ES2555132T3

ES2555132T3 - Tratamiento de PCVD subclínica

Info

Publication number: ES2555132T3
Application number: ES12165993.2T
Authority: ES
Inventors: Vicky Fachinger; Knut Elbers; Marion Kixmoeller; Francois-Xavier Orveillon; Isabelle Frein von Richthofen; Axel Lischewski
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2007-02-13
Filing date: 2008-02-11
Publication date: 2015-12-29
Anticipated expiration: 2028-02-11
Also published as: EP2114447A1; BRPI0807493A2; KR20090109584A; US9132187B2; ES2434117T3; CA2676568A1; EP2481421A1; PL2114447T3; US20090010954A1; TWI438003B; KR101521465B1; DK2114447T3; US7943298B2; US20130273099A1; DK2481421T3; EP2114447B1; CN101610786A; CL2008000445A1; WO2008098909A1; AU2008214639A1

Abstract

Uso de una proteína ORF2 del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2) o una composición inmunogénica que comprende una proteína ORF2 del PCV2 para la preparación de un medicamento para uso en un método de tratamiento de una infección subclínica por PCV2 en un cerdo individual o un grupo de cerdos que da como resultado: - un mayor aumento de peso de los cerdos en engorde, - una reducción de la pérdida de ganancia de peso en los cerdos subclínicamente infectados con PCV2, - una reducción del número de cerdos con una carga viral comprendida entre 104 a 106 copias de genoma por ml de suero en un grupo de cerdos subclínicamente infectado con PCV2, - un aumento de la ganancia media de peso en un cerdo o un grupo de cerdos subclínicamente infectados con PCV2 o una reducción del número de cerdos con carga viral comprendida entre 104 a 106 copias de genoma por ml de suero, y / o - una reducción de la tasa de morbilidad dentro de un grupo subclínicamente infectado de cerdos o una reducción de la tasa de mortalidad dentro de un subgrupo clínicamente infectado de cerdos, en donde dicho método consiste en administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho medicamento a dicho cerdo o dicho grupo de cerdos una vez, y en donde dicha infección subclínica por PCV2 se caracteriza porque la carga viral en un cerdo subclínicamente infectado es inferior a 106 copias genómicas de PCV2 por ml de suero y porque una muestra de 1 ml de suero o 1 mg de tejido de dicho cerdo comprende una cantidad detectable de equivalentes del genoma de PCV2.

Description

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de animales con una carga viral clínicamente relevante (por encima de 106 copias genómicas por ml de suero) en un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con el PCV2, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesita dicha administración. Preferiblemente, el número de animales con una carga viral por encima de 106 copias genómicas por ml de suero se puede reducir mediante la vacunación con un antígeno del PCV2 a menos de 10%, preferiblemente a menos de 5%, incluso más preferiblemente a menos de 4%, incluso más preferiblemente a menos de 3%, incluso más preferiblemente a menos de 2%, lo más preferiblemente a menos de 0,5%.

Según un aspecto adicional, la presente descripción también proporciona un método para la reducción de la excreción nasal del virus y la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con el PCV2, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesite dicha administración. Como se ha descrito anteriormente, la vacunación/tratamiento de animales infectados subclínicamente con PCV2 produjo un acortamiento de la fase virémica en comparación con los animales de control no vacunados. El acortamiento medio del tiempo de duración de la viremia fue de 17 días en comparación con los animales de control no vacunados de la misma especie. Por lo tanto, según un aspecto adicional, la presente invención también proporciona un método para la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con PCV2, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesite dicha administración, en el que el tratamiento o profilaxis produce un acortamiento de la fase de viremia de 5 días o más, preferiblemente de 6 días o más, aún más preferiblemente de 7 días o más, aún más preferiblemente de 8 días o más, aún más preferiblemente de 9, aún más preferiblemente de 10, aún más preferiblemente de 12, aún más preferiblemente de 14, lo más preferiblemente de más de 16 días en comparación con los animales de un grupo de control no tratado de la misma especie.

El término "antígeno", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia de aminoácidos que produce una respuesta inmunológica en un huésped. Un antígeno, tal como se usa en la presente memoria, incluye la secuencia de longitud completa de cualquier proteína del PCV2, sus análogos o sus fragmentos inmunogénicos. La expresión "fragmento inmunogénico" se refiere a un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopes y, así, provoca la respuesta inmunológica en un huésped. Dichos fragmentos pueden identificarse utilizando cualquier técnica de representación en mapas de epítopes, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por ejemplo, los epítopes lineales se pueden determinar, por ejemplo, sintetizando concurrentemente una gran cantidad de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los peptidos a partes de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos, a la vez que los péptidos siguen estando fijados a los soportes. Dichas técnicas son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol.

23: 709-715. De manera similar, los epítopes conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de aminoácidos mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra.

Dentro de la definición de antígenos sintéticos también se incluyen, por ejemplo, los poliepítopes, epítopes flanqueantes y otros antígenos recombinantes u obtenidos de forma sintética. Véase, por ejemplo, Bergmann et al. (1993), Eur. J. Immunol., 23: 2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol., 157: 3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol., 75: 402-408; Gardner et al., (1998) 12ª Conferencia Mundial del SIDA, Ginebra, Suiza, 28 de junio-3 de julio de 1998.

Una "respuesta inmunológica" significa, pero no se limita al desarrollo en un huésped de una respuesta inmunológica celular y/o mediada por anticuerpos a un antígeno, composición inmunológica o vacuna de interés. Habitualmente, una "respuesta inmunológica" incluye pero no se limita a uno o más de los siguientes efectos: la producción o activación de anticuerpos, células B, células T auxiliares, células T supresoras y/o células T citotóxicas, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el huésped exhibirá bien una respuesta inmunológica terapéutica o bien protectora (memoria), de modo que la resistencia a una nueva infección resultará reforzada y/o la gravedad clínica de la enfermedad quedará reducida. Esta protección se verá demostrada bien por una reducción en el número o en la gravedad de los síntomas, o bien por la ausencia de uno o más de los síntomas asociados con las infecciones por PCV2, por un retraso en la aparición de viremia, por una persistencia vírica reducida, por una reducción en la carga viral global y/o por una reducción en la excreción vírica.

La expresión “composición inmunogénica” o el término “vacuna” (ambos términos se utilizan como sinónimos), tal como se utilizan en la presente, se refieren a cualquier composición farmacéutica que contiene un antígeno del PCV2, pudiéndose utilizar dicha composición para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno asociado con una infección por PCV2 en un sujeto. Una composición inmunogénica preferida puede inducir, estimular o reforzar la respuesta inmune frente al PCV2. Por lo tanto, la expresión abarca tanto composiciones inmunogénicas de subunidades, tales como las que se describen a continuación, así como composiciones que contienen PCV2

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tendrán al menos 5, preferiblemente 8, más preferiblemente 10, más preferiblemente al menos 15 y aún más preferiblemente al menos 19 aminoácidos contiguos procedentes del polipéptido ORF-2 del PCV de longitud completa. Dos secuencias preferidas a este respecto se proporcionan como SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 del documento WO06/072065. Se entiende además que dichas secuencias pueden ser parte de fragmentos mayores o formas truncadas.

Como se ha mencionado anteriormente, un polipéptido ORF-2 del PCV2 preferido adicionalmente es cualquiera codificado por las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Sin embargo, los expertos en la técnica entenderán que esta secuencia podría variar tanto como 6-20% en homología de secuencia y aún conservar las características antigénicas que la hacen útil en composiciones inmunogénicas. En algunas formas, se utiliza una forma truncada o sustituida o un fragmento de este polipéptido ORF-2 del PVC2 como el componente antigénico en la composición. Preferiblemente, dichas formas truncadas o sustituidas o fragmentos comprenderán al menos 18 nucleótidos contiguos procedentes de la secuencia de nucleótidos de longitud completa del ORF-2 del PCV2, por ejemplo de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Más preferiblemente, las formas truncadas o sustituidas, o los fragmentos, tendrán al menos 30, más preferiblemente al menos 45, y aún más preferiblemente al menos 57 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del ORF-2 del PCV2 de longitud completa, por ejemplo, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

“Identidad de secuencia”, tal como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, es decir una secuencia de referencia y una secuencia dada que debe ser comparada con la secuencia de referencia. La identidad de secuencia se determina comparando la secuencia dada con la secuencia de referencia después de haber alineado de forma óptima las secuencias para producir el grado más alto de similitud de secuencia, según se determina por el apareamiento entre las hebras de dichas secuencias. Tras el alineamiento, la identidad de secuencia se constata sobre una base de posición-aposición, por ejemplo, las secuencias son “idénticas” en una posición particular si en esa posición los restos de nucleótidos o aminoácidos son idénticos. El número total de dichas identidades de posición se divide entonces por el número total de nucleótidos o restos en la secuencia de referencia para proporcionar el % de identidad de secuencia. La identidad de secuencia se puede calcular fácilmente por métodos conocidos, que incluyen, pero no se limitan a los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., comp., Oxford University Press, Nueva York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., comp., Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. y Griffin, H. G., comps., Humana Press, Nueva Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., comps., M. Stockton Press, Nueva York (1991); y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), cuyas enseñanzas se incorporan en la presente memoria como referencia.

Métodos preferidos para determinar la identidad de secuencia se diseñan para obtener el apareamiento mayor entre las secuencias sometidas a ensayo. Los métodos para determinar la identidad de secuencia están codificados en programas informáticos disponibles públicamente que determinan la identidad de secuencia entre secuencias dadas. Ejemplos de este tipo de programas incluyen, pero no se limitan al paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990). El programa BLASTX está públicamente disponible en el NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990), cuyas enseñanzas se incorporan en la presente memoria como referencia). Estos programas alinean de forma óptima las secuencias utilizando pesos de huecos por defecto con el fin de producir el nivel más alto de la identidad de secuencia entre las secuencias dada y de referencia. Como ilustración, para un nucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos, por ejemplo, 85%, preferiblemente 90%, incluso más preferiblemente 95% de "identidad de secuencia" con una secuencia de nucleótidos de referencia, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido dado es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de nucleótidos dada puede incluir hasta 15, preferiblemente hasta 10, incluso más preferiblemente hasta 5 mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, en un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos que tenga al menos 85%, preferiblemente 90%, incluso más preferiblemente 95% de identidad con relación a la secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 15%, preferiblemente 10%, incluso más preferiblemente 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia puede tener deleciones o estar sustituido con otro nucleótido, o un cierto número de nucleótidos de hasta 15%, preferiblemente 10%, incluso más preferiblemente 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia puede estar insertado en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones terminales 5' ó 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, entremezcladas bien individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Análogamente, para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos dada que tenga al menos, por ejemplo, 85%, preferiblemente 90%, incluso más preferiblemente 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, se entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido dado es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polipéptidos dada puede incluir hasta 15, preferiblemente hasta 10, incluso más preferiblemente hasta 5 alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia de polipéptidos dada que tenga al menos 85%, preferiblemente 90%, incluso más preferiblemente 95% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 15%,

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documento WO06/072065.

Preferiblemente, cualquiera de esas porciones inmunogénicas tiene las características inmunogénicas de la proteína ORF-2 del PCV2 que es codificada por la secuencia de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 del documento WO06/07065.

Según un aspecto adicional, la proteína ORF-2 del PCV2 se proporciona en la composición inmunogénica en un nivel de inclusión de antígeno eficaz para el tratamiento de animales infectados subclínicamente con PCV2. Preferiblemente, el nivel de inclusión de la proteína ORF-2 del PCV2 es al menos 0,2 µg de antígeno/ml de la composición inmunogénica final (µg/ml), más preferiblemente de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 400 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 200 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,35 a aproximadamente 100 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 50 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,45 a aproximadamente 30 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,6 a aproximadamente 15 µg /ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 8 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 6 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 1,3 a aproximadamente 3,0 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 2,5 µg/ml, incluso más preferiblemente de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,0 µg/ml, y lo más preferible de aproximadamente 1,6 µg/ml.

Según otro aspecto, el nivel de inclusión del antígeno ORF-2 del PCV es al menos 0,2 µg/proteína ORF-2 del PCV2, tal como se ha descrito anteriormente, por dosis de la composición antigénica final (µg/dosis), más preferiblemente de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 400 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 200 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,35 a aproximadamente 100 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 50 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,45 a aproximadamente 30 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,6 a aproximadamente 15 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 8 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 6 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 1,3 a aproximadamente 3,0 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 2,5 µg/dosis, incluso más preferiblemente de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,0 µg/dosis, y lo más preferible aproximadamente 1,6 µg/dosis.

El polipéptido ORF-2 del PCV2 utilizado en la composición inmunogénica según la presente descripción se puede obtener de cualquier manera, incluyendo el aislamiento y la purificación del ORF2 del PCV2, síntesis convencional de proteínas y metodología recombinante. Los métodos preferidos para obtener el polipéptido ORF-2 del PCV2 se proporcionan en el documento WO06/072065, cuyas enseñanzas y contenido se incorporan en la presente memoria como referencia en su totalidad. Brevemente, se infectan células susceptibles con un vector vírico recombinante que contiene secuencias codificadoras del ADN de la ORF-2 del PCV2, el polipéptido ORF-2 del PCV2 es expresado por el virus recombinante, y el polipéptido ORF-2 del PCV2 expresado se recupera del sobrenadante por filtración y se inactiva mediante cualquier método convencional, preferiblemente utilizando etilenimina binaria, que luego se neutraliza para detener el proceso de inactivación.

La composición inmunogénica, tal como se utiliza en la presente memoria, también se refiere a una composición que comprende i) cualquiera de las proteínas ORF-2 del PCV2 descritas anteriormente, preferiblemente en las concentraciones descritas anteriormente, y ii) al menos una porción del vector vírico que expresa dicha proteína ORF-2 del PCV2, preferiblemente de un baculovirus recombinante. Además, la composición inmunogénica puede comprender i) cualquiera de las proteínas ORF-2 del PCV2 descritas anteriormente, preferiblemente en las concentraciones descritas anteriormente, ii) al menos una porción del vector vírico que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, preferiblemente de un baculovirus recombinante y iii) una porción del sobrenadante del cultivo celular.

Por lo tanto, según otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2, un método para aumentar el aumento de peso medio en un animal o un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción del número de animales con una carga viral comprendida entre 104 a 106 copias genómicas por ml de suero, un método para la reducción del número de animales con una carga viral por encima de 106 copias genómicas por ml de suero en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la excreción nasal del virus, un método para la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción de la tasa de morbilidad en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la tasa de mortalidad en una piara infectada subclínicamente, comprendiendo todos ellos la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a un animal que necesita dicho tratamiento, en la que el antígeno del PCV2 es el ORF-2 del PCV2 recombinante, preferiblemente un ORF-2 del PCV2 expresado por baculovirus. Preferiblemente, aquellos ORF-2 del PCV2 recombinante o expresado por baculovirus tienen la secuencia como se ha descrito anteriormente.

La composición inmunogénica, tal como se utiliza en la presente memoria, también se refiere a una composición que comprende i) cualquiera de las proteínas ORF-2 del PCV2 descritas anteriormente, preferiblemente en las concentraciones descritas anteriormente, ii) al menos una porción del vector vírico que expresa dicha proteína ORF2 del PCV2, preferiblemente de un baculovirus recombinante, y iii) una porción del cultivo celular; en la que

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estimulante inmunológico conocido por los expertos en la técnica. La expresión “estimulante inmunológico”, tal como se utiliza en la presente memoria, significa cualquier agente o composición que pueda disparar la respuesta inmunológica, preferiblemente sin iniciar ni aumentar una respuesta inmunológica específica, por ejemplo la respuesta inmunológica contra un agente patógeno específico. Se instruye, además, administrar el estimulante inmunológico en una dosis adecuada.

La presente descripción también se refiere al uso de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 para la preparación de una medicina para la profilaxis y el tratamiento de una infección crónica por PCV2 en un animal o grupo de animales (piara), para aumentar el aumento de peso medio en un animal o un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con PCV2, para la reducción del número de animales con una carga viral comprendida entre 104 a 106 copias genómicas por ml de suero, para la reducción del número de animales con una carga viral por encima de 106 copias genómicas por ml de suero en una piara infectada subclínicamente, para la reducción de la excreción nasal del virus y la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción de la tasa de morbilidad en una piara infectada subclínicamente y un método para la reducción de la tasa de mortalidad en una piara infectada subclínicamente. Preferiblemente, el antígeno del PCV2 es un antígeno recombinante, preferiblemente ORF-2 del PCV2, e incluso más preferiblemente Ingelvac® CircoFLEXTM.

El “animal”, tal como se utiliza en la presente memoria, significa un suido, cerdo o lechón. Por lo tanto, según otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la profilaxis y el tratamiento de una infección subclínica por PCV2 en cerdos, un método para aumentar el aumento de peso medio en un animal o un grupo de animales (piara) infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción del número de animales con una carga viral comprendida entre 104 y 106 copias genómicas por ml de suero, un método para la reducción del número de animales con una carga viral por encima de 106 copias genómicas por ml de suero en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la excreción nasal del virus, un método para la reducción de la duración de la viremia en animales infectados subclínicamente con PCV2, un método para la reducción de la tasa de morbilidad en una piara infectada subclínicamente, un método para la reducción de la tasa de mortalidad en una piara infectada subclínicamente, comprendiendo todos ellos la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno del PCV2 o una composición inmunogénica que comprende un antígeno del PCV2 a cerdos que necesitan dicha administración. Preferiblemente, el antígeno de PCV2 o la composición inmunogénica que comprende el antígeno de PCV2 es cualquiera de los descritos anteriormente, más preferiblemente el antígeno de PCV2 es Ingelvac® CircoFLEXTM.

Descripción detallada de los aspectos preferidos

Los siguientes ejemplos recogen materiales y procedimientos preferidos de acuerdo con la presente descripción. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria pueden usarse en la práctica o ensayos de la presente descripción, se describen ahora los métodos, mecanismos y materiales preferidos.

Ejemplo 1

Preparación del antígeno ORF-2 del PCV2

Cultivos de células SF+ iniciales que estaban conservados en nitrógeno líquido se cultivaron en medio Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) en suspensión en matraces de centrifugación estériles con agitación constante. Los cultivos se hicieron crecer en matraces de centrifugación de 100 mL a 250 mL con 25 a 150 mL de medio exento de suero Excell 420. Cuando las células se habían multiplicado hasta una densidad de células de 1,0-8,0x106 células/mL, estos se dividieron en nuevos recipientes con una densidad de siembra de 0,5-1,5x106 células/mL. Los cultivos por expansión posteriores se hicieron crecer en matraces de centrifugación de hasta 36 litros de capacidad o en biorreactores de acero inoxidable de hasta 300 litros durante un periodo de 2-7 días a 25-29°C.

Después de la siembra, los matraces se incubaron a 27°C durante cuatro horas. Posteriormente, cada matraz se sembró con un baculovirus recombinante que contenía el gen ORF-2 del PCV2 (SEQ ID NO: 4). El baculovirus recombinante que contenía el gen ORF-2 del PCV2 se generó como se describe en el documento WO06/072065. Después de ser sembrados con el baculovirus, los matraces se incubaron luego a 27±2°C durante 7 días y se agitaron también a 100 rpm durante ese tiempo. Los matraces utilizaban tapones ventilados para permitir el flujo de aire.

Después de la incubación, se recogió el sobrenadante resultante, se filtró para eliminar los residuos celulares y se inactivó. El sobrenadante se inactivó llevando su temperatura hasta 37±2°C, y se añadió etilenimina binaria (BEI) al sobrenadante hasta una concentración final de 5 mM. Las muestras se agitaron entonces continuamente durante 72 a 96 horas. Se añadió una disolución de tiosulfato de sodio 1,0 M para proporcionar una concentración final mínima de 5 mM para neutralizar cualquier BEI residual. Después de la inactivación, se añadió ORF-2 del PCV2 tamponado con tampón fosfato y Carpopol a aproximadamente 0,5 a 2,5 mg/dosis. La dosis final comprende aproximadamente 16 µg de antígeno ORF-2 de PCV2.

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Resultados

Viremia

La mayor proporción de animales virémicos se observó en la semana 14 del estudio, con 55,5% de animales virémicos en el grupo tratado con PC y aproximadamente 10% de animales virémicos en el grupo vacunado. Como se muestra en las figuras 4 y 5, la mayoría de los animales en ambos grupos de tratamiento tenían solo cargas víricas subclínicas (definida como 104-106 equivalentes genómicos por ml). La mayor proporción de animales con cargas de PCV2 clínicamente relevantes (> 106 equivalentes genómicos por ml) fue de 2,52% para los animales tratados con PC y 0,87% para los animales vacunados.

Mortalidad

La tasa de mortalidad antes y después del inicio de la viremia fue más bien baja. Antes del inicio de la viremia, la tasa de mortalidad fue de 1,55% en los animales vacunados y 2,19% en los animales tratados con PC. Después del inicio de la viremia se observó un aumento en la tasa de mortalidad en los animales tratados con PC (de 1,55% a 3,02%) mientras que la tasa de mortalidad en los animales vacunados disminuyó ligeramente en comparación con el tiempo antes del inicio de la viremia (de 2,19% a 1,98%). Las diferencias en la tasa de mortalidad entre ambos grupos de tratamiento antes y después del inicio de la viremia no fueron estadísticamente significativas.

Signos clínicos

Antes del inicio de la viremia, solo se detectaron unos pocos signos clínicos en ambos grupos de tratamiento con incidencias por debajo de 1% para cada uno de los parámetros analizados. El inicio de la viremia se acompañó con una coinfección con PRRSV y Mycoplasma hyopneumoniae. Sin embargo, ni el PCV2 ni ningún otro patógeno coinfeccioso produjo signos clínicos graves. Consecuentemente, la proporción de animales con síntomas respiratorios tales como tos y/o disnea fue de solo 3,9% y 0,7% en el grupo tratado con PC y 3,0% y 0,4% en el grupo vacunado La frecuencia de otros síntomas clínicos fue siempre inferior a 1% y sin diferencias entre los grupos de tratamiento.

Frecuencia de cerdos retrasados

No se observaron diferencias significativas en la frecuencia de ‘cerdos retrasados’ entre el grupo vacunado y el grupo tratado con placebo en ninguno de los respectivos momentos de peso. Después del inicio global de la viremia por PCV2, la frecuencia de ‘cerdos retrasados’ fue baja, en general, en ambos grupos de tratamiento (3,3-4,7%).

Tabla 1: Comparación de la frecuencia de ‘cerdos retrasados’ (datos reunidos de los tres grupos de semana)

Antes de la aparición de viremia: Después de la aparición de viremia

Semana del estudio: 0 7 12 17 22

CP IVP P: 11,51% 10,84% 0,6874 11,94% 10,46% 0,3728 5,68% 4,78% 0,4884 4,72% 3,36% 0,1898 4,53% 3,27% 0,2259

P: valor de p del ensayo de la t para la comparación entre grupos: p > 0,05 no significativo

Impacto de la infección subclínica sobre el rendimiento del crecimiento

El aumento de peso corporal hasta la semana 17 del estudio fue 2,36 kg mayor y hasta la semana 19 fue 2,39 kg mayor en el grupo vacunado que en el grupo tratado con PC. Como se muestra en la figura 2, la diferencia en el peso corporal comenzó a aumentar ligeramente en el momento del inicio de la viremia (semana 12 del estudio). En la semana 17 del estudio, la diferencia alcanzó 2,36 kg. Debido al mayor aumento de peso, el tiempo medio entre el destete y el sacrificio fue 1,9 días más corto para los animales vacunados que para los animales tratados con PC.

Tabla 2: Comparación del aumento de peso y ADWG (datos colectivos de los cinco grupos semanales)

Semana del estudio: Grupo tratado con PC (LS Media) Grupo vacunado (LS Media) Diferencia (IVP menos CP) Valor de p1)

Aumento de peso: 0-7 20,63 kg 20,71 kg 0,08 kg 0,7166 ns

0-17: 76,73 kg 79,09 kg 2,36 kg <0,0001 ***

0-19: 86,75 kg 89,14 kg 2,39 kg <0,0001 ***

12-17: 29,05 kg 30,73 kg 1,68 kg <0,0001 ***

7-19: 66,07 kg 68,38 kg 2,31 kg <0,0001 ***

1) Valor de p del ensayo de la t para la comparación entre grupos, ns: no significativo; * significativo, p ≤ 0.05; *** significativo, p ≤ 0,001

Duración de la viremia en la sangre

Cuando se comparó la duración media total y la duración mediana en los dos grupos de tratamiento, se detectó una

5 duración de la viremia significativamente mayor (p = 0,0003) en los animales tratados con PC. El grupo IVP presentaba una duración de la viremia media de 5,8 días, mientras que el grupo PC presentaba una duración media de 21,8 días. Esto corresponde a una duración de la viremia reducida en un 73% en el grupo IVP.

Tabla 3: Duración de la viremia media y mediana

Grupo de tratamiento: Número de Cerdos Media (días) Mediana (días) Valor p

Total: CP 76 21,8 14,0 0,0003 ***

IVP: 18 5,8 0,0

IVP menos CP: -16,0 -14,0

P: valor de p del ensayo de la t para la comparación entre grupos ns: no significativo, p>0,05; * significativo, p ≤ 0.05

10 Conclusión

El estudio ha sido realizado en una granja que evolucionó de un estado agudo a crónico con una infección subclínica muy poco antes de la realización del estudio. La carga viral de los animales de estudio durante el estudio confirmo esta suposición. Muy pocos animales de estudio (< 2,19%) tenían una carga viral en el suero por encima del “límite clínico” de 106 copias genómicas/ml.

15 La vacunación consiguió reducir de forma importante el porcentaje de animales infectados en el grupo vacunado. Por lo tanto, la vacunación permitió la comparación de los animales no infectados (grupo vacunado) con los animales infectados subclínicamente (grupo placebo). Los animales vacunados demostraron que tenían un mejor rendimiento del crecimiento que los animales infectados subclínicamente. En la semana 17 del estudio, la diferencia alcanzó 2,36 kg. Los animales vacunados presentaban una duración de la viremia menor en más de 16 días en

20 comparación con el grupo no vacunado.

Se puede concluir que aunque los animales infectados permanecían aparentemente saludables, la infección subclínica por PCV2 puede tener un impacto negativo importante en el rendimiento del crecimiento.

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Claims

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