ES2558689T3 - Métodos para reducir los niveles de eosinófilos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humanizado IgG1 que se une con IL-5R para uso en la reducción de los números de eosinófilos en un sujeto humano por administración parenteral de dicho anticuerpo a dicho sujeto a entre 0,01 y 0,25 mg/kg y en el que dicho anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 1 y 3 y una región Fc de inmunoglobulina que no comprende fucosa.

Description

Métodos para reducir los niveles de eosinófilos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para reducir los niveles de eosinófilos en sujetos humanos.

Antecedentes de la invención

Los eosinófilos están implicados en diversas enfermedades incluyendo enfermedades alérgicas, y se cree que desempeñan un papel importante en la generación de morbilidad de enfermedades alérgicas, tales como asma bronquial crónica y dermatitis atópica [Adv. Immunol., 39, 177(1986), Immunol. Today, 13, 501(1992)]. Además de las enfermedades anteriores, los eosinófilos también están implicados en enfermedades denominadas generalmente síndrome hipereosinófilo (HES), tales como eosinofilia, enterogastritis eosinófila, leucemia eosinófila, granuloma eosinófilo y enfermedad de Kimura [Ann. Intem. Med., 97, 78 (1982)].

El granuloma eosinófilo es una lesión criptogénica no neoplásica, que es osteolitica y focal, y se cree que está asociada con eosinofilia tisular notable [U.S. Armed Forces Med. J., 2, 1085 (1951)]. De acuerdo con el registro de pacientes de tumor óseo en Japón (1972-1984), 379 de 404 pacientes con tumor óseo (93,8 %) padecian granUloma eosinÓfilo. El granUloma eosinófilo en estadio temprano comprende principalmente eosinófilos e histiocitos, y el granuloma en el estadio avanzado comprende fibrosis, o puede progresar a pulmón fibriode. Por lo tanto, además de enfermedades inflamatorias, tales como alergia, los eosinófilos pueden provocar otras diversas enfermedades.

La interceucina-5 (denominada en lo sucesivo en el presente documento IL-5), interceucina-3 (denominada en lo sucesivo en el presente documento IL-3) y factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (denominado en lo sucesivo en el presente documento GM-CSF), que son miembros de la familia de citocinas, están implicados en la regulación de la diferenciación, proliferación y activación de eosinófilos. De estas citocinas, se sabe que IL-5 actúa especifica mente en eosinófilos e induce específicamente la diferenciación terminal [Proc. Natl. Acad. Sci.

U.SA, 85, 2288 (1988)].

In vitro, IL-3 y/o GM-CSF pueden activar eosinófilos o prolongar su supervivencia [J. Clin. Invest., 81 , 1986 (1988)]. Además , IL-3 y/o GM-CSF también actúa predominantemente en la inducción de eosinófilos inmaduros a partir de células madre mieloides [Blood, 76, 1956 (1990)]. Además, las quimiocinas tales como eotaxina y RANTES (regulada en activación expresada y secretada por linfocitos T normales), inducen la quimiotaxis de eosinófilos al sitio inflamado [Clin. Exp. Al1ergy, 26, 1005 (1996»). Los factores de células madre (denominados en lo sucesivo en el presente documento SCF) están implicados en la acumulación de eosinófilos en bronquitis alérgica. Además de IL-5, hay muchos factores que afectan a la función de los eosinÓfilos.

Los eosinófilos se dividen en subgrupos, eosinófilos normodensos y eosinófilos hipodensos. Se ha mostrado que los eosinófilos son eosinófilos hipodensos tras la activación [Immunology, 47, 531 (1982)]. Los eosinófilos hipodensos también se denominan eosinófilos activados. Se ha indicado que se produce un cambio cualitativo además de un cambio cuantitativo en eosinófilos en la sangre periférica de un paciente de HES [Clin. Exp. Immunol., 24, 423 (1976)). Los eosinófilos activados se han implicado en la gravedad del síntoma de HES [Am. J. Cardiol., 52, 321 (1983)]. Además de pacientes de HES, se han encontrado también eosinófilos activados en la sangre periférica, yen el fluido de lavado bronquioalveovar (BALF) de un paciente con asma bronquial [Am. Rev. Respir. Dis, 132, 981 (1985)]. Diversos receptores, tales como los de citocinas, se expresan en eosinófilos activados (eosinófilos hipodensos) [J. Immunol., 142, 4416 (1989)]. En comparación con eosinófilos normodensos, estos eosinófilos hipodensos muestran sensibilidades elevadas frente a IL-5 [Clin. Exp. Immunol., 85, 312 (1991); J. Exp. Med., 172, 1347 (1990»).

También se sabe que los eosinófilos activados anteriormente mencionados sobreviven in vitro sin las citocinas que inducen la diferenciación y proliferación de eosinófilos [J. Exp. Med., 170, 343(1989)]. Por lo tanto, las propiedades de eosinófilos activados son similares a las de eosinófilos, que se infiltrarán en tejidos, tales como alveolos [Inl. Arch. Al1ergy Imrnunol., 120, 91 (1999)]. Sigue sin conocerse una explicación detallada de por qué los eosinólllos activados se hacen independientes de citocinas, sin embargo, su desgranulación y supervivencia prolongada probablemente se induzcan por diversas moléculas funcionales vitales distintas de IL-5.

Se han considerado como agentes que inhiben las funciones de eosinófilos sustancias que tienen actividad de inhibición en citocinas o quimiocinas que están implicadas en la diferenciación o proliferación de eosinÓfilos. Sin embargo, en la mayoria de los casos estos agentes no actúan en eosinófilos independientes de citocinas que se han activado e infiltrado en áreas inflamadas. Por lo tanto, la inhibición específica de eosinófilos y la inducción de muerte celular de eosinófilos activados son necesarias para inhibir las funciones de cualquier eosinófilo. Sin embargo, no se conoce que ningún agente antiinflamatorio, hasta la fecha, induzca apoptosis de eosinófilos activados.

En la actualidad, el tratamiento para pacientes con enfermedades eosinófilas consiste en la administración de

esteroides. Sin embargo, la administración de esteroides se asociada con frecuencia con efectos secundarios. Específicamente, el tratamiento tiene algunos otros problemas, de modo que la afección patológica del paciente puede volver al estado original cuando se detiene la administración de esteroides, y la administración de esteroides prolongada puede inducir resistencia a esteroides. En consecuencia, existe la necesidad de tratamientos seguros y eficaces para enfermedades y trastomos mediados por eosinÓfilos.

El documento EP 1 688 437 se refiere a una composición de anticuerpos que comprende una molécula de anticuerpo recombinante que se une específicamente con la cadena del receptor de interleucina-5 humana y tiene cadenas de azúcares unidas a N-glucósido de tipo complejo en la región Fc. Las cadenas de azúcares unidas a Nglucósido de tipo complejo tienen una estructura en la que la fucosa no está unida con N-acetilglucosamina en el extremo reductor en las cadenas de azúcares.

Sumario de la invención

La invención proporciona un método para reducir los números de eosinófilos en un sujeto humano que comprende la administración a dicho paciente de una molécula de unión a IL-5R que comprende (a) una región que se une especifica mente con IL-5R y (b) una regíón Fc de inmunoglobulina.

Breve descripción de las figuras

Para el fin de ilustrar la invención, se representan en los dibujos ciertas realizaciones sobre la invención. Sin embargo, la invención no se limita a las disposiciones precisas y las instrumentalidades de las realizaciones representadas en los dibujos.

Figura 1. Reducción de la proteína catiónica eosinófila (ECP) del suero: la ECP es un marcador producido por eosinófilos. En la cohorte de pacientes 1, esta reducción de los niveles de ECP se correlaciona con la reducción de eosinófilos observada en la figura 1. El eje Y resume los niveles de ECP (ngfml) y el eje X resume el tiempo (en dias).

Figura 2. Empobrecimiento de basófilos periféricos reversibles: se midieron los basófilos en circulación en la cohorte de pacientes 1. El eje Y resume los recuentos de basófilos (basófilos/mm3) y el eje X resume el tiempo (en días). Se observó una reducción rápida de los basófilos en la periferia a las 24 horas después de la administración.

Figura 3. hsCRP (proteína sensible a c de alta sensibilidad) aumentada (reversible) en sujetos con eosinofilia en la linea basal. La medición de este marcador en la cohorte de pacientes 1 demuestra que se produce la respuesta esperada, mediada por el sistema inmunitario, contra células que expresan IL-5R. El eje Y resume los niveles de hsCRP (mgfdJ) y el eje X resume el tiempo (en días).

Figura 4. Aumento mínimo de IL-6 en el suero. Se resume la medición de la citocina IL-6 en la cohorte de pacientes

1. El eje Y resume los niveles de IL·6 (pg/ml) y el eje X resume el tiempo (en horas).

Figura 5. Reducción variable de neutrófilos en circulación. Se midieron los niveles de neutrófilos en la cohorte de pacientes 1 y se resumen en ambos paneles.

Figura 6. Reducción variable de linfocitos en circulación. Se midieron los niveles de linfocitos en la cohorte de pacientes 1 y se resumen en ambos paneles.

Figura 7. Reducción uniforme y moderada del % de NK el día 1. Se midieron los niveles de linfocitos NK en la cohorte de pacientes 1 antes del tratamiento, el dia 1 después de la administración y el dia 28 después de la administración.

Figura 8. FENO reducido en sujetos con mayor línea basal. La fracción de óxido nítrico exhalado se midió en la cohorte de pacientes 1. Este ensayo es una medición no invasiva de inflamación pulmonar, indicando los datos una tendencia a la reducción de la inflamación.

Figura 9. Ensayo de citotoxicidad in vitro: se ensayó MEDI-563 en un ensayo de citotoxicidad in vitro en comparación con un anticuerpo de control que no se une con IL-5R (A) Y también con el control adicional de MEDI-563 (B) fucosilado. Se usaron células efectoras KC 1333 en una relación 5:1 contra células diana CTLL2. La citotoxicidad se midió a las 4 horas. El eje y mide el porcentaje de citotoxicidad y el eje X es la concentración de anticuerpo.

Figura 10. Unión de MEDI-563 con-rhuIL5Ra: se midió la afinidad de unión de MEDI-563 con IL-5Ra humano recombinante mediante resonancia de plasmón superficial en tres experimentos separados y se resume en esta figura . Figura 11. Unión de MEDI-563 con muFcyRs: la afinidad de unión de MEDI-563 con FcyRs recombinantes de varios lotes diferentes se midió en comparación con un anticuerpo de control fucosilado de isotipo coincidente y se resume en esta figura. Obsérvese que MEDI-563 se une con una afin idad 5-10 veces mayor con huFcyRllla y muFcyRIV.

Figura 12. Se analizó la expresión de IL-5Ra en el pulmón del ratón IL-9tg mediante inmunohistoquímica y se visualiza en esta figura.

Figura 13. Se analizó la expresión de IL-5Ra en pólipos nasales mediante inmunohistioquimica usando MEDI-563 y se visualiza en esta figura. MEDI-563 tiñe todos los eosinófilos en pólipos nasales.

Figura 14. Neutropenia transitoria minima en sujetos: se tomaron recuentos de neutrófilos absolutos para sujetos en la cohorte 1 y se resumen en esta figura . El eje Y resume los recuentos de neutrófilos (neutrófilosfmm3) y el eje X resume el tiempo en días.

Figura 15. MEDI-563 se une con eosinófilos en sangre completa de donantes sanos: se realizó análisis de citometría de flujo en muestras de sangre completa como se describe en el ejemplo 6 del presente documento. Los tres paneles de datos, particularmente el tercer panel titulado "MEDI-563 se une con Eos" demuestra por FACS que MEDI-563 se une con eosinófilos.

Figura 16. Análisis de FACS de leucocitos de ratones transgénicos IL-5: se realizó análisis de citometria de flujo en leucocitos de ratones transgénicos IL5 como se describe en el ejemplo 7. La figura 16A resume un análisis de FACS de eosinófilos SiglecF+CCR3+. La figura 16B demuestra que todos los eosinófilos (SiglecF+CCR3+) en la médula ósea, bazo, sangre y pulmón expresan IL-5Ro+ usando mAb anti-IL-5Ra H7.

Figura 17. MEDI-563 agota células mononudeares positivas para IL-5Ra de la médula ósea en un ensayo ADCC in vitro. Se expusieron células mononucleares de médula ósea no adherentes aisladas a MEDI-563, o anticuerpos de control de isotipo (R347), en presencia de células efectoras teñidas con CFSE. Las células positivas para IL-5Ra se visualizaron por anticuerpo KM 1257/lgG de cabra anti Mu conjugado con PE. Se realizó tinción de control de las muestras usando el anticuerpo de control de isotipo 1A7flgG de cabra anti Mu conjugado con PE. Se presenta el perfil de linción de las poblaciones celulares de las muestras después de empobrecimiento mediado por MEDI-563 o R347 como gráficos de puntos de KM 1257fPE frente a. CFSE o lA7fPE frente a CFSE. Una comparación de los gráficos de puntos de KM 1257/PE frente a. CFSE obtenidos para muestras tratadas con MEDI-563 y R347 revela que ADCC mediada por MEDI-563 agota sustancialmente todas las células positivas IL-5Ra de la muestra.

Figura 18. MEDI-563 agota de forma reversible eosinófilos de sangre periférica en asmáticos leves. Seis voluntarios con asma atópica leve recibieron una única dosis IV de (A) 0,03 mg/kg o (B) 0,1 mg/kg de MEDI-563. Se enumeraron eosinófilos de sangre periférica por citometría de flujo en un momento de exploración, el día O antes de la dosificación, y a intervalos regulares hasta el día 84 y en el seguimiento. El eje Y resume los recuentos de eosinófilos (eosinófilos/mm3) y el eje X resume el tiempo (en días). Se observó reducción rápida de eosinófilos en la periferia a las 24 horas después de la administración. La eosinopenia inducida por MEDI-563 era reversible.

Figura 19. IL-5Ra se expresa en todos los eosinófilos en pulmón humano normal como se analiza mediante inmunohistoquimica usando MEDI-563 y se visualiza en esta figura.

Figura 20. IL-5Ra se expresa en todos los eosinófilos en biopsias de pulmón de pacientes humanos asmáticos como se analiza mediante inmunohistioquímica usando MEDI-563 y se visualiza en esta figura.

Figura 21. Se analizó la expresión de IL-5Ro por basófilos primarios y eosinófilos aislados de donantes sanos mediante citometría de flujo. Se muestran los perfiles de tinción obtenidos usando el anticuerpo MEDI-563 antiIL5Ralpha y un anticuerpo de control de isotipo de especificidad irrelevante, las células CTLLh5r (células tumorales transfectadas con IL-SRalfalbeta) actuaron como un control positivo.

Figura 22. Ensayo de cilotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC) in vitro. Se compararon la actividad de MEDI-563 afucosilado y fucosilado en un ensayo de (ADCC) in vitro. Se usaron linfocitos NK primarios y eosinófilos aislados como células efectoras y diana, respectivamente, a una relación 5:1. El ensayo se realizó en presencia de IL-2 humana 1 ngfml. La muerte celular se evaluó por citometria de flujo basándose en la tinción con anexina V. Los ejes Y y X presentan el porcentaje de citotoxicidad máximo y la concentración de anticueqXls, respectivamente. El valor de CE50 para el anticuerpo MEDI-S63 afucosilado rue de 0,965 pM.

Figura 23. Ensayo de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC) in vitro: se analizó la actividad de MEDI-563 afucosilado en un ensayo ADCC in vitro. Se usaron linfocitos NK primarios y basófilos aislados como células efectoras y dianas, respectivamente. Los ejes y y X presentan el porcentaje de citotoxicidad máxima y la concentración de anticuerpos, respectivamente. El valor CESO para el anticuerpo MEDI-563 afucosilado fue 0,561 pM en este ensayo.

Figura 24. Desgranulación de eosinófilos en un ensayo de citotoxicidad mediado por células dependientes de anticuerpo (ADCC) in vitro: Se analizó la liberación EDN (neurotoxina derivada de eosinófilos) en un ensayo ADCC in vitro usando diversos niveles de anticuerpo anti-IL5Ralfa fucosilado (MEDI-563F) y afucosilado (MEDI-563). El ensayo utilizó eosinófilos recién aislados y linfocitos NK o células PBMC como células diana y efectoras,

respectivamente. Se muestra la desgranulación de eosinófilos máxima detectada en respuesta al tratamiento con Triton X-100 1 % para comparación.

Figura 25. MEDI-563 se une específicamente con un epítopo dentro del dominio D1 de la relación extracelular de IL5Ralfa humana. Se determinó la unión de anticuerpos a células transgénicas que expresaban de forma transitoria proteinas IL-5Ralfa quiméricas por citometría de flujo. Se muestran los perfiles de tinción fluorescente. "Policlonal" y "MEDI-563" indican perfiles de tinción observados usando anticuerpos policlonales anti-IL-5Ralfa humana y MEDI563, respectivamente. La "tinción doble" indica el perfil de tinción fluorescente para los anticuerpos "policlonales" (eje X) y MEDI-563 (eje Y). (A) se expresó de forma transitoria una serie de transgenes de IL-5Ralfa quiméricos de ser humano-ratón. Los transgenes "de anulación" fueron construcciones de IL-5Ralfa quiméricas que comprendían un único dominio extracelular de ratón en un fondo de otro modo humano. Los transgenes "de introducción" fueron construcciones de IL-5Ra1fa quiméricas que comprendían un único dominio extracelular humano en un fondo de otro modo de ratón. (8) MEDI-563 se unió específicamente a células transgénicas que expresaban IL-5Ralfa humano. MEDI-563 no se unió con células transgénicas que expresaban IL-5Ralfa de ratón. (C) MEDI-563 no se unió con células transgénicas que expresaban un transgén de IL-5Ralfa quimérico que comprendía dominios extracelulares D1 de ratón y D2-D3 humano ("DI de anulación"). MEDI-563 se unió específicamente con células transgénicas que expresaban un transgén de IL-5Ralfa quimérico que comprendía los dominios extracelulares D2 o D3 de ratón en un fondo humano ("anulación de D2 o D3"). (D) MEDI-563 se unía específicamente con células transgénicas que expresaban un transgén de IL-5Ralfa quimérico que comprendia los dominios extracelulares D1 humano y D2-D3 de ratón ("introducción de D1"). MEDI-563 no se unió con células transgénicas que expresaban un transgén quimérico basado en IL-5Ralfa de ratón que comprendia el dominio extracelular D2 o D3 humano rintroducción de D2 o D3").

Figura 26. MEDI-563 se une especificamente con un eprtopo dentro del Segmento B del dominio extracelular D1 de IL-5Ralfa humana. La unión del anticuerpo con células transgénicas que expresaban una proteina IL-5Ralfa quimérica se determinó por citometría de flujo. Se muestran los perfiles de tinción fluorescente. "Policlonal" y"MEDI563" indican perfiles de tinción observados usando anticuerpo policionales anti-IL-5Ralfa humana y MEDI-563, respectivamente. La "tinción doble" indica el perfil de tinción fluorescente para los anticuerpos policlonal (eje X) y MEDI-563 (eje Y). (A) la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular D1 de IL-5Ralfa de ratón es 75 % idéntica a la de la proteína IL-5Ralfa humana. El dominio extracelular D1de IL-5Ralfa se dividió en los Segmentos A, By e. las secuencias de aminoácidos de IL-5Ra1fa humanas y de ratón mostradas son los restos 1-102 de SEe ID N °5 Y 6, respectivamente. (8) se expresó de forma transitoria una serie de transgenes de IL-5Ralfa quiméricos de ser humano-ratón. Los transgenes "de anulación" fueron construcciones de IL-5Ralfa quiméricas que comprendían un ún ico segmento de ratón del dominio extracelular 01 en un fondo de otro modo humano. Los transgenes "de introducción "fueron construcciones de IL-5Ralfa quiméricas que comprendían un único segmento humano del dominio extracelular D1 en un fondo 01 de ratón-D2 humano-D3 de ratón-TM de ratón. (e) MEDI-563 reconocia específicamente células transgénicas que expresaban (i) un transgén de IL-5Ralfa humano o (ii) un transgén quimérico de IL-5Ralfa de ratón que comprendía un dominio extracelular 01 humano rintroducción de 0 1"). MEDI563 no se unió con células transgénicas que expresaban (i) transgén de receptor IL-5Ralfa de ratón o (ii) un transgén de IL-5Ra1fa quimérico humano que comprendra un dominio extracelular 01 de ratón. (D) MEDI-563 no se unió con células transgénicas que expresaban un transgén de IL-5Ralfa quimérico que comprendia un Segmento B de ratón del dominio extracelular 0 1 en un fondo de otro modo humano ("anulación de B"). MEDI-563 se unía específicamente con células transgén icas que expresaban un transgén de IL-5Ralfa quimérico que comprendía el Segmento A o C de ratón de los dominios extracelulares 01 en un fondo humano ("anulación de A o COl. (E) MEDI563 se unía específicamente con células transgénicas que expresaban un transgén de IL-5Ra1fa quimérico que comprendía un Segmento B humano del dominio extracelular DI en un fondo de DI de ratón-D2 humano-D3 de ratón-TM de ratón ("introducción de B"). MEDI-563 no se unió con células transgénicas que expresaban un transgén de IL-5Ralfa quimérico que comprendia un Segmento A o e humano en un fondo de 01 de ratón-D2 humano-D3 de ratón-TM de ratón ("íntroducción de A oC").

Figura 27. MEDI-563 se une especifica mente con un epítopo de IL-5Ralfa humano que comprende el resto de aminoácido lIe61 del dominio extracelular 01. La unión de anticuerpos con células transgénicas que expresaban una proteína IL-5Ralfa variante se determinó por citometría de flujo. Se muestran los perfiles de tinción fluorescente. "Policlonar y "MEDI-563" indican perfiles de tinción observados usando anticuerpos policlonales anti-IL-5Ralfa humano y MEDI-563, respectivamente. La "tinción doble" indica el perfil de tinción fluorescente para los anticuerpos policlonales (eje X) y MEDI-563 (eje Y). (A) se muestran los restos 50-61 del dominio extracelular 0 1 de IL-5Ralfa humano (restos 40-61 de SEe ID N °:5). Los restos mostrados en cursiva son diferentes en la región correspondiente de la proteína IL-5Ralfa de ratón. Se expresó una serie de variantes de receptor IL-SRalfa que comprendía al menos un resto de aminoácido mutante en células transgénicas. Las variantes de IL-5Ralfa de "anulación "fueron proteinas humanas mutantes que comprendían al menos una sustitución que intercambiaba con el resto humano el resto de ratón correspondiente. Por ejemplo, la variante de "anulación DE" es una proteina IL5Ralfa humana que comprende las sustituciones de aminoácidos D56E y E58D. las variantes de IL-5Ralfa "de introducción" fueron proteínas quiméricas que comprendían los dominios 01 de ratón, 02 humano, 03 de ratón y TM de ratón en los que el dominio 01 de ratón comprendía un Segmento 8 mutante que tenía al menos una sustitución que intercambiaba con un resto de ratón el resto humano correspondiente. Por ejemplo, la variante de "introducción DE" fue una proteína IL-5Ralfa quimérica que comprendia un Segmento B mutante de ratón en el que el Segmento B de ratón mutante comprendía las sustituciones de aminoácidos E560 y D58E. (8) MED1-563 no se unió con

células transgénicas que expresaban una proteina IL-5Ralfa humana mutante que comprendia las sustituciones de aminoácidos K53Q, D56E, E58D, 161 K ("anulación KDEJ"). MEDI-563 se une especifica mente con células transgénicas que expresan una proteina IL-5Ralfa humana mutante que comprende las sustituciones de aminoácidos N40H, N42D, Q46H ("anulación NNQ") o D56E, E580 ("anulación DE"), o N40H, N42D, 056E, E58D ("anulación NNOE"). (C) MEOI-563 se unió especificamente con células transgénicas que expresaban una proteina IL-5Ralfa quimérica que comprendia un Segmento B de ratón mutante en el que el Segmento 8 de ratón mutante comprendía las sustituciones de aminoácidos Q53K, E56D, 058E, K611 ("introducción KDE1"). (O) MEDI-563 no se unió con células transgénicas que expresaban una proteina IL-5Ralfa humana mutante que comprendia la sustitución de aminoácidos 161 K ("anulación 161"). MEDI-563 se une especificamente con células transgénicas que expresan una proteína IL-5Ralfa humana mutante que comprende la sustitución de aminoácidos K53Q ("anulación de K53"). (E) MEOI-563 se unió especificamente con células transgénicas que expresaban una proteina IL-5Ralfa quimérica que comprendía un Segmento 8 de ratón mutante en el que el Segmento 8 de ratón mutante comprendía la sustitución de K611 rintroducción de 161"). MEOl-563 no se unió con células transgénicas que expresaban una proteina IL-5Ralfa quimérica que comprendia un Segmento 8 de ratón mutante en el que el Segmento B de ratón mutante comprendía la sustitución de aminoácidos Q53K ("introducción de K53").

Figura 28. Unión de IL-5Ra anti ratón quimérico (H7) con FcyR murinos: se midió la afinidad de unión de IL-5Ra anti ratón quimérico (H7) por FcyRs murinos recombinantes en comparación con un anticuerpo de control fucosilado de isotipo coincidente y se resume en esta figura. Se muestran las constantes de disociación (nM). Se realizaron mediciones por resonancia de plasmón superficial.

Figura 29. (A) Se identificaron eosinófilos por análisis citométrico de flujo como células con alta dispersión lateral que se tiñeron positivamente para CCR3 y Siglec-F. (8) IL-5R se expresó selectivamente por eosinófilos en médula ósea, sangre, bazo y tejido pUlmonar de ratones IL-5Tg.

Figura 30. H7 tanto afuc como fue agotó eosinófilos en el bazo (A), tejido pulmonar (A) y sangre (8) de ratones IL5Tg. No se detectó empobrecimiento en la médula ósea (B). H7 afucosilado fue más potente en la retirada de eosinófilos en comparación con H7 fue, especialmente a dosis de anticuerpo menores. Los datos se expresan como media ± ETM, n=6-8 ratonesfgrupo, p<O,05 tratado con anticuerpo en comparación con tratado con IgG de control, ensayo de U de Mann-Whitney.

Figura 31. H7 afuc también agota eosinófilos en un modelo de exposición a alérgeno. H7 afuc agotó eosinófilos en el lumen de las vias respiratorias, tejido pulmonar, sangre y médula ósea. El empobrecimiento fue mayor en todos los compartimentos 72 horas después de la exposición final (96 horas después del suministro de anticuerpos). Los datos se expresan como la media ± ETM, n=6 ratones/grupo, *p<O,05 tratado con anticuerpo en comparación con tratado con IgG de control, ensayo de U de Mann-Whitney.

Descripción detallada de la invención

Como se ha analizado anteriormente en el presente documento y sin quedar ligado a una hipótesis o teoria particular, los eosinófilos se han implicado en la patogénesis de numerosas enfermedades y trastornos. Muchas de estas enfermedades o trastornos se caracterizan por una sobreabundancia de eosinófilos (eosinofilia), y se denominan síndromes hipereosinófilos.

Son ejemplos no limitantes de enfermedades y trastornos en los que los eosinófilos desempeñan un papel : asma , alergia alimentaria mediada por inmunoglobulina (lgE), esofagitis eosinófila (inflamación del esófago), enfermedad inflamatoria del intestino, EPOC, colitis alérgica, reflUjO astroesofágico, enfermedad gastrointestinal eosinófila, (EGIO), gastroenteritis eosinófila, fibrosis endomiocárdica, endocarditis de Loeffier, enfermedad de Davies, angioedema episódico asociado con eosinofilia, síndrome de eosinofiJia-mialgia/síndrome del aceite tóxico español, cirrosis hepática, dermatitis herpetiforme, pemfigoide ampol1oso, síndrome de Churg-Strauss, leucemia eosinófila mielógena aguda, leucemia eosinófila linfocitica aguda, mastocitosis sistémica con eosinofilia, rinitis alérgica, eccema, granulomatosis de Wegener, poliarteritis nodosa, fasciculitis eosinófila y artritis reumatoide.

En consecuencia, la invención se refiere a un método para reducir los números de eosinófilos en un ser humano corno se define en las reivindicaciones adjuntas.

En una realización especifica, un método de la invención reduce el número de eosinófilos en sangre, la médula ósea, el tracto gastrointestinal (por ejemplo, esófago, estómago, intestino delgado y colon) o pulmón. En otra realización espeCifica, un métooo de la invención reduce el número de eosinófilos en sangre. En una realización especifica adicional, un método de la invención reduce el número de eosinófilos de pulmón. En una realización especifica, un método de la invención reduce el número de células precursoras de eosinÓfilos.

En otra realización, un método de la invención reduce el número de eosinófilos en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos

aproximadamente 99 %. En una realización especifica, un método de la invención reduce el número de eosinófilos por debajo del límite de detección.

En otra realización, un método de la invención reduce el número de precursores de eosinófilos en al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos aproximadamente 99 %. En una realización especifica, un método de la invención reduce el número de precursores de eosinófilos por debajo del limite de detección.

En una realización adicional, un método de la invención elimina todos los eosinófilos detectables después de una única administración del anticuerpo. En una realización especifica, una única administración del anticuerpo elimina todos los eosinófilos detectables durante al menos aproximadamente 1 dia, al menos aproximadamente 2 dias, al menos aproximadamente 3 dias, al menos aproximadamente 4 dras, al menos aproximadamente 5 dias, al menos aproximadamente 6 dias, al menos aproximadamente 7 dias, al menos aproximadamente 2 semanas, al menos aproximadamente 3 semanas, al menos aproximadamente 4 semanas, al menos aproximadamente 5 semanas, al menos aproximadamente 6 semanas, al menos aproximadamente 7 semanas, al menos aproximadamente 8 semanas, al menos aproximadamente 9 semanas, al menos aproximadamente 10 semanas, al menos aproximadamente 12 semanas, al menos aproximadamente 14 semanas, al menos aproximadamente 16 semanas, al menos aproximadamente 20 semanas, o al menos aproximadamente 25 semanas.

En una realización adicional, un método de la invención elimina todos los precursores eosinófilos detectables después de una única administración del anticuerpo. En una realización especifica, una única administración del anticuerpo elimina todos los precursores de eosinófilos detectables durante al menos al menos aproximadamente 1 día, al menos aproximadamente 2 días, al menos aproximadamente 3 días, al menos aproximadamente 4 días, al menos aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente 6 días, al menos aproximadamente 7 días, al menos aproximadamente 2 semanas, al menos aproximadamente 3 semanas, al menos aproximadamente 4 semanas, al menos aproximadamente 5 semanas, al menos aproximadamente 6 semanas, al menos aproximadamente 7 semanas, al menos aproximadamente 8 semanas, al menos aproximadamente 9 semanas, al menos aproximadamente 10 semanas, al menos aproximadamente 12 semanas, al menos aproximadamente 14 semanas, al menos aproximadamente 16 semanas, al menos aproximadamente 20 semanas, o al menos aproximadamente 25 semanas.

En una realización especifica, el método de la invención comprende la administración a un sujeto de una única dosis de 0,03 mgfkg del anticuerpo, en el que la administración del anticuerpo conduce al agotamiento de al menos aproximadamente el 99 % de los eosinófilos de la circulación del sujeto, en el que el agotamiento es completo a las 24 horas después de la dosificación, y en el que el agotamiento dura al menos aproximadamente 28 dias después de la dosificación.

En una realización especifica, el método de la invención comprende la administración a un sujeto de una única dosis de 0,1 mgfkg del anticuerpo, en el que la administración del anticuerpo conduce al agotamiento de al menos aproximadamente el 99 % de los eosinófilos de la circu lación del sujeto, en el que el agotamiento está completo a las 24 horas después de la dosificación, y en el que el agotamiento dura al menos aproximadamente 84 días después de la dosificación.

En un aspecto de la divulgación, las moléculas de unión a IL-5R de la presente invención incluyen proteínas de fusión. En ciertas realizaciones de la divulgación, las proternas de fusión comprenden una región polipeptidica que se une especificamente con el IL-5R, y comprenden además una región Fc de inmunoglobulína. En las patentes de Estados Unidos N.O 7.109.299 Y5.677.280, publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.O 200610014680 A, pueden encontrarse ejemplos no limilantes de una región pOlipeptidica que se une especifica mente con el IL-5R. En otras realizaciones de la divulgación, la región polipeptidica que se une específicamente con el IL-5R es la IL-5 humana (véase, por ejemplo, Tanabi et al., Journal de Biological Chemistry, 1987, Vol. 262, N.O 34, págs. 1658016584), o fragmentos, derivados o variantes de la misma (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos N.O 6.465.616).

En una realización de la divulgación, las moléculas de unión a IL-SR de la presente invención comprenden anticuerpos. Los anticuerpos de la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos sintéticos, anticuerpos multiespecificos, (incluyendo anticuerpos biespecificos), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, Fv monocatenarios (scFv) (incluyendo scFv biespecíficos), anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fv con enlaces disulfuro (sdFv) y fragmentos de unión a epitopos de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos de la presente divulgación incluyen moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológica mente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antigeno que se une específicamente con un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina de la divulgación pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgGl , IgG2, IgG3, IgG4, IgAl YIgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.

Los anticuerpos útiles de la presente divulgación pueden ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos (por ejemplo, pero sin limitación, ser humano, murino, burro, oveja, conejo, cabra, cobaya, camello, caballo o pollo). En realizaciones específicas de la divulgación, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos o humanizados.

Los anticuerpos útiles de la presente divulgación pueden ser monoespecíficos, biespecificos, triespecíficos o de mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multiespecíficos pueden unirse específicamente con diferentes epítopos de un polipéptido o pueden unirse especifica mente tanto con un polipéptido como con un epitopo heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Véase, por ejemplo, publicaciones intemacionales N.O WO 93117715, WO 92108802, WO 91100360, Y WO 92105793; Tull, et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; patentes de Estados Unidos N.O 4.474.893, 4.714.681, 4.925.648, 5.573.920, Y 5.601.819; Y Kostelny et al., 1992, J. Immuno!.

148:1547-1553.

Los anticuerpos útíles en la presente divulgación pueden ser anticuerpos monocatenarios. El diseño y construcción de un anticuerpo monocatenario se describe en Marasco et al, 1993, Proc Nall Acad Sci 90:7889-7893.

Pueden encontrarse ejemplo no limitantes de anticuerpos de la divulgación en las patentes de Estados Unidos N.O 7.179.464, 6.538.111, 6.018.032, Y las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos N.O 200410136996A 1, 2005/0226867A 1.

En una realización, las moléculas de unión a IL-5R de la presente divulgación comprenden anticuerpos. En una realización adicional de la divulgación, una molécula de un ión a IL-5R es un anticuerpo que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEC ID N°: 1-4. De acuerdo con la invención, una molécula de unión a IL-5R de la presente invención es un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID N 0: 1 Y 3. En una realización específica de la divulgación, una molécula de unión a IL-5R es un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N 0: 2 y 4.

En una realización, una molécula de unión a IL-5R de la presente divulgación es un anticuerpo que se une especifica mente con el mismo epitopo que MEDI-563. De acuerdo con la invención, el anticuerpo es MEOI-563. En una realización específica adicional de la divulgación, una molécula de unión a IL-5R es un anticuerpo que se une específicamente con el mismo epítopo que MEDI-563 siempre que el anticuerpo no sea MEDI-563.

En una realización de la divulgación, una molécula de unión a IL-5R es un anticuerpo que se une específicamente con un epítopo que comprende los restos 1-102 de SEC ID N °:5. En una realización específica adicional de la divulgación, una molécula de unión a IL-5R es un anticuerpo que se une especificamente con un epitopo que comprende los restos 1-102 de SEC ID N °:5 siempre que el anticuerpo no sea MEol-563.

En una realización de la divulgación, una molécula de unión a IL-5R es un anticuerpo que se une específicamente con un epítopo que comprende los restos 40-67 de SEC ID N °:5. En una realización específica adicional de la divulgación, una molécula de unión a IL-5R es un anticuerpo que se une especificamente con un epitopo que comprende los restos 40-67 de SEC ID N °:5 siempre que el anticuerpo no sea MEOI-563.

En una realización de la divulgación, una molécula de unión a IL-5R es un anticuerpo que se une específicamente con un epítopo que comprende los restos 52-67 de SEC ID N °:5. En una realización específica adicional de la divulgación, una molécula de unión a IL-5R es un anticuerpo que se une especificamente con un epitopo que comprende los restos 52-67 de SEC ID N °:5 siempre que el anticuerpo no sea MEol-563.

En una realización de la divulgación, una molécula de unión a IL-5R es un anticuerpo que se une específicamente con un epítopo que comprende el resto 61 de SEC ID N °:5. En una realización específica adicional de la divulgación, una molécula de unión a IL-5R es un anticuerpo que se une especificamente con un epitopo que comprende el resto 61 de SEC ID N °:5 siempre que el anticuerpo no sea MEOI-563.

En una realización de la divulgación, la molécula de unión a IL-5R es un anticuerpo que se une específicamente con un primer antigeno que comprende los restos 1-102 de SEC ID N °:5 pero no se une especifica mente con un segundo anUgeno que comprende una variante de los restos 1-102 de SEC ID N °:5 en el que la variante comprende la sustitución 161 K. En una realización especifica adicional de la divulgación, una molécula de unión a IL-5R es un anticuerpo que se une específicamente con un primer antigeno que comprende los restos 1-102 de SEC ID N °:5 pero no se une específicamente con un segundo antígeno que comprende una variante de los restos 1-102 de SEC ID N °:5 en el que la variante comprende la sustitución 161 K, siempre que el anticuerpo no sea MEOI-563.

En una realización de la divulgación, una molécula de unión a IL-5R es un anticuerpo que se une específicamente con un primer antígeno que comprende los restos 40-67 de SEC ID N °:5 pero no se une específicamente con un segundo antígeno que comprende una variante de los restos 40-67 de SEC ID N °:5 en el que la variante comprende la sustitución 161 K. En una realización espeCífica adicional de la divulgación, una molécula de unión a IL-5R es un anticuerpo que se une especifica mente con un primer antigeno que comprende los restos 40-67 de SEC ID N °:5 pero no se une específicamente con un segundo antígeno que comprende una variante de los restos 40-67 de SEC

ID N °:5 en el que la variante comprende la sustitución 161 K, siempre que el anticuerpo no sea MEDI-563.

En una realización de la divulgación, una molécula de unión a IL-5R es un anticuerpo que se une especifica mente con IL-5Ralfa humana (SEC ID N °:5) pero no se une específicamente con IL-5Ralfa humana mutante (SEC ID N °:5) que comprende la sustitución 161 K. En una realización especifica adicional de la divulgación, una molécula de unión a IL-5R es un anticuerpo que se une específicamente con IL-5Ralfa humana (SEC ID N °:5) pero no se une especifica mente con IL-5Ralfa humana mutante (SEC ID N °:5) que comprende la sustitución 161K, siempre que el anticuerpo no sea MEDI-563.

La presente divulgación proporciona moléculas de unión a IL-5R con función efectora aumentada. Pueden encontrarse ejemplos no limitantes de métodos para aumentar la función efectora en las patentes de Estados Unidos

N.O 5.624.821, 6.602.684, 7.029.872, publicaciones de solicitud de patentes de Estados Unidos N.O 2006/0067930A 1, 2005/0272128A 1, 2005/0079605A1, 2005/0123546A 1, 2004/0072290A 1, 2006/0257399A 1, 2004/0261148A1 , 2007f0092521 , 2006JOO40325A1 y 2006f0039904A1, y publicaciones de solicitud de patente intemacional N.O WO 04/029207, WOO3011878, WOO5044859, WO 06071856 y WO 06071280.

Se conocen en la técnica métodos para modificar técnicamente regiones Fc de anticuerpos para alterar las funciones efectoras (por ejemplo, publicación de patente de Estados Unidos N.O 20040185045 Y publicación de PCT

N.O WO 2004f016750 , ambas de Koenig et al., que describen la alteración de la región de Fc para potenciar la afinidad de unión por FcyRIIB en comparación con la afinidad de unión por FCyRIIA; véase, también, publicaciones de PCT N.O WO 99f58572 de Armour et al., WO 99f51642 de Idusogie el al., y documento U.S. 6.395.272 de Deo el al. ). También se conocen en la técnica métodos para modificar la región Fc para reducir la afinidad de unión por FcyRIIB (por ejemplo, publicación de patente de Estados Unidos N.O 20010036459 Y publicación de PCT N.O WO 01179299, ambas de Ravetch el al.).

También se han descrito anticuerpos modificados que tienen regiones Fc variantes con una afinidad de unión potenciada por FcyRlIlA yfo FcyRIIA en comparación con una región Fc de tipo silvestre (por ejemplo, publicaciones de PCT N.O WO 2004/063351 , de Stavenhagen el al.).

La función efectora de anticuerpo también puede modificarse mediante la generación de anticuerpos con patrones de glucosilación alterados. Por ejemplo, puede prepararse un anticuerpo que tiene un tipo de glucosilación alterado, tal como un anticuerpo afucosiladofhipofucosilado que tiene cantidades reducidas de restos de fucosilo de un anticuerpo que tiene estructuras de GlcNac de bisección aumentadas. Se ha demostrado que dichos patrones de glucosilación alterados aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones de carbohidratos pueden conseguirse, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula hospedadora con maquinaria de glucosilación alterada. Se han descrito células con maquinaria de glucosilación alterada en la técnica y pueden usarse como células hospedadoras en las que expresar anticuerpos recombinantes de la invención para producir de este modo un anticuerpo con glucosilación alterada. Por ejemplo, el documento EP 1.176.195 de Hanai el al. describe una línea celular con un gen de FUT8 alterado funcionalmente, que codifica una fucosil transferasa, de modo que los anticuerpos expresados en dicha linea celular muestran hipofucosilación. La publicación de PCT WO 03/035835 de Presta describe una linea celular CHO variante, células Lecl3, con capacidad reducida para unir fucosa con carbohidratos unidos a Asn(297), que también da como resultado hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula hospedadora (véase también Shields, R. L. el al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La publicación de PCT WO 99/54342 de Umana et al. describe lineas celulares modificadas técnicamente para expresar glucosil transferasas modificadoras de glucoproternas (por ejemplo, beta(1,4}-Nacetilglucosaminiltransferasa 111 (GnTIII)) de modo que los anticuerpos expresados en las líneas celulares modificadas técnicamente muestran estructuras de GlcNac de bisección aumentadas que dan como resultado una actividad ADCC aumentada de los anticuerpos (véase también Umana el al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180).

Se conocen en la técnica métodos para generar anticuerpos con glucoformas alteradas, e incluyen pero sin limitación los descritos en Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies el al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields el al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa el al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) patente de Estados Unidos N.O 6.602.684; documentos PCT WO 03f035835A1 ; PCT WO 02f079255A1 ; PCT WO 00/61739A1 ; PCT WO 01 /292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02l30954A1; tecnologra Potil1egent™ (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); tecnologra de modificación por glucosilación GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zúrich, Suiza). Véase, por ejemplo, documentos WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki el al., 2004, JMB,

336: 1239-49. También pueden prepararse anticuerpos con patrón de fucosilación alterado por la retirada post traduccional de fucosa (por ejemplo con una enzima fucosidasa).

La presente divulgación proporciona anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que se unen específicamente con IL-5R que tienen una semivida extendida in vivo. En particular, la presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que tienen una semivida en un mamifero (por ejemplo, pero sin limitación, un ser humano), de más de 3 días, más de 7 dias, más de 10 días, más de 15 días, más de 25 dias, más de 30 dias, más de 35 dias, más de 40 dras, más de 45 dias, más de 2 meses, más de 3 meses, más de 4 meses, o más de 5 meses.

Para prolongar la circulación en suero de los anticuerpos (por ejemplo, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales

y anticuerpos monocatenarios) o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, pero sin limitación, fragmentos Fab) in vivo, por ejemplo, pueden unirse moléculas poliméricas inertes tales como polietilenglicol (PEG) de alto peso molecular con los anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpos de los mismos) con o sin un enlazador multifuncional bien mediante conjugación especifica de sitio del PEG con el extremo N o C terminal de los anticuerpos o bien mediante grupos amino-épsilon presentes en restos de lisina. Se usará derivatización de polímeros lineales o ramificados que da como resultado pérdida m¡nima de la actividad biológica. El grado de conjugación puede controlarse estrechamente por SDS-PAGE y espectrometr¡a de masas para asegurar la conjugación apropiada de moléculas de PEG con los anticuerpos. El PEG que no ha reaccionado puede separarse de los conjugados de anticuerpos-PEG por cromatografía de exclusión por tamaño o de intercambio iÓnico. Los anticuerpos derivatizados con PEG (incluyendo fragmentos de anticuerpos de los mismos) pueden ensayarse con respecto a la actividad de unión así como con respecto a la eficacia in vivo usando métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante inmunoensayos descritos en el presente documento.

También pueden generarse anticuerpos que tienen una semivida in vivo aumentada introduciendo una o más modificaciones de aminoácidos (es decir, sustituciones, inserciones o deleciones) en un dominio constante IgG, o fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, Fc °fragmento de dominio Fc de bisagra). Véase, por ejemplo, publicación intemacional N.O WO 98123289; publicación internacional N.O WO 97/34631 ; Y patente de Estados Unidos N.O 6.277.375.

Además, los anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo de los mismos) pueden conjugarse con albúmina para hacer al anticuerpo (induyendo fragmento de anticuerpo del mismo) más estable in vivo o que tenga una semivida más larga in vivo. Las técnicas se conocen bien en este campo, véase por ejemplo, publicación intemacional N.O WO 93/15199 , WO 93/15200 Y WO 01f77137; y patente europea N.O EP 413.622.

La presente divulgación proporciona moléculas de unión a IL-5R que se unen específicamente con IL-5R, en las que las moléculas de unión se fusionan de forma recombinante o se conjugan de forma química (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) con una prote¡na o un polipéptido heterólogo (o fragmento de un polipéptido de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos) para generar proteinas de fusión. En particular, la divulgación proporciona formulaciones de proteínas de fusión que comprenden un fragmento de unión a antigeno de un anticuerpo descrito en el presente documento. (por ejemplo, pero sin limitación, un fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmento F(ab)2, un dominio VH, una CDR VH, un dominio VL o una CDR VL) y una proteina, un polipéptido o un péptido heterÓlogo. Se conocen en la técnica métodos para fusionar o conjugar proteinas, polipéptidos o péptidos con un anticuerpo (induyendo fragmentos de anticuerpo del mismo). Véase, por ejemplo, patentes de Estados Unidos N.O 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851 Y 5.112.946, patentes europeas N.OEP 307.434 Y EP 367.166; publicaciones intemacionales N.O WO 96f04388 y WO 91 /06570; Ashkenazi el al., 1991, Proc. NaU. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng el al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; y Vil el al., 1992, Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 89:11337-11341.

Pueden generarse proteinas de fusión adicionales mediante las técnicas de combinación de genes, combinación de motivos, combinación de exones yfo combinación de codones (denominadas colectivamente "combinación de ADN"). La combinación de ADN puede emplearse para alterar las actividades de anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos (por ejemplo, pero sin limitación, anticuerpos o fragmentos de los mismos con mayores afinidades y menores velocidades de disociación). Véase, en general, patentes de Estados Unidos N.O 5.605.793, 5.811.238,5.830.721,5.834.252 Y 5.837,458; Palien el al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson, el al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; y Lorenzo y 81asco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313. Los anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo de los mismos), o los anticuerpos codificados o fragmentos de los mismos, pueden alterarse sometiéndolos a mutagénesis aleatoria por PCR propensa a errores, inserción de nucleótidos aleatorios u otros métodos antes de la recombinación. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo (incluyendo fragmento de anticuerpo del mismo) del mismo puede recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc., de una o más moléculas heterólogas.

Además, los anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo de los mismos) pueden fusionarse con secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar la purificación. La secuencia de aminoácidos marcadora puede ser un péptido de hexa histidina tal como el marcador proporcionado en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles en el mercado. Como se describe en Gentz el al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, por ejemplo., la hexa histidina proporciona pUrificación conveniente de la prote¡na de fusión. Otros marcadores peptidicos útiles para la purificación incluyen, pero sin limitación, el marcador de hemaglutinina ("HA"), que corresponde a un epitopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson el al., 1984, Ce1l37:767), y el marcador "flag".

En otras realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgación o fragmentos de los mismos se conjugaron con un agente de diagnóstico o detectable. Dichos anticuerpos pueden ser útiles para controlar o pronosticar la aparición, el desarrollo, la progresión yfo la gravedad de una enfermedad o un trastorno (por ejemplo, pero sin limitación, un trastorno autoinmunitario) como parte de un procedimiento de ensayo clínico, tal como determinar la eficacia de una

terapia particular. Dicho diagnóstico y detección pueden conseguirse acoplando el anticuerpo con sustancias detectables incluyendo, pero sin limitación, diversas enzimas, tales como, pero sin limitación, peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, tales como, pero sin limitación, estreptavidinafbiotina y avidinalbiotina; materiales fluorescentes, tales como, pero sin limitación, umbeliferona, f1uoresceina, f1uoresceina isotiocianato, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloruro de dansilo

o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, pero sin limitación, luminol; materiales bioluminiscentes tales como, pero sin limitación, luciferasa, luciferina, y aequorina; materiales radiactivos, tales como, pero sin limitación, yodo (1311, 1251, 1231 Y 1211), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (1151n, 1131n, 1121n y 1111n), tecnecio (99Tc), talio (20Hi), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re,142 Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 17Sn; y metales emisores de positrones usando diversas tomografias de emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos.

Como alternativa , un anticuerpo puede conjugarse con un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo como se describe por Segal en patente de Estados Unidos. 4.676.980.

El resto terapéutico o fármaco conjugado con un antigeno de interés (por ejemplo IL-5R) o fragmento del mismo deberia elegirse para conseguir el efecto o los efectos terapéuticos o profilácticos deseados para una enfermedad o un trastorno particular, por ejemplo, una enfermedad o un trastorno asociado con o caracterizado por expresión ylo actividad aberrante de un polipéptido de interferón alfa, una enfermedad o un trastorno asociado con o caracterizado por la expresión ylo actividad aberrante del receptor de interferón alfa o una o más subunidades del mismo, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad autoinmunitaria, rechazo de trasplantes, enfermedad de injerto contra hospedador, o uno o más síntomas de los mismos, en un sujeto. Un personal clínico u otro médico deberian considerar lo siguiente cuando decida qué conjugar con un anticuerpo de interés, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente con un polipéptido de interferón alfa o fragmento del mismo: la naturaleza de la enfermedad, la gravedad de la enfermedad y la cond ición del sujeto.

Los anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo de los mismos) que se unen específicamente con un antígeno pueden producirse por cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular por sintesis quimica o por técnicas de expresión recombinante (véase, publicación de patente de Estados Unidos 2007/0014724A1).

Pueden producirse anticuerpos policlonales específicos para un antígeno por diversos procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un antigeno humano puede administrarse a diversos animales hospedadores incluyendo, pero sin limitación, conejos, ratones, ratas, etc., para inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales específicos para el antígeno humano. Pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedadora, e incluyen, pero sin limitación, Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacferium parvum. Tales adyuvantes también se conocen bien en la técnica.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales usando una amplia diversidad de técn icas conocidas en este campo incluyendo el uso de hibridoma, tecnologias recombinantes y de presentación en fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos monoclonales usando técnicas de hibridoma incluyendo las conocidas en este campo diseñadas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, za ed. 1988); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibod ies y T Cel! Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981), y Harlow et al., Using Antibodies: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999). La expresión "anticuerpo monodonal" como se usa en el presente documento no se limita a anticuerpos producidos mediante tecnologia de hibridoma. La expresión "anticuerpo monoclona1" se refiere a un anticuerpo que deriva de un único don, incluyendo cualquier don eucariota, procariota o de fago, y no al método por el que se produce.

Los métodos para producir y explorar con respecto a anticuerpos especificos usando tecnologia de hibridoma son rutinarios y se conocen bien en la técnica. Brevemente, los ratones pueden inmunizarse con un antígeno no murino y una vez que se ha detectado una respuesta inmunitaria, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos para el antígeno en el suero de ratón, se recoge el bazo del ratón y se aislan esplenocitos. Los esplenocitos se fusionan después por técnicas bien conocidas con cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo células de la línea celular $P20 disponibles de la ATCC. Los hibridomas se seleccionan y se clonan por dilución limitada. Adicionalmente, puede usarse una técnica RIMMS (sitios múltiples de inmunización repetitiva) para inmunizar a un animal (Kilpatrack er al., 1997, Hybridoma 16:381-9). Los clones de hibridoma se ensayan después por métodos conocidos en la técnica con respecto a células que secretan anticuerpos capaces de unirse con un polipéptido de la invención. Puede generarse líquido ascítico, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, inmunizando ratones con clones de hibridoma positivos.

La presente divulgación proporciona métodos para generar anticuerpos monoclonales asi como anticuerpos

producidos por el método que comprende cultivar una célula de hibridoma que secreta un anticuerpo de la invención en el que el hibridoma se genera fusionando esplenocitos aislados de un ratón inmunizado con un antígeno no murino con células de mieloma y explorando después los hibridomas resultantes de la fusión con respecto a clones de hibridoma que secretan un anticuerpo capaz de unirse con el antígeno.

Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopos particulares específicos por cualquier técnica conocida por expertos en la materia. Por ejemplo, pueden producirse fragmentos Fab y F(ab')2 de la invención por escisión proteolitica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaina (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada. Además, los anticuerpos de la presente divulgación también pueden generarse usando diversos métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica.

En métodos de presentación en fagos, se presentan dominios de anticuerpo funcionales en la superficie de particulas de fago que portan las secuencias de polinucleótidos que las codifican. En particular, se amplifican las secuencias de ADN que codifican dominios VH y VL de bibliotecas de ADNc de animales (por ejemplo, bibliotecas de ADNc humano o murino de tejidos afectados). El AON que codifica los dominios VH y VL se recombinan junto con un enlazador de scFv por PCR y se clonan en un vector fagémido. El vector se introduce por electroforación en

E. coH y la E. coH se infecta con fago auxiliar. Los fagos usados en estos métodos son típicamente fagos filamentosos incluyendo fd y M 13 Y los dominios VH y VL se fusionan habitualmente de forma recombinante con el gen 111 o gen VIII de fago. El fago que expresa un dominio en un anUgeno que se une con un antigeno particular puede seleccionarse o identificarse con anUgeno, por ejemplo, usando anUgeno marcado o anUgeno unido con o capturado en una superficie solida o perla. Los ejemplos de métodos de presentación de fagos que pueden usarse para realizar los anticuerpos de la presente divulgación incluyen los desvelados en Brinkman el al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames el al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kenleborough el al., 1994, Eur.

J. Immuno!. 24:952-958; Persic el al., 1997, Gene 187:9-18; Burton el al., 1994, Advances in Immunology 57:191280; solicitud intemacional N.O PCT/GB91/01 134; publicaciones internacionales N.O WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92fOl047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401 YW097/13844 ; y patentes de Estados Unidos N.O 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484, 5.580.717, 5.427.908, 5.750.753, 5.821.047, 5.571.698, 5.427.908, 5.516.637, 5.780.225, 5.658.727, 5.733.743, 5.969.108, 6.33.187, 5.824.520 Y 5.702.892.

Como se ha descrito en las referencias anteriores, después de la selección de fagos, las regiones codificantes de anticuerpo de los fagos pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión a antigeno deseado, y expresarse en cualquier hospedador deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levadura y bacterias, por ejemplo, como se describe posteriormente. También pueden emplearse técnicas para producir de fonna recombinante Fab, Fab' y F(ab')2 usando métodos conocidos en este campo tales como los desvelados en la publicación de PCT N.O WO 92/22324; MuUinax el al. , 1992, BioTechniques 12(6):864-869; Sawai el al., 1995, AJRI 34:26-34; Y Beller el al., 1988, Science 240:1041-1043.

Para generar anticuerpos completos, pueden usarse cebadores de PCR incluyendo secuencias de nucleótidos de VH o VL, un sitio de restricción, y una secuencia flanqueante para proteger el sitio de restricción para amplificar las secuencias de VH o VL en clones de scFv. Utilizando técnicas de clonación conocidas por los expertos en la materia, los dominios VH amplificados por PCR pueden clonarse en vectores que expresan una región constante VH, por ejemplo, la región constante gamma 4 humana, y los dominios VL amplificados por PCR pueden clonarse en vectores que expresan una región constante VL, por ejemplo, regiones constantes kappa o lamba humanas. Los vectores para expresar los dominios VH o VL pueden comprender un promotor de EF-1a, una señal de secreción, un sitio de clonación para el dominio variable, dominios constantes y un marcador de selección tal como neomicina. Los dominíos VH y VL también pueden clonarse en un vector que exprese las regíones constantes necesarias. Los vectores de conversión de cadena pesada y los vectores de conversión de cadena ligera se cotransfectan después en lineas celulares para generar lineas celulares estables o transitorias que expresan anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, pero sin limitaciones, IgG, usando técnicas conocidas por los expertos en la materia.

Para algunos usos, incluyendo uso in vivo de anticuerpos en seres humanos y ensayos de detección in vilra, puede ser apropiado usar anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos. Son particularmente deseables anticuerpos completamente humanos y anticuerpos humanizados para tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Pueden prepararse anticuerpos humanos por una diversidad de métodos conocidos en la técnica incluyendo métodos de presentación en fagos descritos anteriormente usando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Véase también patentes de Estados Unidos N.O 4.444.887 Y 4.716.111 ; Y publicaciones intemacionales N.O WO 98/46645, WO 98/50433, WO 96/24893, W098/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO

91 /10741.

También pueden producirse anticuerpos humanos usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos de genes de inmunoglobulina de cadena pesada y cadena ligera pueden introducirse aleatoriamente o por recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. Como altemativa, la región variable humana, región constante y región de diversidad pueden introducirse en células madre embrionarias de

ratón además de los genes de cadena pesada y ligera humanos. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y liguera de ratón pueden hacerse no funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de loci de inmunoglobulina humana por recombinadón homóloga. En particular, la deleción homocigota de la región JH evita la producción de anticuerpos endógena. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y se microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos se crian después para producir una descendencia homocigota que expresa anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de una manera normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o una parte de un polipéptido de la invención. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales di rigidos contra el antigeno de los ratones inmunizados, transgénicos, usando tecnologia de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de linfocitos B, y posteriormente experimentan cambio de clase y mutación somática. Por lo tanto, usando dicha técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión de conjunto de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65 93). Para un análisis detallado de esta tecnologia para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir dichos anticuerpos, véase, por ejemplo, publicaciones intemacionales N.O WO 98f24893, WO 96f34096 y WO 96f33735; y patentes de Estados Unidos N.O 5.413.923, 5.625.126, 5.633.425, 5.569.825, 5.661.016, 5.545.806, 5.814.318 Y 5.939.598. Además, puede contactarse con compañ¡as tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) y Genphann (San Jose, CA) para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando tecnolog¡a similar a la descrita anteriormente.

Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes partes del anticuerpo derivan de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Se conocen en la técnica métodos para producir anticuerpos quiméricos. Véase, por ejemplo, Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi el al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Melhods 125:191-202; y patente de Estados Unidos N.O 5.807.715, 4.816.567, 4.816.397 Y 6.331.415.

Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo o su variante o fragmento del mismo que es capaz de unirse con un antigeno predeterminado y que comprende una región marco conservada que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una CDR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv) en los que todas, o sustancialmente todas, las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donante) y todas, o sustancialmente todas, las regiones marco conservadas corresponden a las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. En una realización de la divulgación, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobina humana. Habitualmente, el anticuerpo contendrá tanto la cadena ligera como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. El anticuerpo humanizado puede seleccionarse de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgG1 , IgG2, IgG3 e IgG4. Habitualmente el dominio constante es un dominio constante de fijación del complemento en el que se desea que el anticuerpo humanizado muestre actividad citotóxica, y la clase es tipicamente IgG1. Cuando dicha actividad citotóxica no es deseable, el dominio constante puede ser de la clase IgG2. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo, y la selección de dominios constantes particulares para optimizar funciones efectoras deseadas está dentro de la experiencia habitual de la técnica. No es necesario que las regiones marco conservadas y CDR de un anticuerpo humanizado correspondan con precisión a las secuencias parentales, por ejemplo, la CDR donante o el marco conservado consenso pueden mutarse por sustitución, inserción o deleción de al menos un resto de modo que el resto de CDR o marco conservado en ese sitio no corresponda al anticuerpo consenso o al importado. Dichas mutaciones, sin embargo, no serán extensivas. Habitualmente, al menos el 75 % de los restos de anticuerpo humanízado corresponderán a los de las secuencias marco conservado y CDR parentales, con más frecuencia 90 %, y más del 95 %. Puede producirse anticuerpo humanizado usando una diversidad de técnicas conocidas en este campo, incluyendo pero sin limitación, injerto de CDR (patente europea N.O EP 239.400; publicación intemacional N.O WO 91f09967; y patentes de Estados Unidos N.O 5.225.539, 5.530.101 Y 5.585.089), revestimiento

o cambio de superficie (patentes europeas N.O EP 592.106 Y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4f5):489-498; Studnicka el al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; y Roguska el al., 1994, PNAS 91 :969973), redistribución de cadenas (patente de Estados Unidos N.O 5.565.332), Y técnicas desveladas, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.O 6.407.213, patente de Estados Unidos N.O 5.766.886, documento WO 9317105, Tan el al., J. Immunol. 169:111925 (2002), Caldas el al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000), Morea el al., Methods 20(3):26779 (2000), Baca el al., J. Biol. Chem. 272(16):10678 84 (1997), Roguska el al., Protein Eng. 9(10):895 904 (1996), Couto el al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s 5977s (1995), Couto el al., Cancer Res. 55(8):1717 22 (1995), Sandhu JS, Gene 150(2):409 10 (1994), Y Pedersen el al., J. Mol. Biol. 235(3):95973 (1994). Con frecuencia, los restos marco conservados en las regiones marco conservadas se sustituiran con el resto correspondiente del anticuerpo donante de CDR para allerar, preferentemente mejorar, la unión a antigeno. Estas sustituciones de marco conservado se identifican por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, pero sin limitación, por modelización de las interacciones de los restos de COR y marco conservado para identificar restos de marco conservado importantes para la unión a antigeno y comparación de secuencias para identificar restos de marco conservado poco habituales en posiciones particulares (véase, por ejemplo, Queen el al., patente de Estados Unidos

N.O5.585.089; Y Riechmann el al., 1988, Nature 332:323.

Pueden introducirse anticuerpos de único dominio, por ejemplo, anticuerpos que carecen de las cadenas ligeras, por métodos bien conocidos en la técnica. Véase Riechma nn el al., 1999, J. Immuno. 231:25-38; Nuttall el al., 2000, Curr. Pharm. Biotechnol. 1(3):253-263; Muylderman, 2001 , J. Biotechnol. 74(4):277302; Patente de Estados Unidos

N.O 6.005.079; Y publicaciones internacionales N.O WO 94104678, WO 94f25591 , y WO 01f44301.

Además, los anticuerpos que se unen especificamente con un antigeno (por ejemplo IL-5R) pueden, a su vez, utilizarse para generar anticuerpos antiidiotipicos que "imitan" un antigeno usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Greenspan y Bona, 1989, FASEB J. 7(5):437-444; y Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8):2429-2438).

La expresión recombinante de un anticuerpo de la divulgación (por ejemplo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo de la divulgación o un fragmento del mismo o un anticuerpo monocatenario de la invención) puede requerir la construcción de un vector de expresión que contenga un polinucleótido que codifica el anticuerpo. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo, cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o fragmento del mismo, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede producirse por tecnologia de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en este campo. Por lo tanto, se describen en el presente documento métodos para preparar una proteina expresando un polinucleótido que contenga una secuencia de nucleótidos que codifique un anticuerpo. Pueden usarse métodos que se conocen bien por los expertos en la materia para construir vectores de expresión que contengan secuencias codificantes de anticuerpo y señales de control de la trascripción y la traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. La invención, por lo tanto, proporciona vectores replicables que comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo de la invención, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, un dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo (incluyendo fragmento de anticuerpo del mismo) o una CDR de cadena pesada o ligera, unida operativamente con un promotor. Dichos vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, publicación internacional N.O WO 86f05807; publicación internacional N.O WO 89f01036; y patente de Estados Unidos N.O 5.122.464) Y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en dicho vector para expresión de la cadena pesada completa, la cadena ligera completa, o las cadenas tanto pesada como ligera completas.

El vector de expresión se transfiere a una célula hospedadora por técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan después por técnicas convencionales para producir un anticuerpo de la invención. Por lo tanto, la divulgación incluye células hospedadoras que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la invención o fragmentos del mismo, o una cadena pesada o ligera del mismo, o fragmento del mismo, o un anticuerpo monocatenario de la divulgación unido operativamente con un promotor heterólogo. En realizaciones especificas de la divulgación para la expresión de anticuerpos de doble cadena, pueden coexpresarse vectores que codifican las cadenas tanto pesada como ligera en la célula hospedadora para expresión de la molécula de inmunoglobina completa, como se detalla posteriormente.

Puede utilizarse una diversidad de sistemas de vector de expresión-hospedador para expresar las moléculas de anticuerpo de la invención (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos N.O 5.807.715). Dichos sistemas de expresión-hospedador representan vehiculos por los que las secuencias codificantes de interés pueden producirse y posteriormente purificarse, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, expresar una molécula de anticuerpo de la divulgación in situ. Estos incluyen pero sin limitación microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, pero sin limitación, E. coli y B. sublilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago, ADN plasminico o ADN cosmidico que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; levadura (por ejemplo, pero sin limitación, Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, pero sin limitación, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, pero sin limitación, virus del mosaico de la coliftor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión plasmidicos recombinantes (por ejemplo, pero sin limitación, plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos;

o sisterna celulares de mamiferos (por ejemplo, pero sin limitación, células COS, CHO, BHK, 293, NSO y 3T3) que albergan construcciones de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamifero (por ejemplo, pero sin limitación, promotor de metalotioneina) o de virus de mamiferos (por ejemplo, pero sin limitación, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de 7,5K de virus vaccinia). Se usan células bacterianas tales como Escherichia coli, y células eucariotas, especialmente para la expresión de molécula de anticuerpo recombinante completa, para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, células de mamifero tales como células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector tal como el elemento promotor de gen temprano intermedio principal de citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking el al., 1986, Gene 45:101; y Cockett el al., 1990, BiofTechnology 8:2). En una realización especifica de la divulgación, la expresión de secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos de la invención, derivados, análogos o fragmentos de los mismos está regulada por un promotor constitutivo, promotor inducible o promotor espeCifico de tejido.

En sistemas bacterianos, varios vectores de expresión pueden seleccionarse provechosamente dependiendo del uso pretendido para la molécula de anticuerpo que se expresa. Por ejemplo, cuando va a producirse una gran cantidad de dicho anticuerpo, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos proteicos de fusión que se purifiquen fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero sin limitación, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther el al., 1983, EMBO 12:1791), en el que la secuencia codificante de anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en fase con la región codificante de lac Z de modo que se produzca una proteina de fusión; vectores plN (Inouye e Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke y Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:55035509); y similares. También pueden usarse vectores pGEX para expresar polipéptidos ajenos como prote¡nas de fusión con glutatión 5-transferasa (GST). En general, dichas prote¡nas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas por adsorción y unión con perlas de agarosa de glutatión de matriz seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores de pGEX se diseñan para incluir sitios de escisión por proteasa de trombina o factor Xa, de modo que el producto génico diana clonado pueda liberarse del resto de GST.

En un sistema de insecto, se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa califomica (AcNPV) para expresar genes ajenos. El virus crece en células de Spodoplera frugiperda. La secuencia codificante de anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo el promotor de polihedrina).

En células hospedadoras de mamifero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus. En casos en los que se use un adenovirus como un vector de expresión, la secuencia codificante de anticuerpo de interés puede ligarse con un complejo de control de las transcripciónltraducción de adenovirus, por ejemplo, la secuencia lider tripartita y promotora tard¡a. Este gen quimérico puede insertarse después en el genoma de adenovirus por recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región El o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de anticuerpo en hospedadores infectados (por ejemplo, véase Logan y Shenk, 1984, Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 8 1 :355-359). También pueden requerirse señales de inicio especificas para la traducción eficaz de secuencias codificantes de anticuerpo insertadas. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de inicio debe estar en fase con la fase de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales de control de la traducción exógenas y codones de inicio pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados, tenninadores de la transcripción, etc. (véase, por ejemplo, Bittner etal., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544).

Además, puede seleccionarse una cepa de célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico de la manera especifica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, pero sin limitación, glucosilación) y procesamiento (por ejemplo, pero sin limitación, escisión) de productos proteicos puede ser importante para la función de la proteina. Diferentes células hospedadoras tienen mecanismos caracteristicos y espec¡ficos para el procesamiento postraduccional y la modificación de prote¡nas y productos génicos. Podr¡an seleccionarse lineas celulares o sistemas de hospedadores apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la prote¡na ajena expresada. Para este fin, pueden usarse células hospedadoras eucariotas que posean la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, glucosilación y fosforilación del producto génico. Dichas células hospedadoras de mam¡fero incluyen pero sin limitación células CHO, VERV, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 Y T47O, NSO (u na linea celular de mieloma murina que no produce de fonna endógena ninguna cadena de inmunoglobulina), CRL7030 y HsS78Bsl.

Para producción de alto rendimiento, a largo plazo, de proteinas recombinantes, puede usarse expresión estable. Por ejemplo, pueden modificarse técnicamente lineas celulares que expresen de forma estable la molécula de anticuerpo. En lugar de usar vectores de expresión que contengan or¡genes virales de replicación, las células hospedadoras pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN ajeno, puede pennitirse que las células modificadas técnicamente crezcan durante 1-2 d¡as en un medio enriquecido, y después se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crecer para fonnar focos que a su vez puedan clonarse y expandirse en lineas celulares. Este método puede usarse provechosamente para modificar técnicamente lineas celulares que expresen la molécula del anticuerpo. Dichas lineas celulares modificadas técnicamente pueden ser particularmente útiles en la exploración y evaluación de composiciones que interaccionen directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.

En una realización de la divulgación, la linea celular usada para expresar la molécula de unión a IL-5R es una célula que no fucosila la región Fc de la molécula de unión a IL-5R. Se encuentran ejemplos no limitantes de estos tipos de células en la patente de Estados Unidos N.O 6.946.292 Y publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos N°. 2006/0078991Al , 2004/0110282Al , 2006f0024800Al , 2005f0216958Al , 2004/0132140 y 2004f0259150 . En una realización no especifica de la divulgación, la molécula de unión a IL-5R es un anticuerpo monoclonal IgG1

humanizado, afucosilado, anti cadena a de IL-5R. De acuerdo con la invención, el anticuerpo es MEDI-563 (también conocido como BIW-8405). En una realización especifica adicional más de la divulgación, el anticuerpo no es MEDI

563.

Pueden usarse varios sistemas de selección, incluyendo, pero sin limitación, emplear los genes de timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler el al., 1977, Cell 11 :223), hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202), y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy el al., 1980, Cell 22:8-17) en células tk-, hgprt-o aprt-, respectivamente. Además, puede usarse resistencia a antimetabolitos como la base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al. , 1980, Natl. Acad. Sei. USA 77:357; Q'Hare el al., 1981, Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5): 155-2 15); e higro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre el al., 1984, Gene 30:147). Pueden aplicarse rutinariamente métodos conocidos habitualmente en la técnica de tecnología de ADN recombinante para seleccionar el clon recombinante deseado, y dichos métodos se describen, por ejemplo, en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer y Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); Y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al. , 1981 , J. Mol. Biol.

150:1.

Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden aumentarse por amplificación de vector (para una revisión véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vo1.3. (Academic Press, Nueva York, 1987»). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa anticuerpo es amplificable, el aumento del nivel de inhibidor presente en cultivo de células hospedadoras aumentará el número de copias del gen marcador. Ya que la reg ión amplificada se asocia con el gen de anticuerpo, también aumentara la producción del anticuerpo (Crouse el al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).

La célula hospedadora puede cotransfectarse con dos vectores de expresión de la invención, codificando el primer vector un polipéptido derivado de cadena pesada y codificando el segundo vector un potipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la expresión igual de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Como altemativa, puede usarse un único vector que codifica, y es capaz de expresar, polipéptidos tanto de cadena pesada como ligera. En dichas situaciones, la cadena ligera deberia colocarse antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; y Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2 197). Las secuencias cedificantes para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc o ADN genómico.

Una vez que se ha producido una molécula de anticuerpo de la invención por expresión recombinante, se puede purificar por cualquier método conocido en la técnica para purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografia, (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad por el antrgeno especifico después de proteina A y cromatografia en columna por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Además. los anticuerpos de la presente divulgación o fragmentos de los mismos pueden fusionarse con secuencias polipeptidicas heterólogas descritas en el presente documento o conocidas de otro medo en la técnica para facilitar la purificación.

Para las moléculas de unión a IL-5R (por ejemplo anticuerpos, proteínas, polipéptidos, péptidos y proteinas de fusión) abarcadas por la divulgación, la dosificación administrada a un paciente es tipicamente de 0,0001 mglkg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Preferentemente, la dosificación administrada a un paciente es de entre 0,0001 mg/kg y 20 mgfkg, 0,0001 mg/kg y 10 mg/kg, 0,0001 mglkg y 5 mg/kg, 0,0001 y 2 mg/kg, 0,0001 y 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 0,75 mglkg, 0,0001 mgf1<g y 0,5 mgfkg, 0,0001 mgfkg a 0,25 mg/kg, 0,0001 a O, 155 mg/kg, 0,0001 a 0,10 mg/kg, 0,001 mgfkg a 0,5 mg/kg, 0,01 mg/kg a 0,25 mg/kg o 0,01 mg/kg a 0,10 mg/kg del peso corporal del paciente. En general, los anticuerpos humanos tienen una semivida más larga dentro del cuerpo humano que los anticuerpos de otra especie debido a la respuesta inmunitaria a los polipéptidos ajenos. Por lo tanto, son posibles con frecuencia menores dosificaciones de anticuerpos humanos y la administración menos frecuente. Además, la dosificación y frecuencia de administración de anticuerpos de la divulgación o fragmentos de los mismos puede reducirse potenciando la captación y penetración tisular de los anticuerpos por modificaciones tales como, por ejemplo, lipidación.

En una realización espeCifica de la divulgación, la dosificación de la molécula de unión a IL-5R administrada para prevenir, tratar, controlar y/o aliviar una enfermedad o uno o mas sintomas de la misma en un paciente es de 150 1J9lkg o menos, preferentemente 125IJglkg o menos, 100 1J9/kg o menos, 95IJg/kg o menos, 90 1J9lkg o menos, 85 IJg/kg o menos, 80 IJg/kg o menos, 75 IJgfkg o menos, 70 IJglkg o menos, 65 IJglkg o menos, 60 IJg/kg o menos, 55 IJg/kg o menos, 50 IJg/kg o menos, 45 IJg/kg o menes, 40 IJgfkg o menos, 35 IJgfkg o menos, 30 IJg/kg o menos, 251J9/kg o menos, 20 ¡Jg/kg o menos, 15IJglkg o menos, 10 1J9/kg o menos, 5IJglkg o menos, 2,51J9/kg o menos, 2 IJglkg o menos, 1,5 IJg/kg o menos, 1 ¡Jg/kg o menos, 0,5 IJg/kg o menos, o 0,5 IJglkg o menos del peso corporal de un paciente. En otra realización de la divulgación, la dosificación de las moléculas de unión a IL-5R de la divulgación

administrada para prevenir, tratar, controlar y/o aliviar una enfermedad hiperproliferativa, o uno o más sintomas de la misma en un paciente son una dosis unitaria de 0,1 mg a 20 mg, 0,1 mg a 15 mg, 0,1 mg a 12 mg, 0,1 mg a 10 mg, 0,1 mg a 8 mg, 0,1 mg a 7 mg, 0,1 mg a 5 mg, 0,1 a 2,5 mg, 0,25 mg a 20 mg, 0,25 a 15 mg, 0,25 a 12 mg, 0,25 a 10 mg, 0,25 a 8 mg, 0,25 mg a 7m g, 0,25 mg a 5 mg, 0,5 mg a 2,5 mg, 1 mg a 20 mg, 1 mg a 15 mg, 1 mg a 12 mg, 1 mg a 10 mg, 1 mg a 8 mg, 1 mg a 7 mg, 1 mg a 5 mg, o 1 mg a 2,5 mg.

En otras realizaciones de la divulgación, se administra a un sujeto una o más dosis de una cantidad eficaz de una o terapias de la divulgación en las Que la dosis de una cantidad eficaz consigue un titulo de suero de al menos 0,1 IJg/ml, al menos 0,5IJgfml, al menos 1 IJg/ml, al menos 2lJgfml, al menos 5lJgfml, al menos 61J9/ml. al menos 10 IJg/ml, al menos 15 IJg/ml, al menos 20 IJg/ml, al menos 25 IJg/ml, al menos 50 IJgfml, al menos 100 IJglml, al menos 1251J9/ml, al menos 150 IJg/ml, al menos 175IJQfml, al menos 200 IJg/ml, al menos 225 IJg/ml, al menos 250 IJg/ml, al menos 275 IJg/ml, al menos 300 IJgfml, al menos 325 IJg/ml, al menos 350 IJgfml, al menos 375 IJgfml,

o al menos 400 IJgfml de las terapias de la invención. En otras realizaciones más de la divulgación, se administra a un sujeto una dosis de una cantidad eficaz de una de las moléculas de unión a IL-5R de la divulgación para conseguir un título de suero de al menos 0,1 IJgfml, al menos 0,5 IJgfml, al menos 1 IJglml, al menos, 2lJgfml, al menos 5lJg/ml, al menos 6lJgfml, al menos 10 IJgfml, al menos 15lJgfml, al menos 20 IJglml, al menos 251Jg/ml, al menos 50 IJg/ml, al menos 100 IJgfml, al menos 1251J9'ml, al menos 150 IJglml, al menos 1751Jgfml, al menos 200 IJg/ml, al menos 225 IJg/ml, al menos 250 IJgfml, al menos 275 IJg/ml, al menos 300 IJgfml, al menos 325 IJgfml, al menos 350 IJgfml, al menos 375 IJgfml, o al menos 400 IJgfml de la molécula de unión a IL-5R y se administra una dosis posterior de una cantidad eficaz de una o más moléculas de unión a IL-5R de la divulgación para mantener un titulo de suero de al menos 0,1 IJg/ml, 0,5 IJgfml, 1 IJg/ml, al menos, 2 IJg/ml, al menos 5 IJg/ml, al menos 6 IJglml, al menos 10 IJgfml, al menos 151Jg/ml, al menos 20 IJgfml, al menos 25lJgfml, al menos 50 IJgfml, al menos 100 IJgfml, al menos 125IJg/ml, al menos 150 IJg/ml, al menos 175 IJgfml, al menos 200 IJgfml, al menos 225IJg/ml. al menos 250 IJg/ml, al menos 275 IJg/ml, al menos 300 IJgfml, al menos 325 IJg/ml, al menos 350 IJgfml, al menos 375 IJgfml,

o al menos 400 IJgfml. De acuerdo con estas realizaciones de la divulgación, pueden administrarse al sujeto 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más dosis posteriores.

En una realización especifica, la divulgación proporciona métodos para prevenir, tratar, controlar o aliviar una enfermedad mediada por eosinófilos o uno o más sintomas de la misma, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto que lo necesita una dosis de al menos 10 IJg, preferentemente al menos 151Jg, al menos 20 IJg. al menos 251Jg, al menos 30 IJg, al menos 35 IJg, al menos 40 IJg, al menos 451Jg, al menos 50 IJg. al menos 55 IJg, al menos 60 IJg, al menos 65 IJg, al menos 70 IJg, al menos 751Jg, al menos 80 IJg, al menos 85 IJg. al menos 90 IJg, al menos 951Jg, al menos 100 IJg, al menos 1051Jg, al menos 110 IJg, al menos 1151Jg, o al menos 120 IJg de una o más terapias (por ejemplo, agentes terapéuticos o profilácticos), terapias de combinación o composiciones de la invención. En otra realización, la divulgación proporciona un método para prevenir, tratar, controlar yfo aliviar una enfermedad o un trastorno mediado por eosinófilos o uno o más síntomas del mismo, comprendiendo dichos métodos administrar a un sujeto Que lo necesite una dosis de al menos 10 IJg, preferentemente al menos 151Jg, al menos 20 IJg, al menos 25 IJg, al menos 30 IJg, al menos 35 IJg, al menos 40 IJg, al menos 45 IJg, al menos 50 IJg, al menos 55 IJg, al menos 60 IJg, al menos 65 IJg, al meros 70 IJg, al menos 75 IJg, al menos 80 IJg, al menos 85 IJg, al menos 90 IJg, al menos 951Jg, al menos 100 IJg, al menos 1051Jg, al menos 110 IJg, al menos 1151Jg, o al menos 120 IJg de una o más moléculas de unión a IL-5R, terapias de combinación, o composiciones de la invención una vez cada 3 días. preferentemente. una vez cada 4 días. una vez cada 5 días, una vez cada 6 días, una vez cada 7 días, una vez cada 8 días, una vez cada 10 días, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, o una vez al mes.

La presente divulgación proporciona métodos para prevenir, tratar, controlar o prevenir un trastorno o una enfermedad mediado por eosinófilos o uno o más sintomas del mismo, comprendiendo dicho método: (a) administrar a un sujeto Que lo necesite una o más dosís de una cantidad profiláctica o terapéutícamente eficaz de una o más moléculas de unión a IL-5R, terapias de combinación o composiciones de la divulgación; y (b) controlar el nivelfconcentración en plasma de dichas moléculas de unión a IL-5R administradas en dicho sujeto después de la administración de un cierto número de dosis de dichas terapias (por ejemplo, agentes terapéuticos o profilácticos). Además, preferentemente, dicho cierto número de dosis es 1,2, 3, 4, 5, 6. 7, 8, 9, 10, 11, o 12 dosis de una cantidad profiláctica o terapéutica mente eficaz de una o más moléculas de unión a IL-5R, composiciones o terapias de combinación de la divulgación. En una realización especifica, la divulgación proporciona un método para prevenir, tratar, controlar yfo aliviar un trastomo o una enfermedad mediado por eosinófilos o uno o más sintomas del mismo, comprendiendo dicho método: (a) administrar al sujeto que lo necesite una dosis de al menos 10 IJg (preferentemente al menos 151Jg, al menos 20 IJg, al menos 25 IJg, al menos 30 IJg, al meros 35 IJg, al menos 40 IJg, al menos 45 IJg, al menos 50 IJg, al menos 55 IJg, al menos 60 1J9, al menos 65 IJg, al menos 70 IJg, al menos 75 1J9, al menos 80 IJg, al menos 85 IJg, al menos 90 IJg, al menos 95 1J9, o al menos 100 IJg) de una o mas terapias (por ejemplo, agentes terapéuticos o profilácticos) de la invención; y (b) administrar una o más dosis posteriores a dicho sujeto cuando el nivel en plasma de la molécula de unión a IL-5R administrada en dicho sujeto sea menor de 0,1 IJglml, preferentemente menor de 0,25 IJgfml, menor de 0,5 IJglml, menor de 0,75 IJg/ml. o menor de 1 IJg/ml. En otra realización, la divulgación proporciona un método para prevenir, tratar, controlar y/o aliviar un trastomo o una enfermedad mediado por eosinófilos o uno o más sintomas del mismo, comprendiendo dicho método: (a) administrar a un sujeto Que lo necesita una o más dosis de al menos 10 IJg (preferentemente al menos 151Jg, al menos 20 IJg, al menos 25IJg, al

menos 30 IJg, al menos 35 IJg, al menos 40 IJg, al mel"(ls 45 IJg, al menos 50 IJg, al menos 55 IJg, al menos 60 IJg, al menos 65 1-19, al menos 70 1-19, al menos 75 1-19, al mel"(ls 80 1-19, al menos 85 1-19, al menos 90 1-19, al menos 95 1-19, o al menos 100 IJg) de una o más moléculas de unión a IL-5R de la divulgación; (b) controlar el nivel en plasma de las moléculas de unión a IL-5R administradas en dicho sujeto después de la administración de un cierto número de dosis; y (c) administrar una dosis posterior de moléculas de unión a IL-5R de la divulgación cuando el nivel en plasma de la molécula de unión a IL-5R administrada en dicho sujeto sea menor de 0,1 I-Ig/ml, preferentemente menor de 0,25I-1glml, menor de 0,5I-1g/ml, menor de 0,75I-1glml, o menor de 1 I-Iglml. En ciertas realizacones de la divulgación, dicho ciertos número de dosis es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 dosis de una cantidad eficaz de una

o más moléculas de unión a IL-5R de la divulgación.

Las terapias (por ejemplo, agentes terapéuticos o profilácticos), distintos de las moléculas de unión a IL-5R de la divulgación, que se han usado o se están usando en la actualidad para prevenir, tratar, controlar y/o aliviar una enfermedad proliferativa o uno o más síntomas de la misma pueden administrarse en combinación con una o más moléculas de unión a IL-5R de acuerdo con los métodos de la divulgación para tratar, controlar, prevenir yfo aliviar un trastorno o una enfermedad mediado por eosinófilos o uno o más síntomas del mismo. Preferentemente, las dosificaciones de agentes profilácticos o terapéuticos usados en terapias de combinación de la invención son menores que las que se han usado o se están usando en la actualidad para prevenir, tratar, controlar yfo aliviar un trastorno o una enfermedad mediado por eosinófilos o uno o más síntomas del mismo. Las dosificaciones recomendadas de agentes usados actualmente para la prevención, tratamiento, control o alivio de una enfermedad proliferativa o uno o más síntomas de la misma pueden obtenerse de cualquier referencia en la técnica incluyendo, pero sin limitación, Hardman et al., eds., 2001, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Basis of Therapeutics, 10a ed. , McGraw-HiU, Nueva York; Physician's Oesk Reference (POR) 58a ed., 2004, Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ.

En diversas realizaciones de la divulgación, las terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) se administran con menos de 5 minutos de separación, menos de 30 minutos de separación, 1 hora de separación, aproximadamente 1 hora de separación, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas de separación, aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas de separación, aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas de separación, aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas de separación, aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas de separación, aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas de separación, aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas de separación, aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas de separación, aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas de separación, aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas de separación, aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas de separación, aproximadamente 12 horas a 18 horas de separación, 18 horas a 24 horas de separación, 24 horas a 36 horas de separación, 36 horas a 48 horas de separación, 48 horas a 52 horas de separación, 52 horas a 60 horas de separación, 60 horas a 72 horas de separación, 72 horas a 84 horas de separación, 84 horas a 96 horas de separación, o 96 horas a 120 horas de separación. En otras realizaciones, se administran dos o más terapias dentro de la misma visita del paciente.

A continuación si no se indica de otro modo, los términos "realización" o "realizaciones" se refieren a realizaciones de la divulgación.

En ciertas realizaciones, una o más moléculas de unión a IL-5R de la divulgación y una o más terapias adicionales (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) se administran de forma cíclica. La terapia cíclica implica la administración de una primera terapia (por ejemplo, un primer agente profiláctico o terapéutico) durante un periodo de tiempo, seguido de la administración de una segunda terapia (por ejemplo, un segundo agente profiláctico o terapéutico) durante un periodo de tiempo, opcionalmente, seguido de la administración de una tercera terapia (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutico) durante un periodo de tiempo y así sucesivamente, y repetir esta administración secuencial, es decir, el ciclo para reducir el desarrollo de resistencia a una de las terapias, para evitar

o reducir los efectos secundarios de una de las terapias yfo para mejorar la eficacia de las terapias.

En ciertas realizaciones, la administración de la misma molécula de unión a IL-5R de la divulgación puede repetirse y las administraciones pueden separarse por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 dias, 3 meses, o al menos 6 meses. En otras realizaciones, la administración de la misma terapia (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutíco) distinta de una molécula de unión a IL-5R de la divulgación puede repetirse y la administración puede separarse por al menos 1 día, 2 dias, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 dias, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses, o al menos 6 meses.

En una realización específica, la molécula de unión a IL-5R se administra como una única dosis intravenosa de 0,03 mg/kg.

La presente divulgación proporciona métodos para prevenir, tratar, controlar o prevenir un trastorno o una enfermedad mediado por eosinófilos o uno o más síntomas del mismo, comprendiendo dicho método: (a) administrar al sujeto que lo necesite una o más dosis de una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una o más moléculas de unión a IL-5R, terapias de combinación o composiciones de la divulgación; y (b) controlar al menos un indicador o sintoma de enfermedad en el sujeto antes de y después de la administración de una o más dosis de

dichas terapias (por ejemplo, agentes terapéuticos o profilácticos).

En una realización, el sujeto padece EPOC.

5 En una realización, el sujeto padece asma persistente leve o intermitente leve como se define por el informe de panel de expertos de 2002 del NAEPP.

En una realización, el indicador o sintoma de enfermedad en el sujeto se controla antes de y después de la administración de una única dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En otra realización, el indicador o 10 síntoma de enfermedad en el sujeto se controla antes de y después la administración de múltiples dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R.

En una realización, el indicador o síntoma de enfermedad es una mutación de sintoma de asma autoevaluada. Un ejemplo no limitante de una puntuación de sintoma de asma es una puntuación autoevaluada registrada diariamente

15 por el sujeto en casa. La puntuación clasifica los síntomas del asma durante las últimas 24 horas, basándose en la gravedad de los síntomas matutinos, nocturnos y durante el día. Los síntomas y las puntuaciones asignadas se describen en la Tabla 1. La puntuación máxima diaria es de 9, la minima es de O. Los sujetos se autoevalúan y registran de manera continua.

20 Tabla 1. Clave de puntuación de sintoma de asma. Nocturno dura desde irse a la cama hasta despertarse por la mañana. Matutino dura desde despertarse hasta una hora después de despertarse. Durante el dia comienza 1 hora despuédde espertarse V termina en e momento ds I e Irse a a cama. I

intomas nocturnos

ro me desperté debido a problemas respiratorios.

~~ desperté una vez debido a mis problemas respiratorios, pero no usé

mi medicación de rescate .

~e desperté una vez debido a mis problemas de respiración, pero mi medicación de rescate controló mis síntomas.

~e desperté más de una vez debido a mis problemas respiratorios, ero mi medicación de rescato controló mis sintomas.

uve dificultad para dormir debido a mis problemas respiratorios incluso unque usé mis medicaciones de rescate.

intomas matutinos

~o

;

intomas durante el dia

in síntomas en absoluto; actividad no restringida.

os sintomas provocaron poca o ninguna incomodidad; actividad no

estringida. os sintomas provocaron alguna incomodidad; en ocasiones limitando a actividad extenuante. os sintomas provocaron incomodidad moderada: en ocasiones imitando la actividad rutinaria. os sintomas se produjeron en reposo, provocando incomodidad otable, y habitualmente actividad rutina ria limitada.

En una realización , un sujeto tiene una puntuación de sintomas de asma de X antes de la administración de la o las

25 dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R y una puntuación de sintomas de asma de X-Y después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R, en la que X es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9, en la que Y es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9, y en la que la puntuación postadmínistración nunca está por debajo de O.

En una realización , un sujeto tiene una puntuación de síntomas de asma de entre Oy 9 antes de la admin istración de

30 la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una puntuación de sintomas de asma entre O y 3, entre 1 y 4, entre 2 y 5, entre 3 y 5, entre 4 y 7, entre 5 y 8 o entre 6 y 9 antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización , un sujeto tiene una puntuación de sintomas de asma de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una puntuación de sintomas de asma de 1

antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-SR. En una realización , un sujeto tiene una puntuación de síntomas de asma de 2 antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una puntuación de sintomas de asma de 3 antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una puntuación de sintomas de asma de 4 antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-SR. En una realización , un sujeto tiene una puntuación de sintomas de asma de 5 antes de la administración de una o más dosis de una o más moléculas de unión a IL-SR. En una realización, un sujeto tiene una puntuación de sintomas de asma de 6 antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización , un sujeto tiene una puntuación de sintomas de asma de 7 antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-SR. En una realización, un sujeto tiene una puntuación de síntomas de asma de 8 antes de la administracíón de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-SR. En una realízación, un sujeto tiene una puntuación de síntomas de asma de 9 antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-SR.

En una realización, un sujeto tiene una puntuación de síntomas de asma de entre Oy 9 después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una puntuación de sintomas de asma entre Oy 3, entre 1 y 4, entre 2 y 5, entre 3 y 5, entre 4 y 7, entre 5 y 8 o entre 6 y 9 después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una puntuación de sintomas de asma de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-SR. En una realización, un sujeto tiene una puntuación de sintomas de asma de 1 después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización , un sujeto tiene una puntuación de síntomas de asma de 2 después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una puntuación de sintomas de asma de 3 después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-SR. En una realización , sujeto tiene una puntuación de síntomas de asma de 4 después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una puntuación de síntomas de asma de 5 después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una puntuación de sintomas de asma de 6 después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-SR. En una realización, un sujeto tiene una puntuación de sintomas de asma de 7 después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una puntuación de síntomas de asma de 8 después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-SR. En una realización , un sujeto tiene una puntuación de sintomas de asma de 9 después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-SR.

En una realización, la puntuación de sin tomas de asma de un sujeto es menor después de la administración de una o más dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R que antes de la administración de una o más dosis de una o más moléculas de unión a IL-SR en la que la puntuación después de la administración nunca es menor de O. En una realización especifica, la puntuación de sintomas de asma es 1 punto menor. En una realización específica, la puntuación de síntomas de asma es 9 puntos menor. En una realización específica, la puntuación de síntomas de asma es 2 puntos menor. En una realización especifica, la puntuación de sintomas de asma es 3 puntos menor. En una realización especifica, la puntuación de sintomas de asma es 4 puntos menor. En una realización específica, la puntuación de síntomas de asma es 5 puntos menor. En una realización específica, la puntuación de síntomas de asma es 6 puntos menor. En una realización específica, la puntuación de síntomas de asma es 7 puntos menor. En una realización específica, la puntuación de síntomas de asma es 8 puntos menor. En una realización específica, la puntuación de sintomas de asma es al menos 1 punto menor. En una realización especifica, la puntuación de síntomas de asma es al menos 9 puntos menor. En una realización específica, la puntuación de síntomas de asma es al menos 2 puntos menor. En una realización especifica, la puntuación de sintomas de asma es al menos 3 puntos menor. En una realización específica, la puntuación de síntomas de asma es al menos 4 puntos menor. En una realización específica, la puntuación de síntomas de asma es al menos 5 puntos menor. En una realización especifica, la puntuación de sintomas de asma es al menos 6 puntos menor. En una realización especifica, la puntuación de sintomas de asma es al menos 7 puntos menor. En una realización especifica, la puntuación de síntomas de asma es al menos 8 puntos menor.

En una realización, el indicador o síntoma de enfermedad es óxido nítrico exhalado fraccional (FENO). FE NO puede medirse de acuerdo con las recomendaciones combinadas de la Sociedad Respiratoria Europea y la Sociedad Torácica Americana (Sociedad Torácica Americana, Sociedad Respiratoria Europea. (2005) ATSfERS Recommendations for Standardized Procedures for Ihe Online y Offline Measurements de Exhaled Lower Respiratory Nitric Oxide y Nasal Nitric Oxide, 2005. Am J Respir Crit Care Med. 171: 912-930). Las mediciones de FENO pueden realizarse usando el NIOX a un caudal de 50 mlfs (patrón de ATS).

En una realización, un sujeto tiene un FENQ de entre 20 y 500 ppb antes de la administración de una o más dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización , un sujeto tiene un FENO entre 20 y 500 ppb, entre 20 y 400 ppb, entre 20 y 300 ppb, entre 20 y 200 ppb, entre 50 y 500 ppb, entre 100 y 500 ppb, entre 150 y 500 ppb, entre 200 y 500 ppb, entre 20 y 50 ppb, entre 50 y 100 ppb, entre 100 y 200 ppb, entre 200 y 300 ppb, entre 300 y 500 ppb antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-SR. En una realización, un sujeto tiene un FENO de al menos 50 ppb, al menos 100 ppb, al menos 150 ppb, al menos 200 ppb, al menos

250 ppb, al menos 300 ppb, al menos 350 ppb, al menos 400 ppb antes de la administración de la o las dosis de una

o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENO de 50 ppb antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENO de 100 ppb antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENO de 150 ppb antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENO de 200 ppb antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENO de 250 ppb antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENO de 300 ppb antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENO de 350 ppb antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENO de 400 ppb antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R.

En una realización , un sujeto tiene un FENO de entre 20 y 500 ppb después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENO entre 20 y 500 ppb, entre 20 y 400 ppb, entre 20 y 300 ppb, entre 20 y 200 ppb, entre 50 y 500 ppb, entre 100 y 500 ppb, entre 150 y 500 ppb, entre 200 y 500 ppb, entre 20 y 50 ppb, entre 50 y 100 ppb, entre 100 y 200 ppb, entre 200 y 300 ppb, entre 300 y 500 ppb después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENO de como máximo 50 ppb, como máximo 100 ppb, como máximo 150 ppb, como máximo 200 ppb, como máximo 250 ppb, como máximo 300 ppb, como máximo 350 ppb, como máximo 400 ppb después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENO de como máximo 20 ppb después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENO de como máximo 50 ppb después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENO de como máximo 100 ppb después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENO de como máximo 150 ppb después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENO de como máximo 200 ppb después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENO de como máximo 250 ppb después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización , un sujeto tiene un FENO de como máximo 300 ppb después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENO de como máximo 350 ppb después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un FENQ de como máximo 400 ppb después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R.

En una realización, el FENO de un sujeto es menor después de la administración de una o más dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R que antes de la administración de una o más dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R, en la que el FENO nunca es menor de Oppb. En una realización especifica, el FENO es al menos 50 ppb menor. En una realización específica, el FENO es al menos 100 ppb menor. En una realización específica, el FENO es al menos 150 ppb menor. En una realización especifica, el FENO es al menos 200 ppb menor. En una realización especifica, el FENO es al menos 250 ppb menor. En una realización especifica, el FENO es al menos 300 ppb menor. En una realización específica, el FENO es al menos 10 % menor. En una realización específica. el FENO es al menos 20 % menor. En una realización específica, el FENO es al menos 30 % menor. En una realización especifica, el FENO es al menos 40 % menor. En una realización específica, el FENO es al menos 50 % menor. En una realización especifica, the FENO es al menos 60 % menor. En una realización específica , el FENO es al menos 70 % menor. En una realización específica, el FENO es al menos 80 % menor. En una realización específica, el FENO es al menos 90 % menor. En una realización especifica, el FENO es 10 % menor. En una realización especifica, el FENO es 20 % menor. En una realización especifica, el FENO es 30 % menor. En una realización especifica, el FENO es 40 % menor. En una realización especifica, el FENO es 50 % menor. En una realización especifica, el FENO es 60 % menor. En una realización especifica, el FENO es 70 % menor. En una realización especifica, el FENO es 80 % menor. En una realización especifica, el FENO es 90 % menor.

En una realización, el indicador o sintoma de enfermedad es proteina catiónica de eosinófilos (ECP). Los niveles de ECP en suero pueden evaluarse usando cualquier método conocido por los expertos en la materia, por ejemplo, pero sin limitación, ensayo de ELlSA, radioinmunoensayo. Los niveles de ECP en suero pueden medirse por uno cualquiera de los ensayos disponibles en el mercado.

En una realización, un sujeto tiene un ECP en suero de entre 20 y 500 ng/ml antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización , un sujeto tiene una ECP en suero entre 20 y 200 ng/ml, entre 20 y 150 ng/ml, entre 20 y 100 ng/ml, entre 20 y 50 ngfml, entre 30 y 200 ngfml, entre 40 y 200 ng/ml, entre 50 y 200 ng/ml, entre 30 y 100 ng/ml, entre 30 y 80 ng/ml, entre 30 y 70 ng/ml, entre 20 y 80 ngfml, entre 20 y 70 ng/ml, entre 20 y 60 ng/ml antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de al menos 20 ng/ml, al menos 30 ng/ml, al menos 40 ng/ml, al menos 50 ngfml, al menos 60 nglml, al menos 100 nglml, al menos 150 ngfml, al menos 200 ng/ml antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de 25 ng/ml antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas

de unión a IL-5R. En una realización , un sujeto tiene una ECP en suero de 30 ngfml antes de la administración de la

o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de 35 ng/ml antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de 40 ng/ml antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización , un sujeto tiene una ECP en suero de 50 ngfml antes de la administración de la

o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de 60 ng/ml antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de 70 ng/ml antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de 80 ngfml antes de la administración de la

o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de 100 ngfml antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de 150 ngfml antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de 200 ng/ml antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R.

En una realización, un sujeto no tiene ECP en suero detectable después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización , un sujeto tiene una ECP en suero de entre 1 y 500 ngfml después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero entre 1 y 200 ng/ml, entre 1 y 150 ng/ml, entre 1 y 100 ng/ml, entre 1 y 50 ngfml, entre 1 y 20 ngfml, entre 10 y 200 ngfml, entre 10 y 100 ngfml, entre 10 y 50 ngfml, entre 20 y 100 ngfml, entre 20 y 50 ng/ml después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de como máximo 1 ng/ml, como máximo 5 ng/ml, como máximo 10 ng/ml, como máximo 20 ngfml, como máximo 30 ng/ml, como máximo 50 ng/ml después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de como máximo 1 ng/ml después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de como máximo 5 ng/ml después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de como máximo 10 ng/ml después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de como máximo 15 ng/ml después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de como máximo 20 ng/ml después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de como máximo 25 ng/ml después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una ECP en suero de como máximo 30 ng/ml después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R.

En una realización, la ECP en suero de un sujeto es menor después de la administración de una o más dosis de una

o más moléculas de unión a IL-5R que antes de la administración de una o más dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R, en la que la ECP en suero nunca es menor de O ngfml. En una realización especifica, la ECP en suero es al menos 50 ngfml menor. En una realización especifica, la ECP en suero es al menos 100 ng/ml menor. En una realización especifica, la ECP en suero es al menos 150 ng/ml menor. En una realización especifica, la ECP en suero es al menos 200 ng/ml menor. En una realización especifica, la ECP en suero es al menos 250 ngfml menor. En una realización especifica. la ECP en suero es al menos 300 ng/ml menor. En una realización especifica, la ECP en suero es al menos 10 % menor. En una realización especifica, la ECP en suero es al menos 20 % menor. En una realización especifica, la ECP en suero es al menos 30 % menor. En una realización especifica, la ECP en suero es al menos 40 % menor. En una realización especifica, la ECP en suero es al menos 50 % menor. En una realización especifica, la ECP en suero es al menos 60 % menor. En una realización específica, la ECP en suero es al menos 70 % menor. En una realización especifica, la ECP en suero es al menos 80 % menor. En una realización especifica, la ECP en suero es al menos 90 % menor. En una realización especifica, la ECP en suero es al menos 95 % menor. En una realización especifica, la ECP en suero es 10 % menor. En una rea lización especifica, la ECP en suero es 20 % menor. En una realización específica, la ECP en suero es 30 % menor. En una realización especifica, la ECP en suero es 40 % menor. En una realización especifica, la ECP en suero es 50 % menor. En una realización especifica, la ECP en suero es 60 % menor. En una realización especifica, la ECP en suero es 70 % menor. En una realización espeCifica, la ECP en suero es 80 % menor. En una realización especifica, la ECP en suero es 90 % menor. En una realización especifica, la ECP en suero es 95 % menor. En una realización especifica, la ECP en suero es 99 % menor. En una realización , un sujeto no tiene ECP en suero detectable después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización especifica, el nivel de ECP en suero permanece indetectable durante al menos aproximadamente 1 dia, al menos aproximadamente 2 dias, al menos aproximadamente 3 días, al menos aproximadamente 4 dias, al menos aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente 6 dias, al menos aproximadamente 7 dias, al menos aproximadamente 2 semanas, al menos aproximadamente 3 semanas, al menos aproximadamente 4 semanas, al menos aproximadamente 5 semanas, al menos aproximadamente 6 semanas, al menos aproximadamente 7 semanas, al menos aproximadamente 8 semanas, al menos aproximadamente 9 semanas, al menos aproximadamente 10 semanas, al menos aproximadamente 12 semanas, al menos aproximadamente 14 semanas, al menos aproximadamente 16 semanas, al menos aproximadamente 20 semanas, o al menos aproximadamente 25 semanas.

En una realización, el indicador o sintoma de enfermedad es ensayo de exposición a metacolina (MCT). El MCT puede realizarse de acuerdo con las directrices de la Sociedad Torácica Americana (ATS) (Guidelines for Methacholine y Exercise Testing -1999. (2000) Am J Respir Crit Care Med. 161:309-329) en presencia de un médico que tiene experiencia en el control del broncoespasmo y con agentes terapéuticos apropiados inmediatamente disponibles. Brevemente, el espirómetro usado se calibra de acuerdo con las directrices del ATS. El nebulizador usado debe producir un tamaño de particula con mediana de masa de diámetro aerodinámico (MMAD) de 1-4 micrómetros y flujo de O, 13±1 O % ml/min. Se usa meta colina de una fuente aprobada por la FDA y se diluye con solución salina normal estéril. Puede realizarse exposición de inhalación usando 2 minutos de respiración tidal o el método de dosimetro de cinco respiraciones como se describe en la publicación referida. Se administran concentraciones de metacolina de acuerdo con la práctica establecida del investigador, pero dentro del intervalo de 0,06 mg/dl a 25,0 mgfdl. Se mide FEVj, 30 y 90 segundos después de la compleción de cada dosis y se registra el mayor de los dos valores. Se administran concentraciones crecientes hasta que el FEVj se ha visto caer al menos 20 % desde el valor de linea basal. PC20 es la concentración de metacolina que conduce a al menos 20 % de caida en FEVj desde el valor de linea basal. Después de la compleción de la dosis final puede proporcionarse al sujeto albuterol por inhalador o nebulizador de dosis medida a discreción del investigador principal.

En una realización, un sujeto tiene una PC20 de entre 0,06 y 25 mg/dl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de entre 0,06 y 25 mg/dl , entre 0,1 y 10 mg/dJ, entre 0,06 y 3 mgfdl, entre 0,06 y 2 mgfdl, entre 0,06 y 1 mg/dl, entre 0,1 y 3 mgfdl, entre 0,1 y 2 mg/d l, entre 0,1 y 1 mgfdl, entre 0,2 y 10 mgfdl, entre 0,5 y 10 mg/dJ, entre 1 y 10 mg.ldl , entre 0,1 y 5 mg/dJ , entre 0,2 y 5 mgfdl, entre 0,5 y 5 mg.ldl, entre 0,1 Y 2 mgfdl, entre 0,2 y 2 mgfdl, entre 0,5 y 2 mg.ldl, entre 0,06 y 0,1 mgfdl, entre 0,1 y 0,2 mg/dl, entre 0,2 y 0,5 mgfdl, entre 0,5 y 1 mgfdl, entre 1 y 2 mg/dJ, entre 2 y 5 mg/dl, entre 5 y 10 mg/dl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de como máximo 0,1 mgfdl, como máximo 0,2 mgfdl, como máximo 0,4 mgfdl, como máximo 0,5 mgfdl, como máximo 1 mg/dl, como máximo 2 mg/dl, como máximo 5 mg/dl, como máximo 10 mgfdl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de 10 mgfdl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de 5 mg/dl antes de la administración la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de 2 mg.ldl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de 1 mg.ldl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de 0,5 mg/dl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de 0,2 mgfdl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de 0,1 mg/dl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R.

En una realización, un sujeto tiene una PC20 de entre 0,5 y 25 mg/dl después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de entre 1 y 25 mg.ldl, entre 2 y 25 mg/dl, entre 5 y 25 mg/dl, entre 10 y 25 mgfdl, entre 1 y 10 mg/dl, entre 2 y 10 mgfdl, entre 2 y 10 mgfdl después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de al menos 1 mg/dl, al menos 2 mg/dl, al menos 5 mg/dl, al menos 10 mgfdl, al menos 20 mg/dl después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de al menos 0,2 mg.ldl después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de al menos 0,3 mgfdl después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de al menos 0,4 mg/dl después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL5R. En una realización , un sujeto tiene una PC20 de al menos 0,5 mgfdl después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de al menos 0,7 mgfdl después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización , un sujeto liene una PC20 de al menos 1 mgfdl después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de al menos 2 mg/dl después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de al menos 5 mg/dl después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de al menos 10 mg/dl después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de al menos 20 mgfdl después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene una PC20 de al menos 25 mgfdl después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL5R.

En una realización, la PC20 de un sujeto es mayor después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R que antes de la administración de una o más dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización especifica, la PC20 es al menos 0,3 mg/dl mayor. En una realización especifica, la PC20 es al menos 0,5 mg/dl mayor. En una realización espeCifica, la PC20 es al menos 0,7 mg/dl mayor. En una realización especifica, la PC20 es al menos 1 mg.ldl mayor. En una realización especifica, la PC20 es al menos 3 mg/dl mayor. En una realización especifica, la PC20 es al menos 5 mgldl mayor. En una realización especifica, la PC20 es al menos 10 mgfdl mayor. En una realización espeCifica, la PC20 es al menos 15 mg/dl mayor. En una

realización especifica, la PC20 es al menos 20 mgfdl mayor. En una realización especifica, la PC20 es al menos 2 veces mayor. En una realización especifica, la PC20 es al menos 4 veces mayor. En una realización especifica, la PC20 es al menos 8 veces mayor. En una realización específica, la PC20 es al menos 10 mayor. En una realización especifica, la PC20 es al menos 12 veces mayor. En una realización especifica, la PC20 es al menos 15 veces mayor. En una realización específica, la PC20 es al menos 20 veces mayor. En una realización específica, la PC20 es 2 veces mayor. En una realización específica, la PC20 es 4 veces mayor. En una realización específica, la PC20 es 8 veces mayor. En una realización especifica, la PC20 es 10 veces mayor. En una realización especifica, la PC20 es 15 veces mayor. En una realización especifica, la PC20 es 60 % mayor. En una realización específica, la PC20 es 20 veces mayor.

En una realización, el indicador o sintoma de enfennedad es el recuento de eosinófilos en circulación. El recuento de eosinófilos en circulación puede evaluarse usando cualquier método conocido por los expertos en la materia, por ejemplo, pero sin limitación, histologia, citometria de flujo. El recuento de eosinófilos en circulación puede medirse por uno cualquiera de los kits disponibles en el mercado.

En una realización , un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de entre 50 y 1000 célulasfmicrol antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de entre 50 y 1000 célulasfmicrol, entre 100 y 1000 células/microl, entre 150 y 1000 células/microl, entre 200 y 1000 célulasfmicrol, entre 250 y 1000 células/microl, entre 300 y 1000 célulasfmicrol, entre 400 y 1000 células/microl, entre 500 y 1000 célulasfmicrol, entre 50 y 500 células/microl, entre 100 y 500 células/microl, entre 100 y 400 célulasfmicrol, entre 150 y 500 células/microl, entre 200 y 500 células/microl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de al menos 50 célulasfmicrol, al menos 100 células/microl, al menos 150 célulasfmicrol, al menos 200 célulasfmicrol, al menos 250 células/microl, al menos 300 células/microl, al menos 400 célulasfmicrol, al menos 500 células/microl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de 50 células/microl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de 100 células/microl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de 150 células/microl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de 200 células/microl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de 250 células/microl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de 300 células/microl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de 350 células/microl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de 400 célulasfmicrol antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de 500 células/microl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R.

En una realización. un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de entre 1 y 400 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de entre 1 y 200 células/microl, entre 1 y 100 célulasfmicfOl, entre 1 y 50 célulasfmicrol, entre 1 y 40 célulasfmicrol, entre 10 y 200 célulasfmicrol, entre 10 y 100 célulasfmicrol, entre 10 y 40 célulasfmicrol, entre 20 y 200 célulasfmicrol, entre 20 y 100 células/microl, entre 20 y 50 célulasfmiCfol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de como máximo 1 célula/microl, como máximo 5 células/microl, como máximo 10 célulasfmicrol, como máximo 20 célulasfmicrol, como máximo 30 célulasfmicrol, como máximo 40 célulasfmicrol, como máximo 50 células/microl, como máximo 60 célulasfmicrol, como máximo 80 células/microl, como máximo 100 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de como máximo 1 célulafmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de como máximo 5 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de como máximo 10 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de como máximo 20 células/microl después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de como máximo 30 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de como máximo 40 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de como máximo 50 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de como máximo 60 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de eosinófilos en circulación de como

máximo 80 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R.

En una realización, el recuento de eosinófilos en circulación de un sujeto es menor después de la administración de una o más dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R que antes de la administración de una o más dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R, en el que el recuento de eosinófilos en circulación nunca es menor de O células/microl. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es al menos 50 células/microl menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es al menos 100 células/microl menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es al menos 150 células/microl menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es al menos 200 células/microl menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es al menos 250 células/microl menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es al menos 300 células/microl menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es al menos 10 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es al menos 20 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es al menos 30 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es al menos 40 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es al menos 50 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es al menos 60 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es al menos 70 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es al menos 80 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es al menos 90 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es al menos 95 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es al menos 99 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es 10 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es 20 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es 30 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es 40 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es 50 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es 60 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es 70 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es 80 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es 90 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es 95 % menor. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación es 99 % menor.

En una realización, un sujeto no tiene recuento de eosinófilos en circulación detectable después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización especifica, el recuento de eosinófilos en circulación permanece indetectable durante al menos aproximadamente 1 dia, al menos aproximadamente 2 dras, al menos aproximadamente 3 dias, al menos aproximadamente 4 dias, al menos aproximadamente 5 dras, al menos aproximadamente 6 dias, al menos aproximadamente 7 dias, al menos aproximadamente 2 semanas, al menos aproximadamente 3 semanas, al menos aproximadamente 4 semanas, al menos aproximadamente 5 semanas, al menos aproximadamente 6 semanas, al menos aproximadamente 7 semanas, al menos aproximadamente 8 semanas, al menos aproximadamente 9 semanas, al menos aproximadamente 10 semanas, al menos aproximadamente 12 semanas, al menos aproximadamente 14 semanas, al menos aproximadamente 16 semanas, al menos aproximadamente 20 semanas, o al menos aproximadamente 25 semanas.

En una realización, el indicador o sin toma de enfermedad es % de eosinófilos en esputo inducido. El % de eosinófilos en esputo inducido puede evaluarse usando cualquier método conocido por un experto en la materia, por ejemplo, pero sin limitación, los métodos descritos en Belda et al. (2000) Am JRespir Grit Gare Med 161 :475-478. El % de eosinófilos en esputo inducido puede determinarse por uno cualquiera de los kits disponibles en el mercado.

En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de entre 0,1 % Y 10 % antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de entre 0,1 % Y 2 %, entre 0,1 % Y 5 %, entre 0,5 % Y 2 %, entre 0,5 % Y 5 %, entre 0,5 % Y 10 %, entre 1 % Y 2 %, entre 1 % Y 5 %, entre 1 % Y 10 %, entre 2 % Y 5 %, entre 2 % Y 10 %, entre 3 % Y 5 %, entre 3 % Y 10 %, entre 1,5 % Y 5 %, entre 2,5 % Y 5 %, antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización , un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de al menos 0,1 %, al menos 0,5 %, al menos 1 %, al menos 1,5 %, al menos 2 %, al menos 2,5 %, al menos 3 %, al menos 4 %, al menos 5 %, al menos 6 %, al menos 7 %, al menos 8 %, al menos 9 %, al menos 10 % antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de 0,5 % antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de 1 % antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de 1,5 % antes de la administración de la o las dosis de una o mas moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de 2 % antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de 2,5 % antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de 3 % antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de 4 % antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de

unión a IL-5R. En una realización , un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de 5 % antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de 6 % antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de 7 % antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de 8 % antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de 9 % antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de 10 % antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R.

En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de entre 0,1 % Y 5 % después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido entre 0,1 % Y 3 %, entre 0,1 % Y 2 %, entre 0,1 % Y 1,5 %, entre 0,5 % Y 5 %, entre 0,5 % Y 3 %, entre 0,5 % Y 1 %, entre 1 % Y 5 %, entre 1 % Y 3 %, entre 2 % Y 5 %, entre 3 % Y 5 %, entre 2,5 % Y 5 % después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de como máximo 1 %, como máximo 2 %, como máximo 3 %, como máximo 4 %, como máximo 5 %, como máximo 6 %, como máximo 7 %, como máximo 8 %, como máximo 9 %, como máximo 10 % después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de como máximo 1 % después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-SR. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de como máximo 2 % después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de como máximo 3 % después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de como máximo 4 % después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de como máximo 5 % después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de como máximo 6 % después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de como máximo 7 % después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de como máximo 8 % después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de como máximo 9 % después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un % de eosinófilos en esputo inducido de como máximo 10 % después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R.

En una realización , el % de eosinófilos en esputo inducido de un sujeto es menor después de la administración de una o más dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R que antes de la administración de una o más dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R, en el que el % de eosinófilos en esputo inducido nunca es menor del O %. En una realización espeCífica , el % de eosinófilos en esputo inducido es al menos 10 % menor. En una realización especifica. el % de eosinófilos en esputo inducido es al menos 9 % menor. En una realización específica, el % de eosinófilos en esputo inducido es al menos 8 % menor. En una realización específica, el % de eosinófilos en esputo inducido es al menos 6 % menor. En una realización especifica, el % de eosinófilos en esputo inducido es al menos 5 % menor. En una realización especifica, el % de eosinófilos en esputo inducido es al menos 4 % menor. En una realización especifica, el % de eosinófilos en esputo inducido es al menos 3 % menor. En una realización especifica, el % de eosinófilos en esputo inducido es al menos 2 % menor. En una realización especifica, el % de eosinófilos en esputo inducido es al menos 1 % menor.

En una realización, un sujeto no tiene eosinófilos detectables en esputo inducido después de la administración de la

o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización especifica, los eosinófilos en esputo inducido permanecen indetectables durante al menos aproximadamente 1 dia, al menos aproximadamente 2 dias, al menos aproximadamente 3 dias, al menos aproximadamente 4 días, al menos aproximadamente 5 dias, al menos aproximadamente 6 dias, al menos aproximadamente 7 dias, al menos aproximadamente 2 semanas, al menos aproximadamente 3 semanas, al menos aproximadamente 4 semanas, al menos aproximadamente 5 semanas, al menos aproximadamente 6 semanas, al menos aproximadamente 7 semanas, al menos aproximadamente 8 semanas, al menos aproximadamente 9 semanas, al menos aproximadamente 10 semanas, al menos aproximadamente 12 semanas, al menos aproximadamente 14 semanas, al menos aproximadamente 16 semanas, al menos aproximadamente 20 semanas, o al menos aproximadamente 25 semanas.

En una realización , el indicador o síntoma de enfermedad es recuento de basófilos en circulación. El recuento de basófilos en circulación puede evaluarse usando cualquier método conocido por un experto en la materia, por ejemplo, pero sin limitación, citometria de flujo. El recuento de basófilos en circulación puede medirse por uno cualquiera de los kits disponibles en el mercado.

En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de entre 5 y 500 células/microl antes de la

administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de entre 50 y 500 célulasfmicrol, entre 10 y 500 célulasfmicrol, entre 20 y 500 célulasfmicrol, entre 30 y 500 célulasfmicrol, entre 40 y 500 célulasfmicrol, entre 50 y 500 célulasfmicrol, entre 10 y 400 célulasfmicrol, entre 10 y 300 célulasfmicrol, entre 10 y 200 célulasfmicrol, entre 10 y 100 célulasfmicrol, entre 20 y 100 célulasfmicrol, entre 30 y 100 célulasfmicrol, entre 10 y 75 célulasfmicrol antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de al menos 5 célulasfmicrol, al menos 10 célulasfmicrol, al menos 15 célulasfmicrol, al menos 20 célulasfmicrol, al menos 30 célulasfmicrol, al menos 50 célulasfmicrol, al menos 60 célulasfmicrol, al menos 100 célulasfmicrol antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de 5 célulasfmicrol antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de 10 célulasfmicrol antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de 15 célulasfmicrol antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de 20 célulasfmicrol antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de 30 célulasfmicrol antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de 50 células/microl antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de 60 célulasfmicrol antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de 100 célulasfmicrol antes de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R.

En una realización , un sujeto tiene un recuento de basafilos en circulación de entre 1 y 100 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación entre 1 y 100 célulasfmicrol, entre 1 y 50 célulasfmicrol, entre 1 y 30 célulasfmicrol, entre 1 y 20 célulasfmicrol, entre 1 y 10 célulasfmicrol, entre 5 y 100 célulasfmicrol, entre 5 y 50 célulasfm icrol, entre 5 y 20 célulasfmicrol, entre 5 y 10 célulasfmicrol, entre 10 y 30 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de como máximo 1 célulafmicrol, como máximo 5 célulasfmicrol, como máximo 10 célulasfmicrol, como máximo 20 células/microl, como máximo 30 célulasfmicrol, como máximo 50 células/microl. como máximo 100 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de como máximo 1 célulafmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de como máximo 5 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de como máximo 10 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de como máximo 20 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización. un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de como máximo 30 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de como máximo 40 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización, un sujeto tiene un recuento de basófilos en circulación de como máximo 50 célulasfmicrol después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R.

En una realización, el recuento de basófilos en circulación de un sujeto es menor después de la administración de una o más dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R que antes de la administración de una o más dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R, en el que el recuento de basófilos en circulación nunca es menor de O célulasfmicrol. En una realización especifica. el recuento de basófilos en circulación es al menos 10 célulasfmicrol menor. En una realización espeCifica, el recuento de basófilos en circulación es al menos 20 célulasfmicrol menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es al menos 30 célulasfmicrol menor. En una realización espeCifica, el recuento de basófilos en circulación es al menos 50 célulasfmicrol menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es al menos 75 célulasfmicrol menor. En una realización especifica. el recuento de basófilos en circulación es al menos 100 célulasfmicrol menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es al menos 10 % menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es al menos 20 % menor. En una realización especifica. el recuento de basófilos en circulación es al menos 30 % menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es al menos 40 % menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es al menos 50 % menor. En una realización específica, el recuento de basófilos en circulación es al menos 60 % menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es al menos 70 % menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es al menos 80 % menor. En una realización específica, el recuento de basófilos en circulación es al menos 90 % menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es al menos 95 % menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es al menos 99 % menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es 10 % menor. En una realización especifica. el recuento de basófilos en circulación es 20 % menor. En una realización especifica. el

recuento de basófilos en circulación es 30 % menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es 40 % menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es 50 % menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es 60 % menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es 70 % menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es 80 % menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es 90 % menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es 95 % menor. En una realización especifica, el recuento de basófilos en circulación es 99 % menor.

En una realización , un sujeto no tiene recuento de basófilos en circulación después de la administración de la o las dosis de una o más moléculas de unión a IL-5R. En una realización especifica, el nivel de recuento de basófilos en circulación permanece indetectable durante al menos aproximadamente 1 dra, al menos aproximadamente 2 dias, al menos aproximadamente 3 dias, al menos aproximadamente 4 dias, al menos aproximadamente 5 dias, al menos aproximadamente 6 dias, al menos aproximadamente 7 dias, al menos aproximadamente 2 semanas, al menos aproximadamente 3 semanas, al menos aproximadamente 4 semanas, al menos aproximadamente 5 semanas, al menos aproximadamente 6 semanas, al menos aproximadamente 7 semanas, al menos aproximadamente 8 semanas, al menos aproximadamente 9 semanas, al menos aproximadamente 10 semanas, al menos aproximadamente 12 semanas, al menos aproximadamente 14 semanas, al menos aproximadamente 16 semanas, al menos aproximadamente 20 semanas, o al menos aproximadamente 25 semanas.

Ejemplos

La invención se describe ahora con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proporcionan para el fin de ilustrar solamente y la invención no deberia interpretarse de ninguna manera como limitada a estos ejemplos sino que deberia más bien interpretarse que abarca todas y cada una de las variaciones que resulten evidentes como resultado de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento.

EJEMPLO 1

MEDI-563, un anticuerpo anti receptor de interleucina-5, se tolera bien e induce eosinopenia sanguínea reversible en asmáticos leves en un ensayo de fase 1

Antecedentes: se cree que los eosinófilos desempeñan un papel clave en la patogénesis del asma. La interleucina-5 (IL-5) es una citosina principal en la biologia de eosinófilos, y la expresión de su receptor (IL-5R) está restringida en gran medida a eosinófilos, basófilos y mastocitos. La eficacia subóptima de terapias dirigidas a IL-5 en asma se ha atribuido a un empobrecimiento incompleto de eosinófilos en el tejido pulmonar. El empobrecimiento de eosinófilos pulmonares completo deberia proporcionar información adicional acerca del papel de estas células en el asma y podria representar una estrategia terapéutica nueva.

Objetivos: para evaluar la seguridad y actividad biológica de MEDI-563 (previamente conocido como BIW-8405), se desarrolló un anticuerpo monoclonal IgG1 afucosilado humano anti cadena alfa de IL-5R. MEDI-563 se desarrolló por BioWa, Inc. Mediante tecnologia patentada de Potel1igent® que potencia significativamente la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. MEDI-563 neutraliza la actividad de IL-5 y agota eosinófilos tisulares en modelos preclinicos con un perfil toxicológico aceptable.

Métodos: se admitió a seis sujetos con asma leve y ausencia de terapia de corticosteroides en la primera cohorte del estudio BIW-8405-001, un estudio primero en seres humanos abierto con MEDI-563. Los pacientes recibieron una única dosis intravenosa de MEOI 563 0.03 mgfkg y se les realizó seguimiento durante 84 dras.

Resultados: MEOI-563 se toleró bien, y no se presentaron acontecimientos adversos graves. Todos los acontecimientos adversos (AE) fueron leves, y el AE más frecuentemente presentado fue fatiga el dia de dosificación después de la administración (3/6 sujetos). Los eosinófilos en circulación se redujeron por debajo de los limites de detección a las 24-48 horas de dosificación en los 6 sujetos (induirá valor medio antes de la dosificación). Este efecto duró 8-12 semanas, y los eosinófilos se hicieron detectables en algunos sujetos el dia 58 después de la dosificación y alcanzaron >70 % de niveles de linea basal el dia 84 después de la dosificación en todos los sujetos analizados. Los basómos en circulación siguieron una tendencia similar. Posiblemente ligado al mecanismo esperado de acción de MEDI-563, los niveles de neutrófilos experimentaron una reducción ligera y transitoria en un periodo de 72 horas después de la dosificación, alcanzando niveles de neutropenia leve en 2/6 sujetos que se resolvieron en un periodo de 3 dias. La administración de MEDI-563 se asoció con aumentos inmediatos (en un periodo de 6 horas), modestos «10x linea basal) y transitorios «1 semana de duración) en proteina sensible a e en suero (2/6 sujetos) e IL-6 (2f3).

Conclusiones: una única dosis IV de 0.03 mgfkg de MEOI-563 induce una eosinopenia sanguinea robusta , con un perfil de seguridad aceptable hasta la fecha.

EJEMPLO 2

Citotoxicidad medida por célula dependiente de anticuerpo

Se coincubaron células efectoras KC1333 (linfocitos NK humanos que sobreexpresaban FcgRllla y FceRlg humanos) durante 4 horas con la linea celular CTLL-2 diana (Iinfoma de ratona genéticamente modificado para sobreexpresar IL-5Ra humano) a una relación de 5 efectores: 1 diana, en presencia de MEDI-563 o anticuerpo de control. Se evaluó la citotoxicidad media por anticuerpos usando un ensayo de viabilidad celular Calcein AM. Los resultados se resumen en la figura 9A. Usando una metodologia similar, se analizó un control adicional (MEDI-563 fucosilado) . Los resultados se resumen en la figura 9S.

EJEMPLO 3

Evaluación por resonancia de plasmón superficial de la unión en equilibrio de MEDI-563 a IL-5R

Se obtuvo un dominio exlracelular de IL-5Ra humano soluble, sin vehiculo, de una fuente comercial (R+D Systems). El hulL-5Ra recombinante se inmovilizó directamente en una microplaca sensora mediante enlaces de amina usando un protocolo convencional. La interacción de MEDI-563 con hulL-5Ra inmovilizado a lo largo del tiempo se evaluó mediante el cambio en el indice refractario, del que se calcularon los valores kon, koll, y Ko usando técnicas convencionales. Los resultados se resumen en la figura 10.

EJEMPLO 4

Evaluación por resonancia de plasmón superficial de la unión en equilibrio de MEDI-563 a FcyR

Se inmovilizó directamente MEDI-563 en una microplaca sensora mediante enlaces de amina usando un protocolo convencional. Las interacciones de FcyR humanos solubles (Medlmmune) con MEDI-563 inmovilizado a lo largo del tiempo se evaluaron por el cambio en el índice refractario, a partir del que se calcularon los valores kan, kott, Y Ko usando técnicas convencionales. Los resultados se resumen en la figura 11.

EJEMPLO 5

Inmunohistoquimica de IL-5Ra

Se fijó tejido de pólipo nasal resecado en formaldehido durante 24 horas y se induyó en parafina. Se tiñeron secciones consecutivas con respecto a IL-5Ra, IL-9R, CCR3, y c-kit humanos usando anticuerpos policlonales dirigidos a IL-5R disponibles en el mercado (R+D Systems, Santa Cruz Siotechnology) usando técnicas convencionales. Se fijó tejido pUlmonar de ratones transgénicos IL-9 o ratones de control FVS de cepa coincidente de tipo silvestre en formaldehido durante 24 horas y se incluyeron en parafina. Las secciones se analizaron con respecto a la expresión de IL-9R (pAb, Santa Cruz Biotechnology) e IL-5R (pAb, R+D Systems) usando técnicas de inmunohistoquimica convencionales. Los resultados se resumen en las figuras 12 y 13.

EJEMPLO 6

Medi-563 se une con eosinófilos en sangre completa de donantes sanos

Se aislaron granulocitos de sangre completa humana de donantes normales por centrifugación de gradiente de densidad. Se usaron reactivos de anticuerpo primario marcados directamente para el análisis de la expresión de CD16 (fluorocromo FITC) y MEDI-563 F(Ab)'2 (fluorocromo Alexa-647). Se añadió un cóctel de CD16-FITC más MEDI-563-Alexa647, o CD16-FITC más un anticuerpo de control de isotipo marcado con Alexa647, a la preparación de granUlocitos a 1 microgramo por cada 106 células. Después de incubación durante 45 minutos en hielo, las células se lavaron tres veces en solución salina fria, y se evaluó la unión del anticuerpo a la superficie celular por citometria de flujo. Se analizaron los eosinófilos, que son negativos para CD16. Se expresa la unión de MEDI-563 frente al anticuerpo de control de isotipo en población de granulocitos negativa para CD16. Los resultados se resumen en la figura 15

EJEMPLO 7

Tinción de IL-5Ra de leucocitos de ratón por citometria de flujo

Se aislaron leucocitos de sangre, médula ósea, pulmones y bazo de ratones transgénicos para IL-5. Se tiñeron suspensiones celulares en PSS que contenia FCS 1 "lo. Para reducir la unión no especifica, las células se incubaron con Fc Slock (SD Biosciences) durante 15 minutos antes de la tinción. Los anticuerpos usados fueron anti CCR3 de ratón (R&O systems), anti Siglec F de ratón (SO Siosciences) y anti IL-5R de ratón (H7). Las células se tiñeron durante 30 minutos en hielo, se aclararon dos veces y se fijaron en tampón cytofix (SO Biosciences). Se realizaron análisis citométricos de flujo usando un LSR11 (Secton Dickinson) con software FACS Diva (Becton Dickinson). Los

resultados se analizaron usando el software FlowJo (TreeStar Inc.). Los resultados se resumen en las figuras 16A y 16B.

EJEMPLO 8

Medi-563 agota las células mononucleares positivas para IL-5Ra de la médula ósea

Las células mononucleares de médula ósea congeladas (SM MNC: Lonza) se descongelaron, se lavaron, se sembraron en placas y se incubaron durante 2 horas a 37 oC. Se recogieron las células mononucleares de médula ósea no adherentes (NA BM MNC) de las placas después de la incubación. Se realizó ensayo de ADCC coincubando durante 18 horas 100.000 NA BM MNC Y 50.000 células efectoras KC 1333 por pocino en 200 !JI de F8SfRPMI 1640 10 % en placa TC de 96 pocillos en presencia de anticuerpo de Medi-563 10 !Jgfml. Se realizaron reacciones de control negativo usando el anticuerpo de control de isotipo R347 aFuc de especificidad irrelevante. Las células efectoras KC 1333 usadas en el ensayo de ADCC se pintaron con CFDA SE. Después de la incubación de 18 horas, las células de cada reacción se lavaron tres veces con medio templado y se inmunotiñeron para citometría de flujo. Las células positivas para IL-5Ra se detectaron por tinción de anticuerpo primario KM 1257/anticuerpo secunda rio especifico IgG Fcg anti Mu de cabra conjugado con PE. Se realizó tinción de control de las muestras con anticuerpo primario de control de isotipo coincidente 1A7 en combinación con el anticuerpo secundario específico de IgG Fcg anti Mu de cabra conjugado con PE. Se realizó inmunotinción y citometria de flujo usando los protocolos convencionales. El número de células positivas para IL-5Ra que permanecen en una muestra después de ADCC se detenninó contando el número de células positivas para KM1257 en una selección de linfocitos. Los procedimientos de inmunotinción y citometría de flujo se calibraron usando la línea celular CTLL-2 que expresaba un transgén de IL-5Ra humano. La ADCC mediada por MEDI-563 agotó sustancialmente todas las células positivas para IL-5Ra de las muestras de NA BM MNC. Los resultados se resumen en las figuras 17A y 178.

EJEMPLO 9

Agotamiento mediado por MEDI-563 de eosinófilos de sangre periférica

Se admitieron dos cohortes de seis sujetos con asma leve en un estudio abierto de MEOI-563. Los sujetos de las cohortes 1 y 2 recibieron una única dosis intravenosa de 0,03 mgfkg y 0,1 mglkg de MEDI-563, respectivamente, y sus niveles de eosinófilos en sangre periférica se enumeraron en la exploración, el dia Oantes de la dosificación y a intervalos regulares hasta el dia 84 yen el seguimiento. Se detectaron eosinófilos en circulación por citometria de flujo. Los eosinófilos en circulación se redujeron por debajo del limite de detección a las 24 horas de dosificación en los seis sujetos de ambas cohortes. La eosinopenia inducida por MEDI-563 duró 8-12 semanas. En la cohorte 1, después de la administración de una única dosis de MEOI-563 0,03 mglkg, de los cinco sujetos que completaron el estudio de 84 días, los eosinófilos se hicieron detectables en 1 sujeto el día 58, en 3 sujetos el día 84; el quinto sujeto no tuvo ningún eosinófilo en circulación detectable el dia 84. En la cohorte 2, después de la admin istración de una única dosis de MEOI-563 0,1 mgfkg, ninguno de los sujetos tuvo eosinófilos en circulación detectables el día 84. Los eosinófilos en sangre periférica fueron detectables, sin embargo, en los seis sujetos de la cohorte 2 en un examen de seguimiento posterior. Se presentan los niveles de eosinófilos en sangre periférica detectados en las cohortes 1 y 2 en diversos intervalos temporales después de la administración de una única dosis de MEDI-563 en las figu ras 18A y 18B.

EJEMPLO 10

Inmunohistoquimica de IL-5Ra

Se tiñeron secciones pulmonares de un sujeto humano sano con MEDI-563 usando técnicas histoquímicas convencionales. Los resultados se resumen en la figura 19. Las células que expresan IL-5Ralfa aparecen en negro en la imagen.

Se tiñeron muestras tisulares pUlmonares obtenidas de biopsia bronquial o transbronquial de pacientes asmáticos con MEDI-563 usando técnicas histoquímicas convencionales. Los resultados se resumen en la figura 20. Las células que expresan IL-5Ralfa aparecen en gris oscu ro/negro en la imagen.

Ejemplo 11

MEDI-563 se dirige eficazmente a basófilos y eosinófilos aislados en un ensayo de ADCC in vitro.

Se aislaron basófilos y eosinófilos de donantes sanos con un kit disponible en el mercado (kit de selección negativa de NK!eosinófilos/basófilos RoboSep, Stem Cel! Technologies, Vancouver, Canadá). La expresión de IL-5Ralfa de las células aisladas se determinó por citometría de flujo. Las células se tiñeron por anticuerpo MEDI-563 o un anticuerpo de control de isotipo de especificidad irrelevante después de protocolos convencionales. Las células inmunoteñidas se analizaron por citometría de flujo. Se muestran perfiles de tinción en la figura 21. Tanto los basófilos como los eosinófilos aislados presentaron un nivel de tinción con MEDI-563 mayor que el observado con el

anticuerpo de control de isotipo. Se muestra el patrón de tinción de una linea celular que expresa un transgén de IL5Ralfafbeta humano como un control positivo.

La actividad de MEDI-563 fucosilado y afucosilado se detenninó en un ensayo de ADCC in vitro usando eosinófilos y linfocitos NK autólogos aislados. Los eosinófilos y los linfocitos NK se aislaron de donantes sanos usando kits disponibles en el mercado (kit de selección negativa de NKJeosinófilos/basófilos RoboSep, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá). El ensayo de AoCC se realizó con linfocitos NK y eosinófilos aislados como efectores y células diana a una relación 5:1. Las concentraciones de anticuerpos ensayadas varian de 10.15 a 10.7 M. La citotoxicidad se midió después de 24 horas de incubación usando un ensayo de anexina V basado en citometria de flujo. La actividad AoCC de MEol-563 afucosilado fue varios órdenes de magnitud mayor que la del anticuerpo MEol-563 fucosilado. El valor EC50 de MEDI-563 afucosilado fue 0,965 pM en este ensayo. Los resultados de un experimento representativo se muestran en la figura 22.

La actividad de MEDI-563 afucosilado se determinó en un ensayo de ADCC in vitro usando basófilos y linfocitos NK autólogos aislados. Los basófilos y linfocitos NK se aislaron de donantes sanos usando kits disponibles en el mercado (kit de selección negativa de NKleosinófilos/basófilos RoboSep, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá). El ensayo de AoCC se realizó con linfocitos NK y eosinófilos aislados como efectores y células diana a una relación 5:1 . Las concentraciones de anticuerpos ensayadas varian de 10-15 a 10·\1 M. La citotoxicidad se midió después de 24 horas de incubación detenninando las células positivas para anexina V por citometria de flujo. El valor de EC50 de MEDI-563 afucosilado fue de 0,561 pM en este ensayo. Los resultados de un experimento representativo se muestran en la figura 23.

Ejemplo 12

Los eosinófilos no liberan gránulos citotóxicos en ensayo de AoCC mediado por MEol-563

Se detenninó la desgranulación de eosinófilos expuestos a ADCC dirigida a MEDI-563 midiendo la liberación de EDN (neurotoxina derivada de eosinófilos) al sobrenadante. Las condiciones de ADCC in vitro usadas fueron similares a las descritas en el ejemplo 11 . Se usaron eosinófilos y linfocitos NK o células PBMC aislados de donantes sanos como células diana y efectoras, respectivamente. Se realizaron ensayos usando MEol-563 fucosilado: MEDI-563 afucosilado o el anticuerpo de control de isotipo R347 afucosilado. Se consiguió desgranulación máxima exponiendo los eosinófilos a tritón X-100 1 %; se detectó concentración de EDN > 220 ngfml tras desgranulación máxima de las células. Los resultados del experimento representativo se muestran en la figura

24. Los niveles de EDN pennanecieron por debajo de 25 ng/ml (linea basal) después de ADCC mediada por MEol

563. La concentración de MEol-563 (33 o 100 mg/ml) o el estado de fucosilación del anticuerpo no afectaron significativamente a los niveles de desgranulación.

Ejemplo 13

Mapeo de epitopos de MEDI-563

MEol-563 se une específicamente con células transgénicas que expresan la proteina de IL-5Ralfa humana. MEDI563 no se une con células que expresan una proteína de IL-5Ralfa de ratón. Véase figuras 25B y 26C. La secuencia de aminoácidos de las proteínas de IL5-Ralfa de ratón y humanas son altamente similares. La especificidad epitópica de MEol-563 se determinó analizando las caracteristicas de unión de MEDI-563 con un gran panel de proteínas IL-5Ralfa quiméricas de ratón-ser humano (figuras 25-27). Los experimentos utilizaron células transgénicas que expresaban las proteinas de IL-5Ralfa quiméricas en su superfiCie celular. Se generaron construcciones transgénicas y se expresaron usando métodos moleculares convencionales. La unión de anticuerpo con una proteina de IL-5Ralfa quimérica expresada en la superficie de células transgénicas se determinó por citometria de flujo. Se muestran perfiles de tinción fluorescentes en las figuras 25-27. RPoliclonar y "MEDI-563R indican perfiles de tinción observados usando un anticuerpo anti IL-5Ralfa humano policlonal y MEDI-563, respectivamente. Aunque MEol-563 es especifico para un único epítopo de la proteina de IL-5Ralfa humana, el anticuerpo policlonal reconoce múltiples epitopos de IL-5Ralfa humano (figuras 25B y 26C). La "tinción dualRindica el perfil de tinción fluorescente para los anticuerpos policional (eje x) y MEDI-563 (eje Y).

En primer lugar, el epitopo de MEol-563 se mapeó en la región 01 del dominio extracelular de IL-5Ralfa. IL-5Ralfa comprende 3 dominios extracelulares (0 1, 0 2 Y 0 3), un dominio transmembrana y un dominio intracelular (figura 25A). Debido a que MEol-563 reconoce IL-5Ralfa en células intactas, su epitopo debe localizarse en uno de los dominios extracelulares. Para mapear el epitopo de MEDI-563 en uno de los tres dominios extracelUlares, se generaron células transgénicas que expresaban proteinas de IL-5Ralfa quiméricas que comprendian dominios extracelulares de ratón y ser humano usando métodos de clonación molecular convencionales. Se muestra una representación esquemática de las proteinas quiméricas ensayadas en la figura 25A. Las variantes de "anulación" fueron proteinas de IL-5Ralfa quiméricas que comprendian un único dominio extracelular de ratón en un fondo de otro modo humano. Las variantes de "introducción" fueron proteinas de IL-5Ralfa quiméricas que comprendian un único dominio extracelular humano en un fondo en lo demás de ratón.

La figura 2SB-e muestra el resultado de un experimento representativo. Tanto MEDI-S63 como el anticuerpo policlonal tiñeron las células transgénicas que expresaban la proteína de IL-SRalfa humana; ninguno de los anticuerpos tiñó células transgénicas que expresaban IL-5Ralfa de ratón (figura 258). MEOI-563 no se unió con células transgénicas que expresaban un transgén de IL-5Ralfa quimérico que comprendía los dominios

S extracelulares 01 de ratón y 02-03 humanos (figura 25e; "anulación de 01"). MEOI-563 se unió especificamente con células transgénicas que expresaban un transgén de IL-SRalfa quimérico que comprendia dominios extracelulares 02 o 03 de ratón en un fondo humano (figura 23e; "anulación de 02 o 03"). MEOI-563 se unió especifica mente con células transgénicas que expresaban un transgén de IL-SRalfa quimérico que comprendia los dominios extracelulares 0 1 humano y 02-03 de ratón (figura 2S0; "introducción de 0 1"). MEOI-S63 no se unió con células transgén icas que expresaban un transgén quimérico basado en IL-5Ralfa de ratón que comprendía el dominio extracelular 02 o 03 humano (figura 250; "introducción de 02 o 03"). Todas la células que expresaban una proteína de IL-5Ralfa quimérica que comprendía al menos un dominio extracelular de la proteína humana se tiñeron por el anticuerpo policlonal anti IL-5Ralfa humano lo que mostró que la diferencia en el patrón de tinción de MEOIS63 entre las células transgénicas no se debia a una diferencia en el nivel de expresión de proteinas quiméricas.

15 En segundo lugar, el epítopo de MEOI-563 se mapeó en el segmento B del dominio extracelular 01 de IL-5Ralfa humano (figura 26). El dominio extracelular 01 de IL-SRalfa se dividió en tres segmentos (figura 26A, segmentos A, B Y e). Se generó una serie de transgenes de IL-5Ralfa quiméricos de ser humano-ratón que comprendían diversas combinaciones de segmentos humanos y de ratón del dominio extracelular 01; las proteinas quiméricas usadas en este estadio comprendian todas las secuencias humanas fuera del dominio extracelular 01. Los transgenes de "anulación" fueron construcciones de IL-5Ralfa quiméricas que comprendian un único segmento de ratón del dominio extracelular 01 en un fondo en lo demás humano. Los transgenes de "introducción" fueron construcciones de IL-5Ralfa quiméricas que comprendían un único segmento humano del dominio extra celular 01 en un fondo de 01 de ratón-02 humano-03 de ratón-TM de ratón (figura 26B). La figura 26e muestra el resultado de un

25 experimento de control. MEOI-563 reconoció específicamente células transgénicas que expresaban (i) un transgén de IL-5Ralfa humano o (ii) un transgén quimérico de IL-5Ralfa de ratón que comprendía un dominio extra celular 01 humano ("IL-SRa humano" e "introducción de 01"). MEDI-S63 no se unió con células transgénicas que expresaban

(i) transgén del receptor IL-SRalfa de ratón o (ii) un transgén de IL-5Ralfa quimérico humano que comprendió dominio extracelular 01 de ratón ("IL-5Ra de ratón", "anulación de 01"). Las figuras 260 y E muestran el resultado de un experimento de mapeo representativo. MEOI-563 no se unió con células transgénicas que expresaban un transgén de IL-5Ralfa quimérico que comprendía un segmento B de ratón del dominio extracelular 01 en un fondo en lo demás humano ("anulación de B"). MEOI-563 se unió especificamente con células transgénicas que expresaban un transgén de IL-5Ralfa quimérico que comprendia el segmento A o e de ratón del dominio extracelular 01 en un fondo humano ("anulación de A", "anulación de e"). La figura 26E muestra un ejemplo de los resultados

3S obtenidos con las construcciones de introducción. MEOI-563 se unió especificamente con células transgénicas que expresaban un transgén de IL-5Ralfa quimérico que comprendía el segmento B humano del dominio extra celular 01 en un fondo de 0 1 de ratón-02 humano-03·de ratón-TM de ratón ("introducción de B"). MEOI-563 no se unió con células transgénicas que expresaban un transgén de IL-5Ralfa quimérico que comprendia un segmento A o e humano del dominio extracelular 01 en un fondo de 01 de ratón-02 humano-03 de ratón-TM de ratón ("introducción de A o e"). todas las células que expresaban una proteina de IL-SRalfa quimérica se tiñeron con el anticuerpo policlonal anti IL-SRalfa humano que mostraba que la diferencia en el patrón de tinción de MEOI-563 entre las células transgénicas no se debía a una diferencia en el nivel de expresión de proteínas quiméricas.

En tercer lugar, el epítopo de MEOI-563 se mapeó en restos de aminoácidos particulares dentro del segmento 81

4S del dominio extracelular 01 de IL-5Ralfa humano. Se expresó en células transgénicas una serie de variantes de receptor IL-5Ralfa que comprendían al menos un resto de aminoácido mutante dentro del segmento B1 del dominio extracelular 01 . La posición de restos mutantes se seleccionó comparando la secuencia de aminoácidos de ratón y humana. Se muestra un esquema de las proteínas varíantes ensayadas en la figura 27A. Las variantes de IL-5Ralfa "de anulación" fueron proteínas humanas mutantes que comprendían al menos una sustitución que intercambiaba un resto de ratón por el resto humano correspondiente. Por ejemplo, la variante de "anulación OE" fue una proteína de IL-SRalfa humana que comprendia la sustitución de los aminoácidos 056E y ES80. las variantes de IL-5Ralfa de "introducción" fueron proteínas quiméricas que comprendían 01 de ratón, 02 humano, 03 de ratón y TM de ratón en las que el dominio 01 de ratón comprendia una versión mutante del segmento B de ratón que tenia al menos una sustitución que intercambiaba un resto humano por el resto de ratón correspondiente. Por ejemplo, la variante de

SS "introducción de DE" fue una proteina de IL-SRalfa quimérica que comprendia el segmento B de ratón mutante en un fondo de 01 de ratón-D2 humano-D3 de ratón-TM de ratón en el que el segmento B de ratón mutante comprendia las sustituciones de aminoácidos E56D y D58E. La figura 27B muestra un ejemplo de los resultados obtenidos usando las construcciones de anulación. MEOI-563 no se unió con células transgénicas que expresaban una proteina de IL-5Ralfa humana mutante que comprendia las sustituciones de aminoácidos K53Q, OS6E, E58D, 161K ("anulación de KOEI"). MEOI-563 se unió especifica mente con células transgénicas que expresaban una proteina de IL-SRalfa humana mutante que comprendia las sustituciones de aminoácidos N40H, N420, Q46H ranulación de NNO") o 056E, E58D ("anUlación de DE"), o N40H, N42D, 056E, E58D ("anUlación de NNDE"). La figura 27e muestra un ejemplo de los resultados obtenidos usando las construcciones de introducción. MEDI-563 se unió especifica mente con células transgénicas que expresaban una proteina de IL-SRalfa variante que comprendia un

6S segmento B de ratón mutante de 0 1 que tenia las sustituciones de aminoácidos QS3K, ES6D, D58E, K611 ("introducción de KOEI"). La figura 270 muestra un ejemplo de los resultados obtenidos usando las construcciones

de anulación. MEDI-S63 no se unió con células transgénicas que expresaban una proteina de IL-SRalfa humana mutante que comprendia la sustitución de aminoácidos 161K ("anulación de 161"). MEDI-S63 se unió específicamente con células transgénicas que expresaban una proteína de IL-SRalfa humana mutante que comprendía la sustitución de aminoácidos KS3Q ("anulación de KS3"). (E) la figura 27E muestra un ejemplo de los resultados obtenidos

S usando las construcciones de introducción. MEDI-S63 se unió especifica mente con células transgénicas que expresaban una proteina de IL-SRalfa variante que comprendia un segmento B de ratón mutante de D1 que tenia la sustitución de aminoácidos K611 ("introducción de 161"). MEDI-S63 no se unió con células transgénicas que expresaban una proteina de IL-SRalfa variante que comprendia un segmento B de ratón mutante de D1 que tenia las sustituciones de aminoácidos QS3K ("introducción de KS3"). Todas las células que expresaban una proteina de IL-SRalfa quimérica se tiñeron por el anticuerpo policlonal anti IL-5Ralfa humano que mostraba que la diferencia del patrón de tinción de MEDI-S63 entre las células transgénicas no se debia a una diferencia en el nivel de expresión de proteínas quiméricas.

Ejemplo 14

Agotamiento in vivo de eosinófilos de diversos tejidos.

Se evaluó la potencia de un anticuerpo afucosilado anti IL-5Ra de ratón (afuc H7) para agotar selectivamente eosinófilos de diversos tejidos in vivo en comparación con H7 fucosilado (fuc H7).

Métodos: anticuerpo monoclonal H7: las regiones variables de H7 se injertaron en Fc hlgG 1. Fuc H7 se expresó en células CHO de tipo silvestre y afuc H7 en células CHO deficientes en PUT8. Afinidades de anticuerpo (KD): se midieron las afinidades usando tecnologia de resonancia de plasmón superficial. Ratones: se usaron ratones transgénicos para IL-S, y ratones BALB/c a las 6-8 semanas de edad.

25 Agotamiento de eosinófilos en ratones IL-5Tg: se dosificó a ratones con 0,01-10 mg/kg de H7 afuc y fue i.p. y se analizaron los números de eosinófilos 48 horas después. Inducción de la inflamación de las vias respiratorias alérgica: se sensibilizaron ratones BALB/c a OVA en alumbre y se expusieron a OVA los dias 17-22. Los ratones se dosificaron con 0,1 mg/kg de H7 afuc i.p. el dia 22 y se realizó análisis 1 hora, 24 horas y 72 horas después de la exposición final. Esto correspondió a 25, 48 Y 96 horas después dellratamiento con anticuerpo. Aislamiento de leucocitos:

i) Sangre. Se recogió sangre por punCión cardiaca y se mantuvo en tubos heparinizados. Los leucocitos sanguineos se fenotiparon usando un analizador de hematología Sysmex (Sysmex Corp.), o por citometría de flujo.

3S ii) Lumen de las vias respiratorias. Las vias respiratorias se lavaron con PBS 3XO,6 mI. Las muestras de BAL se centrifugaron a 1200 rpm, se retiraron los sobrenadantes y las células se resuspendieron en RPMI. Las células se contaron usando un contador Coulter Z2 (Beckman-Coulter), y se fenotiparon por citometrfa de flujo. iii) Tejido pulmonar. Se incubó un lóbulo de pulmón a 37 oC durante 1 hora en reactivo de digestión Liberase (18 mg/ml) [Blenzyme 2; Roche], DNasa 25 ).Ig/ml [tipo 1; Roche]) en RPMlfFCS 10 %. Las células recuperadas se filtraron a través de un tamiz de nailon de 70 11m (Falcon), se lavaron dos veces y se contaron y se fenotiparon como para BAL. iv) Médul<l ósea. Se aislaron fémures de r<ltones donantes, y 1<1 medul<l se retiró por lav<ldo con una jering<l unid<l <1 una aguja de calibre 25 que contenía PBS (sin calcio/magnesio). Se prepararon suspensiones celulares individuales lavando la médula arriba y abajo suavemente en una jeringa unida a una aguja del calibre 22. Las células de la

45 médula ósea se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos, se lavaron dos veces con PBS sin aditivos, se resuspendieron en RPMI , se contaron y se fenotiparon por citometria de flujo. v) Bazos. Los bazos se retiraron y se prepararon suspensiones celulares individuales usando tamices de nailon de 70 ).1m. Los leucocitos se resuspendieron en RPMI, se contaron y se fenotiparon como para BAL.

Citometría de flujo. Las células se fenoliparon usando análisis citométrico de flujo. Los anticuerpos usados fueron anti ratón CD4, CD19, CD11b, Siglec-F, Gr-1, IL-5R, e-kit (BD Biosciences), FcsR1 (eBiosciences), y CCR-3 (R and D Systems), y sus controles de isotipo relevantes. Las muestras se analizaron usando un citómetro de flujo LSRII y software FACS DIVA (BD Biosciences). Los resultados se analizaron adicionalmente usando FlowJo (TreeStar Corp.)

5S Identificación de eosinófilos: los eosinófilos se identificaron por análisis citométrico de flujo como células con alta disperSión lateral que se tiñeron positivamente para CCR3 y Siglec-F. Resultados: IL-SR se expresó selectivamente por eosinófilos en médula ósea, sangre, bazo y tejido pu lmonar de ratones IL-5Tg. La expresión de IL-SR se restringió a eosinófilos y no se detectó en ningún otro tipo celular, incluyendo mastocitos o basófilos. El anticuerpo anti IL-5R agota selectivamente eosinófilos en el bazo, tejido pulmonar y sangre de ratones IL-5Tg. Ni anti IL-5R fucosilado ni afucosilado agotaron: neutrófilos (Gr-Ihi); macrófagos/monocitos (CD11 b+); linfocitos T (CD3+); linfocitos B (CDI9+). H7 tanto afuc como fuc agotó eosinófilos en bazo, tejido pulmonar y sangre de ratones IL-5Tg. No se detectó agotamiento en la médula ósea. H7 afuc fue más potente en la retirada de eosinófilos en comparación con H7 fue, especialmente a dosis de anticuerpo menores.

65 H7 Afue también agotó selectivamente eosinófilos en un modelo de exposición a alérgeno. H7 afuc agotó eosinófilos en el lumen de las vias respiratorias, tejido pulmonar, sangre y medula ósea. El empobrecimiento fue mayor en

todos los compartimentos 72 horas después de la exposición final (96 horas después del suministro de anticuerpo).

Aunque se han descrito anteriormente para fines de descripción realizaciones particulares de la invención, se apreciará por los expertos en la materia que pueden realizarse numerosas variaciones de los detalles sin alejarse de 5 la invención como se describe en las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Biowa, Inc. Medlmmune LLC Koike, Masamichi Spitalny, George Wheeler, Alistair White, Barbara

<120> METODOS PARA REDUCIR LOS NIVELES DE EOSINÓFILOS

<130> IR400PCT

15 <150> 60/924.422

<151>

<150> 60/924.832

<151 >

<150> 60/935.005

<151>

<150> 61/064.612 25 <151>

<160> 6

<170> Patentln versión 3.3

<210> 1

<211 > 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

ASp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser val Gly 1 S 10 15

ASp Arg val Thr Ile Thr cys Gly Thr Ser Glu ASp ¡le Ile Asn Tyr 20 2S lO

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gl y Lys Ala pro Lys Leu Leu Ile lS 40 4S

Tyr H;S Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly val Pro Ser Arg phe Ser Gly SO SS 60

Ser Gly Ser Gl y Thr ASp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 6S 70 7\ 80

.,

Glu ASp phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr 8S 90 9S

Thr Phe Gl y Gln Gly Thr Lys val Glu Ile l ys 100 lOS

40 <210> 2

<211 > 214

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

5 ASP Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser leu Ser Ala Ser val Gly1 5 10 15

ASp Arg val Thr Ile Thr cys Gly Thr Ser Glu ASp Ile Ile Asn Tyr 20 25 30

leu Asn Trp Tyr Gln Gln lys Pro Gly lys Ala Pro Lys leu leu Ile 35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly val Pro Ser Arg phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr ASp Phe Thr leu Thr Ile Ser Ser leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu ASp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr leu Pro Tyr 85 ~ ~

Thr Phe Gly Gln Gly Thr lys val Glu Ile Lys Arg Thr val Ala Ala 100 105 UO

Pro Ser val Phe Ile Phe Pro Pro Ser ASP Glu Gln leu LyS Ser Gly U5 120 125

Thr Ala Ser val val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys val Gln Trp Lys val ASP Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser val Thr Glu Gln ASp Ser Lys ASP Ser Thr Tyr Ser leu Ser 165 170 17S

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala ASp Tyr Glu lys His lys val Tyr 180 185 190

Ala cys Glu val Thr His Gln Gly leu Ser Ser Pro val Thr lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu cys 210

<210> 3

<211> 121 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Gl u val Gln Leu val Gln ser Gl y Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Al a 1 5 10 15

Ser val LyS val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr phe Thr Ser Tyr 20 25 30

val Ile His Trp val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly leu Ala Trp Met 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn ASp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg phe 50 55 60

lys Gly Lys val Thr 11e Thr Ser ASp Arg Ser Thr ser Thr val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser leu Arg Ser Glu ASp Thr Ala val Tyr leu cys 85 90 95

Gly Arg Glu Gly 11e Arg Tyr Tyr Gly leu leu Gly ASP Tyr Trp Gl y

100 105 no

Gln Gly Thr leu val Thr val Ser Ser 115 120

<210> 4

<211>451 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Glu val Gln leu val Gln Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

ser val lys val Ser cys lys Ala Ser Gly Tyr Thr phe Thr Ser Tyr 20 25 30

val Ile His Trp val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Ala Trp Met 35 ~ 45

Gly Tyr Jle Asn Pro Tyr Asn ASp Gly Thr l ys Tyr Asn Glu Arg phe 50 55 60

lys Gly Lys val Tnr Ile Thr Ser ASP Arg Ser Thr Ser Tnr val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu ASp Thr Ala val Tyr Leu Cys 85 90 95

Gly Arg Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly leu Leu Gly ASp Tyr Trp Gly 100 105 110

E087796 19

Gln Gly Thr leu va l Thr val Ser Se r-Ai a-ser-Thr Lys Gly pro Ser 115 120 125

val Phe pro l eu A la Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140

Al a l eu Gl y Cys leu val Lys ASP Tyr Phe Pro Glu Pro val Thr val 145 150 1 55 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala leu Thr Ser Gly val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

val leu Gln Ser Ser Gly leu Tyr Ser Leu Ser Ser val val Thr val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn val Asn His

195 200 205

lys Pro Ser Asn Thr l ys val ASp lys lys val Glu Pro lyS Ser Cys

210 215 220

ASP lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu leu leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser val Phe leu Phe Pro Pro Lys pro Lys ASp Thr Leu Met 245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu val Thr cys val val val ASp val Ser His 260 265 270

Glu ASp Pro Glu val LyS Phe Asn Trp Tyr val ASp Gly val Glu val 275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg val val ser val Leu Thr val leu His Gln ASp Trp leu Asn Gly

305 310 315 320 l ys Glu Tyr Lys cys Lys val Ser Asn Lys Ala Leu Pro A la Pro 11. 325 330 335 Glu Lys Thr 11e Ser lyS Ala LyS Gly Gln Pro Arg Glu pro Gln val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg ASP Glu Leu Thr Lys Asn Gl n val Ser 355 360 365

Leu Thr cys leu val lys Gly Phe Tyr Pro Ser ASP Ile Ala val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400

val Leu ASP Ser ASp Gly Ser phe Phe Leu Tyr Ser Lys leu Thr val

405 410 415

ASP LyS Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn val ?he Ser cys Ser val Met 420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln lys Ser leu Ser leu Ser 435 440 445

Pro Gly Lys 450

<210> 5

<211> 400 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

ASp Leu Leu Pro ASp Glu Lys Ile Ser Leu Leu Pro Pro val Asn Phe 1 5 10 15

Thr rle Lys val Thr Gly Leu Ala Gl" val Leu Leu Gln Trp Lys Pro

20 25 lO

Asn Pro ASp Gln Glu Gln Arg Asn val Asn Leu Glu Tyr Gln val Lys

35 40 45

rle Asn Ala Pro Lys Glu ASp ASP Tyr Glu Thr Arg Ile Thr Glu Ser 50 55 60

Lys cys val Thr 1le Leu His Lys Gly Phe Ser Ala Ser val Arg Thr 65 70 75 80

rle Leu Gln Asn ASP His Ser Leu Leu Ala Ser Ser Trp Ala Ser Ala 85 90 95

Glu Leu His Ala Pro Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Ile val Asn Leu 100 105 110

Thr cys Thr Thr Asn Thr Thr Glu ASp Asn Tyr Ser Ar~ Leu Arg Ser 115 120 12

Tyr Gln val Ser Leu His Cys Thr Trp Leu val Gly Thr ASp Ala Pro 130 135 140

Glu ASP Thr Gln Tyr phe Leu Tyr Tyr Arg Tyr Gly Ser Trp Thr Glu 145 150 155 160

G1u cys G1n Glu Tyr Ser LyS ASP Thr Leu G1y Arg Asn Ile Al a cys 165 170 175

Trp phe Pro Arg Thr Phe Ile Leu Ser Lys Gly Arg ASp Trp Leu Ala 180 185 190

val Leu val Asn Gl y Ser Ser LyS His Ser Ala Ile Ar~ Pro Phe ASp 195 200 20

Gln Leu Phe Ala Leu His Ala Ile ASp Gln 11e Asn pro Pro Leu Asn 210 215 220

val Thr Ala Glu I1e Glu Gly Thr Arg Leu Ser I1e G1n Trp G1u Lys225 230 235 240

Pro val Ser Ala Phe Pro 11 e His Cys phe ASp Tyr Glu val L~S 11e 245 250 2 5

Hi s Asn Thr Arg As" Gl y Tyr Leu Gln I1e G1u LyS Leu Met Thr Asn 26 265 270

Ala Phe !le Ser I1e I1e ASp ASp Leu Ser Lys Tyr ASp val G1" val 275 280 285

Arg Ala Ala val Ser Ser Met Cys Arg Glu Ala Gl y Leu Trp Ser Glu

290 295 300

Trp Ser Gl" Pro Ile Tyr va l Gl y AS" ASp Glu His Lys Pro Leu Arg305 310 315 32

Glu Trp Phe val !l. val I1e Met Ala Thr 11. cys Phe Ile Leu Leu 325 330 335

Ile Leu Ser Leu I1e cys Lys Ile cys H1 S Leu Trp Ile Lys Leu Phe 340 345 350

Pro Pro Ile Pro Ala Pro Lys Ser Asn I1e Lys ASp Leu Phe val Thr 355 360 365

Thr As" Tyr Glu Lys Al a G1 y Ser Ser Glu Thr Glu Ile Glu val Ile 370 375 380

cys Tyr Ile G1u Lys Pro G1y val Glu Thr Leu Glu ASp Ser val Phe 385 390 395 400

<210> 6 <211>398

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

ASP Leu Leu As n His Lys l ys Phe leu leu Leu Pro pro val Asn Phe 1 5 10 15

The Ile l ys Ala Thr Gly leu Ala Gln val Leu Leu H;S Trp ASp Pro 20 25 30

Asn Pro ASP Gln Glu Gln Arg His val ASp Leu Glu Tyr H;S val Lys

35 40 45

Ile Asn Al a Pro Gln Glu ASp Gl u Tyr ASp Thr Arg Lys Thr Glu Ser 50 55 60

Lys cys val Thr pro Leu His Glu Gl y Phe Ala Ala Ser val Arg Thr 65 70 75 80

Ile Leu Lys Ser Se r His Thr Thr Leu Ala Ser Ser Trp val Ser Ala 85 90 95

Glu Leu l ys Ala pro pro Gly Se r pro· Gly Thr Ser val Thr Asn Leu 100 105 110

Thr cys Thr Thr His Thr val val Ser Se r Hi s Thr Hi s leu Arg pro115 120 125

Tyr Gln vai Ser leu Arg cys Thr Trp leu val Gly LyS ASp Ala pro

130 135 140

Glu AS p Thr Gln Tyr Phe leu Tyr Tyr Arg Phe Gl y val Leu Thr Glu 145 150 155 160

lys Cys Gln Glu Tyr Ser Arg ASp Ala leu Asn Arg Asn Thr Ala cys 165 170 175

Trp phe Pro Arg Thr Phe Ile Asn Ser lys Gly Phe Glu Gln leu Ala 180 185 190

val His Ile Asn Gly Ser Ser lys Arg Ala Ala Ile lys Pro Phe ASP 195 200 205

Gln Leu Phe Se r pro leu Ala r le ASP Gln val Asn pro pro Arg Asn 210 215 220

val Thr val Glu rle Glu Ser Asn Ser Leu Tyr rle Gl n Trp Glu lys225 230 235 240

Pro Leu Ser Al a Phe pro ASP H;S Cys phe Asn Tyr Glu ~eu Lys Ile 245 250 255

Tyr Asn Thr l ys Asn Gly His rle Gln Lys Glu Lys Leu Ile Ala Asn 260 265 270

E087796 19

l YS Phe 11e Ser lys Ile ASp ASp val Ser Thr Tyr Ser Ile Gln val 275 280 285

Arg Ala Ala val Ser ser pro Cys Arg Me t Pro Gly Arg Trp Gly Glu

290 295 300

Trp Ser Gln Pro Ile Tyr val Gl y Lys Glu Ar~ Lys ser leu val Gl u 305 310 31 320 Trp His Leu 11 e val Leu pro Thr Ala Ala cys Phe val Leu Leu 11e

325 330 335 Phe Ser leu 11e eys Arg val cys Hi s leu Trp Thr Arg Leu Phe Pro 340 345 350 Pro val Pro Ala Pro Lys Ser Asn 11e Lys ASp leu Pro val val Thr 355 360 365 Glu Tyr Glu lys Pro Ser Asn Glu Thr l ys Ile Glu val val Hi s eys

370 375 380

val Glu Glu val Gly phe Glu val Met Gly ASn Ser Thr Phe 385 390 395

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo monoclonal humanizado IgG1 que se une con IL-5R para uso en la reducción de los números de eosinófilos en un sujeto humano por administración parenteral de dicho anticuerpo a dicho sujeto a entre 0,01 y

   5 0,25 mg/kg y en el que dicho anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 1 y 3 Y una región Fc de inmunoglobulina que no comprende fucosa.
2. 2. El anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo se une especifica mente con

   la cadena o. de IL-5R. 10
3. 3. El anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que la reducción de eosinófilos tiene lugar durante las primeras 48 horas de la administración.
4. 4. El anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivind icaciones 1 a 3, en el que la reducción de 15 eosinófilos es reversible.
5. 5. El anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivind icaciones 1 a 4, en el que los números de eosinófilos se reducen a un nivel que es menor de 50 eosinófilos/mm 3.

   20 6. El anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a S, en el que hay una reducción después de la administración en el recuento de eosinófilos absoluto de al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 75, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 125, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 175, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 225, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 275, al menos

   25 aproximadamente 300, al menos aproximadamente 325, al menos aproximadamente 350, al menos aproximadamente 375, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 425, al menos aproximadamente 450, al menos aproximadamente 475, o al menos aproximadamente 500 eosinófilos/mm 3.
6. 7. El anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que, después de la

   30 administración, hay una reducción del recuento de eosinófilos absoluto de entre, e incluyendo de, aproximadamente 50 a aproximadamente 500 eosinófilos/mm3.
7. 8. El anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el recuento de

   eosinófilos absoluto después de la administración es menor de aproximadamente 100, menor de aproximadamente 35 75, menor de aproximadamente 50, o menor de aproximadamente 25 eosinófilosfmm3.
8. 9. El anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el recuento de eosinófilos absoluto previo a la administración del sujeto es de entre aproximadamente 50 y aproximadamente

   500 eosinófilos/mm .
9. 10. El anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el recuento de eosinófilos absoluto previo a la administración de dicho sujeto es de aproximadamente 25, aproximadamente 50, aproximadamente 75, aproximadamente 100, aproximadamente 125, aproximadamente 150, aproximadamente 175, aproximadamente 200, aproximadamente 225, aproximadamente 250, aproximadamente 275, aproximadamente

   45 300, aproximadamente 325, aproximadamente 350, aproximadamente 375, aproximadamente 400, aproximadamente 450, aproximadamente 475, o aproximadamente 500 eosinófilos/mm3.
10. 11. El anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha reducción de eosinófilos conduce a una reducción de los sintomas de asma.
11. 12. El anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha reducción de eosinófilos conduce a una reducción de los sintomas de EPOC.