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ES2576652T3 - PTHrP, sus isoformas y antagonistas de la misma en el diagnóstico y tratamiento de una enfermedad - Google Patents

PTHrP, sus isoformas y antagonistas de la misma en el diagnóstico y tratamiento de una enfermedad Download PDF

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ES2576652T3
ES2576652T3 ES08783388.5T ES08783388T ES2576652T3 ES 2576652 T3 ES2576652 T3 ES 2576652T3 ES 08783388 T ES08783388 T ES 08783388T ES 2576652 T3 ES2576652 T3 ES 2576652T3
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Abstract

Un anticuerpo aislado capaz de unirse a un epítopo de una porción C-terminal de una isoforma PTHrP1-173, la porción C-terminal consistiendo en los residuos aminoacídicos 151 a 169.

Description

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para afectar a la hibridación (véase, por ejemplo, Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization [1985] and Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY [1989], que se incorpora en la presente memoria por referencia).
5 [0043] 0074 El término “fragmento” como se usa en la presente memoria en referencia a secuencias de aminoácidos de cadena única se refiere a un polipéptido que puede tener una porción amino (N) terminal y/o una porción carboxi (C) terminal eliminadas en comparación con la proteína nativa, pero en la que la secuencia de aminoácidos restante del fragmento es idéntica a la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa. Se entenderá por un experto en la técnica relevante que el término “fragmento” también puede referirse a una porción de una molécula de proteína de cadena múltiple (por ejemplo, fragmento de anticuerpo)
[0044] 0075 La expresión “de origen natural” o “nativo” en la presente memoria tal como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o secuencia de polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la
15 naturaleza y que no ha sido modificada es de origen natural.
[0045] 0076 En la presente memoria, el término “cebador” se refiere a un oligonucleótido, independientemente de si se produce de forma natural como en una digestión por restricción purificada o si se produce sintéticamente, que es capaz de actuar como un punto de iniciación de la síntesis cuando se coloca en condiciones en las que se induce (es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados) la síntesis de un producto de extensión cebador que es complementario con una cadena de ácido nucleico. El cebador es preferiblemente de cadena sencilla para una máxima eficiencia en la amplificación, pero puede ser como alternativa de doble cadena. Si es bicatenario, el cebador se trata primero para separar sus cadenas antes de ser utilizado para preparar los productos de extensión. Preferiblemente, el cebador es un
25 oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de extensión en la presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores pueden depender de muchos factores, incluyendo la temperatura, la fuente del cebador y el uso del método. En una reacción de amplificación, el cebador que ceba en el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos se denomina cebador directo, mientras que el cebador que ceba desde el extremo 3' se denomina generalmente cebador inverso.
[0046] 0077 En la presente memoria, el término “sonda” se puede referir a un oligonucleótido (es decir, una secuencia de nucleótidos), ya sea de origen natural como en una digestión por restricción purificada o producido sintéticamente, de forma recombinante o mediante amplificación por PCR, que es capaz de hibridar con otro oligonucleótido de interés. Una sonda puede ser de cadena sencilla o de doble cadena. Las sondas son útiles en la
35 detección, identificación y aislamiento de secuencias de genes particulares. También puede ser entendido por un experto en la técnica relevante que una “sonda” utilizada en la presente invención también puede ser una molécula de proteína (por ejemplo, anticuerpo). Puede entenderse, además, que la sonda se puede marcar con cualquier “molécula informadora”, de modo que sea detectable en cualquier sistema de detección, incluyendo, pero sin limitarse a, la enzima (por ejemplo, ELISA, así como ensayos histoquímicos basados en enzimas), fluorescentes, radiactivos y luminiscentes. No se pretende que la presente invención esté limitada a ningún sistema de detección o etiqueta particular. El término “etiquetado” como se usa en la presente memoria (por ejemplo, cuando una molécula ha sido “etiquetados”) también puede ser entendida por un experto en la técnica relevante como que está vinculada a una molécula informadora.
45 [0047] 0078 En la presente memoria, el término “diana” se refiere a una estructura, tal como, por ejemplo, un ácido nucleico o molécula de proteína, para ser identificada, detectada, caracterizada o amplificada. Por lo tanto, se busca que la “diana” se seleccione de otras estructuras.
[0048] 0079 En la presente memoria, la expresión “reacción en cadena de la polimerasa” (“PCR”) se refiere al método descrito por primera vez en los documentos US-4.683.195, US-4.683.202 y US-4.965.188 que describen un método para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. Este proceso para amplificar la secuencia diana consiste en introducir un gran exceso de dos cebadores oligonucleótidos a la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada, seguido de una secuencia precisa de ciclos térmicos en la presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores son 55 complementarios a sus respectivas cadenas de la secuencia diana de doble cadena. Para efectuar la amplificación, la mezcla se desnaturaliza y los cebadores a continuación se hibridan con sus secuencias complementarias dentro de la molécula diana. Tras la hibridación, los cebadores se extienden con una polimerasa a fin de formar un nuevo par de cadenas complementarias. Las etapas de desnaturalización, hibridación del cebador y extensión con polimerasa pueden repetirse muchas veces (es decir, la desnaturalización, la hibridación y la extensión constituyen un “ciclo”, no puede haber numerosos “ciclos”) para obtener una alta concentración de un segmento amplificado de la secuencia diana deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada se determina por las posiciones relativas de los cebadores entre sí y, por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto repetitivo del proceso, el método se conoce como la “reacción en cadena de la polimerasa” (en lo sucesivo “PCR”). Debido a que los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se convierten en las 65 secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que son “amplificados por PCR”. La
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informadora, aumento en la concentración de iones, acumulación de un producto químico detectable (por ejemplo, anticuerpo)).
[0070] 00101 En la presente memoria, el término “antagonista” se refiere a o describe una molécula que es capaz
5 de, directa o indirectamente, contrarrestar, reducir o inhibir sustancialmente la actividad biológica o la activación de la PTHrP o de sus isoformas. Además de los anticuerpos monoclonales, el antagonista puede incluir péptidos de una secuencia parcial de la PTHrP o una de sus isoformas, preferiblemente la PTHrP1-173 y, en particular, un antagonista competitivo de la PTHrP1-173 y su receptor. Además, el antagonista de la PTHrP puede ser un compuesto no peptídico que disminuye la actividad de la PTHrP. El antagonista de la PTHrP también puede ser un
10 compuesto que inhibe la señalización de la PTHrP o la señalización de una de sus isoformas. El antagonista de la PTHrP también puede ser un compuesto que inhibe el receptor de la PTHrP específico de PTHrP1-173. El antagonista de la PTHrP también puede ser un compuesto que reduce la expresión de la PTHrP1-173 o de su receptor. Una persona experta en la técnica relevante puede entender que un compuesto de este tipo puede incluir, por ejemplo, una molécula que podría unirse al ARNm de la PTHrP diana o al gen o receptor de la PTHrP. Por
15 ejemplo, tales compuestos pueden incluir ARNsi o un oligonucleótido antisentido o un compuesto específico o factor de inhibición del ARNm de la PTHrP1-173. Por ejemplo, se sabe que la PTH7-34 o la PTHrP7-34 han sido utilizados como antagonistas de péptidos pequeños para bloquear la acción de la PTH o la PTHrP. Los péptidos derivados de la PTHrP1-173 se pueden utilizar como un antagonista de la PTHrP1-173 y/o de su receptor. La expresión “antagonista de la PTHrP” puede ser entendida en su sentido más amplio e incluye cualquier compuesto que
20 disminuye los efectos biológicos de la PTHrP o de una de sus isoformas. Además de los anticuerpos monoclonales de la presente invención, el antagonista puede incluir péptidos de una secuencia parcial de la PTHrP y, en particular, un antagonista competitivo de la PTHrP1-173. Además, el antagonista de la PTHrP puede ser un compuesto no peptídico que disminuye la actividad de la PTHrP. Tales compuestos pueden ser un ARNsi o un oligonucleótido antisentido o un factor específico que inhibe el ARNm de la PTHrP1-173 o su receptor.
25 [0071] 00102 En la presente memoria, el término “anticuerpo” o “Ac” se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales individuales anti-PTHrP (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y de neutralización o bloqueo) y composiciones de anticuerpos anti-PTHrP con especificidad poliepitópica. “Anticuerpo” como se usa en la presente memoria incluye moléculas de inmunoglobulina o anticuerpo intactas,
30 anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (es decir, anticuerpos biespecíficos formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos) y fragmentos de inmunoglobulina o anticuerpo (tales como Fab, F(ab')2 o Fv), siempre que presenten cualquiera de las propiedades agonistas o antagonistas deseadas descritas en la presente memoria. Se pueden usar diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos contra un antígeno específico, o contra derivados, fragmentos, análogos,
35 homólogos u ortólogos de los mismos. Aunque la invención se ha demostrado utilizando Acm de ratón como realizaciones preferidas, la invención no es tan limitada. Tales Acm están dentro del alcance de esta invención. Una persona experta en la técnica relevante entenderá que los anticuerpos de la presente invención también incluyen anticuerpos quiméricos, híbridos, “humanizados” o completamente humanos, siempre que presenten la actividad o propiedades biológicas deseadas. Los Acm humanizados o completamente humanos, ya sea utilizando hibridomas
40 humanos o “anticuerpos diméricos” u otro método adecuado puede ser un método preferible para el uso terapéutico humano. Se entenderá por un experto en la técnica relevante que existen técnicas conocidas para la creación de anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos. Como la mayoría de los Acm disponibles son de origen no humano, son naturalmente antigénicos en humanos y, por lo tanto, pueden dar lugar a una respuesta inmunitaria indeseable. Se entenderá por un experto en la técnica relevante que las técnicas para disminuir cualquier
45 respuesta inmunitaria no deseable se denomina genéricamente “humanización”.
[0072] 00103 Los anticuerpos son generalmente proteínas o polipéptidos que exhiben especificidad de unión a un antígeno específico. Los anticuerpos nativos son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Generalmente, cada cadena ligera está unida a 50 una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, aunque el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera también tiene regularmente espaciados puentes disulfuro. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio 55 constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y de la cadena pesada. Las cadenas ligeras de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, basado en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante
60 de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de éstas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-1, IgG-2, IgG-3 e IgG-4; IgA-1 e IgA-2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, epsilon, gamma y mu, respectivamente.
65
12
[0073] 00104 Los anticuerpos, en particular de la subclase IgM, pueden inhibir el crecimiento tumoral indirectamente por mediación de la citotoxicidad a través de una función de focalización: estos Acm pertenecen a una subclase o isotipo que cuando se unen formando un complejo con el receptor activa el complemento del suero y/o median en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Tales anticuerpos pueden ser usados
5 para inducir la lisis mediante el complemento natural y para interactuar con ADCC sobre células normalmente presentes. La capacidad de los anticuerpos para mediar la lisis de las células tumorales de un paciente se puede probar in vitro mediante la adición del anticuerpo a las células tumorales del paciente cultivadas in vitro. A continuación, el suero del propio paciente se puede utilizar como fuente de complemento para ensayar la citolisis de las células tumorales in vitro. Esos anticuerpos, incluyendo anticuerpos de la presente invención, tales como, por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a PTHrP-173, que exhiben el nivel más alto de citolisis (a través de la activación del complemento o ADCC) in vitro se pueden administrar a continuación al paciente para la ablación terapéutica.
[0074] 00105 La selección de una subclase de anticuerpos seleccionados con fines terapéuticos dependerá de la
15 expresión de isoformas específicas de la PTHrP en, sobre o por un tumor. Por ejemplo, si el tumor expresa altos niveles de la isoforma PTHrP-173 en comparación con los tejidos normales, una IgM contra esta isoforma puede ser preferible para inducir la citolisis tumor. Sin embargo, si la isoforma PTHrP1-173 se expresa a niveles más bajos, puede ser preferible usar un IgG contra esta isoforma que sea más pequeña y, por lo tanto, más accesible para penetrar en el tumor y también menos citotóxica para las células normales.
[0075] 00106 En la presente memoria, “fragmentos de anticuerpos” comprenden una porción de un anticuerpo intacto, generalmente la región de unión al antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, diacuerpos, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
25 [0076] 00107 En la presente memoria, el término “dominio variable” describe ciertas porciones de anticuerpos que difieren en la secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye habitualmente de manera uniforme a través de los dominios variables de los anticuerpos. Por lo general se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes de la complementariedad (“RDC”) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan las regiones marco (“RM”). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones RM, adoptando en gran medida una configuración de lámina beta, conectadas por tres RDC, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina beta. Las RDC
35 de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones RM y, con las RDC de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.
[0077] 00108 En la presente memoria, la expresión “anticuerpo monoclonal” o “Acm” se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en menor cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en comparación con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que
45 generalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno.
[0078] 00109 El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como el obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular.
[0079] 00110 Un experto en la técnica relevante entenderá que en la presente memoria se contemplan modificaciones de los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser modificados conjugando, etiquetando o marcando a través de métodos conocidos en la técnica, los anticuerpos a cualquier agente de 55 diagnóstico o terapéutico conocido, incluyendo sin limitarse a agentes citotóxicos (por ejemplo, conjugados de inmunotoxina), profármacos, fármacos (por ejemplo, sustancias farmacéuticamente activas) u otras moléculas efectoras que son eficaces en el tratamiento de la enfermedad, así como moléculas informadoras conocidas. Tales anticuerpos modificados, también referidos como derivados inmunoquímicos de los mismos incluyen, pero sin limitarse a (a) anticuerpos monoclonales marcados (por ejemplo, compuesto radiomarcado, marcado con enzima, fluorocromo o quimioluminiscente), preferiblemente Acm humanizados o completamente humanos, para diagnosticar
o detectar tumores y la extensión del tumor (por ejemplo metástasis) utilizando tecnologías de imágenes conocidas; y (b) conjugados de inmunotoxina de los Acm de la presente invención, preferiblemente Acm humanizados o completamente humanos, donde los Acm están conjugados con residuos citotóxicos, radiactivos, marcados radiactivamente, profármacos o fármacos conocidos (por ejemplo, radioinmunoterapia). Se entenderá por un experto
65 en la técnica relevante que la expresión “agente citotóxico”, “citotoxinas” o “citotóxico” en la presente memoria se
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refieren en general a una sustancia que inhibe o impide la función de las células y/o provoca la destrucción de las células e incluye, pero sin limitarse a, isótopos radiactivos, agentes quimioterapéuticos, y toxinas, tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos. También se comprenderá por una persona experta en la técnica relevante
5 que el término “profármaco” tal como se utiliza en esta solicitud se refiere generalmente a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxico para las células diana en comparación con la sustancia farmacéuticamente activa y es capaz de ser activado o convertido en la sustancia más farmacéuticamente activa.
[0080] 00111 En la presente memoria, “hibridoma” se refiere a líneas celulares que han sido diseñadas para producir un anticuerpo monoclonal, tal como el producido por el método del hibridoma descrito por primero vez por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (1975). En un método de hibridoma, un ratón, hámster u otro animal hospedador apropiado, generalmente se inmuniza con un agente inmunizante para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que pueden unirse específicamente al agente inmunizante. Los linfocitos se
15 fusionan con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Véase, por ejemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103 o Hardy RR et al. In Handbook of Experimental Immmunology (DM Weir Ed) Blackwell Scientific p13.1. Las líneas celulares inmortalizadas son usualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen de roedor, bovino y humano. Por lo general, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden ser cultivadas en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas generalmente puede incluir hipoxantina, aminopterina y timidina (“medio HAT”), sustancias que evitan el crecimiento de células deficientes en
25 HGPRT.
[0081] 00112 El medio de cultivo en el que las células de hibridoma se cultivan a continuación, puede someterse a ensayo para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Dichas técnicas y ensayos son conocidos en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem. 107: 220 (1980). Es ventajoso identificar anticuerpos que tienen un alto grado de especificidad y una alta afinidad de unión por el antígeno diana.
35 [0082] 00113 Después de identificar las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y crecer mediante métodos estándar (Goding, 1986). Medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. Como alternativa, las células de hibridoma pueden ser cultivadas in vivo como ascitis en un mamífero.
[0083] 00114 Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o fluido de ascitis mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
45 [0084] 00115 Una persona experta en la técnica relevante puede entender que los anticuerpos monoclonales de la presente invención también se pueden preparar mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente US-4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede ser fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que luego son transfectados en células hospedadoras, tales como las células de simio COS, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. El ADN también se puede modificar, por
55 ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante por los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas (Patente US-4.816.567; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)) o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido no inmunoglobulina. Tal polipéptido no inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinación con el antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.
[0085] 00116 En la presente memoria, el término “bloquear” y “atenuar” se refieren en general a eliminar funcionalmente la expresión de un producto génico o reducir la reducción del mismo para determinar la función de los productos génicos. Un experto en la técnica relevante puede entender que la expresión eliminar funcionalmente
65 la expresión puede referirse a eliminar por completo la expresión del mismo o reducir la expresión del mismo más
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N.º de acceso NMLHC 150807-01
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