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ES2609016T3 - Anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a BLyS - Google Patents

Anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a BLyS Download PDF

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ES2609016T3
ES2609016T3 ES10185178.0T ES10185178T ES2609016T3 ES 2609016 T3 ES2609016 T3 ES 2609016T3 ES 10185178 T ES10185178 T ES 10185178T ES 2609016 T3 ES2609016 T3 ES 2609016T3
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amino acid
polypeptide
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Steven M. Ruben
Steven C. Barash
Gil H. Choi
Tristan Vaughan
David Hilbert
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Human Genome Sciences Inc
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Publication date
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Abstract

Un anticuerpo humano o humanizado que neutraliza se une a la Proteína Estimuladora de Linfocitos B o un fragmento funcional del mismo, en el que dicho anticuerpo es (a) un anticuerpo humano que se une a la Proteína Estimuladora de Linfocitos B en el que el anticuerpo comprende los restos de aminoácidos 26-35, 50-66, 99-112, 163-173, 189-195 y 228-238 de la SEQ ID NO: 327; (b) un anticuerpo monoclonal humano o humanizado que inhibe competitivamente la unión del anticuerpo producido por la línea celular que tiene el Número de Depósito ATCC PTA-3240 a la Proteína Estimuladora de Linfocitos B; o (c) un anticuerpo monoclonal humano o humanizado que reduce la unión del anticuerpo producido por la línea celular que tiene el Número de Depósito ATCC PTA-3240 a la Proteína Estimuladora de Linfocitos B mediante un aumento dentro de un intervalo en porcentaje seleccionado del grupo que consiste en: (a) del 50 % hasta el 60 %; (b) del 60 % hasta el 70 %; (c) del 70 % hasta el 80 %; (d) del 80 % hasta el 90 %; y (e) del 90 % hasta el 100 %.

Description

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materia, por ejemplo, los inmunoensayos descritos en los Ejemplos a continuación.
Los anticuerpos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, multiespecíficos, humanos o quiméricos, de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id contra anticuerpos de la presente invención) y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. Las moléculas de inmunoglobulina de la presente invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA4 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.
Un anticuerpo de la presente invención "que se une a la forma soluble de BLyS" es uno que se une a la forma soluble de 152 aminoácidos de la proteína BLyS (aminoácidos 134-285 de la SEQ ID NO: 3228). En realizaciones específicas de la presente invención, un anticuerpo de la presente invención "que se une a la forma soluble de BLyS" no se une también a la forma unida a membrana o asociada a membrana de BLyS. Los ensayos que miden la unión a la forma soluble de BLyS incluyen, pero no se limitan a, el ensayo de inhibición de la unión a receptor o la captura de BLyS soluble a partir de una solución, como se describen en los Ejemplos 8 y 9.
Un anticuerpo de la presente invención "que se une a la forma unida a membrana de BLyS" es uno que se une a la proteína BLyS asociada a membrana (no escindida). En realizaciones específicas de la presente invención, un anticuerpo de la presente invención "que se une a la forma unida a membrana de BLyS" no se une también a la forma soluble de BLyS. La unión a BLyS marcado con HIS (como se describe en el presente documento) en un ELISA es un indicador de que un anticuerpo se une a la forma unida a membrana de BLyS, pero no debería confiarse en la misma como prueba de la especificidad por la forma unida a membrana de BLyS. Los ensayos en los que puede confiarse como prueba de la especificidad de un anticuerpo por BLyS unido a membrana incluyen, pero no se limitan a, la unión a membranas plasmáticas que expresan BLyS que se describe en el Ejemplo 2. Un anticuerpo de la presente invención "que se une tanto a la forma soluble como a la forma unida a membrana de BLyS" es uno que se une tanto a la forma unida a membrana como a la forma soluble de BLyS.
El término "variante" como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que posee una función idéntica o similar a la de un polipéptido de BLyS, un fragmento de BLyS, un anticuerpo anti-BLyS o fragmento de anticuerpo del mismo, pero que no comprende necesariamente una secuencia de aminoácidos idéntica o similar a un polipéptido de BLyS, un fragmento de BLyS, un anticuerpo anti-BLyS o fragmento de anticuerpo del mismo, o posee una estructura idéntica o similar a la de un polipéptido de BLyS, un fragmento de BLyS, un anticuerpo anti-BLyS o fragmento de anticuerpo del mismo. Una variante que tiene un aminoácido similar se refiere a un polipéptido que cumple al menos uno de los siguientes: (a) un polipéptido que comprende, o alternativamente consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de BLyS, un fragmento de BLyS, un anticuerpo anti-BLyS o fragmento de anticuerpo del mismo (incluyendo un dominio VH, VHCDR, dominio VL o VLCDR que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las mencionadas en la Tabla 1) descrito en el presente documento;
(b) un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos, cuya secuencia complementaria hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de BLyS (por ejemplo, la SEQ ID NO: 3228), un fragmento de BLyS, un anticuerpo anti-BLyS o fragmento de anticuerpo del mismo (incluyendo un dominio VH, VHCDR, dominio VL o VLCDR que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las mencionadas en la Tabla 1), descrito en el presente documento, de al menos 5 restos aminoacídicos, al menos 10 restos aminoacídicos, al menos 15 restos aminoacídicos, al menos 20 restos aminoacídicos, al menos 25 restos aminoacídicos, al menos 30 restos aminoacídicos, al menos 40 restos aminoacídicos, al menos 50 restos aminoacídicos, al menos 60 restos aminoacídicos, al menos 70 restos aminoacídicos, al menos 80 restos aminoacídicos, al menos 90 restos aminoacídicos, al menos 100 restos aminoacídicos, al menos 125 restos aminoacídicos o al menos 150 restos aminoacídicos; y (c) un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % con la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de BLyS, un fragmento de BLyS, un anticuerpo anti-BLyS o un fragmento de anticuerpo del mismo (incluyendo un dominio VH, VHCDR, dominio VL o VLCDR que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las mencionadas en la Tabla 1), descrito en el presente documento. Un polipéptido con una estructura similar a un polipéptido de BLyS, un fragmento de BLyS, un anticuerpo anti-BLyS o fragmento de anticuerpo del mismo, descrito en el presente documento se refiere a un polipéptido que tiene una estructura secundaria, terciaria o cuaternaria similar a la de un polipéptido de BLyS, un fragmento de BLyS, un anticuerpo anti-BLyS o fragmento de anticuerpo del mismo, descrito en el presente documento. La estructura de un polipéptido puede determinarse por procedimientos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo, pero sin limitación, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear y microscopía electrónica cristalográfica.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean con el fin de una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para un alineamiento óptimo con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico). Los restos aminoacídicos o nucleótidos en posiciones
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La expresión "proteína de fusión", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende, o alternativamente consiste en, una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-BLyS de la presente invención y una secuencia de aminoácidos de un polipéptido heterólogo (es decir, un polipéptido no relacionado con un anticuerpo o dominio de anticuerpo).
La expresión "célula hospedadora", como se usa en el presente documento, se refiere a la célula objeto particular transfectada con una molécula de ácido nucleico y a la progenie o progenie potencial de dicha célula. La progenie puede no ser idéntica a la célula parental transfectada con la molécula de ácido nucleico debido a mutaciones o influencias ambientales que puedan producirse en generaciones sucesivas o a la integración de la molécula de ácido nucleico en el genoma de la célula hospedadora.
Descripción de las figuras
Figura 1. Resultados de ELISA para tres scFv, I006E07, I008D05 y I016F04, que se unen inmunoespecíficamente a membranas de U937 pero que no se unen a ni presentan reactividad cruzada con TNF-alfa o BSA. Figura 2. Los resultados para tres scFv, I016H07, I001C09 y I018D07, en un ensayo de inhibición de receptor. Figura 3. Resultados de ELISA para dos scFv (I022D01 y I031F02) que demuestran su capacidad para unirse a BLyS humano y presentar reactividad cruzada con BLyS de ratón, pero no unirse a o presentar reactividad cruzada con otros antígenos de la familia de ligandos del TNF. Figura 4. Resultados de ELISA para tres scFv (I031F09, I050A12 y I051C04) que se unen a membranas plasmáticas de U937 cuando se usa BLyS o TNF-alfa como competidor. Figura 5. Análisis cinético del anticuerpo scFv I003C02. Se muestran una serie de diluciones de I003C02 de 3 nM a 825 nM. Las curvas de asociación y disociación se generaron usando un software BIAcore 2000 y BIAevaluation 3.0. Figura 6. Se muestran las curvas de titulación típicas para dos anticuerpos scFv (I007F11 y I050A07) en la Figura 6. El BLyS no marcado competía por la unión a su receptor con un valor de CI50 de 0,8 nM. Los valores de CI50 para I007F11 y I050A07 son de 7,9 nM y 17,1 nM, respectivamente. El ensayo se realizó por triplicado y se muestran las barras de los errores típicos. Figura 7. Resultados de ELISA para tres clones de scFv (I074B12, I075F12 y I075A02) que se unen inmunoespecíficamente a BLyS inmovilizado pero no a membranas plasmáticas de U937, TNF-alfa o BSA. Como control, también se muestra en la Figura 7 un anticuerpo de fago que reconoce el TNF-alfa. Figura 8. Los resultados para dos scFv (I025B09 y I026C04) en un ensayo de inhibición de receptor. Figura 9. Resultados de ELISA para dos clones de scFv (I067F05 y I078D02) que demuestran su capacidad para unirse a BLyS humano inmovilizado y presentar reactivada cruzada con BLyS de ratón inmovilizado, pero no para unirse a ni presentar reactividad cruzada con otros antígenos de la familia de ligandos del TNF. Como control, también se muestra en la Figura 7 un anticuerpo de fago que reconoce el TNF-alfa. Figura 10. Análisis cinético del anticuerpo scFv I002A01. Se muestran una serie de diluciones de I002A01 de 3 nM a 1650 nM. Las curvas de asociación y disociación se generaron usando un software BIAcore 2000 y BIAevaluation 3.0. Figura 11. Se muestran las curvas de titulación típicas para dos scFv, I0068C06 y I074B12, en la Figura 11. El BLyS no marcado competía por la unión a su receptor con un valor de constante de inhibición 50 (CI50) de 0,66 nM. Los valores de CI50 para I0068C06 y I074B12 son de 61 nM y 13 nM, respectivamente. El ensayo se realizó por triplicado y se muestran las barras de los errores típicos. Figura 12. Resultados de ELISA para tres clones (I079C01, I081C10 y 1082A02) que demuestran su capacidad para unirse a BLyS marcado con histidina, membranas plasmáticas de U937, pero no unirse a BLyS biotinilado inmovilizado. Figura 13. Resultados de ELISA para tres scFv (I079B04, I079F08 y I080B01) que se unen a membranas plasmáticas de U937 cuando se usa BLyS marcado con histidina o BLyS biotinilado como competidor. Figura 14. Se muestra un ejemplo de la sección de disociación de un sensograma típico para 8 scFv en la Figura
14. Se incluyó como control un anticuerpo anti-TNFOC que no reconoce el BLyS. De los 8 scFv ejemplificados, el I079F06 se identificó para un estudio adicional debido a las cantidades relativamente elevadas de UR unidas a la superficie. Figura 15. Se muestra un ejemplo típico de las curvas de unión generadas para el anticuerpo scFv I082C03 en la Figura 15. La velocidad de disociación para este clon se calculó como de 2 x 10-3 s-1. La afinidad de I082C03 se calculó como de 20 nM, asumiendo una actividad de 100 % del scFv. Figura 16. Resultados de ELISA para tres scFv (I079B04, I079F08 y I080B01) que se unen a membranas plasmáticas de P388 cuando se usa BLyS marcado con histidina o BLyS biotinilado como competidor.
Descripción detallada de la invención
En el presente documento se describen anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespecíficamente a BLyS o un fragmento o variante de BLyS. En particular, se describen en el presente documento anticuerpos tales como, por ejemplo, Fv de cadena sencilla (scFv) que tienen una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 -2128, a las que se hace referencia en la Tabla 1. En particular, en el presente documento se describen anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido, un fragmento polipeptídico o variante, o un
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epítopo de BLyS humano (SEQ ID NO: 3228 y/o 3229) o BLyS expresado en monocitos humanos; BLyS murino (SEQ ID NO: 3230 y/o 3231) o BLyS expresado en monocitos murinos; BLyS de rata (las formas solubles como se proporcionan en las SEQ ID NO: 3232, 3233, 3234 y/o 3235 o en una forma asociada a membrana, por ejemplo, en la superficie de monocitos de rata); o BLyS de mono (por ejemplo, los polipéptidos de BLyS de mono de la SEQ ID NO: 3236 y/o 3237, la forma soluble de BLyS de mono o BLyS expresado en monocitos de mono) (según se determina por inmunoensayos conocidos en la técnica para ensayar la unión específica de antígeno-anticuerpo).
La secuencia polipeptídica mostrada en la SEQ ID NO: 3228 se obtuvo por secuenciación y traducción del ADNc del clon HNEDU15 que se depositó el 22 de octubre de 1996 en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20100-2209, y al que se le asignó el N.° de acceso de la ATCC 97768. El clon depositado está contenido en el plásmido pBluescript SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA). Los depósitos de la ATCC se realizaron conforme a los términos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes.
La secuencia polipeptídica mostrada en la SEQ ID NO: 3229 se obtuvo por secuenciación y traducción del ADNc del clon HDPMC52, que se depositó el 10 de diciembre de 1998 en la Colección Americana de Cultivos Tipo, y al que se le asignó el N.° de acceso de la ATCC 203518. El clon depositado está contenido en el plásmido pBluescript SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA). Los depósitos de la ATCC se realizaron conforme a los términos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes.
Los polipéptidos de BLyS unidos por los anticuerpos descritos en el presente documento pueden estar en monómeros o multímeros (es decir, dímeros, trímeros, tetrámeros y multímeros superiores). Por consiguiente, en el presente documento se describen anticuerpos que se unen a monómeros y multímeros de los polipéptidos de BLyS de la presente invención, su preparación y composiciones (preferentemente composiciones farmacéuticas) que los contienen. Específicamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros de BLyS. Adicionalmente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a al menos dímeros, al menos trímeros o al menos tetrámeros de BLyS.
El BLyS multimérico unido por los anticuerpos descritos en el presente documento puede ser un homómero o heterómero. Un homómero de BLyS se refiere a un multímero que contiene sólo polipéptidos de BLyS (incluyendo fragmentos, variantes y proteínas de fusión de BLyS, como se describen en el presente documento). Estos homómeros pueden contener polipéptidos de BLyS que tienen secuencias de aminoácidos idénticas o diferentes. Específicamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a un homodímero de BLyS (por ejemplo, que contiene dos polipéptidos de BLyS que tienen secuencias de aminoácidos idénticas o diferentes) o un homotrímero de BLyS (por ejemplo, que contiene tres polipéptidos de BLyS que tienen secuencias de aminoácidos idénticas o diferentes). Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a un homotrímeros de BLyS. Además, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a un multímero de BLyS homomérico que es al menos un homodímero, al menos un homotrímero o al menos un homotetrámero.
El BLyS heteromérico se refiere a un multímero que contiene polipéptidos heterólogos (es decir, polipéptidos de una proteína diferente) además de los polipéptidos de BLyS descritos en el presente documento. Específicamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a un heterodímero, un heterotrímero o un heterotetrámero de BLyS. Además, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a un multímero de BLyS heteromérico que es al menos un heterodímero, al menos un heterotrímero o al menos un heterotetrámero. De forma altamente preferible, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a un heterotrímero que comprende tanto polipéptidos de BLyS como polipéptidos de APRIL (SEQ ID NO: 3239; N.° de Acceso GenBank AF046888; Publicación Internacional PCT Número WO97/33902; J. Exp. Med. 188(6):11851190) o fragmentos o variantes de los mismos. También de forma altamente preferible, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a un heterotrímero que comprende un polipéptido de BLyS (incluyendo fragmentos o variantes) y dos polipéptidos de APRIL (incluyendo fragmentos o variantes). También de forma altamente preferible, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a un heterotrímero que comprende dos polipéptidos de BLyS (incluyendo fragmentos o variantes) y un polipéptido de APRIL (incluyendo fragmentos o variantes). En un aspecto adicional no excluyente, los heterómeros unidos por los anticuerpos que se describen en el presente documento contienen una secuencia o secuencias polipeptídicas de ligando de CD40 o un fragmento o fragmentos biológicamente activos o una variante o variantes de las mismas.
Particularmente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipéptidos de BLyS homoméricos, especialmente homotriméricos, en los que los componentes proteicos individuales de los multímeros consisten en la forma madura de BLyS (por ejemplo, los restos aminoacídicos 134-285 de la SEQ ID NO: 3228 o los restos aminoacídicos 134-266 de la SEQ ID NO: 3229) o fragmentos o variantes de la misma. Específicamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipéptidos de BLyS heteroméricos, especialmente heterotriméricos, tales como un heterotrímero que contiene dos polipéptidos de BLyS y un polipéptido de APRIL o un heterotrímero que contiene un polipéptido de BLyS y dos polipéptidos de APRIL, y en los que los componentes proteicos individuales del heterómero de BLyS consisten en la porción soluble extracelular madura de BLyS (por ejemplo, los restos aminoacídicos 134-285 de la SEQ ID NO: 3228 o los restos aminoacídicos 134-266 de
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la SEQ ID NO: 3229) o fragmentos o variantes de la misma, o la porción soluble extracelular madura de APRIL (por ejemplo, los restos aminoacídicos 105-250 de la SEQ ID NO: 3239) o fragmentos o variantes de la misma.
Específicamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a epítopos conformacionales de una proteína monomérica de BLyS. Específicamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a epítopos conformacionales de una proteína multimérica de BLyS, especialmente trimérica. En otros aspectos, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a epítopos conformacionales que surgen de la yuxtaposición de BLyS con un polipéptido heterólogo, como el que podría estar presente cuando BLyS forma heterotrímeros (por ejemplo, con polipéptidos de APRIL (por ejemplo, la SEQ ID NO: 3239) o en proteínas de fusión entre BLyS y un polipéptido heterólogo.
Los multímetros de BLyS unidos por los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser el resultado de asociaciones hidrófobas, hidrófilas, iónicas y/o covalentes y/o pueden unirse indirectamente, por ejemplo, mediante la formación de liposomas. Por lo tanto, en un aspecto, se forman multímeros de BLyS, tales como, por ejemplo, homodímeros u homotrímeros, cuando los polipéptidos que se describen en el presente documento contactan entre sí en solución. En otro aspecto, se forman heteromultímeros de BLyS, tales como, por ejemplo, heterotrímeros de BLyS o heterotetrámeros de BLyS, cuando los polipéptidos que se describen en el presente documento contactan con anticuerpos contra los polipéptidos (incluyendo anticuerpos contra la secuencia polipeptídica heteróloga en una proteína de fusión que se describe en el presente documento) en solución. Se forman multímeros de BLyS por asociaciones covalentes con y/o entre los polipéptidos de BLyS que se describen en el presente documento. Dichas asociaciones covalentes pueden implicar uno o más restos aminoacídicos contenidos en la secuencia polipeptídica (por ejemplo, la enumerada en la SEQ ID NO: 3228 o SEQ ID NO: 3229). En un caso, las asociaciones covalentes son entrecruzamientos entre restos de cisteína localizados dentro de las secuencias polipeptídicas que interaccionan en el polipéptido nativo (es decir, de origen natural). En otro caso, las asociaciones covalentes son la consecuencia de una manipulación química o recombinante. Alternativamente, dichas asociaciones covalentes pueden implicar uno o más restos aminoacídicos contenidos en la secuencia polipeptídica heteróloga en una proteína de fusión de BLyS. En un ejemplo, las asociaciones covalentes son entre la secuencia heteróloga contenida en una proteína de fusión (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Número 5.478.925). En un ejemplo específico, las asociaciones covalentes son entre la secuencia heteróloga contenida en una proteína de fusión de BLyS-Fc. En otro ejemplo específico, las asociaciones covalentes de proteínas de fusión de la presente invención son entre una secuencia polipeptídica heteróloga de otro miembro ligando/receptor de la familia del TNF que es capaz de formar multímeros asociados covalentemente, tales como, por ejemplo, la osteoprotegerina (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional N.° WO 98/49305). En otro ejemplo específico, las asociaciones covalentes de proteínas de fusión como se describen en el presente documento son entre una secuencia polipeptídica heteróloga de CD40L o un fragmento soluble del mismo. En otro aspecto, dos o más polipéptidos de BLyS se unen a través de enlazadores sintéticos (por ejemplo, enlazadores peptídicos, de carbohidrato o polímeros solubles). Los ejemplos incluyen los enlazadores peptídicos descritos en la Patente de EE.UU. N.º 5.073.627. Pueden producirse proteínas que comprenden múltiples polipéptidos de BLyS separados por enlazadores peptídicos usando la tecnología de ADN recombinante convencional.
En un aspecto, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido de BLyS que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3228 o que está codificado por el clon de ADNc contenido en la ATCC N.º 97768, o un polipéptido que comprende una porción (es decir, un fragmento) de los polipéptidos anteriores. También se describe en el presente documento un anticuerpo que se une a un polipéptido de BLyS aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3229 o la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc contenido en la ATCC N.º 203518, o un anticuerpo que se une a un polipéptido que comprende una porción (es decir, fragmento) de los polipéptidos anteriores.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento también se unen inmunoespecíficamente a polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3228 codificada por el ADNc contenido en el plásmido que tiene el número de acceso de la ATCC 97768, o codificada por ácidos nucleicos que hibridan (por ejemplo, en condiciones de hibridación rigurosas) con la secuencia de nucleótidos contenida en el clon depositado. Los anticuerpos de la presente invención también se unen a fragmentos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3228, codificada por el ADNc contenido en el plásmido que tiene el número de acceso de la ATCC 97768, o codificada por los ácidos nucleicos que hibridan (por ejemplo, en condiciones de hibridación rigurosas) con la secuencia de nucleótidos contenida en el clon depositado.
Adicionalmente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3229, codificada por el ADNc contenido en el plásmido que tiene el número de acceso de la ATCC 203518, o codificada por ácidos nucleicos que hibridan (por ejemplo, en condiciones de hibridación rigurosas) con la secuencia de nucleótidos contenida en el clon depositado. Los anticuerpos que se describen en el presente documento también se unen a fragmentos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3229, codificada por el ADNc contenido en el plásmido que tiene el número de acceso de la ATCC 203518, o codificada por ácidos nucleicos que hibridan (por ejemplo, en condiciones de hibridación rigurosas) con la secuencia de nucleótidos contenida en el clon depositado.
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Además, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipéptidos o fragmentos polipeptídicos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoácidos contenida en las SEQ ID NO: 3230 a 3237.
Específicamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen inmunoespecíficamente a fragmentos polipeptídicos, incluyendo polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoácidos contenida en la SEQ ID NO: 3228, codificada por el ADNc contenido en el clon depositado, o codificada por ácidos nucleicos que hibridan (por ejemplo, en condiciones de hibridación rigurosas) con la secuencia de nucleótidos contenida en el clon depositado. Los fragmentos proteicos pueden ser "independientes" o estar comprendidos dentro de un polipéptido de mayor tamaño, del que el fragmento constituye una parte o región, más preferentemente como una sola región continua. Los ejemplos representativos de fragmentos polipeptídicos que pueden unirse por los anticuerpos de la presente invención incluyen, por ejemplo, fragmentos que comprenden, o alternativamente consisten en aproximadamente los restos aminoacídicos: 1 a 50, 51 a 100, 101 a 150, 151 a 200, 201 a 250 y/o 251 a 285 de la SEQ ID NO: 3228. Además, los fragmentos polipeptídicos pueden tener una longitud de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175 o 200 aminoácidos.
Específicamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a fragmentos polipeptídicos que comprenden, o alternativamente consisten en los restos aminoacídicos: 1-46, 31-44, 47-72, 73-285, 73-83, 94102, 148-152, 166-181, 185-209, 210-221, 226-237, 244-249, 253-265 y/o 277-285 de la SEQ ID NO: 3228.
Un experto en la materia reconocerá que las mutaciones dirigidas a regiones de un polipéptido de BLyS de SEQ ID NO: 3228 que incluyen la inserción de diecinueve restos aminoacídicos que no se encuentra en la secuencia polipeptídica de BLyS de SEQ ID NO: 3229 (es decir, los restos aminoacídicos Val-142 a Lys-160 de la secuencia de SEQ ID NO: 3229) pueden afectar a las actividades biológicas observadas del polipéptido de BLyS. Más específicamente, una lista parcial, no limitante y no excluyente de dichos restos de la secuencia polipeptídica de BLyS a los que pueden dirigirse mutaciones incluye los restos aminoacídicos siguientes de la secuencia polipeptídica de BLyS, como se muestra en la SEQ ID NO: 3228: V-142; T-143; Q-144; D-145; C-14 6;L-147; Q-148; L-149; 1-150; A-151; D-152; S-153; E-154; T-155; P-156; T-157; 1-158; Q-159; y K-160. Específicamente, se contemplan los anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen a polipéptidos de BLyS que tienen una o más mutaciones en la región de V-142 a K-160 de la SEQ ID NO: 3228.
Los fragmentos polipeptídicos pueden ser "independientes" o estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande, del que el fragmento constituye una parte o región, más preferentemente como una sola región continua. Los ejemplos representativos de fragmentos polipeptídicos que pueden unirse por anticuerpos de la presente invención incluyen, por ejemplo, fragmentos que comprenden, o alternativamente consisten en aproximadamente los restos aminoacídicos: 1 a 15, 16-30, 31-46, 47-55, 56-72, 73-104, 105-163, 163-188, 186-210 y 210-284 de la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 3228. Los ejemplos representativos adicionales de fragmentos polipeptídicos que pueden unirse por anticuerpos de la presente invención incluyen, por ejemplo, fragmentos que comprenden, o alternativamente consisten en aproximadamente los restos aminoacídicos: 1 a 143, 1-150, 47-143, 47-150, 73-143, 73-150, 100-150, 140-145, 142-148, 140-150, 140-200, 140-225 y 140-266 de la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 3229. Además, los fragmentos polipeptídicos que pueden unirse por anticuerpos de la presente invención pueden tener una longitud de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175 o 200 aminoácidos. En este contexto, "aproximadamente" se refiere a los intervalos particularmente enumerados y a intervalos mayores o menores por varios, unos pocos, 5, 4, 3, 2 o 1 restos aminoacídicos en cualquiera o ambos extremos amino-y carboxi-terminales.
También se describen en el presente documento anticuerpos que se unen a fragmentos polipeptídicos que comprenden, o alternativamente consisten en el dominio intracelular predicho de BLyS (por ejemplo, los restos aminoacídicos 1-46 de la SEQ ID NO: 3228), el dominio transmembrana predicho de BLyS (por ejemplo, los restos aminoacídicos 47-72 de la SEQ ID NO: 3228), el dominio extracelular predicho de BLyS (por ejemplo, los restos aminoacídicos 73-285 de la SEQ ID NO: 3228), el dominio extracelular soluble maduro de BLyS (por ejemplo, los restos aminoacídicos 134-285 de la SEQ ID NO: 3228), el dominio conservado de TNF predicho de BLyS (por ejemplo, los aminoácidos 191 a 284 de la SEQ ID NO: 3228) y un polipéptido que comprende, o como alternativa consiste en el dominio intracelular predicho fusionado al dominio extracelular predicho de BLyS (los restos aminoacídicos 1-46 fusionados a los restos aminoacídicos 73-285 de la SEQ ID NO: 3228).
Adicionalmente se describen en el presente documento fragmentos polipeptídicos que comprenden, o alternativamente consisten en el dominio intracelular predicho de BLyS (restos aminoacídicos 1-46 de la SEQ ID NO: 3229), el dominio transmembrana predicho de BLyS (restos aminoacídicos 47-72 de la SEQ ID NO: 3229), el dominio extracelular predicho de BLyS (restos aminoacídicos 73-266 de la SEQ ID NO: 3229), el dominio conservado de TNF predicho de BLyS (aminoácidos 172 a 265 de la SEQ ID NO: 3229) y un polipéptido que comprende, o alternativamente consiste en el dominio intracelular predicho fusionado al dominio extracelular predicho de BLyS (los restos aminoacídicos 1-46 fusionados a los restos aminoacídicos 73-266 de la SEQ ID NO: 3229).
Ciertos aspectos adicionales de la presente memoria descriptiva describen anticuerpos que se unen a fragmentos polipeptídicos que comprenden, o alternativamente consisten en, las regiones de lámina beta plegada predichas de
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los polipéptidos de BLyS de las SEQ ID NO: 3228 y SEQ ID NO: 3229. Estos fragmentos polipeptídicos que comprenden las láminas beta plegadas de BLyS comprenden, o alternativamente consisten en, los restos aminoacídicos Gln-144 a Ala-151, Phe-172 a Lys-173, Ala-177 a Glu-179, Asn-183 a Ile-185, Gly-191 a Lys-204, His-210 a Val-219, Leu-226 a Pro-237, Asn-242 a Ala-251, Gly-256 a Ile-263 y/o Val-276 a Leu-284 de la SEQ ID NO: 3228. En otro aspecto no excluyente, estos fragmentos polipeptídicos que comprenden las láminas beta plegadas de BLyS comprenden, o alternativamente consisten en los restos aminoacídicos Phe-153 a Lys-154, Ala158 a Glu-160, Asn-164 a Ile-166, Gly-172 a Lys-185, His-191 a Val-200, Leu-207 a Pro-218, Asn-223 a Ala-232, Gly-237 a Ile-244 y/o Val-257 a Leu-265 de la SEQ ID NO: 3229.
Una lista parcial no limitante y ejemplar de polipéptidos que pueden unirse por los anticuerpos descritos en el presente documento incluye polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en combinaciones de secuencias de aminoácidos de la presente invención, incluye, por ejemplo, [Met-1 a Lys-133] fusionado a [Leu-114 a Thr-141] fusionado a [Val-142 a Lys-160] fusionado a [Gly-161 a Gln-198] fusionado a [Val-199 a Ala-248] fusionado a [Gly-249 a Leu-285] de la SEQ ID NO: 3228; o [Met-1 a Lys-113] fusionado a [Val-142 a Lys-160] fusionado a [Gly161 a Gln-198] fusionado a [Val-199 a Ala-248] fusionado a [Gly-249 a Leu-285] de la SEQ ID NO: 3228; o [Met-1 a Lys-113] fusionado a [Leu-114 a Thr-141] fusionado a [Val-142 a Lys-160] fusionado a [Gly-161 a Gln-198] fusionado a [Gly-249 a Leu-285] de la SEQ ID NO: 3228. Otras combinaciones de secuencias de aminoácidos que pueden unirse por los anticuerpos de la presente invención pueden incluir los fragmentos polipeptídicos en un orden distinto del enumerado anteriormente (por ejemplo, [Leu-114 a Thr-141] fusionado a [Val-199 a Ala-248] fusionado a [Gly-249 a Leu-285] fusionado a [Val-142 a Lys-160] de (SEQ ID NO: 3228). Otras combinaciones de secuencias de aminoácidos que pueden unirse por los anticuerpos de la presente invención pueden incluir también fragmentos polipeptídicos heterólogos como se describen en el presente documento y/u otros polipéptidos o fragmentos polipeptídicos descritos en el presente documento (por ejemplo, [Met-1 a Lys-113] fusionado a [Leu-114 a Thr-141] fusionado a [Val-142 a Lys-160] fusionado a [Gly-161 a Gln-198] fusionado a [Gly-249 a Leu-285] de la SEQ ID NO: 3228 fusionado a una etiqueta FLAG; o [Met-1 a Lys-113] de la SEQ ID NO: 3228 fusionado a [Leu-114 a Thr-141] de la SEQ ID NO: 3228 fusionado a [Glu-135 a Asn-165] de la SEQ ID NO: 39 fusionado a [Val-142 a Lys-160] de la SEQ ID NO: 3228 fusionado a [Gly-161 a Gln-198] de la SEQ ID NO: 3228 fusionado a [Val-199 a Ala-248] de la SEQ ID NO: 3228 fusionado a [Gly-249 a Leu-285] de la SEQ ID NO: 3228).
Una lista parcial, no limitante, y ejemplar de polipéptidos que pueden unirse por los anticuerpos descritos en el presente documento incluye polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en combinaciones de secuencias de aminoácidos, incluye, por ejemplo, [Met-1 a Lys-113] fusionado a [Leu-114 a Thr-141] fusionado a [Gly-142 a Gln-179] fusionado a [Val-180 a Ala-229] fusionado a [Gly-230 a Leu-266] de la SEQ ID NO: 3229; [Met-1 a Lys-113] fusionado a [Gly-142 a Gln-179] fusionado a [Val-180 a Ala-229] fusionado a [Gly-230 a Leu-266] de la SEQ ID NO: 3229; o [Met-1 a Lys-113] fusionado a [Leu-114 a Thr-141] fusionado a [Gly-142 a Gln-179] fusionado a [Gly-230 a Leu-266] de la SEQ ID NO: 3229. Otras combinaciones de secuencias de aminoácidos que pueden unirse por los anticuerpos descritos en el presente documento pueden incluir los fragmentos polipeptídicos en un orden distinto del enumerado anteriormente (por ejemplo, [Leu-114 a Thr-141] fusionado a [Val-180 a Ala-229] fusionado a [Gly-230 a Leu-266] fusionado a [Gly-142 a Gln-179] de la SEQ ID NO: 3229). Otras combinaciones de secuencias de aminoácidos que pueden unirse por los anticuerpos descritos en el presente documento pueden incluir también fragmentos polipeptídicos heterólogos como se describen en el presente documento y/u otros polipéptidos o fragmentos polipeptídicos de la presente invención (por ejemplo, [Met-1 a Lys-113] fusionado a [Leu114 a Thr-141] fusionado a [Gly-142 a Gln-179] fusionado a [Gly-230 a Leu-266] de la SEQ ID NO: 3229 fusionado a una etiqueta FLAG (SEQ ID NO: 3238), o [Met-1 a Lys-113] de la SEQ ID NO: 3229 fusionado a [Leu-114 a Thr141] de la SEQ ID NO: 3229 fusionado a [Glu-135 a Asn-165] de la SEQ ID NO: 39 fusionado a [Gly-142 a Gln-179] de la SEQ ID NO: 3229 fusionado a [Val-180 a Ala-229] de la SEQ ID NO: 3229 fusionado a [Gly-230 a Leu-266] de la SEQ ID NO: 3229.
Adicionalmente, se describen anticuerpos en el presente documento que se unen a fragmentos polipeptídicos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en, regiones funcionales de polipéptidos de la presente invención, tales como las regiones alfa, regiones beta, regiones de giros y regiones de enrollamientos de Gamier-Robson, las regiones alfa, regiones beta y regiones de enrollamientos de Chou-Fasman, las regiones hidrófilas y regiones hidrófobas de Kyte-Doolittle, las regiones anfipáticas alfa y beta de Eisenberg, las regiones flexibles de Karplus-Schulz, las regiones formadoras de superficie de Emini y las regiones de Jameson-Wolf de alto índice antigénico expuestas en las Tablas 9 y 10 y que se describen en el presente documento. Preferentemente, los fragmentos polipeptídicos unidos por los anticuerpos descritos en el presente documento son antigénicos (es decir, contienen cuatro o más aminoácidos contiguos que tienen un índice antigénico superior a o igual a 1,5, según se identifica usando los parámetros por defecto del programa de Jameson-Wolf) de un polipéptido de BLyS completo (es decir, de longitud completa) (por ejemplo, SEQ ID NO: 3228 y 3229).
Los datos que representaban los atributos funcionales o estructurales del polipéptido de BLyS de la SEQ ID NO: 3228 (Tabla 9) o del polipéptido de BLyS de la SEQ ID NO: 3229 (Tabla 10), como se han descrito anteriormente, se generaron usando los diversos módulos y algoritmos del DNA*STAR ajustado con los parámetros por defecto. La Columna I representa los resultados de un análisis de Gamier-Robson de regiones de hélice alfa; la Columna II representa los resultados de un análisis de Chou-Fasman de regiones de hélice alfa; la Columna III representa los resultados de un análisis de Garnier-Robson de regiones de lámina beta; la Columna IV representa los resultados de un análisis de Chou-Fasman de regiones de lámina beta; la Columna V representa los resultados de un análisis de
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(continuación)
Res
Posición I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Cys
27 A A . B . . . -0,74 -0,03 * * . 0,30 0,30
Val
28 A A . B . . . -1,00 -0,03 * * . 0,30 0,12
Ser
29 A A . B . . . -0,08 0,40 * * . -0,30 0,11
Ile
30 A . . B . . . -0,08 0,40 * * . -0,30 0,40
Leu
31 . . . B . . . -0,08 -0,17 * . . 0,45 1,08
Pro
32 . . . B . . C 0,29 -0,81 * . F 1,10 1,39
Arg
33 . . . . . . . 0,93 -0,81 . * F 1,50 2,66
Lys
34 . . . . . . . 0,93 -1,07 . . F 1,84 4,98
Glu
35 . . . . . . C 0,97 -1,37 * * F 1,98 4,32
Ser
36 . . . . . T C 1,89 -1,16 * * F 2,52 1,64
Pro
37 . . . . . T C 1,80 -1,16 * * F 2,86 1,60
Ser
38 . . . . T . 1,39 -0,77 * . F 3,40 1,24
Val
39 A . . . . T . 1,39 -0,39 . * F 2,36 1,24
Arg
40 A . . . . . . 1,39 -0,77 * * F 2,46 1,60
Ser
41 A . . . . . . 1,34 -1,20 * * F 2,46 2,00
Ser
42 . . . . T T . 1,60 -1,16 . * F 3,06 2,67
Lys
43 . . . . T T . 1,09 -1,80 . * F 3,06 2,72
Asp
44 . . . . T T . 1,13 -1,11 * * F 3,40 1,67
Gly
45 A . . . . T . 0,43 -0,81 * * F 2,66 1,03
Lys
46 A A . . . . . 0,14 -0,70 . . F 1,77 0,52
Leu
47 A A . . . . . 0,13 -0,20 * . . 0,98 0,31
Leu
48 A A . . . . . -0,72 0,29 * . . 0,04 0,46
Ala
49 A A . . . . . -1,53 0,54 . * . -0,60 0,19
Res
Posición I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Ala
50 A A . . . . . -2,00 1,23 . . . -0,60 0,19
Thr
51 A A . . . . . -2,63 1,23 . . . -0,60 0,19
Leu
52 A A . . . . . -2,63 1,04 . . . -0,60 0,19
Leu
53 A A . . . . . -2,63 1,23 . . . -0,60 0,15
Leu
54 A A . . . . . -2,34 1,41 . . . -0,60 0,09
Ala
55 A A . . . . . -2,42 1,31 . . . -0,60 0,14
Leu
56 A A . . . . . -2,78 1,20 . . . -0,60 0,09
Leu
57 A . . . . T . -2,78 1,09 . . . -0,20 0,06
Ser
58 A . . . . T . -2,28 1,09 . . . -0,20 0,05
Cys
59 A . . . . T . -2,32 1,07 . . . -0,20 0,09
Cys
60 A . . . . T . -2,59 1,03 . . . -0,20 0,08
Leu
61 . . B B . . . -2,08 0,99 . . . -0,60 0,04
Thr
62 . . B B . . . -1,97 0,99 . . . -0,60 0,11
Val
63 . . B B . . . -1,91 1,20 . . . -0,60 0,17
Val
64 . . B B . . . -1,24 1,39 . . . -0,60 0,33
Ser
65 . . B B . . . -1,43 1,10 . . . -0,60 0,40
Phe
66 A . . B . . . -1,21 1,26 . . . -0,60 0,40
Tyr
67 A . . B . . . -1,49 1,11 . . . -0,60 0,54
Gln
68 A . . B . . . -1,44 0,97 . . . -0,60 0,41
Val
69 A . . B . . . -0,59 1,27 . . . -0,60 0,39
Ala
70 A . . B . . . -0,63 0,89 . . . -0,60 0,43
15
imagen8
(continuación)
Res
Posición I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Glu
116 . A . . . . C -0,08 -0,17 * . F 1,25 0,58
Pro
117 . A . . . . C 0,39 0,26 * * F 1,10 1,28
Pro
118 . . . . . . C 0,34 -0,00 . . F 2,20 1,47
Ala
119 . . . . . T C 0,89 -0,79 . * F 3,00 1,47
Pro
120 . . . . . T C 1,59 -0,36 . * F 2,25 0,94
Gly
121 . . . . . T . 1,29 -0,39 . * F 2,15 0,98
Glu
122 . . . . . T . 1,20 -0,43 . . F 2,00 1,30
Gly
123 . . . . . . C 1,41 -0,54 . . F 1,60 1,12
Asn
124 . . . . . T C 2,00 -0,57 . . F 1,50 1,97
Ser
125 . . . . . T C 1,91 -0,60 . * F 1,50 1,82
Ser
126 . . . . . T C 2,37 -0,21 . * F 1,54 2,47
Gln
127 . . . . . T C 2,37 -0,64 . * F 2,18 3,01
Asn
128 . . . . . . C 2,76 -0,64 . . F 2,32 3,61
Ser
129 . . . . . T C 2,87 -1,03 . . F 2,86 5,39
Arg
130 . . . . . . . 2,58 -1,41 * . F 3,40 6,09
Asn
131 . . . . . . . 2,02 -1,31 * . F 3,06 3,83
Lys
132 . . . . . . . 2,02 -1,07 * . F 2,72 2,12
Arg
133 . . . . . . . 1,68 -1,06 * . F 2,18 1,88
Ala
134 . . . . . . C 1,77 -0,63 * . F 1,64 1,15
Val
135 . . . . . . C 1,66 -0,60 * . F 1,49 0,89
Gln
136 . . . . . . C 1,66 -0,60 * . F 1,83 0,79
Gly
137 . . . . . T C 1,30 -0,60 * . F 2,52 1,35
Pro
138 . . . . . T C 0,33 -0,61 * . F 2,86 2,63
Glu
139 . . . . T T . 0,61 -0,61 * . . 3,40 1,13
Glu
140 A . . . . T . 1,47 -0,53 * . . 2,66 1,64
Thr
141 A . . . . . . 1,47 -0,56 . . . 2,12 1,84
Val
142 A . . . . . . 1,14 -0,99 . . . 1,78 1,77
Thr
143 A . . . . T . 0,54 -0,41 . . . 1,19 0,55
Gln
144 A . . . . T . 0,54 0,27 * . . 0,25 0,31
Asp
145 A . . . . T . -0,27 0,19 * . . 0,25 0,73
Cys
146 A . . . . T . -0,84 0,23 * . . 0,10 0,42
Leu
147 A A . . . . . -0,58 0,43 . . . -0,60 0,17
Gln
148 A A . . . . . -0,27 0,53 . . . -0,60 0,10
Leu
149 A A . . . . . -0,57 0,53 . * . -0,30 0,32
Ile
150 A A . . . . . -0,57 0,34 . . . 0,30 0,52
Ala
151 . A . . . . C -0,21 -0,34 . * . 1,40 0,52
Asp
152 . . . . T T . 0,39 -0,26 . * F 2,45 0,91
Ser
153 . . . . . T C 0,08 -0,51 . . F 3,00 2,00
Glu
154 . . . . . T C -0,00 -0,71 . . F 2,70 2,86
Thr
155 . . . . . T C 0,89 -0,53 * . F 2,40 1,20
Pro
156 . . . B . . C 1,52 -0,13 * . F 1,56 1,55
Thr
157 . . . B T . . 1,18 -0,51 * . F 1,92 1,79
Ile
158 A . . B . . . 1,18 -0,09 . . F 1,08 1,23
Gln
159 . . . . T T . 0,93 -0,19 . . F 2,04 1,07
Lys
160 . . . . T T . 0,93 0,14 * . F 1,60 1,16
Gly
161 . . . . T T . 0,44 0,14 * . F 1,44 2,38
17
(continuación)
Res
Posición I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Ser
162 . . . . T T . -0,10 0,24 * . F 1,28 1,19
Tyr
163 . . . B T . . 0,58 0,49 * . . 0,12 0,44
Thr
164 . . B B . . . 0,29 0,91 * . . -0,44 0,69
Phe
165 . . B B . . . -0,57 1,40 * . . -0,60 0,54
Val
166 . . B B . . . -1,03 1,70 . . . -0,60 0,29
Pro
167 . . B B . . . -1,03 1,63 . . . -0,60 0,16
Trp
168 A . . B . . . -1,49 1,53 . * . -0,60 0,25
Leu
169 A . . B . . . -1,13 1,53 * . . -0,60 0,29
Leu
170 A . . B . . . -0,32 0,89 * . . -0,30 0,38
Ter
171 A . . . . . . 0,19 0,46 * . . 0,20 0,71
Phe
172 . . . . T . . 0,10 -0,03 * . . 1,80 0,85
Lys
173 . . . . T T . -0,20 -0,33 * . F 2,60 1,38
Arg
174 . . . . . T C -0,20 -0,51 . . F 3,00 1,04
Gly
175 . . . . . T C 0,61 -0,21 . . F 2,25 0,99
Ser
176 A . . . . T . 0,91 -1,00 * . F 2,05 0,86
Ala
177 A A . . . . . 1,66 -1,00 * . F 1,35 0,76
Leu
178 A A . . . . . 1,61 -1,00 . . F 1,20 1,54
Glu
179 A A . . . . . 1,50 -1,43 . . F 0,90 1,98
Glu
180 A A . . . . . 1,89 -1,41 * . F 0,90 3,16
Lys
181 A A . . . . . 1,30 -1,91 * . F 0,90 7,66
Glu
182 A A . . . . . 1,08 -1,91 . . F 0,90 3,10
Asn
183 A A . . . . . 1,03 -1,23 * * F 0,90 1,48
Lys
184 A A . . . . . 1,08 -0,59 * . F 0,75 0,55
Ile
185 A A . . . . . 1,08 -0,59 * * . 0,60 0,63
Leu
186 A A . . . . . 0,72 -0,59 * * . 0,60 0,68
Val
187 A A . . . . . 0,38 -0,50 . * . 0,30 0,49
Lys
188 A A . . . . . 0,13 -0,07 * * F 0,45 0,69
Glu
189 A . . . . T . -0,61 0,00 * * F 0,40 1,32
Thr
190 . . . . T T . -0,42 0,10 * F 0,80 1,54
Gly
191 . . . . T T . -0,50 0,24 * . F 0,65 0,67
Tyr
192 . . . . T T . 0,11 0,93 * * . 0,20 0,27
Phe
193 . . B B . . . -0,28 1,69 . . . -0,60 0,29
Phe
194 . . B B . . . -0,28 1,63 . * . -0,60 0,29
Ile
195 . . B B . . . -0,82 1,60 . . . -0,60 0,32
Tyr
196 . . B B . . . -1,29 1,49 . . . -0,60 0,28
Gly
197 . . . B T . . -1,29 1,39 . . . -0,20 0,26
Gln
198 . . . B T . . -0,90 1,36 . . . -0,20 0,59
Val
199 . . . B . . C -0,20 1,16 . . . -0,40 0,54
Leu
200 . . . B . . C 0,73 0,40 . . . -0,10 0,92
Tyr
201 . . . . T T . 0,67 -0,03 . . . 1,25 1,06
Thr
202 . . . . T T . 0,77 0,06 . . F 0,80 2,06
Asp
203 . . . . T T . 0,18 0,17 . . F 0,80 3,91
Lys
204 A . . . . T . 0,43 -0,01 . . F 1,00 2,52
Thr
205 A A . . . . . 0,90 -0,16 . . F 0,60 1,73
Tyr
206 A A . . . . . 1,11 -0,21 . . . 0,45 1,03
Ala
207 A A . . . . . 0,61 0,29 . . . -0,30 0,70
18
(continuación)
Res
Posición I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Met
208 A A . . . . . -0,28 0,97 . . . -0,60 0,40
Gly
209 A A . B . . . -0,32 1,17 * . . -0,60 0,18
His
210 A A . B . . . 0,10 0,81 * . . -0,60 0,31
Leu
211 A A . B . . . 0,39 0,31 . . . -0,30 0,61
Ile
212 A A . B . . . 1,02 -0,30 . . . 0,45 1,22
Gln
213 A A . B . . . 0,77 -0,73 . * . 0,75 1,80
Arg
214 A A . B . . . 1,08 -0,59 . * F 0,90 1,62
Lys
215 A A . B . . . 0,26 -0,77 * * F 0,90 3,14
Lys
216 A A . B . . . 0,37 -0,81 . * F 0,90 1,35
Val
217 . . B B . . . 0,91 -0,43 * * . 0,30 0,60
His
218 . . B B . . . 0,91 -0,00 . * . 0,30 0,29
Val
219 . . B B . . . 0,80 -0,00 * * . 0,30 0,25
Phe
220 . . B B . . . -0,06 -0,00 * . . 0,30 0,57
Gly
221 A . . B . . . -0,40 0,04 . * . -0,30 0,35
Asp
222 A . . . . . . -0,36 -0,07 * . . 0,50 0,63
Glu
223 A . . . . . . -1,18 -0,03 * . . 0,50 0,60
Leu
224 A . . B . . . -0,63 -0,17 . . . 0,30 0,45
Ser
225 A . . B . . . -0,74 -0,11 . . . 0,30 0,39
Leu
226 A . . B . . . -1,10 0,57 . * . -0,60 0,18
Val
227 A . . B . . . -0,99 1,36 . * . -0,60 0,19
Thr
228 A . . B . . . -1,66 0,67 * * . -0,60 0,28
Leu
229 A . . B . . . -1,73 0,86 * . . -0,60 0,18
Phe
230 A . . B . . . -1,43 0,86 * . . -0,60 0,17
Arg
231 A . . B . . . -0,62 0,61 * . . -0,60 0,21
Cys
232 . . . B T . . -0,37 0,53 * . . -0,20 0,41
Ile
233 . . . B T . . -0,27 0,46 * . . -0,20 0,46
Gln
234 . . . B T . . 0,54 0,10 * . . 0,10 0,37
Asn
235 . . . B . . C 0,93 0,10 * . . 0,05 1,19
Met
236 . . . B . . C 0,01 0,01 * . F 0,20 2,44
Pro
237 . . . B . . C 0,47 0,01 * . F 0,44 1,16
Glu
238 . . . . T . . 1,36 0,04 * . F 1,08 1,12
Thr
239 . . . . . . C 1,36 0,04 * . F 1,12 1,82
Leu
240 . . . . . . C 1,06 -0,17 * . F 1,96 1,89
Pro
241 . . . . T . . 0,99 -0,21 . . F 2,40 1,46
Asn
242 . . . . T . . 0,96 0,36 . . F 1,41 0,54
Asn
243 . . . . T T . 0,66 0,63 . . F 1,22 1,03
Ser
244 . . . . T T . 0,38 0,33 . . F 1,13 0,89
Cys
245 . . . . T T . 0,84 0,40 . . . 0,74 0,56
Tyr
246 . . . . T T . 0,17 0,43 . . . 0,20 0,35
Ser
247 A . . . . . . -0,42 0,71 . . . -0,40 0,18
Ala
248 A A . . . . . -0,38 0,83 . . . -0,60 0,34
Gly
249 A A . . . . . -0,89 0,26 . . . -0,30 0,43
Ile
250 A A . . . . . -0,22 0,19 * . . -0,30 0,27
Ala
251 A A . . . . . 0,02 -0,20 * . . 0,30 0,46
Lys
252 A A . . . . . -0,02 -0,70 . . . 0,60 0,80
Leu
253 A A . . . . . 0,57 -0,70 . . F 0,90 1,13
19
(continuación)
Res
Posición I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Glu
254 A A . . . . . 0,91 -1,39 . . F 0,90 1,87
Glu
255 A A . . . . . 0,99 -1,89 . . F 0,90 1,62
Gly
256 A A . . . . . 1,58 -1,20 . * F 0,90 1,62
Asp
257 A A . . . . . 0,72 -1,49 . * F 0,90 1,62
Glu
258 A A . . . . . 0,94 -0,80 * * F 0,75 0,77
Leu
259 A A . . . . . 0,06 -0,30 * * . 0,30 0,79
Gln
260 A A . . . . . -0,16 -0,04 * . . 0,30 0,33
Leu
261 A A . . . . . 0,30 0,39 * . . -0,30 0,30
Ala
262 A A . . . . . 0,30 0,39 * . . -0,30 0,70
Ile
263 A A . . . . . 0,30 -0,30 . * . 0,30 0,70
Pro
264 A . . . . T . 0,52 -0,30 . * F 1,00 1,37
Arg
265 A . . . . T . 0,52 -0,49 . * F 1,00 1,37
Glu
266 A . . . . T . 0,44 -0,59 * * F 1,30 3,38
Asn
267 A . . . . T . 0,73 -0,59 * * F 1,30 1,53
Ala
268 A . . . . . . 0,81 -0,63 * * . 0,95 1,05
Gln
269 A . . . . . . 1,02 0,06 * * . -0,10 0,50
Ile
270 A . . . . . . 0,57 0,06 . * . 0,15 0,52
Ser
271 . . . . . . C 0,57 0,09 . * . 0,60 0,51
Leu
272 . . . . . . C -0,29 -0,41 . * F 1,60 0,49
Asp
273 . . . . T T . -0,01 -0,17 . * F 2,25 0,52
Gly
274 . . . . T T . -0,71 -0,37 . * F 2,50 0,56
Asp
275 . . . . T T . -0,52 0,03 . * F 1,65 0,59
Val
276 A . . . . T . -0,57 0,13 . * F 1,00 0,30
Thr
277 A . . B . . . -0,34 0,56 . * . -0,10 0,30
Phe
278 A . . B . . . -1,16 0,63 . * . -0,35 0,18
Phe
279 A . . B . . . -0,77 1,31 . * -0,60 0,20 .
Gly
280 A A . . . . . -1,58 0,67 . * -0,60 0,28 .
Ala
281 A A . . . . . -1,53 0,87 . * -0,60 0,27 .
Leu
282 A A . . . . . -1,61 0,77 * . -0,60 0,26 *
Lys
283 A A . . . . . -1,30 0,41 * . -0,60 0,33 *
Leu
284 A A . . . . . -0,99 0,41 . . -0,60 0,42 .
Leu
285 A A . . . . . -1,03 0,34 * . -0,30 0,65 *
Tabla 10
Res
Posición I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Met
1 A . . . . . . 0,73 -0,71 . . . 0,95 1,39
Asp
2 A . . . . T . 1,12 -0,66 * . . 1,15 1,56
Asp
3 A . . . . T . 1,62 -1,09 * . . 1,15 2,12
Ser
4 A . . . . T . 2,01 -1,51 . . . 1,15 4,19
Thr
5 A . . . . T . 2,40 -2,13 . . F 1,30 4,35
Glu
6 A A . . . . . 2,70 -1,73 * * F 0,90 4,51
Arg
7 A A . . . . . 2,81 -1,34 * * F 0,90 4,51
Glu
8 A A . . . . . 2,00 -1,73 * * F 0,90 6,12
Gln
9 A A . . . . . 1,99 -1,53 * * F 0,90 2,91
Ser
10 A . . B . . . 2,00 -1,04 * * F 0,90 2,15
20
imagen9
(continuación)
Res
Posición I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Leu
56 A A . . . . . -2,78 1,20 . . . -0,60 0,09
Leu
57 A . . . . T . -2,78 1,09 . . . -0,20 0,06
Ser
58 A . . . . T . -2,28 1,09 . . . -0,20 0,05
Cys
59 A . . . . T . -2,32 1,07 . . . -0,20 0,09
Cys
60 A . . . . T . -2,59 1,03 . . . -0,20 0,08
Leu
61 . . B B . . . -2,08 0,99 . . . -0,60 0,04
Thr
62 . . B B . . . -1,97 0,99 . . . -0,60 0,11
Val
63 . . B B . . . -1,91 1,20 . . . -0,60 0,17
Val
64 . . B B . . . -1,24 1,39 . . . -0,60 0,33
Ser
65 . . B B . . . -1,43 1,10 . . . -0,60 0,40
Phe
66 A . . B . . . -1,21 1,26 . . . -0,60 0,40
Tyr
67 A . . B . . . -1,49 1,11 . . . -0,60 0,54
Gln
68 A . . B . . . -1,44 0,97 . . . -0,60 0,41
Val
69 A . . B . . . -0,59 1,27 . . . -0,60 0,39
Ala
70 A . . B . . . -0,63 0,89 . . . -0,60 0,43
Ala
71 A . . B . . . 0,07 0,56 . * . -0,60 0,25
Leu
72 A . . . . T . -0,50 0,16 . . . 0,10 0,55
Gln
73 A . . . . T . -1,09 0,20 . . F 0,25 0,45
Gly
74 A . . . . T . -0,53 0,20 . . F 0,25 0,45
Asp
75 A . . . . T . -0,76 0,09 . * F 0,25 0,73
Leu
76 A A . . . . . -0,06 0,09 . * F -0,15 0,35
Ala
77 A A . . . . . 0,17 -0,31 . * . 0,30 0,69
Ser
78 A A . . . . . 0,17 -0,24 . * . 0,30 0,42
Leu
79 A A . . . . . -0,30 -0,24 . * . 0,30 0,88
Arg
80 A A . . . . . -0,30 -0,24 . * . 0,30 0,72
Ala
81 A A . . . . . 0,17 -0,34 . * . 0,30 0,93
Glu
82 A A . . . . . 0,72 -0,30 . * . 0,45 1,11
Leu
83 A A . . . . . 0,99 -0,49 . * . 0,30 0,77
Gln
84 A A . . . . . 1,21 0,01 . * . -0,15 1,04
Gly
85 A A . . . . . 1,10 0,01 * * . -0,30 0,61
His
86 A A . . . . . 1,73 0,01 * * . -0,15 1,27
His
87 A A . . . . . 0,92 -0,67 . * . 0,75 1,47
Ala
88 A A . . . . . 1,52 -0,39 . * . 0,45 1,22
Glu
89 A A . . . . . 0,93 -0,39 . . . 0,45 1,39
Lys
90 A A . . . . . 0,93 -0,39 * . F 0,60 1,03
Leu
91 A . . . . T . 0,38 -0,46 * . . 0,85 1,01
Pro
92 A . . . . T . 0,07 -0,46 . . . 0,70 0,59
Ala
93 A . . . . T . 0,07 -0,03 . . . 0,70 0,29
Gly
94 A . . . . T . -0,14 0,47 . . . -0,20 0,36
Ala
95 A . . . . . . -0,14 0,21 . * . -0,10 0,36
Gly
96 A . . . . . . 0,08 -0,21 . . F 0,65 0,71
Ala
97 A . . . . . . -0,06 -0,21 . . F 0,65 0,72
Pro
98 A . . . . . . -0,28 -0,21 . * F 0,65 0,71
Lys
99 A A . . . . . 0,07 -0,03 . . F 0,45 0,59
Ala
100 A A . . . . . 0,66 -0,46 . . F 0,60 1,01
Gly
101 A A . . . . . 0,41 -0,96 . . F 0,90 1,13
22
(continuación)
Res
Posición I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Leu
102 A A . . . . . 0,79 -0,89 . . F 0,75 0,57
Glu
103 A A . . . . . 0,41 -0,46 * . F 0,45 0,88
Glu
104 A A . . . . . -0,49 -0,46 * . F 0,45 0,89
Ala
105 A A . . . . . -0,21 -0,24 . . . 0,30 0,81
Pro
106 A A . . . . . -0,46 -0,44 . . . 0,30 0,67
Ala
107 A A . . . . . 0,01 0,06 . . . -0,30 0,39
Val
108 A A . . . . . -0,80 0,49 * * . -0,60 0,38
Thr
109 A A . . . . . -0,76 0,67 . * . -0,60 0,20
Ala
110 A A . . . . . -1,06 0,24 * * . -0,30 0,40
Gly
111 A A . . . . . -1,54 0,43 * * . -0,60 0,38
Leu
112 A A . . . . . -0,96 0,57 * . . -0,60 0,23
Lys
113 . A B . . . . -0,31 0,09 * . . -0,30 0,39
Ile
114 . A B . . . . -0,21 0,01 * . . -0,30 0,61
Phe
115 . A B . . . . -0,21 0,01 * . . 0,15 1,15
Glu
116 . A . . . . C -0,08 -0,17 * . F 1,25 0,58
Pro
117 . A . . . . C 0,39 0,26 * * F 1,10 1,28
Pro
118 . . . . . . C 0,34 0,00 * . F 2,20 1,47
Ala
119 . . . . . T C 0,89 -0,79 . * F 3,00 1,47
Pro
120 . . . . . T C 1,59 -0,36 . * F 2,25 0,94
Gly
121 . . . . . T . 1,29 -0,39 . * F 2,15 0,98
Glu
122 . . . . . T . 1,20 -0,43 . . F 2,00 1,30
Gly
123 . . . . . C 1,41 -0,54 . . F 1,60 1,12
Asn
124 . . . . . T C 2,00 -0,57 . . F 1,50 1,97
Ser
125 . . . . . T C 1,91 -0,60 . * F 1,50 1,82
Ser
126 . . . . . T C 2,37 -0,21 . * F 1,54 2,47
Gln
127 . . . . . T C 2,37 -0,64 . * F 2,18 3,01
Asn
128 . . . . . . C 2,76 -0,64 . . F 2,32 3,61
Ser
129 . . . . . T C 2,87 -1,03 . . F 2,86 5,39
Arg
130 . . . . . . . 2,58 -1,41 * . F 3,40 6,09
Asn
131 . . . . . . . 2,02 -1,31 * . F 3,06 3,83
Lys
132 . . . . . . . 2,02 -1,07 * . F 2,72 2,12
Arg
133 . . . . . . . 1,68 -1,06 * . F 2,18 1,88
Ala
134 . . . . . . C 1,77 -0,63 * . F 1,64 1,15
Val
135 . . . . . . C 1,66 -0,60 * . F 1,15 0,89
Gln
136 . . . . . . C 1,66 -0,60 * . F 1,49 0,79
Gly
137 . . . . . T C 1,30 -0,60 * . F 2,18 1,35
Pro
138 . . . . . T C 0,84 -0,61 * . F 2,52 2,63
Glu
139 . . . . . T C 1,13 -0,83 * . F 2,86 1,50
Glu
140 . . . . T T . 1,74 -0,84 . . F 3,40 2,03
Thr
141 . . . . T . . 1,43 -0,51 . . F 2,86 2,06
Gly
142 . . . . T T . 1,08 -0,46 . . F 2,42 1,72
Ser
143 . . . . T T . 0,43 0,33 . . F 1,33 0,86
Tyr
144 . . . . . . . 0,22 0,97 . . . 0,54 0,44
Thr
145 . . . . . . . -0,07 0,91 . . . 0,20 0,69
Phe
146 . . . B . . . -0,57 1,40 . . . -0,60 0,54
Val
147 . . . B . . . -1,03 1,70 . . . -0,60 0,29
23
(continuación)
Res Posición I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV Pro 148 ...B...-1,03 1,63.. .-0,60 0,16 Trp 149 A..B...-1,49 1,53.* .-0,60 0,25 Leu 150 . . . . .. . -1,13 1,53* . . -0,60 0,29 Leu 151 . . . . .. . -0,32 0,89* . . -0,30 0,38 Ser 152 . . . . .. . 0,190,46* . . 0,200,71 Phe 153 . . . . .. . 0,10-0,03 * . . 1,800,85 Lys 154 . . . . .T . -0,20 -0,33 * . F 2,601,38 Arg 155 . . . . .T . -0,20 -0,51 . . F 3,001,04 Gly 156 . . . . .T . 0,61-0,21 . . F 2,250,99 Ser 157 A. . . .T. 0,91-1,00 * . F 2,050,86 Ala 158 AA. . .. . 1,66-1,00 * . F 1,350,76 Leu 159 AA. . .. . 1,61-1,00 . . F 1,201,54 Glu 160 AA. . .. . 1,50-1,43 . . F 0,901,98 Glu 161 AA. . .. . 1,89-1,41 * . F 0,903,16 Lys 162 AA. . .. . 1,30-1,91 * . F 0,907,66 Glu 163 AA. . .. . 1,08-1,91 . . F 0,903,10 Asn 164 AA. . .. . 1,03-1,23 * * F 0,901,48 Lys 165 AA. . .. . 1,08-0,59 * . F 0,750,55 Ile 166 AA. . .. . 1,08-0,59 * * . 0,600,63 Leu 167 AA. . .. . 0,72-0,59 * * . 0,760,68 Val 168 AA. . .. . 0,38-0,50 . * . 0,920,49 Lys 169 AA. . .. . 0,13-0,07 * * F 0,930,69 Glu 170 A T . -0,61 0,00 * * F 1,641,32 Thr 171 . . . . TT . -0,42 0,10 . * F 1,601,54 Gly 172 ....TT.-0,50 0,24*.F1,290,67 Tyr 173 ....TT. 0,110,93** . 0,680,27 Phe 174 . . . . .. . -0,28 1,69. . . -0,28 0,29 Phe 175 . . . . .. . -0,28 1,63. * . -0,44 0,29 Ile 176 . . . . .. . -0,82 1,60. . . -0,60 0,32 Tyr 177 . . . . .. . -1,29 1,49. . . -0,60 0,28 Gly 178 . . . . T. . -1,29 1,39 . . . -0,20 0,26 Gln 179 . . . . T. . -0,90 1,36 . . . -0,20 0,59 Val 180 . . . . ..C-0,20 1,16. . . -0,40 0,54 Leu 181 . . . . ..C 0,730,40. . . -0,10 0,92 Tyr 182 . . . . TT . 0,67-0,03 . . . 1,251,06 Thr 183 ....TT.0,770,06..F0,802,06 Asp 184 ....TT.0,180,17..F0,803,91 Lys 185 A. . . .T. 0,43-0,01 . . F 1,002,52 Thr 186 AA. . .. . 0,90-0,16 . . F 0,601,73 Tyr 187 AA. . .. . 1,11-0,21 . . . 0,451,03 Ala 188 AA. . .. . 0,610,29. . . -0,30 0,70 Met 189 AA. . .. . -0,28 0,97. . . -0,60 0,40 Gly 190 AA.B...-0,32 1,17*. .-0,60 0,18 His 191 AA.B... 0,100,81*. .-0,60 0,31 Leu 192 AA.B.. . 0,390,31. . . -0,30 0,61
Ile 193 AA.B.. . 1,02-0,30 . . . 0,451,22
24
(continuación)
Res
Posición I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Gln
194 A A . B . . . 0,77 -0,73 . * . 0,75 1,80
Arg
195 A A . B . . . 1,08 -0,59 * * F 0,90 1,62
Lys
196 A A . B . . . 0,26 -0,77 * * F 0,90 3,14
Lys
197 A A . B . . . 0,37 -0,81 . * F 0,90 1,35
Val
198 . A B . . . . 0,91 -0,43 . * . 0,30 0,60
His
199 . A B . . . . 0,91 0,00 . * . 0,30 0,29
Val
200 . A B . . . . 0,80 0,00 . * . 0,30 0,25
Phe
201 . . . B . . . -0,06 0,00 . . . 0,30 0,57
Gly
202 A . . B . . . -0,40 0,04 . * . -0,30 0,35
Asp
203 A . . . . . . -0,36 -0,07 * . . 0,50 0,63
Glu
204 A . . . . . . -1,18 -0,03 * . . 0,50 0,60
Leu
205 A . . B . . . -0,63 -0,17 . . . 0,30 0,45
Ser
206 A . . B . . . -0,74 -0,11 . . . 0,30 0,39
Leu
207 A . . B . . . -1,10 0,57 . * . -0,60 0,18
Val
208 A . . B . . . -0,99 1,36 . * . -0,60 0,19
Thr
209 A . . B . . . -1,66 0,67 * * . -0,60 0,28
Leu
210 A . . B . . . -1,73 0,86 * . . -0,60 0,18
Phe
211 A . . B . . . -1,43 0,86 * . . -0,60 0,17
Arg
212 A . . B . . . -0,62 0,61 * . . -0,60 0,21
Cys
213 . . B T . -0,37 0,53 * . . -0,20 0,41
Ile
214 . . B T . -0,27 0,46 * . . -0,20 0,46
Gln
215 . . B T . 0,54 0,10 * . . 0,10 0,37
Asn
216 . . B . . C 0,93 0,10 * . . 0,05 1,19
Met
217 . . B . . C 0,01 0,01 * . F 0,20 2,44
Pro
218 . . B . . C 0,47 0,01 * . F 0,44 1,16
Glu
219 . . . T . . 1,36 0,04 * . F 1,08 1,12
Thr
220 . . . . . C 1,36 0,04 * . F 1,12 1,82
Leu
221 . . . . . C 1,06 -0,17 * . F 1,96 1,89
Pro
222 . . . T . . 0,99 -0,21 . . F 2,40 1,46
Asn
223 . . . T . . 0,96 0,36 . . F 1,41 0,54
Asn
224 . . . T T . 0,66 0,63 . . F 1,22 1,03
Ser
225 . . . T T . 0,38 0,33 . . F 1,13 0,89
Cys
226 . . . T T . 0,84 0,40 . . . 0,74 0,56
Tyr
227 . . . T T . 0,17 0,43 . . . 0,20 0,35
Ser
228 A . . . . . . -0,42 0,71 . . . -0,40 0,18
Ala
229 A A . . . . . -0,38 0,83 . . . -0,60 0,34
Gly
230 A A . . . . . -0,89 0,26 . . . -0,30 0,43
Ile
231 A A . . . . . -0,22 0,19 . . . -0,30 0,27
Ala
232 A A . . . . . 0,02 -0,20 . . . 0,30 0,46
Lys
233 A A . . . . . -0,02 -0,70 . . . 0,60 0,80
Leu
234 A A . . . . . 0,57 -0,70 . . F 0,90 1,13
Glu
235 A A . . . . . 0,91 -1,39 . . F 0,90 1,87
Glu
236 A A . . . . . 0,99 -1,89 . . F 0,90 1,62
Gly
237 A A . . . . . 1,58 -1,20 . * F 0,90 1,62
Asp
238 A A . . . . . 0,72 -1,49 . * F 0,90 1,62
Glu
239 A A . . . . 0,94 -0,80 * * F 0,75 0,77
25 5
10
15
20
(continuación)
Res
Posición I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Leu
240 A A . . . . 0,06 -0,30 * * . 0,30 0,79
Gln
241 A A . . . . -0,16 -0,04 * . . 0,30 0,33
Leu
242 A A . . . . 0,30 0,39 * . . -0,30 0,30
Ala
243 A A . . . . 0,30 0,39 * . . -0,30 0,70
Ile
244 A . . . . . . 0,30 -0,30 . * . 0,30 0,70
Pro
245 A . . . . . . 0,52 -0,30 . * F 1,00 1,37
Arg
246 A . . . . . . 0,52 -0,49 . * F 1,00 1,37
Glu
247 A . . . . . . 0,44 -0,59 * * F 1,30 3,38
Asn
248 A . . . . . . 0,73 -0,59 * * F 1,30 1,53
Ala
249 A . . . . . . 0,81 -0,63 * * . 0,95 1,05
Gln
250 A . . . . . . 1,02 0,06 * * . -0,10 0,50
Ile
251 A . . . . . . 0,57 0,06 * * . 0,15 0,52
Ser
252 . . . . . . C 0,57 0,09 . * . 0,60 0,51
Leu
253 . . . . . . C -0,29 -0,41 . * F 1,60 0,49
Asp
254 . . . . . T . -0,01 -0,17 . * F 2,25 0,52
Gly
255 . . . . . T . -0,71 -0,37 . * F 2,50 0,56
Asp
256 . . . . . T . -0,52 0,03 . * F 1,65 0,59
Val
257 A . . . . T . -0,57 0,13 . * F 1,00 0,30
Thr
258 A . . B . . . -0,34 0,56 . * . -0,10 0,30
Phe
259 A . . B . . . -1,16 0,63 . * . -0,35 0,18
Phe
260 A . . B . . . -0,77 1,31 . * . -0,60 0,20
Gly
261 A A . . . . . -1,58 0,67 . * . -0,60 0,28
Ala
262 A A . . . . . -1,53 0,87 . * . -0,60 0,27
Leu
263 A A . . . . . -1,61 0,77 * . . -0,60 0,26
Lys
264 A A . . . . . -1,30 0,41 * . . -0,60 0,33
Leu
265 A A . . . . . -0,99 0,41 . . . -0,60 0,42
Leu
266 A A . . . . . -1,03 0,34 * . . -0,30 0,65
La presente memoria descriptiva también describe anticuerpos que se unen a un polipéptido que comprende, o alternativamente consiste en, una porción que lleva un epítopo de un polipéptido descrito en el presente documento. El epítopo de esta porción polipeptídica puede ser un epítopo inmunogénico o antigénico de un polipéptido de la presente invención. Un "epítopo inmunogénico" se define como una parte de una proteína que genera una respuesta de anticuerpos cuando la proteína completa es el inmunógeno. Por otro lado, una región de una molécula proteica a la que puede unirse un anticuerpo se define como un "epítopo antigénico". El número de epítopos inmunogénicos de una proteína generalmente es inferior al número de epítopos antigénicos. Véase, por ejemplo, Geysen y col, Proc. Natl. Acad Sei. EE.UU. 81:3998-4002 (1983).
En relación con la selección de polipéptidos que llevan un epítopo antigénico (es decir, que contienen una región de una molécula proteica a la que puede unirse un anticuerpo), se sabe bien en esa técnica que los péptidos sintéticos relativamente cortos que mimetizan parte de un secuencia proteica son capaces de generar rutinariamente un antisuero que reaccione con la proteína parcialmente mimetizada. Véase, por ejemplo, Sutcliffe, J. G., Shinnick, T. M., Green, N. y Learner R. A. (1983) "Antibodies that react with predetermined sites on proteins", Science, 219:660
666. Los péptidos capaces de generar sueros reactivos con proteínas se representan frecuentemente en la secuencia primaria de una proteína, pueden caracterizarse por un conjunto de reglas químicas simples y no se limitan ni a regiones inmunodominantes de proteínas intactas (es decir, a epítopos inmunogénicos) ni a los extremos amino o carboxilo terminales. Por lo tanto, los péptidos y polipéptidos que llevan un epítopo antigénico descritos en el presente documento son útiles para obtener anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se unen específicamente a un polipéptido descrito en el presente documento. Véase, por ejemplo, Wilson y col., Cell 37: 767778 (1984) en 777.
Específicamente, la memoria descriptiva también describe anticuerpos que se unen a péptidos y polipéptidos de BLyS que llevan epítopos antigénicos y preferentemente contienen una secuencia de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, más preferentemente al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al
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posición del primer resto del extremo N-terminal del dominio extracelular predicho del polipéptido de BLyS (descrito en la SEQ ID NO: 3228). Más en particular, la memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los restos de Q-73 a L-285; G-74 a L-285; D-75 a L-285; L-76 a L-285; A-77 a L-285; S-78 a L-285; L-79 a L-285; R-80 a L-285; A-81 a L-285; E-82 a L-285; L-83 a L-285; Q-84 a L-285; G-85 a L-285; H-86 a L-285; H-87 a L-285; A-88 a L-285; E-89 a L-285; K-90 a L-285; L-91 a L-285; P-92 a L-285; A-93 a L-285; G-94 a L-285; A-95 a L285; G-96 a L-285; A-97 a L-285; P-98 a L-285; K-99 a L-285; A-100 a L-285; G-101 a L-285; L-102 a L-285; E-103 a L-285; E-104 a L-285; A-105 a L-285; P-106 a L-285; A-107 a L-285; V-108 a L-285; T-109 a L-285; A-110 a L-285; G-111 a L-285; L-112 a L-285; K-113 a L-285; 1-114 a L-285; F-115 a L-285; E-116 a L-285; P-117 a L-285; P-118 a L-285; A-119 a L-285; P-120 a L-285; G-121 a L-285; E-122 a L-285; G-123 a L-285; N-124 a L-285; S-125 a L-285; S-126 a L-285; Q-127 a L-285; N-128 a L-285; S-129 a L-285; R-130 a L-285; N-131 a L-285; K-132 a L-285; R-133 a L-285; A-134 a L-285; V-135 a L-285; Q-136 a L-285; G-137 a L-285; P-138 a L-285; E-139 a L-285; E-140 a L285; T-141 a L-285; V-142 a L-285; T-143 a L-285; Q-144 a L-285; D-145 a L-285; C-146 a L-285; L-147 a L-285; Q148 a L-285; L-149 a L-285; I-150 a L-285; A-151 a L-285; D-152 a L-285; S-153 a L-285; E-154 a L-285; T-155 a L285; P-156 a L-285; T-157 a L-285; 1-158 a L-285; Q-159 a L-285; K-160 a L-285; G-161 a L-285; S-162 a L-285; Y163 a L-285; T-164 a L-285; F-165 a L-285; V-166 a L-285; P-167 a L-285; W-168 a L-285; L-169 a L-285; L-170 a L285; S-171 a L-285; F-172 a L-285; K-173 a L-285; R-174 a L-285; G-175 a L-285; S-176 a L-285; A-177 a L-285; L178 a L-285; E-179 a L-285; E-180 a L-285; K-181 a L-285; E-182 a L-285; N-183 a L-285; K-184 a L-285; I-185 a L285; L-186 a L-285; V-187 a L-285; K-188 a L-285; E-189 a L-285; T-190 a L-285; G-191 a L-285; Y-192 a L-285; F193 a L-285; F-194 a L-285; 1-195 a L-285; Y-196 a L-285; G-197 a L-285; Q-198 a L-285; V-199 a L-285; L-200 a L285; Y-201 a L-285; T-202 a L-285; D-203 a L-285; K-204 a L-285; T-205 a L-285; Y-206 a L-285; A-207 a L-285; M208 a L-285; G-209 a L-285; H-210 a L-285; L-211 a L-285; 1-212 a L-285; Q-213 a L-285; R-214 a L-285; K-215 a L-285; K-216 a L-285; V-217 a L-285; H-218 a L-285; V-219 a L-285; F-220 a L-285; G-221 a L-285; D-222 a L-285; E-223 a L-285; L-224 a L-285; S-225 a L-285; L-226 a L-285; V-227 a L-285; T-228 a L-285; L-229 a L-285; F-230 a L-285; R-231 a L-285; C-232 a L-285; 1-233 a L-285; Q-234 a L-285; N-235 a L-285; M-236 a L-285; P-237 a L-285; E-238 a L-285; T-239 a L-285; L-240 a L-285; P-241 a L-285; N-242 a L-285; N-243 a L-285; S-244 a L-285; C-245 a L-285; Y-246 a L-285; S-247 a L-285; A-248 a L-285; G-249 a L-285; 1-250 a L-285; A-251 a L-285; K-252 a L-285; L-253 a L-285; E-254 a L-285; E-255 a L-285; G-256 a L-285; D-257 a L-285; E-258 a L-285; L-259 a L-285; Q-260 a L-285; L-261 a L-285; A-262 a L-285; 1-263 a L-285; P-264 a L-285; R-265 a L-285; E-266 a L-285; N-267 a L-285; A-268 a L-285; Q-269 a L-285; 1-270 a L-285; S-271 a L-285; L-272 a L-285; D-273 a L-285; G-274 a L-285; D-275 a L-285; V-276 a L-285; T-277 a L-285; F-278 a L-285; F-279 a L-285; y G-280 a L-285 de la SEQ ID NO: 3228. La presente memoria descriptiva también describe anticuerpos que se unen a polipéptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia contigua de restos aminoacídicos con una identidad de al menos un 80 %, un 85%, un 90 %, un 92%,un 95%, un 96%, un 97%, un 98% o un 99% con la secuencia de aminoácidos de polipéptidos de BLyS descritos anteriormente.
La presente memoria descriptiva también describe anticuerpos que se unen a polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 % y, más preferentemente, una identidad de al menos un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % con el polipéptido de BLyS que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 134-285 de la SEQ ID NO: 3228.
También se describen en el presente documento anticuerpos que se unen a polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 90 % con un polipéptido de BLyS que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 134-285 de la SEQ ID NO: 3228. También se describen en el presente documento anticuerpos que se unen a polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 95 % con un polipéptido de BLyS que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 134-285 de la SEQ ID NO: 3228. También se describen en el presente documento anticuerpos que se unen a polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 96 % con un polipéptido de BLyS que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 134-285 de la SEQ ID NO: 3228.
También se describen en el presente documento anticuerpos que se unen a polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos un 97 % con un polipéptido de BLyS que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 134-285 de la SEQ ID NO: 3228. También se describen en el presente documento anticuerpos que se unen a polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos un 98 % con un polipéptido de BLyS que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 134-285 de la SEQ ID NO: 3228. También se describen en el presente documento anticuerpos que se unen a polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 99 % con un polipéptido de BLyS que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 134-285 de la SEQ ID NO: 3228.
En aspectos específicos, los anticuerpos de la presente invención se unen a polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en uno de los fragmentos polipeptídicos de BLyS con deleción N-terminal siguientes: los restos aminoacídicos Ala-71 a Leu-285, los restos aminoacídicos Ala-81 a Leu-285, los restos aminoacídicos Leu
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112 a Leu-285, los restos aminoacídicos Ala-134 a Leu-285, los restos aminoacídicos Leu-147 a Leu-285 y los restos aminoacídicos Gly-161 a Leu-285 de la SEQ ID NO:3228.
De forma similar, se conocen muchos ejemplos de polipéptidos con deleción C-terminal biológicamente funcionales. Por ejemplo, el interferón gamma muestra actividades hasta diez veces mayores por deleción de 8-10 restos aminoacídicos del extremo carboxi-terminal de la proteína (Döbeli y col., J. Biotechnology 7: 199-216 (1988). Puesto que la presente proteína es un miembro de la familia de polipéptidos del TNF, se espera que deleciones de aminoácidos C-terminales hasta el resto de leucina en posición 284 conserven la mayor parte, si no toda, de su actividad biológica tal como, por ejemplo, la unión a ligando, la capacidad para estimular la proliferación, diferenciación y/o activación de linfocitos (por ejemplo, linfocitos B) y la modulación de la replicación celular. Los polipéptidos que tienen deleciones de hasta aproximadamente 10 restos C-terminales adicionales (es decir, hasta el resto de glicina en posición 274) también pueden conservar cierta actividad, tal como la unión a receptor, aunque dichos polipéptidos carecerían de una porción del dominio de TNF conservado que se extiende hasta aproximadamente la Leu-284 de la SEQ ID NO: 3228. Sin embargo, incluso si la deleción de uno o más aminoácidos del extremo C-terminal de una proteína da como resultado la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, todavía pueden conservarse otras actividades funcionales. Por lo tanto, la capacidad de la proteína acortada para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconozcan la proteína madura o completa se conservará generalmente cuando se eliminen menos de la mayoría de los restos de la proteína madura o completa del extremo C-terminal. Puede determinarse fácilmente por procedimientos de rutina descritos en el presente documento y conocidos de otro modo en la técnica si un polipéptido particular que carece de restos C-terminales de una proteína completa conserva dichas actividades inmunológicas.
Por consiguiente, la presente memoria descriptiva describe además anticuerpos que se unen a polipéptidos que tienen uno o más restos delecionados del extremo carboxi-terminal de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de BLyS de la SEQ ID NO: 3228, hasta el resto de glicina en posición 274 (Gly-274). En particular, la presente memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en la secuencia de aminoácidos de los restos 1-m1 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3228, donde m1 es cualquier número entero en el intervalo de las posiciones aminoacídicas de los restos aminoacídicos 274-284 en la SEQ ID NO: 3228. Más en particular, la presente invención proporciona anticuerpos que se unen a polipéptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los restos 1-274, 1-275, 1-276, 1-277, 1-278, 1-279, 1-280, 1-281, 1-282, 1-283 y 1-284 de la SEQ ID NO: 3228. La presente memoria descriptiva también describe anticuerpos que se unen a polipéptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia contigua de restos aminoacídicos con una identidad de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de BLyS descritos anteriormente.
También se describen anticuerpos que se unen a polipéptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en polipéptidos de BLyS con uno o más aminoácidos delecionados tanto del extremo amino-como carboxilo-terminal, que pueden describirse en general como que tienen los restos n1-m1 de la SEQ ID NO: 3228, donde n1 y m1 son números enteros como se han definido anteriormente. También se describen anticuerpos que se unen a un polipéptido que comprende, o alternativamente consiste en una porción de la secuencia de aminoácidos de BLyS completa codificada por el clon de ADNc depositado contenido en el N.º de acceso de la ATCC 97768, en el que esta porción excluye de 1 a 190 aminoácidos del extremo amino-terminal o de 1 a 11 aminoácidos del extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos completa (o cualquier combinación de estas deleciones Nterminales y C-terminales) codificada por el clon de ADNc en el plásmido depositado.
De forma similar, las deleciones de restos aminoacídicos C-terminales del dominio extracelular predicho de BLyS hasta el resto de leucina en posición 79 de la SEQ ID NO: 3228 pueden conservar cierta actividad biológica, tal como, por ejemplo, la unión a ligando, la estimulación de la proliferación, diferenciación y/o activación de linfocitos (por ejemplo, linfocitos B) y la modulación de la replicación celular o modulación de las actividades de células diana. No se esperaría que polipéptidos que tengan deleciones C-terminales adicionales que incluyan la Leu-79 de la SEQ ID NO: 3228 conservasen sus actividades biológicas.
Sin embargo, incluso si la deleción de uno o más aminoácidos del extremo C-terminal de un polipéptido da como resultado la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas del polipéptido, todavía pueden conservarse otras actividades funcionales. Por lo tanto, la capacidad del polipéptido acortado para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconozcan las formas completa, madura o extracelular del polipéptido se conservará generalmente cuando se eliminen menos de la mayoría de los restos de las formas completa, madura o extracelular del polipéptido del extremo C-terminal. Puede determinarse fácilmente por procedimientos de rutina descritos en el presente documento y conocidos de otro modo en la técnica si un polipéptido particular que carece de restos C-terminales del dominio extracelular predicho conserva dichas actividades inmunológicas.
Por consiguiente, la presente memoria descriptiva describe además anticuerpos que se unen a polipéptidos que tienen uno o más restos delecionados del extremo carboxi-terminal de la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular predicho del polipéptido de BLyS mostrado en la SEQ ID NO: 3228, hasta el resto de leucina en la posición 79 de la SEQ ID NO: 3228. En particular, la presente memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en la secuencia de aminoácidos de los restos 73-m2
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Por consiguiente, la presente memoria descriptiva describe además anticuerpos que se unen a polipéptidos que tienen uno o más restos delecionados del extremo carboxi-terminal de la secuencia de aminoácidos de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3228, hasta el resto de ácido glutámico en posición número 6, y polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. En particular, la presente memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de los restos 1-m3 de la SEQ ID NO: 3228, donde m3 es un número entero en el intervalo de las posiciones aminoacídicas de los restos aminoacídicos 6-284 de la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 3228.
Más en particular, la memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los restos M-1 a L-284; M-1 a K-283; M-1 a L-282; M-1 a A-281; M-1 a G-280; M-1 a F-279; M-1 a F-278; M-1 a T-277; M-1 a V-276; M-1 a D-275; M-1 a G-274; M-1 a D-273; M-1 a L-272; M-1 a S-271; M-1 a 1-270; M-1 a Q-269; M-1 a A-268; M-1 a N-267; M-1 a E-266; M-1 a R-265; M-1 a P-264; M-1 a 1-263; M-1 a A-262; M-1 a L-261; M-1 a Q-260; M-1 a L-259; M-1 a E-258; M-1 a D-257; M-1 a G-256; M-1 a E-255; M-1 a E-254; M-1 a L-253; M-1 a K-252; M-1 a A-251; M-1 a 1-250; M-1 a G-249; M-1 a A-248; M-1 a S-247; M-1 a Y-246; M-1 a C-245; M-1 a S-244; M-1 a N-243; M-1 a N-242; M-1 a P-241; M-1 a L-240; M-1 a T-239; M-1 a E-238; M-1 a P-237; M-1 a M-236; M-1 a N-235; M-1 a Q-234; M-1 a 1-233; M-1 a C-232; M-1 a R-231; M-1 a F-230; M-1 a L-229; M-1 a T-228; M-1 a V-227; M-1 a L-226; M-1 a S-225; M-1 a L-224; M-1 a E-223; M-1 a D-222; M-1 a G-221; M-1 a F-220; M-1 a V-219; M-1 a H-218; M-1 a V-217; M-1 a K-216; M-1 a K-215; M-1 a R-214; M-1 a Q-213; M-1 a 1-212; M-1 a L-211; M-1 a H-210; M-1 a G-209; M-1 a M-208; M-1 a A-207; M-1 a Y-206; M-1 a T-205; M-1 a K-204; M-1 a D-203; M-1 a T-202; M-1 a Y-201; M-1 a L-200; M-1 a V-199; M-1 a Q-198; M-1 a G-197; M-1 a Y-196; M-1 a I-195; M-1 a F-194; M-1 a F-193; M-1 a Y-192; M-1 a G-191; M-1 a T-190; M-1 a E-189; M-1 a K-188; M-1 a V-187; M-1 a L-186; M-1 a I-185; M-1 a K-184; M-1 a N-183; M-1 a E182; M-1 a K-181; M-1 a E-180; M-1 a E-179; M-1 a L-178; M-1 a A-177; M-1 a S-176; M-1 a G-175; M-1 a R-174; M1 a K-173; M-1 a F-172; M-1 a S-171; M-1 a L-170; M-1 a L-169; M-1 a W-168; M-1 a P-167; M-1 a V-166; M-1 a F165; M-1 a T-164; M-1 a Y-163; M-1 a S-162; M-1 a G-161; M-1 a K-160; M-1 a Q-159; M-1 a 1-158; M-1 a T-157; M1 a P-156; M-1 a T-155; M-1 a E-154; M-1 a S-153; M-1 a D-152; M-1 a A-151; M-1 a 1-150; M-1 a L-149; M-1 a Q148; M-1 a L-147; M-1 a C-146; M-1 a D-145; M-1 a Q-144; M-1 a T-143; M-1 a V-142; M-1 a T-141; M-1 a E-140; M1 a E-139; M-1 a P-138; M-1 a G-137; M-1 a Q-136; M-1 a V-135; M-1 a A-134; M-1 a R-133; M-1 a K-132; M-1 a N131; M-1 a R-130; M-1 a S-129; M-1 a N-128; M-1 a Q-127; M-1 a S-126; M-1 a S-125; M-1 a N-124; M-1 a G-123; M-1 a E-122; M-1 a G-121; M-1 a P-120; M-1 a A-119; M-1 a P-118; M-1 a P-117; M-1 a E-116; M-1 a F-115; M-1 a I114; M-1 a K-113; M-1 a L-112; M-1 a G-111; M-1 a A-110; M-1 a T-109; M-1 a V-108; M-1 a A-107; M-1 a P-106; M1 a A-105; M-1 a E-104; M-1 a E-103; M-1 a L-102; M-1 a G-101; M-1 a A-100; M-1 a K-99; M-1 a P-98; M-1 a A-97; M-1 a G-96; M-1 a A-95; M-1 a G-94; M-1 a A-93; M-1 a P-92; M-1 a L-91; M-1 a K-90; M-1 a E-89; M-1 a A-88; M-1 a H-87; M-1 a H-86; M-1 a G-85; M-1 a Q-84; M-1 a L-83; M-1 a E-82; M-1 a A-81; M-1 a R-80; M-1 a L-79; M-1 a S78; M-1 a A-77; M-1 a L-76; M-1 a D-75; M-1 a G-74; M-1 a Q-73; M-1 a L-72; M-1 a A-71; M-1 a A-70; M-1 a V-69; M-1 a Q-68; M-1 a Y-67; M-1 a F-66; M-1 a S-65; M-1 a V-64; M-1 a V-63; M-1 a T-62; M-1 a L-61; M-1 a C-60; M-1 a C-59; M-1 a S-58; M-1 a L-57; M-1 a L-56; M-1 a A-55; M-1 a L-54; M-1 a L-53; M-1 a L-52; M-1 a T-51; M-1 a A50; M-1 a A-49; M-1 a L-48; M-1 a L-47; M-1 a K-46; M-1 a G-45; M-1 a D-44; M-1 a K-43; M-1 a S-42; M-1 a S-41; M-1 a R-40; M-1 a V-39; M-1 a S-38; M-1 a P-37; M-1 a S-36; M-1 a E-35; M-1 a K-34; M-1 a R-33; M-1 a P-32; M-1 a L-31; M-1 a 1-30; M-1 a S-29; M-1 a V-28; M-1 a C-27; M-1 a E-26; M-1 a K-25; M-1 a L-24; M-1 a K-23; M-1 a M22; M-1 a E-21; M-1 a E-20; M-1 a R-19; M-1 a K-18; M-1 a K-17; M-1 a L-16; M-1 a C-15; M-1 a S-14; M-1 a T-13; M-1 a L-12; M-1 a R-11; M-1 a S-10; M-1 a Q-9; M-1 a E-8; M-1 a R-7; y M-1 a E-6 de la SEQ ID NO: 3228. La presente memoria descriptiva también describe anticuerpos que se unen a polipéptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia contigua de restos aminoacídicos con una identidad de al menos un 80%, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con la secuencia de aminoácidos de polipéptidos de BLyS descritos anteriormente.
La memoria descriptiva también describe anticuerpos que se unen a polipéptidos que tienen uno o más aminoácidos delecionados de los extremos tanto amino-como carboxilo terminales de un polipéptido de BLyS, que puede describirse generalmente como que tiene los restos n3-m3 de la SEQ ID NO: 3228, donde n3 y m3 son números enteros como se han definido anteriormente.
Además, puesto que el dominio extracelular predicho del polipéptido de BLyS de la SEQ ID NO: 322 9 puede generar por sí mismo actividad funcional (por ejemplo, actividad biológica), las deleciones de restos aminoacídicos N-y C-terminales de la región extracelular predicha del polipéptido en las posiciones de Gln-73 a Leu-266 de la SEQ ID NO: 3229 pueden conservar cierta actividad funcional, tal como, por ejemplo, la unión a ligando, la estimulación de la proliferación, diferenciación y/o activación de linfocitos (por ejemplo, linfocitos B), la modulación de la replicación celular, la modulación de actividades de células diana y/o la inmunogenicidad. Sin embargo, incluso si la deleción de uno o más aminoácidos del extremo N-terminal del dominio extracelular predicho de un polipéptido de BLyS da como resultado la modificación o pérdida de una o más actividades funcionales del polipéptido, todavía pueden conservarse otras actividades funcionales. Por lo tanto, la capacidad de los polipéptidos acortados para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconozcan los dominios extracelulares o maduros o completos de los polipéptidos se conservará generalmente cuando se eliminen menos de la mayoría de los restos de los dominios extracelulares o maduros o completos de los polipéptidos del extremo N-terminal. Puede determinarse fácilmente por procedimientos de rutina descritos en el presente documento y conocidos de otro modo en la técnica si un polipéptido particular que carece de restos N-terminales de un polipéptido completo conserva dichas actividades
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Más en particular, la memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los restos de Q-73 a L-265; Q-73 a K-264; Q-73 a L-263; Q-73 a A-262; Q-73 a G-261; Q-73 a F-260; Q-73 a F-259; Q-73 a T-258; Q-73 a V-257; Q-73 a D-256; Q-73 a G-255; Q-73 a D-254; Q-73 a L-253; Q-73 a S-252; Q-73 a 1-251; Q-73 a Q250; Q-73 a A-249; Q-73 a N-248; Q-73 a E-247; Q-73 a R-246; Q-73 a P-245; Q-73 a 1-244; Q-73 a A-243; Q-73 a L-242; Q-73 a Q-241; Q-73 a L-240; Q-73 a E-239; Q-73 a D-238; Q-73 a G-237; Q-73 a E-236; Q-73 a E-235; Q-73 a L-234; Q-73 a K-233; Q-73 a A-232; Q-73 a 1-231; Q-73 a G-230; Q-73 a A-229; Q-73 a S-228; Q-73 a Y-227; Q73 a C-226; Q-73 a S-225; Q-73 a N-224; Q-73 a N-223; Q-73 a P-222; Q-73 a L-221; Q-73 a T-220; Q-73 a E-219; Q-73 a P-218; Q-73 a M-217; Q-73 a N-216; Q-73 a Q-215; Q-73 a 1-214; Q-73 a C-213; Q-73 a R-212; Q-73 a F211; Q-73 a L-210; Q-73 a T-209; Q-73 a V-208; Q-73 a L-207; Q-73 a S-206; Q-73 a L-205; Q-73 a E-204; Q-73 a D-203; Q-73 a G-202; Q-73 a F-201; Q-73 a V-200; Q-73 a H-199; Q-73 a V-198; Q-73 a K-197; Q-73 a K-196; Q-73 a R-195; Q-73 a Q-194; Q-73 a 1-193; Q-73 a L-192; Q-73 a H-191; Q-73 a G-190; Q-73 a Q-7389; Q-73 a A-188; Q73 a Y-187; Q-73 a T-186; Q-73 a K-185; Q-73 a D-184; Q-73 a T-183; Q-73 a Y-182; Q-73 a L-181; Q-73 a V-180; Q-73 a Q-179; Q-73 a G-178; Q-73 a Y-177; Q-73 a 1-176; Q-73 a F-175; Q-73 a F-174; Q-73 a Y-173; Q-73 a G172; Q-73 a T-171; Q-73 a E-170; Q-73 a K-169; Q-73 a V-168; Q-73 a L-167; Q-73 a 1-166; Q-73 a K-165; Q-73 a N-164; Q-73 a E-163; Q-73 a K-162; Q-73 a E-161; Q-73 a E-160; Q-73 a L-159; Q-73 a A-158; Q-73 a S-157; Q-73 a G-156; Q-73 a R-155; Q-73 a K-154; Q-73 a F-153; Q-73 a S-152; Q-73 a L-151; Q-73 a L-150; Q-73 a W-149; Q73 a P-148; Q-73 a V-147; Q-73 a F-146; Q-73 a T-145; Q-73 a Y-144; Q-73 a S-143; Q-73 a G-142; Q-73 a T-141; Q-73 a E-140; Q-73 a E-139; Q-73 a P-138; Q-73 a G-137; Q-73 a Q-136; Q-73 a V-135; Q-73 a A-134; Q-73 a R133; Q-73 a K-132; Q-73 a N-131; Q-73 a R-130; Q-73 a S-129; Q-73 a N-128; Q-73 a Q-127; Q-73 a S-126; Q-73 a S-125; Q-73 a N-124; Q-73 a G-123; Q-73 a E-122; Q-73 a G-121; Q-73 a P-120; Q-73 a A-119; Q-73 a P-118; Q-73 a P-117; Q-73 a E-116; Q-73 a F-115; Q-73 a I-114; Q-73 a K-113; Q-73 a L-112; Q-73 a G-111; Q-73 a A-110; Q-73 a T-109; Q-73 a V-108; Q-73 a A-107; Q-73 a P-106; Q-73 a A-105; Q-73 a E-104; Q-73 a E-103; Q-73 a L-102; Q73 a G-101; Q-73 a A-100; Q-73 a K-99; Q-73 a P-98; Q-73 a A-97; Q-73 a G-96; Q-73 a A-95; Q-73 a G-94; Q-73 a A-93; Q-73 a P-92; Q-73 a L-91; Q-73 a K-90; Q-73 a E-89; Q-73 a A-88; Q-73 a H-87; Q-73 a H-86; Q-73 a G-85; Q73 a Q-84; Q-73 a L-83; Q-73 a E-82; Q-73 a A-81; Q-73 a R-80; Q-73 a L-79; and Q-73 a S-78 de la SEQ ID NO: 3229. La presente memoria descriptiva también describe anticuerpos que se unen a polipéptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia contigua de restos aminoacídicos con una identidad de al menos un 80%, un 85%, un90 %, un 92 %, un 95 %, un 96 %, un 97%, un 98% o un 99 % con la secuencia de aminoácidos de polipéptidos de BLyS descritos anteriormente.
La memoria descriptiva también describe polipéptidos que tienen uno o más aminoácidos delecionados tanto del extremo amino como carboxilo terminal del dominio extracelular predicho de BLyS, que pueden describirse generalmente como que tienen los restos n4-m4 de la SEQ ID NO: 3229, donde n4 y m4 son números enteros como se han definido anteriormente.
En otro aspecto, los anticuerpos de la presente invención se unen a polipéptidos que consisten en una porción del dominio extracelular de la secuencia de aminoácidos de BLyS codificada por el clon de ADNc contenido en el depósito que tiene el N.º de acceso de la ATCC 203518, en los que esta porción excluye de 1 a aproximadamente 260 aminoácidos del extremo amino-terminal del dominio extracelular de la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc contenido en el depósito que tiene el N.º de acceso de la ATCC 203518, o de 1 a aproximadamente 187 aminoácidos del extremo carboxi-terminal del dominio extracelular de la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc contenido en el depósito que tiene el N.º de acceso de la ATCC 203518, o cualquier combinación de las deleciones amino-terminales y carboxi-terminales anteriores, del dominio extracelular completo de la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc contenido en el depósito que tiene el N.º de acceso de la ATCC 203518.
Como se ha mencionado anteriormente, incluso si la deleción de uno o más aminoácidos del extremo N-terminal de un polipéptido da como resultado la modificación o pérdida de una o más actividades funcionales (por ejemplo, la actividad biológica) del polipéptido, todavía pueden conservarse otras actividades funcionales. Por lo tanto, la capacidad de un polipéptido de BLyS acortado para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconozcan las formas madura o de longitud completa o el dominio extracelular del polipéptido se conservará generalmente cuando se eliminen menos de la mayoría de los restos del dominio extracelular o forma madura o de longitud completa del polipéptido del extremo N-terminal. Puede determinarse fácilmente por procedimientos de rutina descritos en el presente documento y conocidos de otro modo en la técnica si un polipéptido particular que carece de restos Nterminales de un polipéptido completo conserva dichas actividades inmunológicas. No es improbable que una muteína de BLyS con un gran número de restos aminoacídicos N-terminales delecionados pueda conservar actividades funcionales (por ejemplo, inmunogénicas). De hecho, los péptidos compuestos por tan pocos como seis restos aminoacídicos de BLyS pueden provocar con frecuencia una respuesta inmune.
En consecuencia, la presente memoria descriptiva describe además anticuerpos que se unen a polipéptidos que tienen uno o más restos delecionados del extremo amino-terminal de la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha del polipéptido de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3229, hasta el resto de glicina en el número de posición 261 de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 3229, y polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. En particular, la presente memoria descriptiva describe anticuerpos que se unen a polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de los restos n5-266 de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 3229, donde n5 es un número entero en el intervalo de las posiciones aminoacídicas de los restos aminoacídicos I a 261 de
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Por lo tanto, la memoria descriptiva describe además anticuerpos que se unen a variaciones de polipéptidos de BLyS que muestran actividad funcional de polipéptido de BLyS (por ejemplo, actividad biológica) o que incluyen regiones de polipéptido de BLyS, tales como los fragmentos polipeptídicos descritos en el presente documento. Dichos mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones tipo seleccionadas de acuerdo con las regias generales conocidas en la técnica, para que tengan un escaso efecto sobre la actividad. Por ejemplo, se proporcionan orientaciones en relación con cómo realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas en Bowie, J. U. y col., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247:1306-1310 (1990), en el que los autores indican que hay dos estrategias principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos al cambio. El primer procedimiento se basa en el procedimiento de evolución, en el que las mutaciones se aceptan o rechazan por selección natural. La segunda estrategia usa la modificación por ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado y selecciones o exploraciones para identificar secuencias que mantengan su funcionalidad.
Como indican los autores, estos estudios han puesto de manifiesto que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a sustituciones de aminoácidos. Los autores indican además qué cambios de aminoácidos serán probablemente permisivos en cierta posición de la proteína. Por ejemplo, los restos aminoacídicos más enterrados requieren cadenas laterales no polares, mientras que pocas características de las cadenas laterales superficiales están conservadas generalmente. Otras sustituciones fenotípicamente silenciosas de este tipo se describen en Bowie, J. U. y col., anteriormente, y en las referencias citadas en el mismo. Típicamente se ven como sustituciones conservativas las sustituciones, de uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e lie; el intercambio de los restos hidroxilo Ser y Thr, el intercambio de los restos ácidos Asp y Glu, la sustitución entre los restos amida Asn y Gin, el intercambio de los restos básicos Lys y Arg y las sustituciones entre los restos aromáticos Phe, Tyr.
Por lo tanto, los anticuerpos que se describen en Ia presente memoria pueden unirse a fragmentos, derivados o análogos del polipéptido de la SEQ ID NO: 3228, o del codificado por el plásmido de ADNc depositado, tales como
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polipéptidos en los que uno o más de los restos aminoacídicos se sustituyen con un resto aminoacídico conservado o no conservado (preferentemente un resto aminoacídico conservado) y dicho resto aminoacídico sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético, o (ii) polipéptidos en los que uno o más de los restos aminoacídicos incluyen un grupo sustituyente, o (iii) polipéptidos en los que el dominio extracelular del polipéptido se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) polipéptidos en los que los aminoácidos adicionales se fusionan con el dominio extracelular del polipéptido, tales como un péptido de fusión de región Fe de IgG o secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para la purificación del dominio extracelular del polipéptido o una secuencia de proproteína.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden unirse a fragmentos, derivados o análogos del polipéptido de la SEQ ID NO: 3229, o del codificado por el plásmido de ADNc depositado, tales como (i) polipéptidos en los que uno o más de los restos aminoacídicos se sustituyen con un resto aminoacídico conservado o no conservado (preferentemente un resto aminoacídico conservado) y dicho resto aminoacídico sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético, o (ii) polipéptidos en los que uno o más de los restos aminoacídicos incluyen un grupo sustituyente, o (iii) polipéptidos en los que el dominio extracelular del polipéptido se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o
(iv)
polipéptidos en los que los aminoácidos adicionales se fusionan con el dominio extracelular del polipéptido, tal como un fragmento soluble biológicamente activo de otro miembro de la familia de ligandos del TNF (por ejemplo, el ligando de CD40), un péptido de fusión de región Fe de IgG o secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para la purificación del dominio extracelular del polipéptido o una secuencia de proproteína. Dichos fragmentos, derivados o análogos se consideran dentro del alcance de los expertos en la materia a partir de los contenidos del presente documento.
Por lo tanto, los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden unirse a polipéptidos de BLyS que incluyen una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, a partir de mutaciones naturales o de manipulación humana. Como se indica, los cambios son preferentemente de una naturaleza menor, tales como sustituciones de aminoácidos conservativas que no afectan significativamente al plegamiento o a la actividad de la proteína (véase la Tabla 13).
TABLA 13. Sustituciones de Aminoácidos Conservativas.
Aromático Hidrófobo
Fenilalanina Triptófano Tirosina Leucina Isoleucina Valina
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sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; R130 sustituido con H o K; N131 sustituido con Q; K132 sustituido con H o R; R133 sustituido con H o K; A134 sustituido con G, I, L, S, T, M ο V; V135 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; Q136 sustituido con N; G137 sustituido con A, I, L, S, T, M ο V; E139 sustituido con D; E140 sustituido con D; T141 sustituido con A, G, I, L, S, M ο V; V142 sustituido con A, G, I, L, S, T ο Μ; T143 sustituido con A, G, I, L, S, M ο V; Q144 sustituido con N; D145 sustituido con E; L147 sustituido con A, G, I, S, T, M o V; Q148 sustituido con N; L149 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; 1150 sustituido con A, G, L, S, T, M ο V; A151 sustituido con G, I, L, S, T, M ο V; D152 sustituido con E; S153 sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; E154 sustituido con D; T155 sustituido con A, G, I, L, S, M o V; T157 sustituido con A, G, I, L, S, M ο V; 1158 sustituido con A, G, L, S, T, M ο V; Q159 sustituido con N; K160 sustituido con H o R; G161 sustituido con A, I, L, S, T, M ο V; S162 sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; Y163 sustituido con F o W; T164 sustituido con A, G, I, L, S, M ο V; F165 sustituido con W o Y; V166 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; W 168 sustituido con F o Y; L169 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; L170 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; S171 sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; F172 sustituido con W o Y; K173 sustituido con H o R; R174 sustituido con H o K; G175 sustituido con A, I, L, S, T, M ο V; S 176 sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; A 177 sustituido con G, I, L, S, T, M ο V; L178 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; E179 sustituido con D; E180 sustituido con D; K181 sustituido con H o R; E182 sustituido con D; N183 sustituido con Q; K184 sustituido con H o R; 1185 sustituido con A, G, L, S, T, M ο V; L186 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; V187 sustituido con A, G, I, L, S, T ο Μ; K188 sustituido con H o R; E189 sustituido con D; T190 sustituido con A, G, I, L, S, M ο V; Gl 91 sustituido con A, I, L, S, T, M ο V; Y192 sustituido con F o W; F193 sustituido con W o Y; F194 sustituido con W ο Y; 1195 sustituido con A, G, L, S, T, M ο V; Y196 sustituido con F o W; G 197 sustituido con A, I, L, S, T, M ο V; Q 198 sustituido con N; V199 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; L200 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; Y201 sustituido con F o W; T202 sustituido con A, G, I, L, S, M ο V; D203 sustituido con E; K204 sustituido con H o R; T205 sustituido con A, G, I, L, S, M ο V; Y206 sustituido con F o W; A207 sustituido con G, I, L, S, T, M ο V; M208 sustituido con A, G, I, L, S, T ο V; G209 sustituido con A, I, L, S, T, M ο V; H210 sustituido con K o R; L211 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; 1212 sustituido con A, G, L, S, T, M ο V; Q213 sustituido con N; R214 sustituido con H o K; K215 sustituido con H o R; K216 sustituido con H o R; V217 sustituido con A, G, I, L, S, T ο Μ; H218 sustituido con K o R; V219 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; F220 sustituido con W o Y; G221 sustituido con A, I, L, S, T, M ο V; D222 sustituido con E; E223 sustituido con D; L224 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; S225 sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; L226 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; V227 sustituido con A, G, I, L, S, T ο Μ; T228 sustituido con A, G, I, L, S, M ο V; L229 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; F230 sustituido con W o Y; R231 sustituido con H ο K; 1233 sustituido con A, G, L, S, T, M ο V; Q234 sustituido con N; N235 sustituido con Q; M236 sustituido con A, G, I, L, S, T ο V; E238 sustituido con D; T239 sustituido con A, G, I, L, S, M ο V; L240 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; N242 sustituido con Q; N243 sustituido con Q; S244 sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; Y246 sustituido con F o W; S247 sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; A248 sustituido con G, I, L, S, T, M ο V; G249 sustituido con A, I, L, S, T, M ο V; 1250 sustituido con A, G, L, S, T, M ο V; A251 sustituido con G, I, L, S, T, M ο V; K252 sustituido con H o R; L253 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; E254 sustituido con D; E255 sustituido con D; G256 sustituido con A, I, L, S, T, M ο V; D257 sustituido con E; E258 sustituido con D; L259 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; Q260 sustituido con N; L261 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; A262 sustituido con G, I, L, S, T, M ο V; 1263 sustituido con A, G, L, S, T, M ο V; R265 sustituido con H o K; E266 sustituido con D; N267 sustituido con Q; A268 sustituido con G, I, L, S, T, M ο V; Q269 sustituido con N; 1270 sustituido con A, G, L, S, T, M ο V; S271 sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; L272 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; D273 sustituido con E; G274 sustituido con A, I, L, S, T, M ο V; D275 sustituido con E; V276 sustituido con A, G, I, L, S, T ο Μ; T277 sustituido con A, G, I, L, S, M ο V; F278 sustituido con W o Y; F279 sustituido con W ο Y; G280 sustituido con A, I, L, S, T, M ο V; A281 sustituido con G, I, L, S, T, M ο V; L282 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; K283 sustituido con H o R; L284 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; y/o L285 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V.
También pueden realizarse cambios dirigidos a nivel de aminoácido de BLyS por sustitución de un aminoácido particular con una sustitución conservativa. Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden unirse a secuencias de aminoácidos de BLyS que contienen mutaciones por sustitución conservativa del polipéptido de la SEQ ID NO: 3229 incluyendo: Ml sustituido con A, G, I, L, S, T ο V; D2 sustituido con E; D3 sustituido con E; S4 sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; T5 sustituido con A, G, I, L, S, M ο V; E6 sustituido con D; R7 sustituido con H
o K; E8 sustituido con D; Q9 sustituido con N; SlO sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; Rll sustituido con H o K; L12 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; T13 sustituido con A, G, I, L, S, M ο V; S14 sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; L16 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; K17 sustituido con H o R; K18 sustituido con H o R; R19 sustituido con H o K; E20 sustituido con D; E21 sustituido con D; M22 sustituido con A, G, I, L, S, T ο V; K23 sustituido con H o R; L24 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; K25 sustituido con H o R; E26 sustituido con D; V28 sustituido con A, G, I, L, S, T
o M; S29 sustituido con A, G, I, L, T, Μ, ο V; 130 sustituido con A, G, L, S, T, M ο V; L31 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; R33 sustituido con H o K; K34 sustituido con H o R; E35 sustituido con D; S36 sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; S38 sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; V39 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; R40 sustituido con H o K; S41 sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; S42 sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; K43 sustituido con H o R; D44 sustituido con E; G45 sustituido con A, I, L, S, T, M ο V; K46 sustituido con H o R; L47 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; L48 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; A4 9 sustituido con G, I, L, S, T, M ο V; A50 sustituido con G, I, L, S, T, M ο V; T51 sustituido con A, G, I, L, S, M ο V; L52 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; L53 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; L54 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; A55 sustituido con G, I, L, S, T, M ο V; L56 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; L57 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; S58 sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; L61 sustituido con A, G, I, S, T, M ο V; T62 sustituido con A, G, I, L, S, M ο V; V63 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; V64 sustituido con A, G, I, L, S, T o M; S65 sustituido con A, G, I, L, T, M ο V; F66 sustituido con W o Y; Y67 sustituido con F o W; Q68 sustituido con N; V69
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como por ejemplo, la proliferación, diferenciación y/o activación. Por consiguiente, los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden unirse a aminoácidos en los polipéptidos de BLyS que son esenciales para su función. En aspectos preferidos, los anticuerpos que se describen en la presente invención se unen a aminoácidos en los polipéptidos de BLyS que son esenciales para su función e inhiben la función del polipéptido de BLyS. En otros aspectos preferidos, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a aminoácidos en los polipéptidos de BLyS que son esenciales para su función y aumentan la función del polipéptido de BLyS.
Son de interés especial las sustituciones de aminoácidos cargados con otros aminoácidos cargados o neutros que puedan producir proteínas con características mejoradas altamente deseables, tales como una menor agregación. La agregación puede no sólo reducir la actividad, sino que también puede ser problemática al preparar formulaciones farmacéuticas, debido a que los agregados pueden ser inmunogénicos (Pinekard y col., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins y col., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland y col., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993).
La memoria descriptiva también describe anticuerpos que se unen a polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que contienen sustituciones no conservativas de la secuencia de aminoácidos proporcionada en la SEQ ID NO: 3228. Por ejemplo, las sustituciones no conservativas de la secuencia proteica de BLyS proporcionada en la SEQ ID NO: 3228 incluyen: Ml sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; D2 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; D3 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; S4 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; T5 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; E6 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; R7 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P
o C; E8 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; Q9 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, F, W, Y, P o C; SlO sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Rll sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L12 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; T13 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; S14 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; C15 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y o P; L16 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; K 17 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; Kl8 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; Rl 9 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E20 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E21 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; M22 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; K2 3 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L24 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; K25 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E26 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; C27 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y o P; V28 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F,W, Y, P o C; S29 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P
o C; 130 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L31 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C, P32 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Y ο C; R33 sustituido con D, Ε, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Κ34 sustituido con D, Ε, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Ε35 sustituido con Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; S36 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Ρ37 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Y ο C; S38 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; V39 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, Po C; R40 sustituido con D, Ε, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; S41 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; S42 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Κ43 sustituido con D, Ε, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; D44 sustituido con Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; G45 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Κ46 sustituido con D, Ε, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; L47 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; L48 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; A4 9 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Α50 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Τ51 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; L52 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; L53 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; L54 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Α55 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; L56 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; L57 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; S58 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; C59 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Y ο Ρ; C60 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Y ο Ρ; L61 I sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Τ62 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; V63 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, Po C; V64 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; S65 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; F66 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Po C; Υ67 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Po C; Q68 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, F, W, Υ, P ο C; V69 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Α70 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Α71 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; L72 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Q73 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, F, W, Υ, P ο C; G74 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; D75 sustituido con Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; L76 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Y, P o C; All sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; S78 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L79 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; R80 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; A81 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; E82 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L83 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Q84 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; G85 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; H86 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; H87 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; A88 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; E89 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; K90 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; L91 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P92 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y o C; A93 sustituido
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con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; G94 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A95 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; G96 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A97 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; P98 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y o C; K99 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; AlOO sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; GlOl sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; L102 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; E103 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E104 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; A105 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P106 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y o C; A107 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; V108 sustituido con D, E, Η, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; T109 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; AllO sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Gill sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; L112 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; K113 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; 1114 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; F115 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, Μ, V, Po C; E116 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; P117 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y o C; Pl18 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y o C; Al19 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P120 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y o C; G121 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; E122 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; G123 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; N124 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, F, W, Y, P
o C; S125 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; S126 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; Q127 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, F, W, Y, P o C; N128 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, F, W, Y, P o C; S12 9 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; R130 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, Po C; N131 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, F, W, Y, P o C; K132 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; R133 sustituido con D, E, A, G, I, L, S, Tom, V, N, Q, F, W, Y, P o C; A134 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; V135 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; Q136 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, F, W, Y, P o C; G 137 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; P138 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y o C; E139 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; E140 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; T141 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; V 142 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; T143 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Q144 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, F, W, Y, P o C; D145 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; C146 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y o P; L147 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; Q148 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, F, W, Y, P o C; L149 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, Po C; 1150 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; A151 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; D152 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; S 153 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; E154 sustituido con H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y, P o C; T155 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; P156 sustituido con D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Μ, V, N, Q, F, W, Y o C; T157 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; 1158 sustituido con D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; Q15 9 sustituido con D, E, Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, F, W, Υ, P ο C; Kl60 sustituido con D, Ε, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Gl61 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; S162 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, Po C; Υ163 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Po C; Τ164 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, Po C; F165 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Po C; V166 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, Po C; Ρ167 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Y ο C; W168 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Po C; L169 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; L170 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, Po C; S171 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; F172 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Po C; Κ173 sustituido con D, Ε, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; R174 sustituido con D, Ε, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; G175 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, Po C; S 176 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Α177 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; L178 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Ε17 9 sustituido con Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; El 80 sustituido con Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Κ181 sustituido con D, Ε, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; El82 sustituido con Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Ν183 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, F, W, Υ, P ο C; Κ184 sustituido con D, Ε, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; 1185 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; L186 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; V 187 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, Po C; Κ188 sustituido con D, Ε, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, Po C; El 8 9 sustituido con Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Tl 90 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; G191 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, Po C; Υ192 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Po C; F193 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Po C; Fl 94 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Po C; 1195 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Υ196 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Po C; Gl 97 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Q198 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, F, W, Υ, P ο C; Vl 99 sustituido con D, E, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; L200 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, Po C; Υ201 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Po C; Τ202 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, Po C; D203 sustituido con Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Κ204 sustituido con D, Ε, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, Po C; Τ205 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Υ206 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Po C; Α207 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Μ208 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, Po C; G209 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Η210 sustituido con D, Ε, Α, G, I, L, S, Τ, Μ, V, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; L211 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; 1212 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, Ν, Q, F, W, Υ, P ο C; Q213 sustituido con D, Ε, Η, Κ, R, A, G, I, L, S, Τ, Μ, V, F, W, Υ, P ο C; R214 sustituido con D, Ε, A, G, I, L, S,
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Los anticuerpos también se unen a polipéptidos de BLyS que comprenden, o alternativamente consisten en una secuencia de aminoácidos de BLyS en la que más de un aminoácido (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 y 50) se sustituye con los aminoácidos sustituidos como se ha descrito anteriormente (conservativos o no conservativos).
La sustitución de aminoácidos también puede cambiar la selectividad de la unión de un ligando a receptores de superficie celular. Por ejemplo, Ostade y col., Nature 361:266-268 (1993) describe ciertas mutaciones que dan como resultado la unión selectiva de TNF-alfa a sólo uno de los dos tipos conocidos de receptores de TNF. Puesto que BLyS es un miembro de la familia de polipéptidos del TNF, mutaciones similares a las del TNF-alfa es probable que tengan efectos similares en polipéptidos de BLyS.
También pueden determinarse sitios que sean críticos para la unión de ligando-receptor por análisis estructural, tal como cristalización, resonancia magnética nuclear o marcaje por fotoafinidad (Smith y col., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) y de Vos y col. Science 255:306-312 (1992)).
Puesto que BLyS es un miembro de la familia de proteínas relacionadas con TNF, pueden realizarse mutaciones en secuencias que codifican aminoácidos en el dominio conservado de TNF, por ejemplo, en las posiciones Gly-191 a Leu-284 de la SEQ ID NO: 3228 o en las posiciones Gly-172 a Leu-265 de la SEQ ID NO: 3229, y pueden modular más que eliminar completamente las actividades funcionales (por ejemplo, las actividades biológicas) de polipéptidos de BLyS o fragmentos o variantes de los mismos. Por consiguiente, los anticuerpos de la presente invención pueden unirse a polipéptidos de BLyS que tengan mutaciones en el dominio conservado de TNF. Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden unirse a polipéptidos de BLyS que tengan mutaciones en el dominio conservado de TNF y actúen como antagonistas de BLyS. En otros aspectos preferidos, los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden unirse a polipéptidos de BLyS que tengan mutaciones en el dominio conservado de TNF y actúen como agonistas de BLyS.
Puede usarse la tecnología de ADN recombinante conocida por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, el barajado de ADN anterior) para crear nuevas proteínas mutantes o muteínas que incluyan una sola o múltiple sustituciones, deleciones, adiciones de aminoácidos o proteínas de fusión. Dichos polipéptidos modificados pueden mostrar, por ejemplo, una actividad aumentada o una estabilidad aumentada. Además, pueden purificarse en mayores rendimientos y muestran una mejor solubilidad que el polipéptido natural correspondiente, al menos en determinadas condiciones de purificación y almacenamiento.
Por lo tanto, la memoria descriptiva también describe anticuerpos que se unen a derivados de BLyS y análogos que tienen uno o más restos aminoacídicos delecionados, añadidos o sustituidos para generar polipéptidos de BLyS, por ejemplo, que estén mejor adaptados a la expresión, aumento a escala, etc., en las células hospedadoras. Por ejemplo, pueden delecionarse o sustituirse los restos de cisteína con otro resto aminoacídico para eliminar puentes disulfuro; pueden alterarse o eliminarse sitios de glucosilación ligada a N para conseguir, por ejemplo, la expresión de un producto homogéneo que se recupere y purifique más fácilmente a partir de hospedadores de levadura que se sabe que hiperglucosilan sitios ligados a N. Con este fin, una diversidad de sustituciones de aminoácidos en una o ambas de la primera o tercera posición de aminoácido en una o más de cualquiera de las secuencias de reconocimiento de glucosilación en los polipéptidos de BLyS de la presente invención, y/o una deleción de aminoácido en la segunda posición de una o más de cualquiera de dichas secuencias de reconocimiento evitará la glucosilación del BLyS en la secuencia tripeptídica modificada (véase, por ejemplo, Miyajimo y col., EMBO J 5(6) : 1193-1197) . A modo de ejemplo no limitante, la mutación de la serina en la posición 244 a alanina, individualmente
o en combinación con la mutación de la asparagina en la posición 242 a glutamina, suprime la glucosilación de la forma soluble madura de BLyS (por ejemplo, los aminoácidos 134-285 de la SEQ ID NO: 3228) cuando se expresa en la levadura Pichea pastoris. Un polipéptido de BLyS mutante en el que sólo se muta la asparagina en la posición 242 a glutamina se glucosila todavía cuando se expresa en Pichea pastoris. En este mutante, el acontecimiento de glucosilación puede deberse a la activación o desenmascaramiento de un sitio de glucosilación ligado a O en la serina 244. También podrían realizarse mutaciones similares que afecten a la glucosilación en el polipéptido de BLyS de la SEQ ID NO: 3229, es decir, la asparagina 223 a glutamina y/o la serina 224 a alanina de la SEQ ID NO: 3229. Además, uno o más de los restos aminoacídicos de los polipéptidos que se describen en el presente documento (por ejemplo, los restos de arginina y lisina) pueden delecionarse o sustituirse con otro resto para eliminar el procesamiento no deseado por proteasas tales como, por ejemplo, furinas o kexinas. Un resultado posible de dicha situación es que el polipéptido de BLyS de la presente invención no se escinde y libera de la superficie celular. Por consiguiente, los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden unirse a derivados de BLyS y análogos que tengan uno o más restos aminoacídicos delecionados, añadidos o sustituidos. Los anticuerpos que se describen en el presente documento también se unen a derivados, variantes o análogos de BLyS que son incapaces de escindirse de la superficie celular.
Específicamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipéptidos de BLyS en los que la Lys-132 y/o la Arg-133 de la secuencia de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3228 se mutan a otro resto aminoacídico, o se delecionan por completo, para impedir o disminuir la liberación de la forma soluble de BLyS a partir de células que expresen BLyS. Más específicamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipéptidos de BLyS en los que la Lys-132 de la secuencia de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3228 se muta a Ala-132. Los anticuerpos específicos que se describen en el presente documento también se
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porciones de dichos polipéptidos con al menos 30 aminoácidos y, más preferentemente, al menos 50 aminoácidos. También se describen en el presente documento polinucleótidos que codifican estos polipéptidos.
Por "% de similitud" para dos polipéptidos se entiende una puntuación de similitud producida por la comparación de las secuencias de aminoácidos de los dos polipéptidos usando el programa Bestfit (Paquete de Análisis de Secuencias Wisconsin, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711) y los ajustes por defecto para determinar la similitud. Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2:482-489, 1981) para encontrar el mejor segmento de similitud entre dos secuencias.
Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una "identidad" de al menos, por ejemplo, un 95 % con una secuencia de aminoácidos de referencia de un polipéptido de BLyS se entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia excepto por que la secuencia polipeptídica puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de los aminoácidos de referencia del polipéptido de BLyS. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos un 95 % con una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta un 5 % de los restos aminoacídicos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse con otro aminoácido, o varios aminoácidos hasta un 5 % del total de restos aminoacídicos en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino-o carboxi-terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia, o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre restos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Como materia práctica, si cualquier polipéptido particular tiene una identidad de al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % con, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3228, la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc depositado HNEDU15 (N.º de Acceso ATCC 97768), o fragmentos de la misma o, por ejemplo, con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3229, la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc depositado HDPMC52 (N.º de Acceso ATCC 203518), o fragmentos de la misma, puede determinarse de forma convencional usando programas informáticos conocidos tales como el programa Bestfit (Paquete de Análisis de Secuencias Wisconsin, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711). Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular tiene una identidad de, por ejemplo, un 95 % con una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se ajustan, por supuesto, de modo que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia y que se permitan huecos en la homología de hasta un 5 % del número total de restos aminoacídicos en la secuencia de referencia.
En un aspecto especifico descrito y desvelado en el presente documento, la identidad entre una secuencia de referencia (de consulta) (una secuencia de la presente invención o como se describe en el presente documento) y una secuencia objeto, también denominada alineamiento de secuencias global, se determina usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag y col. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)). Los parámetros preferidos usados en un alineamiento de aminoácidos FASTDB son: Matriz = PAM 0, k-tuple = 2, Penalización por Emparejamiento Erróneo = 1, Penalización por Unión = 20, Longitud del Grupo de Aleatorización = 0, Puntuación de Corte = 1, Tamaño de Ventana = longitud de la secuencia, Penalización por Hueco = 5, Penalización por Tamaño de Hueco = 0,05, Tamaño de Ventana = 500 o la longitud de la secuencia de aminoácidos objeto, lo que sea más corto. De acuerdo con este aspecto, si la secuencia objeto es más corta que la secuencia de consulta debido a deleciones N-o C-terminales, no debido a deleciones internas, se realiza una corrección manual de los resultados para tener en cuenta el hecho de que el programa FASTDB no tiene en cuenta los truncamientos N-y C-terminales de la secuencia objeto cuando se calcula el porcentaje de identidad global. Para las secuencias objeto truncadas en los extremos N-y C-terminales respecto a la secuencia de consulta, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de restos de la secuencia de consulta que son N-y C-terminales de la secuencia objeto, que no están emparejados/alineados con un resto objeto correspondiente, como porcentaje del total de bases de la secuencia de consulta. Una determinación de si un resto está emparejado/alineado se determina mediante los resultados del alineamiento de secuencias FASTDB. Después, este porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado mediante el programa FASTDB anterior usando los parámetros especificados, para llegar a un resultado de porcentaje de identidad final. Este resultado de porcentaje de identidad final es el que se usa para los fines de este aspecto. Sólo se consideran los restos en los extremos N-y C-terminales de la secuencia objeto que no están emparejados/alineados con la secuencia de consulta con el fin de ajustar manualmente el resultado del porcentaje de identidad. Es decir, solo las posiciones de restos de consulta fuera de los restos N-y C-terminales más alejados de Ia secuencia objeto. Por ejemplo, una secuencia objeto de 90 restos aminoacídicos se alinea con una secuencia de consulta de 100 restos para determinar su porcentaje de identidad. La deleción aparece en el extremo N-terminal de Ia secuencia objeto y, por lo tanto, el alineamiento FASTDB no muestra un emparejamiento/alineamiento de los 10 primeros restos en el extremo N-terminal. Los 10 restos no emparejados representan 10% de Ia secuencia (número de restos en los extremos N-y C-terminales no emparejados/número total de restos en Ia secuencia de consulta) de modo que se resta 10% del resultado del porcentaje de identidad calculado mediante el programa FASTDB. Si los 90 restos restantes están perfectamente emparejados el porcentaje de identidad final sería de 90%. En otro ejemplo, una secuencia objeto de 90 restos se compara con una secuencia de consulta de 100 restos. Esta
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o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de estos scFv que se unen inmunoespecíficamente a BLyS, preferentemente a la forma soluble de BLyS, así como las moléculas de ácido nucleico que codifican estos scFv, moléculas, fragmentos y/o variantes.
También se describen en el presente documento scFv que se unen inmunoespecíficamente a la forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los dominios VH contenidos en las SEQ ID NO: 1881 -2128 que se describe en la Tabla 1 y/o uno cualquiera de los dominios VL contenidos en las SEQ ID NO: 1881 -2128 que se describen en la Tabla 1. También se describen en el presente documento scFv de la presente invención que se unen inmunoespecíficamente a la forma soluble de BLyS, que comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una CDR de VH y una CDR de VL del mismo scFv mencionado en la Tabla 1. También se describen en el presente documento scFv de la presente invención que se unen inmunoespecíficamente a la forma unida a membrana de BLyS, que comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio VH y un dominio VL de scFv diferentes mencionados en la Tabla 1. También se describen en el presente documento scFv que se unen específicamente a la forma unida a membrana de BLyS, que comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una, dos, tres o más de cualquiera de las CDR de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1881 -2128 que se describen en la Tabla 1 y/o una, dos, tres o más de cualquiera de las CDR de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1881 -2128 que se describen en la Tabla 1. Los scFv que se describen en el presente documento que se unen inmunoespecíficamente a la forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio VH y un dominio VL del mismo scFv mencionado en la Tabla 1. Alternativamente, los scFv que se describen en el presente documento que se unen inmunoespecíficamente a la forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH y un dominio VL de scFv diferentes mencionados en la Tabla 1. Preferentemente, los scFv que se unen inmunoespecíficamente a la forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR3 de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1881 -2128 que se describen en la Tabla 1 y/o una cualquiera de las CDR3 de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1881 -2128 que se describen en la Tabla 1. Preferentemente, los scFv que se describen en el presente documento que se unen inmunoespecíficamente a la forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio VH y un dominio VL del mismo scFv mencionado en la Tabla 1. Alternativamente, los scFv que se unen inmunoespecíficamente a la forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una CDR de VH y una CDR de VL de scFv diferentes mencionados en la Tabla 1. También se describen en el presente documento moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de estos scFv, que se unen inmunoespecíficamente a BLyS, preferentemente a la forma unida a membrana de BLyS, así como las moléculas de ácido nucleico que codifican estos scFv, moléculas, fragmentos y o variantes.
En un aspecto específico, los scFv que se unen inmunoespecíficamente a la forma soluble y a la forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los dominios VH contenidos en las SEQ ID NO: 1 -1562 que se describen en la Tabla 1 y/o uno cualquiera de los dominios VL contenidos en las SEQ ID NO: 1 -1562 que se describen en la Tabla 1. Preferentemente, los scFv de la presente invención que se unen inmunoespecíficamente a las formas soluble y unida a membrana de BLyS comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio VH y un dominio VL del mismo scFv mencionado en la Tabla 1. Alternativamente, los scFv que se describen en el presente documento que se unen inmunoespecíficamente a la forma soluble y a la forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio VH y un dominio VL de scFv diferentes mencionados en la Tabla
1. En un aspecto específico, los scFv que se unen inmunoespecíficamente a Ia forma soluble y a Ia forma unida a membrana de BLyS también comprenden un polipéptido que tiene Ia secuencia de aminoácidos de una, dos, tres o más de cualquiera de las CDR de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1 -1562 que se describen en la Tabla 1 y/o una, dos, tres o más de cualquiera de las CDR de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1 -1562 que se describen en la Tabla 1. Preferentemente, los scFv que se describen en Ia presente memoria que se unen inmunoespecíficamente a Ia forma soluble y a Ia forma unida a membrana de BLyS comprenden un polipéptido que tiene Ia secuencia de aminoácidos de un dominio VH y un dominio VL del mismo scFv mencionado en la Tabla 1. Alternativamente, los scFv que se describen en Ia presente memoria que se unen inmunoespecíficamente a las formas soluble y unida a membrana de BLyS comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio VH y un dominio VL de scFv diferentes mencionados en la Tabla 1. Preferentemente, los scFv que se unen inmunoespecíficamente a las formas soluble y unida a membrana de BLyS comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR3 de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1 -1562 que se describen en la Tabla 1 y/o una cualquiera de las CDR3 de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1 -1562 que se describen en la Tabla 1. Preferentemente, los scFv que se unen inmunoespecíficamente a las formas soluble y unida a membrana de BLyS comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una CDR de VH y una CDR de VL del mismo scFv mencionado en la Tabla 1. Alternativamente, los scFv que se describen en el presente documento que se unen inmunoespecíficamente a las formas soluble y unida a membrana de BLyS comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una CDR de VH y una CDR de VL de scFv diferentes mencionados en la Tabla 1. También se describen en el presente documento moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de estos scFv o moléculas que se unen inmunoespecíficamente a BLyS, preferentemente las formas soluble y unida a membrana de BLyS, así como las moléculas de ácido nucleico que codifican estos scFv, moléculas, fragmentos y/o variantes.
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Preferentemente, un anticuerpo que se describe en el presente documento comprende, o alternativamente consiste en un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de un dominio VH, CDR de VH, dominio VL o CDR de VL de uno cualquiera de los contenidos en las secuencias mencionadas en la Tabla 1. Los anticuerpos que se describen en el presente documento también incluyen moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos o variantes de los anticuerpos anteriores que se unen inmunoespecíficamente a BLyS.
Más preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento son anticuerpos completos o fragmentos de anticuerpo que se unen inmunoespecíficamente a BLyS humano. Los fragmentos de anticuerpo de la presente invención que se unen inmunoespecíficamente a BLyS humano incluyen, pero sin limitación, Fab, Fab' y F(ab')2, fragmentos Fd, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, Fv unidos por enlaces disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden, o alternativamente consisten en un dominio VL o VH y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores.
Los fragmentos de anticuerpo de unión a BLyS, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla, pueden comprender, o alternativamente consistir en la región o regiones variables en solitario o en corabinación con la totalidad o una parte de los siguientes: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento comprenden, o alternativamente consisten en un polipéptido que se une inmunoespecíficamente a BLyS, comprendiendo dichos polipéptidos, o alternativamente consistiendo en una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más CDR mencionadas en la Tabla 1, preferentemente un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de una CDR3 de VH y/o una CDR3 de VL de las contenidas en las SEQ ID NO: 1 -46, 321 -329, 834 -872, 1563 -1595 o 1881 -1908, que se describen en la Tabla 1. Más preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento comprenden, o alternativamente consisten en una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más CDR del mismo scFv al que se hace referencia en la Tabla 1. Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden ser de cualquier origen animal, incluyendo aves y mamíferos. Preferentemente, los anticuerpos son humanos, murinos (por ejemplo, de ratón y rata), de burro, de oveja, de conejo, de cabra, de cobaya, de camello, de caballo o de polio. Más preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos humanos. Como se usa en el presente documento, el término de anticuerpos "humanos" incluye anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluye anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana y xenoratones u otros organismos que se han obtenido por ingeniería genética para producir anticuerpos humanos. Para una discusión detallada de unas pocas tecnologías para la producción de anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y de protocolos para producir dichos anticuerpos, véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Patente Europea N.º 0 598 877; Patentes de EE.UU. N.º 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771 y 5.939.598; y Lonberg y Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:6593(1995). Pueden producirse anticuerpos humanos o anticuerpos monoclonales quiméricos "humanizados" usando técnicas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la técnica. Por ejemplo, se conocen en la técnica procedimientos para producir anticuerpos quiméricos. Véanse para una revisión las referencias siguientes: Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi y col., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly y col., Patente de Estados Unidos N.º 4.816.567; Taniguchi y col., documento EP 171496; Morrison y col., documento EP 173494; Neuberger y col., documento WO 8601533; Robinson y col., documento WO 8702671; Boulianne y col., Nature 312:643 (1984); Neuberger y col., Nature 314:268 (1985). Además, compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) y Genpharm (San José, CA) pueden ocuparse de proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando una tecnología similar a la descrita anteriormente.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden ser monovalentes, bivalentes, trivalentes o multivalentes. Por ejemplo, los scFv monovalentes pueden multimerizarse químicamente o por asociación con otra proteína o sustancia. Un scFv que está fusionado a una etiqueta de hexahistidina o una etiqueta Flag puede multimerizarse usando Ni-NTA agarosa (Qiagen) o usando anticuerpos anti-Flag (Stratagene, Inc.).
Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido de BLyS, o fragmento del mismo, o pueden ser específicos tanto para un polipéptido de BLyS, o fragmento del mismo, como para un epítopo heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, y col., J. Immunol. 147:60-69 (1991); las Patentes de EE.UU. N.º 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; 5.601.819; Kostelny y col., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992).
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) pueden unirse inmunoespecíficamente a BLyS murino (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de BLyS humano (SEQ ID NO: 3228 y/o 3229) o BLyS expresado en monocitos humanos; BLyS murino (SEQ ID NO: 3230 o 3231) o BLyS expresado en monocitos murinos; BLyS de rata (las formas solubles que se proporcionan en las SEQ ID NO: 3232, 3233, 3234 y/o 3235 o en una forma asociada a membrana, por ejemplo, en la superficie de monocitos de rata); o BLyS de mono (por ejemplo, los polipéptidos de BLyS de mono de las SEQ ID NO: 3236 y/o 3237, la forma soluble de BLyS de mono o BLyS expresado en monocitos de mono) , preferentemente los anticuerpos de la presente invención se unen inmunoespecíficamente a BLyS humano. Preferentemente, los anticuerpos de la presente invención se unen inmunoespecíficamente a BLyS humano y de mono. También preferentemente, los
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La presente memoria descriptiva también describe proteínas de fusión que comprenden, o alternativamente consisten en un anticuerpo (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se une específicamente a BLyS y un polipéptido heterólogo. Preferentemente, el polipéptido heterólogo con el que se fusiona el anticuerpo es útil para la función de linfocitos B o es útil para dirigir el anticuerpo a linfocitos B. Preferentemente, el polipéptido heterólogo con el que se fusiona el anticuerpo es útil para la función de células monocíticas o es útil para dirigir el anticuerpo a un monocito. En un aspecto especifico, el polipéptido heterólogo con el que se fusiona el anticuerpo es albúmina (incluyendo, pero sin limitación, albúmina sérica humana recombinante o fragmentos o variantes de la misma (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.º 5.876.969, expedida el 2 de marzo de 1999, la Patente EP 0413 622 y la Patente de Estados Unidos N.º 5.766.883, expedida el 16 de junio de 1998). Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) se fusionan con la forma madura de la albúmina sérica humana (es decir, los aminoácidos 1-585 de la albúmina sérica humana, como se muestra en las Figuras 1 y 2 de la Patente EP 0 322 094). Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) se fusionan con fragmentos polipeptídicos que comprenden, o alternativamente consisten en los restos aminoacídicos 1-x de la albúmina sérica humana, donde x es un número entero de 1 a 585 y el fragmento de albúmina tiene actividad de albúmina sérica humana. Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) se fusionan con fragmentos polipeptídicos que comprenden, o alternativamente consisten en los restos aminoacídicos 1-z de la albúmina sérica humana, donde z es un número entero de 369 a 419, como se describe en la Patente de Estados Unidos 5.766.883 en el presente documento. Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) pueden fusionarse con el extremo N-o C-terminal de la proteína heteróloga (por ejemplo, polipéptido Fc de inmunoglobulina o polipéptido de albúmina sérica humana).
En un aspecto específico, una proteína de fusión que se describe en el presente documento comprende, o alternativamente consiste en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de uno o más de cualquiera de los dominios VH mencionados en la Tabla 1, o la secuencia de aminoácidos de uno o más de cualquiera de los dominios VL mencionados en la Tabla 1, o fragmentos o variantes de los mismos, y una secuencia polipeptídica heteróloga. En otro aspecto específico, una proteína de fusión que se describe en el presente documento comprende, o alternativamente consiste en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una, dos, tres o más de cualquiera de las CDR de VH mencionadas en la Tabla 1, o la secuencia de aminoácidos de una, dos, tres o más de cualquiera de las CDR de VL mencionadas en la Tabla 1, o fragmentos o variantes de las mismas, y una secuencia polipeptídica heteróloga. Preferentemente, la proteína de fusión comprende, o alternativamente consiste en un polipéptido que tiene Ia secuencia de aminoácidos de una CDR3 de VH mencionada en la Tabla 1, o un fragmento o variante de Ia misma, y una secuencia polipeptídica heteróloga, uniéndose dicha proteína de fusión inmunoespecíficamente a BLyS. En otro aspecto específico, una proteína de fusión comprende, o alternativamente consiste en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de al menos un dominio VH mencionado en la Tabla 1 y la secuencia de aminoácidos de al menos un dominio VL mencionado en la Tabla 1, o fragmentos o variantes de las mismas, y una secuencia polipeptídica heteróloga. Preferentemente, los dominios VH y VL de la proteína de fusión corresponden al mismo scFv mencionado en la Tabla 1. En otro aspecto específico, una proteína de fusión comprende, o alternativamente consiste en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una, dos, tres o más de cualquiera de las CDR de VH mencionadas en la Tabla 1, y la secuencia de aminoácidos de una, dos, tres o más de cualquiera de las CDR de VL mencionados en la Tabla 1, o fragmentos o variantes de las mismas, y una secuencia polipeptídica heteróloga. Preferentemente, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de las CDR de VH o CDR de VL corresponden al mismo scFv mencionado en la Tabla 1. También se describen en el presente documento las moléculas de ácido nucleico que codifican estas proteínas de fusión.
La presente memoria descriptiva también describe anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespecíficamente a la forma soluble de BLyS; anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a la forma unida a membrana de BLyS; y anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente tanto a la forma soluble como a la forma unida a membrana de BLyS.
En un aspecto específico, los anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespecíficamente a la forma soluble de BLyS comprenden, o alternativamente consisten en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de uno o más de cualquiera de los dominios VH contenidos en las SEQ ID NO: 1563-1880 que se describen en la Tabla 1 y/o la secuencia de aminoácidos de uno o más de cualquiera de los dominios VL contenidos en las SEQ ID NO: 15631880 que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o fragmentos o variante o variantes (incluyendo derivados) del mismo. Preferentemente, los dominios VH y VL del anticuerpo corresponden al mismo scFv que se describe en la Tabla 1. Los anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a la forma soluble de BLyS se describe que comprenden, o alternativamente consisten en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una, dos, tres o más de cualquiera de las CDR de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1563-1880 que se describen en la Tabla 1, y/o la secuencia de aminoácidos de una, dos, tres o más de cualquiera de las CDR de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1563-1880 que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o fragmentos o variante o variantes del mismo. Preferentemente, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de las CDR de VH y VL del anticuerpo corresponden al mismo scFv que se describe en la Tabla 1. Preferentemente, los anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a la
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forma soluble de BLyS se describe que comprenden, o alternativamente consisten en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una o más de cualquiera de las CDR3 de VH contenidas en las SEQ ID NO: 15631880 que se describen en la Tabla 1, y/o la secuencia de aminoácidos de una o más de cualquiera de las CDR3 de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1563-1880 que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o fragmentos o variante o variantes del mismo. Preferentemente, la CDR3 de VH y la CDR3 de VL del anticuerpo corresponden al mismo scFv, que se describe en la Tabla 1. También se describen en el presente documento las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuerpos.
Los anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo
o variantes de los mismos) que se unen inmunoespecíficamente a la forma unida a membrana de BLyS también se describe en el presente documento que comprenden, o alternativamente consisten en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de uno o más de cualquiera de los dominios VH contenidos en las SEQ ID NO: 18812128 que se describen en la Tabla 1, y/o la secuencia de aminoácidos de uno o más de cualquiera de los dominios VL contenidos en las SEQ ID NO: 1881-2128, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. Preferentemente, los dominios VH y VL del anticuerpo corresponden al mismo scFv que se describe en la Tabla 1. Los anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a la forma unida a membrana de BLyS también se describe en el presente documento que comprenden, o alternativamente consisten en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una, dos, tres o más de cualquiera de las CDR de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1881-2128 que se describen en Ia Tabla 1, y/o Ia secuencia de aminoácidos de una, dos, tres o más de cualquiera de las CDR de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1881-2128, que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o fragmentos o variante o variantes del mismo. Preferentemente, dos, tres, cuatro, cinco, seis ο más de las CDR de VL y VH del anticuerpo corresponden al mismo scFv que se describe en la Tabla 1. Preferentemente, los anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a Ia forma unida a membrana de BLyS se describe en Ia presente memoria que comprenden, o alternativamente consisten en un polipéptido que tiene Ia secuencia de aminoácidos de una o más de cualquiera de las CDR3 de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1881-2128 que se describen en la Tabla 1, y/o Ia secuencia de aminoácidos de una o más de cualquiera de las CDR3 de VL contenidas en las SEQ ID NO: 18812128 que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o fragmentos o variante o variantes del mismo. Preferentemente, la CDR3 de VH y CDR3 de VL del anticuerpo corresponden al mismo scFv que se describe en la Tabla 1. También se describen en Ia presente memoria moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuerpos.
En otro aspecto específico, los anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespecíficamente a Ia forma soluble y a Ia forma unida a membrana de BLyS comprenden, o alternativamente consisten en un polipéptido que tiene Ia secuencia de aminoácidos de uno o más de cualquiera de los dominios VH contenidos en las SEQ ID NO: 1-1562 que se describen en la Tabla 1, y/o Ia secuencia de aminoácidos de uno o más de cualquiera de los dominios VL contenidos en las SEQ ID NO: 1-1562 que se describen en la Tabla 1, o un fragmento o variante del mismo. Preferentemente, los dominios VH y VL del anticuerpo corresponden al mismo scFv que se describe en la Tabla 1. En un aspecto específico, los anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a Ia forma soluble y a Ia forma unida a membrana de BLyS comprenden, o alternativamente consisten en un polipéptido que tiene Ia secuencia de aminoácidos de una, dos, tres o más de cualquiera de las CDR de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1-1562 que se describen en la Tabla 1, y/o Ia secuencia de aminoácidos de una, dos, tres o más de cualquiera de las CDR de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1-1562 que se describen en Ia Tabla 1, o un fragmento o fragmentos o variante o variantes del mismo. Preferentemente, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de las CDR de VH y VL del anticuerpo corresponden al mismo scFv que se describe en la Tabla 1. En un aspecto preferido, los anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a la forma soluble y a la forma unida a membrana de BLyS se proporciona que comprenden,
o alternativamente consisten en un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una o más de cualquiera de las CDR3 de VH contenidas en las SEQ ID NO: 1-1562 descritas en la Tabla 1, y/o la secuencia de aminoácidos de una o más de cualquiera de las CDR3 de VL contenidas en las SEQ ID NO: 1-1562 descritas en la Tabla 1, o un fragmento o fragmentos o variante o variantes del mismo. Preferentemente, la CDR3 de VH y CDR3 de VL del anticuerpo corresponden al mismo scFv como se describe en la Tabla 1.
La presente memoria descriptiva también describe mezclas de anticuerpos (incluyendo scFv y otras moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespecíficamente a BLyS, en la que la mezcla tiene al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o más anticuerpos diferentes que se describen en el presente documento. En particular, la memoria descriptiva describe mezclas de diferentes anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a la forma soluble de BLyS, a la forma unida a membrana de BLyS y/o tanto a la forma unida a membrana como a la forma soluble de BLyS. En aspectos específicos, se describen en el presente documento mezclas de al menos 2, preferentemente al menos 4, al menos 6, al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 anticuerpos diferentes que se unen inmunoespecíficamente a BLyS, en las que al menos 1, al menos 2, al menos 4, al menos 6 o al menos 10 anticuerpos de la mezcla son un anticuerpo que se describe en el presente documento. Específicamente, cada anticuerpo de la mezcla es un anticuerpo que se describe en el presente documento.
La presente memoria descriptiva también describe paneles de anticuerpos (incluyendo scFv y otras moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespecíficamente a BLyS, en la que el panel tiene al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o más anticuerpos diferentes de la presente invención. En particular, la presente invención proporciona paneles de anticuerpos
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invención se han depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo ("ATCC") en las fechas enumeradas en la Tabla 2 y se les ha dado los Números de Depósito de la ATCC identificados en la Tabla 2. La ATCC se localiza en 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, Estados Unidos. El depósito de la ATCC se ha realizado conforme a los términos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes.
Línea Celular
scFv Correspondiente SEQ ID NO: : Número de Depósito de la ATCC Fecha de Depósito en la ATCC
NS0-B11-15
1050B11-15 24 PTA-3238 27 marzo 2001
NSO-antiBLyS-6D08-18
1006D08 2 PTA-3239 27 marzo 2001
NSO-anti-BLyΞΙ 16A0 1-60
1116A01 327 PTA-3240 27 marzo 2001
IO26C04K
1026C04-K 1563 PTA-3241 27 marzo 2001
IO50A12
1050A12 12 PTA-3242 27 marzo 2001
IO50-B11
1050B11 9 PTA-3243 27 marzo 2001
Por consiguiente, la memoria descriptiva también describe anticuerpos que comprenden los dominios VH y VL de scFv que se describen en el presente documento.
Preferentemente, un anticuerpo que se describe en la presente memoria es el anticuerpo expresado por la línea 10 celular NS0-B11-15.
Preferentemente, un anticuerpo que se describe en la presente memoria es el anticuerpo expresado por la línea celular NSO-anti-BLyS-6D08-18.
Preferentemente, un anticuerpo que se describe en la presente memoria es el anticuerpo expresado por la línea celular NSO-anti-BLyS-116A01-60.
15 Preferentemente, un anticuerpo que se describe en la presente memoria es el anticuerpo expresado por la línea celular IO26C04K.
Preferentemente, un anticuerpo que se describe en Ia presente memoria es el anticuerpo expresado por la línea celular IO50A12.
Preferentemente, un anticuerpo que se describe en Ia presente memoria es el anticuerpo expresado por Ia línea 20 celular NSO-Bll.
La memoria descriptiva también describe anticuerpos que inhiben competitivamente la unión de un anticuerpo que comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino VL, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) o variante de un scFv mencionado en la Tabla 1 a un polipéptido de BLyS. Preferentemente, Ia memoria descriptiva describe anticuerpos que reducen la unión de un anticuerpo que 25 comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino VL, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) o variante de un scFv mencionado en la Tabla 1 a un polipéptido de BLyS entre 1% y 10% en un ensayo de inhibición competitiva. Preferentemente, Ia memoria descriptiva describe anticuerpos que reducen la unión de un anticuerpo que comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino VL, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) o variante de un scFv mencionado en la
30 Tabla 1 a un polipéptido de BLyS entre 1% y 10% en un ensayo de inhibición competitiva.
Preferentemente, Ia memoria descriptiva describe anticuerpos que reducen Ia unión de un anticuerpo que comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino VL, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) o variante de un scFv mencionado en la Tabla 1 a un polipéptido de BLyS al menos 10% y hasta 20% en un ensayo de inhibición competitiva.
35 Preferentemente, Ia memoria descriptiva describe anticuerpos que reducen Ia unión de un anticuerpo que comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino VL, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) o variante de un scFv mencionado en la Tabla 1 a un polipéptido de BLyS al menos 20% y hasta 30% en un ensayo de inhibición competitiva.
Preferentemente, Ia memoria descriptiva describe anticuerpos que reducen Ia unión de un anticuerpo que
40 comprende un fragmento (por ejemplo, dominio VH, domino VL, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) o variante de un scFv mencionado en la Tabla 1 a un polipéptido de BLyS al menos 30% y hasta 40% en un ensayo de inhibición competitiva.
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Además, el codón de inicio debe estar en fase de lectura con la fase de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción del inserto de interés. Estas señales de control de la traducción y codones de inicio exógenos pueden ser de una diversidad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede aumentarse por inclusión de elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. apropiados (véase, por ejemplo, Bittner y col., Methods in Enzymol. 153:51-544(1987)).
Además, puede seleccionarse una cepa de célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto génico de la forma específica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteicos puede ser importante para la función de la proteína. Diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento postraduccional y la modificación de proteínas y productos génicos. Pueden seleccionarse líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Con este fin, pueden usarse células hospedadoras eucariotas que posean la maquinaria celular para un procesamiento apropiado del transcrito primario, glucosilación y fosforilación del producto génico. Dichas células hospedadoras de mamífero incluyen, pero sin limitación CHO, VERY, BHK, Heia, COS, NSO, MDCK, 293, 3T3, W138 y, en particular, líneas celulares de cáncer de mama tales como, por ejemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, y líneas celulares de glándula mamaria normal, tales como, por ejemplo, CRL7030 y HsS78Bst.
Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere una expresión estable. Por ejemplo, pueden obtenerse por ingeniería genética líneas celulares que expresen de forma estable el anticuerpo. Más que usar vectores de expresión que contengan orígenes de replicación virales, las células hospedadoras pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, secuencias promotoras, potenciadoras, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador de selección. Después de la introducción del ADN extraño, puede dejarse que las células modificadas por ingeniería genética crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido y después se cambian a un medio selectivo. El marcador de selección en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crecer para formar focos, que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este procedimiento puede usarse ventajosamente para obtener por ingeniería genética líneas celulares que expresen la molécula de anticuerpo. Dichas líneas celulares obtenidas por ingeniería genética pueden ser particularmente útiles en la exploración y evaluación de composiciones que interaccionen directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.
Pueden usarse varios sistemas de selección incluyendo, pero sin limitación, los genes de timidina quinasa del virus herpes simple (Wigler y col., Cell 11: 223 (1977)), de hipoxantinoguanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 48: 202 (1992)) y de adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y col., Cell 22: 8 17 (1980)) que pueden emplearse en células tk-, hgprt-o aprt-, respectivamente. Además, puede usarse la resistencia a antimetabolitos como base de la selección para los genes siguientes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler y col., Natl. Acad. Sei. EE.UU. 77: 357 (1980); O'Hare y col., Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 78:1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu y Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); TIB TECH 11(5): 155-2 15 (May, 1993)); e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre y col., Gene 30: 147 (1984)). Los procedimientos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología del ADN recombinante pueden aplicarse rutinariamente para seleccionar el clon recombinante deseado, y dichos procedimientos se describen, por ejemplo, en Ausubel y col. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli y col. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin y col., J. Mol. Biol.
150:1 (1981).
Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden aumentarse por amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington y Hentschei, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema vector que expresa un anticuerpo es amplificable, un aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula hospedadora aumentará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada está asociada con la secuencia codificante del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará (Crouse y col., Mol. Cell. Biol. 3: 257 (1983)).
La célula hospedadora puede cotransfectarse con dos vectores de expresión que se describen en el presente documento, codificando el primer vector un polipéptido derivado de una cadena pesada y codificando el segundo vector un polipéptido derivado de una cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores de selección idénticos que permitan una expresión equivalente de polipéptidos de cadena ligera y pesada. Alternativamente, puede usarse un solo vector que codifique y sea capaz de expresar ambos polipéptidos de cadena ligera y pesada. En tales situaciones, la cadena ligera se coloca preferentemente antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, Nature 322: 52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 77: 2 197 (1980)). Las secuencias codificantes para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc o ADN
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genómico.
Una vez que una molécula de anticuerpo que se describe en el presente documento se ha producido por expresión recombinante, puede purificarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina o, más en general, para la purificación de una proteína, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico después de proteína A, y cromatografía en columna de exclusión molecular), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden fusionarse a secuencias polipeptídicas heterólogas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la técnica por facilitar la purificación.
Caracterización de Anticuerpos
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo scFv y otras moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) pueden caracterizarse en una diversidad de formas. En particular, los anticuerpos y moléculas relacionadas que se describen en el presente documento pueden ensayarse para determinar la capacidad de unirse inmunoespecíficamente a BLyS o un fragmento de BLyS (por ejemplo, la forma soluble o a la forma unida a membrana de BLyS) usando técnicas descritas en el presente documento o procedimientos de modificación de forma rutinaria conocidos en la técnica. El BLyS, o fragmentos de BLyS, que puede unirse inmunoespecíficamente por las composiciones de la presente invención incluye, pero sin limitación, BLyS humano (SEQ ID NO: 3228 y/o 3229) o BLyS expresado en monocitos humanos; BLyS murino (SEQ ID NO: 3230 y/o 3221) o BLyS expresado en monocitos murinos; BLyS de rata (las formas solubles que se proporcionan en las SEQ ID NO: 3232, 3233, 3234 y/o 3235 o en una forma asociada a membrana, por ejemplo, en la superficie de monocitos de rata); o BLyS de mono (por ejemplo, los polipéptidos de BLyS de mono de las SEQ ID NO: 3236 y/o 3237, la forma soluble de BLyS de mono o BLyS expresado en monocitos de mono) o fragmentos del mismo. Preferentemente, las composiciones de la presente invención se unen a BLyS humano (SEQ ID NO: 3228 y/o 3229) o fragmentos del mismo. Los ensayos para determinar la capacidad de los anticuerpos que se describen en el presente documento para unirse inmunoespecíficamente a BLyS o a un fragmento de BLyS pueden realizarse en solución (por ejemplo, Houghten, Bio/Techniques 13: 412-421 (1992)), en perlas (por ejemplo, Lam, Nature 354: 82-84 (1991)), en microplacas (por ejemplo, Fodor, Nature 364: 555-556 (1993)), en bacterias (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.º 5.223.409), en esporas (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N.º 5.571.698; 5.403.484 y 5.223.409), en plásmidos (por ejemplo, Cull y col., Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 89: 1865-1869 (1992)) o en fagos (por ejemplo, Scott y Smith, Science 249: 386-390 (1990); Devlin, Science
249: 404-406 (1990); Cwirla y col., Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 87:6378-6382 (1990); y Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991)). Los anticuerpos que se ha identificado que se unen inmunoespecíficamente a BLyS o a un fragmento de BLyS pueden ensayarse después para determinar su especificidad y afinidad por BLyS o un fragmento de BLyS, usando técnicas de modificación de forma rutinaria descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la técnica.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden ensayarse para determinar su unión inmunoespecífica a BLyS y su reactividad cruzada con otros antígenos por cualquier procedimiento conocido en la técnica. En particular, la capacidad de un anticuerpo para unirse inmunoespecíficamente a la forma soluble o a la forma unida a membrana de BLyS, y la especificidad del anticuerpo, fragmento o variante por un polipéptido de BLyS de una especie particular (por ejemplo, murino, de mono o humano, preferentemente humano) pueden determinarse usando técnicas de modificación de forma rutinaria descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la técnica.
Los inmunoensayos que pueden usarse para analizar la unión inmunoespecífica y la reactividad cruzada incluyen, pero sin limitación, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando técnicas tales como transferencias de Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos tipo "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteína A, por nombrar algunos. Dichos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel y col, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York). Se describen brevemente inmunoensayos ejemplares a continuación (pero sin pretender que sea a modo de limitación).
Los protocolos de inmunoprecipitación comprenden generalmente lisar una población de células en un tampón de lisis tal como tampón RIPA (NP-40 o Triton X-IOO 1%, desoxicolato sódico 1%, SDS 0,1%, NaCI 0,15 M, fosfato sódico 0,01 M a pH 7,2, Trasylol 1%) complementado con proteína fosfatasa y/o inhibidores de proteasas (por ejemplo, EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato sódico), anadir el anticuerpo de interés al lisado celular, incubar durante un período de tiempo (por ejemplo, de 1 a 4 horas) a 40°C, anadir perlas de proteína A y/o proteína G sefarosa al lisado celular, incubar durante aproximadamente una hora o más a 40°C, lavar las perlas en tampón de lisis y resuspender las perlas en SDS/tampón de muestras. La capacidad del anticuerpo de interés para inmunoprecipitar un antígeno particular puede evaluarse, por ejemplo, mediante análisis de transferencia de Western. Un experto en la materia estaría familiarizado con los parámetros que pueden modificarse para aumentar la unión del anticuerpo a un antígeno y disminuir el fondo (por ejemplo, preaclaramiento del lisado celular con perlas de sefarosa). Para una
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alfa, TNF-beta, Fas-L, LIGHT y PBS (véase el Ejemplo 4 a continuación). Los anticuerpos también pueden ensayarse para determinar su afinidad por BLyS usando, por ejemplo, un análisis de BIAcore (véanse los Ejemplos 6, 12, 17 y 18 a continuación). Los anticuerpos también pueden ensayarse para determinar su capacidad para estimular, inhibir o no alterar la producción de inmunoglobulina y/o Ia proliferación de linfocitos B inducidas por BLyS usando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, linfocitos B humanas, BLyS y anticuerpos pueden incubarse juntos en placas de 96 pocillos y puede medirse la incorporación de 3H-timidina usando un contador de centelleo.
Selección y Exploración de Anticuerpos que se Unen Inmunoespecíficamente a BLyS Unido a Membrana
Los anticuerpos que se describen en Ia presente memoria (incluyendo scFv y otras moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) pueden explorarse en una diversidad de ensayos para identificar aquellos anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a Ia forma unida a membrana de BLyS. En un ensayo particular, los anticuerpos que se unen a BLyS en membranas de U937 o BLyS marcado con histidina inmovilizado se capturan. Otras líneas celulares que expresan BLyS que podrían ser útiles para ensayar la unión de anticuerpo a Ia forma unida a membrana de BLyS incluyen las células K-562, HL-60 y THP-
I. En otro ensayo, los anticuerpos se exploran usando ELISA para determinar aquellos anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo o variantes) que se unen a BLyS en membranas de U937 o a BLyS marcado con histidina. En este ensayo, los anticuerpos se añaden a placas de 96 pocillos revestidas con membranas de U937 o BLyS marcado con histidina, y aquellos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo o variantes que se unen a las membranas de U937 o a BLyS marcado con histidina se capturan. En otro ensayo, los anticuerpos se exploran usando ELISA para determinar aquellos anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que no se unen a BLyS biotinilado (BLyS soluble) pero se unen a BLyS unido a membrana, tal como, por ejemplo, el de membranas de células U937 (véase el Ejemplo 2 a continuación). En estos ensayos, se incuba BLyS soluble (por ejemplo, BLyS biotinilado) y BLyS unido a membrana (por ejemplo, en membranas de U937) en muestras separadas con los mismos anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo o variantes), y aquellos anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo o variantes) que no se unen al BLyS soluble (BLyS biotinilado) pero se unen al BLyS unido a membrana (por ejemplo, en membranas de U937) se capturan y se identifican. En otros ensayos, los anticuerpos se exploran usando ELISA para determinar cuáles de los anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo o variantes) que se unen a BLyS marcado con histidina o membranas de células U937 no muestran reactividad cruzada con APRIL, endoquina-alfa, VEGI, TRAIL, TNF-alfa, TNF-beta, Fas-L, LIGHT y PBS (véase el Ejemplo 4 a continuación). También pueden usarse ELISA para determinar cuáles de los anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo o variantes) que se unen a BLyS marcado con histidina o membranas de células U937 se unen a BLyS en presencia de TNF-alfa (véase el Ejemplo 4 a continuación). También pueden ensayarse anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos que se unen inmunoespecíficamente a la forma unida a membrana de BLyS para determinar su afinidad por BLyS marcado con histidina, usando un análisis de BIAcore de alto rendimiento (véase el Ejemplo 14 a continuación).
Además, los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden explorarse frente a células modificadas por ingeniería genética para que expresen una forma "no escindible" de BLyS, para determinar su especificidad por la forma unida a membrana de BLyS. Las mutaciones en BLyS que pueden conseguir este resultado incluyen, pero sin limitación, la mutación o deleción de los restos aminoacídicos Lys-132 y/o Arg-133 de la secuencia de BLyS mostrada en la SEQ ID NO: 3228. Una mutagénesis típica podría incluir la mutación de uno o ambos restos de Lys132 o Arg-133 a restos de alanina. Las células que expresan dicha forma "no escindible" de BLyS proporcionan un reactivo importante para usar en el ensayo de la capacidad de anticuerpos para unirse a la forma de unida a membrana de BLyS.
Selección y Exploración de Anticuerpos que se Unen Inmunoespecíficamente a BLyS Soluble y BLyS unido a Membrana
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo scFv y otras moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes) pueden explorarse en una diversidad de ensayos para identificar aquellos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo o variantes que se unen inmunoespecíficamente a la forma soluble y a la forma unida a membrana de BLyS. En un ensayo particular, los anticuerpos que se unen a BLyS inmovilizado se capturan. En otro ensayo, los anticuerpos se exploran usando ELISA para aquellos anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo o variantes) que inhiben la unión de BLyS soluble (por ejemplo, bio-BLyS soluble) a células IM-9 como se ha descrito anteriormente. En otros ensayos, los anticuerpos se exploran usando ELISA para aquellos anticuerpos que se unen a membranas de células U937. Además, pueden realizarse ensayos de ELISA adicionales usando procedimientos conocidos en la técnica para determinar qué anticuerpos no muestran reactividad cruzada con APRIL, endoquina-alfa, VEGI, TRAIL, TNF-alfa, TNF-beta, Fas-L, LIGHT y PBS, o aquellos anticuerpos que se unen a BLyS en presencia de TNF-alfa (véase el Ejemplo 4 a continuación). Los anticuerpos pueden ensayarse en ensayos de neutralización usando técnicas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la técnica. Los anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a las formas soluble y unida a membrana de BLyS también pueden ensayarse para determinar su afinidad por BLyS usando un análisis de BIAcore de alto rendimiento.
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Conjugados de Anticuerpos
La presente memoria descriptiva describe anticuerpos (incluyendo scFv y otras moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) fusionados recombinantemente
o conjugados químicamente (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) con un polipéptido heterólogo (o porción del mismo, preferentemente con al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos del polipéptido ) para generar proteínas de fusión. La fusión no tiene que ser necesariamente directa, sino que puede producirse a través de secuencias enlazadoras. Por ejemplo, los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden usarse para dirigir polipéptidos heterólogos a tipos celulares particulares (por ejemplo, células del linaje monocítico y linfocitos B) in vitro o in vivo, por fusión o conjugación de los polipéptidos heterólogos con anticuerpos que se describen en el presente documento que son específicos para antígenos de superficie celular particulares (por ejemplo, BLyS unido a membrana en células de linaje monocítico), o que se unen a antígenos que se unen a receptores de superficie celular particulares (por ejemplo, TACI y/o BCMA localizados en linfocitos B). Los anticuerpos fusionados o conjugados con polipéptidos heterólogos también pueden usarse en inmunoensayos in vitro y procedimientos de purificación que usan procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harbor y col., anteriormente, y publicación PCT WO 93/21232; documento EP 439.095; Naramura y col., Immunol. Lett. 3
9:91 -99 (1994); Patente de Estados Unidos 5.474.981; Gillies y col., PNAS 89:1428-1432 (1992); Fell y col., J. Immunol. 146:2446-2452 (1991).
En un aspecto específico, una proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los dominios VH mencionados en la Tabla 1, y un polipéptido heterólogo. En otro aspecto específico, una proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR1 de VH mencionadas en la Tabla 1, y un polipéptido heterólogo. En otro aspecto específico, una proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR2 de VH mencionadas en la Tabla 1, y un polipéptido heterólogo. Preferentemente, una proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR3 de VH mencionadas en la Tabla 1 (es decir, SEQ ID NO: 2129-3227), y un polipéptido heterólogo.
En otro aspecto específico, una proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los dominios VL mencionados en la Tabla 1, y un polipéptido heterólogo. En otro aspecto específico, una proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR1 de VL mencionadas en la Tabla 1, y un polipéptido heterólogo. En otro aspecto específico, una proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR2 de VL mencionadas en la Tabla 1, y un polipéptido heterólogo. Preferentemente, una proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR3 de VL mencionadas en la Tabla 1, y un polipéptido heterólogo.
En otro aspecto específico, una proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los dominios VH mencionados en la Tabla 1 y uno o más dominios VL mencionados en la Tabla 1, y un polipéptido heterólogo. En otro aspecto especifico, una proteína de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR de VH mencionadas en la Tabla 1 y una cualquiera de las CDR de VL mencionadas en la Tabla 1, y un polipéptido heterólogo.
La presente memoria descriptiva describe además composiciones que comprenden, o alternativamente consisten en polipéptidos heterólogos fusionados o conjugados con fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, los polipéptidos heterólogos pueden fusionarse o conjugarse con un fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmento F(ab)2 o una porción de los mismos. Se conocen en la técnica procedimientos para fusionar o conjugar polipéptidos con porciones de anticuerpo. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.º 5.336.603; 5.622.929; 5.359.046; 5.349.053; 5.447.851; 5.112.946; EP 307.434; EP 367.166; publicaciones PCT WO 96/04388; WO 91/06570; Ashkenazi y col., Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 88: 10535-10539 (1991); Zheng y col., J. Immunol. 154:5590-5600 (1995); y Vil y col., Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU 89:11337-11341 (1992).
Las proteínas de fusión adicionales que se describen en el presente documento pueden generarse por medio de las técnicas de barajado de genes, barajado de motivos, barajado de exones y/o barajado de codones (denominadas en conjunto "barajado de ADN"). El barajado de ADN puede emplearse para modular las actividades de anticuerpos (incluyendo scFv y otras moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos), pudiendo usarse dichos procedimientos para generar anticuerpos con una actividad alterada (por ejemplo, anticuerpos con mayores afinidades y menores velocidades de disociación). Véanse, en general, las Patentes de Estados Unidos N.º 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252 y 5.837.458, y Patten y col., Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33 (1997); Harayama, Trends Biotechnol. 16(2):76-82 (1998); Hansson, y col.,
J. Mol. Biol. 287:265-76 (1999); y Lorenzo y Blasco, Biotechniques 24(2):308-13 (1998). Los polinucleótidos que codifican anticuerpos que se describen en el presente documento pueden alterarse sometiéndose a mutagénesis aleatoria mediante PCR propensa a error, inserción de nucleótidos aleatoria u otros procedimientos antes de la recombinación. Una o más porciones de un polinucleótido que codifica un anticuerpo, uniéndose dichas porciones inmunoespecíficamente a BLyS, pueden recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.
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Además, los anticuerpos de la presente invención (incluyendo scFv y otras moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) pueden fusionarse con secuencias marcadoras, tales como polipéptidos, para facilitar la purificación. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos marcadora es un polipéptido de hexa-histidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otras, muchas de las cuales están disponibles en el mercado. Como se describe en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, pero sin limitación, la etiqueta de hemaglutinina "HA", que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de influenza (Wilson y col., Cell 37:767 (1984)) y la etiqueta "flag" (DYKDDDDK, (SEQ ID NO: 3238) Stratagene, La Jolla, CA).
La presente memoria descriptiva describe además anticuerpos (incluyendo scFv y otras moléculas que comprenden,
o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) conjugados con un agente de diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos pueden usarse de forma diagnóstica para, por ejemplo, controlar o pronosticar el desarrollo o la progresión de un tumor como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse por acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen, pero sin limitación, diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones usando diversas tomografías por emisión de positrones, e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. La sustancia detectable puede acoplarse o conjugarse directamente con el anticuerpo, o indirectamente a través de un intermedio (tal como, por ejemplo, un enlazador conocido en la técnica) usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.º
4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para su uso como diagnóstico de acuerdo con la presente memoria descriptiva. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen, pero sin limitación, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen, pero sin limitación, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen, pero sin limitación, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye, pero sin limitación, luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen, pero sin limitación, luciferasa, luciferina y aequorina; y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen, pero sin limitación, yodo (131I, 125I, 123I, 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115mIn, 113mIn, 112In, 111In) y tecnecio ("Tc, 99mTc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga) , paladio (103Pd) , molibdeno (99Mo) , xenón (133Xe) , flúor (18F) , 153Sm,177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru , 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd,169Yb, 51Cr, 54Mn, 175Se, 113Sn y 117Tin.
Además, un anticuerpo que se describe en el presente documento (incluyendo un scFv u otra molécula que comprende, o alternativamente consiste en fragmentos de anticuerpos o variantes de los mismos) puede conjugarse con un resto terapéutico tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico
o un ion metálico radiactivo, por ejemplo, emisores de alfa tales como, por ejemplo, 213Bi. En aspectos específicos, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos incluyendo, pero sin limitación, 111In, 177Lu, 90Y, 166Ho y 153Sm, con polipéptidos. Preferentemente, el ion radiometálico asociado con los quelantes macrocíclicos unidos a anticuerpos de la presente invención es 111In. Preferentemente, el ion radiometálico asociado con los quelantes macrocíclicos unidos a anticuerpos de la presente invención es 90Y. Específicamente, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7, IOtetraazaciclododecano-N, Ν',N'',N'' '-tetraacético (DOTA). Específicamente, el DOTA se une al anticuerpo de la presente invención mediante una molécula enlazadora. Los ejemplos de moléculas enlazadoras útiles para conjugar el DOTA con un polipéptido se conocen comúnmente en la técnica —véase, por ejemplo, DeNardo y col., Clin Cancer Res. 4(10): 2483-90, 1998; Peterson y col., Bioconjug. Chem. 10(4):553-7, 1999; y Zimmerman y col, Nucl. Med. Biol. 26(8): 943-50,1999.
Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para células, e incluye moléculas tales como toxinas moleculares pequeñas y toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación paclitaxol, citochalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, epóxido (VP-16), tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracino diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, timidina quinasa, endonucleasa, ARNasa y puromicina y fragmentos, variantes u homólogos de las mismas. Los agentes terapéuticos incluyen, pero sin limitación, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiamina de platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (antiguamente daunomicina) y doxorubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antiguamente actinomicina) , bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina), improsulfán, piposulfán, benzodopa, carbocuona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietiIenfosforamida, trietilentiofosforamida trimetiloImelamina, clornafazina, ciclofosfamida, estramustina, ifosfamida, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, clorozotocina, fotemustina, nimustina, ranimustina, aclacinomisinas, azaserina, cactinomicina,
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caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, tiamiprina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona, aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, glucósido de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, dernecolcina, diazicuona, elfornitina, acetato de eliptinio, etoglúcido, nitrato de galio, hidroxiurea, lentinán, lonidamina, mitoguazona, mopidamol, nitracrina, pentostatina, fenamet, pirarubicina, ácido podofil inico, 2-etilhidrazida, procarbazina, PSKO, razoxano, sizofirán, espirogermanio, ácido tenuazónico, triazicuona, 2,2',2''-triclorotrietilamina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, arabinósido ("Ara-C"), taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOI/', Bristol-Miers Squibb Oncology, Princeton, NJ) doxetaxel (TAXOTERE'', Rh6ne-Poulenc Rorer, Antony, Francia), gemcitabina, ifosfamida, vinorelbina, navelbina, novantrona, tenipósido, aminopterina, xeloda, ibandronato, CPT-11, inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000, difluorometilmitina (DM-FO), ácido retinoico, esperamicinas, capecitabina y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición agentes antihormonales que actúan regulando o inhibiendo la acción hormonal en tumores, tales como antiestrógenos que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)imidazoles inhibidores de la aromatosa, 4 hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristona, toremifeno (Fareston), y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Los procedimientos conocidos en la técnica pueden aplicarse a anticuerpos marcadores que se describen en el presente documento. Dichas técnicas incluyen, pero sin limitación, el uso de agentes de conjugación bifuncionales (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.º 5.756.065; 5.714.631; 5.696.239; 5.652.361; 5.505.931; 5.489.425; 5.435.990; 5.428.139; 5.342.604; 5.274.119; 4.994.560; y 5.808.003) y reacciones de acoplamiento directo (por ejemplo, reacción de Bolton-Hunter y Cloramina-T).
Los anticuerpos que se describen en el presente documento que son conjugados pueden usarse para modificar una respuesta biológica dada, y el agente terapéutico o resto farmacológico no debe interpretarse como limitado a los agentes químicos terapéuticos clásicos. Por ejemplo, el resto farmacológico puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, pero sin limitación, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, toxina alfa, exotoxina de Pseudomonas o toxina de difteria, saporina, momordina, gelonina, proteína antiviral del ombú, alfa-sarcina y toxina colérica; una proteína tal como factor de necrosis tumoral, interferón alfa, interferón beta, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno tisular, un agente apoptótico, por ejemplo, TNF-alfa, TNF-beta, AIM I (véase la Publicación Internacional N.º WO 97/33899), AIM II (véase la Publicación Internacional N.º WO 97/34911), Ligando Fas (Takahashi y col., Int. Immunol., 6: 1567-1574 (1994)), VEGl (véase la Publicación Internacional N.º WO 99/23105), un agente trombótico y un agente antiangiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina; o modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 (IL-I), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL6), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) u otros factores de crecimiento.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo scFv y otras moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) también pueden unirse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o para la purificación del antígeno diana. Dichos soportes sólidos incluyen, pero sin limitación, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.
Se conocen bien técnicas para conjugar un resto terapéutico con anticuerpos, véase, por ejemplo, Arnon y col., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld y col. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y col., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson y col. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y col. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin y col. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe y col., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62: 119-58 (1982).
Alternativamente, un anticuerpo que se describe en la presente memoria puede conjugarse con un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo, como se describe por Segal en Ia Patente de Estados Unidos N.º 4.676.980.
Un anticuerpo que se describe en el presente documento (incluyendo un scFv y otra molécula que comprende, o alternativamente consiste en un fragmento de anticuerpo o variante del mismo) con o sin un resto terapéutico conjugado con el mismo, administrado en solitario o en combinación con un factor o factores citotóxicos y/o una citocina o citocinas, puede usarse como producto terapéutico.
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BLyS en suero tenían niveles elevados de anticuerpos anti-ADNbc en comparación tanto con los controles normales como con los pacientes con SLE con menos de 5 ng/ml de BLyS en suero (datos no publicados).
Además, el suero de dos subgrupos de pacientes que eran positivos para anticuerpos antinucleares (ANA+) pero que no cumplían los requisitos formales del Colegio Americano de Reumatología (ACR) para su clasificación en SLE se analizó para determinar los niveles de BLyS. El primer subgrupo de sueros eran sueros ANA+ que venían de pacientes que no presentaban impresión clínica de SLE. Este grupo tenía niveles de BLyS sólo ligeramente elevados (~9 ng/ml de BLyS). El segundo subgrupo, sin embargo, que tenía sueros ANA+ de pacientes que presentaban la impresión clínica de SLE, tenían niveles de BLyS significativamente aumentados (~ 15 ng/ml). Estos resultados sugieren que un nivel elevado de BLyS precede al cumplimiento formal de los criterios de la ACR. Los criterios de la ACR se describen en Tan, E. M., y col, Arthritis and Rheumatism 25:1271-1277 (1982).
Por lo tanto, específicamente, los anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen específicamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar, pronosticar o controlar el Lupus Eritematoso Sistémico o afecciones asociadas con el mismo. La memoria descriptiva describe la detección de la expresión aberrante de BLyS que comprende: (a) ensayar la expresión de BLyS en una muestra biológica de un individuo usando uno o más anticuerpos que se describen en el presente documento, que se unen inmunoespecíficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patrón de BLyS, por ejemplo, en muestras biológicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparación con el nivel patrón de BLyS es indicativo de SLE.
También específicamente, los anticuerpos que se describen en la presente memoria que se unen específicamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar, pronosticar o controlar una nefropatía por IgA o afecciones asociadas con la misma. La memoria descriptiva describe la detección de la expresión aberrante de BLyS que comprende: (a) ensayar la expresión de BLyS en una muestra biológica de un individuo usando uno o más anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespecíficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patrón de BLyS, por ejemplo, en muestras biológicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparación con el nivel patrón de BLyS es indicativo de nefropatía por IgA.
En otros aspectos específicos de la presente memoria descriptiva, los anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen específicamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar, pronosticar o controlar el Síndrome de Sjögren o afecciones asociadas con el mismo. la presente invención proporciona la detección de la expresión aberrante de BLyS, que comprende: (a) ensayar la expresión de BLyS en una muestra biológica de un individuo usando uno o más anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespecíficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patrón de BLyS, por ejemplo, en muestras biológicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparación con el nivel patrón de BLyS es indicativo del Síndrome de Sjögren.
En otros aspectos específicos de la presente memoria descriptiva, los anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen específicamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar, pronosticar o controlar una infección por VIH o afecciones asociadas con la misma (por ejemplo, SIDA). La memoria descriptiva describe la detección de la expresión aberrante de BLyS, que comprende: (a) ensayar la expresión de BLyS en una muestra biológica de un individuo usando uno o más anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespecíficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patrón de BLyS, por ejemplo, en muestras biológicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparación con el nivel patrón de BLyS es indicativo de infección por VIH.
En otros aspectos específicos de la presente memoria descriptiva, los anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen específicamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar, pronosticar o controlar la miastenia grave o afecciones asociadas con la misma. La memoria descriptiva describe la detección de la expresión aberrante de BLyS, que comprende: (a) ensayar la expresión de BLyS en una muestra biológica de un individuo usando uno o más anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespecíficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patrón de BLyS, por ejemplo, en muestras biológicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparación con el nivel patrón de BLyS es indicativo de miastenia grave.
En otros aspectos específicos de la presente memoria descriptiva, los anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen específicamente a BLyS pueden usarse con fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar, pronosticar o controlar la púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) o afecciones asociadas con la misma. La memoria descriptiva describe la detección de la expresión aberrante de BLyS, que comprende: (a) ensayar la expresión de BLyS en una muestra biológica de un individuo usando uno o más anticuerpos de la presente invención que se unen inmunoespecíficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patrón de BLyS, por ejemplo, en muestras biológicas normales, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparación con el nivel patrón de BLyS es indicativo de púrpura trombocitopénica idiopática (ITP).
En otros aspectos específicos de la presente memoria descriptiva, los anticuerpos que se describen en el presente
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polimiositis/dermatomiositis, poli angeítis microscópica, artritis asociada a hepatitis C, arteritis de Takayasu y trastorno del tejido conectivo no diferenciado) pueden usarse para determinar, diagnosticar, pronosticar o controlar la gravedad de ciertos aspectos o síntomas de la enfermedad, tales como la proteinuria en el intervalo nefrótico.
En otros aspectos específicos de la presente memoria descriptiva, los anticuerpos que se describen en el presente documento se usan para diagnosticar, pronosticar, tratar o prevenir afecciones asociadas con CVID, incluyendo, pero sin limitación, afecciones asociadas con infecciones agudas y recurrentes (por ejemplo, neumonía, bronquitis, sinusitis, otitis media, septicemia, meningitis, artritis séptica y osteomielitis) , enfermedad pulmonar crónica, autoinmunidad, enfermedad granulomatosa, linfoma, cánceres (por ejemplo, cánceres de mama, estómago, colon, boca, próstata, pulmón, vagina, ovario, piel y células formadoras de melanina (es decir, melanoma), enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y proctitis ulcerosa), malabsorción, enfermedad de Hodgkin y macroglobulinemia de Waldenstrom.
La memoria descriptiva describe un ensayo de diagnóstico para diagnosticar o pronosticar una enfermedad o trastorno, que comprende: (a) ensayar para determinar el nivel de BLyS en una muestra biológica de un individuo usando uno o más anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespecíficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel de BLyS patrón, por ejemplo, en una muestra biológica de un paciente sin la enfermedad o trastorno, por lo que un aumento o disminución en el nivel ensayado de BLyS en comparación con el nivel patrón de BLyS es indicativo de una enfermedad o trastorno particular. Con respecto al cáncer, la presencia de una cantidad relativamente alta de BLyS en tejido biopsiado de un individuo puede indicar una predisposición para el desarrollo de la enfermedad o puede proporcionar un medio para detectar la enfermedad antes de la aparición de los síntomas clínicos reales. Un diagnóstico más definitivo de este tipo puede permitir a los profesionales sanitarios emplear antes medidas preventivas o un tratamiento agresivo, evitando de este modo el desarrollo o la progresión adicional del cáncer.
En aspectos específicos de la presente memoria descriptiva, la presencia de una cantidad relativamente alta de BLyS unido a membrana en una muestra biológica es indicativa de leucemias o linfomas relacionados con células monocíticas, tales como, por ejemplo, leucemia mielógena aguda, y/o de la gravedad de los mismos.
En otros aspectos específicos de la presente memoria descriptiva, la presencia de una cantidad relativamente alta de receptor de BLyS en una muestra biológica (según se determina usando anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen a BLyS soluble, pero que no inhiben la unión de BLyS/receptor de BLyS) es indicativa de leucemias o linfomas relacionados con linfocitos B (por ejemplo, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin y enfermedad de Hodgkin) y/o de la gravedad de los mismos.
En aspectos específicos de la presente memoria descriptiva, la memoria descriptiva describe un ensayo de diagnóstico para diagnosticar o pronosticar el Lupus Eritematoso Sistémico, que comprende: (a) ensayar para determinar el nivel de BLyS en una muestra biológica de un individuo usando uno o más anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespecíficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patrón de BLyS, por ejemplo, en una muestra biológica de un paciente sin Lupus Eritematoso Sistémico, por lo que un aumento en el nivel ensayado de BLyS en comparación con el nivel patrón de BLyS es indicativo de Lupus Eritematoso Sistémico.
En aspectos específicos, la memoria descriptiva describe un ensayo de diagnóstico para diagnosticar o pronosticar una artritis reumatoide, que comprende: (a) ensayar para determinar el nivel de BLyS en una muestra biológica de un individuo usando uno o más anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespecíficamente a BLyS; y (b) comparar el nivel de BLyS con un nivel patrón de BLyS, por ejemplo, en una muestra biológica de un paciente con artritis reumatoide, por lo que un aumento o disminución en el nivel ensayado de BLyS en comparación con el nivel patrón de BLyS es indicativo de artritis reumatoide.
La memoria descriptiva describe un ensayo de diagnóstico para diagnosticar o pronosticar una enfermedad o trastorno, que comprende: (a) ensayar para determinar el nivel de receptor de BLyS en células o en una muestra tisular de un individuo usando uno o más anticuerpos que se describen en el presente documento que se unen inmunoespecíficamente sólo a BLyS soluble, pero que no neutralizan la unión de BLyS/receptor de BLyS; y (b) comparar el nivel de receptor de BLyS con un nivel patrón de receptor de BLyS, por ejemplo, en una muestra tisular de un paciente sin la enfermedad o trastorno, por lo que un aumento o disminución en el nivel ensayado de receptor de BLyS en comparación con el nivel patrón de receptor de BLyS es indicativo de una enfermedad o trastorno particular. Con respecto al cáncer, la presencia de una cantidad relativamente alta de receptor de BLyS en tejido biopsiado de un individuo puede indicar una predisposición para el desarrollo de la enfermedad, o puede proporcionar un medio para detectar la enfermedad antes de la aparición de los síntomas clínicos reales. Un diagnóstico más definitivo de este tipo puede permitir a los profesionales sanitarios emplear antes medidas preventivas o un tratamiento agresivo, evitando este modo el desarrollo o una progresión adicional del cáncer.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) pueden usarse para los ensayar niveles de proteínas en una muestra biológica usando procedimientos inmunohistológicos clásicos, que se describen en el presente documento o que conocen los expertos en la materia (por ejemplo, véase Jalkanen, y col., J. Cell.
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Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, y col., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros procedimientos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión génica de proteínas incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Se conocen en la técnica marcadores de ensayos de anticuerpos adecuados e incluyen marcadores enzimáticos, tales como glucosa oxidasa, fosfata alcalina y peroxidasa de rábano picante; radioisótopos tales como yodo (121I, 123I, 125I, 131I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (111In, 112In, 113mIn, 115mIn), tecnecio ("Tc, 99mTc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno ("Mo), xenón (133Xe), flúor (18F)1 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166HO, 90Y, 47SC, 186Re, 188Re,142Pr, 105Rh y 97Ru; marcadores luminiscentes tales como luminol; y marcadores fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina, y biotina.
Un aspecto de la memoria descriptiva es la detección y diagnóstico de una enfermedad o trastorno asociado con una expresión aberrante de BLyS o receptor de BLyS en un animal, preferentemente un mamífero y, más preferentemente, un ser humano. En un aspecto de la presente memoria descriptiva, el diagnóstico comprende: a) administrar (por ejemplo, por vía parenteral, subcutánea o intraperitoneal) a un sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo marcado de la presente invención como se describe el presente documento (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se une inmunoespecíficamente a BLyS; b) esperar un intervalo de tiempo después de la administración para permitir que el anticuerpo marcado se concentre preferentemente en sitios en el sujeto en los que se exprese BLyS (y para que se elimine hasta el nivel de fondo la molécula marcada no unida); c) determinar el nivel de fondo; y d) detectar el anticuerpo marcado en el sujeto, de modo que la detección de anticuerpo marcado o fragmento del mismo por encima del nivel de fondo y por encima o por debajo del nivel observado en una persona sin la enfermedad o trastorno indica que el sujeto tiene una enfermedad o trastorno particular asociado con una expresión aberrante de BLyS o receptor de BLyS. El nivel de fondo puede determinarse por diversos procedimientos, incluyendo comparar la cantidad de molécula marcada detectada con un valor patrón previamente determinado para un sistema particular.
Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de formación de imágenes usado determinarán la cantidad de resto de formación de imágenes necesario para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de un resto radioisotópico, para un sujeto humano, la cantidad de radiactividad inyectada variará normalmente de aproximadamente 5 a 20 milicurios de "Tc. El anticuerpo marcado se acumulará después preferentemente en la localización de células que contenga la proteína específica. La formación de imágenes de tumores in vivo se describe en S.W. Burchiel y col., "Immunopharmacokinetics of Antibodies and Their Fragments". (Capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel y B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982).
Dependiendo de varias variables, incluyendo el tipo de marcador usado y el modo de administración, el intervalo de tiempo después de la administración para permitir que la molécula marcada se concentre preferentemente en sitios en el sujeto y que la molécula marcada no unida se elimine hasta el nivel de fondo es de 6 a 48 horas o de 6 a 24 horas o de 6 a 12 horas. En otro aspecto, el intervalo de tiempo después de la administración es de 5 a 20 días o de 5 a 10 días.
El control de la enfermedad o trastorno puede llevarse a cabo repitiendo el procedimiento para diagnosticar la enfermedad o trastorno, por ejemplo, un mes después del diagnóstico inicial, seis meses después del diagnóstico inicial, un año después del diagnóstico inicial, etc.
La presencia de la molécula marcada puede detectarse en el paciente usando procedimientos conocidos en la técnica para la exploración in vivo. Estos procedimientos dependen del tipo de marcador usado. Los expertos en la materia serán capaces de determinar el procedimiento apropiado para detectar un marcador particular. Los procedimientos y dispositivos que pueden usarse en los procedimientos de diagnóstico de la presente invención incluyen, pero sin limitación, tomografía computarizada (CT), exploración de todo el cuerpo tal como una tomografía por emisión de positrones (PET), formación de imágenes de resonancia magnética (MRI) y sonografía.
Específicamente, la molécula se marca con un radioisótopo y se detecta en el paciente usando un instrumento quirúrgico sensible a radiación (Thurston y col., Patente de Estados Unidos N.º 5.441.050). En otro aspecto específico, la molécula se marca con un compuesto fluorescente y se detecta en el paciente usando un instrumento de exploración sensible a fluorescencia. En otro aspecto específico, la molécula se marca con un metal emisor de positrones y se detecta en el paciente usando tomografía por emisión de positrones. En otro aspecto específico, la molécula se marca con un marcador paramagnético y se detecta en un paciente usando formación de imágenes de resonancia magnética (MRI).
Inmunofenotipado
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) pueden utilizarse para el inmunofenotipado de líneas celulares y muestras biológicas por su expresión de BLyS o por su expresión de receptor de BLyS. Pueden utilizarse diversas técnicas que usan anticuerpos, fragmentos o variantes que se describen en el presente documento para explorar poblaciones celulares (es decir, células inmunes, particularmente células monocíticas o linfocitos B) que expresan BLyS o receptor de BLyS, e incluyen separación magnética usando
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perlas magnéticas revestidas de anticuerpo, "selección" con anticuerpo unido a una matriz sólida (es decir, placa) y citometría de flujo (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5.985.660; y Morrison y col., Cell, 96:737-49 (1999)).
Estas técnicas permiten la exploración de poblaciones particulares de células, como las que podrían encontrarse en tumores malignos hematológicos (es decir, enfermedad mínima residual (MRD) en pacientes con leucemia aguda) y "células extrañas" en trasplantes para prevenir la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD). Alternativamente, estas técnicas permiten la exploración de células madre y progenitoras hematopoyéticas capaces de experimentar proliferación y/o diferenciación, como podrían encontrarse en sangre de cordón umbilical humano.
En un aspecto específico, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) se usan para identificar células de origen monocítico o linfocitos B.
Usos Terapéuticos de Anticuerpos
La presente memoria descriptiva describe además terapias basadas en anticuerpos que implican administrar anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) a un animal, preferentemente un mamífero, y más preferentemente un paciente humano, para tratar una o más de las enfermedades, trastornos o afecciones descritos. Los compuestos terapéuticos que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, anticuerpos que se describen en el presente documento y ácidos nucleicos que codifican anticuerpos (y anticuerpos antiidiotípicos) que se describen en el presente documento. Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en el tratamiento, mejoría o prevención de enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con una expresión y/o actividad aberrante de BLyS o receptor de BLyS incluyendo, pero sin limitación, una o más de cualquiera de las enfermedades, trastornos o afecciones descritas en el presente documento. El uso en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades, trastornos o afecciones asociados con una expresión y/o actividad aberrante de BLyS o una expresión y/o actividad aberrante de receptor de BLyS incluye, pero sin limitación, aliviar los síntomas asociados con esas enfermedades, trastornos o afecciones. Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden proporcionarse en composiciones farmacéuticamente aceptables como se conocen en la técnica o como se describen en el presente documento.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpos o variantes de los mismos) que funcionan como agonistas
o antagonistas de BLyS, preferentemente de la transducción de señales inducida por BLyS, pueden ser para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresión aberrante de BLyS, con la ausencia de función de BLyS, con una expresión aberrante de receptor de BLyS o la ausencia de función de receptor de BLyS. Por ejemplo, los anticuerpos que se describen en el presente documento que alteran la interacción entre BLyS y su receptor pueden ser para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresión aberrante de BLyS, una función excesiva de BLyS, una expresión aberrante de receptor de BLyS o una función excesiva de receptor de BLyS. Los anticuerpos que se describen en la presente memoria que no impiden la unión de BLyS a su receptor pero que inhiben o regulan negativamente la transducción de señales inducida por BLyS pueden ser para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresión aberrante de BLyS, con una función excesiva de BLyS, una expresión aberrante de receptor de BLyS o una función excesiva de receptor de BLyS. En particular, los anticuerpos que se describen en la presente invención que impiden la transducción de señales inducida por BLyS por reconocimiento especifico del BLyS no unido, del BLyS unido a receptor o del BLyS tanto unido a receptor como no unido, pueden ser para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresión aberrante de BLyS, una función excesiva de BLyS, una expresión aberrante de receptor de BLyS o una función excesiva de receptor de BLyS. La capacidad de un anticuerpo que se describe en el presente documento para inhibir o regular negativamente la transducción de señales inducida por BLyS puede determinarse mediante técnicas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la técnica. Por ejemplo, la activación de receptor inducida por BLyS y la activación de moléculas de señalización pueden determinarse por detección de la fosforilación (por ejemplo, tirosina o serina/treonina) del receptor o una molécula de señalización por inmunoprecipitación, seguida de análisis por transferencia de Western (por ejemplo, como se describe en el presente documento).
Específicamente, un anticuerpo que se describe en el presente documento (incluyendo moléculas que comprenden,
o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que inhibe o regula negativamente Ia actividad de BLyS al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 45%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 35%, al menos 30%, al menos 25%, al menos 20% o al menos 10% respecto a Ia actividad de BLyS en ausencia del anticuerpo, es para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir ο mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresión aberrante de BLyS, una función excesiva de BLyS, una expresión aberrante de receptor de BLyS
o una función excesiva de receptor de BLyS. En otro aspecto especifico, una combinación de anticuerpos, una combinación de fragmentos de anticuerpo, una combinación de variantes de anticuerpo o una combinación de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y/o variantes que inhiben o regulan negativamente la actividad de BLyS al
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menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55%, al menos 50%, al menos 45%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 35%, al menos 30%, al menos 25%, al menos 20% o al menos 10% respecto a la actividad de BLyS en ausencia de dichos anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y/o variantes de anticuerpo, es para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresión aberrante de BLyS, una función excesiva de BLyS, una expresión aberrante de receptor de BLyS o una función excesiva de receptor de BLyS.
Además, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que activan la transducción de señales inducida por BLyS, son para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresión aberrante de BLyS, con la ausencia de función de BLyS, una expresión aberrante de receptor de BLyS o la ausencia de función de receptor de BLyS. Estos anticuerpos pueden potenciar o activar todas o un subconjunto de las actividades biológicas de la activación de receptor mediada por BLyS, por ejemplo, induciendo la multimerización de BLyS y/o la multimerización del receptor. Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden administrarse formando o no previamente complejos con BLyS. Específicamente, un anticuerpo que se describe en el presente documento que aumenta la actividad de BLyS al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % respecto a la actividad de BLyS en ausencia del anticuerpo es para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresión aberrante de BLyS, la ausencia de función de BLyS, una expresión aberrante de receptor de BLyS o la ausencia de función de receptor de BLyS. En otro aspecto específico, una combinación de anticuerpos, una combinación de fragmentos de anticuerpo, una combinación de variantes de anticuerpo o una combinación de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y/o variantes de anticuerpo que aumentan la actividad de BLyS al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % respecto a la actividad de BLyS en ausencia de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo y/o variantes de anticuerpo, es para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con una expresión aberrante de BLyS o la ausencia de función de BLyS o una expresión aberrante de receptor de BLyS o la ausencia de función de receptor de BLyS.
Uno o más anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespecíficamente a BLyS pueden ser para uso local o sistémico en el cuerpo como producto terapéutico. Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) también pueden utilizarse ventajosamente en combinación con otros anticuerpos monoclonales o quiméricos, o con linfocinas o factores de crecimiento hematopoyético (tales como, por ejemplo, IL-2, IL-3 e IL-7), por ejemplo, que sirven para aumentar el número o la actividad de células efectoras que interaccionan con los anticuerpos.
Los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) pueden usarse en la administración en solitario o en combinación con otros tipos de tratamientos (por ejemplo, terapia de radiación, quimioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia, agentes antitumorales, agentes antiangiogénesis y antiinflamatorios). Generalmente, se prefiere la administración de productos de un origen de especie o reactividad de especie (en el caso de anticuerpos) que sea la misma especie que la del paciente. Por lo tanto, preferentemente, los anticuerpos humanos, fragmentos o variantes (por ejemplo, derivados), o ácidos nucleicos, son para usarse en la administración a un paciente humano para terapia o profilaxis.
Se prefiere usar anticuerpos neutralizantes y/o inhibidores in vivo de alta afinidad y/o potentes como se describen en el presente documento (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespecíficamente a BLyS, o polinucleótidos que codifican anticuerpos que se unen, para tanto inmunoensayos dirigidos contra como terapia, dichos anticuerpos tendrán preferentemente afinidad por BLyS y/o fragmentos de BLyS. Las afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd inferior a o igual a 5 X 10-2 M, 10-2 M, 5 X 10-3 M, 10-3 M, 5 X 10-4 M, 10-4, 5 X 10-5 M o 10-5 M. Más preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipéptidos de BLyS o fragmentos o variantes de los mismos con una constante de disociación o Kd inferior a o igual a 5 X 10-6 M, 10-6 M, 5 X 10-7 M, 10-7 M, 5 X 10-8 M o 10-8 M. Aún más preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento se unen a polipéptidos de BLyS o fragmentos o variantes de los mismos con una constante de disociación o Kd inferior a o igual a 5 X 10-9 M, 10-9 M, 5 X 10-10 M, 10-10 M, 5 X 10-11 Μ, 10-11 M, 5 X 10-12 M, 10-12 M, 5 X 10-13 M, 10-13 M, 5 X 10-14 M, 10-14 M, 5 X una constante de disociación o Kd que está dentro de uno cualquiera de los intervalos que están entre cada uno de los valores enumerados individuales.
Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento neutralizan la actividad de BLyS. En otro aspecto preferido de la memoria descriptiva, los anticuerpos inhiben la proliferación de linfocitos B.
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Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) inhiben o reducen la unión de la forma soluble de BLyS a un receptor de BLyS. En otro aspecto especifico, los anticuerpos que se describen en el presente documento, preferentemente, inhiben o reducen la proliferación de linfocitos B inducida por la forma soluble de BLyS. En otro aspecto específico, los anticuerpos que se describen en el presente documento, preferentemente, inhiben o reducen la producción de inmunoglobulina inducida por la forma soluble de BLyS.
En un aspecto específico, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) preferentemente inhiben o reducen la unión de BLyS unido a membrana a un receptor de BLyS. En otro aspecto específico, los anticuerpos que se describen en el presente documento preferentemente inhiben o reducen la proliferación de linfocitos B inducida por la forma unida a membrana de BLyS. También preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento inducen o reducen la producción de inmunoglobulina inducida por la forma unida a membrana de BLyS.
Preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) inhiben o reducen la unión de las formas tanto soluble como unida a membrana de BLyS a un receptor de BLyS. También preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento inhiben o reducen la proliferación de linfocitos B inducida por cualquiera o ambas formas de BLyS. También preferentemente, los anticuerpos que se describen en el presente documento inhiben o reducen la producción de inmunoglobulina inducida por cualquiera o ambas formas de BLyS.
La memoria descriptiva también describe conjugados de anticuerpos que se describen en el presente documento para su uso en la administración a células diana, tales como, por ejemplo, células monocíticas que expresan la forma unida a membrana de BLyS, o linfocitos B que expresan un receptor de BLyS.
La memoria descriptiva también describe anticuerpos y conjugados de anticuerpos que se describen en el presente documento para su uso en la administración específica a células por administración de moléculas que se describen en el presente documento que están asociadas con polipéptidos heterólogos o ácidos nucleicos. En un ejemplo, la memoria descriptiva describe una proteína terapéutica para su uso en la administración a la célula diana. En otro ejemplo, la memoria descriptiva describe un ácido nucleico monocatenario (por ejemplo, antisentido o ribozimas) o ácido nucleico bicatenario (por ejemplo, ADN que puede integrarse en el genoma de la célula o replicarse episomalmente y que puede transcribirse) para su uso en la administración a la célula diana.
La memoria descriptiva también describe anticuerpos o conjugados de anticuerpos que se describen en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos conjugados con radioisótopos, toxinas o profármacos citotóxicos) para su uso en la destrucción específica de células (por ejemplo, la destrucción de células tumorales). Específicamente, los anticuerpos o conjugados de anticuerpo que se describen en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos conjugados con radioisótopos, toxinas o profármacos citotóxicos) que se unen inmunoespecíficamente a la forma unida a membrana de BLyS para su uso en la destrucción específica de células de linaje monocítico (por ejemplo, leucemias o linfomas relacionados con células monocíticas, tales como, por ejemplo, leucemia mielógena aguda). La memoria descriptiva también describe específicamente anticuerpos o conjugados de anticuerpo que se describen en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos conjugados con radioisótopos, toxinas o profármacos citotóxicos) que se unen a BLyS soluble pero que no inhiben la unión de BLyS a un receptor de BLyS en linfocitos B, para su uso en la destrucción específica de células de linaje celular B (por ejemplo, leucemias o linfomas relacionados con linfocitos B (por ejemplo, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin y enfermedad de Hodgkin).
En otro aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes) promueven o potencian la proliferación de linfocitos B inducida por la forma soluble de BLyS. En otro aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes) promueven o potencian la proliferación de linfocitos B inducida por la forma soluble o unida a membrana de APRIL. En otro aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes) aumentan o potencian la producción de inmunoglobulina inducida por la forma soluble de BLyS. En otro aspecto preferido, los anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes) aumentan o potencian la producción de inmunoglobulina inducida por la forma soluble o unida a membrana de APRIL. En otro aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes) aumentan o potencian la producción de inmunoglobulina en respuesta a inmunógenos dependientes de células T. En otro aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes y anticuerpos anti-anticuerpo) aumentan o potencian la producción de inmunoglobulina en respuesta a inmunógenos independientes de células T.
En otro aspecto, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas son para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir o mejorar trastornos inmunes. Los trastornos inmunes incluyen, pero sin limitación, trastornos autoinmunes (por ejemplo, artritis, rechazo de injerto, tiroiditis de Hashimoto, diabetes insulinodependiente, lupus,
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por ejemplo, por Ig y complemento en las paredes de los vasos y/o bajo nivel de complemento en suero), post-IM (con frecuencia caracterizado, por ejemplo, por anticuerpos miocardiales), síndrome de cardiotomía (con frecuencia caracterizado, por ejemplo, por anticuerpos miocardiales), urticaria (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos IgG e IgM contra IgE), dermatitis atópica (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos IgG e IgM contra IgE), asma (con frecuencia caracterizada, por ejemplo, por anticuerpos IgG e IgM contra IgE), miopatías inflamatorias y muchos otros trastornos inflamatorios, granulomatosos, degenerativos y atróficos.
En un aspecto preferido, las composiciones terapéuticas y farmacéuticas son para usarse en el tratamiento, prevención, mejoría, diagnóstico o pronóstico de un miembro del grupo: anemia hemolítica autoinmune, como glomerulonefritis primaria, glomerulonefritis por IgA, síndrome de Goodpasture, trombocitopenia idiopática, Esclerosis Múltiple, Miastenia Grave, Pénfigo, polimiositis/dermatomiositis, policondritis recidivante, artritis reumatoide, síndrome de Sjögren, lupus eritematoso sistémico, uveítis, vasculitis y cirrosis biliar primaria.
En otro aspecto preferido, las composiciones terapéuticas y farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevención, mejoría, diagnóstico o pronóstico de una enfermedad reumatológica de base inmune, tal como, por ejemplo, SLE, artritis reumatoide, síndrome de CREST (una variante de esclerodermia caracterizada por calcinosis, fenómeno de Raynaud, trastornos de la motilidad esofágica, esclerodactilia y telangiectasia) , espondiloartropatia seronegativa (SpA), polimiositis/dermatomiositis, poliangeitis microscópica, artritis asociada a hepatitis C, arteritis de Takayasu y trastorno del tejido conectivo no diferenciado.
En un aspecto preferido especifico, las composiciones terapéuticas y farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevención, mejoría, diagnóstico o pronóstico de la artritis reumatoide y/o de afecciones médicas asociadas con la misma.
Por ejemplo, un anticuerpo o anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento de pacientes con diagnóstico clínico de artritis reumatoide (RA). El paciente tratado preferentemente no tendrá un tumor maligno de linfocitos B. Además, el paciente se trata opcionalmente además con uno o más de cualquiera de los agentes empleados para tratar la RA, tales como salicilato; fármacos antiinflamatorios no esteroideos, tales como indometacina, fenilbutazona, derivados del ácido fenilacético (por ejemplo, ibuprofeno y fenoprofeno), ácidos naftaleno acéticos (naproxeno), ácido pirrolalcanoico (tometina), ácidos indolacéticos (sulindaco), ácido antranilico halogenado (meclofenamato sódico), piroxicam, zomepiraco y diflunisal; antimaláricos tales como cloroquina; sales de oro; penicilamina; o agentes inmunosupresores tales como metotrexato o corticosteroides, en dosificaciones conocidas para dichos fármacos o dosificaciones reducidas. Sin embargo, preferentemente, el paciente se trata solamente con un anticuerpo o anticuerpos. Los anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administración al paciente con RA de acuerdo con un programa de dosificación que se describe a continuación, que puede determinarse fácilmente por un experto en la materia. La respuesta primaria se determina por el índice de Paulus (Paulus y col. Athritis Rheum. 33:477-484 (1990)), es decir, mejora de la rigidez matutina, número de articulaciones dolorosas e inflamadas, sedimentación eritrocitaria (ESR), y al menos una mejora de 2 puntos en una escala de 5 puntos de gravedad de enfermedad evaluada por el paciente y por el médico. La administración de un anticuerpo o anticuerpos que se describen en el presente documento aliviará uno o más de los síntomas de RA en el paciente tratado como se ha descrito anteriormente.
En un aspecto preferido específico, las composiciones terapéuticas y farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevención, mejoría, diagnóstico o pronóstico de lupus y/o de afecciones médicas asociadas con el mismo. Las afecciones asociadas con lupus que pueden tratarse, prevenirse, mejorarse, pronosticarse y/o diagnosticarse con los anticuerpos y composiciones de anticuerpos que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, trastornos hematológicos (por ejemplo, anemia hemolítica, leucopenia, linfopenia y trombocitopenia), trastornos inmunológicos (por ejemplo, anticuerpos anti-ADN y anticuerpos anti-Sm), sarpullidos, fotosensibilidad, úlceras orales, artritis, fiebre, fatiga, pérdida de peso, serositis (por ejemplo, pleuritis (pleuresía) ) , trastornos renales (por ejemplo, nefritis), trastornos neurológicos (por ejemplo, ataques, neuropatía periférica, trastornos relacionados con el SNC), trastornos gastrointestinales, fenómeno de Raynaud y pericarditis. En un aspecto preferido, las composiciones terapéuticas y farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevención, mejoría, diagnóstico o pronóstico de trastornos renales asociados con lupus eritematoso sistémico. En un aspecto más preferido, las composiciones terapéuticas y farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevención, mejoría, diagnóstico o pronóstico de la nefritis asociada con lupus eritematoso sistémico. En otro aspecto más preferido, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir o mejorar el lupus o la nefritis glomerular.
En un aspecto específico adicional, los anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, inhibición, pronóstico, diagnóstico o prevención de la anemia hemolítica. Por ejemplo, los pacientes diagnosticados con anemia hemolítica autoinmune (AIHA), por ejemplo, crioglobulinemia o anemia positiva a Coombs, se tratan con un anticuerpo o anticuerpos que se describen en el presente documento. La AIHA es una anemia hemolítica adquirida debida a autoanticuerpos que reaccionan con los glóbulos rojos del paciente. El paciente tratado preferentemente no tendrá un tumor maligno de linfocitos B. Pueden combinarse terapias adyuvantes adicionales (tales como glucocorticoides, prednisona, azatioprina, ciclofosfamida, plaquetas cargadas con alcaloides de la vinca o Danazol) con la terapia de anticuerpos, pero preferentemente el paciente se trata con un
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Clin. North Am. (4): 179 (1990)). Varias intervenciones terapéuticas han demostrado ser eficaces en el tratamiento de la ITP. Los esteroides se consideran generalmente terapia de primera línea, después de la cual la mayoría de los pacientes son candidatos para inmunoglobulina intravenosa (IVIG), esplenectomía u otras terapias médicas incluyendo vincristina o agentes inmunosupresores/citotóxicos. Hasta 80% de los pacientes con ITP responden inicialmente a un ciclo de esteroides, pero muchos menos tienen remisiones completas y duraderas. La esplenectomía se ha recomendado como terapia de segunda línea convencional para el fracaso de los esteroides, y conduce a una remisión prolongada en casi 60% de los casos, aunque puede dar como resultado una inmunidad reducida a infecciones. La esplenectomía es un procedimiento quirúrgico mayor que estar asociado con una morbilidad (15%) y mortalidad (2%) importantes. La IVIG también se ha usado como terapia médica de segunda línea, aunque sólo una pequeña proporción de los pacientes adultos con ITP consiguen una remisión. Opciones terapéuticas que interfiriesen con la producción de anticuerpos por linfocitos B activadas sin las morbilidades asociadas que aparecen con los corticosteroides y/o con la esplenectomía proporcionarían una estrategia de tratamiento importante para una proporción de pacientes con ITP. Los pacientes con diagnóstico clínico de ITS se van a tratar con un anticuerpo o anticuerpos que se describen en el presente documento, opcionalmente en combinación con terapia con esteroides. Los pacientes a tratar no tendrán un tumor maligno de linfocitos B. Los anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administración al paciente con RA de acuerdo con un programa de dosificación que se describe a continuación, que puede determinarse fácilmente por un experto en la materia. El índice de respuesta global del paciente se determina basándose en el recuento de plaquetas determinado en dos ocasiones consecutivas separadas por dos semanas después de los tratamientos que se han descrito anteriormente. Véase George y col. "Idiopathic Thrombocytopenic Purpura: A Practice Guideline Developed by Explicit Methods for The American Society of Hematology", Blood 88:3-40 (1996).
En otro aspecto, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administración a un animal, para tratar, prevenir o mejorar una reacción alérgica mediada por IgE
o una reacción alérgica mediada por histamina. Los ejemplos de reacciones alérgicas incluyen, pero sin limitación, asma, rinitis, eccema, urticaria crónica y dermatitis atópica. En otro aspecto, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir o mejorar la anafilaxia, la hipersensibilidad a una molécula antigénica o a la incompatibilidad de grupo sanguíneo. En otro aspecto, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir o mejorar o modular una inflamación o un trastorno inflamatorio. Los ejemplos de trastornos inflamatorios agudos y crónicos que van a tratarse, prevenirse o mejorarse con las composiciones terapéuticas y farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero sin limitación, prostatitis crónica, prostatitis granulomatosa y malacoplaquia, inflamación asociada con infección (por ejemplo, choque séptico, septicemia o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS)), lesión por isquemia-reperfusión, letalidad de endotoxinas, artritis, rechazo hiperagudo mediado por el complemento, nefritis, lesión pulmonar inducida por citocinas o quimiocinas, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedades pulmonares inflamatorias agudas y crónicas, infección bacteriana, psoriasis, septicemia, malaria cerebral, artritis, gastroenteritis y nefritis glomerular.
En otro aspecto, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir o mejorar la isquemia y la arterioesclerosis. Los ejemplos de dichos trastornos incluyen, pero sin limitación, los danos por reperfusión (por ejemplo, en el corazón y/o cerebro) e hipertrofia cardíaca.
Las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento también pueden ser para usarse en la administración para modular la coagulación sanguínea y para tratar o prevenir trastornos de la coagulación sanguínea, tales como, por ejemplo, trombosis mediada por anticuerpos (es decir, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos (APS)). Por ejemplo, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en la inhibición de la proliferación y diferenciación de células implicadas en la producción de anticuerpos anti-cardiolipina. Estas composiciones pueden ser para usarse en el tratamiento, prevención, mejoría, diagnóstico y/o pronóstico de acontecimientos relacionados con trombosis incluyendo, pero sin limitación, ictus (e ictus recurrente) , ataque cardíaco, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, infarto de miocardio, arteriopatía coronaria (por ejemplo, arteriopatía coronaria mediada por anticuerpos), trombosis, reoclusión de injerto después de cirugía cardiovascular (por ejemplo, injertos de derivación arterial coronaria), pérdida fetal recurrente y acontecimientos tromboembólicos cardiovasculares recurrentes.
Las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento también pueden ser para usarse en la administración para tratar, prevenir o mejorar el rechazo de órganos o la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) y/o afecciones asociadas con los mismos. El rechazo de órganos se produce por la destrucción por células inmunes del hospedador del tejido trasplantado por medio de una respuesta inmune. De forma similar, también está implicada una respuesta inmune en la GVHD pero, en este caso, las células inmunes trasplantadas extrañas destruyen los tejidos del hospedador. La administración de anticuerpos que se describen en el presente documento, que inhiben una respuesta inmune, puede ser una terapia eficaz en la prevención del rechazo de órganos o de la GVHD.
En otro aspecto, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno, o
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enfermedades asociadas con un aumento de la apoptosis incluyendo, pero sin limitación, SIDA, trastornos neurodegenerativos (tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa, degeneración cerebelar), síndromes mielodisplásicos (tales como anemia aplásica), lesión isquémica (tal como la causada por infarto de miocardio, ictus y lesión por reperfusión), hepatopatía inducida por toxinas (tal como la causada por alcohol), choque séptico, caquexia y anorexia. En otro aspecto, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir o mejorar una insuficiencia de la médula ósea, por ejemplo, la anemia aplásica y el síndrome mielodisplásico.
En otro aspecto, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir o mejorar el crecimiento, la progresión y/o las metástasis de tumores malignos y trastornos proliferativos asociados con una supervivencia celular aumentada o con la inhibición de la apoptosis. Los ejemplos de dichos trastornos incluyen, pero sin limitación, leucemia (por ejemplo, leucemia aguda tal como leucemia linfocítica aguda y leucemia mielocítica aguda), neoplasias, tumores (por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, Iinfangiosarcoma, Iinfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomisarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de linfocitos Basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma), enfermedad de las cadenas pesadas, metástasis ο cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por un crecimiento celular descontrolado.
En un aspecto específico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento o la prevención de un trastorno caracterizado por hipergammaglobulinemia (por ejemplo, SIDA, enfermedades autoinmunes y algunas inmunodeficiencias).
En un aspecto específico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento o la prevención de un trastorno caracterizado por una producción deficiente de inmunoglobulinas séricas, infecciones recurrentes y/o una disfunción del sistema inmune. Además, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en el tratamiento o la prevención de infecciones de las articulaciones, huesos, piel y/o glándulas parotídeas, infecciones de la sangre (por ejemplo, septicemia, meningitis, artritis séptica y/o osteomielitis), enfermedades autoinmunes (por ejemplo, las descritas en el presente documento), trastornos inflamatorios y tumores malignos, y/o cualquier enfermedad o trastorno o afección asociada con estas infecciones, enfermedades, trastornos y/o tumores malignos incluyendo, pero sin limitación, CVID, otras inmunodeficiencias primarias, enfermedad por VIH, CLL, bronquitis recurrente, sinusitis, otitis media, conjuntivitis, neumonía, hepatitis, meningitis, herpes zóster (por ejemplo, herpes zóster grave) y/o Pneumocistis carnii.
Las composiciones terapéuticas o farmacéuticas pueden ser para usarse en el diagnóstico, pronóstico, tratamiento o prevención de una o más de las enfermedades o trastornos siguientes, o afecciones asociadas con los mismos: inmunodeficiencias primarias, trombocitopenia mediada por el sistema inmune, síndrome de Kawasaki, trasplante de médula ósea (por ejemplo, trasplante de médula ósea reciente en adultos o niños), leucemia linfocítica crónica de linfocitos B, infección por VIH (por ejemplo, infección por VIH pediátrica o del adulto), poli neuropatía desmielinizante inflamatoria crónica y púrpura post-transfusión.
Además, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en el diagnóstico, pronóstico, tratamiento o prevención de una o más de las enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con los mismos siguientes, síndrome de Guillain-Barre, anemia (por ejemplo, anemia asociada con parvovirus BI 9, pacientes con mieloma múltiple estable que presenten alto riesgo de infección (por ejemplo, infección recurrente), anemia hemolítica autoinmune (por ejemplo, anemia hemolítica autoinmune tipo caliente), trombocitopenia (por ejemplo, trombocitopenia neonatal) y neutropenia mediada por el sistema inmune, trasplante (por ejemplo, receptores negativos para citomegalovirus (CMV) de órganos positivos para CMV), hipogammaglobulinemia (por ejemplo, neonatos hipogammaglobulinémicos con factores de riesgo para infección o morbilidad), epilepsia (por ejemplo, epilepsia intratable), síndromes vasculíticos sistémicos, miastenia grave (por ejemplo, descompensación en la miastenia grave), dermatomiositis y polimiositis.
Los aspectos preferidos adicionales de la memoria descriptiva incluyen, pero sin limitación, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento para su uso en las aplicaciones siguientes:
La administración a un animal (por ejemplo, ratón, rata, conejo, hámster, cobaya, cerdos, microcerdos, polios, camélidos, cabras, caballos, vacas, ovejas, perros, gatos, primates no humanos y seres humanos, más preferentemente seres humanos) para reforzar el sistema inmune para producir cantidades aumentadas de uno o
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pueden ser para usarse en la administración como adyuvantes vacunales a pacientes que padecen una inmunodeficiencia. En un aspecto específico adicional, las composiciones que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en la administración como adyuvantes vacunales a pacientes que padecen VIH.
En un aspecto específico, las composiciones que se describen en el presente documento pueden ser para usarse para aumentar o potenciar las respuestas de anticuerpos específicos de antígeno contra vacunas convencionales y experimentales. En un aspecto específico, las composiciones que se describen en el presente documento pueden ser para usarse para potenciar la seroconversion en pacientes tratados con vacunas convencionales y experimentales. En otra realización específica, pueden usarse composiciones de la presente invención para aumentar el repertorio de anticuerpos que reconocen epítopos únicos en respuesta a una vacunación convencional y experimental.
En un aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes, y anticuerpos anti-anticuerpo) aumentan o potencian las respuestas de anticuerpos específicos de antígenos contra vacunas convencionales y experimentales por regulación de la unión de la forma soluble de BLyS a un receptor de BLyS (por ejemplo, BCMA y TACI). En otro aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes, y anticuerpos antianticuerpo) aumentan o potencian las respuestas de anticuerpos específicos de antígenos contra vacunas convencionales y experimentales por regulación de la unión de la forma soluble de APRIL a un receptor de APRIL (por ejemplo, BCMA y TACI).
En un aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpos y variantes, y anticuerpos anti-anticuerpo) aumentan o potencian la seroconversion en pacientes tratados con vacunas convencionales y experimentales por regulación de la unión de la forma soluble de BLyS a receptor de BLyS (por ejemplo, BCMA y TACI). En otro aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpos y variantes, y anticuerpos anti-anticuerpo) aumentan o potencian la seroconversion en pacientes tratados con vacunas convencionales y experimentales por regulación de la unión de la forma soluble de APRIL a un receptor de APRIL (por ejemplo, BCMA y TACI).
En un aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpos y variantes, y anticuerpos anti-anticuerpo) aumentan o potencian el repertorio de anticuerpos que reconocen epítopos únicos en respuesta a una vacunación convencional y experimental por regulación de la unión de la forma soluble de BLyS a un receptor de BLyS (por ejemplo, BCMA y TACI). En otro aspecto preferido, los anticuerpos que se describen en el presente documento (incluyendo fragmentos de anticuerpo y variantes, y anticuerpos anti-anticuerpo) aumentan o potencian el repertorio de anticuerpos que reconocen epítopos únicos en respuesta a una vacunación convencional y experimental por regulación de la unión de la forma soluble de APRIL a un receptor de APRIL (por ejemplo, BCMA y TACI).
En un aspecto específico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como estimulante de la sensibilidad de linfocitos B a patógenos.
En un aspecto específico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como agente que eleve el estado inmune de un individuo antes de que reciba terapias inmunosupresoras.
En un aspecto específico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como agente para inducir anticuerpos de mayor afinidad.
En un aspecto especifico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como agente para aumentar las concentraciones de inmunoglobulinas séricas.
En un aspecto especifico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como agente para acelerar la recuperación de individuos inmunocomprometidos.
En un aspecto específico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como agente para reforzar la inmunosensibilidad entre poblaciones envejecidas.
En un aspecto específico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como potenciador del sistema inmune antes de, durante o después de un trasplante de médula ósea y/o de otros trasplantes (por ejemplo, trasplantes de órganos alogénicos o xenogénicos). Con respecto al trasplante, las composiciones de la presente invención pueden administrarse antes de, al mismo tiempo que y/o después del trasplante. En un aspecto específico, las composiciones que se describen en el presente documento son para usarse en la administración después del trasplante, antes del comienzo de la recuperación de las poblaciones de células T. En otro aspecto específico, las composiciones que se describen en el presente documento son para usarse para administrarse en primer lugar después del trasplante, después del comienzo de la recuperación de las poblaciones de células T, pero antes de la recuperación completa de las poblaciones de linfocitos B.
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tanto buenos reguladores de las respuestas inmunes independientes de células T contra patógenos ambientales. En particular, las poblaciones de linfocitos B no convencionales (CD5+), que están asociadas con sitios de la mucosa y responsables de mucha de la inmunidad innata en seres humanos, pueden responder a anticuerpos o composiciones que se describen en el presente documento, potenciando o inhibiendo por lo tanto el estado inmune de un individuo.
En un aspecto específico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas de la presente invención son para usarse como agente para dirigir el sistema inmune de un individuo hacia el desarrollo de una respuesta humoral (es decir, TH2), en vez de una respuesta celular THl.
En un aspecto específico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como medio para inducir la proliferación de tumores y de este modo hacerlos más susceptibles a agentes antineoplásicos. Por ejemplo, el mieloma múltiple es una enfermedad que se divide lentamente y, por lo tanto, es resistente a prácticamente todos los regímenes antineoplásicos. Si se forzase a estas células a proliferar más rápidamente, su perfil de susceptibilidad cambiaria probablemente.
En un aspecto específico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como proteína de unión específica de células monocíticas a la que pueden unirse activadores o inhibidores específicos del crecimiento celular. El resultado sería centrar la actividad de dichos activadores o inhibidores sobre poblaciones de linfocitos B normales, enfermas o neoplásicas.
En un aspecto específico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como proteína de unión específica de linfocitos B a la que pueden unirse activadores o inhibidores específicos del crecimiento celular. El resultado sería centrar la actividad de dichos activadores o inhibidores sobre poblaciones de linfocitos B normales, enfermas o neoplásicas.
En un aspecto específico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como medio de detección de células monocíticas en virtud de su especificidad. Esta aplicación puede requerir el marcaje de la proteína con biotina u otros agentes (por ejemplo, como se describe en el presente documento) para proporcionar un medio de detección.
En un aspecto específico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como medio de detección de células de Iinaje B en virtud de su especificidad. Esta aplicación puede requerir el marcaje de la proteína con biotina u otros agentes (por ejemplo, como se describe en el presente documento) para proporcionar un medio de detección.
En un aspecto específico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como estimulante de la producción de linfocitos B en patologías tales como el SIDA, el trastorno linfocítico crónico y/o la inmunodeficiencia variable común.
En un aspecto específico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como parte de un dispositivo de selección de monocitos cuya función es aislar monocitos a partir de una mezcla heterogénea de tipos celulares. Los anticuerpos de la presente invención podrían estar acoplados a un soporte sólido con el que después se unirían específicamente los monocitos. Las células no unidas se eliminarían por lavado y las células unidas se eluirían posteriormente. Un uso no limitante de esta selección seria permitir la purga de células tumorales, por ejemplo, de médula ósea o sangre periférica antes de un trasplante.
En un aspecto específico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como parte de un dispositivo de selección de linfocitos B cuya función es aislar linfocitos B a partir de una mezcla heterogénea de tipos celulares. Los anticuerpos de la presente invención (que no inhiben la interacción de BLyS/receptor de BLyS) que se unen a BLyS soluble podrían estar acoplados a un soporte sólido con el que después se unirían específicamente las linfocitos B. Las células no unidas se eliminarían por lavado y las células unidas se eluirían posteriormente. Un uso no limitante de esta selección seria permitir la purga de células tumorales, por ejemplo, de médula ósea o sangre periférica antes de un trasplante.
En un aspecto específico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como terapia para la generación y/o regeneración de tejidos linfoides después de una cirugía, traumatismo o defecto genético.
En un aspecto especifico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como terapia basada en genes para trastornos heredados genéticamente que dan como resultado una inmunoincompetencia tal como la observada entre pacientes con SCID.
En un aspecto especifico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como antígeno para la generación de anticuerpos para inhibir o potenciar respuestas mediadas por BLyS.
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En un aspecto especifico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como medio de activación de monocitos/macrófagos para defenderse frente a enfermedades parasitarias que afectan a los monocitos tales como Leishmania.
En un aspecto especifico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como pretratamiento de muestras de médula ósea antes de un trasplante. Dicho tratamiento aumentaría la representación de linfocitos B y por lo tanto aceleraría la recuperación.
En un aspecto especifico, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse como medio de regulación de citocinas secretadas que se generan por BLyS y/o receptor de BLyS.
Los polipéptidos o polinucleótidos de anticuerpos que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en la modulación de las concentraciones de IgE in vitro o in vivo.
Además, los polipéptidos o polinucleótidos de anticuerpos que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de reacciones alérgicas mediadas por IgE. Dichas reacciones alérgicas incluyen, pero sin limitación, asma, rinitis y eccema.
En un aspecto especifico, los polipéptidos o polinucleótidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administración para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar una deficiencia selectiva de IgA.
En otro aspecto especifico, los polipéptidos o polinucleótidos de anticuerpos que se describen en Ia presente memoria son para usarse en la administración para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar la ataxia-telangiectasia.
En otro aspecto especifico, los polipéptidos o polinucleótidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administración para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar la inmunodeficiencia variable común.
En otro aspecto especifico, los polipéptidos o polinucleótidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administración para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar la agammaglobulinemia ligada a X.
En otro aspecto especifico, los polipéptidos o polinucleótidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administración para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar la inmunodeficiencia combinada grave (SCID).
En otro aspecto especifico, los polipéptidos o polinucleótidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administración para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar el síndrome de Wiskott-Aldrich.
En otro aspecto especifico, los polipéptidos o polinucleótidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administración para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar la deficiencia de Ig ligada a X con híper-IgM. En una realización específica, los polipéptidos o polinucleótidos de anticuerpos de la presente invención se administran para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar la deficiencia de Ig ligada a X con híper-IgM.
En otro aspecto especifico, los polipéptidos o polinucleótidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administración para tratar, prevenir y/o diagnosticar la leucemia mielógena crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia, leucemia histiocítica, leucemia monocítica (por ejemplo, leucemia monocítica aguda), reticulosis leucémica, leucemia monocítica Tipo Schilling y/o otras leucemias derivadas de monocitos y/o células y/o tejidos monocíticos.
En otro aspecto especifico, los polipéptidos o polinucleótidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administración para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar la reacción leucemoide monocítica como se observa, por ejemplo, con la tuberculosis.
En otro aspecto específico, los polipéptidos o polinucleótidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en la administración para tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar la leucocitosis monocítica, leucopenia monocítica, monocitopenia y/o monocitosis.
En un aspecto específico, los polipéptidos o polinucleótidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevención, detección y/o diagnóstico de trastornos y/o enfermedades de monocitos, y/o afecciones asociadas con las mismas.
En un aspecto específico, los polipéptidos o polinucleótidos de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en el tratamiento, prevención, detección y/o diagnóstico de trastornos y/o enfermedades de linfocitos B primarios, y/o afecciones asociadas con las mismas. En una realización, dichos trastornos,
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pero sin limitación, fibrosis quística (incluyendo fibrosis tales como fibrosis quística del páncreas, síndrome de Clarke-Hadfield, enfermedad fibroquística del páncreas, mucoviscidosis y viscidosis), fibrosis endomiocárdica, fibrosis retroperitoneal idiopática, fibrosis leptomeníngea, fibrosis mediastinica, fibrosis subepidérmica nodular, fibrosis pericentral, fibrosis perimuscular, fibrosis periportal, fibrosis de sustitución, fibrosis subadventicia y fibrosis periportal de Symmers.
En otro aspecto, las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que se describen en el presente documento son para usarse en la administración a un animal para tratar, prevenir o mejorar enfermedades infecciosas. Las enfermedades infecciosas incluyen enfermedades asociadas con levaduras, hongos, infecciones víricas y bacterianas. Los virus causantes de infecciones víricas que pueden tratarse o prevenirse de acuerdo con esta invención incluyen, pero sin limitación, retrovirus (por ejemplo, virus linfotrófico de células T humano (HTLV) tipos I y II y virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)), herpesvirus (por ejemplo, virus herpes simple (HSV) tipos I y II, virus Epstein-Barr, HHV6-HHV8 y citomegalovirus), arenavirus (por ejemplo, virus de la fiebre de Lassa), paramixovirus (por ejemplo, virus morbilivirus, virus respiratorio sincitial humano, paperas y pneumovirus),adenovirus, bunyavirus (por ejemplo, hantavirus), Coronavirus, filovirus (por ejemplo, virus del Ébola), flavivirus (por ejemplo, virus de la hepatitis C (HCV), virus de la fiebre amarilla y virus de la encefalitis japonesa), hepadnavirus (por ejemplo, virus de la hepatitis B (HBV)), ortomiovirus (por ejemplo, virus de la influenza A, B y C) , papovavirus (por ejemplo, papilomavirus) , picornavirus (por ejemplo, rinovirus, enterovirus y virus de la hepatitis A), poxvirus, reovirus (por ejemplo, rotavirus), togavirus (por ejemplo, virus de la rubeola), rabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia). Los patógenos microbianos causantes de infecciones bacterianas incluyen, pero sin limitación, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoea, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Klebsiella rhinoscleromotis, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushi, Chlamydia spp. y Helicobacter pylori.
Terapia Génica
En un aspecto específico, los ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican anticuerpos o derivados funcionales de los mismos son para usarse en la administración para tratar, inhibir o prevenir una enfermedad o trastorno asociado con una expresión y/o actividad aberrante de BLyS y/o su receptor, por medio de terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia realizada mediante la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o que puede expresarse. En esta realización de la memoria descriptiva, los ácidos nucleicos producen su proteína codificada que media un efecto terapéutico.
Cualquiera de los procedimientos para terapia génica disponibles en la técnica puede usarse de acuerdo con la presente memoria descriptiva. Los procedimientos ejemplares se describen a continuación.
Para revisiones generales de los procedimientos de terapia génica véase Goldspiel y col., Clinical Pharmacy 12: 488-505 (1993); Wu y Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); May, TIBTECH I 1(5): 155-215 (1993). Se describen procedimientos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología del ADN recombinante que pueden usarse en Ausubel y col. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).
En un aspecto preferido, una composición de la memoria descriptiva comprende, o alternativamente consiste en ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo, siendo dichos ácidos nucleicos parte de un vector de expresión que expresa el anticuerpo o fragmentos o proteínas quiméricas o cadenas pesadas o ligeras del mismo en un hospedador adecuado. En particular, dichos ácidos nucleicos tienen promotores, preferentemente promotores heterólogos, unidos operativamente a la región codificante de anticuerpo, siendo dicho promotor inducible o constitutivo y, opcionalmente, específico de tejido. En otro aspecto particular, se usan moléculas de ácido nucleico en las que las secuencias codificantes de anticuerpo y cualquier otra secuencia deseada está flanqueada por regiones que promueven la recombinación homóloga en un sitio deseado del genoma, proporcionando de este modo la expresión intracromosómica de los ácidos nucleicos codificantes de anticuerpos (Koller y Smithies, Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 86: 8932-8935 (1989); Zijlstra y col., Nature 342:435-438 (1989). En aspectos específicos, la molécula de anticuerpo expresada es un scFv; alternativamente, las secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias que codifican las cadenas tanto pesada como ligera, o fragmentos o variantes de las mismas, de un anticuerpo.
La administración de los ácidos nucleicos a un paciente puede ser directa, en cuyo caso el paciente se expone directamente al ácido nucleico o a vectores que llevan el ácido nucleico, o indirecta, en cuyo caso las células se
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Las células recombinantes resultantes pueden administrarse a un paciente por diversos procedimientos conocidos en la técnica. Las células sanguíneas recombinantes (por ejemplo, células madre o progenitoras hematopoyéticas) se administran preferentemente por vía intravenosa. La cantidad de células prevista para usar depende del efecto deseado, del estado del paciente, etc. y puede determinarse por un experto en la materia.
Las células en las que puede introducirse un ácido nucleico con fines de terapia génica incluyen cualquier tipo celular disponible deseado e incluyen, pero sin limitación, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; diversas células madre o progenitoras, en particular células madre o progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, como se obtienen de médula ósea, sangre de cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc.
En un aspecto preferido, la célula a usar para terapia génica es autóloga respecto al paciente.
En un aspecto en el que se van a usar células recombinantes en terapia génica, las secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo o fragmento del mismo se introducen en las células de modo que puedan expresarse por las células o su progenie, y las células recombinantes se administran después in vivo para su efecto terapéutico. En un aspecto específico, se van a usar células madre o progenitoras. Cualquier célula madre y/o progenitora que puede aislarse y mantenerse in vitro puede usarse potencialmente de acuerdo con este aspecto (véase, por ejemplo, la Publicación PCT WO 94/08598; Stemple y Anderson, Cell 7 I: 973-985 (1992); Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A: 229 (1980); y Pittelkow y Scott, Mayo Clinic Proc. 61: 771 (1986)).
En un aspecto específico, el ácido nucleico a introducir con fines de terapia génica comprende un promotor inducible unido operativamente a la región codificante, de modo que la expresión del ácido nucleico puede controlarse por control de la presencia o ausencia del inductor de la transcripción apropiado.
Demostración de la Utilidad Terapéutica o Profiláctica de una Composición
Los compuestos que se describen en el presente documento se ensayan preferentemente in vitro y después in vivo para la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes de su uso en seres humanos. Por ejemplo, los ensayos in vitro que pueden usarse para determinar si está indicada la administración de un anticuerpo o composición específica que se describe en el presente documento incluyen ensayos de cultivos celulares in vitro, en los que se cultiva una muestra de tejido de paciente en cultivo, y se expone a o se le administra de otro modo un anticuerpo o composición que se describe en el presente documento, y se observa el efecto de dicho anticuerpo o composición de la presente invención sobre la muestra de tejido. En diversos aspectos específicos, pueden llevarse a cabo ensayos in vitro con células representativas de tipos celulares implicados en un trastorno de un paciente para determinar si un anticuerpo o composición que se describe en el presente documento tiene un efecto deseado sobre dichos tipos celulares. Preferentemente, los anticuerpos o composiciones que se describen en el presente documento también se ensayan en ensayos in vitro γ sistemas de modelos animales antes de su administración a seres humanos.
Los anticuerpos o composiciones que se describen en el presente documento para su uso en terapia pueden ensayarse para determinar su toxicidad en sistemas de modelos animales adecuados incluyendo, pero sin limitación, ratas, ratones, polios, vacas, monos y conejos. Para el ensayo in vivo de la toxicidad de un anticuerpo o composición puede usarse cualquier sistema de modelo animal conocido en la técnica.
La eficacia en el tratamiento o prevención de una infección vírica puede demostrarse detectando la capacidad de un anticuerpo o composición que se describe en el presente documento para inhibir la replicación del virus, para inhibir la transmisión o evitar el establecimiento del propio virus en su hospedador, o para prevenir, mejorar o aliviar los síntomas de progresión de una enfermedad. El tratamiento se considera terapéutico si, por ejemplo, existe una reducción en la carga viral, una mejoría de uno o más síntomas o una disminución en la mortalidad y/o morbilidad después de la administración de un anticuerpo o composición de la presente invención.
Los anticuerpos o composiciones que se describen en el presente documento pueden ensayarse para determinar la capacidad para inducir la expresión de citocinas tales como IFN-γ por contacto de células, preferentemente células humanas, con un anticuerpo o composición de la presente invención o un anticuerpo de control o composición de control, y determinación de la capacidad del anticuerpo o composición de la presente invención para inducir una o más citocinas. Pueden usarse técnicas conocidas por los expertos en la materia para medir el nivel de expresión de citocinas. Por ejemplo, el nivel de expresión de citocinas puede medirse analizando el nivel de ARN de citocinas, por ejemplo, mediante RT-PCR y análisis de transferencia de Northern, y analizando el nivel de citocinas mediante, por ejemplo, inmunoprecipitación seguida de análisis de transferencia de Western y ELISA. En un aspecto preferido, un compuesto que se describe en el presente documento se ensaya para determinar su capacidad para inducir la expresión de IFN-γ.
Los anticuerpos o composiciones que se describen en el presente documento pueden ensayarse para determinar su capacidad para modular la actividad biológica de células inmunes por contacto de las células inmunes, preferentemente células inmunes humanas (por ejemplo, células T, linfocitos B y células asesinas naturales) con un anticuerpo o composición que se describe en el presente documento o un compuesto de control, y determinación de
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la capacidad del anticuerpo o composición que se describe en el presente documento para modular (es decir, aumentar o disminuir) la actividad biológica de células inmunes. La capacidad de un anticuerpo o composición que se describe en el presente documento para modular la actividad biológica de células inmunes puede evaluarse detectando la expresión de antígenos, detectando la proliferación de células inmunes (es decir, la proliferación de linfocitos B), detectando la activación de moléculas de señalización, detectando la función efectora de células inmunes o detectando la diferenciación de células inmunes. Pueden usarse técnicas conocidas por los expertos en la materia para medir estas actividades. Por ejemplo, la proliferación celular puede ensayarse mediante ensayos de incorporación de 3H-timidina y recuentos de células con azul tripán. La expresión de antígeno puede ensayarse, por ejemplo, mediante inmunoensayos incluyendo, pero sin limitación, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando técnicas tales como transferencias de Western, radioinmunensayos inmunohistoquimicos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos tipo "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A y análisis de FACS. La activación de moléculas de señalización puede ensayarse, por ejemplo, mediante ensayos de quinasa y ensayos de desplazamiento electroforético (EMSA). En un aspecto preferido, se mide la capacidad de un anticuerpo o composición que se describe en el presente documento para inducir la proliferación de linfocitos B. En otro aspecto preferido, se mide la capacidad de un anticuerpo o composición que se describe en el presente documento para modular la expresión de inmunoglobulina.
Los anticuerpos o composiciones que se describen en el presente documento pueden ensayarse para determinar su capacidad para reducir la formación de tumores en ensayos in vitro, ex vivo e in vivo. Los anticuerpos o composiciones que se describen en Ia presente memoria también pueden ensayarse para determinar su capacidad para inhibir Ia replicación viral o reducir Ia carga viral en ensayos in vitro e in vivo. Los anticuerpos o composiciones que se describen en Ia presente memoria también pueden ensayarse para determinar su capacidad para reducir Ia cantidad de bacterias en ensayos in vitro e in vivo conocidos por los expertos en la materia. Los anticuerpos o composiciones que se describen en Ia presente memoria también pueden ensayarse para determinar su capacidad para aliviar uno o más síntomas asociados con cáncer, un trastorno inmune (por ejemplo, una enfermedad inflamatoria), un trastorno neurológico o una enfermedad infecciosa. Los anticuerpos o composiciones que se describen en el presente documento también pueden ensayarse para determinar su capacidad para disminuir el curso temporal de la enfermedad infecciosa. Además, los anticuerpos o composiciones que se describen en el presente documento pueden ensayarse para determinar su capacidad para aumentar el período de supervivencia de animales que padecen una enfermedad o trastorno, incluyendo cáncer, un trastorno inmune o una enfermedad infecciosa. Pueden usarse técnicas conocidas por los expertos en la materia para analizar la función de los anticuerpos o composiciones de la presente invención in vivo.
Composiciones Terapéuticas/Profilácticas y Administración
La memoria descriptiva describe una cantidad eficaz de anticuerpo (o fragmento o variante del mismo) o composición farmacéutica que se describe en el presente documento, preferentemente un anticuerpo que se describe en el presente documento, para su uso en el tratamiento, inhibición o profilaxis por administración a un sujeto. En un aspecto preferido, un anticuerpo o fragmento o variante del mismo está sustancialmente purificado (es decir, sustancialmente libre de sustancias que limiten su efecto o produzcan efectos secundarios no deseados). El sujeto es preferentemente un animal, incluyendo, pero sin limitación, animales tales como vacas, cerdos, caballos, polios, gatos, perros, etc., y es preferentemente un mamífero, y más preferentemente un ser humano.
Las formulaciones y procedimientos de administración que pueden emplearse cuando el compuesto comprende un ácido nucleico o una inmunoglobulina se han descrito anteriormente; pueden seleccionarse formulaciones y vías de administración apropiadas adicionales de entre las descritas a continuación en el presente documento.
Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar un anticuerpo o fragmento o variante del mismo que se describe en el presente documento, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral o de otro tipo, etc. Los procedimientos de introducción incluyen, pero sin limitación, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Las composiciones pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección en embolada, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser local o sistémica. Además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la presente invención en el sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, incluyendo la inyección interventricular e intratecal; la inyección interventricular puede facilitarse mediante un catéter interventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito Ommaya. También puede emplearse la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador y la formulación con un agente aerosolizante.
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En un aspecto especifico, puede ser deseable usar las composiciones farmacéuticas que se describen en el presente documento para su administración local en el área que necesite tratamiento; esto puede conseguirse mediante, por ejemplo, y no a modo de limitación, infusión local durante una cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, junto con un vendaje de heridas después de una cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, siendo dicho implante un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas de Silastic o fibras. Preferentemente, cuando se administra una proteína, incluyendo un anticuerpo de la presente invención, debe tenerse cuidado de usar materiales a los que no se absorba la proteína.
En otro aspecto, la composición puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat y col., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein y Fidler (eds-), Liss, Nueva York, págs. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibidem., págs. 317-327; véase en general ibid).
En otro aspecto más, la composición se va administrar en un sistema de liberación controlada. En un aspecto, puede usarse una bomba (véase Langer, anteriormente; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 20 1 (1987); Buchwald y col., Surgery 88: 507 (1980); Saudek y col., N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989)). En otro aspecto, pueden usarse materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, J., Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 (1983); véase también Levy et al., Science 228: 190 (1985); During y col., Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard y col., J. Neurosurg. 7 1: 105 (1989)). En otra realización más, un sistema de liberación controlada puede ponerse en las cercanías de la diana terapéutica, es decir, el cerebro, requiriendo de este modo sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, anteriormente, vol. 2, págs. 115-138 (1984)).
Otros sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión por Langer (Science 249: 1527-1533 (1990)).
En un aspecto específico en el que la composición que se describe en el presente documento es un ácido nucleico que codifica una proteína, el ácido nucleico puede ser para usarse en la administración in vivo para promover la expresión de su proteína codificada, por construcción del mismo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administración del mismo de modo que se haga intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (véase la Patente de Estados Unidos N.º 4.980.286) o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont) o revestimiento con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, o por administración del mismo en unión a un péptido tipo caja homeótica (homeobox) que se sabe que se introduce en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot y col., Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU. 88: 1864-1868 (1991)), etc. Alternativamente, un ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula hospedadora para su expresión mediante recombinación homóloga.
La presente memoria descriptiva también describe composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto específico, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa autorizada por una agencia reguladora del Gobierno Federal o estatal, o enumerada en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea reconocida en general para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el producto terapéutico. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles tales como agua y aceites, incluyendo los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También pueden emplearse soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche en polvo desnatada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos convencionales tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Se describen ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento del mismo, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma de administración apropiada al paciente. La formulación debería adaptarse al modo de administración.
En un aspecto preferido, la composición se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para su administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para
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administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando es necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizaste y un anestésico local tal como lignocaína para paliar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o mezclados juntos en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo seco liofilizado o un concentrado sin agua en un recipiente sellado herméticamente, tal como una ampolla o sobrecito que indique la cantidad de agente activo. Cuando la composición va a administrarse por infusion, puede dispensarse con un frasco de infusion que contiene solución salina o agua de calidad farmacéutica estéril. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de modo que los ingredientes puedan mezclarse antes de su administración.
Las composiciones que se describen en el presente documento pueden formularse como formas neutras o formas de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones tales como los derivados de los ácidos clorhidrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. y las formadas con cationes tales como los derivados de sodio, potasio, amonio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, tietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaina, etc.
La cantidad de la composición que se describe en el presente documento que será eficaz en el tratamiento, inhibición y prevención de una enfermedad o trastorno asociado con una expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de la presente invención puede determinarse mediante técnicas clinicas convencionales. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro para contribuir a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosis exacta a emplear en la formulación también dependerá de la via de administración y de la gravedad de la enfermedad o trastorno, y deberia decidirse de acuerdo con el juicio del médico y con las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de ensayo de modelos animales o in vitro.
Para anticuerpos, la dosificación administrada a un paciente es tipicamente de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Preferentemente, la dosificación administrada a un paciente es de entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del paciente, más preferentemente, de 1 mg/kg y 10 mg/kg del peso corporal del paciente. Generalmente, los anticuerpos humanos tienen una semivida más prolongada dentro del cuerpo humano que los anticuerpos de otras especies debido a la respuesta inmune contra los polipéptidos extrahos. Por lo tanto, con frecuencia son posibles menores dosificaciones de anticuerpos humanos y una administración menos frecuente. Además, la dosificación y la frecuencia de administración de composiciones terapéuticas o farmacéuticas de la presente invención pueden reducirse aumentando la captación y penetración tisular (por ejemplo, en el cerebro) de los anticuerpos mediante modificaciones tales como, por ejemplo, lipidación.
Los anticuerpos y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en la administración en solitário o en combinación con otros adyuvantes. Los adyuvantes que pueden administrarse con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo de la presente invención incluyen, pero sin limitación, alumbre, alumbre más desoxicolato (InmunoAg), MTP-PE (Biocine Corp.), QS21 (Genentech, Inc.), BCG y MPL. En un aspecto especifico, los anticuerpos y composiciones de anticuerpos que se describen en el presente documento se administran en combinación con alumbre. En otro aspecto especifico, los anticuerpos y composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en la administración en combinación con QS-21. Los adyuvantes adicionales que pueden ser para usarse en la administración con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, monofosforil lipido inmunomodulador, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, sales de alumínio, MF-59 y tecnología adyuvante virosomal. Las vacunas que pueden ser para usarse en la administración con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, vacunas dirigidas hacia la protección frente a MMR (sarampión, paperas, rubeola), polio, varicela, tétanos/difteria, hepatitis A, hepatitis B, Haemophilus influenzae B, tos ferina, neumonía, influenza, Enfermedad de Lyme, rotavirus, cólera, fiebre amarilla, encefalitis japonesa, poliomielitis, rabia, fiebre tifoidea y pertusis y/o PNEUMOVAX-23™. Las combinaciones pueden ser para usarse en la administración de forma concomitante, por ejemplo, como una mezcla, por separado pero simultáneamente o de forma concurrente; o de forma secuencial. Esto incluye presentaciones en las que los agentes combinados se administran juntos como una mezcla terapéutica y también procedimientos en los que los agentes combinados se administran por separado pero simultáneamente, por ejemplo, a través de vias intravenosas separadas en el mismo indivíduo. La administración "en combinación" incluye además la administración separada de uno de los compuestos o agentes administrado primero, seguida del segundo.
En otro aspecto específico, los anticuerpos y las composiciones de anticuerpos que se describen en el presente documento son para usarse en combinación con PNEUMOVAX-23™ para tratar, prevenir y/o diagnosticar una infección y/o cualquier enfermedad, trastorno y/o afección asociada con la misma. En un aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en combinación con PNEUMOVAX-23™ para tratar, prevenir y/o diagnosticar cualquier infección bacteriana Gram positiva y/o cualquier enfermedad, trastorno y/o afección asociada con la misma. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en combinación con PNEUMOVAX-23™ para tratar, prevenir y/o diagnosticar una infección y/o cualquier enfermedad, trastorno y/o afección asociada con uno o más miembros del género Enterococcus y/o del género Streptococcus. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en cualquier combinación
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Una amplia diversidad de otros factores antiangiogénicos pueden utilizarse también dentro del contexto de la presente memoria descriptiva. Los ejemplos representativos incluyen, pero sin limitación, factor plaquetario 4; sulfato de protamina; derivados de quitina sulfatada (preparada a partir de caparazones de cangrejo de las nieves), (Murata y col., Cancer Res. 51: 22-26,1991); Complejo de Polisacárido Sulfatado-Peptidoglicano (SP-PG) (la función de este compuesto puede potenciarse en presencia de esteroides tales como estrógeno y citrato de tamoxifeno); estaurosporina; moduladores del metabolismo de la matriz, incluyendo, por ejemplo, análogos de prolina, cishidroxiprolina, d, L-3,4-deshidroprolina, Tiaprolina, alfa,alfa-dipiridilo, fumarato de aminopropionitrilo; 4-propil-5(4-piridinil)-2(3H)-oxazolona; Metotrexato; Mitoxantrona; Heparina; Interferones; 2 Macroglobulina-sérica; ChlMP-3 (Pavloff y col., J. Bio. Chem. 267: 17321-17326, 1992); Quimostatina (Tomkinson y col., Biochem J. 286: 475480,1992); TetradecasuIfato de Ciclodextrina; Eponemicina; Camptotecina; Fumagilina (Ingber y col., Nature 348: 555-557, 1990); Tiomalato Sódico de Oro ("GST"; Matsubara y Ziff, J. Clin. Invest. 79: 1440-1446, 1987); anticolagenasa-sérica; alfa2-antiplasmina (Holmes y col., J. Biol. Chem. 262 (4): 1659-1664, 1987); Bisantreno (National Cancer Institute); Lobenzarit disódico (ácido N-(2)-carboxifenil-4-cloroantroníIico disódico o "CCA"; (Takeuchi y col., Agents Actions 36: 312-316,1992); e inhibidores de la metaloproteinasa tales como BB94 .
Los factores antiangiogénicos adicionales que también pueden utilizarse dentro del contexto de la presente invención incluyen Talidomida (Celgene, Warren, NJ) ; esteroide angiostático; AGM-1470 (H. Brem y J. Folkman J Pediatr. Surg. 28: 445-51 (1993)); un antagonista de integrina alfa v beta 3 (C. Storgard y col., J Clin. Invest. 103: 4754 (1999)); carboxinaminoimidazol; Carboxiamidotriazol (CAI) (National Cancer Institute, Bethesda, MD) ; Conbretastatina A-4 (CA4P) (OXiGENE, Boston, MA); Escualamina (Magainin Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA); TNP-470, (Tap Pharmaceuticals, Deerfield, IL); ZD-OlOl AstraZeneca (Londres, UK); APRA (CT2584); Benefina, Birostatina-I (SC339555); CGP-41251 (PKC 412); CM101; Dexrazoxano (ICRFl87); DMXAA; Endostatina; Flavopridiol; Genesteina; GTE; ImmTher; Iressa (ZD1839); Octreotida (Somatostatina); Panretina; Penacilamina; Photopoint; PI-88; Prinomastat (AG-3340) Purlytin; Suradista (FCE26644); Tamoxifeno (Nolvadex); Tazaroteno; Tetratiomolibdato; Xeloda (Capecitabina); y 5-Fluorouracilo.
Los agentes antiangiogénicos que pueden ser para usarse en la administración en combinación con los compuestos que se describen en el presente documento pueden funcionar a través de una diversidad de mecanismos incluyendo, pero sin limitación, inhibiendo la proteolisis de la matriz extracelular, bloqueando la función de moléculas de adhesion de células endoteliales a la matriz extracelular, antagonizando la función de los inductores de la angiogénesis, tales como factores de crecimiento, e inhibiendo los receptores de integrina expresados en células endoteliales en proliferación. Los ejemplos de inhibidores antiangiogénicos que interfieren con la proteolisis de la matriz extracelular y que pueden ser para usarse en la administración en combinación con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, AG-3340 (Agouron, La Jolla, CA), BAY-12-9566 (Bayer, West Haven , CT), BMS-275291 (Bristol Myers Squibb, Princeton, NJ) , CGS-27032A (Novartis, East Hanover, NJ) , Marimastat (British Biotech, Oxford, Reino Unido) y Metastat (Aeterna, St-Foy, Quebec). Los ejemplos de inhibidores antiangiogénicos que actúan bloqueando la función de las moléculas de adhesion de células endoteliales a la matriz extracelular y que pueden ser para usarse en la administración en combinación con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, EMD-121974 (Merck KcgaA Darmstadt, Alemania) y Vitaxina (Ixsys, La Jolla, CA/Medimmune, Gaithersburg, MD) . Los ejemplos de agentes antiangiogénicos que actúan antagonizando o inhibiendo directamente los inductores de la angiogénesis y que pueden ser para usarse en la administración en combinación con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, Angiozyme (Ribozyme, Boulder, GO), anticuerpo anti-VEGF (Genentech, S. San Francisco, CA), PTK-787/ZK-225846 (Novartis, Basel, Suiza), SU-IOl (Sugen, S. San Francisco, CA), SU-5416 (Sugen/Pharmacia Upjohn, Bridgewater, NJ) y SU-6668 (Sugen). Otros agentes antiangiogénicos actúan inhibiendo directamente la angiogénesis. Los ejemplos de inhibidores directos de la angiogénesis que pueden ser para usarse en la administración en combinación con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, IM-862 (Cytran, Kirkland, WA) , Interferón-alfa, IL-12 (Roche, Nutley, NJ) y polisulfato de pentosán (Georgetown University, Washington, DC).
En aspectos particulares, el uso de un anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento en combinación con agentes antiangiogénicos se contempla para el tratamiento, prevención y/o mejoria de una enfermedad autoinmune, tal como, por ejemplo, una enfermedad autoinmune descrita en el presente documento.
En un aspecto particular, el uso de un anticuerpo y de las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento en combinación con agentes antiangiogénicos se contempla para el tratamiento, prevención y/o mejoria de la artritis. En un aspecto más particular, el uso del anticuerpo y de las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento en combinación con agentes antiangiogénicos se contempla para el tratamiento, prevención y/o mejoria de la artritis reumatoide.
En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en la administración en combinación con un anticoagulante. Los anticoagulantes que pueden ser para usarse en la administración con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en la presente memoria incluyen, pero sin limitación, heparina, warfarina y aspirina. En un aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en la administración en
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combinación con heparina y/o warfarina. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en la administración en combinación con warfarina. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en la administración en combinación con warfarina y aspirina. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en la presente memoria son para usarse en la administración en combinación con heparina. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en la administración en combinación con heparina y aspirina.
En otra realización, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en Ia administración en combinación con un agente que suprima la producción de anticuerpos anticardiolipina. En aspectos específicos, los polinucleótidos que se describen en el presente documento son para usarse en la administración en combinación con un agente que bloquee y/o reduzca la capacidad de anticuerpos anti-cardiolipina para unirse a la proteína plasmática de unión a fosfolípidos beta 2-glicoproteína I (b2GPI).
En ciertos aspectos, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en la administración en combinación con agentes antirretrovirales, inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa inversa, inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa y/o inhibidores de proteasa. Los inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa inversa que pueden ser para usarse en la administración en combinación con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, RETROVIR™ (zidowdina/AZT/), VIDEX™ (didanosina/ddl) , HIVID™ (zalcitabina/ddC) , ZERIT™ (stawdina/d4T) , EPI-VIR™ (lamivudina/3TC) y COMBIVIR™ (zidovudina/lamivudina). Los inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa que pueden ser para usarse en la administración en combinación con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, VIRAMUNE™ (nevirapina), RESCRIPTOR™ (delavirdina) y SUSTIVA™ (efavirenz). Los inhibidores de proteasas que pueden ser para usarse en la administración en combinación con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, CRIXIVAN™ (indinavir), NORVIR™ (ritonavir), INVIRASE™ (saquinavir) y VIRACEPT™ (nelfinavir). En un aspecto específico, los agentes antirretrovirales, inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa inversa, inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa y/o inhibidores de proteasa pueden ser para usarse en cualquier combinación con un anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento para tratar, prevenir y/o diagnosticar el SIDA y/o para tratar, prevenir y/o diagnosticar una infección por VIH.
En otros aspectos, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento pueden ser para usarse en la administración en combinación con agentes anti-infecciones oportunistas. Los agentes anti-oportunistas que pueden ser para usarse en la administración en combinación con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE™, DAPSONE™, PENTAMIDINE™, ATOVAQUONE™, ISONIAZID™, RIFAMPIN™, PYRAZINAMIDE™, ETHAMBUTOL™, RIFABUTIN™, CLARITHROMYCIN™, AZITHROMYCIN™, GANCICLOVIR™, FOSCARNET™, CIDOFOVIR™, FLUCONAZOLE™, ITRACONAZOLE™, KETOCONAZOLE™, ACYCLOVIR™, FAMCICOLVIR™, PYRIMETHAMINE™, LEUCOVORIN™, NEUPOGEN™ (filgrastim/G-CSF) y LEUKINE™ (sargramostim/GM-CSF). En un aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se usan en cualquier combinación con TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE™, DAPSONE™, PENTAMIDINE™ y/o ATOVAQUONE™ para tratar profilácticamente, prevenir y/o diagnosticar una infección de neumonia oportunista por Pneumocystis carinii. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en cualquier combinación con ISONIAZID™, RIFAMPIN™, PYRAZINAMIDE™ y/o ETHAMBUTOL™ para tratar profilácticamente, prevenir y/o diagnosticar una infección oportunista por complejo de Mycobacterium avium. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en cualquier combinación con RIFABUTIN™, CLARITHROMYCIN™ y/o AZITHROMYCIN™ para tratar profilácticamente, prevenir y/o diagnosticar una infección oportunista por Mycobacterium tuberculosis. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en cualquier combinación con GANCICLOVIR™, FOSCARNET™ y/o CIDOFOVIR™ para tratar profilácticamente, prevenir y/o diagnosticar una infección oportunista por citomegalovirus. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en cualquier combinación con FLUCONAZOLE™, ITRACONAZOLE™ y/o KETOCONAZOLE™ para tratar profilácticamente, prevenir y/o diagnosticar una infección fúngica oportunista. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en cualquier combinación con ACYCLOVIR™ y/o FAMCICOLVIR™ para tratar profilácticamente, prevenir y/o diagnosticar una infección oportunista por virus herpes simple tipo I y/o tipo II. En otro aspecto específico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en la presente memoria son para usarse en cualquier combinación con PYRIMETHAMINE™ y/o LEUCOVORIN™ para tratar profilácticamente, prevenir y/o diagnosticar una infección oportunista por Toxoplasma gondii. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento son para usarse en cualquier combinación con LEUCOVORIN™ y/o NEUPOGEN™ para tratar profilácticamente, prevenir y/o diagnosticar una infección bacteriana oportunista.
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En un aspecto adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con un agente antiviral. Los agentes antivirales que pueden administrarse con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, aciclovir, ribavirina, amantadina y remantidina.
En un aspecto adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con un agente antibiótico. Los agentes antibióticos que pueden administrarse con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, amoxicilina, aminoglucósidos, beta-lactámicos (glucopéptidos), beta-lactamasas, clindamicina, cloranfenicol, cefalosporinas, ciprofloxacina, ciprofloxacina, eritromicina, fluoroquinolonas, macrólidos, metronidazol, penicilinas, quinolonas, rifampina, estreptomicina, sulfonamida, tetraciclinas, trimetoprim, trimetoprimsulfamtoxazol y vancomicina.
Los agentes inmunosupresores inespecificos convencionales que pueden administrarse en combinación con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, esteroides, ciclosporina, análogos de ciclosporina, ciclofosfamida, ciclofosfamida IV, metilprednisolona, prednisolona, azatioprina, FK-506, 15-desoxiespergualina y otros agentes inmunosupresores que actúan suprimiendo la función de células T respondedoras.
En aspectos específicos, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con inmunosupresores. Las preparaciones de inmunosupresores que pueden administrarse con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, ORTHOCLONE™ (0KT3), SANDIMMUNE™/NEORAL™/SANGDYA™ (ciclosporina), PROGRAF™ (tacrolimus), CELLCEPT™ (micofenolato), azatioprina, glucorticosteroides y RAPAMUNE™ (sirolimus). En un aspecto especifico, los inmunosupresores pueden ser para usarse en la prevención del rechazo de órganos o transplante de médula ósea.
En un aspecto preferido, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con terapia de esteroides. Los esteroides que pueden ser para usarse en la administración en combinación con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, corticosteroides orales, prednisona y metilprednisolona (por ejemplo, metilprednisolona IV) . En un aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con prednisona. En un aspecto especifico adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con prednisona y un agente inmunosupresor. Los agentes inmunosupresores que pueden ser para usarse en la administración con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento y prednisona son los descritos en el presente documento e incluyen, pero sin limitación, azatioprina, ciclofosfamida y ciclofosfamida IV. En otro aspecto especifico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se administran en combinación con metilprednisolona. En un aspecto especifico adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con metilprednisolona y un agente inmunosupresor. Los agentes inmunosupresores que pueden ser para usarse en la administración con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento y metilprednisolona son los descritos en el presente documento e incluyen, pero sin limitación, azatioprina, cilofosfamida y ciclofosfamida IV.
En un aspecto preferido, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con un antimalárico. Los antimaláricos que pueden ser para usarse en la administración con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, hidroxicloroquina, cloroquina y/o quinacrina.
En un aspecto preferido, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con un ΑΙΝΕ.
En un aspecto no excluyente, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con uno, dos, tres, cuatro, cinco, diez o más de los fármacos siguientes: NRD-101 (Hoechst Marion Roussel), diclofenaco (Dimethaid), oxaprozina potásica (Monsanto) , mecasermina (Chiron), T-614 (Toyama), pemetrexed disódico (Eli Lilly), atreleuton (Abbott), valdecoxib (Monsanto), eltenaco (Byk Gulden), campath, AGM-1470 (Takeda), CDP-571 (Celltech Chiroscience), CM-IOl (CarboMed), ML3000 (Merckle), CB-2431 (KS Biomedix), CBF-BS2 (KS Biomedix), terapia génica con IL-IRa (Valentis), JTE-522 (Japan Tobacco), paclitaxel (Angiotech), DW-166HC (Dong Wha), mesilato de darbufelona (Warner-Lambert), receptor de TNF soluble I (synergen; Amgen), IPR-6001 (Institute for Pharmaceutical Research), trocade (Hoffman-La Roche), EF-5 (Scotia Pharmaceuticals), BIIL-284 (BoehringerIngelheim), BIIF-1149 (Boe-hringer Ingelheim), LeukoVax (Inflammatics), MK-663 (Merck), ST-1482 (Sigma-Tau) y propionato de butixocort (WarnerLambert).
En un aspecto preferido, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con uno, dos, tres, cuatro, cinco o más de los fármacos siguientes: metotrexato, sulfasalazina, aurotiomalato sódico, auranofina, ciclosporina, penicilamina, azatioprina, un fármaco
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antimalárico (por ejemplo, que se describe en el presente documento), ciclofosfamida, clorambucilo, oro, ENBREL™ (Etanercept), anticuerpo anti-TNF, LJP 394 (La Jolla Pharmaceutical Company, San Diego, California) y prednisolona.
En un aspecto más preferido, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en Ia presente memoria se van a administrar en combinación con un antimalárico, metotrexato, anticuerpo anti-TNF, ENBREL™ y/o sulfasalazina. En un aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en Ia presente memoria se van a administrar en combinación con metotrexato. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en Ia presente memoria se van a administrar en combinación con un anticuerpo anti-TNF. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en Ia presente memoria se van a administrar en combinación con metotrexato y anticuerpo anti-TNF. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con suitasalazina. En otro aspecto específico, ei anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con metotrexato, anticuerpo anti-TNF y sulfasalazina. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con ENBREL™. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con ENBREL™ y metotrexato. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con ENBREL™, metotrexato y sulfasalazina. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con ENBREL™, metotrexato y sulfasalazina. En otro aspecto, uno o más antimaláricos se combinan con una de las combinaciones enumeradas anteriormente. En un aspecto específico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con un antimalárico (por ejemplo, hidroxicloroquina), ENBREL™, metotrexato y sulfasalazina. En otro aspecto específico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con un antimalárico (por ejemplo, hidroxicloroquina), sulfasalazina, anticuerpo anti-TNF y metotrexato.
En un aspecto adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en solitário o en combinación con una o más preparaciones de inmunoglobulina intravenosa. Las preparaciones de inmunoglobulina intravenosa que pueden ser para usarse en la administración con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, GAMMAR™, IVEEGAM™, SANDOGLOBULIN™, GAMMAGARD S/ID™ y GAMIMUNE™. En un aspecto específico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con preparaciones de inmunoglobulina intravenosa en una terapia de trasplante (por ejemplo, trasplante de médula ósea).
El ligando de CD40 (CD40L), una forma soluble de CD40L (por ejemplo, AVREND™), o fragmentos biológicamente activos, variantes o derivados de CD40L, anticuerpos anti-CD40L (por ejemplo, anticuerpos agonistas o antagonistas) y/o anticuerpos anti-CD40 (por ejemplo, anticuerpos agonistas o antagonistas) .
En un aspecto adicional, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en solitário o en combinación con un agente antiinflamatorio. Los agentes antiinflamatorios que pueden administrarse con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, glucocorticoides y los antiinflamatorios no esteroideos, derivados del ácido aminoarilcarboxilico, derivados del ácido arilacético, derivados del ácido arilbutirico, ácidos arilcarboxílicos, derivados del ácido arilpropiónico, pirazoles, pirazolonas, derivados del ácido salicilico, tiazinocarboxamidas, ácido e-acetamidocaproico, S-adenosilmetionina, ácido 3-amino-4-hidroxibutírico, amixetrina, bendazaco, bencidamina, bucolome, difenpiramida, ditazol, emorfazona, guaiazuleno, nabumetona, nimesulida, orgoteina, oxaceprol, paranilina, perisoxal, pifoxime, proquazona, proxazol y tenidap.
En otro aspecto, las composiciones que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con un agente quimioterápico. Los agentes quimioterápicos que pueden ser para usarse en la administración con el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitación, derivados de antibióticos (por ejemplo, doxorubicina, bleomicina, daunorubicina y dactinomicina); antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifeno); antimetabolitos (por ejemplo, fluorouracilo, 5-FU, metotrexato, floxuridina, interferon alfa-2b, ácido glutámico, plicamicina, mercaptopurina y 6-tioguanina); agentes citotóxicos (por ejemplo, carmustina, BCNU, lomustina, CCNU, arabinósido de citosina, ciclofosfamida, estramustina, hidroxiurea, procarbazina, mitomicina, busulfán, cisplatino y sulfato de vincristina); hormonas (por ejemplo, medroxiprogesterona, fosfato sódico de estramustina, etinil estradiol, estradiol, acetato de megestrol, metiltestosterona, difosfato de dietilestilbestrol, clorotrianiseno y testolactona); derivados de mostaza nitrogenada (por ejemplo, mefaleno, clorambucilo, mecloretamina (mostaza nitrogenada) y tiotepa); esteroides y combinaciones (por ejemplo, fosfato sódico de betametasona) ; y otros (por ejemplo, dicarbazina, asparaginasa, mitotano, sulfato de vincristina, sulfato de vinblastina y etopósido).
En un aspecto específico, el anticuerpo y las composiciones de anticuerpo que se describen en el presente documento se van a administrar en combinación con CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisona) o cualquier combinación de los componentes de CHOP. En otro aspecto, el anticuerpo y las composiciones de
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a un anticuerpo específico, los componentes del suero no unidos se eliminan por lavado, se anade anticuerpo antihumano marcado con indicador, se elimina el anticuerpo anti-humano no unido por lavado y se hace reaccionar un reactivo con anticuerpo anti-humano marcado con indicador para unir el indicador al reactivo en proporción a la cantidad de anticuerpo anti-BLyS unido en el soporte sólido. Tipicamente, el indicador es una enzima que se detecta por incubación de la fase sólida en presencia de un sustrato fluorométrico, luminiscente o colorimétrico adecuado.
El reactivo de superficie sólida en el ensayo anterior se prepara por técnicas conocidas para unir un material proteico a un material de soporte sólido, tal como perlas poliméricas, varillas, placas de 96 pocillos o material de filtro. Estos procedimientos de unión incluyen generalmente la adsorción inespecífica de la proteína al soporte o la unión covalente de la proteína, tipicamente a través de un grupo amino libre, a un grupo quimicamente reactivo en el soporte sólido, tal como un grupo carboxilo, hidroxilo o aldehído activado. Alternativamente, las placas revestidas con estreptavidina pueden usarse junto con un antígeno o antígenos biotinilados.
Por lo tanto, la memoria descriptiva describe un sistema de ensayo o kit para llevar a cabo este procedimiento de diagnóstico. El kit generalmente incluye un soporte con BLyS recombinante unido a superficie y un anticuerpo antihumano marcado con indicador para detectar el anticuerpo anti-BLyS unido a superficie.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un Fv de cadena sencilla (scFv) que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: la 2128.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un Fv de cadena sencilla (scFv) que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 46, 321 a 329, 1563 a 1595 y 1881 a 1908.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un Fv de cadena sencilla (scFv) que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1563 a 1880.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un Fv de cadena sencilla (scFv) que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1881 a 2128.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un Fv de cadena sencilla (scFv) que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: la 1562.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se unen inmunoespecíficamente a BLyS.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 46, 321 a 329, 1563 a 1595 y 1881 a 1908.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1881 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a la forma unida a membrana de BLyS.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1563 a 1880, y en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a la forma soluble de BLyS.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a BLyS.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 46, 321 a 329, 1563 a 1595 y 1881 a 1908.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: : 1881 a 2128, y en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a la forma unida de membrana de BLyS.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1563 a 1880, y en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a la forma soluble de BLyS.
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En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a BLyS y que también comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a BLyS y, que también comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, y en la que dicho dominio VL y dicho dominio VH proceden del mismo scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO:: 1 a 2128.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 2129 a 3227, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a BLyS.
En aspectos específicos, el anticuerpo o fragmento del mismo que se describe en el presente documento es una molécula de inmunoglobulina completa.
En aspectos específicos, el anticuerpo o fragmento del mismo que se describe en el presente documento es un fragmento Fab.
En aspectos específicos, el anticuerpo o fragmento del mismo que se describe en el presente documento es un fragmento Fv.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe una proteína quimérica que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de la presente invención unido covalentemente a un polipéptido heterólogo.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe una composición que comprende dos o más tipos de anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, uniéndose cada uno de dichos tipos inmunoespecíficamente a BLyS, y comprendiendo cada uno de dichos tipos de anticuerpo o fragmento del mismo un dominio VH de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128 .
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe una composición que comprende dos o más tipos de anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, uniéndose cada uno de dichos tipos inmunoespecíficamente a BLyS y comprendiendo cada uno de dichos tipos de anticuerpo o fragmento del mismo un dominio VL de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128 .
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe una composición que comprende dos o más tipos de anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, uniéndose cada uno de dichos tipos inmunoespecíficamente a BLyS y comprendiendo cada uno de dichos tipos de anticuerpo o fragmento del mismo un dominio VL de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, y en la que cada tipo de anticuerpo o fragmento del mismo comprende además un dominio VH de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: la 2128.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe una composición que comprende dos o más tipos de anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, uniéndose cada uno de dichos tipos inmunoespecíficamente a BLyS y comprendiendo cada uno de dichos tipos de anticuerpo o fragmento del mismo una CDR3 de VH que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 3129 a 3227.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un panei de dos o más tipos de anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, uniéndose cada uno de dichos tipos inmunoespecíficamente a BLyS, y comprendiendo cada uno de dichos tipos de anticuerpo o fragmento del mismo un domino VH de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: la 2128.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un panei de dos o más tipos de anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, uniéndose cada uno de dichos tipos inmunoespecíficamente a BLyS, y comprendiendo cada uno de dichos tipos de anticuerpo o fragmento del mismo un domino VL de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: la 2128.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un panei de dos o más tipos de anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, uniéndose cada uno de dichos tipos inmunoespecíficamente a BLyS, y comprendiendo cada uno de dichos tipos de anticuerpo o fragmento del mismo un domino VL de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, y en la que cada tipo de anticuerpo o fragmento comprende además un dominio VH de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128.
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En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe un panei de dos o más anticuerpos o fragmentos
o variantes de los mismos, uniéndose cada uno de dichos tipos inmunoespecíficamente a BLyS y comprendiendo cada uno de dichos tipos de anticuerpo o fragmento del mismo una CDR3 de VH de un scFv diferente que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 2129 a 3227.
En aspectos específicos, los anticuerpos o fragmentos de los mismos del panei de anticuerpos que se describe en el presente documento están cada uno en un pocillo de una placa de 96 pocillos.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a BLyS.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos qu e codifica un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: la 46, 321 a 329, 1563 a 1595 y 1881 a 1908, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a BLyS.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1881 a 1908, en la que el anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a la forma unida a membrana de BLyS.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos qu e codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: : 1563 a 1569, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a la forma soluble de BLyS. La presente memoria descriptiva también describe vectores que comprenden la molécula de ácido nucleico aislada descrita anteriormente, incluyendo vectores que comprenden una secuencia de nucleótidos que regula la expresión del anticuerpo o fragmento del mismo codificado por la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente. Además, la presente memoria descriptiva también describe células hospedadoras, incluyendo células hospedadoras de mamífero, que comprenden la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente que está unida operativamente a un promotor heterólogo, así como células hospedadoras, incluyendo células hospedadoras de mamífero, que comprenden los vectores descritos anteriormente. Además, la presente memoria descriptiva también describe un procedimiento para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende cultivar las células hospedadoras descritas anteriormente en condiciones en las que se exprese la molécula de ácido nucleico.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a BLyS. La presente memoria descriptiva también describe vectores que comprenden la molécula de ácido nucleico aislada descrita anteriormente, incluyendo vectores que comprenden una secuencia de nucleótidos que regula la expresión del anticuerpo o fragmento del mismo codificado por la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente. Además, la presente memoria descriptiva también describe células hospedadoras, incluyendo células hospedadoras de mamífero, que comprenden la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente que está unida operativamente a un promotor heterólogo, así como células hospedadoras, incluyendo células hospedadoras de mamífero, que comprenden los vectores descritos anteriormente. Además, la presente memoria descriptiva también describe un procedimiento para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende cultivar las células hospedadoras descritas anteriormente en condiciones en las que se exprese la molécula de ácido nucleico.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1 a 46, 321 a 329, 1563 a 1595 y 1881 a 1908, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a BLyS. La presente memoria descriptiva también describe vectores que comprenden la molécula de ácido nucleico aislada descrita anteriormente, incluyendo vectores que comprenden una secuencia de nucleótidos que regula la expresión del anticuerpo o fragmento del mismo codificado por la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente. Además, la presente memoria descriptiva también describe células hospedadoras, incluyendo células hospedadoras de mamífero, que comprenden la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente que está unida operativamente a un promotor heterólogo, así como células hospedadoras, incluyendo células hospedadoras de mamífero, que comprenden los vectores descritos anteriormente. Además, la presente memoria descriptiva también describe un procedimiento para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende cultivar las células hospedadoras descritas anteriormente en condiciones en las que se exprese la molécula de ácido nucleico.
En aspectos específicos, la presente memoria descriptiva describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un
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administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo marcado o fragmento del mismo que se une inmunoespecíficamente a BLyS; esperar durante un intervalo de tiempo después de la administradora para permitir que el anticuerpo marcado o fragmento dei mismo se concentre preferentemente en sítios en el sujeto en los que se exprese BLyS; determinar el nivel de fondo; y detectar el anticuerpo marcado o fragmento del mismo en el sujeto, de modo que la detección de anticuerpo marcado o fragmento del mismo por encima del nivel de fondo indica que el sujeto tiene una enfermedad o trastorno particular asociado con una expresión aberrante de BLyS.
En aspectos específicos, el anticuerpo o fragmento del mismo utilizado en los dos procedimientos descritos inmediatamente antes comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: la 2128.
En aspectos específicos, el anticuerpo o fragmento del mismo utilizado en los dos procedimientos descritos inmediatamente antes comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: la 2128.
En aspectos específicos, el anticuerpo o fragmento del mismo utilizado en los dos procedimientos descritos inmediatamente antes comprende una CDR3 de VH que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 2129 a 3227.
En aspectos específicos, el anticuerpo o fragmento del mismo utilizado en los dos procedimientos descritos inmediatamente antes se conjuga con un agente de diagnóstico.
En aspectos específicos, el anticuerpo o fragmento del mismo utilizado en los dos procedimientos descritos inmediatamente antes se conjuga con un agente de diagnóstico en el que el agente de diagnóstico es peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa.
En aspectos específicos, el anticuerpo o fragmento del mismo utilizado en los dos procedimientos descritos inmediatamente antes se conjuga con un agente de diagnóstico en el que el agente de diagnóstico es fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina.
En aspectos específicos, el anticuerpo o fragmento del mismo utilizado en los dos procedimientos descritos inmediatamente antes se conjuga con un agente de diagnóstico, en el que el agente de diagnóstico es 125I, 131I, 111In,90Y o "Tc.
En aspectos específicos, el anticuerpo o fragmento del mismo utilizado en los dos procedimientos descritos inmediatamente antes se conjuga con un agente de diagnóstico, en el que el agente de diagnóstico es Iuciferasa, luciferina o aequorina. La presente memoria descriptiva también describe lo siguiente:
Una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: la 2128, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a BLyS y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: la 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a BLyS y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: la 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a BLyS, y que también comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: la 2128 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 2129 a 3227, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a BLyS y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende un dominio VL de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: la 2128, en la que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une inmunoespecíficamente a BLyS, y que también comprende un dominio VH de un scFv que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: : 1 a 2128 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad o trastorno para su uso en un procedimiento de tratamiento, prevención o mejoría de una enfermedad o trastorno asociado con una expresión o actividad aberrante de BLyS, siendo dicha composición para administrarse a un animal que lo necesite. Este procedimiento puede usarse para tratar un trastorno infeccioso, cáncer y/o enfermedad autoinmune tal como lupus 0 nefritis glomerular.
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BLyS marcado con histidina revestido en una placa de ensayo de plástico; el "BLyS biotinilado" es una forma soluble de BLyS excepto cuando se usa para revestir una placa de ELISA, en cuyo caso seria "BLyS inmovilizado". Las formas unidas a membrana de BLyS incluyen, pero sin limitación, membranas plasmáticas de U937 y P388.
Ejemplo 1: Los Anticuerpos se Unen Inmunoespecíficamente a BLyS Soluble y Unido a Membrana
Se exploró una biblioteca de fago en un ensayo para identificar aquellos fagos que presentan scFv que se unen inmunoespecíficamente a las formas soluble y unida a membrana de BLyS. Los fagos que presentan scFv que se unen a BLyS inmovilizado se identif icaron después de selección sobre BLyS inmovilizado y evaluación mediante ELISA para determinar su unión a BLyS inmovilizado. El BLyS que se inmovilizó en placas para estos ensayos se purifico a partir de sobrenadantes de células Sf9 infectadas con una construcción de expresión de baculovirus que se describe en Moore y col., Science 285: 260-263. Cada uno de los scFv identificados se secuenció después. Se aislaron ciertas secuencias múltiples veces, de modo que se generó un panei (panel 1) que contenia un miembro de cada secuencia única, y se caracterizaron adicionalmente para determinar su capacidad para unirse inmunoespecíficamente a las formas soluble y unida a membrana de BLyS.
Las secuencias de aminoácidos derivadas de estos scFv se muestran en la Tabla 1 anterior. Los segmentos Vh y Vl individuales de los scFv se alinearon con las secuencias de linea germinal humana conocidas en V-BASE (Tomlinson y col, www.mrc-cpe.cam.ac.uk) y se identificó la linea germinal más próxima.
Ejemplo 2: Especificidad de scFv por BLyS y BLyS Unido a Membrana
La especificidad de cada uno de los scFv tanto por BLyS como por BLyS unido a membrana se determino mediante ELISA de fago. El BLyS se inmovilizó sobre plástico como una forma soluble purificada de la proteína o como una forma unida a membrana presente en preparaciones de membrana plasmática de la linea celular tipo macrófago humano U937.
Mantenimiento de Células U937
Las células U937 son una linea celular de linfoma histiocítico tipo monocito humano que se sabe que expresa BLyS en sus membranas plasmáticas. Se mantuvieron en RPMI-1640 complementado con L-glutamina 4 mM, FCS 10 %, penicilina 10 U, estreptomicina 100 g/ml (todos los reactivos de Sigma). Después las células se Ies congelaron a partir de reservas congeladas y se usaron para la preparación de membrana plasmática o se dividieron 1:5, después de 2 dias en cultivo cuando la densidad celular alcanza I x IOfVml.
Preparación de Membranas Plasmáticas de U937
Para preparar membranas plasmáticas, se recogieron I x 10 células U937 a partir de su medio de cultivo por centrifugación a 1000 rpm a 4 °C durante 5 minutos en una centrífuga de sobremesa. Las células se resuspendieron en 40 ml de Tris 12 mM, pH 7,5, sacarosa 250 mM y se pusieron en hielo. Después, las células se lisaron usando un homogeneizador eléctrico manual (Labortechnik IKA Ultra-Turrax) durante cuatro ráfagas de un minuto. Para comprobar que se había producido la lisis celular, se anadieron 10 μl de lisado celular a 10 μl de azul Tripán y el lisado celular se examino bajo un microscopio. Después de confirmar la lisis, el homogeneizado se centrífugo a 270 x g durante 10 minutos a 4°C para sedimentar la fracción nuclear y se conservo el sobrenadante. El sobrenadante se centrífugo a 8000 x g, 10 min, 4°C para sedimentar las fracciones mitocondrial y lisosómica y se conservo el sobrenadante. Después, el sobrenadante se centrífugo a 100000 X g 60 min, 4°C para sedimentar la fracción enriquecida en membrana plasmática. El sobrenadante se desechó y el sedimento de membrana plasmática se resuspendió en 1 ml de PBS y se almacenó a -70°C. La concentración de proteína de la fracción de membrana plasmática se determino usando un kit de cuantificación de proteína (Biorad). Los rendimientos típicos estaban entre 5 y 10 mg de membranas plasmáticas.
ELISA de fago
Para determinar la especificidad de cada uno de los scFv únicos, se realizo un ELISA de fago para cada scFv frente a BLyS humano, membranas plasmáticas de U937, TNFa (R&D Systems, Minneapolis, MN), BSA y pocillo no revestido. Se inocularon colonias de E. coli individuales que contenían un fagémido que representaba uno de los scFv únicos del panel 1 en placas de 96 pocillos que contenían 100 μl de medio 2TYAG por pocillo. Las placas se incubaron a 37°C durante 4 horas en agitación. Se anadió el fago auxiliar M13K07 a cada pocillo a una MOI de 10 y las placas se incubaron durante 1 hora adicional a 37 °C. Las placas se centrifugaron en una centrífuga de sobremesa a 2000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se retiró y los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 μl de 2TYAK y se incubaron a 30°C durante una noche en agitación. Al dia siguiente, las placas se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 min y los 100 μl del sobrenadante que contenia fago de cada pocillo se transfirieron cuidadosamente a una placa de 96 pocillos recién preparada. Se anadieron veinte μl de MPBS 6x a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora para prebloquear el fago antes del ELISA.
Se revistieron placas flexibles de 96 pocillos (Falcon) durante una noche a 4°C con BLyS humano (1 μρ/πιΐ) en PBS, membranas plasmáticas de U937 (10 μg/ml) en PBS, TNFa (1 μg/ml) en PBS, BSA (1 μg/ml) en PBS o PBS. Después del revestimiento, las soluciones se eliminaron de los pocillos y las placas se bloquearon durante 1 hora a
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placas de microtitulación (Bio-Rad 3550).
Los resultados para 3 clones, I079B04, I079F08 y I080B01, y un anticuerpo de fago de control que reconoce TNFa se muestran en la Figura 13. Los 3 scFv reconocen membranas plasmáticas de U937 (U937). Se competia con esta unión hasta los niveles de fondo (es decir, comparable a la senal observada con el anticuerpo de fago anti-TNFa) en presencia de BLyS marcado con His (HIS-BLyS) pero no BLyS biotinilado (bio-BLyS). Esto confirma que los scFv reconocen específicamente la forma unida a membrana pero no la forma soluble de BLyS .
Ejemplo 17: Exploración de BIAcore de alto rendimiento para identificar scFv de alta afinidad
Esta es una exploración de 96 pocillos en la que las muestras de ensayo (scFv) proceden de 1 ml de extractos periplásmicos de clones que expresan anticuerpos individuales. Después, los scFv potencialmente de mayor afinidad se identifican principalmente como aquellos que proporcionan un gran número de UR totales unidas a una superficie de HIS-BLyS en BIAcore. Este procedimiento de clasificación asume rendimientos aproximadamente equivalentes de scFv a partir de caracterización. Puesto que éste no siempre es el caso, también pueden identificarse algunos scFv que simplemente expresen mayores niveles de scFv. Estos pueden discriminarse de los de mayor afinidad mediante una caracterización adicional de los scFv (véase el Ejemplo 18).
Preparación de ScFv a partir de Cultivos de E. coli de 1 ml
Se inocularon colonias de E. coli individuales que contenían un fagémido que representaba uno de los scFv únicos del panel 3 en placas de 96 pocillos que contenían 100 μl de medio 2TYAG por pocillo. Se reservaron ocho pocillos en cada placa para muestras de control positivo y negativo. La placa se cultivo durante una noche a 30°C con agitación a 120 rpm.
Al dia siguiente, se anadió 1 ml de 2TYAG + sacarosa 345 mM a cada pocillo de una placa de 96 pocillos profundos autoclavada (Beckman). Se resuspendieron veinte μl de cada cultivo de una noche y se transfirieron al pocillo apropiado de la placa de pocillos profundos. La placa se cultivo durante aproximadamente 3,5 horas a 30°C con agitación a 250 rpm (o hasta la D06oo = 0,6). Se anadieron 50 μl de IPTG I M a 5 ml de 2TY y se anadió 10 μl de esto a cada pocillo. La placa se cultivo durante una noche a 30°C con agitación a 250 rpm.
Las placas se mantuvieron a 4 °C durante el resto del procedimiento. La placa de una noche (anterior) se centrífugo a 3500 rpm durante 10 minutos a 4°C para sedimentar las células. El sobrenadante se decanto y cada sedimento se resuspendió en 100 μl de TES (Tris HCI 0,2 M pH 8,0, EDTA 0,5 mM, sacarosa 0,5 M) y se transfirió a una placa de 96 pocillos recién preparada. Esta placa se incubo en hielo durante 30 minutos y después se centrífugo durante 10 minutos a 3500 rpm a 4°C para sedimentar el resíduo celular. Durante la centrifugación, se anadieron 15 μl de cóctel de inhibidores de proteasas recién preparado (Roche, 1 comprimido disuelto en 1,5 ml de agua) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos recién preparada. Los sobrenadantes de la placa centrifugada se transfirieron después a la placa que contenía los inhibidores de proteasas. La placa se centrifugó a 3500 rpm durante 10 minutos a 4 °C y el sobrenadante se transfirió a una placa de 96 pocillos adicional. Esta etapa se repitió al menos una vez más o hasta que no había indícios de resíduos celulares después de la centrifugación. Por último, la placa se cubrió con papel de alumínio para evitar la evaporación de las muestras durante el procesamiento en BIAcore.
Generación de una superficie de HIS-BLyS de alta densidad
Todos los análisis de Biacore se realizaron en máquinas Biacore 2000 usando el software de control Biacore 2000 y se evaluaron usando el software BIAevaluation 3.0. Se preparo una superficie de BLyS marcado con His de alta densidad (>1000 UR de HIS-BLyS acoplado) en una celda de flujo 2 por acoplamiento con amina a una microplaca CM5. Se insertó una nueva microplaca CM5 en el BIAcore y se inició un sensograma sobre la celda de flu jo 2 con tampon HBS a un caudal de 5 μl/min. La solución de NHS y EDC se mezcló 1:1 antes de inyectar 30 μl sobre la superficie de CM5. Se inyectaron cincuenta μl de HIS-BLyS (a 10 μρ/πιΐ en tampón acetato sódico, pH 4) y se dejó que se acoplaran a la superficie. Después se inyectaron treinta μl de solución de etanolamina-HCl para bloquear los ésteres de NHS libres. Antes de usar la microplaca, se inyectaron 10 μl de clorhidrato de guanidina 4 M en HBS sobre la superficie para separar el BLyS no unido covalentemente de la superficie. También se preparo una superficie en bianco (sin HIS-BLyS) sobre la celda de flujo 1 de modo que pueden restarse los efectos de la unión inespecífica de las curvas de unión a HIS-BLyS.
Tipicamente, se generó de esta forma una superficie de BLyS marcado con His de 5000 UR y se usó para un análisis de 96 pocillos de scFv aislados del periplasma de E. coli.
Análisis de BIAcore
La placa de 96 pocillos que contenía scFv periplásmicos se fijó en el interior del BIAcore. Se pusieron 2 ml de clorhidrato de guanidina 4 M en HBS en una gradilla en el interior del BIAcore para la regeneración de la superficie de HIS-BLyS entre muestras. El sensograma se procesó sobre las celdas de flujo 1 y 2 a un caudal de 20 μl/minuto. Se procesó el procedimiento siguiente:
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