, o despues de una
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etapa de desnaturalizacion en la que se separan las dos cadenas. Etapas adicionales, por ejemplo etapas de reaccion qmmica o enzimatica o etapas de purificacion, se pueden incluir entre la etapa sintetica y la etapa de deteccion. En particular, la cadena objetivo que incorpora los nucleotidos modificados se puede aislar o purificar y luego procesar adicionalmente o utilizar en un analisis posterior. Por via de ejemplo, los polinucleotidos objetivo marcados con nucleotidos modificados de acuerdo con la invencion en una etapa sintetica se pueden utilizar posteriormente como cebadores o sondas marcadas. En otras realizaciones el producto de la etapa sintetica se puede someter a etapas de reaccion y, si se desea, el producto de estas etapas posteriores se purifica o afsla.
Condiciones adecuadas para la etapa sintetica son bien conocidas por las personas familiarizadas con las tecnicas de biologfa molecular estandar. En una realizacion, la etapa sintetica puede ser analoga a una reaccion de extension de cebador estandar utilizando precursores de nucleotidos, que incluyen nucleotidos modificados de acuerdo con la invencion, para formar una cadena objetivo extendida complementaria a la cadena plantilla en la presencia de una enzima de polimerasa adecuada. En otras realizaciones, la etapa sintetica puede en sf misma hacer parte de una reaccion de amplificacion que produce un producto de amplificacion de cadena doble marcada que comprende cadenas complementarias hibridadas a partir de la copiar de las cadenas de polinucleotidos plantilla y objetivo. Otras etapas “sinteticas” de ejemplo incluyen traduccion de muesca, polimerizacion de desplazamiento de cadena, marcado de ADN cebado aleatorio etc. La enzima polimerasa utilizar en la etapa sintetica puede ser capaz de catalizar la incorporacion de nucleotidos modificados de acuerdo con la invencion. Otra forma, la naturaleza precisa de la polimerasa no se limita particularmente, si no que puede depender de las condiciones de la reaccion sintetica. Por via de ejemplo, si la reaccion sintetica se lleva a cabo utilizando termociclado entonces se requiere una polimerasa termoestable, mientras que esto puede no sea esencial para reacciones de extension de cebador estandar. Las polimerasas termoestables adecuadas que son capaces de incorporar los nucleotidos modificados de acuerdo con la invencion incluyen aquellos descritos en el documento WO 2005/024010 o WO06120433. En reacciones sinteticas que se llevan a cabo a temperaturas inferiores tal como 37°C, no se necesita que las enzimas polimerasas sean polimerasas termoestables, por lo tanto, la eleccion de la polimerasa dependera de una serie de factores tal como la temperatura de reaccion, pH, actividad de desplazamiento de cadena y similares.
En realizaciones no limitantes espedficas la invencion abarca el uso de nucleosidos o nucleotidos modificados marcados con tintes de acuerdo con la invencion en un metodo de secuenciamiento de acido nucleico, resecuenciamiento, secuenciamiento de genoma completo, calificacion de polimorfismo de nucleotido sencillo, cualquier otra aplicacion que implique la deteccion del nucleotido o nucleosido modificado cuando se incorpora en un polinucleotido, o cualquier otra aplicacion que requiera el uso de polinucleotidos marcados con los nucleotidos modificados que comprenden tintes fluorescentes de acuerdo con la invencion.
En una realizacion particular, la invencion proporciona el uso de nucleotidos modificados que comprenden compuestos de tintes de acuerdo con la invencion en una reaccion de “secuenciamiento por smtesis” de polinucleotido. El secuenciamiento por smtesis implica generalmente la adicion secuencial de uno o mas nucleotidos u oligonucleotidos a una cadena de polinucleotidos creciente en la direccion 5' a 3' utilizando una polimerasa oligasa con el fin de formar una cadena de polinucleotidos extendida complementaria al acido nucleico plantilla que se va a secuenciar. La identidad de la base presente en uno o mas de los nucleotidos agregados se determina en una etapa de deteccion o “formacion de imagen”. La identidad de la base agregada se puede determinar despues de cada etapa de incorporacion de nucleotidos. La secuencia de la plantilla se puede deducir utilizando reglas de emparejamiento base Watson-Crick. El uso de los nucleotidos modificados marcados con tintes de acuerdo con la invencion para la determinacion de la identidad de una base sencilla puede ser util, por ejemplo, en la clasificacion de polimorfismos de nucleotidos sencillos, y dichas reacciones de extension de base sencilla estan dentro del alcance de esta invencion.
En una realizacion de la invencion, la secuencia de un polinucleotido plantilla se determina al detectar la incorporacion de uno o mas nucleotidos en una cadena naciente complementaria al polinucleotido plantilla que se va a secuenciar a traves de la deteccion de marcadores fluorescentes adheridos a los nucleotidos incorporados. El secuenciamiento de los polinucleotidos plantilla se ceba con un cebador adecuado (o se prepara como una construccion de horquilla que contendra el cebador como parte de la horquilla), y la cadena naciente se extiende en forma de etapas mediante la adicion de nucleotidos al extremo 3' del cebador en una reaccion catalizada por polimerasas.
En realizaciones particulares cada uno de los diferentes trifosfatos de nucleotidos (A, T, G y C) se pueden marcar con un fluoroforo unico y tambien comprende un grupo de bloqueo en la posicion 3' para evitar la polimerizacion no controlada. Alternativamente uno de los cuatro nucleotidos puede no estar marcado (oscuro). La enzima de polimerasa incorpora un nucleotido en una cadena naciente complementaria al polinucleotido plantilla, y el grupo de bloqueo evita la incorporacion adicional de nucleotidos. Se elimina nucleotidos no incorporados y la senal fluorescente de cada nucleotido incorporado se “lee” opticamente mediante metodos adecuados, tal como un dispositivo acoplado a carga que utiliza excitacion laser y filtros de emision adecuados. El grupo de bloqueo 3' y los compuestos de tintes fluorescentes se retiran posteriormente (desprotegen), particularmente mediante el mismo metodo qrnmico o enzimatico, para exponer la cadena naciente a incorporacion adicional de nucleotidos. Normalmente, la identidad del nucleotido incorporado se determinara despues de cada etapa de incorporacion, pero esto no es estrictamente esencial. Del mismo modo, la Patente Estadounidense No. 5,302,509 divulga un metodo para secuenciar polinucleotidos inmovilizados sobre un soporte solido. El metodo se basa en la incorporacion de nucleotidos A, G, C y T bloqueados en 3' marcados fluorescentemente en una cadena creciente complementaria a los polinucleotidos inmovilizados, en la presencia de
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polimerasa de ADN. La polimerasa incorpora una base complementaria al polinucleotido objetivo, pero se evita la adicion mediante el grupo de bloqueo 3'. El marcado del nucleotido incorporado se puede determinar luego y el grupo de bloqueo removido mediante division qmmica para permitir que ocurra polimerizacion adicional. La plantilla de acido nucleico que se va a secuenciar en una reaccion de secuenciamiento por smtesis puede ser cualquier polinucleotido que se desee secuenciar. La plantilla de acido nucleico para una reaccion de secuenciamiento comprendera normalmente una region de cadena doble que tiene un grupo hidroxilo 3' libre que sirve como un cebador o punto de inicio para la adicion de nucleotidos adicionales en la reaccion de secuenciamiento. La region de la plantilla que se va a secuenciar sobresaldra de este grupo hidroxilo 3' libre en la cadena complementaria. La region que sobresale de la plantilla que se va a secuenciar puede ser de cadena sencilla, pero puede ser de doble cadena, siempre que “se presente una muesca” en la cadena complementaria a la cadena plantilla que se va a secuenciar para proporcionar un grupo OH 3' libre para iniciacion de la reaccion de secuenciamiento. En dichas realizaciones la secuenciamiento puede proceder mediante desplazamiento de cadenas. En determinadas realizaciones un cebador lleva un grupo hidroxilo 3' libre que se puede agregar como un componente separado (por ejemplo, un oligonucleotido corto) que hibrida a una region de cadena sencilla de la plantilla que se va a secuenciar. Alternativamente, el cebador y la cadena de plantilla que se van a secuenciar cada uno pueden hacer parte de una cadena de acido nucleico parcialmente autocomplementaria capaz de formar un duplex intramolecular, tal como por ejemplo una estructura de bucle horquilla. Los polinucleotidos horquilla y los metodos mediante los cuales se pueden unir a soportes solidos se divulgan en la publicacion de la solicitud internacional copendiente del solicitante No. WO0157248 y WO 2005/047301. Los nucleotidos se agregan sucesivamente a los grupos hidroxilo 3' libres, que resulta en la smtesis de una cadena de polinucleotidos en la direccion 5' a 3'. La naturaleza de la base que se ha agregado se puede determinar, particularmente pero no necesariamente despues de cada adicion de nucleotidos, proporcionando de esta manera informacion de secuencia para la plantilla de acido nucleico. El termino “incorporacion” de un nucleotido en una cadena de acido nucleico (o polinucleotidos) en este contexto se refiere a la union del nucleotido al grupo hidroxilo 3' libre de la cadena de acido nucleico a traves de la formacion de una conexion fosfodiester con el grupo fosfato 5' del nucleotido.
La plantilla de acido nucleico que se va a secuenciar puede ser ADN o ARN, o incluso una molecula hnbrida comprendida de desoxinucleotidos y ribonucleotidos. La plantilla de acido nucleico puede comprender nucleotidos que se presentan en forma natural y/o que no se presentan en forma natural y enlaces de estructura principal naturales o no naturales, siempre que estos no eviten copiar la plantilla en la reaccion de secuenciamiento.
En determinadas realizaciones, la plantilla de acido nucleico que se va a secuenciar se puede unir a un soporte solido a traves de cualquier metodo de enlace adecuado conocido en la tecnica, por ejemplo a traves de union covalente. En determinadas realizaciones los polinucleotidos plantilla se pueden unir directamente a un soporte solido (por ejemplo, un soporte basado en sflice). Sin embargo, en otras realizaciones de la invencion, la superficie del soporte solido se puede modificar en alguna manera con el fin de permitir la union covalente directa de los polinucleotidos plantilla, o inmovilizar los polinucleotidos plantilla a traves de una multicapa de hidrogel o polielectrolitos, que en sf mismo se pueden unir no covalentemente al soporte solido. Matrices en las que se han unido polinucleotidos directamente a soportes a basados en sflice son aquellas, divulgadas, por ejemplo, en el documento W000006770, en el que los polinucleotidos se inmovilizan sobre un soporte de vidrio mediante la reaccion entre un grupo epoxido pendiente en el vidrio con un grupo amino interno en el polinucleotido. Adicionalmente, los solicitantes divulgan en una solicitud de patente internacional copendiente No de publicacion WO2005/047301 matrices de polinucleotidos unidas a un soporte solido, por ejemplo para uso en la preparacion de SMA, mediante la reaccion de un nucleofilo basado en azufre con soporte solido. Un ejemplo adicional de polinucleotidos de plantilla soportados con solidos es cuando los polinucleotidos plantilla se unen a hidrogeles soportador en soportes solidos o basados en sflice. Los soportes basados en sflice se utilizan normalmente para soportar hidrogeles y matrices de hidrogeles como se describe en el documento WO00/31148, WO01/01143, WO02/12566, WO03/014392, Patente estadounidense No. 6,465,178 y WO00/53812.
Una superficie particular a la que se pueden inmovilizar polinucleotidos plantilla es un hidrogel poliacrilamida. Los hidrogeles poliacrilamida se describen en la tecnica anterior, algunos de los cuales se discutieron anteriormente. Sin embargo, un hidrogel particular se describe en el documento WO2005/065814.
Las moleculas de plantilla de ADN se pueden unir a lechos o micropartmulas con el proposito de secuenciamiento; por ejemplo como se describe en la patente estadounidense No 6,172,218. Ejemplos adicionales de la preparacion de colecciones de lecho, en donde cada globulo contiene secuencias de ADN diferentes se puede encontrar en la tecnica anterior (Nature. 437, 376-380 (2005); Science. 309, 5741, 1728-1732 (2005)). El secuenciamiento de matrices de dichos globulos que utilizan nucleotidos como se describe esta dentro del alcance de la invencion.
Las plantillas que se van a secuenciar, pueden hacer parte de una “matriz” sobre un soporte solido, en cuyo caso la matriz puede tomar cualquier forma conveniente. De esta manera, el metodo de la invencion se puede paliar a todos los tipos de matrices de “alta densidad”, que incluyen matrices de una molecula, matrices agrupadas y matrices de globulos. Los nucleotidos modificados marcados con compuestos de tinte de la invencion se pueden utilizar para plantillas de secuenciamiento en esencialmente cualquier tipo de matriz formada por inmovilizacion de moleculas de acido nucleico sobre un soporte solido, y mas particularmente cualquier tipo de matriz de alta densidad. Sin embargo, los nucleotidos modificados marcados con compuestos de tinte de la invencion son particularmente ventajosos en el contexto del secuenciamiento de matrices agrupadas.
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En matrices de multipolinucleotido o matrices agrupadas, distintas regiones en la matriz comprenden multiples moleculas de plantillas de polinucleotidos. El termino “matriz agrupada” se refiere a una matriz en el que distintas regiones o sitios en la matriz comprenden multiples moleculas de polinucleotidos que se pueden resolver individualmente mediante metodos opticos. Dependiendo de como se forma la matriz cada sitio en la matriz puede comprender multiples copias de una molecula de polinucleotidos individual o incluso multiples copias de un pequeno numero de diferentes moleculas de polinucleotidos (por ejemplo, multiples copias de dos cadenas de acido nucleico complementarias). Se pueden producir matrices agrupas o de multipolinucleotido de moleculas de acido nucleico utilizando tecnicas conocidos generalmente en la materia. Por via de ejemplo, los documentos WO 98/44151 y WO00/18957 describen metodos de amplificacion de acidos nucleicos en el que los productos de amplificacion y plantilla permanecen inmovilizados sobre un soporte solido con el fin de formar matrices comprendidas de grupos o “colonias” de moleculas de acido nucleico inmovilizadas. Las moleculas de acido nucleico presentes en las matrices agrupadas preparadas de acuerdo con estos metodos son plantillas adecuadas para secuenciamiento utilizando los nucleotidos modificados marcados con compuestos tinte de la invencion.
Los nucleotidos modificados marcados con los compuestos de tinte de la invencion tambien son utiles en el secuenciamiento de plantillas sobre matrices de unas moleculas individuales. El termino “matriz de molecula individual” o “SMA” como se utiliza aqrn se refiere a una poblacion de moleculas de polinucleotidos, distribuidas (o dispuestas) sobre un soporte solido, en el que la separacion de cualquier polinucleotido individual de todas las otras poblaciones es tal que es posible efectuar resolucion individual de los polinucleotidos. Las moleculas de acido nucleico objetivo inmovilizadas sobre la superficie del soporte solido debe ser capaz de ser resuelta mediante medios opticos. Esto significa que, dentro del area soluble del dispositivo formador de imagenes particular utilizado, puede haber una o mas senales distintas, cada una representa un polinucleotido.
Esto se puede lograr cuando la separacion entre las moleculas de polinucleotidos adyacentes sobre la matriz tenga por lo menos 100 nm, mas particularmente por lo menos 250 nm, aun mas particularmente por lo menos 300 nm, aun mas particularmente por lo menos 350 nm. De esta manera, cada molecula puede ser resoluble individualmente y detectable como un punto fluorescente de molecula sencilla, y la fluorescencia de dicho punto fluorescente de molecula sencilla tambien presenta fotoblanqueamiento de etapa sencilla.
Los terminos “resuelto individualmente” y “resolucion individual” se utilizan aqrn para especificar que, cuando se visualizan, es posible distinguir una molecula en la matriz de sus moleculas vecinas. La separacion entre las moleculas individuales en la matriz se determinara, en parte, mediante tecnicas particulares utilizadas para resolucion de las moleculas individuales. Las caractensticas generales de las matrices de molecula sencilla se entenderan con referencia a las solicitudes publicadas WO00/06770 y WO 01/57248. Aunque un uso de los nucleotidos modificados de la invencion esta en las reacciones de secuenciamiento por smtesis, la utilidad de los nucleotidos modificados no se limita a dichos metodos. De hecho, los nucleotidos se pueden utilizar ventajosamente en cualquier metodologfa de secuenciamiento que requiere la deteccion de etiquetas fluorescentes unidas a nucleotidos incorporados en un polinucleotido.
En particular, los nucleotidos modificados marcados con compuestos de tinte de la invencion se pueden utilizar en protocolos de secuenciamiento fluorescente, particularmente secuenciamiento de ciclo de terminador de tinte fluorescente basado en el metodo de secuenciamiento de terminacion de cadena de Sanger y colaboradores. Dichos metodos utilizan por lo general secuenciamiento por ciclos y enzimas para incorporar didesoxinucleotidos marcados fluorescentemente en una reaccion de secuenciamiento de extension de cebador. De esta manera los denominados metodos de secuenciamiento Sanger, y protocolos relacionados (tipo Sanger), se basan en la terminacion de cadena aleatorizada con didesoxinucleotidos marcados.
De esta manera, la invencion tambien abarca nucleotidos modificados marcados con compuestos de tinte de acuerdo con la invencion que son didesoxinucleotidos que carecen de grupos hidroxilo en las posiciones 3 'y 2', tal como didesoxinucleotidos que adecuados para uso en metodos de secuenciamiento tipo de Sanger y similares.
Los nucleotidos modificados marcados con compuestos de tinte de la presente invencion que incorporan grupos de bloqueo 3', se reconoceran, tambien son de utilidad en los metodos Sanger y protocolos relacionados en razon a que el mismo efecto alcanzado al utilizar los nucleotidos didesoxi modificados se puede alcanzar al utilizar nucleotidos modificados que tienen grupos de bloqueo OH 3': que evitan la incorporacion de nucleotidos posteriores. En donde los nucleotidos de acuerdo con la presente invencion, y que tienen un grupo de bloqueo 3' que se van a utilizar en los metodos de secuenciamiento tipo Sanger, se apreciara que los compuestos de tinte o marcas detectables unidas a los nucleotidos no necesitan conectar a traves de enlaces divisibles, en razon a que en cada caso se incorpora un nucleotido marcado de la invencion; no se necesita incorporar posteriormente nucleotidos y de esta manera no se necesita retirar la marca del nucleotido.
La invencion tambien proporciona kits que incluyen nucleosidos y/o nucleotidos marcados modificados con tintes de acuerdo con la invencion. Dichos kits incluiran por lo general por lo menos un nucleotido o nucleosido modificado marcado con un tinte de acuerdo con la invencion junto con por lo menos un componente adicional. Los componentes adicionales pueden ser nucleotidos o nucleosidos modificados o no modificados adicionalmente. Por ejemplo, los nucleotidos modificados marcados con tintes de acuerdo con la invencion se pueden suministrar en combinacion con
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nucleotidos no marcados o naturales, y/o con nucleotidos marcados fluorescentemente o cualquier combinacion de los mismos. De acuerdo con lo anterior, los kits pueden comprender nucleotidos modificados marcados con tintes de acuerdo con la invencion y nucleotidos modificados marcados con otros, por ejemplo, compuestos de tintes de la tecnica anterior. Se pueden proporcionar combinaciones de nucleotidos como componentes individuales separados o como mezclas de nucleotidos.
Cuando los kits comprenden una pluralidad, particularmente dos, particularmente cuatro, nucleotidos modificados marcados con un compuesto de tinte, los nucleotidos diferentes se pueden marcar con diferentes compuestos de tinte, o uno puede ser oscuro, sin compuestos de tinte. Cuando los diferentes nucleotidos se marcan con diferentes compuestos de tinte es una caractenstica de los kits que dichos compuestos de tinte sean tintes fluorescentes distinguibles espectralmente. Como se utiliza aqm, el termino “tintes fluorescentes distinguibles espectralmente” se refiere a tintes fluorescentes que emiten energfa fluorescente en longitudes de onda que se pueden distinguir mediante equipos de deteccion fluorescente (por ejemplo, una plataforma comercial de secuenciamiento de ADN basado en capilares) en donde dos o mas de dichos tintes estan presentes en una muestra. Cuando dos nucleotidos modificados marcados con compuestos de tinte fluorescentes se suministran en forma de kit, es una caractenstica de la invencion que los tintes fluorescentes distinguibles espectralmente se pueden excitar en la misma longitud de onda, tal como, por ejemplo, por el mismo laser. Cuando cuatro nucleotidos modificados marcados con compuestos de tinte fluorescente se proporcionan en forma de kit, es una caractenstica de la invencion que dos tintes fluorescentes distinguibles espectralmente puedan ser excitados en una longitud de onda y los otros dos tintes distinguibles espectralmente se pueden excitar en otra longitud de onda. Las longitudes de onda de excitacion particular son 532 nm, 630 nm a 700 nm, particularmente 660 nm.
En una realizacion, un kit comprende un nucleotido modificado marcado con un compuesto de la invencion y un segundo nucleotido modificado marcado con un segundo tinte, en el que los tintes tienen una diferencia en absorbancia maxima de por lo menos 10 nm, particularmente 20 nm a 50 nm. Mas particularmente, los dos compuestos de tinte tienen cambios de Stokes de entre 15-40 nm, en donde los “cambios de Stokes” es la distancia entre la absorcion maxima y los picos de longitud de onda de emision.
En una realizacion adicional, dicho kit comprende otros dos nucleotidos modificados marcados con tintes fluorescentes en el que dichos tintes se excitan por el mismo laser a 600 nm a 700 nm, particularmente 630 nm a 700 nm, mas particularmente 660 nm. En el que los tintes tienen una diferencia en la absorbancia maxima de por lo menos 10 nm, particularmente 20 nm a 50 nm. Mas particularmente los dos compuestos de tinte tienen cambios de Stokes de entre 20 a 40 nm. Aun mas particularmente los dos compuestos de tinte tienen una absorbancia diferente maxima por encima de 600 nm, particularmente por encima de 640 nm. Tintes particulares que se pueden distinguir espectralmente de tintes rodamina de la invencion y que cumplen el criterio anterior son analogos de polimetina como se describe en la Patente de estadounidense No. 5,268,486 (por ejemplo Cy5) o el documento WO 0226891 (Alexa 647; Molecular Probes A20106) o polimetinas no simetricas como se divulga en la Patente estadounidense No 6,924,372.
En una realizacion alternativa, los kits de la invencion pueden contener nucleotidos, en donde la misma base se marca con dos compuestos diferentes. Un primer nucleotido se puede marcar con un compuesto de la invencion. Un segundo nucleotido se puede marcar con un compuesto espectralmente distinto, por ejemplo un tinte “rojo” que absorbe mas de 600 nm. Un tercer nucleotido se puede marcar como una mezcla de los compuestos de la invencion y el compuesto espectralmente distinto, y el cuarto nucleotido puede ser “oscuro” y no contener marcador. Por lo tanto en terminos simples, los nucleotidos 1-4 se pueden marcar “verde”, “rojo”, “rojo/verde”, y oscuro. Para simplificar la instrumentacion adicional, se pueden marcar cuatro nucleotidos con dos tintes excitados con un unico laser, y de esta manera marcar los nucleotidos 1-4 “verde 1”, “verde 2” “verde1/verde 2”, y oscuro.
Los nucleotidos pueden contener dos tintes de la presente invencion. Tintes en donde R1 y R4 son H absorbe en una menor longitud de onda que cuando R1 y R4 son alquilo. Un kit puede contener dos o mas nucleotidos marcados con tintes de la invencion. Un kit puede contener un nucleotido marcado con un compuesto de la invencion en donde R1 y R4 son H, y un segundo nucleotido marcado con un compuesto de la invencion en donde R1 y R4 son alquilo. Los kits pueden contener un nucleotido adicional en donde una parte del nucleotido se marca con un compuesto de la invencion en donde R1 y R4 son H, y una segunda porcion del nucleotido marcado con un compuesto de la invencion en donde R1 y R4 son alquilo. Los kits pueden contener adicionalmente un nucleotido no marcado.
En una realizacion, los kits pueden incluir una enzima de polimerasa capaz de catalizar la incorporacion de los nucleotidos modificados en un polinucleotido. Otros componentes que se van incluir en dichos kits pueden incluir reguladores y similares. Los nucleotidos modificados marcados con tintes de acuerdo con la invencion, y cualesquier otros componentes de nucleotidos que incluyen mezclas de diferentes nucleotidos, se pueden proporcionar en el kit en una forma concentrada que se va a diluir antes de uso. En dichas realizaciones, tambien se puede incluir un regulador de dilucion adecuado.
Cabe senalar, como se utiliza en esta especificacion y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “uno” y “el” incluyen plurales referentes a menos que se limite expresamente e ineqrnvocamente a un referente.
Detalles de Experimentos
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4-hidroxiftalato de dietilo (2.1).
Este compuesto se prepare a partir de acido 4-hidroxi-ftalico 2.0 mediante esterificacion con un exceso de etanol (absolute) en la presencia de acido sulfurico concentrado.
A un matraz de fondo redondo de 0.5 L que contiene etanol absoluto (250 ml, ~200 g ~4.3 mol) acido 4-hidroxiftalico 2.0 (15 g, 82.4 mmol) se agrego en algunas porciones a temperature ambiente con agitacion. Esto luego se siguio mediante adicion de 0.5 ml (~0.92 g, 9.4 mmol) de acido sulfurico concentrado. Esta mezcla se agito a temperatura ambiente durante media hora, y luego se sometio a reflujo adicional durante 24 horas con un condensador.
Aproximadamente la mitad del volumen del solvente se destilo utilizando un condensador descendente y el solvente restante se elimino bajo una presion reducida. El residuo aceitoso viscoso se disolvio en 400 ml de DCM. A esta solucion, se agrego 1.5 g de carbonato de potasio anhidro cuidadosamente en pequenas porciones. Esta mezcla se mantiene a temperatura ambiente con agitacion durante aproximadamente 2 horas, luego se filtro a traves de ~100 g de geles de sflice. Los geles de silice se lavaron adicionalmente con DCM para eluir mas productos absorbidos. Las fracciones organicas combinadas se secaron con sulfato de magnesio anhidro (~5 g) durante la noche. Los solidos se filtraron, y se lavaron adicionalmente con DCM. El solvente se evaporo bajo una presion reducida.
Este ester 2.1 obtenido como producto aceitoso incoloro se utilizo en la siguiente etapa sin purificacion adicional. Rendimiento: 22 g (~99 %) 1H RMN: (400 MHz, DMSO-da) 6 10.59 (s, 1H), 7.68 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.07 -6.76 (m, 2H), 4.22 (dq, J = 13.4, 7.1 Hz, 4H), 1.25 (td, J = 7.1, 3.3 Hz, 6H).
4-[(3-etoxicarbonil)propiloxi]ftalato de dietilo (2.2).
Este compuesto se prepare en etanol a partir de 4-hidroxiftalato de dietilo 2.1 a traves de formacion anterior de 3,4- bis(etoxicarbonil)fenolato de potasio y luego mediante alquilacion con 4-bromobutirato de etilo en el mismo crisol de reaccion.
A una solucion del ester 2.1 (2 g, 8.4 mmol) en etanol absoluto (20 ml), tert-butoxido de potasio solido (1.1 g, 9.8 mmol,
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1.15 eq) se agrego lentamente. La mezcla de reaccion se mantiene a temperatura ambiente durante una hora, y se agrego luego 4-bromobutirato de etilo (2 g, ~1.5 ml). La reaccion se mantiene a temperatura ambiente durante una hora, y luego se calento bajo reflujo con un condensador durante la noche.
La mezcla de reaccion se congelo (hasta aproximadamente 0-5°C) con un bano de hielo durante 3 a 4 horas. Los precipitados inorganicos se filtraron y adicionalmente se lavaron con etanol absoluto frio. Los precipitados se descargaron y los filtrados combinados se concentraron bajo presion reducida.
El residuo que contiene algunos solidos inorganicos se diluyo con una mezcla de DCM-Eter de petroleo (7:3, 50 ml) y se filtro a traves de de un tapon corto de geles de silice (~10 g). Los geles de silice se lavaron adicionalmente con DCM- MeOH (97:3, ~150 ml) para eluir mas producto absorbido (se utilizo TLC para monitorizar la terminacion de elucion del producto; se utiliza mas solvente eluyente si se desea). Las fracciones organicas combinadas se secaron con sulfato de magnesio anhidro (~1 g) durante la noche y se evaporaron bajo una presion reducida. Este ester 2.2 se utilizo en la siguiente etapa sin purificacion adicional. Rendimiento: 2 g (67.6 %)
1H RMN: (400 MHz, Metanol-d4) 8 7.87 - 7.77 (m, 1H), 7.18 - 7.05 (m, 2H), 4.33 (dq, J = 14.5, 7.1 Hz, 4H), 4.21 - 4.07 (m, 4H), 2.53 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.17 -2.04 (m, 2H), 1.36 (td, J = 7.1, 3.5 Hz, 6H), 1.25 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
Acido 4-(3-Carboxipropiloxi)ftalico (2.3).
Este derivado de acido ftalico se preparo mediante una saponificacion del ester de trietilo 2.2 de la etapa previa mediante una solucion acuosa de hidroxido de sodio.
Preparacion:
A un matraz de fondo redondo, equipado con un agitador y un condensador, se vertio 100 ml de agua deionizada y luego se agregaron NaOH (5 g, 125 mmol) en pequenas porciones. Despues se disolvio hidroxido de sodio, se agrego el ester de trietilo 2.2 (10.5 g, ~30 mmol). La mezcla de reaccion se agito vigorosamente a 110°C (bloque de calentamiento) durante 5 horas. Despues de aproximadamente 3 horas, el material de partida oleosos 2.2 se disolvio. La matraz de fondo redondo se filtro y el filtrado recolectado se transfirio a un matraz de fondo redondo. Aproximadamente 10 a 15 ml de lfquido que contiene etanol formado durante la reaccion y agua, se destilo con un condensador descendente. La solucion restante se enfrio mediante bano de hielo (0 a 5°C).
A esta solucion fna, se agrego lentamente acido clorhfdrico concentrado (37%, 11 ml, 135 mmol con agitacion). El pH de esta mezcla se verifico mediante un indicador para asegurar un exceso de acido mineral. El producto esperado como un precipitado blanco se formo poco despues de esto. La mezcla se mantiene a ~0-5°C durante una hora. El precipitado se filtro, se lavo con unos pocos ml de agua fna y luego se seco durante la noche. Este producto 2.3 se utilizo en la siguiente etapa sin purificacion adicional. Sin embargo, se puede purificar mediante cristalizacion a partir de agua si es necesario. Rendimiento: 5.1 g, 64 %.
1H-RMN : (400 MHz, CFaCOO-d) 8 11.62 (d, J = 1.5 Hz, 6H), 8.10 (dd, J = 8.8, 1.5 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.23 - 7.14 (m, 1H), 4.24 (td, J = 5.9, 1.6 Hz, 2H), 2.76 (td, J = 7.2, 1.6 Hz, 2H), 2.35 -2.24 (m, 2H).
Anhfdrido 4-(3-Carboxipropiloxi)ftalico (2.4).
La preparacion del anhfdrido 2.4 se puede lograr mediante del acido 2.3 con reactivos de deshidratacion similares a anhfdrido acetico, precalentamiento del acido 2.3 a alta temperaturas o solo al mantener el acido 2.3 en un disector con
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Este compuesto se prepare a partir de acido 4-hidroxi-ftalico 2.0 mediante deshidratacion con un exceso de antndrido acetico de acuerdo con el procedimiento publicado en la bibliografia (Synthesis 2008, p.3415).
A una solucion de acido 4-hidroxiftalico 2 (5.39 g) en tolueno (100 ml) se agrego antndrido acetico (25 ml) y la mezcla se sometio a reflujo durante 2 h. Al d^a siguiente se filtro el producto cristalizado. Rendimiento 2.6 g (42.5 %).
La srntesis de tinte (XI-1):
A un matraz de fondo redondo, se agrego acido 4-acetiloftalico (1.03 g), 3-etilamino-cresol (2.0 g) y pirosulfato de potasio (1.5 g). Los reactivos se mezclaron cuidadosamente junto con una espatula y se calentaron a l50°C (bloque de calentamiento) durante 6 h. Durante este tiempo se desarrollo mas y mas color rojo intenso y se solidifico la mezcla de reaccion. Se utilizaron TLC (acetonitrilo-agua, 20%) y HPLC (@ 280 nm) para cerificar el progreso de la reaccion al monitorizar la reaccion de tintes y el 3-etilaminocresol de partida. Despues de aproximadamente 5 horas la relacion se mantuvo casi constante. A la mezcla de reaccion se agrego 10 ml de agua y se filtro el producto de color rosado. El precipitado se coloco en un matraz de fondo redondo, se agrego metanol (50 ml) y la mezcla se sometio a reflujo durante 10 min. Aproximadamente % del solvente se elimino en vacfo y esta solucion de color rojo se dejo durante la noche. Se filtro el producto como cristales rojos. Rendimiento 1 g (46 %).
Si se necesitan se pueden separar isomeros mediante cromatograffa.
La srntesis de tinte (I):
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Se sintetizaron compuestos objetivo como una mezcla de isomeros constitucionales mediante una condensacion del acido ftalico 2.3 con 7-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroquinolina a alta temperatura. Se completo la reaccion al utilizar acido fosforico anhidro como un catalizador y tambien como solvente
Esquema de reaccion:
Preparacion:
Acido 4-(3-carboxipropoxi)ftalico (0.268 g) y 0.5 g de hidrosulfato de 1 -butil-3-metil-imidazolio (IL-HSO4) se calento 1 h a 125°C para completar la formacion de anhndrido (Xa-2.4). Se agrego 7-Hidroxi-tetrahidro-dihidroquinolina (0.298 g) y la mezcla de reaccion se agito a 175°C durante 2 h. Se formo compuesto de color rojo con fuerte fluorescencia. El control de TLC en CHaCN-agua (4:1) confirmo formacion de tintes. Se continuo calentamiento a 175°C durante 3 h adicionales.
Este material crudo se disolvio en mezcla de CHaCN-agua (10%) y se purifico mediante cromatograffa de columna flash sobre gel de sflice. Se recolectaron fracciones de color rojo y los solventes se evaporaron.
Tinte (I-1): Rendimiento 18 mg (16 %). Tinte (I-2): Rendimiento 9 mg (8 %).
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Se sintetizaron compuestos objetivo como una mezcla de isomeros constitucionales mediante condensacion del acido ftalico 2.3 con 3-etilamino-4-metil-fenol a alta temperature. Se completo la reaccion al utilizar acido fosforico anhidro como un catalizador con y sin solvente organico polar de alto punto de ebullicion como DMF, DMA, sulfolano o 1,2- diclorobenceno.
Esta reaccion se puede llevar a cabo utilizando disulfato de potasio como un catalizador. Este reactivo actua como un acido de Lewis suave, que puede estimular la formacion y/o reacciones adicionales de los materiales de partida y/o intermedios formados. Como resultado, la temperatura de reaccion fue menor y se redujo la cantidad de productos secundarios. La naturaleza de un catalizador y un disolvente que se han utilizado ejercen un efecto significativo no solo sobre el rendimiento y pureza de la reaccion de los productos, sino tambien sobre la regioselectividad de la formacion de tintes de isomeros. De este modo se puede conseguir la formacion de uno u otro isomero como uno prevalente.
Adicionalmente, algunos lfquidos ionicos (IL) pueden mejorar la formacion de tinte de rodamina tanto en el rendimiento de reaccion como en la pureza del producto. Tambien hemos logrado una mejora definitiva con algunos IL sobre la smtesis de tintes (I). Entre la familia de sales cuaternarias de IL (1 -etil-3-metilimidazolio y algunas sales de tetraalquilamonio) que probamos, algunas promueven eficientemente la formacion de uno u otro isomero y proporcionan un producto mas limpio (menos subproductos coloreados en la mezcla de reaccion).
Tintes (1-3) y (1-4)
Nombre qmmico:
(1-3): betama de 3,6-Bis(etilamino)-2,7-dimetil-[2-carboxilato-5-(3-carboxipropiloxi)fenil]xantilio(1-4): betama de 3,6- Bis(etilamino)-2,7-dimetil-[2-carboxilato-4-(3-carboxipropiloxi)fenil]xantilio
Esquema de reaccion
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Preparacion:
A un matraz de fondo redondo, se agrego acido 4-carboxipropiloxiftalico (1.0 g, 3.73 mmol), 3-etilamino-cresol (2.0 g, 13.23 mmol), IL-CF3 (1.72 g, 6.61 mmol) y pirosulfato de potasio (1.68 g, 6.61 mmol). Los reactivos se mezclaron cuidadosamente junto con una espatula y se calentaron a 150°C (bloque de calentamiento) durante 10 h. Durante este tiempo se desarrollo mas y mas color rojo intenso y se solidifico la mezcla de reaccion. Se utilizaron ambos TLC (acetonitrilo-agua, 20%) y HPLC (@ 280 nm) para verificar el progreso de reaccion al monitorizar la relacion de tintes y el 3-etilaminocresol de partida. Despues de 10 horas la relacion se mantuvo casi constante.
La mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente, y el solido rojo se disolvio en metanol (~20 ml). Los materiales inorganicos insolubles incoloros se filtraron. Se agrego trietilamina (2 ml) al filtrado y la solucion resultante se aplico a una muestra Biotage C-is (40 g). La muestra luego se seca en vado para eliminar la mayona de solventes.
El producto se aislo mediante cromatograffa de destello en un instrumento Biotage Isolera-4 en una columna 400 g C-is utilizando mezcla de TEAB 0.1 M en agua y acetonitrilo como solventes de elucion (gradiente 17-27). Se establecio la longitud de onda de recoleccion de producto a 520 nm, y la longitud de onda de control se establecio a nm para monitorizar la separacion del exceso de los materiales de partida y productos secundarios incoloros formados.
Se recolectaron fracciones de color naranja-amarillo. Los solventes se eliminaron mediante un evaporador rotativo en vado. Se trituro el residuo rojo solido restante con eter de petroleo (60-95°C, 25 ml) y producto, I-3 como un polvo rojo se filtro y se seco sobre aire.
Rendimiento: 0.50 g (29%).
(I-3):
1H-RMN:
(400 MHz, DMSO-d6) 5 7.84 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.18 (dd, J = 8.5, 2.2 Hz, 1H), 6.58 (d, J= 2.2 Hz, 1H), 6.30 (s, 2H), 6.25 (s, 2H), 5.26 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.95 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.22 - 3.10 (m, 4H), 2.30 (d, J= 7.3 Hz, 2H), 1.91 (s, 8H), 1.21 (t, J = 7.1 Hz, 6H).
(I-4) :
Rendimiento: 0.16 g (9%).
Tinte (I-5) I-3-NHS
5
El tinte (I-3) se seco bajo alto vado durante la noche luego se tomo 35 mg de muestra (68 pmol) y se coloco en matraz de fondo redondo. Se agrego DMF anhidro (3 mL) y base de Hunig (678 pmol, 116 pL) al matraz. La mezcla (se hace cada vez mas incolora debido a la formacion de derivado dclico (IC) y se agito durante aproximadamente 20 min bajo atmosfera de nitrogeno. Luego se agrego TSTU (80 pmol, 25 mg). Se desarrollo un color rosado claro. La mezcla de 10 reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1h, Se verifico el progreso mediante TLC, (20% en H2O en CH3CN). Esta lactona se puede aislar mediante precipitacion de la solucion, o solo destilacion del solvente en vado. El ester de NHS (I-5) preparado de esta forma se utilizo para acoplamiento sin purificacion adicional y aislamiento de la solucion. Si se necesita el ester de NHS se puede aislar de la solucion mediante precipitacion, por ejemplo, mediante precipitacion con acetato de etilo, se filtro y se seco.
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Tinte (I-6) I-3-PEG12
Esquema de reaccion:
Preparacion:
Una solucion de NH2Peg12COOH (203 jmol, 126 mg) en agua (300 jL) se agrego a la solucion de (I-5) preparada 5 como se describio anteriormente y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche. Se verifica la terminacion de la reaccion mediante TLC (20% en H2O en acetonitrilo). Despues de la terminacion del acoplamiento, se agrego solucion de TEAB 0.1M en agua (4 mL) y la mezcla se agito a ~20°C durante 1 h para detener los intermedios reactivos. Los solventes se eliminaron bajo vado. El residuo se disolvio en 10 ml de TEAB 0.1 M. Esta solucion se filtro a traves de un filtro de jeringa 0.2 nm de tamano de poro y se transfirio en dos frascos de 5 mL de HPLC para 10 purificacion por HPLC. El producto se purifico mediante HPLC utilizando columna de fase inversa C18 con acetonitrilo- TEAB 0.1 M. se recolectaron las fracciones con absorcion maxima 526 nm. Rendimiento 47 mmol (70%).
Tinte (I-7) I-4-NHS
15 Esquema de reaccion
Preparacion:
El tinte (1-4) se seco bajo alto vado durante la noche luego se tomo 28 mg de muestra. Se agrego DMF anhidro (3 mL) 5 y base de Hunig al matraz. La mezcla se hizo mas inocolora. Se agito la solucion de forma dclica durante aproximadamente 20 min bajo atmosfera de nitrogeno. Luego se agrego TSTU (25 mg). Se desarrollo color rosado claro. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1h. El progreso se verifico mediante TLC, (20% en H2O en MeCN). NHS-ester Rf~0.7. Se completa la actividad en 2h.
10 El NHS ester (I-7) preparado de esta forma se utilizo para acoplamiento sin purificacion adicional y aislamiento de la solucion. Si se necesita el NHS ester se puede aislar de la solucion mediante precipitacion con acetato de etilo, filtrar y secar.
Tinte (I-8)I-4-PEG12 15
Esquema de reaccion:
Una solucion de NH2Peg12COOH (100 mg) en agua (300 jL) se agrego a la solucion de (I-7) preparada como se 5 describio anteriormente y esta mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche. La terminacion de la reaccion (consumo de NHS ester) luego se verifica mediante TLC (20% en H2O en acetonitrilo, la placa se seco en vado). Para tratamiento final se agrego 0.1 TEAB 1 M en agua (4 mL) y la mezcla se agito a ~20°C durante 1 h. Los solventes se eliminaron bajo vado. El residuo se disolvio en 10 ml de TEAB 0.1 M. Esta solucion se filtro a traves de un filtro de jeringa de 0.2 nm de tamano de poro y se transfirio en dos frascos de HPLC de 5 mL para purificacion mediante 10 HPLC. El producto se purifico mediante HPLC utilizando columna de fase inversa C18 con acetonitrilo TEAB 0.1 M. Se recolectaron fracciones con absorcion maxima 520 nm. Rendimiento 41 mmol (76 %).
Tinte (I-9) pppG-I-3-PEG12
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Esquema de Reaccion:
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DMA anhidro (7 mL) y base de Hunig (0.082 mL) se agregaron a la muestra seca (52 mg) de (I-6). Luego se agrego una solucion de TSTU (17 mg) en 1 mL de DMA seco. Se enjuago el sistema dos veces con nitrogeno y luego la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1h, de acuerdo con TLC (20% en H2O en CH3CN) se completo la activacion. Una vez se inicio la activacion una solucion de pppG-LN3 (3 mL de solucion madre 3.5 mM) se vacio hasta secado. Despues de que se completo la activacion esta solucion se agrego a pppG. La reaccion se agito a temperatura ambiente bajo atmosfera de nitrogeno durante 3 h. Control de TLC en 20% en H2O en acetonitrilo. La mezcla de reaccion se enfrio a ~4°C con un bano de hielo, luego se agrego TEAB 0.1 M (4 mL) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 10 min.
Purificacion: La solucion se aplico a columna con ~20 g de de suspension de resina DEAE sephadex en solucion de TEAB 0.05 M y se lavo con TEAB de 0.1 M hasta 0.4 M. se combinaron las fracciones coloreadas, se coevaporaron con agua para eliminar mas TEAB y se vacio hasta secado.
El residuo se redisolvio luego en TEAB 0.1 M. Esta solucion se filtro a traves de un filtro de jeringa 0.2 nm de tamano de poro en un matraz corning, y luego se transfirio a frascos de alta recuperacion de 5 mL de HPLC para purificacion de HPLC. La solucion se puede almacenar en el congelador hasta purificacion. El producto se purifico mediante HPLC utilizando una columna de fase inversa C18 con acetonitrilo - TEAB 0.1 M como eluyentes, Se recolectaron fracciones con absorcion 525 nm. Rendimiento: 54 %.
Tinte (I-10) pppG-I-4-PEG12
Esquema de reaccion:
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El tinte (I-8) se seco despues de la segunda purificacion HPLC prep (3 mL) y se disolvio en DMA anhidro (3 mL) y luego se agrego la base de Hunig (0.036 g). Una solucion de TSTU (11 mg) en 1 mL de DMA seco se agrego posteriormente. La mezcla de reaccion se agito a temperature ambiente durante 3 h.
De acuerdo con TLC (20% en H2O en CH3CN) se contemplo la activacion.
Una solucion de pppG-LN3 (1.6 mL de stock 35.5 mM) se extrajo en vado hasta secado. Despues de activacion de (I-8) se completo esta solucion y se agrego a pppG. La reaccion se agito a temperature ambiente bajo atmosfera de nitrogeno durante 2 h. TLC (20% en H2O en acetonitrilo) control indicado el progreso de reaccion. La mezcla de reaccion se mantiene a ~4°C durante la noche, luego se agrego TEAB 0.1 M (4 mL) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 10 min.
Purificacion de intercambio ionico: esta solucion se aplico a columna con ~20 g de suspension de resina DEAE sephadex en solucion de TEAB 0.05 M y se lavo con TeAb de 0.1 M hasta 0.35 M.
Se combinaron fracciones de color eluidas en aproximadamente 0.35 M TEAB, se coevaporo con agua para eliminar mas TEAB y se vacio hasta secado.
Purificacion: similar al compuesto anterior. Rendimiento: 14 pmol (51 %).
Tinte (I-11) pppT-I-3
Esquema de reaccion
5 Se agrega DMA anhidro (15 mL) y Base de Hunig (0.06 mL) a la muestra seca del tinte (I-3) (60 mg). Se formo una solucion incolora de lactona IC. Una solucion de TSTU, (0.50 g) en 5 mL de DMA seco se agrego posteriormente a esta. Se desarrollo color rojo del ester activado (I-6). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1h, De acuerdo con TLC (20% en H2O en MeCN) se completo la activacion. Despues de que se completo la activacion se agrego esta solucion a la solucion de pppT-LN3 (0.23 g) en agua (10 mL). La mezcla de reaccion se agito a temperatura 10 ambiente bajo atmosfera de nitrogeno durante 3 h. El progreso de acoplamiento se verifico mediante TLC (20% en H2O en acetonitrilo). La mezcla de reaccion se enfrio a ~4°C con un bano de hielo, luego la solucion de TEAB 0.1 M (5 mL) se agrego en agua y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 10 min. La mezcla de reaccion se aplico a columna con ~50 g de suspension de resina sephadex DEAE en solucion de TEAB 0.05 M en agua y se lavo con TEAB (gradiente de concentracion de 0.1 M hasta 0.5 M). Se recolectaron fracciones coloreadas y se evaporaron luego se co- 15 evaporaron de nuevo con agua para eliminar mas TEAB y se vacio hasta secado. El residuo se redisolvio luego en TEAB 0.1 M. Esta solucion se filtro a traves de un filtro de jeringa 0.2 nm de tamano de poro en un matraz corning y se almaceno en el congelador. El producto se purifico mediante HPLC utilizando columna de fase inversa C18 con acetonitrilo- TEAB 0.1 M, se recolecto la fraccion con absorcion a 520 nm. Rendimiento 57 %.
20 Tinte (I-12)pppT-I-4
Esquema de reaccion:
Preparacion:
Se agregaron DMA anhidro (5 mL) y Base de Hunig (0.02 mL) a la muestra seca del tinte (I-4) (20 mg). Se formo una 5 solucion incolora de lactona IC. Se agrego posteriormente una solucion de TSTU, (0.175 g) en 1 mL de DMA seco a esta. Se desarrollo color rojo de ester activado (1-6). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 h, de acuerdo con el TLC (20% en H2O en MeCN) se completo la activacion. Despues de que se completo la activacion esta solucion se agrego a la solucion de pppT-LN3 (77 mg) en agua (3 mL). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente bajo atmosfera de nitrogeno durante 3h. El progreso del acoplamiento se verifico mediante TLC 10 (20% en H2O en acetonitrilo). La mezcla de reaccion se enfrio a ~4°C con un bano de hielo, luego se agrego solucion de
TEAB 0.1 M (2 mL) en agua y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 10 min. La mezcla de reaccion se aplico a columna con ~20 g de suspension de resina sephadex DEAE en solucion de TEAB 0.05 M en agua y se lavo con TEAB (gradiente de concentracion de 0.1 M hasta 0.5 M). Se recolectaron fracciones coloreadas y se evaporaron luego se coevaporaron de nuevo con agua para eliminar mas TEAB y se vaciaron hasta secado. El residuo se redisolvio 15 luego en TEAB 0.1M. Esta solucion se filtro a traves de un filtro de jeringa 0.2 nm de tamano de poro en un matraz corning y se almaceno en el congelador. El producto se purifico mediante HPLC utilizando columna de fase inversa C18 con acetonitrilo TEAB 0.1 M, se recolecto la fraccion con absorcion a 520 nm. Rendimiento 57 %.
Tinte (I-13) pppT-I-1
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Esquema de reaccion:
Preparacion:
Se agregaron DMA anhidro (10 mL) y base de Hunig (0.04 mL) a la muestra seca del tinte (I-1) (40 mg). Se formO una 5 soluciOn incolora de lactona IC. Se agregO posteriormente una soluciOn de TSTU, (0.35 g) en 5 mL de DMA seco a esta. se desarrollO color rojo del ester activado. La mezcla de reacciOn se agitO a temperatura ambiente durante 1 h. De acuerdo con TLC (20% en H2O en MeCN), se completO la activaciOn. Despues de que se completO la activaciOn esta soluciOn se agregO a la soluciOn de pppT-LN3 (0.18 g) en agua (10 mL). La mezcla de reacciOn se agitO a temperatura ambiente bajo atmOsfera de nitrOgeno durante 3 h. El progreso del acoplamiento se verificO mediante TLC (20% en H2O 10 en acetonitrilo). La mezcla de reacciOn se enfriO a ~4°C con un bano de hielo, luego se agregO una soluciOn de TEAB 0.1 M (5 mL) en agua y la mezcla se agitO a temperatura ambiente durante 10 min. La mezcla de reacciOn se aplicO a columna con ~50 g de suspensiOn de resina sephadex DEAE en soluciOn de TEAB 0.05 M en agua y se lavO con TEAB (gradiente de concentraciOn de 0.1 M hasta 0.5 M). Se recolectaron fracciones coloreadas y se evaporaron luego then se coevaporaron de nuevo con agua para eliminar mas TEAB y se vaciO hasta secado. El residuo luego se volviO a 15 disolver en TEAB 0.1 M. Esta soluciOn se filtrO a traves de un filtro de jeringa 0.2 nm de tamano de poro en un matraz corning y se almacenO en el congelador. El producto se purificO mediante HPLC utilizando columna de fase inversa C18 con acetonitrilo- TEAB 0.1 M, se recolectO fracciOn con absorciOn a 535 nm. Rendimiento 60%.
Tinte (I-14) pppT-I-2
Esquema de reacciOn
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Preparacion:
Se agregaron DMA anhidro (10 mL) y base de Hunig (0.04 mL) a la muestra seca del tinte (I-2) (40 mg). Se formO una soluciOn incolora de lactona IC. Se agregO posteriormente una soluciOn de TSTU, (0.35 g) en 5 mL de DMA seco a esta. Se desarrollO color rojo de ester activado. La mezcla de reacciOn se agitO a temperature ambiente durante 1 h. De acuerdo con TLC (20% en H2O en CH3CN), se completO la activaciOn. Despues de que se completO la activaciOn esta soluciOn se agregO a la soluciOn de pppT-LN3 (0.18 g) en agua (10 mL). La mezcla de reacciOn se agitO a temperatura ambiente bajo atmOsfera de nitrOgeno durante 3 h. Se monitorizO el progreso de la reacciOn de acoplamiento mediante TLC (20% en H2O en acetonitrilo). La mezcla de reacciOn se enfriO a ~4°C con un bano de hielo, luego se agregO una soluciOn de TEAB 0.1 M (5 mL) en agua y la mezcla se agitO a temperatura ambiente durante 10 min. La mezcla de reacciOn se aplicO a columna con ~50 g de suspensiOn de resina sephadex DEAE en soluciOn de TEAB 0.05 M en agua y se lavO con TEAB (gradiente de concentraciOn de 0.1 M hasta 0.5 M). Se recolectaron las fracciones coloreadas y se evaporaron luego se coevaporaron de nuevo con agua para eliminar mas TEAB y se vaciaron hasta secado. El residuo luego se volviO a disolver en TEAB 0.1 M. Esta soluciOn se filtrO a traves de un filtro de jeringa 0.2 nm de tamano de poro en un matraz corning y se almacenO en el congelador. El producto se purificO mediante HPLC utilizando columna de fase inversa C18 con acetonitrilo- TEAB 0.1M, se recolectO la fracciOn con absorciOn a 535 nm. Rendimiento 45 %.
CaracterizaciOn de nuevos tintes frente a tintes conocidos
Intensidad de temperatura
Se compararon las intensidades de fluorescencia normalizadas de soluciones de 1. 10-6 M de tintes (I-1) e (I-3) con el tinte comercialmente disponible Atto532 para la misma regiOn espectral a diferentes temperaturas. Se midiO la intensidad de los tintes a 20, 40 y 60°C. La Figura 1 muestra la intensidad relativa de los tintes a cada temperatura. El tinte comercial Atto532 muestra una mayor perdida de intensidad de fluorescencia a temperaturas mas altas con
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respecto a los tintes I-1 e I-3. La Figura 1 demuestra que la fluorescencia de los nuevos tintes en soluciones a base de agua es menos variable con la temperature.
Intensidad cuando se conjugan con nucleotidos
Se compararon espectros de fluorescencia normalizada de soluciones 1.10-6 M de conjugados de nucleobase de tinte (I- 13)-T y (I-11)-T con analogos estructurales cuando se conjuga pppT con un tinte comercialmente disponible Atto532.
La Figura 2 demuestra que la fluorescencia de los conjugados de nucleobase se basa en estos nuevos tintes en soluciones basadas en agua mayores que los tintes comercialmente disponibles cuando se excita por 532 nm de luz. El tinte 1-3 es mas brillante que el tinte atto 532 a la misma concentracion de nucleotidos. El tinte I-1 esta desplazado en rojo en comparacion con el tinte atto 532.
La Figura 3 demuestra que la fluorescencia de nuevos tintes en soluciones basadas en agua es menos fiable respecto sobre temperatura. Las intensidades de fluorescencia normalizadas soluciones 1.10-6 M de tintes cuando se conjuga con nucleobases, T-(I-11) y T-(I-13) en comparacion con el tinte comercialmente disponible Atto532 conjugado con la misma nucleobase T. Tanto los tintes I-1 como I-3 muestran una mayor intensidad de fluorescencia a temperaturas elevadas en comparacion con atto-532.
Datos de secuenciacion
La Figura 4 demuestra una mejor distincion de las senales de fluorescencia cuando una nucleobase se ha marcado con el nuevo tinte de acuerdo con la invencion (I-3) (carril 6) en comparacion con el fluoroforo estandar fijado cuando la misma nucleobase se ha conjugado con el tinte comercialmente disponible Atto532 (control 1). La Figura 4 muestra un grafico de intensidad roja frente a intensidad verde en una serie de secuenciacion de color Illumina 4. La mayor distancia entre los grupos de senales de tintes reduce las posibilidades de una llanada fallida, y por lo tanto aumenta la precision de la secuenciacion. El aumento en el brillo del tinte I-3 en comparacion con el tinte comercial significa que se mejoran los datos de secuenciacion.
Claims (15)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. Un compuesto de la formula (I) y mesomeros del mismo:
imagen1 En el que M+/- es un contraion comun, k es un entero desde 0 hasta 6, q es un entero desde 1 hasta 6,R1 es H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido,R2 es H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi- o alcoxi, o R2 junto con R1 o R5 es una cadena de carbonos o heterosustituida que forma un anillo,R3 es H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, carboxi, carboxamida, grupo hidroxi- o alcoxi o R3 junto con R4 o R6 es una cadena de carbonos o heterosustituida que forma un anillo,R4 es H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido,R5 y R6 son H, grupo alquilo o alquilo sustituido, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi,R8 es H, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi, grupo alquilo o alquilo sustituido o junto con R1 es un carbono o cadena de carbono heterosustituidos que forman un anillo,Rg es H, halogeno, grupo hidroxi- o alcoxi, grupo alquilo o alquilo sustituido o junto con R4 es un carbono o cadena de carbono heterosustituidos que forman un anillo,R7 es OR11 o NR11R12 en el que R11 y R12 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido,R13 es OR14 o NR14R15 en el que R14 y R15 son independientemente H, alquilo o un alquilo sustituido; arilo o un arilo sustituido, yR16 y R17 son independientemente H o un grupo alquilo, arilo o alquilo sustituido o arilo sustituido. - 2. El compuesto de la reivindicacion 1 en el que R16 es alquilo y R17 es alquilo, o R16 y R17 son H.
- 3. El compuesto de la reivindicacion 1 en el que R1, R4, R5, R6, R8 y Rg todos son H, R2 y R3 son H o CH3.
- 4. Un compuesto de la reivindicacion 1 en el que R1 se une a R2 o R8 a traves de una cadena de grupos CH2 para formar un anillo, y R4 se une a R3 o Rg a traves de una cadena de grupos CH2 para formar un anillo.
- 5. Un compuesto de la reivindicacion 1 en el que uno o mas de R1, R4, R16 y R17 son grupos alquilo sustituidos con un grupo SO3'.
- 6. Un compuesto de reivindicaciones 1 a 5 en el que R7 es OH.510152025
- 7. Un compuesto de reivindicaciones 1
- 8. Un compuesto de reivindicaciones 1 un alquilo sustituido.
- 9. Un compuesto de la reivindicacion 8 en el que el compuesto se adhiere a un nucleotido u oligonucleotido a traves de grupo alquilo sustituido R15.
- 10. Un nucleotido u oligonucleotido marcado con un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9.
- 11. Un nucleotido u oligonucleotido marcado de acuerdo con la reivindicacion 10 en el que el marcador se adhiere a la posicion C5 de una base de pirimidina o la posicion C7 de una base de 7-deaza purina a traves de un grupo funcional enlazador.
- 12. Un nucleotido u oligonucleotido marcado de acuerdo con las reivindicaciones 10 o 11, que adicionalmente comprende un grupo de bloqueo 3' OH unido covalentemente al azucar de ribosa o desoxirribosa del nucleotido.
- 13. Un kit que comprende dos o mas nucleotidos en el que por lo menos un nucleotido es un nucleotido marcado de acuerdo con las reivindicaciones 10 a 12.a 6 en el que q es 3.a 7 en el que R13 es OH o NR14R15 en el que R14 es H o alquilo y R15 es alquilo o
- 14. Uso de un nucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, un oligonucleotido de acuerdo con las reivindicaciones 10 a 12 o un kit de acuerdo con la reivindicacion 13 en secuenciacion, analisis de expresion, analisis de hibridacion, analisis genetico, analisis de ARN o ensayos de union de protema.
- 15. Un metodo para sintetizar un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 a partir de derivado de acido ftalico de la formula Xa o Xb
imagen2 en la que q es 1 a 6.
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